JP2016504369A - 抗体を含む治療用組成物 - Google Patents

Abstract

生物学的治療薬の体内のスペースへの制御的徐放を与える製剤及び方法が開示されている。より具体的には、複数の親水性ポリマー鎖を含む製剤、及び前記製剤の形成及び投与方法が開示されている。幾つかの実施形態では、前記製剤は生物学的治療薬のバースト放出、初期放出、三相放出及び３０〜９０日間にわたる放出を示す。幾つかの実施形態では、前記製剤は約５０ｎｍ〜約１０μｍの直径を有する沈殿物となる生物学的治療薬の可逆的な沈殿を示す。

Description

生物学的治療薬は公知であり、その無比のベネフィット及び効力のために広く処方されている。しかしながら、生物学的治療薬は高い全身濃度で望ましくない副作用を伴うことがある。加えて、有痛で高価な生物学的治療薬を反復投与しなければならず、患者や供給業者に対するあるベネフィット及びアピールが低下することがある。従って、全身暴露及び投与頻度を減らし、生物学的治療薬の安全性及び患者コンプライアンスを改善するために生物学的治療薬のデリバリーに対して制御的徐放性製剤を提供することが望ましい。

変形性関節炎は、生物学的治療薬の制御的放出に対する高いまだ満たされていない必要性を有する病変の一例である。米国だけでも現在３８００万人以上の人が変形性関節炎を患っている。変形性関節炎は、関節痛、こわばり及び狭い可動域を特徴とする進行性の病気であり、典型的には手、脊椎、股及び膝の関節を冒す。現在、変形性関節炎の疾患修飾のためにＦＤＡが認可している薬はない。現在、変形性関節炎の疼痛はＮＳＡＩＤ及びオピオイドにより管理されている。また、視野を段階的に害し、失明に至る黄斑変性の治療は目への反復注射の必要性により妨げられている。本明細書中に開示されているような低い全身濃度、低い最大局所及び全身濃度、少ない投与頻度要件、より高い有効投与及び改善されたコンプライアンスを与える生物学的治療薬の制御放出製剤は変形性関節炎、黄斑変性及び他の病気の治療を大きく前進させる。

開示されている主題の目的及び作用効果は、以下の明細書中に記載されており、この記載から明白であり、開示されている主題の実施により分かるであろう。開示されている主題の別の作用効果は本明細書及び特許請求の範囲中に特に指摘されている方法及びシステムにより、添付されている図面から実現され、達成されるであろう。

上記及び他の作用効果を達成するために、具体化されており、広く記載されているように開示されている主題の目的に従って、開示されている主題は生物学的治療薬を体内のスペースに制御的徐放するための製剤、キット及び方法を含む。開示されている主題に従って、生物学的治療薬及び複数の親水性ポリマー鎖を含み、前記ポリマー鎖の各々がポリマー間重合することができる、すなわち架橋することができる官能基を含んでいる製剤が提供される。開示されている主題の製剤の重合により、製剤の体内のスペースへの投与から２４時間以内の生物学的治療薬の放出の「バースト効果」；製剤の体内のスペースへの投与から７日以内での生物学的治療薬の初期累積放出；三相放出プロフィール；及び生物学的治療薬を完全放出するための体内のスペースへの投与から１〜３ヶ月の放出期間；を含めた多数の作用効果及び独自の特性が与えられる。

開示されている主題の別の態様によれば、体内のスペースからの生物学的治療薬の可逆的沈殿を与えるための製剤が提供される。この製剤は生物学的治療薬及び複数の親水性ポリマー鎖を含み、前記ポリマー鎖の各々はポリマー間重合することができる官能基を含む。複数の親水性ポリマー鎖が重合されると、架橋組成物は生物学的治療薬の可逆的沈殿を示し、これらの沈殿物は直径約５０ｎｍ〜約１０μｍの沈殿物を含む。

開示されている主題の別の態様では、可逆的に沈殿する生物学的治療薬を含む架橋組成物の投与方法が提供される。この方法は、生物学的治療薬及び複数の親水性ポリマー鎖を組み合わせて配合物を形成し、配合物を親水性ポリマー鎖のポリマー間重合を誘導するための活性化バッファーと混合して可逆的に沈殿する生物学的治療薬を含む架橋組成物を形成し、架橋組成物をその必要がある患者に対して投与することを含む。更なる実施形態では、非限定的に癌、眼の疾患、炎症、自己免疫疾患、創傷、骨折、感染性疾患または心血管疾患を含めた疾患の治療方法が提供される。

開示されている主題の別の態様では、全身循環中の生物学的治療薬の濃度より約１０〜約１００００倍高い生物学的治療薬の局所的濃度を約１日〜約９０日間生ずる製剤が提供される。

図１は、開示されている主題の１つの態様の略図を表し、生物学的治療薬の制御的徐放製剤は架橋組成物を形成すべく複数の親水性ポリマー鎖を架橋することにより形成され、該組成物は体内のスペースに投与され得る。 図２は、開示されている主題の１つの態様に従うプレミックスした製剤の略図を表す。 図３Ａは、４アーム、８アーム及び混合４アーム／８アーム親水性ポリマー鎖を含む架橋組成物からの生物学的治療薬のインビトロ徐放カイネティックスを表す。 図３Ｂは、４アーム、８アーム及び混合４アーム／８アーム親水性ポリマー鎖を含む架橋組成物からの生物学的治療薬のインビトロ徐放カイネティックスを表す。 図４Ａは、インビトロでのモノクローナル抗体の放出と平行して架橋組成物の膨潤を示す。 図４Ｂは、インビトロでの各種架橋組成物製剤の目に見える溶解までの時間を表す。 図５は、開示されている主題に従う幾つかの製剤中のＰＥＧ固体濃度及び生物学的治療薬濃度を関数とする目に見える沈殿物形成及び沈殿物沈降を図示する。 図６Ａは、５、１５及び３０回注射器プランジングすることにより１０％ ４アームＰＥＧ固体架橋組成物を生成した後の可逆的に沈殿した蛍光標識したモノクローナル抗体沈殿物を表す。 図６Ｂは、５、１５及び３０回注射器プランジングすることにより１０％ ８アームＰＥＧ固体架橋組成物を生成した後の可逆的に沈殿した蛍光標識したモノクローナル抗体沈殿物を表す。 図６Ｃは、５、１５及び３０回注射器プランジングすることにより２０％ ４アームＰＥＧ固体架橋組成物を生成した後の可逆的に沈殿した蛍光標識したモノクローナル抗体沈殿物を表す。 図６Ｄは、５、１５及び３０回注射器プランジングすることにより２０％ ８アームＰＥＧ固体架橋組成物を生成した後の可逆的に沈殿した蛍光標識したモノクローナル抗体沈殿物を表す。 図７は、開示されている主題の幾つかの製剤中に形成される生物学的治療薬の沈殿物のサイズ分布の図である。 図８Ａは、健康なラットの後肢の関節内スペースに投与してから２、４、６、１２及び２４時間後の非製剤化モノクローナル抗体の血清及び滑液濃度を表す。 図８Ｂはこの情報を棒グラフの形で示す。 図９Ａは、８アームＰＥＧ−ＳＨ／ＰＥＧ−Ａｃｒ架橋組成物からのモノクローナル抗体のインビトロ放出カイネティックスを表す。 図９Ｂは、開示されている主題の１つの態様に従う例示的三相放出プロフィールを図示する。 図１０は、健康なラットの後肢の関節内スペースへの投与から１４日間に架橋ヒドロゲル組成物を介してデリバリーされたモノクローナル抗体の血清及び滑液濃度を表す。 図１１Ａは、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定した形成から１８及び２６日目に示す４アーム親水性ポリマー鎖を含む各種架橋組成物からインビトロで放出されたモノクローナル抗体のモノマー、凝集物及び断片の割合を表す。 図１１Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定した形成から１８及び２６日目に示す４アーム親水性ポリマー鎖を含む各種架橋組成物からインビトロで放出されたモノクローナル抗体のモノマー、凝集物及び断片の割合を表す。 図１２は、血清ｍＡｂ濃度対開示されている主題に従う架橋組成物の投与からの時間のプロットを図示する。 図１３Ａは、注射から４時間後のラットの関節内スペース中の架橋組成物の写真である。 図１３Ｂは、注射から４時間後のラットの関節内スペース中の架橋組成物の写真である。 図１３Ｃは、ラット後肢の関節内スペースに注射及びスペースからの射出後の蛍光標識したｍＡｂを含む架橋組成物の写真である。 図１４Ａは、それぞれ各種の架橋プレミックスした及びプレミックスしていない組成物からの平均インビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１４Ｂは、それぞれ各種の架橋プレミックスした及びプレミックスしていない組成物からの平均インビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１５Ａは、図１４Ａにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１５Ｂは、図１４Ａにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１５Ｃは、図１４Ａにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１５Ｄは、図１４Ａにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１５Ｅは、図１４Ａにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１６Ａは、図１２Ｂにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１６Ｂは、図１２Ｂにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１６Ｃは、図１２Ｂにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１６Ｄは、図１２Ｂにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１６Ｅは、図１２Ｂにプロットした平均値に対応する個々の架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図１７Ａは、開示されている主題に従う各種架橋組成物からの追加のインビトロ経時的ｍＡｂ放出を表す。 図１７Ｂは、開示されている主題に従う各種架橋組成物からの追加のインビトロ経時的ｍＡｂ放出を表す。 図１７Ｃは、開示されている主題に従う各種架橋組成物からの追加のインビトロ経時的ｍＡｂ放出を表す。 図１８Ａは、開示されている主題に従う各種架橋組成物についての膨潤比の経時的プロットを表す。 図１８Ｂは、開示されている主題に従う各種架橋組成物についての膨潤比の経時的プロットを表す。 図１９は、開示されている主題に従う各種架橋組成物の経時的目に見える膨潤のデジタル写真である。 図２０は、開示されている主題に従う各種架橋組成物の架橋までの時間のグラフである。 図２１は、開示されている主題に従う各種架橋組成物からのインビトロｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図２２は、開示されている主題に従う架橋組成物の投与後または非製剤化抗体の投与後のｍＡｂの血清濃度のプロットである。 図２３Ａは、それぞれ図２２に表した治療群Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥについての平均血清濃度の経時的プロットである。 図２３Ｂは、それぞれ図２２に表した治療群Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥについての平均血清濃度の経時的プロットである。 図２３Ｃは、それぞれ図２２に表した治療群Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥについての平均血清濃度の経時的プロットである。 図２３Ｄは、それぞれ図２２に表した治療群Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥについての平均血清濃度の経時的プロットである。 図２３Ｅは、それぞれ図２２に表した治療群Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥについての平均血清濃度の経時的プロットである。 図２４Ａは、それぞれ図２２に表した治療群Ａ〜Ｅについての個別の動物についての血清濃度の経時的プロットである。 図２４Ｂは、それぞれ図２２に表した治療群Ａ〜Ｅについての個別の動物についての血清濃度の経時的プロットである。 図２４Ｃは、それぞれ図２２に表した治療群Ａ〜Ｅについての個別の動物についての血清濃度の経時的プロットである。 図２４Ｄは、それぞれ図２２に表した治療群Ａ〜Ｅについての個別の動物についての血清濃度の経時的プロットである。 図２４Ｅは、それぞれ図２２に表した治療群Ａ〜Ｅについての個別の動物についての血清濃度の経時的プロットである。 図２５は、開示されている主題に従う架橋組成物の投与後または非製剤化抗体の投与後のｍＡｂの血清濃度のプロットである。 図２６Ａは、それぞれ図２４に表した治療群Ｄ及びＥについての血清濃度の経時的プロットである。 図２６Ｂは、それぞれ図２４に表した治療群Ｄ及びＥについての血清濃度の経時的プロットである。 図２７Ａは、それぞれ図２５に表した治療群Ａ、Ｄ及びＥの個別の動物についての血清濃度の経時的プロットである。 図２７Ｂは、それぞれ図２５に表した治療群Ａ、Ｄ及びＥの個別の動物についての血清濃度の経時的プロットである。 図２７Ｃは、それぞれ図２５に表した治療群Ａ、Ｄ及びＥの個別の動物についての血清濃度の経時的プロットである。 図２８は、別々の実験からの選択治療群についての血清及び滑液暴露の経時的プロットである。 図２９は、開示されている主題に従う架橋組成物からインビトロで放出されたｍＡｂについてのサイズ排除クロマトグラフィーデータである。 図３０は、開示されている主題に従う架橋組成物からのｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図３１は、投与したｍＡｂの初期濃度に正規化した開示されている主題に従う架橋組成物からのｍＡｂ放出のプロットである。 図３２は、開示されている主題に従う架橋組成物からのｍＡｂ放出の経時的プロットである。 図３３は、開示されている主題に従う架橋組成物から放出された抗ＭＭＰ ｍＡｂに対するサイズ排除クロマトグラフィー結果を図示する。

開示されている主題の実施形態を詳細に説明する。方法及びキットは開示されている主題の製剤の具体的実施形態の詳細説明に関連して記載する。

非限定的に説明し、例示する目的で、開示されている主題の製剤及び対応する方法の例示的実施形態を図１に模式的に図示する。図示されているように、本明細書中に具体化されている製剤は架橋性ポリマー（すなわち、ポリマー間重合することができる親水性ポリマー鎖）及び生物学的治療薬を含む。架橋されると、親水性ポリマー鎖は三次元ネットワークを形成し、この中に生物学的治療薬は可逆的に沈殿している。生物学的治療薬は、架橋されたポリマーネットワークが膨潤し、分解して、生物学的治療薬が放出されるまでこのネットワーク中に効果的に捕捉されている。予期せぬことに、生物学的治療薬が架橋組成物中にデリバリーされている開示されている主題の製剤では、ポリマーネットワークから放出後生物学的治療薬は復元され、復元された生物学的治療薬はその治療有効性を保持していることが知見された。更に、開示されている主題の製剤が生物学的治療薬の非常に望ましい放出プロフィールを与えることができ、制御的三相放出を３０〜９０日間与えることができることが驚くことに知見された。

開示されている主題の１つの態様によれば、体内のスペースからの生物学的治療薬の制御的放出を与える製剤が提供される。この製剤は生物学的治療薬及びポリマー間架橋することができる複数の親水性ポリマー鎖を含む。前記製剤及び関連するキットは更に活性化バッファー、懸濁バッファー及びデリバリーデバイスを含み得る。以下、これらについて順次記載する。

Ｉ．製剤
１．生物学的治療薬
本明細書中に開示されている主題によれば、広範囲の生物学的治療薬が使用され得る。非限定的に例示する目的で、生物学的治療薬には核酸及びタンパク質が含まれる。適当な核酸の例にはｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びＤＮＡプラスミドが含まれ、例示的な適当なタンパク質には成長因子、酵素、サイトカイン、ペプチドホルモン、サイトカイントラップ及び抗体が含まれる。

本明細書に記載されている主題で使用するための適当な成長因子には、非限定的にインスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）、神経成長因子、血管内皮細胞成長因子（例えば、ＶＥＧＦ Ａ、ＶＥＧＦ Ｂ、ＶＥＧＦ Ｃ、ＶＥＧＦ Ｄ、ＰＩＧＦ及びそのアイソマー）、血小板由来成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、脳由来神経栄養成長因子、トランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）、エリスロポエチン及びアンジオポエチンが含まれる。適当なペプチドホルモンには、非限定的にインスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、グルカゴン様ペプチド２、副腎皮質刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、キスペプチン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、レプチン、コレシストキニン、グレリン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、アンギオテンシン及びアンギオテンシンＩＩが含まれる。

非限定的に例示する目的で、以後主に抗体について言及する。例えば哺乳動物、ヒト化、キメラ及び完全ヒト抗体を含めた全ての抗体が開示されている製剤、並びに対応する方法及びキットにおいて使用するのに適している。適当な抗体の非限定例には、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体、抗インターロイキン−（ＩＬ−）１３抗体、抗血管内皮細胞成長（ＶＥＧＦ）抗体、抗マトリックスメタロプロテアーゼ１３抗体及び抗ＩＬ−１抗体が含まれる。二重可変ドメイン抗体も開示されている主題で使用するのに適している。適当な抗ＴＮＦ抗体にはアダリムマブが含まれるが、これに限定されない。適当な抗ＩＬ−１３抗体にはＡＢＴ−３０８が含まれるが、これに限定されない。本明細書に開示されている主題で使用するのに適している具体的な抗体にはトラスツズマブ（ハーセプチン（ＴＭ））、ベバシズマブ（アバスチン（ＴＭ））、アダリムマブ（ヒュミラ（ＴＭ））、ラニビズマブ（ルセンティス（ＴＭ））、アフリバーセプト（アイリーア（ＴＭ））、エタネルセプト（エンブレル（ＴＭ））、リツキシマブ（リツキサン（ＴＭ））、ペグフィルグラスチム（ニューラスタ（ＴＭ））、インターフェロンβ−１ａ（アボネックス（ＴＭ））、インターフェロンβ−１ａ（レビフ（ＴＭ））及びインフリキシマブ（レミケード（ＴＭ））が含まれるが、これらに限定されない。

開示されている主題の１つの態様によれば、驚くことに、本明細書中に開示されている製剤、並びに対応するキット及び方法での使用と併せてペプチド生物学的治療薬（例えば、抗体及び他のタンパク質）が可逆的沈殿を受けることが知見された。高濃度の１つの親水性ポリマーのポリエチレングリコール（以後、“ＰＥＧ”）がタンパク質を沈殿させることは立証されているが、開示されている製剤のペプチド生物学的治療薬は予期せぬことに再可溶化後その構造及び機能を保持することが本発明において立証された。こうした構造及び機能の保存により、第３級及び第４級タンパク質構造は分解することなく非常に望ましい長期間放出が可能となる。抗体を開示されている主題の生物学的治療薬として使用する場合、生物学的治療薬の抗原結合は保存され、生物学的治療薬の放出が１〜９０日間持続される。

開示されている主題の別の態様によれば、開示されている主題のある実施形態では生物学的治療薬は直径約１００ｎｍ〜約１μｍの沈殿物を形成することが判明した。直径が２５ｎｍ〜約１０μｍの範囲の沈殿物は下記に示すように望ましい薬物動態性能に関連している。

２．親水性ポリマー
開示されている主題の別の態様によれば、その各々がポリマー鎖間重合することができる、すなわち他の親水性ポリマー鎖と架橋することができる複数の親水性ポリマー鎖を用意する。ある実施形態では、親水性ポリマー鎖は他の親水性ポリマー鎖上にある官能基と架橋することができる官能基を含む。

ポリマー間重合することができる親水性ポリマー鎖には、非限定的にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸、デキストラン、ペクチン、コラーゲン、フィブリノーゲン、アルギネート、ＰＬＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＬＡコポリマー、ＰＬＤＡ−ＰＥＧ−ＰＬＤＡコポリマー、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡコポリマー、ＰＥＧ−ＰＬＬＡコポリマー、ＰＥＧ−ＰＬＤＡコポリマー及びＰＥＧ−ＰＬＧＡコポリマーが含まれる。適当な官能基には、非限定的にチオール、ビニル、アミノ、アルデヒド、ビニルスルホン、スクシンイミジル、ヒドロキシスクシンイミジル、ニトロフェノラート及びカルボヒドラジド部分が含まれる。

非限定的に例示する目的で、以後複数のＰＥＧポリマー鎖を含む製剤、並びに関連する方法及びキットについて言及する。ＰＥＧは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）サブユニットの反復構造を有する合成ポリマーである。加えて、開示されている主題で使用するのに適しているＰＥＧポリマー鎖はポリマー鎖間重合することができる少なくとも１つの官能基を含み得る。従って、開示されている主題の適当なＰＥＧポリマー鎖には、非限定的にＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−ビニル、ＰＥＧ−アミノ、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−スクシンイミジル、ＰＥＧ−ヒドロキシスクシンイミジル、ＰＥＧ−ニトロフェノラート及びＰＥＧ−カルボヒドラジドポリマーが含まれる。例示のみの目的で、親水性ポリマー鎖は２〜３０キロダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール分子であり得る。

加えて、開示されている製剤で使用するのに適しているＰＥＧポリマー鎖はポリマー間重合前に１ポリマー鎖分子あたり２個以上の官能基を含み得る。本明細書では、前記ＰＥＧポリマー鎖を「多官能性」と称する。開示されている製剤で使用するのに適しているＰＥＧポリマーには、非限定的に線状ＰＥＧ、２アームＰＥＧ、３アームＰＥＧ、４アームＰＥＧ、６アームＰＥＧ、８アームＰＥＧ及び１６アームＰＥＧが含まれる。多官能性ＰＥＧポリマー鎖は各種の異なる構造配置で入手可能である。開示されている製剤のポリマーのために適している構造の例には線状、分岐状、星形及び櫛形配置が含まれるが、これらに限定されない。開示されている主題の幾つかの実施形態では、親水性ポリマー鎖の各アームは図１に描かれている官能基を含む。開示されている主題に従う幾つかの実施形態では、多官能性ＰＥＧポリマー鎖上にある官能基のすべてが同一の官能基から構成されている。

本明細書中に開示されている主題の幾つかの実施形態によれば、複数の親水性ポリマー鎖は２つ以上のタイプのＰＥＧポリマーからなる。本明細書中に開示されているように、ＰＥＧポリマーのタイプは同一数のアーム（例えば、４本のアーム、８本のアームまたは１６本のアーム）及び同一の官能基（例えば、チオールまたはアクリレート）を有する複数のＰＥＧポリマー鎖を指す。開示されている主題によれば、複数の親水性ポリマー鎖は少なくとも２つのタイプのＰＥＧポリマーからなり得、２つのタイプの官能基の合計（すなわち、ｍ＋ｎの合計であり、ｍは第１タイプのＰＥＧポリマー上に存在する官能基の数を表し、ｎは第２タイプのＰＥＧポリマー上に存在する官能基の数を表す）は２〜３２（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２）である。

幾つかの実施形態では、複数の親水性ポリマー鎖は２タイプのＰＥＧポリマーからなる。幾つかの実施形態では、第１タイプのＰＥＧポリマーは４本のアームを有するＰＥＧアクリレートであり、第２タイプのＰＥＧポリマーは４本のアームを有するＰＥＧチオールてある。更なる実施形態では、第１タイプのＰＥＧポリマーは８本のアームを有するＰＥＧアクリレートであり、第２タイプのＰＥＧポリマーは８本のアームを有するＰＥＧチオールである。更なる実施形態では、第１タイプのＰＥＧポリマーは１６本のアームを有するＰＥＧアクリレートであり、第２タイプのＰＥＧポリマーは１６本のアームを有するＰＥＧチオールである。これらのタイプは１：１の比で用意され得る。しかしながら、開示されている主題に従う追加の実施形態では、第１タイプのＰＥＧポリマー：第２タイプのＰＥＧポリマーの比は約１：１０〜約１０：１である。

更なる実施形態では、複数のＰＥＧポリマー鎖は４タイプのＰＥＧポリマーからなり得る。幾つかの実施形態では、第１及び第２タイプのＰＥＧポリマーは同一数の官能基を有し、第３及び第４タイプのＰＥＧポリマーも同一数の官能基を有しているが、その数は第１及び第２タイプのＰＥＧポリマー上の官能基の数とは異なり得る。第１及び第２タイプのＰＥＧポリマー上の官能基の数が第３及び第４タイプのＰＥＧポリマー上の官能基の数と異なる更なる実施形態では、第１及び第２タイプのＰＥＧポリマー：第３及び第４タイプのＰＥＧポリマーの比は調節され得る。非限定的に例示する目的で、第１及び第２タイプのポリマー：第３及び第４タイプのポリマーの比は５０：５０、２５：７５、または７５：２５であり得る。以下に記載されているように、存在するポリマー鎖のタイプの比を調節することにより製剤の制御的放出特性を変更することができる。

開示されている主題の１つの態様によれば、予期せぬことに、親水性ポリマー鎖上のある官能基が可逆的沈殿後の再可溶化時の生物学的治療薬の構造及び機能の改善された保存に関連していることが分かった。官能基は生物学的治療薬の溶媒暴露残基及び生物学的治療薬に対する翻訳後修飾に基づいて選択され得る。非限定的に例示する目的で、以下に記載する所望の制御的放出特性及び特定の生物学的治療薬との最低相互作用に関連するチオール官能基及びアクリレート官能基について言及する。

開示されている主題の幾つかの実施形態では、生物学的治療薬：親水性ポリマーの重量比は約１：１〜１：１２５である。ある好ましい実施形態では、生物学的治療薬：親水性ポリマーの重量比は１：３．７５〜１：２５である。下記するように、予期せぬことにこの重量比が所望の制御的放出プロフィールに従って調節され得ることが立証された。

３．懸濁バッファー
開示されている主題の幾つかの実施形態では、生物学的治療薬及び複数の親水性ポリマー鎖を懸濁バッファー溶液中に用意し得る。懸濁バッファー溶液は約３．５〜約６のｐＨを有し得、非限定的にヒスチジン、クエン酸及び／またはリン酸からなり得る。追加の候補バッファーにはコハク酸、酢酸、トリス及び炭酸が含まれる。幾つかの例示的実施形態では、懸濁バッファーはｐＨ５．２の１５ｍＭ ヒスチジン、またはｐＨ３．５の０．０５Ｍ クエン酸−リン酸バッファーからなり得る。０．０５Ｍ〜３Ｍのバッファーモル濃度が開示されている主題の各種実施形態で使用するのに適している。懸濁バッファーは、ポリマー間重合までポリマー及び生物学的治療薬を懸濁させ、保存する。或いは、幾つかの実施形態では、親水性ポリマー鎖、生物学的治療薬、または親水性ポリマー鎖と生物学的治療薬の両方を凍結乾燥形態で用意してもよい。

４．懸濁バッファー添加剤
開示されている主題に従うある実施形態では、１つ以上の添加剤を含み得る懸濁バッファーを用意する。非限定的例として、添加剤には塩、糖、ポリオール、アミノ酸、保存剤及び／または追加の化合物が含まれ得る。懸濁バッファーと共に使用するための塩には、非限定的に塩化ナトリウム、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムが含まれる。懸濁バッファーと共に使用するための糖には、非限定的にスクロース、トレハロース、マンノース及びデキストロースが含まれる。懸濁バッファーと共に使用するためのポリオールには、非限定的にソルビトール、マンニトール及びグリセロールが含まれる。懸濁バッファーと共に使用するための候補アミノ酸には、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、メチオニン、プロリン、リシン、グルタミン酸、アラニン及びアルギニン混合物が含まれる。ある実施形態では、アルブミン及び組換えアルブミンも懸濁バッファーと共に使用され得る。開示されている主題の懸濁バッファー中に使用するための適当な保存剤には、非限定的にｍ−クレゾール、ベンジルアルコール及びフェノールが含まれる。トゥイーン８０及びトゥイーン２０のような保存剤、及びＳＤＳ、Ｂｒｉｊ ３５及びトリトンｘ−１０のような界面活性剤も使用し得る。デキストランのような多糖、ＥＤＴＡのようなキレート剤、プルロニックＦ−６８及びＦ−１２７のようなポロキサマー、ポリビニルピロリドン、アルキルサッカライド及びセルロース系も開示されている主題の懸濁バッファー中に使用され得る。加えて、低分子量ＰＥＧ、すなわち４０００未満の分子量を有するＰＥＧも懸濁バッファー添加剤として使用され得る。

５．活性化バッファー
開示されている主題の幾つかの実施形態では、活性化バッファーも用意する。本明細書中で言及されているように、活性化バッファーは複数の親水性ポリマー鎖のポリマー間重合を触媒する溶液である。非限定的に例示する目的で、活性化バッファーは炭酸バッファーまたはリン酸バッファーであり得る。幾つかの実施形態では、活性化バッファーは７〜１０．５のｐＨを有している。

開示されている主題の１つの態様によれぱ、親水性ポリマー鎖のポリマー間重合、すなわち架橋は１つの親水性ポリマー鎖上にある官能基と別の親水性ポリマー鎖上にある官能基の間で起こる。異なる官能基を有する２つ以上のタイプの親水性ポリマー鎖を用意し、１つの官能基が求電子性であり、別の官能基が求核性である幾つかの実施形態では、架橋は当業者に公知のマイケル付加反応を介して起こり得る。例えば、基本活性化溶液中でチオールで官能化されているポリマー鎖及びアクリレートで官能化されているポリマーを混合すると、求核性チオール基の脱プロトン化、次いで求電子性アクリレート部分への電子の供給が生じて、ポリマー間チオエーテルエステル結合が形成される。別の適当なＰＥＧ架橋反応は、全文を参照により本明細書に組み入れる米国特許Ｎｏ．７，７３２，１９０及び米国特許出願公開Ｎｏ．２００９／０２２６５１９に開示されている。

開示されている主題の別の態様によれば、以下に記載されているように、活性化バッファーは製剤の制御放出特性を最適化し、再可溶化したとき生物学的治療薬の機能の保存を最適化するように選択され得る。驚くことに、活性化バッファーのｐＨは生物学的治療薬の溶媒露出残基及び親水性ポリマー鎖上に存在する官能基の架橋を最小限とするように選択され得ることが立証された。特に、生物学的治療薬の等電点（以下、“ｐＩ”）よりも僅かに高いｐＨを有するバッファーを選択することにより、生物学的治療薬の構造及び機能は親水性ポリマー鎖及び生物学的治療薬をポリマー間重合を触媒するための活性化バッファーと混合している間保存される。

幾つかの実施形態では、求核性官能基で官能化したＰＥＧポリマー鎖の部分集合は当業者に公知のマイケルタイプ反応により求電子性官能基で官能化したＰＥＧポリマー鎖の別の部分集合と共有結合を形成する。適当な求核性官能基には、非限定的にチオール、アミノ、ヒドロキシ及びＣＯ−ＮＨ−ＮＨ_２基が含まれる。適当な求電子性官能基には、非限定的にアクリレート、ビニルスルホン及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド基が含まれる。基本活性化バッファーは求核性官能基を脱プロトン化してマイケルタイプ付加反応を促進させることによりポリマー間重合を触媒し得る。

開示されている主題の幾つかの実施形態では、ＰＥＧポリマー鎖：活性化バッファーの％重量／容量比は活性化バッファー溶液の５容量％〜３０容量％である。下記するように、予期せぬことに、この重量／容量比は所望する制御的放出プロフィールに従って調節され得ることが立証された。

ＩＩ．架橋組成物
開示されている主題の別の態様によれば、生物学的治療薬及び親水性ポリマー鎖を組合せ、親水性ポリマー鎖を架橋して上で検討した所望の放出特性を有する架橋組成物を形成する。開示されている主題の１つの態様によれば、製剤を親水性ポリマー鎖のポリマー間重合（すなわち、架橋）を触媒するための活性化バッファーの存在下で混合し、これにより間質空間中に生物学的治療薬を含有している架橋組成物が形成される。

開示されている主題の１つの非限定的態様によれば、開示されている主題の架橋組成物をデリバリーするために３つの基本ステップを実施する。生物学的治療薬を親水性ポリマー鎖と組合せ、親水性ポリマー鎖を（例えば、活性化バッファーと混合することにより）架橋し、架橋組成物を体内のスペースにデリバリーする。幾つかの実施形態では、生物学的治療薬及び親水性ポリマー鎖を溶液中に用意することができる。或いは、体内のスペースにデリバリーする前に再懸濁するためにこれらを凍結乾燥形態で用意してもよい。幾つかの実施形態では、体内のスペースに投与する少し前に生物学的治療薬及び親水性ポリマー鎖を活性化バッファーと混合して、親水性ポリマー鎖を架橋してもよい。或いは、デリバリー前に混合を実施し得、デリバリー前に再懸濁するために生じた生物学的治療薬を含む架橋組成物を粉砕し、凍結乾燥し得る。この後者の実施形態の架橋組成物を「プレミックスした」と称する。プレミックスした製剤の非限定的略図を図２に示す。

開示されている主題の幾つかの実施形態では、生物学的治療薬及び親水性ポリマー鎖を含む製剤を溶液中に用意する。製剤溶液をポリマー間重合を触媒するための基本活性化バッファーと混合する。幾つかの実施形態では、求核性官能基で官能化したＰＥＧポリマー鎖の部分集合を当業者に公知のマイケルタイプ反応により求電子性官能基で官能化したＰＥＧポリマー鎖の別の部分集合と共有結合を形成する。適当な求核性官能基には、非限定的にチオール、アミノ、ヒドロキシ及びＣＯ−ＮＨ−ＮＨ_２基が含まれる。適当な求電子性官能基には、非限定的にアクリレート、ビニルスルホン及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド基が含まれる。基本活性化バッファーは、求核性官能基を脱プロトン化してマイケルタイプ付加反応を促進させることによりポリマー鎖架橋を触媒し得る。

開示されている主題の幾つかの実施形態によれば、ポリマー鎖架橋をエキソビボで開始し、インビボで、すなわち製剤をデリバリーした体内のスペース中で完了するまで進行させる。ポリマー間重合（架橋）を開始後、混合物を体内のスペースに投与し、ここで架橋反応が完了して架橋組成物を形成する。追加の実施形態では、なお注射器で押し出し可能な少しばかり架橋したＰＥＧを形成し、その後生物学的治療薬と混合し得る。次いで、第２の活性化バッファーと混合することにより更なる架橋を達成し得る。このような混合により、生物学的治療薬とＰＥＧポリマー鎖上の官能基と基本活性化バッファー間の接触時間を最小限として、より多くの生物学的治療薬を充填することができ、また生物学的治療薬の活性の保存を強化することができる。

開示されている主題の幾つかの態様によれば、溶液中の製剤を注射器混合により活性化バッファーと混合する。この点で、驚くことに、ある非限定的実施形態では特定程度の注射器混合が所望の沈殿物サイズ及び放出プロフィールに関連していることが立証された。例えば、図６に図示されているように、幾つかの実施形態では、約３秒間〜約１０秒間に通常不変のプランジャーストローク（例えば、約５〜１５回プランジャーストローク）を用いる注射器混合により、所望の沈殿物サイズ及び均一性が生じ、例えば３０回以上のプランジャーストロークによりより長時間混合すると大きな粘着性の沈殿物及び生物学的治療薬の損失を伴う。雌−雌ルアフィッテイングを接続した１ｍｌ ベクトン・ディッキンソン注射器を含めた各種の適当な注射器を混合のために使用し得る。ほぼ等しい全剪断力及び製剤に対する剪断力の暴露期間を与える混合方法により同様の結果が得られる。幾つかの実施形態では、５０ｎｍ〜１０μｍの範囲の直径を有する生物学的治療薬の沈殿物が上記した所望の再可溶化及び放出プロフィールに関連している。幾つかの実施形態では、最高２５０μｍの生物学的治療薬の沈殿物が提供される。幾つかの実施形態では、混合は製剤及び活性化バッファーの混合物を渦流混合または反復反転により実施する。

開示されている主題の別の態様によれば、多数の親水性ポリマー鎖を生物学的治療薬の存在下でポリマー間重合すると架橋組成物が形成する。開示されている主題によれば、架橋後架橋組成物の特性を最適化するように複数の親水性ポリマーを選択し得る。架橋組成物の架橋密度は、例えばポリマー鎖の分子量、ゲル化反応の時間（すなわち「ゲル化時間」）、ＰＥＧアームの数、ＰＥＧポリマー鎖上に存在する官能基及びポリマー間架橋前の溶液中のＰＥＧ固体の濃度により影響される。懸濁バッファーのｐＨ、懸濁バッファー添加剤、及びポリマー間架橋を触媒するために使用される活性化バッファーもゲル化時間、架橋密度、及び生じる生物学的治療薬の沈殿物サイズに影響を与える。通常、架橋密度は、ポリマーのより低い分子量、親水性ポリマー鎖あたりのＰＥＧアームの高い割合、溶液中のＰＥＧ固体のより高い濃度、及び活性化バッファーのより高いｐＨに応じて増加する。架橋組成物の架橋密度は生物学的治療薬に関するその放出プロフィールの決定因子である。

例えば、図３Ａ及び図３Ｂに図示されているように、４アームＰＥＧ：８アームＰＥＧの比を変更し、製剤のＰＥＧ固体の重量／容量比を変えると、架橋組成物の制御的放出プロフィールが変化する。示されているように、各架橋組成物は所望の制御的放出及び期間を与えるが、その放出は生物学的治療薬、適応、デリバリーの場所及び他の考慮すべき要件に従って最適化され得る。加えて、実施例１３で検討し、図５に図示されているように、親水性ポリマーの重量％、生物学的治療薬：親水性ポリマーの重量比、生物学的治療薬の沈殿物のサイズは架橋製剤の放出プロフィールに対する付随する影響で調節される。

驚くことに、ＰＥＧの存在下でタンパク質が沈殿している間またはその後にＰＥＧポリマー鎖を架橋組成物ネットワークに架橋することにより、タンパク質はＰＥＧポリマー鎖の官能基との共有相互作用から保護され、その生物学的活性は再可溶化後維持されることが知見された。更に、架橋触媒作用のために活性化バッファーを用意することにより、ＰＥＧポリマー鎖間で比較的迅速な架橋が達成され、それにより例えばアミン基のようなタンパク質の反応性溶媒暴露残基が例えばアクリレート基のようなＰＥＧポリマーの架橋官能基と反応する機会が最小限となる。加えて、ＰＥＧポリマー鎖の架橋官能基はタンパク質の溶媒暴露残基の共有修飾を最小限とするように選択され得る。例えば、タンパク質がジスルフィド結合に関与しないシステイン残基の量が高いことにより特徴づけられている場合、生物学的治療薬とＰＥＧポリマー鎖間のジスルフィド結合の形成を最小限とするためにはアミン基のような架橋官能基を有するＰＥＧポリマー鎖がチオール基のような架橋官能基を有するＰＥＧポリマー鎖より好ましいことがある。

親水性ポリマー鎖を架橋した後、生じた架橋組成物は水を吸収する。架橋組成物が水を吸収するので、架橋組成物はその容量が増加するにつれて膨潤する。架橋組成物の容量が増加すると、沈殿した生物学的治療薬は再可溶化し、ポリマーマトリックスから拡散する。加えて、水は架橋組成物の成分ポリマー間のチオエーテルエステル結合を加水分解して、生物学的治療薬を更に放出させる。更に、生物学的治療薬は平衡水摂取量を減少させ、それにより架橋組成物は大きな膨潤から妨げられる。形成された架橋組成物は相互貫入または半相互貫入ネットワーク構造を有し得る。

架橋組成物の放出プロフィールに加えて、組成物の追加パラメーターは関節内スペースのような体内のスペースへのデリバリーの適合性に対して最適化され得る。例えば、架橋組成物の粘弾性及び弾性係数が患者の快適さを最大限とするように考慮され得る。インビボでの膨潤比に依存する架橋組成物の最終的最大容量は体内のスペースにデリバリーされ得る製剤の全量を制限する。加えて、形成されるポリマー組成物が親水性ポリマー鎖から構成されているので、インビボで再吸収され得、架橋組成物を体内の同一スペースに反復投与することができる。

図４Ａは、架橋組成物の膨潤と生物学的治療薬放出の関係を図示している。平行プロットから、生物学的治療薬の膨潤及び放出が平行して起こることが明らかである。加えて、図４Ｂは各種架橋組成物のインビトロでの目に見える溶解までの時間を示している。検討しているように、複数の変数が架橋組成物の所望の溶解速度を達成するように調節され得る。

２．生物学的治療薬沈殿物のサイズ及び均質性
本明細書中に開示されている主題によれば、生物学的治療薬と親水性ポリマーの製剤は架橋された親水性ポリマーマトリックス内に生物学的治療薬の沈殿物を生じる。驚くことに、これらの沈殿物はポリマーマトリックスから拡散され、再可溶化された後その構造及び機能を保持している。使用する具体的製剤に基づいて、混合の力及び期間、選択する生物学的治療薬、懸濁バッファー及び活性化バッファーのｐＨ及び他の変数に基づいて、沈殿物のサイズは変わる。例えば、図５に図示するように、ＰＥＧ固体の量及び生物学的治療薬の濃度が高くなると沈殿物サイズは大きくなる。２５％以上のＰＥＧ固体では、生物学的治療薬の沈降も観察される。

更に、図６Ａ〜Ｄに示すように、混合の程度は生ずる生物学的治療薬の沈殿物のサイズにも影響を与える。図示されているように、５〜１５回のプランジャーストロークによる混合はより小さい沈殿物が生じ、３０回のプランジャーストロークでの混合はより大きく、より粘着性の沈殿物を生ずる。幾つかの実施形態では５０ｎｍ〜１０μｍの沈殿物サイズが好ましく、最高２５０μｍの沈殿物サイズが形成され得る。沈殿物サイズの選択は主にその適応、その効力及びその薬物動態を含めた生物学的治療薬に依存している。より大きな沈殿物は通常、より小さく且つより均一な沈殿物に比して局所及びそれほどではないが全身濃度での山及び谷に関連している。

更に図６Ａ〜Ｄに図示されているように、沈殿物の均質性は混合の程度及び親水性ポリマー鎖の組成によっても影響され得る。図６Ｂ（１０％ ＰＥＧ固体）及び図６Ｄ（２０％ ＰＥＧ固体）に示すように４アームＰＥＧよりも架橋された親水性ポリマー鎖のより密なネットワークを形成する８アームＰＥＧは、通常図６Ａ（１０％ ＰＥＧ固体）及び図６Ｃ（２０％ ＰＥＧ固体）に示す４アームＰＥＧよりも高度の沈殿物サイズの均質性及び分布に関連している。

例示する目的で、図７は製剤を用いて、以下の実施例４に記載するプロトコルに従って達成され得る沈殿物サイズを示す。沈殿物サイズは、ナノサイトのナノ粒子トラッキング解析 バージョン２．２ Ｂｕｉｌｄ ０３６６を用いて測定した。約５０ｎｍ〜約４００ｎｍの直径を有する生物学的治療薬の沈殿物が生ずる。図示されているように、沈殿物のサイズは通常ガウス分布を示す。更なる実施形態では、約５０ｎｍ〜約１０μｍの直径を有する生物学的治療薬の沈殿物が生ずる。更に別の実施形態では、約１０μｍ〜約２５０μｍの直径を有する生物学的治療薬の沈殿物が生ずる。

ＩＩＩ．架橋組成物の使用
１．制御的放出
開示されている主題の架橋組成物は、頭部及び臓器の洞腔、長骨の骨髄、胸腔内及び腹腔内スペース、血管の管腔、外分泌管、眼内（例えば、硝子体内）スペース及び関節内スペースを含めた体内の各種スペースにデリバリーするのに適している。非限定的に例示する目的で、以後本明細書中に開示されている主題に従う架橋組成物の体内の関節内スペースまたは眼内スペースへのデリバリーについて言及する。滑液の関節内スペースから血漿へのターンオーバーは比較的速い。その結果、可溶性生物学的治療薬の関節内スペースへのデリバリーは、特に比較的長い半減期を有する治療薬の場合関節内濃度を最大限にし且つ全身濃度を最小限とするためには有効でない。この現象を図８Ａ及び図８Ｂに図示する。示されているように、非製剤化（すなわち、ポリマーマトリックスに被包されていない）モノクローナル抗体をｔ_０に関節内スペースに注射し、関節内及び全身濃度をモニターする。１２時間以内に、抗体の局所（関節内）濃度は血漿内で見られるのとほぼ同一濃度まで２桁ずつ低下したが、全身暴露はコントロールされない。硝子体内流体ターンオーバーも非常に高く、更に薬物の眼への全身デリバリーを阻止する血液眼関門により眼は全身循環から分離されている。

対照的に、開示されている主題の１つの態様によれば、本明細書中に開示されている製剤は生物学的治療薬の局所デリバリーの点で非常に有利である放出プロフィールを示す。非限定的に例示する目的で、前記放出プロフィールは、「バースト」、すなわち架橋組成物の体内のスペースへの投与により２４時間以内にデリバリーされた全生物学的治療薬の一部分が比較的即時に放出されることにより特徴づけられ得る。「バースト効果」は図９Ａに図示されており、この図は生物学的治療薬の短期間放出がコントロールされていることを図示している。この減少したバースト効果は全身暴露を低下させる。特定実施形態の放出プロフィールは更に、投与された全生物学的治療薬の大部分が投与の最初の７日間以内に放出される初期放出により特徴づけられ得る。更なる実施形態では、放出プロフィールは生物学的治療薬の架橋組成物マトリックスから体内のスペースへの長期間放出により特徴づけられ得る。

開示されている主題の追加実施形態では、放出プロフィールは約０〜３０日間の第１期間の間の第１放出率、０〜３０日間の第２期間の間の第２放出率及び約０〜３０日間の第３期間の間の第３放出率の三相である。幾つかの好ましい実施形態では、三相放出プロフィールの少なくとも１つの相はほぼ直線、すなわちゼロ次放出カイネティックスを示す。すなわち、生物学的治療薬の放出率は相の期間にわたってほぼ同一である。開示されている主題の態様に従う三相放出プロフィールを図９Ｂに図示する。示されているように、三相放出プロフィールは３０〜９０日間にわたって生物学的治療薬の安定した長期間放出を与える。以下に検討するように、前記放出プロフィールにより、非製剤化生物学的治療薬の投与に比して生物学的治療薬のより高い局所濃度及び低い全身濃度が生ずる。記載されている放出プロフィールを与える例示的製剤の非限定的リストを表１に示し、この表には本明細書中に開示されている架橋されている成分の各種成分についての仕様が記載されている。幾つかの非限定実施形態では、表２に従う薬物動態結果が達成される。

本明細書中に開示されている「バースト効果」は架橋組成物を投与してから最初の２４時間以内に一部分の生物学的治療薬が架橋組成物から体内のスペースに放出されることを指す。非限定的に例示する目的で、バースト効果はデリバリーされた全生物学的治療薬の約０．１％〜デリバリーされた全生物学的治療薬の約３０％の放出に相当し得る。幾つかの実施形態では、バースト効果はデリバリーされた全生物学的治療薬の約１％〜約１０％である。更なる実施形態では、バースト効果は約１０％〜約２０％である。もっと更なる実施形態では、バースト効果は２０％〜３０％である。本明細書中に開示されている用語「初期累積放出」は、最初の２４時間にわたり放出された部分を含めて、投与から最初の７日以内に一部分の生物学的治療薬が架橋組成物から体内のスペースに放出されることを指す。幾つかの実施形態では、初期放出はデリバリーされた全生物学的治療薬の１０％に相当し得る。追加の実施形態では、初期放出はデリバリーされた全生物学的治療薬の１０〜２０％に相当する。幾つかの実施形態では、初期放出は２０〜３０％である。もっと更なる実施形態では、初期放出は約３０〜４０％である。本明細書中に開示されている「三相放出プロフィール」は生物学的治療薬の放出プロフィール、すなわち一定期間の３つの識別できる放出率で一部分の生物学的治療薬が架橋組成物から経時的に放出されたプロットを指す。図９Ｂは本明細書中に開示されている主題に従う三相放出プロフィールを例示的非限定例を示す。

開示されている主題の製剤により与えられる制御的放出により、生物学的治療薬のデリバリーのための著しく改善された薬物動態エンドポイントが生ずる。全放出期間にわたり全及び最大全身暴露が少なくなるのに対して、局所濃度は最大限となり、これにより治療の有効性が最大となり、望ましくない副作用は最小限となる。これらの改善された薬物動態を図１０に図示する。示されているように、開示されている主題に従うＡＢＴ−３０８を含む製剤をデリバリーした後、生物学的治療薬（モノクローナル抗体）の全身濃度は最小限となるのに対して、関節内濃度は１４日間維持される。更に、表３に示すように、滑液中の生物学的治療薬の濃度：生物学的治療薬の濃度の平均比は１００以上である。これらの薬物動態エンドポイントは図８Ａに図示されている非製剤化抗体に比して非常に有意な改善を表す。

２．生物学的治療薬の全身濃度：局所濃度の比
本明細書中に開示されている主題の目的は、架橋組成物を関節内スペースにデリバリーしてから約１日〜約９０日間関節内スペース中の生物学的治療薬の全身濃度：生物学的治療薬の局所濃度の比を１未満とすることである。開示されている主題のある好ましい実施形態では、生物学的治療薬の全身濃度：生物学的治療薬の局所濃度の比は０．１以下である。本発明で言及されている生物学的治療薬の「局所濃度」は生物学的治療薬をデリバリーした体内のスペース内の生物学的治療薬の濃度であり、生物学的治療薬の「全身濃度」はデリバリーした生体中の生物学的治療薬の平衡血清濃度である。

生物学的治療薬の局所濃度；生物学的治療薬の全身濃度の比は多くの要因により影響される。開示されている主題の製剤を投与する体内のスペースに従って、その比は血管新生の程度、細静脈または毛細血管の周囲の密度、リンパ管クリアランスの速度及び／または体内のスペースの流体ターンオーバーの速度に依存する。製剤をデリバリーする被験者の相対的大きさ、被験者の活動の相対レベル及び製剤をデリバリーするスペースの容積を含めた追加の要因もこの比に影響を与える。この比は更に生物学的治療薬の半減期により影響される。

非限定的に例示する目的で、開示されている主題に従う製剤をデリバリーするための体内の適当なスペースには硝子体内スペース、関節内スペース、腹腔内スペース、動脈内スペース、骨内スペース、洞腔または外分泌管が含まれる。非限定的に説明する目的で、開示されている主題に従う製剤を関節内スペースにデリバリーした後の生物学的治療薬の局所濃度：生物学的治療薬の全身濃度の比について言及する。

組成物を関節内スペースにデリバリーする実施形態に関して、１未満の生物学的治療薬の全身濃度：局所濃度の比は記載されている架橋組成物から生物学的治療薬を比較的ゆっくり、制御して溶離させることにより達成される。架橋組成物から溶離させた後、生物学的治療薬は関節内スペース中に一時的に保持され、ここで標的の抗原、受容体またはリガンドに結合し、または他の方法で相互作用し、または他の方法で所望の局所治療効果を達成し得る。幾つかの好ましい実施形態では、体循環に入る前に大部分の生物学的治療薬は排泄または不活化される。排泄は免疫媒介クリアランス、腎臓濾過、酵素分解または他の手段により起こり得る。

本明細書中に開示されている主題によれば、製剤を関節内スペースにデリバリーした後に生ずる生物学的治療薬の全身濃度：生物学的治療薬の局所濃度の比は約１〜０である。幾つかの好ましい実施形態では、前記比は０．１未満である。幾つかの好ましい実施形態では、前記比は約０．１〜約０．００１である。他の好ましい実施形態では、この比は約０．２〜約０．００２である。追加の好ましい実施形態では、この比は約０．５〜約０．００５である。表３、表４Ａ及び表４Ｂに示すように、約０．２〜約０．０１の比は開示されている主題に従うある架橋組成物製剤を関節内にデリバリーすることにより達成される。意義深いことに、この比は、非製剤化生物学的治療薬の投与から生ずる約５〜約７の比より約２５〜５００倍低い。類似の結果が表５及び表６に示されている。図１０を参照すると、滑液中の生物学的治療薬の濃度は以下の実施例７に記載されているようにモニタリング期間中血清中の生物学的治療薬の濃度より約２桁高い。以下の実施例８で検討するように、局所：血清濃度のこの比は開示されている主題に従う製剤をデリバリーしてから３０〜９０日間維持される。

開示されている主題に従う幾つかの実施形態では、１未満の生物学的治療薬の全身濃度：生物学的治療薬の局所濃度の比は架橋組成物を体内のスペースにデリバリーした後約１〜約９０日間与えられる。幾つかの好ましい実施形態では、１未満の比はデリバリーしてから約１〜約７日間与えられる。追加の実施形態では、１未満の比はデリバリーしてから約１〜約１４日間与えられる。開示されている主題に従う追加の好ましい実施形態では、１未満の比はデリバリーしてから約１４〜約３０日間与えられる。更に別の実施形態では、１未満の比はデリバリーしてから約３０〜約６０日間与えられる。更なる実施形態では、１未満の生物学的治療薬の全身濃度：生物学的治療薬の局所濃度の比は開示されている主題に従う架橋組成物を体内のスペースにデリバリーしてから約６０日〜約９０日間与えられる。追加の好ましい実施形態では、前記比は０．１未満である。

３．治療方法
上記した所望の制御的放出特性及び生じた１未満の生物学的治療薬の全身濃度：局所濃度の比の結果として、開示されている主題の重合（架橋）組成物は疾患の治療において特に有益である。広範囲の疾患が本明細書中に開示されている架橋組成物のデリバリーを含む方法により適切に治療され、疾患の中には非限定的に癌、眼の疾患、炎症、自己免疫疾患、創傷、骨折、感染性疾患または心血管疾患が含まれる。その方法は、生物学的治療薬及び複数の親水性ポリマー鎖を組み合わせて配合物を形成し、配合物を親水性ポリマー鎖のポリマー間重合を誘導するための活性化バッファーと混合して、可逆的に沈殿する生物学的治療薬を含む架橋組成物を形成し、架橋組成物をその必要がある患者に対して投与し、それにより疾患を治療することを含む。

開示されている主題に従う幾つかの実施形態では、腫瘍のような限局性癌を治療するための方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば腫瘍、腫瘍に供給する血管、または腫瘍近くの体内のスペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は血管新生阻害薬、例えば抗ＶＥＧＦ抗体である。

幾つかの実施形態では、黄斑変性のような眼の疾患の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合し、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成し、架橋組成物を例えば眼の硝子体内スペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は血管新生阻害薬、例えば抗ＶＥＧＦ抗体である。追加の非限定的実施形態では、炎症の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば炎症部位または炎症部位近くの体内のスペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は抗炎症性化合物、例えば炎症性サイトカインに結合し、中和する抗体である。幾つかの実施形態では、薬物は抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１３抗体または抗ＩＬ−１抗体である。

幾つかの実施形態では、関節リウマチのような自己免疫疾患の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば冒されている関節の関節内スペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は抗炎症性サイトカインを中和する抗体、例えば抗ＴＮＦ抗体である。

幾つかの実施形態では、変形性関節炎のような関節疾患の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば冒されている関節の関節内スペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は抗炎症性サイトカインを中和する抗体（例えば、抗ＴＮＦ抗体）、冒されている関節中の軟膏を分解するプロテアーゼを中和する抗体（例えば、抗マトリックスメタロプロテアーゼ１３抗体）である。

幾つかの実施形態では、創傷の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば創傷または創傷近くの体内のスペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は創傷治癒を促進し、瘢痕化を阻止し、または感染を予防するタンパク質である。

幾つかの実施形態では、骨折の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば骨折した骨、または骨折した骨の近くの体内のスペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は骨折治癒を促進するタンパク質である。

幾つかの実施形態では、感染の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば体の感染部位にデリバリーするステップを含む。感染はウイルス病原体、細菌病原体または真菌病原体により引き起こされ得る。更なる実施形態では、生物学的治療薬はウイルス、細菌または真菌病原体に対する抗体である。

幾つかの実施形態では、冠動脈疾患のような心血管疾患の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば体内のスペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は抗凝固剤、抗炎症剤または抗高脂血性タンパク質である。

更なる実施形態では、術後創傷癒着のような手術による瘢痕化の治療方法が提供される。手術は、例えば腸切除のような侵襲性、または例えば関節鏡下靱帯修復のような非侵襲性であり得る。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば手術部位にデリバリーするステップを含む。デリバリーは手術創を縫合する前または後に実施し得る。更なる実施形態では、生物学的治療薬は抗線維性タンパク質である。

更なる実施形態では、乾癬のような皮膚疾患の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば乾癬病変の近くの皮下スペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は抗炎症性または免疫調節性タンパク質である。

更なる実施形態では、子宮内膜症の治療方法が提供される。その方法は、製剤を混合するステップ、製剤を架橋して開示されている架橋組成物を形成するステップ、及び架橋組成物を例えば腹腔内スペースにデリバリーするステップを含む。更なる実施形態では、生物学的治療薬は抗エストロゲンタンパク質である。

ＩＶ．キット
開示されている主題の別の態様によれば、各種組合せで複数の親水性ポリマー鎖、生物学的治療薬、及び場合により活性化バッファー及び懸濁バッファー、並びに架橋組成物を体内のスペースにデリバリーするためのデリバリーデバイスを別々に含むキットが提供される。各種デリバリーデバイスが開示されている主題の製剤及び架橋組成物のために適している。非限定的に例示する目的で、シングルボア注射器、デュアルボア注射器、または混合ヘッドを有する多チャネルデリバリーデバイスを使用し得る。幾つかの実施形態では、製剤及び活性化バッファーを混合ヘッドを含む多チャネルデリバリーデバイスの別々のチャネルに用意する。追加の実施形態では、生物学的治療薬及び複数の親水性ポリマー鎖を投与の少し前に再構成するための架橋組成物として用意する。

幾つかの実施形態では、キットは（上記した）懸濁バッファー及び複数の親水性ポリマー鎖を含む第１溶液、及び（上記した）生物学的治療薬及び活性化バッファーを含む第２溶液を含み得る。他の非限定的実施形態では、生物学的治療薬、複数の親水性ポリマー鎖及び活性化バッファーを含む第１溶液を別々に含むキットが提供される。都合上、これらの成分をデュアルボア注射器または多チャネルデリバリーデバイスの別々のチャネル中に用意してもよい。

各種刊行物が本明細書中で引用されており、その内容は参照によりその全文を本明細書に組み入れる。

以下の特許請求の範囲に記載されている具体的実施形態に加えて、開示されている主題は以下の特許請求の範囲に記載されている及び上に開示した独立の要件の他の考えられる組合せを有する他の実施形態にも向けられる。従って、独立の特許請求の範囲及び上に開示されている具体的要件は、開示されている主題が他の考えられる組合せを有する他の実施形態に具体的に向けられているとも認識されるべきであるように開示されている主題の範囲内の他の方法で相互に組み合わされ得る。よって、開示されている主題の具体的実施形態の記載は例示及び説明の目的で提示されている。網羅的であるとも、開示されている主題をこれらの開示されている実施形態に限定するとも意図されない。

開示されている主題の趣旨または範囲を逸脱することなく開示されている主題の方法及びシステムに各種修飾及び変更を加え得ることは当業者に自明であろう。よって、開示されている主題は添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内の修飾及び変更を含むと意図される。

５．１ 実施例１
５％、６．３％、７．５％、１１．５％または２０％重量／容量比のＰＥＧ固体で１：１比でチオールまたはアクリレートで官能化した８アームＰＥＧ及びアダリムマブを含む製剤を示されているｐＨ８．０のリン酸活性化バッファーまたはｐＨ９．５の炭酸活性化バッファーと混合して、架橋組成物を形成した。ＰＥＧ固体に対する抗体充填量は、示されているように２０％、２７％、３２％または５０％であった。インビトロで１８日間及び２６日間インキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーを架橋組成物から放出された生物学的治療薬に対して実施して、凝集物及び断片の量に対する放出されたモノマーの量を調べた。高量（例えば、＞９０％）のモノマーは生物学的治療薬の良好な可逆的沈殿及び再可溶化を示している。図１１Ａ及び図１１Ｂに図示されているように、高量のモノマーが製剤の重合から１８日及び２６日後に架橋組成物から放出される。図１１Ａに示すように、ＮＨＳで官能化したＰＥＧが使用されている場合にはより高量の凝集物及び断片が生成される。

５重量％のＰＥＧ固体及び２０重量％のＰＥＧ固体を有する４アームＰＥＧ−アクリレート及び４アームＰＥＧ−チオールをｐＨ８のリン酸ナトリウムバッファーの溶液中で８ｍｇまたは０．８ｍｇの用量で凍結乾燥したアダリムマブ抗体を用いて製剤化した。５０μＬの製剤を健康なラット後肢の関節内スペースに注射した。群Ａ及びＣには２０％ ＰＥＧ固体から形成した架橋組成物を与え、群Ｂ及びＤには５％ ＰＥＧ固体で製剤化した架橋組成物を与え、群Ｅ及びＧには非製剤化ｍＡｂを投与した。群Ａ及びＢには８ｍｇ ｍＡｂを投与し、残りの群は０．８ｍｇ ｍＡｂを投与した。表７はＴＮＦ−α結合定量アッセイにより測定した抗体の血清暴露を示し、図１２はｍＡｂの濃度をデリバリー後最長１４日まで経時的に示す。架橋組成物を介するデリバリーはアダリムマブ血清濃度を大きく低下させた。図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃはラット後肢に注射後及びラット後肢から除去後の架橋組成物の写真である。

５．２ 実施例２
５０μｌのリン酸緩衝食塩液中の４．２５ｍｇの非製剤化アダリムマブ抗体を健康なラットの後肢の関節内スペースに投与した。アダリムマブの血清濃度及び滑液濃度を投与から２４時間にわたり定期的にモニターした。図８Ａ及び８Ｂに図示されているように、非製剤化抗体は滑液から迅速に取り除かれ、血清に入って、１２時間後低い滑液濃度及び高い全身暴露が生じた。投与から２時間後関節中に比較的高濃度の抗体が見られる。投与から約１０時間以内に滑液中の生物学的治療薬の局所濃度が約２桁低下し、生物学的治療薬の血清暴露は比較的高い。

５．３ 実施例３
１０％、１５％及び２０％重量／容量比の１：１比でチオールまたはアクリレートで官能化した８アームＰＥＧ、及び１：２５比の生物学的治療薬：ＰＥＧ固体のＡＢＴ−３０８を含む溶液を作成した。ポリマー鎖の分子量は１０ｋＤａであった。これらの溶液の半分を活性化バッファーと混合して、架橋組成物を形成した。溶液の半分はプレミックスした。プレミックスした溶液は懸濁バッファー中に溶解したＰＥＧ固体からなり、これを活性化バッファー中に溶解した生物学的治療薬と混合して、架橋組成物を形成した。架橋組成物をインビトロで観察し、インキュベーションの最初の４時間の間の生物学的治療薬の初期放出を調べた。図９Ａに示すように、プレミックスした架橋組成物からは平均６．８％の生物学的治療薬が放出され、プレミックスしていない２０％ ＰＥＧ架橋組成物からは平均７．９％が放出された。プレミックスした架橋組成物の場合３％くらいの生物学的治療薬の初期放出が観察された。図９Ｂは開示されている主題の１つの態様に従う例示的三相放出プロフィールを示す。図１４Ａ及び１４Ｂは実験からの全てのインビトロ放出を図示している。ＰＥＧ固体を１０％から１５％に増加させるとｍＡｂ放出率は低下するようである。

プレミックスした８アーム、４アーム及びブレンドした８アーム／４アームＰＥＧゲルの制御的放出プロフィールを評価した追加の長期間放出インビトロアッセイを行った。架橋組成物は、１：１比でチオールまたはアクリレートで官能化した８アームＰＥＧを１：２５比の生物学的治療薬：ＰＥＧ固体でＡＢＴ−３０８と混合することにより、１：１比でチオールまたはアクリレートで官能化した４アームＰＥＧを１：２５比の生物学的治療薬：ＰＥＧ固体でＡＢＴ−３０８と混合することにより、２５：７５、５０：５０または７５：２５の８アームＰＥＧ：４アームＰＥＧ比の８アームと４アームＰＥＧ製剤の混合物を混合することにより形成した。溶液中のＰＥＧの全重量／溶液比は１０％または１５％であった。図３Ａ及び図３Ｂに示すように、１０％ ＰＥＧ固体または１５％ ＰＥＧ固体で製剤化されていても全ての架橋組成物が生物学的治療薬の０〜３０日間の初期放出率、０〜３０日間の第２放出率及び０〜３０日間の第３放出率の三相放出プロフィールを示したことが観察された。第２放出率は第１放出率及び第３放出率よりも速かった。制御的放出の全期間は約４０日間〜約８０日間で異なった。表１は、５％以下のバースト効果、１０％未満の初期放出、３０日間以上の放出期間及び三相放出プロフィールをインビトロで確認した追加の実施形態を示す。図１５Ａ〜Ｅ及び図１６Ａ〜Ｅはそれぞれ図３Ａ及び図３Ｂに曲線を作成すべく平均化した個々の実験を示している。

上記実験を２０％ ＰＥＧ固体で繰り返した。プレミックスした８アーム、４アーム、及びブレンドした８アーム／４アームＰＥＧゲルの制御的放出プロフィールを評価する延長放出インビトロアッセイを行った。１：１比でチオールまたはアクリレートで官能化した８アームＰＥＧと１：２５の生物学的治療薬：ＰＥＧ固体比でＡＢＴ−３０８を混合することにより、１：１比でチオールまたはアクリレートで官能化した４アームＰＥＧを１：１２．５の生物学的治療薬：ＰＥＧ固体比でＡＢＴ−３０８と混合することにより、または２５：７５、５０：５０または７５：２５比の８アームＰＥＧ：４アームＰＥＧの８アームと４アームＰＥＧ製剤の混合物を混合することにより形成した。溶液中のＰＥＧの全重量／容量比は２０％であった。プレミックスした製剤及びプレミックスしていない製剤を研究した。図１７Ａ及び図１７Ｂに示すように、全ての架橋組成物が生物学的治療薬の０〜３０日間の初期放出、０〜３０日間の第２放出及び０〜３０日間の第３放出の三相放出プロフィールを示すことが観察された。第２放出率は第１放出率及び第３放出率よりも大きかった。制御的放出の全期間は約４０日間〜約８０日間で異なった。加えて、８アームＰＥＧの量が多くなると、完全ｍＡｂ放出と完全ゲル分解の間の遅れが増した。更に、プレミックスしていない架橋組成物がより大きなバースト効果を生じ得ることが観察された。

加えて、図１７Ｃに示すように、溶液中のＰＥＧの全重量／容量比が１２または２０％であり、８または３２μｇ／μｌの抗体を含有している８アームプレミックスしたまたはプレミックスしていないＰＥＧ製剤を用いて上記した実験を繰り返した。生物学的治療薬の三相放出が最長８５日まで観察された。架橋製剤の完全分解が１００日目までに起こった。上記したより大きいバースト放出が溶液中の全ＰＥＧ固体が多くなると観察された。

上記した製剤の架橋組成物の初期質量に対する質量の経時的増加により測定される膨潤比をプロットした。これらのグラフを図１８Ａ及び図１８Ｂに示す。表８に示すように、プレミックスしていない架橋組成物はプレミックスした架橋組成物よりも有意により多くの水を吸収する。

５．４ 実施例４
ｐＨ３．５の０．０５Ｍ リン酸懸濁バッファー中に溶解した１：１比でチオールまたはアクリレートで官能化した８アームＰＥＧを蛍光体で標記した０．１６ｍｇのＡＢＴ−３０８（モノクローナル抗体）と合わせ、ｐＨ９．０の０．２Ｍ 炭酸水素懸濁バッファー中に溶解した。合わせた溶液を注射器中に吸引し、注射器から射出させる（プランジングする）ことにより混合した。１０％ 全ＰＥＧ固体及び２０％ 全ＰＥＧ固体の両方の溶液を混合した。５、１５または３０回注射器プランジングし、この間に架橋反応が開始し、その後混合物を吸引し、架橋を完了近くまで進行させ、部分的に形成された架橋組成物を射出させた。架橋が完了したら、架橋組成物を位相差イメージング及び２０倍の倍率で蛍光イメージング下で観察した。実験を１０％ 全ＰＥＧ固体及び２０％ 全ＰＥＧ固体の４アームＰＥＧ溶液に対して繰り返した。驚くことに、４アームＰＥＧ固体混合物により製剤の全体にわたって非均一の沈殿物サイズ及び沈殿物の非均質分布が生ずることが観察された。更に、混合プランジングの回数と共に沈殿物サイズが大きくなり、３０回プランジングすることにより形成された混合物は大きくて粘った沈殿物及び不完全な沈殿物を示す。対照的に、８アームＰＥＧ固体混合物は５、１５または３０回プランジングすることにより混合したとき比較的均一な沈殿物サイズを呈した。プランジングの回数が増えると沈殿物サイズの増加が観察された。２０％ ＰＥＧ固体溶液は直径約１００ｎｍ〜１μｍのサイズの生物学的治療薬沈殿物を示した。これらの結果を図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ及び図６Ｄに図示する。図６Ａは１０％ ４アームＰＥＧ製剤を図示し、図６Ｂは１０％ ８アームＰＥＧ製剤を図示し、図６Ｃは２０％ ４アームＰＥＧ製剤を図示し、図６Ｄは２０％ ８アームＰＥＧ製剤を図示する。

５．５ 実施例５
１：１比でチオールまたはアクリレートで官能化した４アームＰＥＧの製剤を２７重量％ モノクローナル抗体（アダリムマブ）の充填量で７．９１容量％の濃度、または３２重量％ モノクローナル抗体（アダリムマブ）の充填量で６．２９容量％の濃度で用意した。製剤をｐＨ９．５の炭酸活性化バッファーと混合して、架橋組成物を形成した。プラスチック管中での高さの変化の％により観察される膨潤が放出された抗体の％と平行して観察された。図４Ａに図示されているように、架橋組成物の膨潤は放出された抗体の量に密接に対応している。ゲルの経時的膨潤を図１９に示す。

加えて、ＰＥＧ固体濃度、モノクローナル抗体充填量、溶液バッファー組成及び官能基の各種割合を有する４アームＰＥＧの製剤を架橋して、架橋組成物を形成した。架橋組成物をインビトロでインキュベートし、各種組成物について目視検査により調べた溶解までの時間を記録した。架橋組成物の成分及び対応する溶解時間を図４Ｂに図示する。

５．６ 実施例６
ｐＨ５．２の１５ｍＭ ヒスチジンバッファー中、またはバッファー中に再溶解される凍結乾燥形態の４アームＰＥＧ−Ａｃｒ／ＰＥＧ−ＳＨ及びアダリムマブの製剤をｐＨ８またはｐＨ１０の０．２Ｍ リン酸バッファーまたはｐＨ９．５及びｐＨ１０．５の０．２Ｍ 炭酸−炭酸水素バッファーと混合した。ゲルを滅菌遠心管中で形成し、ゲル化時間を自然流下に対する抵抗として目視検査することにより調べた。ゲル形成から１時間後に放出媒体（ＰＢＳ＋０．１ｗｔ％ トゥイーン８０及び０．０５ｗｔ％のナトリウムアジド，ｐＨ７．４）を添加し、６００ｕＬサンプルを特定の時間間隔で採取することにより抗体放出も経時的に調べた。サンプル容量を直ちに交換した。図２０及び図２１はそれぞれ示した架橋組成物のゲル化時間及び抗体放出を経時的に示す。結果は、幾つかの変数がゲル化時間及びｍＡｂ放出に影響を与えることを示している。

５．７ 実施例７
５群（群Ａ〜Ｅ）の９匹のルイスラット（３匹×３群に小分けする）に対してＡＢＴ−３０８モノクローナル抗体を後肢の関節内スペースに投与した。群Ａには、０．１６ｍｇの非製剤化凍結乾燥したｍＡｂを与えた。群Ｂには、ｐＨ３．５の０．０５Ｍ リン酸バッファー中に懸濁した８アームＰＥＧ−Ａｃｒ／ＳＨ中で製剤化し、ｐＨ９．０の０．２Ｍ リン酸バッファーと混合した０．１６ｍｇのｍＡｂを与えた。ＰＥＧは用意したバッファーに対して２０％重量／容量比で用意した。ＰＥＧの分子量は１０ｋＤａであり、ＰＥＧ−Ａｃｒ及びＰＥＧ−ＳＨは１：１比で組み合わせた。懸濁バッファー及び活性化バッファーは１：１比で用意した。群Ｃには、２０％ ８アームＰＥＧ−Ａｃｒ／ＳＨ中で製剤化した０．１６ｍｇのｍＡｂを与えた。ＰＥＧは使用したバッファーに対して２０％重量／容量比で使用した。ＰＥＧ及びｍＡｂをｐＨ７．５の０．２Ｍ リン酸バッファー中で混合した。ＰＥＧの分子量は１０ｋＤａであり、ＰＥＧ−Ａｃｒ及びＰＥＧ−ＳＨを１：１比で組み合わせた。群Ｄには、５０：５０比の４アーム及び８アームＰＥＧ中に用意したＰＥＧ−Ａｃｒ／ＳＨ中の０．１６ｍｇのｍＡｂを与えた。ＰＥＧは用意したバッファーに対して２０％重量／容量比で用意した。ＰＥＧの分子量は１０ｋＤａであり、ＰＥＧ−Ａｃｒ及びＰＥＧ−ＳＨは１：１比で組み合わせた。群Ｅには、２０％ ８アームＰＥＧ−Ａｃｒ／ＳＨ中で製剤化した０．３２ｍｇのｍＡｂを与えた。ＰＥＧは用意したバッファーに対して２０％重量／容量比で用意した。群Ａには１４日目に滑液洗浄を行い、群Ｂ〜Ｅには１、７及び１４日目に滑液洗浄を行った。図１０は群Ｃの１４日間にわたる抗体の血清及び滑液濃度を図示する。暴露期間にわたって比較的高い滑液濃度が維持され、血清暴露は最小限となった。各治療群についての滑液濃度、血清濃度及び滑液：血清濃度の比を表５に示す。各群についてのＡＵＣ暴露データを表７に示す。群及び時間ポイントによる平均滑液及び血清ｍＡｂ濃度を図２２に図示する。図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃ及び図２３Ｄはそれぞれ治療群Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥについての血清及び滑液濃度を示し、図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ及び図２４Ｅはそれぞれの研究群の個別の動物についての全身暴露及びＡＵＣ暴露データを示す。

５．８ 実施例８
５群（群Ａ〜Ｅ）の９匹のルイスラット（３匹×３群に小分けする）に対してＡＢＴ−３０８モノクローナル抗体を後肢の関節内スペースに投与した。群Ａには、０．１６ｍｇの非製剤化凍結乾燥したｍＡｂを与えた。群Ｂには、４アームＰＥＧ−Ａｃｒ／ＳＨ中で製剤化した０．１６ｍｇのｍＡｂを与えた。ＰＥＧは使用したバッファーに対して２０％重量／容量比で用意した。ＰＥＧの分子量は１０ｋＤａであり、ＰＥＧ−Ａｃｒ及びＰＥＧ−ＳＨは１：１比で組み合わせた。懸濁バッファー及び活性化バッファーは１：１比で用意した。群Ｃには、４アームＰＥＧ−Ａｃｒ／ＳＨ中で製剤化した０．１６ｍｇのｍＡｂを与えた。ＰＥＧは用意したバッファーに対して２０％重量／容量比で用意した。ＰＥＧ及びｍＡｂをｐＨ７．５の０．２Ｍ リン酸バッファー中で混合した。ＰＥＧの分子量は２ｋＤａであり、ＰＥＧ−Ａｃｒ及びＰＥＧ−ＳＨを１：１比で組み合わせた。群Ｄには、４アームＰＥＧ−Ａｃｒ／ＳＨ中で用意した０．１６ｍｇのｍＡｂを与えた。ＰＥＧは用意したバッファーに対して１０％重量／容量比で用意した。ＰＥＧの分子量は１０ｋＤａであり、ＰＥＧ−Ａｃｒ及びＰＥＧ−ＳＨは１：１比で組み合わせた。群Ｅには、８アームＰＥＧ−Ａｃｒ／ＳＨ中で製剤化した０．１６ｍｇのｍＡｂを与えた。ＰＥＧは用意したバッファーに対して２０％重量／容量比で用意した。群Ａには１４日目に滑液洗浄を行い、群Ｂ〜Ｅには１、７及び１４日目に滑液洗浄を行った。群毎の平均滑液及び血清ｍＡｂ濃度を図２５に図示し、表９は全群についての血清ＡＵＣ全量を示す。

本研究を３群で繰り返した。群Ａには０．１６ｍｇの非製剤化凍結乾燥したｍＡｂを与え、群Ｄには１０％ ８アームＰＥＧ−ＡＣ／ＳＨ（ｐＨ３．５の０．０５Ｍ クエン酸−リン酸バッファー中に懸濁し、ｐＨ９の０．２Ｍ 炭酸水素バッファーで架橋した）中の０．１６ｍｇのｍＡｂを与え、群Ｅには２０％ ８アームＰＥＧ−ＡＣ／ＳＨ（ｐＨ３．５の０．０５Ｍ クエン酸−リン酸バッファー中に懸濁し、ｐＨ９の０．２Ｍ 炭酸水素バッファーで架橋した）中の０．１６ｍｇのｍＡｂを与えた。群Ａは１４日目に抽出した滑液洗浄液サンプルを有しており、群Ｄ及びＥは１日目、７日目及び１４日目に抽出した滑液洗浄液サンプルを有していた。血清暴露及びＡＵＣ計算値を図２３に図示する。滑液暴露は表６に示す。各治療群についての結果を図２６Ａ及び図２６Ｂに図示する。各群の個々の動物についての結果を図２７Ａ〜Ｃに図示する。約０．１以下の全身：局所濃度の比が少なくとも６週間にわたり維持されていることを示す更なる実験データを図２８に示す。対応するＡＵＣデータを表１０に示す。

５．９ 実施例９
１００μｌの８、１６、２４及び３２μｇのＡＢＴ−３０８／μＬ組成物の充填量を有する２０％ ８アーム架橋組成物についてゲル時間及び沈殿物の均一性を評価した。プレミックスした製剤を０．２Ｍ ｐＨ７．５のリン酸バッファー中で混合し、プレミックスしていない製剤を０．０５Ｍ ｐＨ３．５のクエン酸−リン酸バッファー中で懸濁し、０．２Ｍ ｐＨ９．０の炭酸水素バッファーと混合した。平均ゲル化時間及び沈殿物の均一性を表１１に示す。

５．１０ 実施例１０
１００μｌの８μｇ／μＬ組成物の凍結乾燥したＡＢＴ−３０８または凍結した抗ＭＭＰ１３の充填量を有する２０％ ８アーム架橋組成物についてゲル化時間を評価した。プレミックスした製剤を０．２Ｍ ｐＨ７．５のリン酸バッファー中で混合し、プレミックスしていない製剤を０．０５Ｍ ｐＨ３．５のクエン酸−リン酸バッファー中で懸濁し、０．２Ｍ ｐＨ９．０の炭酸水素バッファーと混合した。プレミックスした溶液の場合、ｍＡｂをバッファー中でプレミックスし、架橋時にＰＥＧ固体と組み合わせるか、または架橋前にＰＥＧ固体中でプレミックスした。平均ゲル化時間を表１２に示す。

５．１１ 実施例１１
表４Ａ及び表４Ｂは、ラットにおいてＭＭＴ手術後に製剤化ｍＡｂを関節内投与した後、または非製剤化ｍＡｂを静脈内投与した後の全身及び滑液濃度の実験データを示す。ＭＭＴ手術は変形性関節炎の病態モデルとしてのルイスラットの３群（Ａ〜Ｃ）に対して０日目に実施した。５日目に、ラットに対して手術を実施した後肢の関節内スペースに製剤化抗ＭＭＰ１３またはＡＢＴ−３０８ ｍＡｂを注射し、または７００ｍｇ／ｋｇ体重の抗ＭＭＰ１３を静脈内注射した。製剤はプレミックスしたかまたはプレミックスしていなかった。７日目に、血清及び滑膜洗浄液サンプルを集めた。ＡＢＴ−３０８濃度を測定するために抗ＩＬ−１３ ＭＳＤアッセイを用いて、または抗ＭＭＰ１３濃度を測定するために抗ＭＭＰ１３ ＭＳＤアッセイを用いて抗体濃度を分析した。実験結果を表１２Ａ（プレミックスしていない製剤に関する）及び表１２Ｂ（プレミックスした製剤に関する）に示す。

５．１２ 実施例１２
インビトロｍＡｂ（アダリムマブ）放出を調べるために、１：１比のＰＥＧ−Ａｃｒ：ＰＥＧ−ＳＨを有する１００００ＭＷ ４アームＰＥＧ、４．８４％ 全ＰＥＧ固体及び５０％ ｍＡｂ充填量の製剤を滅菌遠心管中で形成した。放出後の抗体の完全性を、ゲル形成から１時間後に放出媒体（０．１ｗｔ％ トゥイーン８０及び０．０５ｗｔ％ ナトリウムアジドを有するＰＢＳ，ｐＨ７．４）を添加し、特定の時間間隔で６００ｕＬのサンプルを採取することにより調べた。ゲルは、目視検査で３７℃で１０秒未満に形成された。図２９及び表１３は放出されたモノクローナル抗体に対して実施したサイズ排除クロマトグラフィーの結果を図示している。架橋組成物から放出された抗体は断片及び凝集物に比して高量のモノマーを示し、再可溶化時の構造保存を示している。放出されたｍＡｂの濃度を９６ウェル石英プレートを用いてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ９６ウェルプレートリーダーを使用して２８０ｎｍでの吸光度により測定した。各サンプルの吸光度を各時点で標準ｍＡｂ曲線と比較し、プランク放出媒体吸光度に対して調節した。図３０は経時的に放出されたｍＡｂの平均濃度を図示し、図３１は経時的に放出された投与された初期ｍＡｂの平均パーセントを示す。

１：２５の抗ＭＭＰ１３抗体：ポリマー充填量比を有する２０％ ８アームＰＥＧ−ＳＨ／Ａｃｒの製剤を架橋し、インビトロでの累積ｍＡｂ放出の％をモニターした。放出されたモノクローナル抗体を集め、その完全性をサイズ排除クロマトグラフィーにより調べた。図３２はｍＡｂの累積放出を経時的に図示する。図３３は凝集物及び断片に比して高量のモノマーを示すサイズ排除クロマトグラフィー結果を表している。

５．１３ 実施例１３
０、５、１０、１５、２０、２５または３０重量％のＰＥＧ固体及び０ｍｇ、０．１６ｍｇまたは０．３２ｍｇのｍＡｂ（ＡＢＴ−３０８）から構成される８アームＰＥＧ−ＳＨ／Ａｃｒの製剤。製剤の全容量は２０μｌである。架橋製剤は目視検査のために透明なバイアル中で形成する。ｍＡｂなしの製剤はすべて透明であった。０．１６ｍｇの全ｍＡｂを含有している製剤では、２０％以下のＰＥＧの製剤は透明であり、２５％及び３０％製剤は目視検査により沈降している沈殿物を示した。０．３２ｍｇのｍＡｂを含有している製剤では、２０％のＰＥＧ製剤は懸濁した沈殿物を示し、２０％未満のＰＥＧを含有している製剤は透明であり、２５重量％のＰＥＧまたは３０重量％のＰＥＧを含有している製剤は浮遊したり、沈降している沈殿物を示す。これらの実験を図５に図示する。

５．１４ 実施例１４
１：１比のＰＥＧ−Ａｃｒ：ＰＥＧ−ＳＨを有する１００００ＭＷ ８アームの製剤を眼内注射用に作成した。表１４に示す組成を有する１２％重量／容量のＰＥＧ及び２０％重量／容量のＰＥＧの製剤を作成した。いずれの製剤にも生物学的治療薬を配合しなかった。

１つの注射器には８アームＰＥＧ−ＳＨの溶液を充填し、もう一方の注射器には８アームＰＥＧ−Ａｃの溶液を充填した２つの充填済み１ｍｌ注射器に雌型−雌型ルアーロックアダプターを取り付け、前後に手動でプランジングすることにより各製剤を５〜１０秒間プレミックスした後、３０ゲージの眼科用針及び深さ５ｍｍに即席に作った針ストップを有する１ｍｌ ベクトン・ディッキンソン注射器に吸引して、５０ｕｌの均一注射容量を得た。プレミックスし、吸引した後、６匹のニュージーランドホワイト家兔の眼の各々の硝子体内スペースに５０μｌの１２％重量／容量ＰＥＧ製剤または２０％重量／容量ＰＥＧ製剤を注射した。各注射は約５秒間かけた。ゲル化の前後に眼を観察し、その後水晶体及び網膜を観察し、形成されたヒドロゲルを抽出するために切開した。

各製剤は３０ゲージの眼科用針を用いて注射可能であった。注射後眼の大きな出っ張りが観察されず、各製剤をその場で硝子体内スペース内で架橋して、ゲルを形成した。ゲルは光学的に透明のままであり、ピンセットで掴んだり、操作するのに十分に堅かった。２０重量％ ＰＥＧの製剤ゲルは１２重量％ ＰＥＧの製剤ゲルよりも堅いことが観察された。ゲルの抽出時に眼組織の付着は観察されず、切開した眼の検査時に水晶体の破裂または網膜損傷は観察されなかった。ヒドロゲル製剤のゲル化時間を目視観察し、上記のように混合した製剤がもはや試験マイクロチューブ内を流れなくなるまでの期間を調整することによりインビトロで実験的に評価した。１２％製剤は約４５秒間でゲル化し、２０％製剤は約２３秒間でゲル化した。

Claims (30)

1. （ａ）生物学的治療薬、及び
   （ｂ）ポリマー間架橋することができる官能基を含む複数の親水性ポリマー鎖
   を含む製剤であって、製剤は架橋されると生物学的治療薬が可逆的に沈殿し、直径約５０ｎｍ〜約１０μｍのサイズを有する沈殿物となる、製剤。
2. 生物学的治療薬は、タンパク質である、請求項１に記載の製剤。
3. 生物学的治療薬は、抗体である、請求項２に記載の製剤。
4. 生物学的治療薬は、二重可変ドメイン抗体である、請求項２に記載の製剤。
5. 抗体は、トラスツズマブ（ハーセプチン（ＴＭ））、ベバシズマブ（アバスチン（ＴＭ））、アダリムマブ（ヒュミラ（ＴＭ））、ラニビズマブ（ルセンティス（ＴＭ））、アフリバーセプト（アイリーア（ＴＭ））、エタネルセプト（エンブレル（ＴＭ））、リツキシマブ（リツキサン（ＴＭ））、ペグフィルグラスチム（ニューラスタ（ＴＭ））、インターフェロンβ−１ａ（アボネックス（ＴＭ））、インターフェロンβ−１ａ（レビフ（ＴＭ））、インフリキシマブ（レミケード（ＴＭ））からなる群から選択される、請求項２に記載の製剤。
6. 抗体は、アダリムマブである、請求項４に記載の製剤。
7. 複数の親水性ポリマー鎖は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ヒアルロン酸、ペクチン、コラーゲン、フィブリノーゲン、アルギネート、ＰＬＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＬＡコポリマー、ＰＬＤＡ−ＰＥＧ−ＰＬＤＡコポリマー、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡコポリマー、ＰＥＧ−ＰＬＬＡコポリマー、ＰＥＧ−ＰＬＤＡコポリマー及びＰＥＧ−ＰＬＧＡコポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。
8. 複数の親水性ポリマー鎖は、アクリレート、チオール、ビニル、アミノ、ヒドロキシル、ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ_２、アルデヒド、ビニルスルホン、スクシンイミジル、ニトロフェノレート及びヒドロキシスクシンイミジルからなる群から選択される官能基を含む、請求項７に記載の製剤。
9. 複数の親水性ポリマー鎖の各親水性ポリマー鎖は、線状、分岐状、星形及び櫛形からなる群から選択される構造を有している、請求項８に記載の製剤。
10. 親水性ポリマー鎖の構造は、分岐状、星形または櫛形であり、２〜１６本のアームを有している、請求項９に記載の製剤。
11. 親水性ポリマー鎖の各々の分子量は、約２〜３０ｋＤａである、請求項１０に記載の製剤。
12. 複数の親水性ポリマー鎖は、第１タイプの親水性ポリマー及び第２タイプの親水性ポリマーを含む、請求項１１に記載の製剤。
13. 第１タイプの親水性ポリマー鎖は、ＰＥＧ−アクリレートであり、第２タイプの親水性ポリマー鎖は、ＰＥＧ−チオールである、請求項１２に記載の製剤。
14. 第１タイプの親水性ポリマー鎖は４、８または１６本のアームを有し、第２タイプの親水性ポリマー鎖は４、８または１６本のアームを有している、請求項１３に記載の製剤。
15. 親水性ポリマー鎖の各アームは、官能基を含む、請求項１４に記載の製剤。
16. 第１タイプの親水性ポリマー鎖：第２タイプの親水性ポリマー鎖の比は、９：１０〜約１０：９である、請求項１５に記載の製剤。
17. 第１タイプの親水性ポリマー鎖は８本のアームを有し、第２タイプの親水性ポリマー鎖は８本のアームを有している、請求項１５に記載の製剤。
18. 第１タイプの親水性ポリマー鎖は１６本のアームを有し、第２タイプの親水性ポリマー鎖は１６本のアームを有している、請求項１５に記載の製剤。
19. 第１タイプの親水性ポリマー鎖は８本のアームを有し、第２タイプの親水性ポリマー鎖は８本のアームを有しており、複数の親水性ポリマーは、更に４本のアームを有するＰＥＧ−アクリレートである第３タイプの親水性ポリマー鎖及び４本のアームを有するＰＥＧ−チオールである第４タイプの親水性ポリマー鎖を含む、請求項１５に記載の製剤。
20. 第１及び第２親水性ポリマー鎖：第３及び第４親水性ポリマー鎖の比は、１：９９〜９９：１である、請求項１９に記載の製剤。
21. 第１及び第２タイプの親水性ポリマー鎖：第３及び第４タイプの親水性ポリマーの比は、７５：２５、５０：５０、または２５：７５である、請求項２０に記載の製剤。
22. 製剤は、凍結乾燥形態で用意されている、請求項１５に記載の製剤。
23. 更に、バッファー溶液を含む、請求項２２に記載の製剤。
24. バッファー溶液は、約３．５〜約６のｐＨを有する、請求項２３に記載の製剤。
25. ＰＥＧ−アクリレート及びＰＥＧ−チオール：バッファーの重量／容量比は、約５％〜約３０％である、請求項２４に記載の製剤。
26. 生物学的治療薬：全親水性ポリマーの重量比は、約１：１〜約１：１２５である、請求項２５に記載の製剤。
27. （ａ）生物学的治療薬及び複数の親水性ポリマー鎖を含む、製剤、及び
    （ｂ）架橋を誘導するための活性化バッファー
    を含むキットであって、製剤は架橋されたとき
    （ｉ）患者の体内のスペースへの投与から２４時間で＜５％の累積生物学的治療薬放出のバースト効果；
    （ｉｉ）患者の体内のスペースへの投与から７日で＜１０％の累積生物学的治療薬放出の初期放出；
    （ｉｉｉ）患者の体内のスペースへの投与後の放出率が約０〜３０日間の第１相、約０〜３０日間の第２相及び約０〜３０日間の第３相の間ほぼ一定である三相放出プロフィール；
    （ｉｖ）生物学的治療薬を完全放出するための患者の体内のスペースへの投与から１〜３ヶ月の放出期間；
    を示す、キット。
28. 更に、活性化バッファーと混合した製剤をデリバリーするためのデリバリーデバイスを含み、デリバリーデバイスはシングルボア注射器、デュアルボア注射器、または混合ヘッドを含む多チャネルデリバリーデバイスから選択される、請求項２７に記載のキット。
29. （ａ）生物学的治療薬及び複数の親水性ポリマー鎖を含む製剤、
    （ｂ）架橋を誘導するための活性化バッファー
    を含むキットであって、製剤は架橋されると生物学的治療薬が可逆的に沈殿し、直径約５０ｎｍ〜約１０μｍのサイズを有する沈殿物となる、キット。
30. 更に、活性化バッファーと混合した製剤をデリバリーするためのデリバリーデバイスを含み、デリバリーデバイスはシングルボア注射器、デュアルボア注射器、または混合ヘッドを含む多チャネルデリバリーデバイスから選択される、請求項２９に記載のキット。

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