CN105007896A

CN105007896A - 包含抗体的治疗组合物

Info

Publication number: CN105007896A
Application number: CN201380068796.8A
Authority: CN
Inventors: M·特罗尔萨斯; J·斯坦库斯; 詹姆斯·苏; 赛义德·霍萨尼; 约书亚·T·史密斯; 沙地德·阿斯卡
Original assignee: Abbott Vascular Inc
Current assignee: Abbott Vascular Inc
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-12-27
Also published as: WO2014106116A3; JP2016504369A; US9452138B2; JP6533932B2; WO2014106116A2; CN105007896B; WO2014106116A8; US20140186446A1; US20170042816A1; EP2938323A2

Abstract

公开了制剂和方法，其提供了生物治疗剂向体内空间受控地、持续地释放。更具体地说，公开了包括多个亲水性聚合物链的制剂和制备以及施用此类制剂的方法。在一些实施方式中，制剂表现出生物治疗剂的突释、初始释放、三相释放和在30至90天内的释放。在一些实施方式中，制剂表现出生物治疗剂可逆沉淀成直径约50nm至约10μm的沉淀物。

Description

包含抗体的治疗组合物

背景技术

归因于无比的益处和功效，生物治疗剂是公知的且广泛用于处方中。然而，在高全身性浓度时，此类生物治疗剂可能涉及不期望的副作用。此外，可能需要反复疼痛地、昂贵地施用生物制剂，减少了某些益处和对患者和供应商的吸引力。因此，希望提供生物治疗剂递送的受控地、持续释放的制剂，以减少全身性暴露和给药频率，并改善生物治疗剂的安全性和患者的依从性。

骨关节炎是一个显著的对控释生物治疗剂的需求未得到满足的病理的实例。目前仅在美国就有超过3800万人受骨关节炎影响。骨关节炎是一种渐进性疾病，其特征在于关节疼痛、僵硬和运动范围受限，并且通常会影响手关节、脊柱关节、髋关节和膝关节。目前没有经FDA批准的用于骨关节炎中疾病缓解的药物。目前，骨关节炎疼痛由NSAID和阿片类药物处理。类似地，黄斑变性(其渐进性地损伤视力并导致失明)的治疗因需要反复的眼内注射而受到限制。如本文所公开的生物治疗剂的控释制剂提供了低的全身性暴露、低的最大局部和全身性浓度、频繁较低的剂量要求、更高的有效剂量和改善的依从性，代表了骨关节炎、黄斑变性和其它疾病治疗中的一个显著突破。

发明内容

所公开的主题的目的和优点将在以下描述中进行阐述和表现，并通过所公开的主题的实施而得以知悉。所公开的主题的其它优点将通过在本说明书和权利要求以及附图中所具体指出的方法和系统来实现并获得。

为了实现这些优点和其它优点，并且根据所公开的主题的目的(如所实施的和概括描述的)，所公开的主题包括用于受控地、持续释放生物治疗剂至体内空间的制剂、试剂盒和方法。根据所公开的主题，提供了包括生物治疗剂和多个亲水性聚合物链的制剂，其中每个所述聚合物链包括能进行聚合物间聚合(即交联)的官能团。所公开的主题的制剂的聚合提供了许多优点和独特的特征，这包括施用制剂至体内空间的24小时内生物治疗剂释放的“突释效应”；施用制剂至体内空间的7天内生物治疗剂的初始累积释放；三相释放曲线；以及施用至体内空间后1至3个月的释放持续期，以完全释放生物治疗剂。

根据所公开的主题的另一个方面，提供了用于提供来自体内空间的生物治疗剂的可逆沉淀的制剂。制剂包括生物治疗剂和多个亲水性聚合物链，每个所述的聚合物链包括能进行聚合物间聚合的官能团。通过多个亲水性聚合物链的聚合，交联的组合物表现出了生物治疗剂的可逆沉淀，其中沉淀剂包括直径约50nm至约10μm的沉淀物。

在所公开的主题的另一个方面中，提供了施用包括可逆沉淀的生物治疗剂的交联组合物的方法。方法包括将生物治疗剂与多个亲水性聚合物链组合以形成组合物，将组合物与活化缓冲液混合以诱导亲水性聚合物链的聚合物间聚合以形成包括可逆沉淀的生物治疗剂的交联组合物，并向有需要的患者施用交联组合物。在进一步的实施方式中，提供了治疗疾病的方法，其中疾病包括但不限于癌症、眼部疾病、炎症、自身免疫性疾病、创伤、骨折、传染性疾病或心血管疾病。

在所公开的主题的另一方面中，提供了制剂，该制剂用于在约1天至约90天之间产生比全身性循环中的生物治疗剂的浓度高约10至约10000倍的生物治疗剂的局部浓度。

附图说明

图1示出了所公开的主题的一个方面的示意图，其中通过交联多个亲水性聚合物链以形成可施用至体内空间的交联的组合物，从而形成生物治疗剂的受控地、持续释放的制剂。

图2示出了根据所公开的主题的一个方面的预混的制剂的示意图。

图3示出了生物治疗剂从交联的组合物的体外持续释放的动力学，其中交联的组合物包含4-臂、8-臂以及混合的4-臂和8-臂的亲水性聚合物链。

图4A示出了平行的交联组合物的溶胀以在体外释放单克隆抗体。图4B示出了体外各种交联组合物制剂的可见的溶解的时间。

图5阐明了在一些根据所公开的主题的制剂中，作为PEG固体浓度和生物治疗剂浓度的函数的可视的沉淀物形成和沉淀物沉降。

图6A示出了通过5、15和30个注射器刺入(plunges)生成10％的4-臂PEG固体交联组合物之后的可逆沉淀的荧光标记的单克隆抗体沉淀物。图6B示出了通过5、15和30个注射器刺入生成10％的8-臂PEG固体交联组合物之后的可逆沉淀的荧光标记的单克隆抗体沉淀物。图6C示出了通过5、15和30个注射器刺入生成20％的4-臂PEG固体交联组合物之后的可逆沉淀的荧光标记的单克隆抗体沉淀物。图6D示出了通过5、15和30个注射器刺入生成20％的8-臂PEG固体交联组合物之后的可逆沉淀的荧光标记的单克隆抗体沉淀物。

图7是在一些所公开的主题的制剂中形成的生物沉淀物的粒径分布的图示。

图8A示出了在向健康大鼠后肢的关节内空间给药后2、4、6、12和24小时的未配制的单克隆抗体的血清和滑液浓度。图8B以柱状图的形式提供了这一信息。

图9A示出了单克隆抗体从8-臂PEG-SH/PEG-Acr交联的组合物的体外释放动力学。图9B示出了根据所公开的主题的一个方面的示例性的三相释放曲线。

图10示出了在向健康大鼠后肢的关节内空间给药后14天经交联的水凝胶组合物递送的单克隆抗体的血清和滑液浓度。

图11A和图11B示出了如通过尺寸排阻色谱确定形成后18和26天时所指示的，从包括4-臂亲水性聚合物链的各种交联组合物体外释放的单克隆抗体的单体、聚集体和片段的比例。

图12示出了在施用根据所公开的主题的交联组合物后，血清mAb浓度与时间的曲线图。

图13A是注射后4小时的交联组合物在大鼠关节内空间的照片。图13B是注射后4小时的交联组合物在大鼠关节内空间的照片。图13C是向大鼠后肢关节内空间注射并切取的包含荧光标记的mAb的交联组合物的照片。

图14A和图14B是分别来自各种交联的预混和非预混的组合物的体外平均mAb释放随时间的曲线图。

图15A、图15B、图15C、图15D和图15E是mAb从对应于图14A所标绘的平均值的单个的交联组合物随时间的体外释放曲线图。

图16A、图16B、图16C、图16D和图16E是mAb从对应于图12B所标绘的平均值的单个的交联组合物随时间的体外释放曲线图。

图17A、图17B和图17C示出了另外的mAb从根据所公开的主题的各种交联组合物随时间的体外释放实验。

图18A和图18B示出了根据所公开的主题的各种交联组合物的溶胀比随时间的曲线图。

图19是根据所公开的主题的各种交联组合物的可视溶胀随时间的数码照片。

图20是根据所公开的主题的各种交联组合物的交联时间的图。

图21是mAb从根据所公开的主题的各种交联组合物随时间的体外释放曲线图。

图22是施用根据所公开的主题的交联组合物后或施用未配制的抗体后的mAb血清浓度的曲线图。

图23A、图23B、图23C和图23D是分别如图22所示的治疗组B、C、D和E中平均血清浓度随时间的曲线图。

图24A、图24B、图24C、图24D和图24E是分别如图22所示的治疗组A-E中的个体动物的血清浓度随时间的曲线图。

图25是施用根据所公开的主题的交联组合物后或施用未配制的抗体后的mAb血清浓度的曲线图。

图26A和图26B是分别如图24所示的治疗组D和E中血清浓度随时间的曲线图。

图27A、图27B和图27C是分别如图25所示的治疗组A、D和E中的个体动物的血清浓度随时间的曲线图。

图28是独立试验所选择的治疗组的血清和滑液暴露随时间的曲线图。

图29是从根据所公开的主题的交联组合物体外释放的mAb的尺寸排阻色谱数据。

图30是mAb从根据所公开的主题的交联组合物随时间的释放曲线图。

图31是标准化至所施用的mAb的初始浓度的mAb从根据所公开的主题的交联组合物释放的曲线图。

图32是mAb从根据所公开的主题的交联组合物随时间的释放曲线图。

图33是从根据所公开的主题的交联组合物释放的抗-MMP mAb的尺寸排阻色谱结果的图示。

具体实施方式

现在给出所公开的主题的实施方式的详细参考。在所公开的主题的制剂的具体实施方式的详细描述中描述了方法和试剂盒。

出了说明和示例而非限制的目的，示意性地在图1中示出了所公开的主题的制剂和相应的方法的示例性实施方式。如所示出的，本文所示的制剂包括可交联的聚合物(即能进行聚合物间聚合的亲水性聚合物链)以及生物治疗剂。当交联时，亲水性聚合物链形成三维网络，其中生物治疗剂被可逆地沉淀。生物治疗剂有效地困在交联的聚合物网络中，直至网络溶胀和降解，释放出生物治疗剂。出乎意料的是，发现在所公开的主题的制剂中，其中生物治疗剂在所述的交联组合物中被递送，生物治疗剂从聚合物网络中释放后复性，且复性的生物治疗剂保持了其治疗效力。还进一步意外地发现，所公开的主题的制剂可以提供生物治疗剂的高度期望的释放曲线，并且可以提供30至90天的受控三相释放。

根据所公开的主题的一个方面，提供了用于提供从体内空间受控释放生物治疗剂的制剂。制剂包含生物治疗剂和多个能进行聚合物间交联的亲水性聚合物链。制剂和相关的试剂盒可另外包含激活缓冲液、悬浮缓冲液和递送装置。这些将在下文依次说明。

I.制剂

1.生物治疗剂

根据本文所公开的主题，可以使用各种各样的生物治疗剂。出于说明而非限制的目的，此类生物治疗剂包括核酸和蛋白质。合适的核酸的示例性实例包括siRNA、反义寡核苷酸和DNA质粒，而示例性的合适的蛋白质包括生长因子、酶、细胞因子、肽激素、细胞因子诱捕(traps)和抗体。

用于本发明所述主题的合适的生长因子包括但不限于胰岛素样生长因子(包括IGF-1和IGF-2)、神经生长因子、血管内皮生长因子(包括VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、PIGF和其同种型)、血小板衍生的生长因子、粒细胞集落刺激因子、脑源性神经营养生长因子、转化生长因子(包括TGF-α和TGF-β)、促红细胞生成素和血管生成素。合适的肽激素包括但不限于：胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、胰高血糖素样肽2、促肾上腺皮质激素、人绒毛膜促性腺激素、吻素(kisspeptin)、促黄体激素、卵泡刺激素、瘦素、胆囊收缩素、生长激素释放肽、抗利尿激素、催产素、血管紧张素和血管紧张素II。

出于说明而非限制的目的，下文主要对抗体作出参考。所有的抗体，包括例如哺乳动物的、人源化的、嵌合的和全人的抗体，都适用于所公开的制剂和相应的方法和试剂盒。合适的抗体的非限制性实例包括抗肿瘤坏死因子(TNF)抗体、抗-白介素(IL-)13抗体、抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体、抗-基质金属蛋白酶13抗体和抗-IL-1抗体。双重可变结构域抗体也适用于所公开的主题。合适的抗-TNF抗体包括但不限于阿达木单抗(adalimumab)。合适的抗-IL-13抗体包括但不限于ABT-308。适用于本发明所公开的主题的具体的抗体包括但不限于，曲妥珠单抗(trastuzumab)(Herceptin^TM)、贝伐单抗(bevacizumab)(Avastin^TM)、阿达木单抗(adalimumab)(Humira^TM)、兰尼单抗(ranibizumab)(Lucentis^TM)、阿柏西普(aflibercept)(Eylea^TM)、依那西普(etanercept)(Enbrel^TM)、利妥昔单抗(rituximab)(Rituxan^TM)、培非司亭(pegfilgrastim)(Neulasta^TM)、干扰素β-1a(Avonex^TM)、干扰素β1-a(Rebif^TM)和英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade^TM)。

根据所公开的主题的一个方面，意外地发现，在本文所公开的制剂和相应的试剂盒和方法中使用时，肽生物治疗剂(如抗体和其它蛋白质)经历了可逆沉淀。尽管高浓度的一种亲水性聚合物-聚乙二醇(以下简称为“PEG”)已被证明能引起蛋白质沉淀，本文证明了所公开的制剂的肽生物治疗剂在重新溶解后出乎意料地保留了其结构和功能。所述结构和功能的保留使得能进行高度渴望的延长释放而不存在三级和四级蛋白结构降解。在使用抗体作为所公开的主题的生物治疗剂时，生物治疗剂的抗原结合被保留，同时生物治疗剂的释放持续1至90天。

根据所公开的主题的另一个方面，已确定在所公开的主题的某些实施方式中，生物治疗剂形成直径约100nm至约1μm的沉淀物。直径在25nm至约10μm范围内的沉淀物与所需的药物动力学性能有关(如下文所述)。

2.亲水性聚合物

根据所公开的主题的另一方面，提供了多个亲水性聚合物链，其每个都能进行聚合物链间聚合，即与其它亲水性聚合物链交联。在某些实施方式中，亲水性聚合物链包括能与其它亲水性聚合物链所提供的官能团相交联的官能团。

能进行聚合物间聚合的亲水性聚合物链包括但不限于聚乙二醇(PEG)、透明质酸、葡聚糖、果胶、胶原、纤维蛋白原、藻酸盐、PLLA-PEG-PLLA共聚物；PLDA-PEG-PLDA共聚物、PLGA-PEG-PLGA共聚物、PEG-PLLA共聚物、PEG-PLDA共聚物和PEG-PLGA共聚物。合适的官能团包括但不限于硫醇基团、乙烯基、氨基、醛基团、乙烯砜基团、琥珀酰亚胺基、羟基琥珀酰亚胺基、硝基苯酚基团和碳酰肼部分。

出于说明而非限制的目的，下文对包括多个PEG聚合物链的制剂以及相关的方法和试剂盒作出了参考。PEG是具有(OCH₂CH₂)亚基的重复结构的合成的聚合物。此外，适用于所公开的主题的PEG聚合物链可以包括至少一种能进行聚合物链间聚合的官能团。因此，所公开的主题的合适PEG聚合物链包括但不限于PEG-硫醇基团、PEG-乙烯基、PEG-氨基、PEG-醛基团、PEG-乙烯砜基团、PEG-琥珀酰亚胺基、PEG-羟基琥珀酰亚胺基、PEG-硝酚基团和PEG-碳酰肼基团聚合物。仅出于说明的目的，亲水性聚合物链可以是分子量在2至30千道尔顿之间的聚乙二醇分子。

此外，适用于所公开的制剂的PEG聚合物链在进行聚合物间聚合之前，可在每个聚合物链分子中包括多于一个的官能团。此类PEG聚合物链在本文中被称为“多官能的”。适用于所公开的制剂的PEG聚合物包括但不限于线性PEG、2-臂PEG、3-臂PEG、4-臂PEG、6-臂PEG、8-臂PEG和16-臂PEG。多官能的PEG聚合物链可以各种不同的结构构象提供。适用于所公开的制剂的聚合物的结构的实例包括但不限于线性、分支、星形和梳状构象。在所公开的主题的一些实施方式中，亲水性聚合物链的每个臂均包括如图1所示的官能团。在一些根据所公开的主题的一些实施方式中，在多官能的PEG聚合物链上所提供的所有官能度都将由相同的官能团组成。

根据本文所公开的主题的一些实施方式，多个亲水性聚合物链包含多于一种类型的PEG聚合物。如本文所公开的，一种类型的PEG聚合物是指具有相同数量的臂(如4-臂、8-臂或16-臂)和相同的官能团(如硫醇基团或丙烯酸基团)的多个PEG聚合物链。根据所公开的主题，多个亲水性聚合物链可包含至少两种类型的PEG聚合物，且两种类型的官能度之和(即m+n之和，其中m表示在第一种类型的PEG聚合物上的官能度的数量，n表示在第二种类型的PEG聚合物上的官能度的数量)是在2至32之间(即2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22或23或24或25或26或27或28或29或30或31或32)。

在一些实施方式中，多个亲水性聚合物链包括两种类型的PEG聚合物。在一些此类实施方式中，第一种类型的PEG聚合物是具有4条臂的PEG丙烯酸酯(acrylate)，第二种类型的PEG聚合物是具有4条臂的PEG硫醇(thiol)。在进一步的此类实施方式中，第一种类型的PEG聚合物是具有8条臂的PEG丙烯酸酯，第二种类型的PEG聚合物是具有8条臂的PEG硫醇。在更进一步的实施方式中，第一种类型的PEG聚合物是具有16条臂的PEG丙烯酸酯，第二种类型的PEG聚合物是具有16条臂的PEG硫醇。这些类型可以以1：1的比例提供。然而，在根据所公开的主题的其它实施方式中，第一种类型的PEG聚合物与第二种类型的PEG聚合物的比例在约1：10至约10：1之间。

在进一步的实施方式中，多个PEG聚合物链可包括4种类型的PEG聚合物。在一些此类实施方式中，第一种和第二种类型的PEG聚合物将具有相同数量的官能度，且第三种和第四种类型的PEG聚合物也将具有相同数量的官能度，其可以与第一种和第二种类型的PEG聚合物上的官能度数量不同。在进一步的第一种和第二种类型的PEG聚合物上的官能度数量不同于第三种和第四种类型的PEG聚合物上的官能度数量的实施方式中，第一种和第二种类型的PEG聚合物相对于第三种和第四种类型的PEG聚合物的比例可以调整。出于说明而非限制的目的，第一种和第二种类型的聚合物与第三种和第四种类型的聚合物的比例可以是50：50、25：75或者75：25。如下文所述，通过调整存在的聚合物链的类型的比例，可以修改制剂的受控释放特性。

根据所公开的主题的一个方面，令人预想不到地示出了在亲水性聚合物链上的某些官能度与可逆沉淀后再溶解的生物治疗剂的结构和功能的改善的保护相关。可以基于生物治疗剂的暴露于溶剂的残基以及任何对生物治疗剂的翻译后修饰来选择官能度。出于说明而非限制的目的，本文对硫醇官能度和丙烯酸酯官能度作出参考，其与所期望的受控释放性质以及如下所述的与选择的生物治疗剂的最小相互作用相关。

在所公开的主题的一些实施方式中，生物治疗剂与亲水性聚合物的重量比是在约1：1至1：125之间。在某些优选的实施方式中，生物治疗剂与亲水性聚合物的重量比是在1：3.75至1：25之间。如下文所述，已经出乎意料地证实了可以根据所期望的受控释放曲线来调整这一重量比。

3.悬浮缓冲液

在所公开的主题的一些实施方式中，可以在悬浮缓冲液溶液中提供生物治疗剂和多个亲水性聚合物链。此类悬浮缓冲液溶液的pH可以为约3.5至约6，且其可以包括但不限于组氨酸、柠檬酸盐和/或磷酸盐。另外的候选缓冲液包括琥珀酸盐、乙酸盐、tris和碳酸盐。在一些示例性实施方式中，悬浮缓冲液可以包括15mM的组氨酸(pH 5.2)或0.05摩尔的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 3.5)。摩尔浓度在0.05M至3M之间的缓冲液适用于所公开的主题的各种实施方式。悬浮缓冲液将悬浮并保留聚合物和生物治疗剂，直至进行聚合物间聚合。或者，在一些实施方式中，亲水性聚合物链、生物治疗剂或者亲水性聚合物链和生物治疗剂两者都可以以冻干的形式提供。

4.悬浮缓冲液添加剂

在根据所公开的主题的某些实施方式中，提供了可以包括一种或多种添加剂的悬浮缓冲液。通过说明而非限制的方式，此类添加剂可以包括盐、糖、多元醇、氨基酸、防腐剂和/或另外的化合物。用于悬浮缓冲液的盐包括但不限于氯化钠、氯化钙和氯化镁。用于悬浮缓冲液的糖包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖和葡萄糖。用于悬浮缓冲液的多元醇包括但不限于山梨醇、甘露醇和甘油。用于悬浮缓冲液的候选氨基酸包括组氨酸、精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸和精氨酸混合物。在某些实施方式中，白蛋白和重组白蛋白也可以用于悬浮缓冲液。用于所公开的主题的悬浮缓冲液的合适的防腐剂包括但不限于间甲酚、苄醇和苯酚。还可以使用聚山梨酯如Tween 80和Tween 20，还可以使用表面活性剂如SDS、Brij 35和Triton X-10。还可以在所公开的主题的悬浮缓冲液中使用多糖如葡聚糖、螯合剂如EDTA、泊洛沙姆如普朗尼克F-68和F-127、聚乙烯吡咯烷酮、烷基糖类和纤维素。此外，低分子量的PEG，即分子量低于4000的PEG也可以作为悬浮缓冲液添加剂使用。

5.激活缓冲液

在所公开的主题的一些实施方式中，还提供了激活缓冲液。如本文所指，激活缓冲液是催化多个亲水性聚合物链的聚合物间聚合的溶液。出于说明而非限制的目的，激活缓冲液可以是碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。在一些实施方式中，激活缓冲液的pH在7至10.5之间。

根据所公开的主题的一个方面，亲水性聚合物链的聚合物间聚合或交联将发生于一个亲水性聚合物链上提供的官能团和另一个亲水性聚合物链上提供的官能团之间。在提供了具有不同官能度的2种或更多种类型的亲水性聚合物链且一个官能度是亲电子的另一个官能度是亲核的的一些实施方式中，通过本领域技术人员所公知的迈克尔加成反应发生交联。例如，在碱性激活溶液中将用硫醇官能化的聚合物链和用丙烯酸酯官能化的聚合物混合将导致亲核的硫醇基团的去质子化并随后捐赠电子给亲电子的丙烯酸酯部分，以导致形成聚合物间硫醚酯键。其它的合适的PEG交联反应公开于美国专利7,732,190号和美国专利申请公开2009/0226519号中，其通过引用以其整体并入本文。

根据所公开的主题的另一个方面，如下文所述，可以选择激活缓冲液以优化制剂的受控释放特性并且优化再溶解时生物治疗剂的功能的保留。已令人惊奇地证明了，可以选择激活缓冲液的pH以使生物治疗剂的暴露于溶剂的残基和存在于亲水性聚合物链上的官能度的交联最小化。特别地，通过选择pH稍微高于生物治疗剂的等电点(下文称为“pI”)的缓冲液，使得在将亲水性聚合物链和生物治疗剂与激活缓冲液混合以催化聚合物间聚合的过程中保留了生物治疗剂的结构和功能。

在一些实施方式中，用亲核官能团官能化的PEG聚合物链的子集与用亲电子官能团官能化的PEG聚合物链的另一个子集通过迈克尔类型的反应(这是本领域技术人员所公知的)形成共价键。合适的亲核官能团包括但不限于硫醇基团、氨基、羟基和CO-NH-NH₂基团。合适的亲电子官能团包括但不限于丙烯酸酯基团、乙烯砜基团和N-羟基琥珀酰亚胺基团。碱性激活缓冲液可通过亲核官能团的去质子来催化聚合物间聚合以加快迈克尔类型的加成反应。

在所公开的主题的一些实施方式中，PEG聚合物链与激活缓冲液溶液的重量与体积的百分比是在激活缓冲液溶液体积的5％至30％之间。如下文所述，已令人预想不到地证明了可以根据所期望的受控释放曲线调整这一重量与体积之比。

II.交联的组合物

根据所公开的主题的另一个方面，生物治疗剂与亲水性聚合物链结合并且亲水性聚合物链被交联，以形成具有上文所讨论的所期望的释放特性的交联组合物。根据所公开的主题的一个方面，在存在激活缓冲液的情况下混合制剂以催化亲水性聚合物链的跨聚合物聚合(即交联)，从而形成在其孔隙空间中包含生物治疗剂的交联组合物。

根据所公开的主题的一个非限制性方面，进行3个基本步骤以递送所公开的主题的交联组合物。生物治疗剂与亲水性聚合物链组合，亲水性聚合物链被交联(例如通过与激活缓冲液混合)以及将交联的组合物递送至体内空间中。在一些实施方式中，可提供在溶液中的生物治疗剂和亲水性聚合物链。或者，可以在递送至体内空间之前提供用于再悬浮的冻干形式的生物治疗剂和亲水性聚合物链。在一些实施方式中，可以在施用至体内空间之前的短时间内将生物治疗剂和亲水性聚合物链与激活缓冲液混合以交联亲水性聚合物链。或者，可在递送之前进行混合，并在递送之前将所得的包括生物治疗剂的交联的组合物研磨并冻干以用于再悬浮。后面的实施方式的这样的交联组合物可被称为“预混的”。在图2中提供了预混制剂的一个非限制性示意图。

在所公开的主题的一些实施方式中，提供了在溶液中的包括生物治疗剂和亲水性聚合物链的制剂。制剂溶液与碱性激活缓冲液混合以催化聚合物间聚合。在一些实施方式中，用亲核官能团官能化的PEG聚合物链的子集与用亲电子官能团官能化的PEG聚合物链的另一子集通过迈克尔类型的反应(其是本领域技术人员所公知的)形成共价键。合适的亲核官能团包括但不限于硫醇基团、氨基、羟基和CO-NH-NH₂基团。合适的亲电子官能团包括但不限于丙烯酸酯基团、乙烯砜基团和N-羟基琥珀酰亚胺基团。碱性激活缓冲液可通过亲核官能团的去质子化来催化聚合物链交联以加快迈克尔类型的加成反应。

根据所公开的主题的一些实施方式，聚合物链交联于离体条件下起始并于体内进行至完成，即在制剂所递送的体内空间中。在聚合物间聚合(交联)开始后，施用混合物至体内空间，在此空间内完成交联反应以形成交联的组合物。在另外的实施方式中，可以形成仍可被注射器挤出的低度交联的PEG并随后与生物治疗剂混合。随后，可以通过与第二种激活缓冲液混合来实现进一步的交联。以这种方式混合将使得生物治疗剂和PEG聚合物链上的功能团之间的接触时间最小，并且碱性激活缓冲液使得生物治疗剂的负载更大，并且进一步使生物治疗剂的活性的保留提高了。

根据所公开的主题的一些方面，通过注射器混合将溶液中的制剂与激活缓冲液混合。在此方面，已令人惊奇地证明了，在某些非限制性实施方式中，注射器混合的具体程度与所期望的沉淀物尺寸和释放曲线相关。例如并且如图6所示，在一些实施方式中，通常使用在约3秒至约10秒的恒定柱塞冲程(consistent plunger strokes)(例如约5至15的柱塞冲程)的注射器混合将导致所期望的沉淀物尺寸和均匀性，而混合更长时间(例如30或更多柱塞冲程)与大的粘性沉淀物以及损失生物治疗剂相关。各种合适的注射器都可用于混合，这包括用母对母Luer配件相连接的1ml Becton Dickinson注射器。通过提供了大致等量的总剪切力和大致等量的制剂暴露于剪切力的时间的混合方法获得了类似的结果。在一些实施方式中，直径在50nm至10μm范围内的生物治疗剂沉淀物与上述所期望的再溶解和释放曲线相关。在一些实施方式中，提供了尺寸高达250μm的生物治疗剂沉淀物。在一些实施方式中，通过涡旋或重复翻转制剂和激活缓冲液的混合物进行混合。

根据所公开的主题的另一方面，在存在生物治疗剂的情况下，通过多个亲水性聚合物链的聚合物间聚合，将形成交联的组合物。根据所公开的主题，在交联后可以选择多个亲水性聚合物链以优化交联的组合物的特性。例如，交联的组合物的交联密度将受聚合物链的分子量、胶凝反应的持续时间(即“胶凝时间”)、PEG臂的数量、PEG聚合物链上存在的官能团和在聚合物间交联前溶液中的PEG固体的浓度影响。悬浮缓冲液的pH、悬浮缓冲液的添加剂和用于催化聚合物间交联的激活缓冲液也将影响胶凝时间、交联密度和所获得的生物治疗剂的沉淀物尺寸。通常，交联密度将随着更低分子量的聚合物、每亲水性聚合物链中更高比例的PEG臂、溶液中更高浓度的PEG固体和更高的激活缓冲液pH而增加。交联的组合物的交联密度将是其与生物治疗剂相关的释放曲线的决定因素。

通过举例的方式，并如图3A和图3B中所示，改变4-臂PEG与8-臂PEG的比例和改变制剂的PEG固体的重量与体积比将改变交联的组合物的受控释放曲线。如所示，每个交联的组合物提供了所期望的受控释放和持续时间，但可以根据生物治疗剂、适应症、递送部位和其它考虑因素优化此类释放。此外，如实施例13所讨论并如图5所示，通过调整亲水性聚合物的重量百分比和生物治疗剂与亲水性聚合物的重量比，生物治疗剂的沉淀物的尺寸将得以调整，并具有对交联的制剂的释放曲线的伴随影响。

已令人惊奇地发现，在存在PEG的情况下，通过在蛋白沉淀之时或之后交联PEG聚合物链到交联的组合物网络中，蛋白质得以保护，未受其与PEG聚合物链的官能团的共价相互作用的影响，并且在再溶解之后保持了其生物活性。此外，通过提供用于交联催化的激活缓冲液，使得在PEG聚合物链之间实现相对快速的交联，从而使蛋白的反应性的暴露于溶剂的残基(包括例如胺基)与PEG聚合物的交联官能度(包括例如丙烯酸酯基团)反应的机会最小化。此外，可以选择PEG聚合物链的交联官能度以使蛋白的暴露于溶剂的残基的共价修饰最小化。例如，当蛋白质的特征为高比例的不参与二硫键键合的半胱氨酸残基，具有交联官能度如胺基的PEG聚合物链可优于具有交联官能度如硫醇基团的PEG聚合物链，以最小化在生物治疗剂和PEG聚合物链之间二硫键的形成。

亲水性聚合物链交联后，所得到的交联的组合物将吸收水。当交联的组合物吸收水时，其会溶胀且其体积也会增大。当交联的组合物的体积增大时，沉淀的生物治疗剂会再溶解并扩散出聚合物的基质。此外，水会水解交联的组合物的组分聚合物之间的硫醚酯键，导致进一步释放生物治疗剂。进一步，生物治疗剂可以降低平衡水的吸收，从而进一步阻止交联的组合物的显著溶胀。所形成的交联的组合物可以具有互相贯通的或半互相贯通的网络结构。

除了交联的组合物的释放曲线，也可以优化组合物的另外的参数以适合于递送至体内空间如关节内空间。例如，可以考虑交联的组合物的粘弹性和弹性系数以最大化患者的舒适性。交联的组合物的最终最大体积(这将取决于其在体内的溶胀比)将限制可被递送到体内空间中的制剂的总量。此外，由于所形成的聚合物组合物由亲水性聚合物链组成，其在体内是可再吸收的，这允许将交联的组合物重复施用至体内的同一空间中。

图4A示出了交联的组合物的溶胀和生物治疗剂释放之间的关系。从并行曲线中显而易见的是，溶胀和生物治疗剂的释放平行发生。此外，图4B提供了时间与在体外的各种交联组合物的可见溶解。如所讨论，可以调整多个变量以实现所期望的交联的组合物的所期望的溶解速率。

2.生物治疗剂沉淀物的尺寸和同质性

根据本文所公开的主题，具有亲水性聚合物的生物治疗剂的制剂在交联的亲水性聚合物基质中产生了生物治疗剂的沉淀物。这些沉淀物在从聚合物基质扩散并再溶解后令人惊奇地保留了它们的结构和功能。基于所使用的具体的制剂、混合力度和持续时间、所选择的生物治疗剂、悬浮液和激活缓冲液的pH和其它变量，沉淀物的尺寸将会变化。例如，并如图5所示，增加PEG固体的比例和生物治疗剂的浓度与较大的沉淀物尺寸相关。在25％的PEG固体和以上，也观察到生物治疗剂的沉降。

此外，如图6A-D所示，混合的程度也将影响产生的生物治疗剂沉淀物的尺寸。如所示，通过5至15柱塞冲程的混合与较小的沉淀物相关，而用30柱塞冲程的混合与较大的、较粘的沉淀物相关。当在一些实施方式中优选的沉淀物尺寸在50nm至10μm之间时，可以形成高达250μm的沉淀物尺寸。沉淀物尺寸的偏好将主要取决于生物治疗剂，这包括其适应症、其效价和其药物代谢动力学。较大的沉淀物通常与局部的以及较少程度上的全身浓度的波峰和波谷相关，相对于较小且较均匀的沉淀物。

如由图6A-D进一步地所示，沉淀物的同质性还受混合程度以及亲水性聚合物链的组成影响。如图6B(10％PEG固体)和图6D(20％PEG固体)所示，形成比4-臂PEG更致密的交联的亲水性链网络8-臂PEG通常与比如图6A(10％PEG固体)和图6C(20％PEG固体)所示的4-臂PEG更大程度的沉淀物尺寸和分布的均匀度相关。

出于说明的目的，图7提供了通过制剂并根据如下述实施例4所述的方案可以实现的沉淀物尺寸。使用来自Nanosight的Nanoparticle TrackingAnalysis Version 2.2Build 0366测定沉淀物尺寸。提供了直径为约50nm至约400nm的生物治疗剂沉淀物。如所示，沉淀物的尺寸具有一般的高斯分布。在进一步的实施方式中，提供了直径为约50nm至约10μm的生物治疗剂沉淀物。在更进一步的实施方式中，提供了直径为约10μm至约250μm的生物治疗剂沉淀物。

III.交联的组合物的用途

1.受控释放

所公开的主题的交联的组合物适用于递送到体内的各种空间，这包括头和器官的窦腔(sinus cavity)、长骨的髓质、胸内和腹膜内空间、血管内腔、外分泌导管、眼内(例如玻璃体内)空间和关节内空间。出于说明而非限制的目的，在下文中对根据本文所公开的主题的交联的组合物递送至体内关节内空间或眼内空间作出参考。从关节内空间到血浆的滑液流通是相对迅速的。其结果是，可溶性生物治疗剂递送至关节内空间并不能有效地使关节内浓度最大化且使全身浓度最小化，尤其是对具有相对长的半衰期的治疗剂。这种现象示于图8A和图8B中。如所示，在t₀时将未配制的(即封装的非聚合物基质)单克隆抗体注入关节内空间并监测关节内浓度和全身浓度。在12小时内，抗体的局部(关节内)浓度减少了两个数量级，降至与在血浆中发现的大致相同的浓度，此时全身性暴露未被控制。玻璃体内的流体流通也是相当高的，而且更重要地，眼部被血眼屏障隔离出全身循环，这抑制了药物全身递送至眼部。

相比之下，并与所公开的主题的一个方面一致，本文所公开的制剂表现出了在生物治疗剂的局部递送上十分有利的释放曲线。出于说明而非限制的目的，此类释放曲线可以由“突释”(burst)表征或由24小时内通过施用交联的组合物至体内空间所递送的一定比例的总生物治疗剂的相对快速的释放表征。这样的“突释效应”示于图9A，其示出了生物治疗剂的短期释放是受控的。该减少了的突释效应降低了全身暴露。具体实施方式的释放曲线可以进一步由给药头七天内所施用的总生物治疗剂的最大比例的初始释放所表征。在进一步的实施方式中，释放曲线可以由生物治疗剂从交联的组合物基质释放到体内空间中的延长的持续时间所表征。

在所公开的主题的另外的实施方式中，释放曲线是三相的，其具有在约0至30天之间的第一期间的第一释放速率，在约0至30天的第二期间的第二释放速率，以及在约0至30天的第三期间的第三释放速率。在一些优选的实施方式中，三相释放曲线中的至少一个相将呈现近似线性或零级释放动力学，即生物治疗剂的释放速率在相的持续期间是大致相同的。根据所公开的主题的一个方面的三相释放曲线示于图9B。如所示，三相释放曲线提供了持续30至90天的稳定且延长的生物治疗剂的释放。如下所讨论地，此类释放曲线导致了生物治疗剂的较高的局部浓度并降低了全身浓度(相对于施用未配制的生物治疗剂)。表1提供了提供所述释放曲线的示例性制剂的非限制性列表，其提供了如本文所公开的交联的组分的各种组分的详细说明。在一些非限制性实施方式中，获得了根据表2的药物代谢动力学结果。

如本文所公开的，“突释效应”是指在施用交联的组合物后第一个24小时内从交联的组合物释放到体内空间的生物治疗剂的比例。出于说明而非限制的目的，突释效应可以表示所递送的总生物治疗剂的约0.1％至所递送的总生物治疗剂的约30％的释放。在一些实施方式中，突释效应是所递送的总生物治疗剂的约1％至约10％之间。在进一步的实施方式中，突释效应是约10％至约20％之间。在进一步的实施方式中，突释效应是在20％至30％之间。如本文所公开的，术语“初始累积释放”是指在施用后头七天内从交联的组合物释放到体内空间中的生物治疗剂的比例，这包括在第一个24小时内释放的比例。在一些实施方式中，初始释放可以表示少于10％的所递送的总生物治疗剂。在另外的实施方式中，初始释放构成了10％至20％的所递送的总生物治疗剂。在一些实施方式中，初始释放是在20％至30％之间。在更进一步的实施方式中，初始释放是在约30％至40％之间。如本文所公开的，“三相释放曲线”是指生物治疗剂的释放曲线，即生物治疗剂随时间从交联的组合物中释放的比例的曲线图，其具有3个可辨别的明确持续时间的释放速率。图9B提供了根据本文所公开的主题的示例性的非限制性的三相释放曲线。

由所公开的主题的制剂提供的受控释放使得显著改善了生物治疗剂递送的药物动力学端点。降低了总的和最大的全身暴露，而在整个释放持续时间内最大化局部浓度，从而将治疗功效最大化并将不希望的副作用最小化。这些改善的药物动力学示于图10。如所示，在递送根据所公开的主题的包括ABT-308的制剂后，生物治疗剂(单克隆抗体)的全身浓度被最小化，而维持关节内浓度14天。此外，如表3所示，滑液中的生物治疗剂的浓度与生物治疗剂的浓度的平均比率大于100。如图8A中所示，这些药物动力学端点表示了与未配制的抗体相比非常显著的改善。

2.生物治疗剂的全身浓度与局部浓度的比率

本文所公开的主题的目的是提供生物治疗剂的全身浓度与生物治疗剂在关节内空间的局部浓度的比率，此比率在将交联的组合物递送到关节内空间后的约1天至约90天之间是小于1的。在所公开的主题的某些优选实施方式中，生物治疗剂的全身浓度与生物治疗剂的局部浓度的比率将低于0.1。如本文所指，生物治疗剂的“局部浓度”是在其所递送的体内空间中的生物治疗剂的浓度，而生物治疗剂的“全身浓度”是在其所递送的器官中的生物治疗剂的平衡血清浓度。

生物治疗剂的局部浓度与生物治疗剂的全身浓度的比率将受多种因素影响。依据所公开的主题的制剂所施用的体内空间，此比率将取决于血管化程度、小静脉或毛细血管的周围密度、淋巴清除率和/或所述体内空间的流体流通率。其它的因素也会影响此比率，这包括制剂所递送的受试者的相对尺寸、受试者活动的相对水平以及制剂所递送的空间的体积。比率还受生物治疗剂的半衰期的影响。

出于说明而非限制的目的，用于递送根据所公开的主题的制剂的合适的体内空间包括玻璃体内空间、关节内空间、腹膜内空间、动脉内空间、骨内(intra-osseal)空间、窦腔或外分泌管。出于说明而非限制的目的，本文对在递送根据所公开的主题的制剂至关节内空间后，生物治疗剂的局部浓度与生物治疗剂的全身浓度的比率作出参考。

关于将组合物递送至关节内空间的实施方式，通过从所述的交联的组合物中相对缓慢、受控地洗脱生物治疗剂来使得生物治疗剂的全身浓度与局部浓度的比率小于1。从交联的组合物中洗脱后，生物治疗剂暂时性地保留在关节内空间中，在此其要么可以结合靶抗原、受体或配体或与其相互作用，或要么实现所期望的局部治疗效果。在一些优选的实施方式中，在进入全身循环之前，显著比例的生物治疗剂被消除或失活。可以通过免疫介导的清除、肾过滤、酶分解或任何其它的方式产生消除。

根据本文所公开的主题，在递送制剂至关节内空间后所获得的生物治疗剂的全身浓度与生物治疗剂的局部浓度的比率是在约1至0之间。在一些优选实施方式中，此比率小于0.1。在一些优选的实施方式中，此比例是在约0.1至约0.001之间。在其它的优选实施方式中，此比值是在约0.2至约0.002之间。在另外的优选实施方式中，此比值是在约0.5至约0.005之间。如表3、表4A和表4B所示，根据所公开的主题的某些交联的组合物制剂的关节内递送实现了约0.2至约0.01的比率。重要地，这一比率比施用未配制的生物治疗剂所得到的比率(在约5至约7之间)低约25至500倍。类似的结果示于表5和表6中。关于图10，如下述实施例7所述，在监测期间，滑液中的生物治疗剂的浓度比血清中的生物治疗剂的浓度高约2个数量级。如下述实施例8所讨论，在递送根据所公开的主题的制剂后，局部浓度与血清浓度的这一比例维持30至90天之间。

在根据所公开的主题的一些实施方式中，提供了在递送交联的组合物至体内空间后的约1至约90天的持续时间中，小于1的生物治疗剂的全身浓度与生物治疗剂的局部浓度的比率。在一些优选的实施方式中，提供了在递送后约1至约7天中，小于1的比率。在另外的实施方式中，提供了在递送后约1至约14天中，小于1的比率。在根据所公开的主题的其它优选实施方式中，提供了在递送后约14至约30天中，小于1的比率。在进一步的实施方式中，提供了在递送后约30至约60天中，小于1的比率。在进一步的实施方式中，提供了在递送根据所公开的主题的交联的组合物至体内空间后的约60至约90天之间，小于1的生物治疗剂的全身浓度与生物治疗剂的局部浓度的比率。在另外的优选实施方式中，此比率小于0.1。

3.治疗方法

归因于上述所期望的受控释放性质以及所获得的小于1的生物治疗剂的全身浓度与局部浓度的比率，所公开的主题的聚合的(交联的)组合物尤其有利于疾病的治疗。利用包括递送本文所公开的交联的组合物的方法，恰当地治疗了大量疾病，这包括但不限于癌症、眼部疾病、炎症、自身免疫性疾病、创伤、骨折、感染性疾病或心血管疾病。方法包括将生物治疗剂与多个亲水性聚合物链组合以形成组合物，将此组合物与激活缓冲液组合以诱导亲水性聚合物链的聚合物间聚合，以形成包含可逆沉淀的生物治疗剂的交联的组合物并向有需要的患者施用交联的组合物，从而治疗疾病。

在根据所公开的主题的一些实施方式中，提供了方法以治疗局部化癌症如肿瘤。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至肿瘤、至供给肿瘤的血管或靠近肿瘤的体内空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是一种抗血管生成药物，如抗-VEGF抗体。

在一些实施方式中，提供了治疗眼部疾病如黄斑变性的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至眼部的玻璃体内空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂将是抗血管生成药物，如抗-VEGF抗体。在另外的非限制性实施方式中，提供了治疗炎症的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至炎症部位或靠近炎症部位的体内空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂将是抗炎化合物如抗体，其结合并中和炎性细胞因子。在一些实施方式中，药物是抗TNF抗体、抗IL-13抗体或抗IL-1抗体。

在一些实施方式中，提供了治疗自身免疫疾病如类风湿关节炎的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至受影响的关节的关节内空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是中和抗炎细胞因子的抗体，如抗TNF抗体。

在一些实施方式中，提供了治疗关节疾病如骨关节炎的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至受影响的关节的关节内空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是中和抗炎细胞因子的抗体，如抗TNF抗体，中和在受影响的关节中破坏软骨的蛋白酶的抗体，如抗基质金属蛋白酶13抗体。

在一些实施方式中，提供了治疗创伤的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至创伤或靠近创伤的体内空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是促进创伤愈合、抑制瘢痕形成或预防感染的蛋白。

在一些实施方式中，提供了治疗骨折的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至骨折处或靠近骨折处的体内空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是促进骨折愈合的蛋白。

在一些实施方式中，提供了治疗感染的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至身体的受感染区。感染可以由病毒病原体、细菌病原体或真菌病原体引起。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是针对病毒、细菌或真菌病原体的抗体。

在一些实施方式中，提供了治疗心血管疾病如冠状动脉疾病的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至体内空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是抗凝血、抗炎或抗血脂的蛋白。

在进一步的实施方式中，提供了治疗因手术形成的瘢痕如术后伤口(would)粘连的方法。手术可以是侵入性的，其包括例如肠切除，或非侵入性的，其包括例如关节韧带修复。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至手术部位。递送可以发生于任何手术创伤闭合之前或之后。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是抗纤维化的蛋白。

在进一步的实施方式中，提供了治疗皮肤疾病如银屑病的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至靠近银屑病病变的皮下空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是抗炎或免疫调节蛋白。

在进一步的实施方式中，提供了治疗子宫内膜异位的方法。此类方法将包括以下步骤：混合制剂并交联此制剂以形成所公开的交联的组合物，并递送交联的组合物例如至腹膜内空间。在进一步的实施方式中，生物治疗剂是抗雌激素蛋白。

IV.试剂盒

根据所公开的主题的另一方面，提供了试剂盒，其在各种组合物中单独地包含多个亲水性聚合物链、生物治疗剂和任选的激活和悬浮缓冲液，以及用于将交联的组合物递送至体内空间的递送装置。多种递送装置都适用于所公开的主题的制剂和交联的组合物。出于说明而非限制的目的，可以使用单一内径注射器、双内径注射器或具有混合头的多通道递送装置。在一些实施方式中，在包括混合头的多通道递送装置的分别的通道中提供制剂和激活缓冲液。在另外的实施方式中，提供生物治疗剂和多个亲水性聚合物链为用于给药前的即刻复溶的交联的组合物。

在一些实施方式中，试剂盒可以包括含有悬浮缓冲液和多个亲水性聚合物链(如上所述)的第一溶液，和含有生物治疗剂和激活缓冲液(也如上所述)的第二溶液。在其它非限制性实施方式中，提供了单独包括含有生物治疗剂和多个亲水性聚合物链的第一溶液和激活缓冲液的试剂盒。为了方便，可以在双内径注射器或多通道递送装置的各自的通道中提供这些组分。

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本文引用了各种出版物，其内容通过引用以其整体并入本文。

除了下述所要求保护的具体实施方式，所公开的主题还涉及具有下述要求保护的从属特征和上述公开的任何其它可能组合的其它实施方式。如此，从属权利要求中所示的和上述所公开的特定特征可以以其它方式在所公开的主题的范围内相互组合，使得所公开的主题应被视为还具体涉及具有任何其它可能组合的其它实施方式。因此，所公开的主题的具体实施方式的上述描述是出于说明和描述的目的。其不意图穷举或限制所公开的主题为所公开的那些实施方式。

对于本领域技术人员显而易见的是，在所公开的主题的方法和系统中进行各种修改和变化而不脱离所公开的主题的精神或范围。因此，指的是所公开的主题包括在所附的权利要求及其等同物的范围之内的修改和变化。

5.实施例

5.1实施例1

将按1：1比例用硫醇基团或丙烯酸酯基团官能化的8-臂PEG和按PEG固体计的5％、6.3％、7.5％、11.5％或20％重量体积比的阿达木单抗的制剂与如所示的磷酸盐激活缓冲液(pH 8.0)或碳酸盐激活缓冲液(pH 9.5)混合以形成交联的组合物。如所示，抗体负载相对于PEG固体是20％、27％、32％或50％。体外孵育18天和26天后，对从交联的组合物释放的生物治疗剂进行尺寸排阻色谱，以确定相对于聚集体和片段的比例的所释放的单体的比例。高比例的单体(如>90％)指示了生物治疗剂的良好的可逆沉淀和再溶解。如图11A和图11B所示，在制剂聚合后18天和26天时从交联的组合物中释放出高比例的单体。如图11A所示，其中使用了用NHS官能化的PEG，产生了高比例的聚集体和片段。

用剂量为8mg或0.8mg的冻干的阿达木单抗抗体在pH 8的磷酸钠缓冲液溶液中配制按PEG固体重量计5％和按PEG固体重量计20％的4-臂PEG-丙烯酸酯和4-臂PEG-硫醇。将50μL的制剂注射到健康大鼠后肢关节内空间中。组A和组C接收从20％的PEG固体形成的交联的组合物，组B和组D接收由5％的PEG固体配制的交联的组合物，且组E和组G施用未配制的mAb。组A和组B接收8mg的mAb，而其余组接收0.8mg的mAb。表7示出了通过TNF-α结合定量分析所测量的抗体的血清暴露，而图12示出了在递送后多达14天随时间变化的mAb的浓度。经由交联的组合物的递送显著地降低了阿达木单抗的血清浓度。图13A、图13B和图13C是在注射到大鼠后肢后和从大鼠后肢移除后的交联的组合物的照片。

5.2实施例2

将在50μl磷酸盐缓冲盐水中的4.25mg的未配制的阿达木单抗抗体施用至健康大鼠后肢的关节内空间中。在给药后24小时间隔地监测阿达木单抗的血清浓度和滑液浓度。如图8A和8B所示，未配制的抗体迅速地从滑液中清除并进入血清，这导致了12小时后的相对低的滑液浓度和高的全身暴露。给药后2小时在节点处看到了相对高浓度的抗体。给药约10小时内，在滑液中的生物治疗剂的局部浓度下降了约两个数量级，且生物治疗剂的血清暴露是相对高的。

5.3实施例3

制备10％、15％和20％重量体积比的用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1：1比例官能化的8-臂PEG和以1：25比例(生物治疗剂比PEG固体)的ABT-308的溶液。聚合物链的分子量是10kDa。这些溶液的一半与激活缓冲液混合以形成交联的组合物。溶液的一半是预混合的。预混合的溶液由溶解于悬浮缓冲液中的PEG固体组成，其与溶解于激活缓冲液的生物治疗剂混合以形成交联的组合物。体外观察到交联的组合物，并确定孵育头4小时的生物治疗剂的初始释放。如图9A所示，从预混合的交联的组合物释放了平均6.8％的生物治疗剂，从未预混合的20％PEG交联的组合物释放了平均7.9％的生物治疗剂。预混合的交联的组合物观察到的生物治疗剂的初始释放低至3％。图9B提供了根据所公开的主题的一个方面的示例性三相释放曲线。图14A和14B示出了实验中的所有体外释放数据。PEG固体从10％增加至15％似乎降低了mAb释放的速率。

进行另外的延长释放的体外分析，其中评估了预混合的8-臂、4-臂和混合的8-臂/4-臂PEG凝胶的受控释放曲线。通过混合下述物质来形成交联的组合物：用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1：1比例官能化的8-臂PEG和以1：25比例(生物治疗剂比PEG固体)的ABT-308，用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1：1比例官能化的4-臂PEG和以1：25比例(生物治疗剂比PEG固体)的ABT-308，或以25:75、50:50或75:25比例(8-臂PEG比4-臂PEG)的8-臂和4-臂PEG制剂的混合物。溶液中的PEG的总重量体积比是10％或15％。如图3A和图3B所示，观察到所有的交联组合物(无论用10％PEG固体或15％PEG固体配制的)都显示出了生物治疗剂的三相释放曲线，其具有0-30天持续时间的初始释放速率，0-30天持续时间的第二释放速率和0-30天的第三释放速率。第二释放速率大于第一释放速率和第三释放速率。受控释放的总持续时间从约40天至约80天不等。表1提供了突释效应低于5％、初始释放小于10％、释放持续时间大于30天且在体外已确认了三相释放曲线的另外的实施方式。图15A-E和图16A-E分别示出了被平均以产生图3A和图3B的曲线的单独实验。

用20％PEG固体重复上述实验。进行延长释放体外分析，其中评估了预混合的8-臂、4-臂和混合的8-臂/4-臂PEG凝胶的受控释放曲线。通过混合用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1：1比例官能化的8-臂PEG和以1：25比例(生物治疗剂比PEG固体)的ABT-308，用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1：1比例官能化的4-臂PEG和以1：25比例(生物治疗剂比PEG固体)的ABT-308，或以25:75、50:50或75:25比例(8-臂PEG比4-臂PEG)的8-臂和4-臂PEG制剂的混合物来形成交联的组合物。溶液中的PEG的总重量体积比是20％。对预混合的和未预混合的制剂进行研究。如图17A和图17B所示，观察到所有交联的组合物都显示出了生物治疗剂的三相释放曲线，其具有0-30天持续时间的初始释放速率，0-30天持续时间的第二释放速率和0-30天的第三释放速率。第二释放速率大于第一释放速率和第三释放速率。受控释放的总持续时间从约40天至约80天不等。此外，增加8-臂PEG的比例将提高完整mAb释放和完整凝胶降解之间的延迟。进一步观察到，未预混合的交联的组合物可以产生更大的突释效应。

此外，如图17C所示，用具有溶液中12或20％的总重量体积比的PEG并包含8或32μg/μl的抗体的8-臂预混合的或未预混合的PEG制剂重复上述实验。观察到生物治疗剂的三相释放长达85天。在100天发生交联的制剂的完全降解。溶液中的总PEG固体越多，观察到越大的所述的突释。

也绘制了溶胀比的曲线，如通过如上所述的制剂的质量相对于交联的组合物的初始质量随时间变化的增加所确定的溶胀比的曲线图。在图18A和图18B中提供了这些图。如表8所示，未预混合的交联的组合物比预混合的交联的组合物显著地吸收了更多的水。

5.4实施例4

将溶解于0.05M磷酸悬浮缓冲液(pH 3.5)的用硫醇基团或丙烯酸酯基团以1：1比例官能化的8-臂PEG与0.16mg标记有荧光团的ABT-308(单克隆抗体)组合，并溶解于0.2M的碳酸氢盐悬浮缓冲液(pH 9.0)中。通过吸入并排出(冲排)注射器混合合并的溶液。将10％总PEG固体和20％总PEG固体二者的溶液混合。5、15或30个注射器冲排后，在此期间交联反应开始，吸入混合物，允许交联进行至接近完成，排出部分形成的交联的组合物。交联完成后，在相衬成像和荧光成像下用20倍放大倍率观察交联的组合物。重复了10％总PEG固体和20％总PEG固体的4-臂PEG溶液的实验。令人惊奇地，观察到在整个制剂中4-臂PEG固体混合物导致了不均匀的沉淀物尺寸和沉淀物的不均匀分布。此外，沉淀物尺寸随混合冲排的次数而增加，使得由冲排30次所形成的混合物表现出大的、粘性的沉淀物和不完全沉淀。相比之下，8-臂PEG固体混合物通过5、15或30个冲排混合时表现出相对均匀的沉淀物尺寸。观察到沉淀物尺寸随冲排的次数的增加而增大。20％PEG固体溶液表现出在约100nm至1μm的直径之间的生物治疗剂沉淀物尺寸。这些结果示于图6A、图6B、图6C和图6D。图6A示出了10％的4-臂PEG制剂；图6B示出了10％的8-臂PEG制剂；图6C示出了20％的4-臂PEG制剂；图6D示出了20％的8-臂PEG制剂。

5.5实施例5

以具有27％单克隆抗体(阿达木单抗)负载(按重量计)的7.91％(按体积计)或具有32％单克隆抗体(阿达木单抗)负载(按重量计)的6.29％(按体积计)的浓度提供了以1：1比例用硫醇基团或丙烯酸酯基团官能化的4-臂PEG的制剂。将制剂与碳酸盐激活缓冲液(pH 9.5)混合以形成交联的组合物。观察到溶胀(通过塑料管中高度变化的百分比所观察到)平行于释放的抗体的百分比。如图4A所示，交联的组合物的溶胀紧密地与释放的抗体的比例相一致。凝胶的溶胀随时间的变化示于图19。

此外，交联具有不同比例的PEG固体浓度、单克隆抗体负载、溶液缓冲液组合物和官能团的4-臂PEG的制剂以形成交联的组合物。体外孵育交联的组合物并记录各个组合物的溶解时间(如通过目测检查所确定的)。交联的组合物的组分和相应的溶解时间示于图4B中。

5.6实施例6

将15mM组氨酸缓冲液(pH 5.2)中的或以冻干形式再溶解于缓冲液的4-臂PEG-Acr/PEG-SH和阿达木单抗的制剂与0.2M磷酸盐缓冲液(pH 8或pH10)或0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.5和pH 10.5)混合。在无菌离心管中形成凝胶，并通过目测检查(抵抗重力流)来测量胶凝时间。通过在凝胶形成后1小时添加释放介质(含有0.1wt％的吐温80和0.05wt％的叠氮化钠的PBS，pH 7.4)并在指定时间间隔取出600μL样品来测量随时间变化的抗体释放。样品体积被立即替换。图20和图21分别描绘了所示的交联的组合物随时间变化的胶凝时间和抗体释放。结果表明数个变量都影响胶凝时间和mAb释放。

5.7实施例7

将ABT-308单克隆抗体施用于5组(组A-E)每组9只路易斯大鼠(每组再分成三只一组的三组)的后肢关节内空间。组A接受0.16mg的未配制的冻干mAb。组B接受0.16mg的配制于悬浮于0.05M磷酸盐缓冲液(pH 3.5)的8-臂PEG-Acr/SH并与0.2M的磷酸盐缓冲液(pH 9.0)混合的mAb。以相对于所提供的缓冲液计20％重量体积比提供PEG。PEG的分子量是10kDa且PEG-Acr和PEG-SH以1：1比例合并；以1:1比例提供悬浮缓冲液和激活缓冲液。组C接受0.16mg的在20％8-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。益相对于所提供的缓冲液计20％重量体积比提供PEG。将PEG和mAb混合于0.2M的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中。PEG的分子量是10kDa且PEG-Acr和PEG-SH以1：1比例合并。组D接受0.16mg的以50:50比例的4-臂和8-臂PEG所提供的PEG-Acr/SH中的mAb。以相对于所提供的缓冲液计20％重量体积比提供PEG。PEG的分子量是10kDa且PEG-Acr和PEG-SH以1：1比例合并。组E接受0.32mg的在20％8-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。以相对于所提供的缓冲液计20％重量体积比提供PEG。组A在14天接受滑膜灌洗，而组B-E在1、7和14天接受滑膜灌洗。图10示出了组C中抗体在14天中的血清和滑液浓度。在实验期间，保持了相对高的滑膜浓度，而血清暴露最小化。在表5中提供了各个治疗组的滑液浓度、血清浓度和滑液浓度：血清浓度的比例。在表7中提供了各组的AUC暴露数据。各组和时间点的平均滑膜和血清的mAb浓度示于图22中。图23A、图23B、图23C和图23D分别提供了治疗组B、C、D和E的血清和滑液浓度，而图24A、图24B、图24C、图24D和图24E提供了在分别的研究组中各个个体动物的全身暴露和AUC暴露数据。

5.8实施例8

将ABT-308单克隆抗体施用于5组(组A-E)每组9只路易斯大鼠(每组再分成三只一组的三组)的后肢关节内空间。组A接受0.16mg的未配制的冻干mAb。组B接受0.16mg的在4-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。以相对于所提供的缓冲液计20％重量体积比提供PEG。PEG的分子量是10kDa且PEG-Acr和PEG-SH以1：1比例合并；以1:1比例提供悬浮缓冲液和激活缓冲液。组C接受0.16mg的在4-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。相对于所提供的缓冲液计的20％重量体积比的提供PEG。将PEG和mAb混合于0.2M的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中。PEG的分子量是2kDa且PEG-Acr和PEG-SH以1：1比例合并。组D接受0.16mg的在4-臂PEG-Acr/SH中所提供的PEG-Acr/SH中的mAb。以相对于所提供的缓冲液计10％重量体积比提供PEG。PEG的分子量是10kDa且PEG-Acr和PEG-SH以1：1比例合并。组E接受0.16mg的在8-臂PEG-Acr/SH中配制的mAb。以相对于所提供的缓冲液计20％重量体积比提供PEG。组A在14天接受滑膜灌洗，而组B-E在1、7和14天接受滑膜灌洗。各组的平均滑膜和血清mAb浓度示于图25中，并且表9提供了所有组的血清AUC总计。

用三组重复这一研究。组A接受0.16mg的未配制的冻干mAb，组D接受0.16mg的在10％的8-臂PEG-AC/SH(悬浮于0.05M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 3.5)并用0.2M的碳酸氢盐缓冲液(pH 9)交联)中的mAb，组E接受0.16mg的在20％的8-臂PEG-AC/SH(悬浮于0.05M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 3.5)并用0.2M的碳酸氢盐缓冲液(pH 9)交联)中的mAb。组A有在14天提取的滑膜灌洗样品，而组D和组E有在1天、7天和14天提取的滑膜灌洗样品。血清暴露和AUC计算示于图23。表6提供了滑液暴露。分别的治疗组的结果示于图26A和图26B中。各组的个体动物的结果示于图27A-C中。在图28中提供了进一步的实验数据，其示出了低于约0.1的全身浓度与局部浓度的比例维持了至少6周。表10中提供了相应的AUC数据。

5.9实施例9

用每μL组合物8、16、24和32μg的ABT-308负载的100μl 20％8-臂交联的组合物评估沉淀的胶凝时间和均匀性。在0.2M的磷酸盐缓冲液(pH7.5)中混合预混合的制剂，而将未预混合的制剂悬浮于0.05M的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 3.5)并与0.2M的碳酸氢盐缓冲液(pH 9.0)混合。表11提供了沉淀的平均胶凝时间和均匀性。

5.10实施例10

用每μL组合物8μg冻干ABT-308或冷冻的抗-MMP 13的负载的100μl 20％8-臂交联的组合物评估胶凝时间。在0.2M的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中混合预混合的制剂，而将未预混合的制剂悬浮于0.05M的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 3.5)并与0.2M的碳酸氢盐缓冲液(pH 9.0)混合。对于预混合的溶液，mAb在缓冲液中预混合并利用交联与PEG固体组合或在交联前在PEG固体中预混合。表12提供了平均的胶凝时间。

5.11实施例11

表4A和表4B提供了在大鼠中进行MMT手术之后，在关节内施用配制的mAb或静脉内施用未配制的mAb的实验性全身和滑液浓度数据。在0天对三组(A-C)路易斯大鼠进行MMT手术以作为骨关节炎病理的模型。在5天时，将配制的抗MMP13或ABT-308mAb注射到大鼠后肢的关节内空间中，在所述后肢中进行了手术或静脉注射施用700mg/kg(按体重计)的抗-MMP13。制剂是预混合的或未预混合的。在7天时，收集血清和滑液灌洗样品。用抗IL-13MSD分析来分析抗体浓度，以确定ABT-308的浓度，或用抗MMP13MSD分析，以确定抗MMP 13的浓度。表12A(对于未预混合的制剂)和表12B(对于预混合的制剂)提供了实验结果。

5.12实施例12

在无菌离心管中形成具有1：1比例的PEG-Acr：PEG-SH、4.84％的总PEG固体和50％的mAb负载的10000MW的4-臂PEG的制剂以研究体外的mAb(阿达木单抗)释放。通过在凝胶形成后1小时添加释放介质(具有0.1wt％的吐温80和0.05wt％的叠氮化钠的PBS(pH 7.4))并在指定时间间隔取出600μL样品来测量释放后随时间变化的抗体完整性。通过目测在37摄氏度不到10秒内形成凝胶。图29和表13示出了在所释放的单克隆抗体上进行的尺寸排阻色谱的结果。从交联的组合物中释放的抗体相对于片段和聚集体，显示出高比例的单体，这表明再溶解时的结构保留。使用96孔石英板在SpectraMax 96孔板读取器上通过280nm处的吸光度来测定所释放的mAb的浓度。将各个样品的吸光度与每个时间点的标准mAb曲线相比较，并用空白释放介质的吸光度进行调整。图30示出了所释放的mAb随时间变化的平均浓度，而图31示出了释放的所施用的初始mAb随时间变化的平均百分比。

交联具有1：25的抗-MMP13抗体：聚合物负载比例的20％的8-臂PEG-SH/Acr的制剂并监测体外累积的mAb释放的百分比。收集所释放的单克隆抗体并通过尺寸排阻色谱来检测其完整性。图32示出了mAb随时间变化的累积释放。图33描述了尺寸排阻色谱结果，这一结果示出了相对于聚集体和片段高比例的单体。

5.13实施例13

由0、5、10、15、20、25或30％的PEG固体(按重量计)和0mg、0.16mg或0.32mg的mAb(ABT-308)组成的8-臂PEG-SH/Acr的制剂。制剂的总体积是20μl。目测在干净的小瓶中形成交联的形成物。不含mAb的所有制剂是澄清的。在含有0.16mg总mAb的制剂中，20％PEG和更低的制剂是澄清的，而25％和30％的制剂目测表现出沉降的沉淀物。在含有0.32mg mAb的制剂中，20％的PEG制剂表现出悬浮的沉淀物，含有小于20％的PEG的制剂是澄清的，含有25％的PEG或30％的PEG(按重量计)的制剂显示出浮动的和沉降的沉淀物。这些实验示于图5。

5.14实施例14

制备具有1:1比例的PEG-Acr：PEG-SH的10000MW的8-臂的制剂用于眼内注射。制备具有示于表14的组成的12％重量的PEG(按体积计)和20％重量的PEG(按体积计)的制剂。在任一的制剂都不包括生物治疗剂。

通过在两个预负载的装有合适的母对母鲁尔锁(luer lock)的1-ml注射器(其中一个注射器包含8-臂PEG-SH的溶液，另一个包含8-臂PEG-Acr的溶液)之间手动前后冲排预混合各个制剂，5-10秒之后吸入到1-ml的具有30Gauge的眼科针和停在5mm深度的简易针(improvised needle)的BectonDickinson注射器中，以确保50μl的均匀注射体积。预混合和吸入后，将50μl的12％的PEG(重量体积比)制剂或20％的PEG(重量体积比)制剂注入6只新西兰白兔眼睛的每一只的玻璃体内空间。每次注射定时为持续约5秒。在胶凝期间和胶凝之后观察眼部，并随后解剖以观察晶状体和视网膜并提取所形成的水凝胶。

各个制剂可通过30Gauge眼科针注射。注射后未观察到眼部有显著的凸出，并且各个制剂在玻璃体内空间原位交联以形成凝胶。凝胶保持光学透明，并且有足够的刚性以被镊子抓握和操作。观察到20％的PEG(按重量计)制剂凝胶比12％的PEG(按重量计)制剂凝胶更硬(rigid)。在凝胶的提取中未观察到眼组织粘连，并且在解剖的眼部的检查中没有晶状体穿刺或视网膜损伤。通过目视观察并计时持续时间直到如上所述的混合制剂不再在测试微型管内流动来体外实验性地评估水凝胶制剂的胶凝时间。12％的制剂在约45秒内胶凝，而20％的制剂在约23秒内胶凝。

表1

表2

表3

表4A

表4B

表5

表5(续)

表6

表7

表8

表9

表10

表11

表12

表13

表1.SEC结果表明从PEG-PEG胶释放mAb达14天的稳定性

表14

Claims

1.一种制剂，其包括：

(a)生物治疗剂；和

(b)多个包括能够进行聚合物间交联的官能团的亲水性聚合物链；

其中所述制剂在交联时表现出生物治疗剂可逆沉淀成直径约50nm至约10μm大小的沉淀物。

2.如权利要求1所述的制剂，其中生物治疗剂是蛋白质。

3.如权利要求2所述的制剂，其中生物治疗剂是抗体。

4.如权利要求2所述的制剂，其中生物治疗剂是双重可变结构域抗体。

5.如权利要求2所述的制剂，其中抗体选自：曲妥珠单抗(Herceptin^TM)、贝伐单抗(Avastin^TM)、阿达木单抗(Humira^TM)、兰尼单抗(Lucentis^TM)、阿柏西普(Eylea^TM)、依那西普(Enbrel^TM)、利妥昔单抗(Rituxan^TM)、培非司亭(Neulasta^TM)、干扰素β-1a(Avonex^TM)、干扰素β1-a(Rebif^TM)和英夫利昔单抗(Remicade^TM)。

6.如权利要求4所述的制剂，其中抗体是阿达木单抗。

7.如权利要求1所述的制剂，其中多个亲水性聚合物链选自：聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、透明质酸、果胶、胶原蛋白、纤维蛋白原、褐藻胶、PLLA-PEG-PLLA共聚物、PLDA-PEG-PLDA共聚物、PLGA-PEG-PLGA共聚物、PEG-PLLA共聚物、PEG-PLDA共聚物和PEG-PLGA共聚物。

8.如权利要求7所述的制剂，其中多个亲水性聚合物链包括选自丙烯酸酯基团、硫醇基团、乙烯基、氨基、羟基、-CO-NH-NH₂、醛基团、乙烯砜基团、琥珀酰亚胺基、硝基苯酚基团和羟基琥珀酰亚胺基的官能团。

9.如权利要求8所述的制剂，其中所述多个亲水性聚合物链中的每个亲水性聚合物链具有选自线性、分支、星形和梳状的结构。

10.如权利要求9所述的制剂，其中亲水性聚合物链的结构是分支、星形或梳状，且具有2至16个臂。

11.如权利要求10所述的制剂，其中各个亲水性聚合物链的分子量是在约2和30kDa之间。

12.如权利要求11所述的制剂，其中多个亲水性聚合物链包含第一类型的亲水性聚合物和第二类型的亲水性聚合物。

13.如权利要求12所述的制剂，其中第一类型的亲水性聚合物链是PEG-丙烯酸酯，第二类型的亲水性聚合物链是PEG-硫醇。

14.如权利要求13所述的制剂，其中第一类型的亲水性聚合物链具有4或8或16个臂，第二类型的亲水性聚合物链具有4或8或16个臂。

15.如权利要求14所述的制剂，其中亲水性聚合物链的每个臂包括官能团。

16.如权利要求15所述的制剂，其中第一类型的亲水性聚合物链和第二类型的亲水性聚合物链的比率是在9：10至约10：9之间。

17.如权利要求15所述的制剂，其中第一类型的亲水性聚合物链具有8个臂，第二类型的亲水性聚合物链具有8个臂。

18.如权利要求15所述的制剂，其中第一类型的亲水性聚合物链具有16个臂，第二类型的亲水性聚合物链具有16个臂。

19.如权利要求15所述的制剂，其中第一类型的亲水性聚合物链具有8个臂，第二类型的亲水性聚合物链具有8个臂，并且其中多个亲水性聚合物进一步包括第三类型的亲水性聚合物链，其是具有4个臂的PEG-丙烯酸酯，以及第四类型的亲水性聚合物链，其是具有4个臂的PEG-硫醇。

20.如权利要求19所述的制剂，其中第一和第二亲水性聚合物链与第三和第四亲水性聚合物链的比例是在1：99和99：1之间。

21.如权利要求20所述的制剂，其中第一和第二亲水性聚合物链与第三和第四亲水性聚合物的比例是75：25、50：50或25：75。

22.如权利要求15所述的制剂，其中以冻干形式提供制剂。

23.如权利要求22所述的制剂，其进一步包含缓冲液。

24.如权利要求23所述的制剂，其中所述缓冲液具有约3.5至约6的pH值。

25.如权利要求24所述的制剂，其中PEG-丙烯酸酯和PEG-硫醇与缓冲液的重量体积比是在约5％至约30％之间。

26.如权利要求25所述的制剂，其中生物治疗剂与总亲水性聚合物的重量比是在约1：1至约1：125之间。

27.一种试剂盒，其包括：

(a)包含生物治疗剂和多个亲水性聚合物链的制剂；和

(b)诱导交联的激活缓冲液；

其中所述制剂在交联时显示出：

(i)在施用至患者体内空间后24小时小于5％的累积生物治疗剂释放的突释效应；

(ii)在施用至患者体内空间后7天小于10％的累积生物治疗剂释放的初始释放；

(iii)三相释放曲线，其中施用至患者体内空间后的释放速率对于约0-30天的第一期间、约0-30天的第二期间和约0-30天的第三期间是大致恒定的；

(iv)施用至患者体内空间后1-3个月的释放持续时间，以完全释放生物治疗剂。

28.如权利要求27所述的试剂盒，其进一步包括用于递送与激活缓冲液混合的制剂的递送装置，其中递送装置选自单内径注射器、双内径注射器或含有混合头的多通道递送装置。

29.一种试剂盒，其包括：

(a)包含生物治疗剂和多个亲水性聚合物链的制剂；

(b)诱导交联的激活缓冲液；

30.如权利要求29所述的试剂盒，其进一步包括用于递送与激活缓冲液混合的制剂的递送装置，其中递送装置选自单内径注射器、双内径注射器或含有混合头的多通道递送装置。