ES2601211T3 - Polímero biorreabsorbible implantable cargado con macromoléculas frágiles - Google Patents

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Alexandre Laurent
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Laurent Bedouet
Stéphanie LOUGUET
Valentin VERRET
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Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Universite Paris Diderot Paris 7
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Abstract

Polímero reticulado biorreabsorbible cargado con macromoléculas en el que el polímero puede obtenerse a partir de la polimerización de: (i) por lo menos un monómero de fórmula (I) (CH2>=CR1)CO-K (I) en el que: - K representa O-Z o NH-Z, representando Z (CR2R3)m-CH3, (CH2-CH2-O)m-H, (CH2-CH2-O)m-CH3, (CH2)m- NR4R5 representando m un número entero desde 1 hasta 30; - R1, R2, R3, R4 y R5 representan independientemente H o un alquilo C1-C6; y (ii) por lo menos un agente de reticulación de copolímero de bloque biorreabsorbible, en el que el agente de reticulación de copolímero de bloque biorreabsorbible es lineal y presenta unos grupos (CH2>=(CR6))- en ambas de sus extremidades, en el que R6 representa independientemente H o un alquilo C1- C6, y en el que la macromolécula se se selecciona de entre el grupo que consiste en proteínas y ácidos nucleicos.

Description

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DESCRIPCION
Polfmero biorreabsorbible implantable cargado con macromoleculas fragiles.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a polfmeros reticulados reabsorbibles y que pueden hincharse susceptibles de implantarse en un individuo y de administrar macromoleculas al individuo con liberacion controlada.
Antecedentes de la tecnica
Existe la necesidad, en el campo de la implantacion de materiales biologicos, de partfculas reabsorbibles y que pueden hincharse cargadas con farmacos bioactivos fragiles tales como macromoleculas. Sin embargo, hasta el momento solo se han ideado disoluciones incompletas.
Las macromoleculas son nuevos tipos de moleculas que presentan utilizaciones terapeuticas particularmente interesantes. En especial, las actividades biologicas especializadas de estos tipos de farmacos proporcionan tremendas ventajas con respecto a otros tipos de compuestos farmaceuticos. Los ejemplos de macromoleculas son protefnas y acidos nucleicos.
En la actualidad se comercializan mas de 130 protefnas (Leader, 21-39,2008, Nature Reviews). Cada vez estan utilizandose mas farmacos de protefnas en ensayos clfnicos debido a los avances en biotecnologfa que permiten la produccion en masa de protefnas recombinantes. Se utilizan para tratar pacientes que padecen numerosas enfermedades: cancer (tratamiento con anticuerpos monoclonales e interferones), enfermedad cardiovascular, fibrosis qufstica, enfermedad de Gaucher (tratamiento con enzimas y protefnas de la sangre), diabetes (insulina), anemia (eritropoyetina), defectos oseos (protefnas morfogeneticas oseas) y hemofilia (factores de coagulacion).
Los acidos nucleicos tambien son macromoleculas con aplicaciones medicas. Estos agentes terapeuticos incluyen plasmidos que contienen transgenes, oligonucleotidos, aptameros, ribozimas, ADNzimas y ARN de interferencia pequenos. Estos farmacos pueden utilizarse para mitigar enfermedades o bien profilacticamente o bien en un estadio muy temprano, impidiendo la progresion de la enfermedad y sus complicaciones
Este tipo de moleculas es muy fragil y debe evitarse el contacto con disolventes organicos, la utilizacion de alta temperatura, tension de corte o entorno acido. Por tanto, la administracion de macromoleculas en el organismo constituye un reto.
De hecho, debido a su naturaleza, las macromoleculas no pueden administrarse por via oral. Estos productos tienden a degradarse rapidamente el tracto gastrointestinal, en particular debido al entorno acido y a la presencia de enzimas en el mismo. Ademas, macromoleculas presentan vidas cortas in vivo.
Ademas, en mayor medida, las macromoleculas no pueden atravesar las barreras endoteliales, epiteliales e intestinales, debido a su tamano y, generalmente, a su caracter polar.
Por estos motivos, las macromoleculas tienen que llevarse al sistema por via parenteral, es decir mediante inyeccion. Sin embargo, el perfil farmacocinetico de estos productos es de manera que la inyeccion del producto requiere una administracion frecuente. En ocasiones se requieren incluso multiples inyecciones diarias o infusiones continuas para que el farmaco de protefnas presente un efecto terapeutico deseado. Resultara evidente que esto es incomodo para los pacientes que requieren estos farmacos. Ademas, este tipo de aplicacion a menudo requiere hospitalizacion y/o supervision medica y presenta inconvenientes logfsticos.
Ademas, parece que al menos para determinadas clases de macromoleculas farmaceuticas, tales como citocinas que se utilizan actualmente por ejemplo en tratamientos contra el cancer, la eficacia terapeutica es fuertemente dependiente de la administracion eficaz en el sitio en que se necesita. En tales casos, las macromoleculas deben dirigirse a los sitios en los que se necesita su actividad durante un periodo de tiempo prolongado.
Por tanto, existe la necesidad de sistemas de administracion que presenten la capacidad de liberacion controlada. En la tecnica, se han propuesto sistemas de administracion que consisten en redes polimericas en las que se cargan las macromoleculas tales como protefnas y de las que se liberan gradualmente.
La administracion local de macromoleculas constituye un reto. El principal inconveniente de este enfoque es la necesidad de una etapa de solubilizacion de polfmero utilizando un disolvente, tal como cloruro de metileno o isopropanol, alta temperatura, espumacion, que pueden poner en peligro la estabilidad de las macromoleculas. La administracion local de acido nucleico en micropartfculas presenta varias limitaciones, similares a las de protefnas. Estos problemas incluyen dano al ADN durante la microencapsulacion, baja eficacia de encapsulacion y liberacion inicial minima del compuesto atrapado (O'Hagan, 10-19, 2006, Methods).
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Una de las diferencias mas importantes que afectan a la eficacia biologica y de administracion de las macromoleculas, en particular de las protemas, es la complejidad de la estructura de las protemas, la estrecha relacion entre la eficacia de las protemas y la estructura molecular tridimensional. Resulta esencial mantener la integridad estructural a traves de todas las etapas de formulacion del sistema de administracion local. El metodo de encapsulacion de protemas en un sistema de administracion es una etapa cntica que puede conducir a la inactivacion de las protemas (Sinha y Trehan, 261-280,2003, Journal of Controlled Release,). Los metodos utilizados mas comunmente para la encapsulacion de farmacos de protemas en micropartmulas polimericas incluyen evaporacion o extraccion con disolvente a partir de una dispersion de tipo W1/O/W2, coacervacion y secado por pulverizacion (Dai, 117-120, 2005, Colloids and Surface B, Freitas, 313-332, 2005, Journal of Controlled Release; Sinha y Trehan, 261-280, 2003, Journal of Controlled Release; Tamber, 357-376, 2005, Advanced Drug Delivery Reviews). Se asocian muchas desventajas con estos metodos que podnan producir la desnaturalizacion y la inestabilidad de las protemas durante el procedimiento de encapsulacion y liberacion. El metodo de emulsion doble presenta las limitaciones de exposicion a disolventes organicos, alta tension de corte y superficies de contacto organicas acuosas. El secado por pulverizacion funciona a temperatura elevada y no es aconsejable utilizarlo para compuestos sensibles a alta temperatura tales como protemas y acidos nucleicos terapeuticos.
Brevemente, las protemas presentan cuatro niveles de organizacion estructural: la estructura primaria de la cadena lineal de aminoacidos a lo largo de la cadena polipeptfdica, la estructura secundaria formada por el plegamiento local de los aminoacidos en una region de la cadena polipeptfdica en helices o laminas, la estructura terciaria compuesta por una disposicion estable en el espacio de las helices y las laminas. La estructura cuaternaria es una disposicion de subunidades de estas protemas, consistiendo la activa en varias subunidades, tales como hemoglobina o anticuerpos (ensamblaje de cuatro cadenas proteicas mediante puentes disulfuro establecidos entre 2 cistemas). La estructura terciaria o cuaternaria de las protemas depende de uniones debiles (de hidrogeno, hidrofobos, ionicos) establecidos entre residuos de aminoacido de cadenas polipeptfdicas. Estas uniones no covalentes son fragiles y pueden romperse en determinadas condiciones conduciendo al desplegamiento de la protema. La funcion biologica de una protema depende de su estructura, no pudiendo realizar su funcion una protema desnaturalizada. Los principales factores que producen desnaturalizacion de protemas son el calor que rompe las uniones de hidrogeno debiles, el pH (demasiado acido o demasiado alcalino) y la fuerza ionica. Tambien se produce desplegamiento de una protema en presencia de disolventes organicos, donde las regiones hidrofobas de las protemas plegadas se giran hacia fuera mientras que las regiones hidrofilas se reuniran en el centro de la molecula. Durante la preparacion de microesferas, las protemas pueden exponerse tanto a alta temperatura como a disolventes organicos tales como diclorometano (disolvente de pLgA) y pueden desnaturalizarse (Raghuvanshi, 269-276, 1998, Pharm Dev Technol).
Con mayor detalle, en la actualidad, pueden distinguirse dos tipos principales de sistemas de administracion polimericos: polfmeros biodegradables e hidrogeles no biodegradables.
Los polfmeros biodegradables, por ejemplo poli(acido lactico) (PLA) y copolfmeros de PLA con acido glicolico (PLGA), se utilizan frecuentemente como sistemas de administracion para macromoleculas tales como protemas.
Pueden incorporarse macromoleculas en sistemas de administracion farmaceuticos, por ejemplo microesferas, mediante una variedad de procedimientos. In vitro e in vivo, habitualmente se observa un perfil de liberacion bifasico: una rafaga inicial seguida por una liberacion mas gradual. La rafaga se produce por las macromoleculas presentes en o cerca de la superficie de las microesferas y por las macromoleculas presentes en los poros. La liberacion gradual se atribuye a una combinacion de difusion de las macromoleculas a traves de la matriz y degradacion de la matriz. Especialmente para las macromoleculas mas grandes, la difusion en estas matrices es insignificante, de modo que la liberacion depende de la degradacion del polfmero. La degradacion puede resultar influida por la composicion del (co)polfmero. Una estrategia bien conocida para aumentar la velocidad de degradacion de PLA es la copolimerizacion con acido glicolico.
Aunque los sistemas de administracion basados en polfmeros biodegradables son interesantes, resulta muy difroil controlar la liberacion de la macromolecula incorporada. Esto dificulta la aplicabilidad de estos sistemas, especialmente para macromoleculas con una estrecha ventana terapeutica, tales como citocinas y hormonas. Ademas, han de utilizarse disolventes organicos para la encapsulacion de las macromoleculas en estos sistemas polimericos. La exposicion de las macromoleculas a disolventes organicos generalmente conduce a desnaturalizacion, lo que afectara a la actividad biologica de las macromoleculas. Ademas, los requisitos muy estrictos de las autoridades de registro con respecto a posibles trazas de sustancias perjudiciales puede prohibir la utilizacion de tales formulaciones de farmacos terapeuticos en pacientes humanos.
Ademas, la hidrolisis de PLGA en el nucleo de las microesferas produce acidificacion local. Se midio el pH utilizando sondas organicas sensibles al pH y se obtuvieron valores de entre 1,5 - 3 (Fu, 100-106, 2000, Pharmaceutical Research; Li y Schwendeman, 163-173, 2005, Journal of Controlled Release). La diminucion del pH dentro de la matriz de polfmero de las microesferas puede inducir diferentes alteraciones de protemas encapsuladas en la matriz de PLGA. Las reacciones adversas mas documentadas que afectan a las protemas encapsuladas son desamidacion, acilacion e hidrolisis del enlace peptfdico (Murty, 50-61, 2005, International Journal of Pharmaceutics; Abbas Ibrahim, 241-252, 2005, Journal of Controlled Release, Houchin y Topp, 2395-2404, 2008, Journal of Pharmaceutical Sciences). La desamidacion de protemas es una reaccion catalizada por acido en la que los
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aminoacidos asparagina y glutamina se degradan para dar acido aspartico y acido glutamico. Se observo una desamidacion significativa para insulina encapsulada (Uchida, 234-236, 1996, Chem Pharm Bull, Shao y Bailey, 623632, 1999, Pharm Dev Technol). La acilacion es otra alteracion de las protefnas atrapadas dentro de microesferas de PLGA. Durante la reabsorcion de microesferas, las protefnas pueden acilarse con aductos de acido glicolico o acido lactico. Esta reaccion secundaria se observo in vivo para el peptido octreotida implantado por via subcutanea en micropartfculas de PLGA (Murty, 50-61, 2005, International Journal of Pharmaceutics,) e in vitro para calcitonina de salmon (Lucke, 175 - 181, 2002, Pharmaceutical Research). Se produce acilacion en varios aminoacidos: amina libre del aminoacido N-terminal de la protefna, lisina, tirosina o serina ubicada a lo largo de la cadena peptfdica. La acidez local dentro de las microesferas puede producir hidrolisis de la cadena peptfdica, particularmente a nivel del acido aspartico, la union Asp-Pro se considera fragil. Durante un experimento de liberacion in vitro, se libero mas del 50% de anhidrasa carbonica tras una semana de microesferas de PLGA (1-3 micrometros) correspondiente a fragmentos (Sandor, 63-74, 2002, Biochimica y Biophysica Acta).
Las microesferas de PLGA cargadas se cargan por sf mismas sobre un hidrogel de alginato para controlar la liberacion durante periodos de tiempo prolongados (Lee, Journal of Controlled Release 137, 196-202, 2009). El compuesto bioactivo todavfa se incorpora en la microesfera de PLGA lo que puede desnaturalizar su estructura durante la degradacion.
Los hidrogeles tambien se utilizan frecuentemente como sistemas de administracion para protefnas y peptidos. Los hidrogeles pueden obtenerse reticulando un polfmero soluble en agua produciendo una red tridimensional que puede contener grandes cantidades de agua. Pueden cargarse protefnas en el gel anadiendo la protefna al polfmero antes de que se lleve a cabo la reaccion de reticulacion o sumergiendo un hidrogel preformado en una disolucion de protefnas. Por tanto, no tienen que utilizarse disolventes organicos (agresivos) para cargar los hidrogeles con moleculas de protefnas.
A diferencia de los polfmeros biodegradables, la liberacion de protefnas de hidrogeles puede controlarse y manipularse facilmente variando las caracterfsticas del hidrogel, tales como el contenido en agua y la densidad de reticulacion del gel. Sin embargo, una desventaja principal de los sistemas de administracion de hidrogel utilizados actualmente es que no son biodegradables. Esto necesita extraccion quirurgica del gel del paciente tras la liberacion de la protefna con el fin de impedir complicaciones de inclusion del material de hidrogel vacfo (con frecuencia se forma tejido herido).
Se han utilizado hidrogeles biodegradables en la preparacion de sistemas de administracion para farmacos de protefnas. Uno de estos sistemas comprende dextranos reticulados obtenidos acoplando metacrilato de glicidilo (GMA) a dextrano, seguido por la polimerizacion por radicales de una disolucion acuosa de dextrano derivatizado con GMA (dex-GMA) (Hennink, Pharmaceutical Research, vol 15, n°.4, 1998). Pero el tamano de las microesferas obtenidas es bastante pequeno (aproximadamente 100 mm).
Pueden encapsularse protefnas en los hidrogeles anadiendo protefnas a una disolucion de dextrano derivatizado con GMA antes de la reaccion de reticulacion. Parece que la liberacion de las protefnas de estos hidrogeles depende de y puede controlarse por el grado de reticulacion y el contenido en agua del gel (Hennink et al., J. Contr. Rel. 39, (1996), 47-57).
Aunque se esperaba que los hidrogeles de dextrano reticulados descritos fueran biodegradables, estos hidrogeles son bastante estables en condiciones fisiologicas.
Para resolver este problema, el documento US2008/131512 propone anadir un polfmero reabsorbible sintetico (PLA o PGA) entre el dextrano y el doble enlace metacrflico para facilitar la degradacion de la red por hidrolisis. Sin embargo, debido a su naturaleza qufmica, el dextrano es bastante diffcil de modificar con el fin de introducir grupos funcionales especfficos en la estructura. Estos grupos funcionales pueden ayudar a favorecer la incorporacion de las macromoleculas y/o a controlar la liberacion.
Pueden obtenerse microesferas con polfmero natural (gelatina o colageno). Sin embargo, la liberacion es rapida (en una semana tras la implantacion en la cavidad articular de conejos) (Inoue, 264-270, 2006, Arthritis & Rheumatism) y excluyendo su utilizacion para la administracion de farmacos controlada y a largo plazo. Tambien debe senalarse que el colageno es de origen bovino y se observan reacciones alergicas a las protefnas bovinas en aproximadamente el 2% de los pacientes.
Por tanto, un objetivo de la presente invencion es resolver los problemas anteriores, en particular para evitar la inestabilidad de la macromolecula, tal como protefna, durante la preparacion de las microesferas, las interacciones no especfficas con los polfmeros, la acidez local dentro de la matriz de polfmero en degradacion y para obtener una previsibilidad y un control mejores de la liberacion de la microesfera con un efecto de rafaga limitado.
Sumario de la invencion
La presente invencion surge del hallazgo inesperado de los inventores de que la presencia de (met)acrilatos neutros
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en un polfmero reticulado mediante copolfmeros de bloque basados en PLGA, PEG y/o PLA biorreabsorbibles puede influir en la velocidad de degradacion de un polfmero de este tipo mientras que tambien permite controlar el hinchamiento del polfmero. Ademas, este tipo de polfmero es particularmente adecuado para administrar a su sitio de accion en el organismo. De hecho, es posible utilizar un procedimiento para cargar el polfmero con las macromoleculas que preserva la fragil conformacion y por tanto la actividad de las macromoleculas. Ademas, cuando el polfmero se proporciona como una partfcula esferica, puede mantenerse la esfericidad incluso con hinchamiento. Este tipo de polfmero se describe en la solicitud de patente n.° PCT/EP 2010/063227. Resulta particularmente interesante puesto que proporciona una liberacion controlada de las macromoleculas cargadas. Al contrario del dispositivo de PLGA puro, la red de polfmero segun la presente invencion no solo esta compuesta por PLGA sino que tambien posee PEG y cadenas de metacrilato. Durante la degradacion de la red, se diluiran los productos de degradacion acida de PLGA dentro del hidrogel y pueden difundir fuera de la estructura.
Ademas, el solicitante tambien demostro que en experimentos con animales realizados en articulaciones de hombro de ovejas, a diferencia de las microesferas de la tecnica anterior, las microesferas basadas en el polfmero de la invencion se incorporaron rapidamente en el tejido sinovial y que su tiempo de residencia en la membrana sinovial fue al menos de varias semanas (1 mes), lo que hace que las microesferas de la invencion sean adecuadas para administrar farmacos en la membrana sinovial durante varias semanas o meses.
La presente invencion se refiere por tanto a un polfmero reticulado biorreabsorbible cargado con macromoleculas. El polfmero es el descrito en la solicitud de patente n.° PCT/EP 2010/063227.
Por tanto, este polfmero puede obtenerse a partir de la polimerizacion de:
(i) al menos un monomero de formula (I)
(CH2=CR1)CO-K (I)
en la que:
- K representa O-Z o NH-Z, representando Z (CR2R3)m-CH3, (CH2-CH2-O)m-H, (CH2-CH2-O)m-CH3, (CH2)m-NR4R5 representando m un numero entero desde 1 hasta 30;
- R1, R2, R3, R4 y R5 representan independientemente H o un alquilo C1-C6; y
(ii) al menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible.
Ventajosamente segun la invencion, el polfmero definido anteriormente puede obtenerse a partir de la polimerizacion del al menos un monomero de formula (I), dicho por lo menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible, y (iii) adicionalmente al menos un agente de transferencia de cadena.
A menudo, las especies activas utilizadas para iniciar la polimerizacion son altamente reactivas y pueden conducir en algunos casos a reacciones secundarias indeseables tales como transferencia de cadena. Esto puede conducir a la produccion de ramificaciones cortas o largas o incluso lo que es mas problematico, a la formacion de reticulacion no reabsorbible (Scorah 2006, Polim. Bull. 57, 157-167). Estos cambios estructurales pueden tener efectos adversos sobre la biocompatibilidad del material. Para evitar estas reacciones secundarias, pueden anadirse niveles apropiados de agentes de transferencia de cadena a la disolucion de monomero sin afectar a la formacion de red. Estas moleculas con alta reactividad de transferencia, tambien denominadas "moleculas reguladoras", son muy eficaces incluso a concentraciones pequenas. Ademas, la utilizacion de al menos un agente de transferencia es una forma adicional de reducir / controlar el peso molecular del residuo de cadena polimerica (Loubat 2001, Polim. Int. 50, 375-380; Odian, G. "Principles of polimerization" 3a ed., J. Wiley, New York 1991).
Ventajosamente, dicho por lo menos un agente de transferencia de cadena se selecciona del grupo que consiste en complejos, sales de metales de transicion, haluros de alquilo o tioles monofuncionales o polifuncionales y otros compuestos que se sabe que son activos en procedimientos de transferencia de cadena por radicales libres tales como 2,4-difenil-4-metil-1-penteno.
De manera particularmente ventajosa, dicho por lo menos un agente de transferencia de cadena es un tiol cicloalifatico o preferentemente alifatico, que presenta normalmente desde 2 hasta aproximadamente 24 atomos de carbono, y que presenta o no un grupo funcional adicional seleccionado de amino, hidroxilo y carboxilo.
Los ejemplos de agentes de transferencia de cadena particularmente preferidos son acido tioglicolico, 2- mercaptobutanol, dodecanotiol y hexanotiol.
Segun la invencion, dicho por lo menos un agente de transferencia de cadena puede estar presente en la mezcla de reaccion en una cantidad de, por ejemplo, desde el 0,1 hasta el 10%, preferentemente desde el 1 hasta el 4 %, y en particular desde el 1,5 hasta el 3,5 % en moles, en relacion con el numero de moles de monomeros
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monofuncionales.
Ventajosamente segun la invencion, el polfmero definido anteriormente puede obtenerse a partir de la polimerizacion del al menos un monomero de formula (I), dicho por lo menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible, (iii) opcionalmente al menos un agente de transferencia de cadena tal como se definio anteriormente, y (iv) adicionalmente al menos un monomero cfclico que presenta un grupo exo-metileno de formula (III):
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en la que:
- R6, R7, R8 y R9 representan independientemente H o un grupo arilo C5-C7 o R6 y R9 estan ausentes y R7 y Rs forman junto con el atomo de carbono en que se unen un grupo arilo C5-C7;
- i y j representan independientemente un numero entero elegido entre 0 y 2, ventajosamente i y j se eligen entre 0 y 1, mas ventajosamente i=j, todavfa mas ventajosamente, i=j=1; y
- X representa o bien O o bien X no esta presente y en este ultimo caso, CR6R7 y CRsR9 se unen a traves de un enlace sencillo C-C.
Ventajosamente, la presencia de un monomero cfclico que presenta un grupo exo-metileno durante la polimerizacion del polfmero descrita en la patente n.° PCT/EP 2010/063227, puede reducir el peso molecular del residuo obtenido tras la degradacion del polfmero sin modificar las propiedades mecanicas del polfmero.
La utilizacion de este tipo de monomero durante la polimerizacion aumentara el numero de puntos labiles en la cadena principal de la red de polfmero y por tanto reducira el peso molecular del residuo obtenido tras la degradacion hidrofoba. Esta caracterfstica evitara por tanto la acumulacion no deseada de polfmeros en los rinones
De hecho, la introduccion de la union ester en la red de polfmero mediante la utilizacion de monomeros cfclicos que presentan un grupo exo-metileno proporcionara una mayor flexibilidad sobre el control de degradacion de la red de polfmero.
Preferentemente segun la invencion, el monomero cfclico que presenta un grupo exo-metileno de formula (III) se selecciona del grupo que consiste en 2-metilen-1,3-dioxolano, 2-metilen-1,3-dioxano, 2-metilen-1,3-dioxepano, 2- metilen-1,3,6-trioxocano, y derivados de los mismos, en particular benzoderivados y derivados fenil-sustituidos, ventajosamente del grupo que consiste en 2-metilen-1,3-dioxolano, 2-metilen-1,3-dioxano, 2-metilen-1,3-dioxepano, 2-metilen-4-fenil-1,3-dioxolano, 2-metilen-1,3,6-trioxocano y 5,6-benzo-2-metilen-1,3-dioxepano, mas ventajosamente del grupo que consiste en 2-metilen-1,3-dioxepano, 5,6-benzo-2-metilen-1,3-dioxepano, 2-metilen- 1,3,6-trioxocano y 2-metilen-1,3,6-trioxocano.
Ventajosamente, el polfmero segun la presente invencion se obtiene utilizando entre el 0,1 y el 50% en moles, mas ventajosamente entre el 0,1 y el 20% en moles, normalmente entre el 1 y el 10% en moles, del monomero cfclico mencionado anteriormente basado en la cantidad total del monomero.
En una forma de realizacion de la invencion, el polfmero definido anteriormente puede obtenerse a partir de la polimerizacion del al menos un monomero, dicho por lo menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible, opcionalmente al menos un agente de transferencia de cadena tal como se definio anteriormente, opcionalmente al menos un monomero cfclico que presenta un grupo exo-metileno tal como se definio anteriormente y al menos un monomero adicional que es un monomero cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo de la siguiente formula (V):
(CH2=CR-i1)CO-M-F (V) en la que:
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- Rii representa H o un alquilo C1-C6;
- M representa un enlace sencillo o un resto de union que presenta desde 1 hasta 20 atomos de carbono;
- F representa un grupo cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo que presenta 100 atomos como maximo.
Estas formas de realizacion son ventajosas porque cuando el polfmero de la invencion se polimeriza a partir de un monomero cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo tal como se definio anteriormente, el polfmero puede presentarse con diversas caracterfsticas fisicoqufmicas de superficie que permiten la carga, es decir, la adsorcion no covalente, de las macromoleculas que van a administrarse. La macromolecula que se carga en el polfmero segun la presente invencion se elige del grupo que consiste en protefnas y acidos nucleicos.
La presente invencion tambien se refiere a al menos un polfmero tal como se definio anteriormente para su utilizacion como especialidad farmaceutica.
La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende al menos un polfmero tal como se definio anteriormente, en asociacion con un portador farmaceuticamente aceptable.
La presente invencion tambien se refiere a al menos un polfmero tal como se definio anteriormente para su utilizacion como especialidad farmaceutica destinada ventajosamente para la correccion del envejecimiento de la piel y/o para la cicatrizacion de heridas y/o para la reconstitucion tisular y/o para la reparacion de tejidos blandos, y/o para el tratamiento de la inflamacion, tumores benignos y malignos, malformaciones arteriovenosas, sangrado gastrointestinal, epistaxis, hemorragia posparto primaria y/o hemorragia quirurgica y/o para regenerar tejido en un ser humano o un animal, o ingenierfa tisular en cultivo celular.
La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende al menos un polfmero tal como se definio anteriormente, en asociacion con un portador farmaceuticamente aceptable, destinada ventajosamente para la administracion mediante inyeccion.
En particular, se refiere a una composicion farmaceutica inyectable que comprende
- (a) un polfmero tal como se describio anteriormente que presenta una conformacion esferica de un diametro de entre 50 y 500 mm y un tiempo de reabsorcion de entre 2 dfas y 3 semanas;
- (b) un polfmero tal como se describio anteriormente que presenta una conformacion esferica de un diametro de entre 50 y 500 mm y un tiempo de reabsorcion de entre uno y 3 meses; y
- (c) al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable,
en la que al menos uno del polfmero (a) o (b) esta cargado con una macromolecula tal como se describio anteriormente.
Ventajosamente, en la composicion segun la presente invencion, las partfculas esfericas de los polfmeros (a) y (b) no presentan el mismo diametro, ventajosamente el diametro de las partfculas esfericas del polfmero (a) es de entre 100 y 300 mm y el diametro de las partfculas esfericas del polfmero (b) es de entre 300 y 500 mm.
La presente invencion tambien se refiere a un implante que contiene al menos un polfmero tal como se definio anteriormente o la composicion tal como se definio anteriormente.
Descripcion detallada de la invencion
Copolimero de bloque biorreabsorbible
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "biorreabsorbible" significa que el copolimero de bloque se degrada o escinde cuando se administra a un organismo vivo, preferentemente un organismo mamffero, en particular un ser humano. Tal como se preve en la presente memoria "biorreabsorbible" indica que el copolimero de bloque puede hidrolizarse.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "agente de reticulacion de copolimero" se pretende que signifique que el copolimero contiene un grupo funcional en al menos dos de sus extremidades con el fin de unir entre sf varias cadenas polimericas. Ventajosamente, este grupo funcional contiene un doble enlace.
Preferentemente, el agente de reticulacion de copolimero de bloque biorreabsorbible tal como se definio anteriormente es lineal y ventajosamente presenta grupos (CH2=(CR6))- en ambas de sus extremidades, en los que R6 representan independientemente un H o un alquilo C1-C6. Preferentemente tambien, el agente de reticulacion de copolimero de bloque biorreabsorbible es un copolimero de dibloque o tribloque. Los agentes de reticulacion de
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copolfmero de bloque son mas ventajosos que los copolfmeros estadfsticos puesto que, en particular si uno del bloque contiene PEG, tienen tendencia a atraer mas moleculas de agua y por tanto son mas facilmente hidrolizables. Ademas, es facil cambiar el tamano del bloque y por tanto adaptar la velocidad de biodegradabilidad del polfmero segun la presente invencion en funcion de su utilizacion pretendida.
Tambien se prefiere que el bloque del agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible tal como se definio anteriormente se seleccione de los grupos que consisten en polietilenglicol (PEG), poli(acido lactico) (tambien denominado polilactida) (PLA), poli(acido glicolico) (tambien denominado poliglicolida) (PGA), poli(acido lactico-acido glicolico) (PLGA) y poli(caprolactona) (PCL).
Tal como conoce bien un experto en la materia, PEG, PLA, PGA y PCL pueden representarse tal como sigue, representando n su grado de polimerizacion:
- PEG:
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PLA:
PGA:
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O
Para PLGA que comprende tanto unidades de lactida como de glicolida, el grado de polimerizacion es la suma del numero de unidades de lactida y glicolida.
Mas preferentemente, el agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible tal como se definio anteriormente es de la siguiente formula (II):
(CH2=CR7)CO-(Xn)j-PEGp-Yk-CO-(CR8=CH2) (II)
en la que:
- R7 y R8 representan independientemente H o un alquilo C1-C6;
- X e Y representan independientemente PLA, PGA PLGA o PCL;
- n, p y k representan respectivamente el grado de polimerizacion de X, PEG e Y, siendo n y k independientemente numeros enteros desde 1 hasta 150, y siendo p un numero entero desde 1 hasta 100;
- j representa 0 o 1.
Todavfa mas preferentemente, el agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible tal como se definio anteriormente es de una formula seleccionada del grupo que consiste en:
(CH2=CR7)CO-PLAn-PEGp-PLAk-CO-(CR8=CH2),
(CH2=CR7)CO-PGAn-PEGp-PGAk-CO-(CR8=CH2),
(CH2=CR7)CO-PLGAn-PEGp-PLGAk-CO-(CR8=CH2),
(CH2=CR11)CO-PCLn-PEGp-PCLk-CO-(CR-i2=CH2),
(CH2=CR7)CO-PEGp-PLAk-CO-(CR8=CH2),
(CH2=CR7)CO-PEGp-PGAk-CO-(CR8=CH2),
(CH2=CR7)CO-PEGp-PLGAk-CO-(CR8=CH2); y
(CH2=CR11)CO-PEGp-PCLk-CO-(CR-i2=CH2);
en las que R7, R8, n, p y k son tal como se definio anteriormente.
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Polimeros
Tal como resulta evidente para un experto en la materia, el polfmero de la invencion es un polfmero reticulado biorreabsorbible (es decir, hidrolizable). En particular, el polfmero de la invencion esta constituido por al menos una cadena de monomeros polimerizados tal como se definio anteriormente, en el que al menos una cadena esta reticulada mediante los agentes de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbibles tal como se definio anteriormente.
Ventajosamente, el polfmero de la invencion puede hincharse, es decir presente la capacidad para absorber lfquidos, en particular agua. Por tanto, este tipo de polfmero se denomina hidrogel.
Tal como resulta evidente para un experto en la materia, y a modo de ejemplo, los monomeros de la invencion tambien pueden representarse tal como sigue:
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Tras la polimerizacion, los monomeros de la invencion pueden representarse entonces tal como sigue:
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Preferentemente, el monomero de formula (I) tal como se definio anteriormente se selecciona del grupo que consiste en acrilato de sec-butilo, acrilato de n-butilo, acrilato de t-butilo, metacrilato de t-butilo, metacrilato de metilo, N- dimetil-aminoetil(metil)acrilato, (met)acrilato de N,N-dimetilaminopropilo, (met)acrilato de t-butilaminoetilo, acrilato de N,N-dietilamino, poli(oxido de etileno) terminado en acrilato, poli(oxido de etileno) terminado en metacrilato, metacrilato de metoxi-poli(oxido de etileno), metacrilato de butoxi-poli(oxido de etileno), polietilenglicol terminado en acrilato, polietilenglicol terminado en metacrilato, metacrilato de metoxipolietilenglicol, metacrilato de butoxipolietilenglicol.
Todavfa mas preferentemente, el monomero de formula (I) tal como se definio anteriormente es metacrilato de metil eter de polietilenglicol.
Ademas, se prefiere que F se seleccione del grupo constituido por COOH, COO', SO3H, SO3', PO4H2, PO4H', PO42', NR9R10, NRgRi2Ri0+, representando Rg, R10 y R12 independientemente H o un alquilo C1-C6, un grupo alquilo C1-C20, un grupo arilo C5-C20, un grupo heteroarilo de 5-30 miembros que contiene un heteroatomo elegido del grupo que consiste en O, N o S, un grupo O-arilo C5-C20 y un grupo O-heteroarilo de 5-30 miembros, un eter corona y una ciclodextrina.
Preferentemente, el monomero cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo es un monomero cationico, seleccionado ventajosamente del grupo que consiste en (metacriloiloxi)etil-fosforilcolina, (met)acrilato de 2-(dimetilamino)etilo, (met)acrilato de 2-(dietilamino)etilo y cloruro de 2-((met)acriloiloxi)etil]trimetilamonio. Mas ventajosamente, el monomero cationico es (met)acrilato de (dietilamino)etilo. Ventajosamente, el polfmero segun la presente invencion puede obtenerse utilizando entre el 1 y el 30% en moles del monomero cationico mencionado anteriormente basado en la cantidad total del monomero, mas ventajosamente entre el 10 y el 15% en moles.
En otra forma de realizacion ventajosa, el monomero cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo es un monomero anionico seleccionado ventajosamente del grupo que consiste en acido acrflico, acido metacrflico, acrilato de 2- carboxietilo, oligomeros de acrilato de 2-carboxietilo, sal de potasio de (met)acrilato de 3-sulfopropilo e hidroxido de 2-(metacriloiloxi)etil]dimetil-(3-sulfopropil)amonio. Ventajosamente, el polfmero segun la presente invencion puede obtenerse utilizando entre el 1 y el 30% en moles del monomero anionico mencionado anteriormente basado en la cantidad total del monomero, mas ventajosamente entre el 10 y el 15% en moles.
En una forma de realizacion ventajosa, F es una ciclodextrina y el monomero cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo presenta la siguiente formula (VI):
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(CH2=CRi3)COO-Li-W-CD (VI) en la que:
- R13 representa H o un alquilo C1-C6;
- Li representa un resto de union que presenta desde 1 hasta 20 atomos de carbono opcionalmente sustituidos con un grupo hidroxilo;
- W representa un grupo -NH-, -CO-, -NH-R19-NH-, -CO-R19-CO- o -triazolil-R20 en el que R19 y R20 representan independientemente entre si un grupo alquilo C1-C6;
- CD representa una ciclodextrina.
Ventajosamente, el polfmero segun la presente invencion puede obtenerse utilizando entre el 1 y el 40% en moles, normalmente entre el 1 y el 20% en moles del monomero de formula (VI) mencionado anteriormente basado en la cantidad total del monomero.
En la presente invencion, la ciclodextrina puede ser cualquier ciclodextrina conocida, seleccionada en particular del grupo que consiste en beta-ciclodextrina, metil-beta-ciclodextrina, gamma-ciclodextrina o hidroxipropil-gamma- ciclodextrina. Ventajosamente, es beta- ciclodextrina.
Los ejemplos de estructuras (met)acrflicas que portan residuo de ciclodextrina se proponen en las siguientes referencias: Macromol Chem Phys 2009, 210, 2107; Macromol Chem Phys 2010, 211, 245; J polim Sci 2009, 47, 4267.
En otra forma de realizacion ventajosa, F es un eter corona y el monomero cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo presenta la siguiente formula (VII):
(CH2=CR14)COO-L2-CRE (VII)
en la que:
- R14 representa H o un alquilo C1-C6;
- L2 representa un resto de union que presenta desde 1 hasta 20 atomos de carbono opcionalmente sustituidos con un grupo hidroxilo, elegido ventajosamente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y alquil C1-C6(O-alquilo C1-C6) estando el grupo alquilo opcionalmente sustituido por un grupo hidroxilo;
- CRE representa un eter corona.
Ventajosamente, el polfmero segun la presente invencion puede obtenerse utilizando entre el 1 y el 50% en moles, normalmente entre el 1 y el 20% en moles del monomero de formula (VII) mencionado anteriormente basado en la cantidad total del monomero.
Los ejemplos de estructuras (met)acrflicas que portan un residuo de eter corona se proponen en las referencias: Polymer 2004, 45, 1467; Macromolecules 2003, 36, 1514.
En todavfa otra forma de realizacion ventajosa, F se selecciona del grupo constituido por un grupo arilo grupo heteroarilo de 5-30 miembros que contiene un heteroatomo elegido del grupo que consiste en O, grupo O-arilo C5-C20 y un grupo O-heteroarilo de 5-30 miembros y el monomero cargado, ionizable, hidrofobo presenta la siguiente formula (VIII):
(CH2=CR22)COO-L4-Ar (VIII)
en la que:
- R22 representa H o un alquilo C1-C6;
- L4 representa un resto de union que presenta desde 1 hasta 20 atomos de carbono opcionalmente sustituidos con un grupo hidroxilo, elegido ventajosamente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y alquil C1-C6(O-alquilo C1-C6), estando el grupo alquilo opcionalmente sustituidos con un grupo hidroxilo;
- Ar representa un arilo C5-C20, heteroarilo de 5-30 miembros que contiene un heteroatomo elegido del grupo que consiste en O, N o S, O-arilo C5-C20 o grupo O-heteroarilo de 5-30 miembros que contiene un heteroatomo elegido del grupo que consiste en O, N o S.
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C5-C20, un N o S, un hidrofilo o
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Ventajosamente, el polfmero segun la presente invencion se obtiene utilizando entre el 1 y el 50% en moles, normalmente entre el 1 y el 30% en moles del monomero de formula (VIII) mencionado anteriormente basado en la cantidad total del monomero, mas ventajosamente entre el 5 y el 15% en moles.
Ventajosamente, el monomero cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo de formula (VIII) tal como se definio anteriormente se selecciona del grupo que consiste en (met)acrilato de 2-(4-benzoil-3- hidroxifenoxi)etilo, (met)acrilato de 2-hidroxi-3-fenoxipropilo, (met)acrilato de fenil eter de etilenglicol, metacrilato de bencilo, metacrilato de 9H-carbazol-9-etilo.
Tambien se prefiere que L-i, L2 y M sean de la siguiente formula:
O-T-(U)q-T' o NH-T-(U)q-T'
en la que T y T', identicos o diferentes, representan una cadena de alquilo C1-C6 opcionalmente sustituida por uno o mas grupos hidroxilo, oxo o amino, U representa una funcion hidrolizable, tal como una funcion ester, amida, disulfuro, amino-oxilo o anhfdrido, y q representa un numero entero desde 0 hasta 2 para M y desde 1 hasta 2 para L1 y L2.
El polfmero de la invencion puede sintetizarse facilmente mediante numerosos metodos bien conocidos por un experto en la materia si las macromoleculas se cargan tras su preparacion. A modo de ejemplo, los polfmeros de la invencion pueden obtenerse mediante polimerizacion por suspension utilizando un procedimiento o bien directo o bien inverso tal como se describe a continuacion y en los ejemplos.
Una suspension directa puede transcurrir tal como sigue: (a) remover o agitar una mezcla que comprende (i) al menos un monomero tal como se definio anteriormente, y al menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible; (ii) un iniciador de polimerizacion presente en cantidades que oscilan entre 0,1 y aproximadamente 2 partes en peso por 100 partes en peso de los monomeros; (iii) un tensioactivo en una cantidad no mayor de aproximadamente 5 partes en peso por 100 partes en peso de los monomeros, preferentemente no mayor de aproximadamente 3 partes en peso y todavfa mas preferentemente en el intervalo de 0,5 a 1,5 partes en peso; y (iv) agua para formar una suspension de aceite en agua; y (b) polimerizar el(los) monomero(s) y el agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible.
Una suspension inversa puede transcurrir tal como sigue: (a) remover o agitar una mezcla que comprende: (i) al menos un monomero tal como se definio anteriormente, y al menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible; (ii) un iniciador de polimerizacion presente en cantidades que oscilan entre 0,1 y aproximadamente 2 partes en peso por 100 partes en peso de los monomeros; (iii) un tensioactivo en una cantidad no mayor de aproximadamente 5 partes en peso por 100 partes en peso de los monomeros, preferentemente no mayor de aproximadamente 3 partes en peso y todavfa mas preferentemente en el intervalo de 0,5 a 1,5 partes en peso; y (iv) aceite para formar una suspension de agua en aceite; y (b) polimerizar los monomeros y el agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible.
Por tanto, en este caso, el procedimiento de preparacion del polfmero cargado con macromoleculas segun la presente invencion comprende la impregnacion del polfmero preformado con las macromoleculas. Por ejemplo, se hace que el polfmero en forma seca se hinche en una disolucion que contiene una cantidad predeterminada de la macromolecula durante de 1 h a 24 h dependiendo de la macromolecula.
El tamano de malla del polfmero descrito anteriormente debe ser suficiente para permitir una penetracion de la macromolecula dentro de la red polimerica. En cualquier caso, debido al gran tamano de la macromolecula, solo de adsorbera sobre la superficie y se observara una rafaga inicial o rapida liberacion de macromoleculas. Un tamano de malla de este tipo puede obtenerse eligiendo con particular atencion la cantidad de agente de reticulacion utilizada.
Para las macromoleculas ionicas, la adsorcion puede favorecerse por la presencia de cargas opuestas sobre la estructura de hidrogel segun la presente invencion, en particular debido a la utilizacion de monomeros de formula (V) para lograr altas eficacias de complejacion.
El procedimiento para la preparacion del polfmero cargado con macromoleculas segun la presente invencion tambien puede ser diferente. Comprende la etapa de mezclar de las macromoleculas con una disolucion que contiene los monomeros y el agente de reticulacion tal como se describio anteriormente antes de la reaccion de reticulacion. Este tipo de procedimiento es mas ventajoso puesto que permite eficacias de incorporacion superiores, un mejor control de la liberacion y evita el efecto de rafaga.
El procedimiento debe disenarse para evitar cualquier contacto con disolventes organicos y calor. De esta forma, la formulacion del polfmero que va a cargarse se realiza con monomeros solubles en agua y agentes de reticulacion que pueden polimerizar a temperatura ambiente o hasta 40°C.
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Un segundo aspecto importante es la liberacion controlada de la macromolecula. La liberacion se producira durante la reabsorcion de la red de polfmero por lo que debe controlarse a traves de diversos parametros como el grado de reticulacion, la naturaleza del agente de reticulacion hidrolizable y la presencia de comonomeros especfficos tal como se describe en la patente n.° PCT/EP 2010/063227. Ademas, la red de polfmero debe permitir la difusion de los productos de degradacion con el fin de mantener un pH adecuado dentro del polfmero para la macromolecula.
Ventajosamente, cuando la reaccion de reticulacion se lleva a cabo mediante polimerizacion por suspension inversa, la disolucion es una disolucion acuosa.
De hecho, la reticulacion de las cadenas polimericas puede lograrse mediante varios metodos:
- Polimerizacion por suspension inversa: en este procedimiento, la polimerizacion se produce en gotitas de agua suspendidas en una fase oleosa. La macromolecula podrfa mezclarse con monomeros hidrofilos y el agente de reticulacion reabsorbible en agua antes de la polimerizacion. La reaccion puede iniciarse por un iniciador soluble en agua tal como persulfato de potasio o amonio en presencia de TEMED como catalizador a temperatura ambiental (Cha, Adv. Funct. Mater., 3056-3062, 2009). Para evitar la utilizacion de tales compuestos, la polimerizacion tambien puede realizarse bajo irradiacion gamma (fotopolimerizacion) (Van Tomme, International Journal of Pharmaceutics, 355, 1-18, 2008).
- En lugar de trabajar en un reactor para realizar la polimerizacion por suspension inversa, pueden formarse microesferas mediante un procedimiento gota a gota. En este caso, una disolucion acuosa compuesta por la macromolecula, monomeros hidrofilos y el agente de reticulacion reabsorbible en agua desciende a traves de una boquilla sobre un medio oleoso y entonces se polimeriza a traves de polimerizacion termica o fotopolimerizacion durante su descenso. (Tokuyama, Reactive & Functional Polymers, 70, 967-971, 2010).
- Tambien puede contemplarse la reticulacion de grupos (met)acrilato a traves de la reaccion de adicion de tipo Michael. Esta reaccion puede realizarse en condiciones fisiologicas.
- Un procedimiento relativamente nuevo utilizando una tecnica de emulsionamiento en membrana desarrollada por SPG Technology Co permite la formacion de microesferas de tamano uniforme. Este metodo puede adaptarse para la incorporacion de compuestos bioactivos gracias a la emulsion doble W/O/W. Sin embargo, actualmente, el tamano de las microesferas esta limitado a 100 mm.
- Otro metodo consiste en incorporar en primer lugar el compuesto bioactivo en una nanocapsula con el fin de proteger el farmaco. Entonces, las nanocapsulas cargadas se cargan ellas mismas sobre el implante reabsorbible preferentemente en forma de microesferas.
Las nanocapsulas presentan un tamano promedio inferior a 1 mm cuando se miden mediante dispersion de la luz. La incorporacion de los farmacos en las nanocapsulas se realiza durante la preparacion de las nanopartfculas que se preparan ellas mismas mediante el metodo de emulsion doble (Pharm Res 15(2): 270-5 1998, J Control Release 75(1-2): 211-24, 2001, Crit Rev Ther Drug Portador Syst. 2002; 19(2):99-134).
El polfmero del que estan compuestas las nanopartfculas se elige preferentemente entre poli(acido lactico) (polilactida), poli(acido glicolico)poliglicolida, copolfmeros de lactida-glicolida, copolfmeros de lactida-glicolida- polietilenglicol, poliortoesteres, polianhfdridos, copolfmeros de bloque biodegradables, poli(esteres), poli(butirolactona), poli(valerolactona), poli(acido malico) y generalmente polilactonas y los copolfmeros de cada de uno o mas de estos polfmeros.
Macromoleculas
Tal como esta prevista en la presente memoria, la macromolecula tal como se definio anteriormente puede ser de cualquier tipo del grupo seleccionado de protefnas y acidos nucleicos y esta prevista para la prevencion o el tratamiento de cualquier enfermedad o alteracion.
Tal como se indico anteriormente, en particular cuando el polfmero de la invencion se obtiene a partir de la polimerizacion de al menos un monomero cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo, la macromolecula se carga sobre el polfmero que se adsorbe sobre el polfmero mediante interacciones no covalentes. Entonces no se impone ningun requisito particular sobre las macromoleculas que van a cargarse.
En particular, la macromolecula se elige del grupo que consiste en enzimas, anticuerpos, citocinas, factor de crecimiento, factores de coagulacion, hormonas, en particular hormona de crecimiento, plasmidos, oligonucleotidos antisentido, ARNip, ribozimas, ADNzimas, aptameros, ventajosamente del grupo que consiste en protefnas antiinflamatorias tales como infliximab y rilonacept, protefnas morfogeneticas oseas, factores angiogenicos tales como factores de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento endoteliales vasculares y TGF-beta, inhibidores de angiogenesis tales como bevacizumab o pegaptanib. Entre los peptidos y las protefnas preferidos
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estan las eritropoyetinas, tales como epoetina alfa, epoetina beta, darbepoetina, hemoglobina raffmero, y analogos o derivados de las mismas; interferones, tales como interferon alfa, interferon alfa-2b, PEG-interferon alfa-2b, interferon alfa-2a, interferon beta, interferon beta-1a e interferon gamma; insulinas; anticuerpos, tales como rituximab, infliximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab y cetuximab; factores sangufneos tales como alteplasa, tenecteplasa, factor VII(a), factor VIII; factores estimulantes de colonias tales como filgrastim, pegfilgrastim; hormonas de crecimiento tales como factor de crecimiento humano o somatropina; interleucinas tales como interleucina-2 e interleucina-12; factores de crecimiento tales como beclapermina, trafermina, ancetism, factor de crecimiento de queratinocito; analogos de LHRH tales como leuprorelina goserelina, triptorelina, buserelina, nafarelina; vacunas, etanercept, imiglucerasa, drotrecogina alfa.
Ventajosamente, los anticuerpos se seleccionan del siguiente grupo: anticuerpo anti-CD3 tal como muromonab (en particular Othroclone OKT3® de J & J-Ortho Biotech), anticuerpo anti-GPIIb/IIIa tal como abciximab (en particular Reopro® de Centocor Lilly), anticuerpo anti-CD20 tal como rituximab (en particular Rituxan® de Idec-Genentech) o ibritumomab (en particular Zevalin® de Biogen Idec) o tositumomab-I131 (en particular Bexxar® de Corixam-GSK), anticuerpo anti-CD25 tal como daclizimab (en particular Zenapax® de Roche) o basilixamab (en particular Simulect® de Novartis), anticuerpo anti-RSV tal como palivizumab (en particular Synagis® de MedImmune), anticuerpo anti- TNFa tal como infliximab (en particular Remicade® de Centocor) o adalimumab (en particular Humira® de Abbott), anticuerpo anti-HER2 tal como trastuzumab (en particular Herceptin® de Genectech), inmunotoxina tal como gemtuzumab (en particular Mylotarg® de Wyeth), anticuerpo anti-CD52 tal como alemtuzumab (en particular Campath®R-1 H de Millennium-ILEX), anticuerpo anti-IgE tal como omalizumab (en particular Xolair® de Genentech), anticuerpo anti-CD11a tal como efalizumab (en particular Raptiva® de Genentech), anticuerpo anti-EGFR tal como cetuximab (en particular Erbitux® de Imclone Systems), anticuerpo anti-VEGF tal como bevacizumab (en particular Avastin® de Genentech) y anticuerpo anti-4a-integrina tal como natalizumab (en particular Tysabri® de Biogen Idec).
Ventajosamente, las hormonas se seleccionan del siguiente grupo: somatropina tal como Norditropin® de Novo Nordisk Inc, lutropina alfa tal como Luveris® de Serono, Inc., folitropina alfa tal como Gonal-f® de Serono, Inc, acetato de sermorelina tal como Geref® de Serono, Inc., epoetina alfa tal como Epogen® de Amgen, Inc., y pegvisomant tal como Somavert® de, Sensus Corporation.
Ventajosamente, las citocinas se seleccionan del siguiente grupo: interferon gamma-1b tal como Actimmune® de InterMune, Inc., interferon beta-1a tal como Avonex® de Biogen idec, interferon alfa-2a tal como Roferon-A® de Hoffmann-La Roche, Inc, interferon beta-1b tal como Betaseron® de Chiron Corp. & Berlex Laboratories, interferon alfa-2b tal como Intron®A de Schering Corporation, interferon alfa-n1 tal como Wellferon® de Glaxo Wellcome Inc., peginterferon alfa-2a tal como Pegasys® de Hoffman-La Roche Inc. y GM-CSF recombinante humano tal como Leucomax ® de Novartis.
Ventajosamente, las citocinas se seleccionan del siguiente grupo de protefnas morfogeneticas oseas (BMP): BMP-2, -3, -3b, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -11, -12, -13, -14, con preferencia por BMP-2, -4, -6, -7 y -9 como inductores de hueso y cartflago para fines de ingenierfa tisular (Bessa, 1-13, 2008, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medecine, Bessa, 81-96, 2008, Journal of Tissue Engineering and Regenerative MedecineJ.
Ventajosamente, los factores proangiogenicos se seleccionan del grupo que consiste en angiopoyetinas, angiogeninas, efrinas, E-selectina, factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) (FGF acido, FGF basico, FGF3-9), factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombospondina, factor de crecimiento transformante-b (TGF-b), factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), factores de crecimiento endoteliales vasculares (VEGF) (VEGFA-121, -145, -165, -189, -206, VEGFB, VEGFC, VEGFD, VEGFE, factor de crecimiento de la placenta) (Lei, 121-132, 2004, Basic Research in Cardiology).
Los acidos nucleicos son macromoleculas con aplicaciones medicas. Estos agentes terapeuticos incluyen plasmidos que contienen transgenes, oligonucleotidos, aptameros, ribozimas, ADNzimas y ARN de interferencia pequenos. Estos farmacos pueden utilizarse para mitigar la enfermedad o bien profilacticamente o bien en un estadio muy temprano, impidiendo la progresion de la enfermedad y sus complicaciones. Entre los acidos nucleicos terapeuticos pueden distinguirse esquematicamente plasmidos, que son ADN circular bicatenario de alto peso molecular (> 1000 pares de bases). Actualmente, solo se comercializa un plasmido (Gendicine) en China desde 2004, que codifica para la protefna p53 supresora de tumores. Este plasmido se transfirio a celulas humanas utilizando un portador de adenovirus. Los oligonucleotidos antisentido son ADN monocatenario con una longitud de 12-28 nucleotidos. Solo se comercializa un oligonucleotido antisentido con el nombre Vitravene (fomivirsen sodico) con indicacion para el tratamiento de retinitis por citomegalovirus inducida en pacientes con sida. Los ARN de interferencia (ARNip) son segmentos de ARN bicatenario de 21 a 23 nucleotidos complementarios con una region de un ARN mensajero que va a degradarse en el citoplasma de la celula. Actualmente, no hay tal ARN en el mercado pese a los ensayos clfnicos alentadores para el producto bevasiranib (Opko Health, Inc.., Miami, FL, EE.UU.; fase III) y ALN-RSV01 (Alnylam, Cambridge, MA, EE.UU., fase II).
Los aptameros son ARN o ADN monocatenarios o bicatenarios que interaccionan especfficamente con una protefna para inactivarla. Se comercializa un aptamero (Macugen, pegaptanib, Eyetech/Pfizer), que actua como inhibidor de VEGF en el tratamiento de la degeneracion macular relacionada con la edad. Los aptameros son moleculas fragiles,
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por ejemplo un aptamero no modificado dirigido contra trombina presenta una semivida in vivo de 108 segundos (Ng et al., 2006). Las modificaciones qufmicas aumentan su estabilidad hacia las nucleasas. Se obtienen aptameros resistentes mediante la modificacion del grupo hidroxilo de 2'-ribosa con fluor, el grupo amino, metilo o anadiendo una molecula de polietilenglicol. El aptamero Macugen modificado con estas sustituciones presenta una semivida de 18 horas en plasma humano (Ng, 123-132, 2006, Nature Reviews,). En comparacion con los anticuerpos, la sfntesis de aptameros es mas simple y por tanto mas economica a diferencia de los anticuerpos que requieren una infraestructura compleja basada en sistemas de expresion de protefnas. Los aptameros pueden considerarse “anticuerpos qufmicos”, que combinan las ventajas de los anticuerpos (especificidad de reconocimiento de antfgeno) con una fabricacion economica.
Todos estos tipos diferentes de acidos nucleicos podrfan cargarse en el polfmero segun la presente invencion.
En una forma de realizacion particular, el polfmero reabsorbible se combina de manera no covalente durante su sfntesis con polfmeros cationicos para la carga de acido nucleico tales como poli(clorhidrato de alilamina), polidialildimetilamonio, polietilenimina, poli(L-lisina), polidopamina, quitosano y dendrfmeros de poliamidoamina. Antes de su utilizacion, el polfmero se carga con acidos nucleicos que se absorben mediante un mecanismo ionico.
El implante reabsorbible comprende un marcador tal como un colorante para controlar su administracion a partir de la jeringa hacia el cilindro del cateter o aguja, o un agente de obtencion de imagenes para su visibilidad en el organismo durante o tras la inyeccion (sulfato de bario, polvo de tungsteno o titanio, compuestos yodados, compuestos paramagneticos tales como partfculas de dextrano-magnetita, derivados de gadolinio, un radionuclido).
Forma del polfmero
Preferentemente, el polfmero de la invencion esta en forma de una pelfcula, una espuma, una partfcula, un grupo, una hebra o una esponja, y todavfa mas preferentemente esta en forma de una partfcula esferica. La partfcula esferica es preferentemente una microesfera, es decir presenta un diametro tras el hinchamiento (es decir tras la hidratacion), que oscila entre 1 y 5000 mm, mas preferentemente que oscila entre 50 y 2500 mm, normalmente entre 50 y 1000 mm (que ya no se fagocita y pasa facilmente a traves de agujas pequenas), mas ventajosamente que oscila entre 100 y 300 mm o entre 300 y 500 mm o entre 500 y 700 mm, o entre 700 y 900 mm, o entre 900 y 1200 mm. Las partfculas esfericas deben presentar un diametro suficientemente pequeno para inyectarse mediante agujas o un cateter, en particular agujas de diametro pequeno pero suficientemente grandes como para evitar que las envuelvan los macrofagos. Las partfculas esfericas pueden inyectarse tras hincharse y por tanto su diametro en este caso podrfa ser de de entre 100 y 300 mm. Su hinchamiento tambien podrfa limitarse, por ejemplo a aproximadamente el 50% de su capacidad total de absorcion de fluidos, antes de la inyeccion, con el fin de que se hinchen principalmente tras la implantacion absorbiendo fluidos fisiologicos tales como el fluido de las heridas, del medio intersticial y de los fluidos sangufneos.
Con el fin de hincharse, el polfmero de la invencion puede absorber, preferentemente de manera controlada, lfquidos, tales como agua, en particular de disoluciones utilizadas comunmente, tales como solucion salina fisiologica, disolucion tamponada, disolucion de glucosa, plasma, medios de contraste yodados ionicos o no ionicos, medios de contraste basados en oxido de hierro para obtencion de imagenes por resonancia magnetica, disoluciones de farmacos, o cualquier lfquido apirogeno esteril que pueda inyectarse en el cuerpo humano o animal. El polfmero de la invencion absorbe una cantidad de agua definida y limitada, lo que permite prever de ese modo, cuando el polfmero es una partfcula esferica, el diametro tras el hinchamiento.
Utilizacion farmaceutica y terapeutica del polimero
Ventajosamente ademas, la resorcion del polfmero de la invencion depende de la hidrolisis y no de un mecanismo enzimatico. Por tanto, puede controlarse facilmente la velocidad de resorcion modulando el tipo y la cantidad de agente de reticulacion biorreabsorbible y monomero tal como se definio anteriormente.
La reabsorcion igualmente ventajosa del polfmero de la invencion puede oscilar entre algunas horas y algunas semanas o incluso algunos meses dependiendo del tipo y de la cantidad de agente de reticulacion biorreabsorbible y el monomero tal como se definio anteriormente. Ademas, el polfmero de la invencion desarrolla solo una respuesta inflamatoria local limitada tras la implantacion, puesto que los productos de degradacion del polfmero no son toxicos y se eliminan rapidamente.
La composicion farmaceutica asf definida contiene un vehfculo farmaceuticamente aceptable, destinado ventajosamente para la administracion mediante inyeccion.
Los ejemplos de vehfculo farmaceuticamente aceptable incluyen, pero sin limitarse a, agua para inyeccion, solucion salina, almidon, hidrogel, polivinilpirrolidona, polisacarido, ester de acido hialuronico y plasma. La composicion farmaceutica tambien puede contener un agente de contraste para obtencion de imagenes por rayos X, RM o US, un agente de tamponamiento, un conservante, un agente de gelificacion, un tensioactivo. Ventajosamente, el portador farmaceuticamente aceptable es solucion salina o agua para inyeccion.
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La composicion farmaceutica debe presentar una viscosidad aceptable para inyeccion. En particular, puede ser de entre 10 y 100 cP, mas ventajosamente de entre 20 y 30 cP cuando se mide a 25°C con un viscosfmetro Couette.
En particular, la composicion farmaceutica inyectable comprende
- (a) un polfmero segun la presente invencion cargado o no con la macromolecula que presenta una conformacion esferica de un diametro de entre 50 y 500 mm tras hincharse de manera total o limitada y un tiempo de reabsorcion de entre dos dfas y 3 semanas;
- (b) un polfmero segun la presente invencion cargado o no con la macromolecula que presenta una conformacion esferica de un diametro de entre 50 y 500 mm tras hincharse de manera total o limitada y un tiempo de reabsorcion de entre uno y 3 meses; y
- (c) al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable;
en la que al menos uno del polfmero (a) o (b) esta cargado con una macromolecula, ventajosamente el polfmero (a) esta cargado con la macromolecula. Ambos polfmeros (a) y (b) podrfan cargarse con una macromolecula, siendo las macromoleculas identicas o diferentes.
En particular, los excipientes farmaceuticamente aceptables pueden ser un hidrogel, por ejemplo que presenta un tiempo de reabsorcion de como maximo 1 semana.
Ventajosamente, las partfculas del polfmero (a) y del polfmero (b) presentan la misma densidad.
En una forma de realizacion ventajosa particular, las partfculas esfericas de los polfmeros (a) y (b) presentan todas el mismo diametro tras hincharse de manera total o limitada, en particular seleccionado en el intervalo de 100 a 300 mm o en el intervalo de 300 a 500 mm, mas ventajosamente en el intervalo de 100 a 300 mm.
La proporcion de polfmero (a) y (b) en la composicion farmaceutica puede ser de entre el 20 y el 80% en peso, ventajosamente de entre el 40 y el 70% en peso, todavfa mas ventajosamente del 60% en peso.
En otra forma de realizacion ventajosa, la proporcion del polfmero (a) es identica a la proporcion del polfmero (b) en la composicion farmaceutica.
En otra forma de realizacion ventajosa, sus proporciones son diferentes. Por ejemplo en este caso, su razon respectiva es: polfmero (a) entre el 60 y el 80%, ventajosamente el 70% en peso, y polfmero (b) entre el 20 y el 40%, ventajosamente el 30% en peso de la cantidad total de polfmero (a) + (b).
En una forma de realizacion particular, las partfculas esfericas de los polfmeros (a) y (b) no presentan el mismo diametro. Ventajosamente, el diametro de las partfculas esfericas del polfmero (a) es de entre 100 y 300 mm y el diametro de las partfculas esfericas del polfmero (b) es de entre 300 y 500 mm.
En otra forma de realizacion ventajosa, las partfculas esfericas del polfmero (a) no presentan todas el mismo diametro. Algunas de ellas presentan un diametro de entre 100 y 300 mm y las otras un diametro de entre 300 y 500 mm, ventajosamente la mitad de ellas presentan un diametro de entre 100 y 300 mm y la otra mitad un diametro de entre 300 y 500 mm.
En una composicion particular segun la presente invencion, las partfculas esfericas del polfmero (a) y las partfculas esfericas del polfmero (b) presentan todas un diametro de entre 100 y 300 mm, siendo la proporcion de partfculas del polfmero (a) del 70% en peso mientras que la proporcion de partfculas del polfmero (b) es del 30% en peso.
En otra composicion particular segun la presente invencion, las partfculas esfericas del polfmero (a) y las partfculas esfericas del polfmero (b) presentan todas un diametro de entre 300 y 500 mm, siendo la proporcion de partfculas del polfmero (a) del 70% en peso mientras que la proporcion de partfculas del polfmero (b) es del 30% en peso.
En una composicion particular adicional segun la presente invencion, las partfculas esfericas del polfmero (a) presentan todas un diametro de entre 100 y 300 mm, y las partfculas esfericas del polfmero (b) presentan todas un diametro de entre 300 y 500 mm, siendo la proporcion de partfculas del polfmero (a) del 50% en peso mientras que la proporcion de partfculas del polfmero (b) es del 50% en peso.
Todavfa en una composicion particular adicional segun la presente invencion, la mitad de las partfculas esfericas del polfmero (a) presentan todas un diametro de entre 100 y 300 mm, teniendo la otra mitad todas un diametro de entre 300 y 500 mm y las partfculas esfericas del polfmero (b) presentan todas un diametro de entre 300 y 500 mm, siendo la proporcion de partfculas del polfmero (a) del 50% en peso mientras que la proporcion de partfculas del polfmero
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(b) es del 50% en peso.
Tras la inyeccion, esta composicion farmaceutica forma un deposito en el sitio de inyeccion.
Estas composiciones son particularmente utiles para el llenado y/o el camuflaje y/o la correccion de arrugas, lineas finas, grietas de la piel, depresiones cutaneas, lipodistrofias, hemiatropfa facial y/o cicatrices, en particular cicatrices de acne y/o el alisado de irregularidades de la piel y/o como matriz para cultivo celular y/o para ingenierfa tisular. De hecho, una gran parte de las partfculas del polfmero (a) se reabsorbe rapidamente in situ para promover la penetracion de tejidos en el deposito. En particular, con el fin de aumentar la penetracion de tejidos, la macromolecula cargada se elige del grupo que consiste en factores de crecimiento (VEGF, bFGF, TGF-b, PDGF, insulina, angiopoyetina).
La reabsorcion es progresiva y se desarrolla en tres fases para ayudar al organismo a considerar el deposito como matriz y no como un cuerpo extrano.
Tras la inyeccion hay varias fases: Durante la fase aguda (algunos dfas), la composicion presenta un efecto de aumento de volumen. Hay admision de agua (controlada) de la composicion debido al hinchamiento de las partfculas del polfmero (a) y en menor grado del polfmero (b). Tambien hay adsorcion de protefnas y adhesion celular sobre la composicion implantada segun la presente invencion. Durante la segundo fase (que dura semanas o meses) se produce la reabsorcion de las partfculas del polfmero (a), lo que crea una porosidad de la masa facilitando su penetracion en las celulas (fibroblastos por ejemplo), comenzando el deposito de colageno y la fibrosis (primera estructura de red). Las partfculas del polfmero (a) se reemplazan por fase de acido hialuronico o colageno. Estas partfculas estan disenadas para ser muy flexibles y se comportan como un gel viscoso lo que facilita la inyeccion y la estabilidad de las partfculas del polfmero (b). La proporcion de estas partfculas se mantendra relativamente baja con el fin de evitar una respuesta inflamatoria global dirigida hacia el deposito. En una tercera fase, durante los siguientes meses, se produce una reabsorcion de las partfculas del polfmero (b) que abriran nuevos canales para un reemplazo total por tejido tisular y su vascularizacion (penetracion fibrovascular).
Debido a este tipo de composicion, la porosidad del deposito obtenido tras la inyeccion aumenta a lo largo del tiempo ademas de la reabsorcion del polfmero segun la presente invencion. La velocidad y la importancia de la reabsorcion se controlan por el polfmero utilizado para la preparacion de la composicion y por tanto por su tiempo de reabsorcion. El tiempo de reabsorcion depende del tipo de monomero utilizado para la preparacion del polfmero y en particular del tipo y de la cantidad del agente de reticulacion.
Por tanto, el polfmero segun la presente invencion permite la obtencion de suspension inyectable de una combinacion de microesferas reabsorbibles que presentan diversos tamanos y tiempos de reabsorcion para producir de manera controlada in situ tras la implantacion de una estructura de soporte o matriz tisular, que se transforma mediante reabsorcion en una estructura porosa disenada para colonizarse por una penetracion de tejido, aumentando la penetracion de tejido por la liberacion controlada de la macromolecula cargada en el polfmero. Con el fin de aumentar la penetracion de tejido, el polfmero segun la presente invencion puede cargarse con macromoleculas tal como se describio anteriormente. Esta liberacion puede controlarse en lo que se refiere a la velocidad de administracion segun la velocidad de reabsorcion del polfmero que las contiene. Puede utilizarse una combinacion de varios polfmeros que contienen diferente macromoleculas para obtener una secuencia de administracion de macromoleculas. Por ejemplo, una composicion para aposito de heridas garantizarfa una administracion de VEGF durante la primera semana y una administracion de TGF-b, PDGF o BFGF durante las siguientes semanas.
Las propiedades de la estructura porosa (conexion y tamano de poro, tiempo de aparicion) estan disenadas para controlar varios factores: la naturaleza de las microesferas reabsorbibles, las proporciones de las diferentes microesferas reabsorbibles asociadas en la suspension, los tamanos de las diferente microesferas reabsorbibles.
La presente invencion tambien se refiere a un implante, en particular para su implantacion en la piel, u otros tejidos y organos, en particular organos profundos tales como rinon o hfgado, cerebro, medula espinal, defectos oseos, espacios anatomicos internos, tales como peritoneo y espacios menfngeos, cavidades corporales, conductos y vasos. El implante se implanta donde es necesario el tratamiento con la macromolecula que se carga en el polfmero.
La terapia local mediante la utilizacion de este tipo de implante se refiere a organos que difieren en su ubicacion, desde la superficie del organismo como la piel, menos accesible como los huesos, u organos profundos tales como el rinon o el hfgado. La accesibilidad a los organos es diferente, muy accesible para la piel cuando se requiere un aposito para heridas ayudado con una macromolecula tal como bFGF, VEGf o eGf, mas invasivo para la administracion de protefnas con el fin de ayudar a la consolidacion de huesos, y requiriendo procedimientos quirurgicos complejos para suministrar de manera local agentes citotoxicos o antiangiogenicos en el entorno de un tumor en un organo interno (hfgado, pulmon). Por lo tanto, las propiedades del polfmero (conformacion, composicion, capacidad de degradacion, rendimientos de liberacion) seran diferentes y estaran adaptadas a un tratamiento especffico.
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Dependiendo del tipo de aplicacion terapeutica o cosmetica deseada, el sitio de aplicacion es diferente. Si la aplicacion deseada se refiere a la cara, el implante se inyecta en el tejido blando, en particular por via subcutanea o intradermica.
Si el implante se inyecta en el tejido, puede aumentar el volumen tisular.
En una forma de realizacion particular, la composicion farmaceutica comprende el pohmero de la invencion en forma seca, tal como en forma liofilizada.
La composicion farmaceutica de la invencion se utilizara preferentemente en el marco de la embolizacion, en particular para embolizacion de las arterias uterinas (EAU), o para la hemostasia. Tambien puede utilizarse en el tratamiento de tumores benignos o malignos, malformaciones arteriovenosas, sangrado gastrointestinal, epistaxis, hemorragia posparto primaria y/o hemorragia quirurgica.
La composicion farmaceutica de la invencion tambien se utiliza preferentemente para tratar cancer. En este caso, el tratamiento puede producirse mediante la administracion de macromoleculas anticancerosas cargadas en el polfmero de la invencion y posiblemente mediante embolizacion, en particular mediante embolizacion repetida. En particular, el cancer de interes se selecciona del grupo que consiste en lesiones hepaticas, normalmente carcinoma hepatocelular (CHC), lesiones renales y/o fibroides uterinos.
La presente invencion tambien se refiere a la utilizacion del implante tal como se describio anteriormente, del polfmero segun la presente invencion o de la composicion tal como se describio anteriormente para el llenado y/o el camuflaje y/o la correccion de arrugas, lmeas finas, grietas de la piel, depresiones cutaneas, lipodistrofias, hemiatropfa facial y/o cicatrices, en particular cicatrices de acne y/o el alisado de irregularidades de la piel y/o como matriz para cultivo celular y/o para ingeniena tisular.
En un aspecto particular de la invencion, es posible utilizar el pohmero y/o la composicion y/o el implante segun la invencion como matriz para cultivo celular, con aplicaciones en particular en cirugfa cosmetica, dermatologfa, reumatologfa y gastroenterologfa. En realidad, el polfmero reabsorbible segun la invencion, en particular en forma de la composicion tal como se describio anteriormente, es un buen sustrato tridimensional para soportar el crecimiento de diversos tipos de celulas.
En cirugfa cosmetica, es posible citar aplicaciones para implantes para el llenado en arrugas o huecos.
En dermatologfa, puede utilizarse para cicatrizar heridas cronicas: como matriz, posibilita el desarrollo tangencial del procedimiento de cicatrizacion y la prevencion de gemacion en caso de cicatrizacion hipertrofica.
En reumatologfa y ortopedia, la utilizacion del pohmero y/o la composicion y/o el implante segun la invencion como matriz para el cultivo celular es particularmente adecuada para la reparacion del cartflago por condroinduccion.
En relacion con las aplicaciones del polfmero y/o la composicion y/o el implante como sustrato tridimensional, para el crecimiento celular de celulas autologas para preparar estructuras de soporte implantables obtenidas mediante ingeniena tisular para la reconstruccion de hueso, cartflago, piel y otros organos.
El polfmero y/o la composicion y/o el implante segun la presente invencion tambien pueden utilizarse para una variedad de procedimientos de aumento y reparacion de tejidos blandos, en particular en el tejido facial tal como por ejemplo camuflaje de cicatrices, llenado de depresiones, alisado de irregularidades, correccion de asimetna en hemiatropfa facial, lipodistrofia facial y camuflaje de arrugas relacionadas con la edad. Puede utilizarse en cirugfa reconstructiva para restablecer la forma y/o la funcion a tejidos blandos alterados por edad, traumatismo, enfermedad u otros defectos. Tambien puede reemplazar la perdida de grasa facial (lipoatrofia), por ejemplo, para proporcionar volumen en zonas de los tejidos blandos del paciente que padecen de perdida de grasa, colageno o musculo por motivos de vejez o enfermedad.
Definiciones
Tal como se usa en la presente memoria, el termino “alquilo” se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente saturado lineal o ramificado, que presenta el numero de atomos de carbono tal como se indica. Por ejemplo, el termino “alquilo Ci-e’ incluye grupos alquilo Ci, C2, C3, C4, C5 y C6. A modo de ejemplo no limitativo, los grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, ferc-butilo, pentilo y hexilo. En un aspecto de la presente invencion, la variedad de grupos alquilo es: alquilo C1-6, alquilo C1-5, alquilo C1-4, alquilo C1-3 y alquilo C1-2.
Tal como se usa en la presente memoria, el termino “arilo” se refiere a un radical carbodclico aromatico insaturado monovalente que presenta uno, dos o tres anillos, que pueden estar condensados o ser bidclicos. En un aspecto de la presente invencion, el termino “arilo se refiere a un anillo monodclico aromatico que contiene 5 o 6 atomos de carbono, un sistema de anillos condensado o bidclico aromatico que contiene 7, 8, 9 o 10 atomos de carbono, o un sistema de anillos tridclico aromatico que contiene hasta 10 atomos de carbono. A tftulo de ejemplo no limitativo, los
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grupos arilo adecuado incluyen fenilo, bifenilo, antracenilo, tiofenilo. En un aspecto de la presente invencion, la variedad de grupos arilo es: arilo C5-20, arilo C5-10, arilo C5-8 y arilo C6-7.
El termino “heteroarilo de 5-30 miembros” se refiere a radicales heterocfclicos aromaticos insaturados monovalentes que contienen de 5 a 30 miembros que presentan uno, dos, tres o mas anillos que contienen al menos un heteroatomo, en particular O, N o S, ventajosamente dos heteroatomos, en particular 3 heteroatomos, que pueden estar condensados o ser bicfclicos. De manera adecuada, el termino “heteroarilo” comprende restos heteroarilo que son sistemas de anillos monocfclicos aromaticos que contienen cinco miembros de los que al menos un miembro es un atomo de N, O o S y que contienen opcionalmente uno, dos o tres atomos de N adicionales, un anillo monocfclico aromatico que presenta seis miembros de los que uno, dos o tres miembros son un atomo de N, anillos condensados o bicfclicos aromaticos que presentan nueve miembros de los que al menos un miembro es un atomo de N, O o S y que contienen opcionalmente uno, dos o tres atomos de N adicionales o anillos bicfclicos aromaticos que presentan diez miembros de de los cuales uno, dos o tres miembros son un atomo de N. A tftulo de ejemplo no limitativo, los grupos heteroarilo adecuados incluyen furanilo, piridilo, ftalimido, tiofenilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, pironilo, pirazinilo, tetrazolilo, tionaftilo, benzofuranilo, indolilo, oxiindolilo, isoindolilo, indazolilo, indolinilo, azaindolilo, benzopiranilo, cumarinilo, isocumarinilo, quinolilo, isoquinolilo, cinolinilo, quinazolinilo, benzoxazinilo, cromenilo, cromanilo, isocromanilo, tiazolilo, isoxazolilo, isoxazolonilo, isotiazolilo, triazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, triazil-carbazol, porfirina, trifenilenos y piridazilo, ventajosamente piridina, carbazol, porfirina, trifenilenos.
Ejemplos
Ejemplo 1
1. Sfntesis del agente de reticulacion biorreabsorbible mediante el metodo de HEMA/PEGMA:
- Primera etapa: En un recipiente Schlenk seco que contiene una barra de agitacion magnetica, se disolvieron lactida (2,22 g; 0,0154 mol) y metacrilato de hidroxietilo (0,75 ml; 0,0062 mol) en 5 ml de tolueno bajo nitrogeno. Se inicio la reaccion introduciendo una disolucion en tolueno de Sn(Oct)2 (8 mg) en el sistema anterior. Tras 20 h a 90°C, se anadieron 5 ml de cloroformo para diluir la mezcla de reaccion y se purifico el polfmero formado mediante precipitacion en un gran volumen de eter de petroleo. Rendimiento del 94%.
1H RMN en CD3COCD3: 1,53 (m, CH3, PLA), 1,91 (s, CH3, metacrilato), 4,38 (m, CH2, HEMA), 5,17 (m, CH, PLA), 5,65-6,10 (m, CH2=C).
- Segunda etapa: Se modifico adicionalmente el polfmero formado en la primera etapa a traves del grupo hidroxilo en el extremo de la cadena de PLA haciendolo reaccionar con cloruro de metacriloflo. Se disolvio el polfmero preformado (1,07 mmol de grupo OH, 1 eq.) en CH2Cl2 anhidro (2,5 ml) en un matraz de tres bocas equipado con un agitador magnetico y un embudo de goteo. Se enfrio el contenido del matraz hasta 0°C y se anadio trietilamina (1,5 eq.; 0,0016 mol). Se agito la disolucion y entonces se anadio cloruro de metacriloflo (1,5 eq.; 0,0016 mol) en CH2Cl2 (2,5 ml) gota a gota a la disolucion. Se continuo con la agitacion durante 1 h a 0°C y luego durante una noche a temperatura ambiente. Se retiro por filtracion la sal de trietilamina y se precipito el polfmero en un gran volumen de eter de petroleo. Rendimiento: el 95%.
1H RMN en CD3COCD3: 1,53 (m, CH3, PLA), 1,91 (m, CH3, metacrilato), 4,39 (m, CH2, HEMA), 5,17 (m, CH, PLA), 5,65-6,16 (m, CH2=C).
2. Sfntesis del agente de reticulacion biorreabsorbible mediante el metodo de PEG:
- Primera etapa: En un recipiente Schlenk seco que contiene una barra de agitacion magnetica, se hizo reaccionar PEG600 (10 g; 0,0167 mol) con d, I-lactida (7,2 g; 0,05 mol) y glicolida (5,8 g; 0,05 mol) durante 20 h a 115°C utilizando octoato estannoso como catalizador (114 mg) bajo argon. Entonces, se disolvio el polfmero en cloroformo, se precipito en un gran volumen de eter de petroleo / dietil eter (50/50), luego en eter de petroleo puro.
1H RMN en CDCh: 1,55 (m, CH3, PLA), 3,64 (m, CH2, PEG), 4,25 (m, CH2, PEG), 4,80 (m, CH2, PGA), 5,20 (m, CH, PLA)
- Segunda etapa: Se modifico adicionalmente el polfmero formado en la primera etapa a traves de grupos hidroxilo en el extremo de PLGA haciendolo reaccionar con anhfdrido metacrflico. En una reaccion tfpica, se disolvio el polfmero preformado (4,91 g) en acetato de etilo desgasificado (25 ml) en un tubo Schlenk seco provisto de un agitador magnetico. Se enfrio el contenido del matraz hasta 0°C y se anadio anhfdrido metacrflico (3,3 ml.; 0,022 mol) gota a gota a la disolucion bajo un flujo de argon. Se continuo con la agitacion durante 1 h a 0°C y luego durante 6 h a 80°C. Tras enfriar, se precipito el polfmero tres veces en un gran volumen de eter de petroleo.
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1H RMN en CDCI3: 1,56 (m, CH3, PLA), 1,94 (m, CH3, metacrilato), 3,63 (m, CH2, PEG), 4,29 (m, CH2, PEG), 4,80 (m, CH2, PGA), 5,20 (m, CH, PLA), 5,64-6,15 (m, CH2=C)
Se ha sintetizado una serie de agentes de reticulacion biorreabsorbibles variando el peso molecular del PEG, y la longitud y la composicion qufmica del segmento reabsorbible (tabla 1).
Tabla 1. Agentes de reticulacion reabsorbibles
Codigo
PEG (g.mol-1) Lact./glic. (% en moles) GP seamento reabs*
EG-PLGA12
44 50/50 12
TEG-PLGA12
176 50/50 12
TEG-PLGA20
176 50/50 20
TEG-PLA12
176 100/0 12
PEG13PLGA12
600 50/50 12
PEG13PLA12
600 100/0 12
PEG22PLGA12
1000 50/50 12
PEG22PLGA8
1000 50/50 8
PEG1aPLA12
1000 100/0 12
PEG13PCL6
600 PCL100 6
*: grado de polimerizacion del segmento reabsorbible de agentes de reticulacion reabsorbibles. Ejemplo 2: Sfntesis de hidrogeles reabsorbibles:
1. En disolvente organico G n.° 1
Se disolvio el agente de reticulacion reabsorbible PEG22PLGA12 (5% en moles) en 1 ml de tolueno y se desgasifico bajo nitrogeno. A esto se le anadio metacrilato de metil eter de polietilenglicol, Mw 300 (95% en moles) y hexanotiol (3% en moles/mol de PEGMA). Se disolvio el 1% en moles de AIBN en 1 ml de tolueno y se anadio a la disolucion de monomeros. Se calento la mezcla a 80°C durante 8 h. Tras enfriar, se lavo el polfmero dos veces con acetona y luego con agua destilada. Discos de hidrogel (7 mm de grosor y 21 mm de diametro) colocados en un vial de vidrio que contenfa 50 ml de NaOH 0,1 N a 37°C con agitacion se degradaron totalmente (ausencia de residuo visible) en 10 min.
2. En disolvente acuoso G n.° 2
Se disolvio el agente de reticulacion reabsorbible PEG22PLGA8 (0,33 g, 0,2 mmol) en 3 ml de agua destilada y se desgasifico. A esto se le anadio metacrilato de metil eter de polietilenglicol, Mw 475 (1,9 g, 4 mmol), tetrametiletilendiamina (12 ml) y acido tioglicolico (10 mg). Se disolvieron 180 mg de peroxodisulfato de amonio en
0. 2 ml de agua destilada y se anadieron a la disolucion de monomeros. Se calento la mezcla a 40°C durante 30 min. Tras enfriar, se lavo el polfmero con agua destilada y se liofilizo.
Unos discos de hidrogel (4 mm de grosor y 10 mm de diametro) colocados en un vial de vidrio que contenfa 10 ml de NaOH 0,1 N se degradaron totalmente (ausencia de residuo visible) en 10 min.
Ejemplo 3: Microesferas reabsorbibles mediante polimerizacion por suspension directa
1. Preparacion de microesferas reabsorbibles
Se introdujo un 0,5% de disolucion acuosa de poli(alcohol vinflico) hidrolizado al 88% (120 ml) que contenfa NaCl al 3% en un reactor de 250 ml y se dejo permanecer bajo una atmosfera de nitrogeno durante 15 min. Se desgasifico la fase de monomeros que contenfa metacrilato de metil eter de polietilenglicol, agente de reticulacion reabsorbible, agente de transferencia de cadena (3% en moles/mol de PEGMA) y el 1% en moles de AIBN solubilizado en 7,5 ml de tolueno burbujeando nitrogeno a traves de la disolucion durante 15 min. Se anadio la fase de monomeros a la fase acuosa a 80°C y se agito durante 8 h. Se filtro la mezcla en caliente y se lavo con acetona y agua. Entonces, se liofilizaron las perlas.
Se ha sintetizado una serie de microesferas reabsorbibles variando la naturaleza del agente de reticulacion y el monomero de PEG (tabla 2).
Tabla 2. Microesferas reabsorbibles: Velocidad de degradacion
Agente de reticulacion (% en moles) PEGMA (% en moles) MDO (% en moles) Perdida de peso a,b Mn (kDa)c
MS n.° 1
PEG13PLGA12 (3%) DEGMA - 97% 0 23% a 1 mes, 100% a los 4
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meses
MS n.° 2
PEG13PLGA12 (5%) PEGMA300 - 95% 0 20% a las 8 h, 80% a las 24 h
MS n.° 3
PEG13PLA12 (5%) PEGMA300 - 95% 0 80% a los 4 dfas, 100% a los 7 dfas
MS n.° 4
PEG22PLGA12 (5%) PEGMA300 - 95% 0 26% a las 8 h, 100% a las 24 h 55
MS n.° 5
PEG22PLGA12 (5%) PEGMA300 - 90% 5 100% a las 24 h
MS n.° 6
PEG22PLGA12 (5%) PEGMA300 - 85% 10 100% a las 24 h
MS n.° 7
PEG22PLGA12 (5%) PEGMA300 - 75% 20 100% a las 24 h 27
MS n.° 8
PEG22PLGA12 (5%) PEGMA300 - 65% 30 100% a las 48 h 15
a PBS, pH 7,4 a 37°C
b Perdida de peso (%) = (W0 - Wt)/W0 x 100 donde W0 y Wt son el peso seco de la muestra antes y despues de la degradacion, respectivamente.
c Peso molecular de las cadenas polimericas tras la degradacion
La velocidad de degradacion de estas microesferas puede adaptarse variando la composicion qufmica del agente de reticulacion y/o la naturaleza del monomero de PEG desde menos de 1 dfa hasta 4 meses. Por ejemplo, la degradacion de microesferas que contienen DEGMA (MS n.° 1) fue mas lenta que la de microesferas compuestas por PEGMA300 (MS n.° 2). Los segmentos reabsorbibles compuestos por PLA (MS n.° 3) ralentizaron la degradacion de las microesferas en comparacion con el agente de reticulacion que contenfa PLGA (MS n.° 2). La longitud de PEG en el agente de reticulacion reabsorbible modifico lel destino de las microesferas: se produce una degradacion mas rapida con PEG22 (MS n.° 4) en comparacion con PEG13 (MS n.° 2).
El monomero cfclico no modifica notablemente la velocidad de reabsorcion. Ademas, el monomero cfclico reduce el peso molecular de la cadena polimerica residual tras la degradacion.
2. Control del tamano
Es completamente posible lograr distribuciones de tamano definidas a traves de un intervalo considerable de tamanos de partfcula variando simplemente la velocidad de agitacion, la razon de agua con respecto a la fase de monomeros, y la concentracion del estabilizador de poli(alcohol vinflico). Se determino la distribucion del tamano de partfcula mediante difraccion de laser en un aparato Mastersizer S (Malvern Instrument Ltd.) a 25°C. Se dispersaron perlas secas en agua y se dejo que se hincharan durante 15 min antes de la medicion. Se analizo cada inyeccion 3 veces.
La combinacion de estos factores permite la preparacion de intervalos de tamano que oscilan entre 220 mm (260 rpm, O/W = 1/11), y 317 mm (215 rpm, O/W = 1/8), y 614 mm (160 rpm, O/W = 1/6) y 1144 mm (120 rpm, O/W = 1/6).
Ejemplo 4: Preparacion de microesferas reabsorbibles mediante polimerizacion por suspension inversa, MS n.° 9
Se introdujo una disolucion de Span80® (0,2% en peso) disuelta en 88 ml de aceite de parafina en un reactor de 250 ml reactor y se dejo estar bajo una atmosfera de nitrogeno durante 15 min. Se desgasifico la fase de monomeros que contenfa metacrilato de metil eter de polietilenglicol, Mw 475 (4,47 g, 95% en moles), agente de reticulacion PEG22-PLGA8 (0,86 g, 5% en moles), mercaptobutanol (29 ml, 3% en moles/mol de PEGMA) y peroxido- disulfato de amonio al 1% en peso solubilizado en 7,5 ml de agua burbujeando nitrogeno a traves de la disolucion durante 15 min. Se anadio la fase de monomeros a la fase organica a 70°C y se agito durante 2 h. Se filtro la mezcla en caliente y se lavo con agua y acetona. Entonces, se liofilizaron las perlas.
Ejemplo 5: Sfntesis de microesferas reabsorbibles ionicas
Se uso el mismo procedimiento mediante polimerizacion por suspension directa que en el ejemplo 3, pero se anadio un monomero ionico en la fase de tolueno (tabla 3).
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Tabla 3. Microesferas reabsorbibles ionicas: Velocidad de degradacion
Monomero ionico % en moles de monomero ionico Agente de reticulacion3/ monomero MDO (% en moles) Perdida de pesob,c
MS n.° 10
Acrilato de B- carboxietilo 10 PEG13PLGA12/PEGMA300 0 100% a las 24 h
MS n.° 11
Acido metacrflico 10 PEG13PLGA12/DEGMA 0 98% a los 14 dfas
MS n.° 12
Acido metacrflico 10 PEG13PLGA12/PEGMA300 0 100% a los 7 dfas
MS n.° 13
Acido metacrflico 10 PEG22PLGA12/PEGMA300 0 100% a los 7 dfas
MS n.° 14
Acido metacrflico 10 PEG13PLGA12/PEGMA300 0 95% a las 24 h
MS n.° 15
Acido metacrflico 20 PEG13PLGA12/PEGMA300 2,5 100% a las 24 h
MS n.° 16
Acido metacrflico 50 PEG22PLGA12/PEGMA300 5 100% a las 12 h
a Microesferas preparadas con agente de reticulacion al 3 o al 5% en moles bPBS, pH 7,4 a 37°C
c Perdida de peso (%) = (W0 - Wt)/W0 x 100 donde W0 y Wt son el peso seco de la muestra antes y despues de la dearadacion, respectivamente.
Se han sintetizado satisfactoriamente microesferas que contienen diversas cantidades de MDO y diferentes monomeros anionicos. Su velocidad de dearadacion en tampon salino no resulto influida por la cantidad de MDO pero resulto influida por la cantidad de monomero ionico, que resulta de una composicion hidrofila superior de la matriz de polfmero.
Ejemplo 6: Sfntesis de hidrogeles reabsorbibles que contienen ciclodextrinas.
Preparacion de monometacrilato de B-ciclodextrina
Se sintetizo el monomero de manera similar a un metodo descrito anteriormente (Ren et al. Journal of polymer science, parte A 2009, 4267-4278).
Etapa 1. Rendimiento = el 51%. 1H RMN (300 MHz, DMSO-de): 7,74 (d, 2H, tosilo), 7,45 (d, 2H, tosilo), 4,844,77 (m, 7H, O-CH-O), 3,70-3,45 (m, 28H), 3,40-3,20 (m, 14H), 2,43 (s, 3H, Ph-CHa)
Etapa 2. Rendimiento = el 69% 1H RMN (300 MHz, D2O): 9,26 (s, CHO), 5,20-5,10 (m, 7H, O-CH-O), 4,04-3,90 (m, 26H), 3,73-3,60 (m, 14H)
Etapa 3. Rendimiento = el 71%. 1H RMN (300 MHz, D2O): 6,22 (s, =CH), 5,89 (s, =CH), 5,11 (d, 7H, O-CH-O), 4,04-3,88 (m, 28H), 3,71-3,59 (m, 14H), 3,05 (s, 2H, CH2-OCO), 2,90 (s, 2H, CH2-NH), 2,04 (s, 3H, CH3-C=)
2. Preparacion de hidrogeles reabsorbibles con monometacrilato de B-ciclodextrina. G n.° 3
En primer lugar se solubilizo el monometacrilato de B-ciclodextrina en 4,5 ml de agua destilada/DMSO (3/1 en vol.). A esto se le anadio en este orden, el agente de reticulacion reabsorbible PEG22-PLGA8 (0,33 g, 0,2 mmol), metacrilato de metil eter de polietilenglicol, Mw 475 (1,71 g, 3,6 mmol), 2-metilen-1,3-dioxepano (0,023 g, 0,2 mmol), tetrametiletilendiamina (12 ml) y acido tioglicolico (10 mg). Se disolvieron 180 mg de peroxodisulfato de amonio en
0. 5 ml de agua destilada y se anadieron a la disolucion de monomeros. Se calento la mezcla a 40°C durante 30 min. Tras enfriar, se lavo el polfmero con agua destilada y se liofilizo.
Discos de hidrogel G n.° 3 (4 mm de grosor y 10 mm de diametro) colocados en un vial de vidrio que contenfa 10 ml de NaOH 0,1 N se degradaron totalmente (ausencia de residuo visible) en 10 min.
Ejemplo 7: Sfntesis de hidrogeles reabsorbibles que contienen eter corona
1. Preparacion de 18-corona-6-metacrilato
Se disolvio 2-hidroximetil-18-corona-6 (1 mmol) en CH2O2 desgasificado (10 ml) en un tubo Schlenk equipado con agitador magnetico. Se enfrio el contenido del matraz hasta 0°C y se anadio trietilamina (3 mmol). Se agito la disolucion y entonces se anadio cloruro de metacriloflo (3 mmol) gota a gota a la disolucion. Se continuo con la agitacion 2 h a 0°C y luego durante la noche a temperatura ambiente. Se extrajo la mezcla de reaccion con
5
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disolucion de HCl 1 M, se lavo con agua, luego con disolucion saturada de Na2CO3 y se seco sobre MgSO4. Tras la filtracion y evaporacion del disolvente, se purifico el residuo mediante cromatograffa sobre gel de sflice (eluyente CHCl3/MeOH 9/1) para obtener 194 mg (rendimiento del 54%) de 2-metacrilato de metilo-18-corona-6. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): 6,11 (s, 1H, =CH2), 5,57 (s, 1H, =CH2), 4,32-4,15 (m, 2H, CH2-OCO), 3,81-3,68 (m, 23H, CH2-O), 1,95 (s, 3H, CH3)
2. Preparacion de hidrogeles reabsorbibles con eter corona G n.°4
Se disolvio el agente de reticulacion reabsorbible PEG22-PLGA12 (0,22 g, 0,125 mmol) en 0,8 ml de tolueno y se desgasifico bajo nitrogeno. A esto se le anadio metacrilato de eter corona (0,27 g, 0,75 mmol), metacrilato de metil eter de polietilenglicol, Mw 300 (0,49 g, 1,62 mmol), 2-metilen-1,3-dioxepano (14,3 mg, 0,125 mmol) y hexanotiol (7 ml). Se disolvio el 2% en moles de AIBN en 0,2 ml de tolueno y se anadio a la disolucion de monomeros. Se calento la mezcla a 80°C durante 8 h. Tras enfriar, se lavo el polfmero dos veces con acetona y luego con agua destilada.
Unos discos de hidrogel (4 mm de grosor y 10 mm de diametro) colocados en un vial de vidrio que contema 10 ml de NaOH 0,1 N se degradaron totalmente (ausencia de residuo visible) en 12 h.
Ejemplo 8: Sfntesis de hidrogeles reabsorbibles que contienen PEI
Se disolvio el agente de reticulacion reabsorbible PEG22PLGA8 (5% en moles) en 3 ml de agua destilada y se desgasifico bajo nitrogeno. A esto se le anadio polietilenimina (PEI), metacrilato de metil eter de polietilenglicol, Mw 475 (95% en moles), tetrametiletilendiamina (7 ml) y acido tioglicolico (12 ml). Se disolvio el 1,5% en moles de peroxodisulfato de amonio en 0,5 ml de agua destilada y se anadio a la disolucion de monomeros. Se calento la mezcla a 40°C durante 30 min. Tras enfriar, se lavo el polfmero con agua destilada.
Unos discos de hidrogel (4 mm de grosor y 10 mm de diametro) colocados en un vial de vidrio que contema 10 ml de NaOH 0,1 N se degradaron totalmente (ausencia de residuo visible) en 2 min.
Se ha sintetizado una serie de geles con cantidad creciente de PEI (tabla 4).
Tabla 4. Hidrogeles reabsorbibles que contienen PEI
Agente de reticulacion PEG22-PLGA8 (% en moles) PEG475MA (% en moles) PEI (peso/peso de monomeros)
G n.° 5
5 95 1/500
G n.° 6
5 95 1/250
G n.° 7
5 95 1/100
G n.° 8
5 95 1/50
Ejemplo 9: Sfntesis de hidrogeles reabsorbibles que contienen tripsina
Se disolvio el agente de reticulacion reabsorbible PEG22PLGA8 (5% en moles) en 11,5 ml de agua destilada y se desgasifico bajo nitrogeno. A esto se le anadio tripsina, metacrilato de metil eter de polietilenglicol, Mw 475 (95% en moles), tetrametiletilendiamina (30 ml) y acido tioglicolico (26 mg). Se disolvio el 1,5% en moles de peroxodisulfato de amonio en 0,5 ml de agua destilada y se anadio a la disolucion de monomeros. Se calento la mezcla a 40°C durante 30 min. Tras enfriar, se lavo el polfmero con agua destilada.
Unos discos de hidrogel (4 mm de grosor y 10 mm de diametro) colocados en un vial de vidrio que contema 10 ml de NaOH 0,1 N se degradaron totalmente (ausencia de residuo visible) en 2 min.
Se ha sintetizado una serie de geles con cantidad creciente de tripsina (tabla 5).
Tabla 5. Hidrogeles reabsorbibles que contienen tripsina
Agente de reticulacion PEG22-PLGA8 (% en moles) PEG475MA (% en moles) Tripsina (mg)
G n.° 9
5 95 0
G n.° 10
5 95 5
G n.° 11
5 95 10
Ejemplo 10: Sfntesis de hidrogeles reabsorbibles que contienen bFGF
Se disolvio el agente de reticulacion reabsorbible PEG22PLGA8 (5% en moles) en 14 ml de agua destilada y se desgasifico bajo nitrogeno. A esto se le anadio bFGF, metacrilato de metil eter de polietilenglicol, Mw 475 (95% en
5
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moles), tetrametiletilendiamina (30 ml) y acido tioglicolico (30 mg). Se disolvio el 1,5% en moles de peroxodisulfato de amonio en 0,5 ml de agua destilada y se anadio a la disolucion de monomeros. Se calento la mezcla a 40°C durante 30 min. Tras enfriar, se lavo el polfmero con agua destilada.
Unos discos de hidrogel (4 mm de grosor y 10 mm de diametro) colocados en un vial de vidrio que contenfa 10 ml de NaOH 0,1 N se degradaron totalmente (ausencia de residuo visible) en 10 min.
Se ha sintetizado una serie de geles con cantidad creciente de bFGF (tabla 6).
Tabla 6. Hidrogeles reabsorbibles que contienen bFGF
Agente de reticulacion PEG22-PLGA8 (% en moles) PEG475MA (% en moles) bFGF (mg)
G n.° 12
5 95 10
G n.° 13
5 95 50
G n.° 14
5 95 100
Ejemplo 11: Carga de Avastin® en microesferas reabsorbibles
Bevacizumab (Avastin®) es un anticuerpo IgG monoclonal humanizado, cuyos valores de punto isoelectrico (pI) aparente de las isoformas respectivas son 8,26, 8,45 y 8,59 (Vlckova et al., 2008 J. Chromatogr. A, 1181: 145-152). A pH 7, el anticuerpo esta cargado positivamente y podrfa inmovilizarse sobre microesferas anionicas.
1- Carga del anticuerpo
En agua, se mezclaron 100 ml de microesferas esterilizadas descritas en los ejemplos 3 y 5 (100-300 mm) con 1 ml de agua a pH 7 antes de la adicion de la disolucion de anticuerpo (Avastin® 25 mg/ml, Roche). Tras el mezclado, se incubaron los tubos de ensayo horizontalmente a 37°C con agitacion durante 1 h. Se determino el anticuerpo residual en agua usando el metodo de acido bicinconfnico (BCA protein Reagent, Sigma) con BSA como patron de protefna (tabla 7).
Tabla 7. Porcentaje de carga de anticuerpo obtenido a pH 7 con 100 ml de granulos de microesferas en 1 ml de medio
MS n.° 3 MS n.° 12 MS n.° 2 MS n.° 14 Control de microesfera*
Naturaleza de las microesferas
PLA PLA PLGA PLGA
% de MA
0 10 0 10 -
Avastin® (300 mg)
5 100 12 100 92
Avastin® (600 mg)
0,6 97 9 100 100
Avastin® (1300 mg)
0,3 45 0 100 100
* HepaSphere™/ QuadraSphere™ (BioSphere Medical)
Se produjo la union del anticuerpo sobre las microesferas que contenfan acido metacrflico (MS n.° 12 y 14) lo que sugiere que se forman uniones electrostaticas entre el anticuerpo cargado positivamente y las funciones de acido carboxflico de la MS anionica. Por el contrario, se observo muy baja o ninguna inmovilizacion de anticuerpo con MS que no contenfan acido metacrflico (MS n.° 2 y 3). La union ionica de bevacizumab a las microesferas anionicas se demostro con partfculas de embolizacion de referencia, HepaSphere™/ QuadraSphere™. Resulta interesante que las microesferas anionicas reabsorbibles construidas con agentes de reticulacion reabsorbibles de PLGA parecen ser mas eficaces para la immobilizacion de bevacizumab.
2- Evaluacion de la liberacion del anticuerpo de las microesferas
Se retiro el medio de carga y se reemplazo por el mismo volumen de tampon fosfato salino. Se mezclaron los granulos y se retiro el medio a intervalos regulares y se reemplazo por PBS reciente. La liberacion del anticuerpo se realizo a 37°C con agitacion. Se determino la cantidad de bevacizumab liberada en el medio utilizando el metodo de BCA. Tras la incubacion (1 h a 37°C), se midio la absorbancia a 550 - 570 nm y se obtuvo la cantidad de anticuerpo libre mediante extrapolacion de la curva patron utilizando albumina serica bovina (tabla 8).
5
10
15
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25
30
Tabla 8. Liberacion de bevacizumab en tampon salino (37°C). Cantidad de proteinas medida en el medio de liberacion para carga de Avastin® (1300 mg de proteinas) realizada en 100 ml de granulos de microesferas.
MS n.° 12 MS n.° 14 Control de microesfera*
Naturaleza de las microesferas
PLA PLGA -
% de MA
10 10 -
5 min en PBS (mg de proteinas)
5,4 39,7 571,5
1 h en PBS (mg de proteinas)
179,2 348,2 329,4
2 h en PBS (mg de proteinas)
80,7 168 31,6
4 h en PBS (mg de proteinas)
89,6 204 0
24 h en PBS (mg de proteinas)
192,7 164,8 0
48 h en PBS (mg de proteinas)
48,2 70,3 0
Cantidad total de anticuerpo liberado (mg) (% de carga inicial)
595 (100%) 995 (81%) 932 (70%)
* HepaSphere™/ QuadraSphere™ (BioSphere Medical)
Se produjo una liberacion sostenida de bevacizumab de las microesferas reabsorbibles anionicas durante 48 h de incubacion en PBS sin rafaga inicial. Por el contrario, se observo una rafaga de liberacion de anticuerpo para el producto de quimioembolizacion de referencia, HepaSphere™/ QuadraSphere™, que libero aproximadamente el 70% de la dosis inicial del anticuerpo inmovilizado en la primera hora.
3- Actividad in vitro del anticuerpo liberado: inhibicion de proliferacion de HUVEC
Se sembraron celulas endoteliales umbilicales humanas (HUVEC) en placas de 96 pocillos (Nunc) a una densidad de 5000 celulas por pocillo en medio EGM-2 completo (Lonza) con todos los aportes complementarios de cultivo celular. El dfa posterior a la siembra, se mezclaron las fracciones liberadas recogidas durante experimentos de liberacion in vitro con medio EBM-2 que contenfa 50 ng/ml de VEGF de raton (R&D) y se cultivaron las celulas HUVEC durante 3 dfas hasta el analisis de la lisis celular. La cantidad de bevacizumab liberado anadido a las celulas fue de 100 y 500 ng/ml. Como control positivo, se trataron las celulas con diluciones de Avastin®. Se determino la lisis celular midiendo la densidad optica (DO) de la actividad lactato deshidrogenasa (Promega) en medio de cultivo celular al final del cultivo (tabla 9).
Tabla 9. Eficacia in vitro de fracciones liberadas recogidas de microesferas reabsorbibles cargadas con bevacizumab. La neutralizacion de VEGF con bevacizumab aumento la lisis de HUVEC
MS n.° 12
Avastina libre (ng/ml)
100 ng/ml 500 ng/ml
Control 0
100 500 1000 1 h de liberacion 24 h de liberacion 1 h de liberacion 24 h de liberacion
Actividad LDH en medio de cultivo celular (DO 450 nm)
0,203 ± 0,011 0,191 ± 0,024 0,286 ± 0,055 0,417 ± 0,065 0,204 ± 0,019 0,197 ± 0,028 0,331 ± 0,055 0,305 ± 0,064
pa
NS 0,0039 0,0039 NS NS 0,0039 0,0039
pb
NS NS
pc
0,0370 0,0370
MS n.° 14 | |
Avastina libre (ng/ml) 100 ng/ml 500 ng/ml
Control 1 h de 24 h de 1 h de 24 h de
0 100 500 1000 liberacion liberacion liberacion liberacion
Actividad LDH en medio de cultivo celular (DO 450 nm)
0,203 ± 0,191 ± 0,024 0,286 ± 0,417 ± 0,065 0,215 ± 0,191 ± 0,38 ± 0,412 ±
0,011
0,055 0,024 0,024 0,104 0,084
pa
NS 0,0039 0,0039 NS NS 0,0039 0,0039
pb
NS 0,0104
pc
1 1 1 1 1 NS NS
a: Se realizaron comparaciones entre los tratamientos con control (sin bevacizumab) y con bevacizumab (fracciones de Avastin® libre y de liberacion) segun la prueba de Mann-Whitney no parametrica. La significacion se fijo a p < 0,05. NS: no significativo
b: Comparaciones entre 500 ng de anticuerpo liberado (1 h y 24 h) y bevacizumab libre a 500 ng/ml (prueba de Mann-Whitney no parametrica, la significacion se fijo a p < 0,05).
5
10
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30
35
40
45
50
c: Comparaciones entre 500 ng de anticuerpo liberado (1 h y 24 h) y bevacizumab libre a 1000 ng/ml (prueba de Mann-Whitney no parametrica, la significacion se fijo p < 0,05).
Durante el ensayo basado en celulas, bevacizumab control (Avastin® 25 mg/ml, Roche) a 0,5 y 1 mg/ml aumento (p< 0,05) la liberacion de la lactato deshidrogenasa intracelular en el medio de cultivo celular lo que indica acontecimientos de muerte celular.
Se observo significativamente (p< 0,05) un aumento del escape de la lactato deshidrogenasa de las HUVEC con fracciones recogidas tras 1 h y 24 h de incubacion de MS n.° 12 y 14 reabsorbibles ionicas en PBS en comparacion con control sin tratamiento con anticuerpo. El anticuerpo liberado de MS n.° 12 (500 ng/ml) redujo la viabilidad celular tal como se mide con la misma dosis de control con Avastin®. El anticuerpo liberado de MS n.° 14 fue equivalente a la actividad biologica inducida con 1 mg/ml de anticuerpo control.
Estos resultados indican que se conservo la actividad biologica de bevacizumab eluido de microesferas degradables. En conclusion, las microesferas ionicas reabsorbibles liberan el anticuerpo bevacizumab no desnaturalizado funcional.
Ejemplo 12: Carga de bFGF en microesferas
1- Carga de citocina
Se retiro el agua por aspiracion de 100 ml de microesferas esterilizadas (100-300 mm) hidratadas previamente. Se disolvio el factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano liofilizado (rh-bFGF) (Fiblast, Trafermin, Kaken Pharmaceutical Co., Inc (Tokio, Japon)) en agua esteril ajustada a pH 7 (0,33 mg de bFGF/ml). A los granulos de microesferas, se anadieron 50 ml de disolucion Fiblast, y tras mezclar suavemente mediante inversion, se logro la union de la citocina a las partfculas durante la noche a 4°C (tabla 10).
Tabla 10. Carga de Fiblast (en % de dosis inicial) obtenida a pH 7 (4°C, durante la noche) con 100 ml de granulos de microesferas
MS n.° 3 MS n.° 12 MS n.° 2 MS n.° 14 DCBeads 700-900 mm
Naturaleza de las microesferas
PLA PLA PLGA PLGA -
% de MA
0 10 0 10 -
% de carga de Fiblast
75 49 66 23 88
Cantidad de citocina inmovilizada (mg)
12,3 8 10,9 3,8 14,5
La carga de citocinas sobre microesferas reabsorbibles anionicas es eficaz tal como se obtiene con CD beads anionicas de referencia. La union a microesferas reabsorbibles sin acido metacrflico parece ser mas eficaz (MS n.° 3 y MS n.° 2) que la observada con microesferas que contienen acido metacrflico (MS n.° 12 y MS n.° 14). Las protefnas basicas fuertes (pi proximo a 10) probablemente interaccionan fuertemente con algunas cargas negativas de la matriz de polfmero de microesferas reabsorbibles sin necesidad de acido metacrflico.
2- Evaluacion de liberacion de bFGF de las microesferas
Se anadio solucion salina tamponada con fosfato (200 ml) a granulos de microesferas y se retiro el medio a intervalos regulares y se reemplazo con PBS reciente. La liberacion de citocinas se realizo a 37°C con agitacion. La retirada del sobrenadante se realizo a los 5 min, 1 h, 24 h y 48 h. Se determino la cantidad de liberacion de bFGF en el medio usando el metodo de BCA. Tras la incubacion (1 h a 37°C), se midio la absorbancia a 550 - 570 nm y se obtuvo la cantidad de citocina libre mediante extrapolacion de la curva patron utilizando albumina serica bovina (tabla 11). Se trataron microesferas en blanco de la misma forma sin bFGF con el fin de evaluar las sustancias liberadas de las microesferas que podrfan interferir con el ensayo de BCA.
Tabla 11. Liberacion de Fiblast en PBS a 37°C. Se detecto la cantidad de protefnas en el medio de liberacion segun el ensayo de BCA.
MS n.° 3 MS n.° 12 MS n.° 2 MS n.° 14 DCbeads 700-900 mm
Naturaleza de las microesferas
PLA PLA PLGA PLGA -
% de MA
0 10 0 10 -
5 min de liberacion (mg de protefnas)
0,7 4,2 6,2 1,36 3,1
1 h de liberacion (mg de protefnas)
0,04 0,6 1,1 0,12 1,3
24 horas de liberacion (mg de protefnas)
1,2 1 0,95 0 0,8
5
10
15
20
25
30
35
40
48 horas de liberacion (mg de proteinas)
1,2 1,3 0,7 0,7 1,1
Cantidad total de citocinas liberadas (mg) (% de carga inicial)
3,1 (25%) 7,1 (87%) 8,9 (82%) 2,1 (57%) 6,3 (43%)
Se midio una liberacion sostenida de bFGF para cada microesfera, microesferas reabsorbibles ionicas y no ionicas. La cantidad (en mg) de bFGF liberada de MS n.° 12 y MS n.° 2 fue similar a la elucion lograda para DCbeads.
3- Actividad in vitro actividad de citocinas liberadas
Se sembraron celulas endoteliales umbilicales humanas (HUVEC) en placas de 96 pocillos (Nunc) a una densidad de 5000 celulas por pocillo en medio EGM-2 completo (Lonza) con todos los aportes complementarios de cultivo celular. El dfa posterior a la siembra, se mezclaron las fracciones recogidas durante los experimentos de liberacion in vitro con medio EBM-2 sin ninguna citocina (de 5 a 8 pocillos por condicion). Se cultivaron las HUVEC durante 4 dfas hasta el analisis de la proliferacion celular. Como control positivo de la proliferacion celular, se trataron las celulas con disolucion de Fiblast (100 ng de bFGF/ml). Se determino la proliferacion celular midiendo la protefna celular total usando el ensayo de BCA (tabla 12).
Tabla 12. Eficacia in vitro de Fiblast liberado recogido de microesferas reabsorbibles (MS n.° 12) y DC beads no reabsorbibles. Tras 4 dias de cultivo, se determino la proliferacion de HUVEC segun el ensayo de proteinas totales.
Microesferas cargadas con Fiblast Microesferas en blanco Control de cultivo celular Disolucion control de Fiblast (100 ng/ml)
Periodo de liberacion 5 min 1 h 24 h 48 h 5 min 1 h 24 h 48 h -
MS n.° 12
Proteinas celulares totales (mg) 4,67 ± 1 7,12 ± 0,9 7,91 ± 0,36 8,43 ± 1 5,23 ± 0,96 4,87 ± 0,76 5,05 ± 0,78 5,86 ± 0,95 4,69 ± 0,65 7,67 ± 0,77
pa
0,9585 0,0039 0,0019 0,0019 0,0062
pb
0,4008 0,0027 0,0008 0,0143
pc 0,0034 0,5642 0,2416 0,1432
DC- Beads
Proteinas celulares totales (mg) 4,32 ± 1 3,32 ± 0,34 4,19 ± 1,5 5,16 ± 0,22 3,58 ± 0,39 3,59 ± 0,35 3,10 ± 0,24 3,41 ± 0,3 3,3 ± 0,35 6,48 ± 0,52
pa
0,0609 0,6973 0,6056 0,0201 0,0062
pb
0,0585 0,1146 0,1031 0,0339
pc 0,0043 0,0033 0,0281 0,0253
a: Se realizo una comparacion entre tratamientos con Fiblast (microesferas cargadas con Fiblast y disolucion control de Fiblast) y el control de cultivo celular segun la prueba de Mann-Whitney no parametrica. La significacion se fijo a p < 0,05
b: Comparacion entre Fiblast eluido de microesferas con microesferas en blanco en cada momento de toma de muestras (prueba de Mann-Whitney, la significacion se fijo a p < 0,05)
c: Comparacion entre Fiblast eluido de microesferas con disolucion de Fiblast control (100 ng/ml) (prueba de Mann-Whitney, la significacion se fijo a p < 0,05)
Cuando se cultivaron HUVEC con diluciones de fracciones de liberacion (1 h, 24 h y 48 h) obtenidas a partir de MS n.° 12 cargadas previamente con bFGF, se mejoro significativamente (p<0,05) la proliferacion celular desde la primera hora en comparacion con el control de cultivo celular (sin Fiblast) y las fracciones recuperadas de las microesferas en blanco (sin carga de bFGF). La proliferacion celular inducida con bFGF eluido de MS n.° 12 (1 h, 24 h y 48 h) fue equivalente a la respuesta celular observada durante el cultivo con el control de Fiblast (100 ng/ml).
Por el contrario, en fracciones recogidas de DC beads cargadas con bFGF, no se midio induccion de proliferacion celular significativa (p > 0,05) (5 min, 1 h, 24 h) tal como se observa tras la comparacion con control de cultivo celular y las microesferas en blanco. Se observo una baja actividad proliferativa con la ultima fraccion recogida (48 h), que es significativamente menor que la proliferacion inducida con la disolucion de control de Fiblast (100 ng/ml).
En conclusion, bFGF adsorbido sobre microesferas degradables mantienen su actividad biologica lo que no es el caso para las DC beads pese a una mejor inmovilizacion de bFGF.
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Ejemplo 13: Carga de poliplexos en microesferas
1- Formacion de poliplexos
Se condenso ADN con polietilenimina (PEI) ramificada de 25 kDa a una razon molar de nitrogeno de PEI con respecto a fosfato de ADN (razon N/P) de 5. Se prepararon poliplexos de ADN/PEI a una concentracion de ADN final de 400 mg/ml mediante el mezclado en un dispositivo Flashmix de ADN de esperma de salmon lineal (Sigma) con PEI en agua que contenfa glucosa al 5%. Se dejaron estar los poliplexos durante al menos 20 min a temperatura ambiente antes de la utilizacion.
2- Carga de microesferas (100 - 300 mm) con poliplexos
En agua, se mezclaron 100 ml de granulos de microesferas esterilizados con disolucion de poliplexos. Tras el mezclado suave, se incubaron los tubos de ensayo horizontalmente en un horno a 37°C con agitacion durante 1 h. Se cuantifico la union de los poliplexos sobre las microesferas midiendo la absorbancia del sobrenadante a 260 nm. Como control, se trataron las microesferas en blanco de la misma forma sin ADN (tabla 13).
3- Evaluacion de la liberacion de poliplexos de las microesferas
Se desecho el medio de carga y se anadio tampon fosfato salino (200 ml) a las microesferas. Se realizo la liberacion de ADN a 37°C con agitacion, se retiro el medio de PBS a los 5 min, 1 h y 24 h. Se determino la cantidad de liberacion de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm (tabla 13).
Tabla 13. Carga de poliplexos sobre microesferas reabsorbibles y liberacion
MS n.° 3 MS n.° 12 MS n.° 2 MS n.° 14 DCBeads 700900 mm
Naturaleza de las microesferas
PLA PLA PLGA PLGA -
% de MA
0 10 0 10 -
mg de ADN cargado en las microesferas a 1 h
200 214 212 232 31
% de carga de ADN (1 h)
76 77 77 78 11
Liberacion de ADN a los 5 min (mg)
34 44 62 118 26
Liberacion de ADN a 1 h (mg)
20 46 45 42 6
Liberacion de ADN a las 24 h (mg)
8 10 11 7 0
Cantidad total de ADN liberado (mg)
62 (31% de la carga inicial) 100 (46% de la carga inicial) 118 (55% de la carga inicial) 167 (71% de la carga inicial) 32 (100% de la carga inicial)
Se observo una union baja de poliplexos a DC Beads, mientras que la carga de poliplexos sobre microesferas reabsorbibles fue superior (6 veces). La carga de poliplexos parece independiente de la carta de partfculas, la carga que se produce sobre microesferas degradables que contienen acido metacrflico (MS n.° 12 y MS n.° 14) y sobre microesferas sin acido metacrflico (MS n.° 3 y MS n.° 2).
La liberacion del ADN de las DC beads se produjo segun un perfil de rafaga, mientras que se midio una liberacion sustancial de DNA con microesferas reabsorbibles. La liberacion parecio ser mas rapida con microesferas reabsorbibles anionicas que contienen el agente de reticulacion PLGA. Para las otras microesferas reabsorbibles, se eluyo aproximadamente la mitad del ADN cargado durante 24 h de incubacion en tampon salino. Estas partfculas podrfan ser portadores eficaces para la administracion local de ADN.
5
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25
30
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45
Ejemplo 14: Geles degradables que contienen polietilenimina de 25 kDa ramificada para adsorcion de ADN
1- Carga de gel con ADN
Utilizando un punzon de biopsia, se prepararon tapones de 6 mm de diametro a partir de geles que contenfan diversas cantidades de PEI. Se lavaron los tapones de gel humedo (aproximadamente 100 mg) con agua hasta que la absorbancia a 260 nm fue proxima a cero. Se anadio un ml de ADN lineal de esperma de salmon (125 mg en 1 ml de agua) a los tapones de gel lavados (por duplicado). Se realizo la carga de ADN a 37°C con agitacion y se monitorizo la absorcion de ADN midiendo la absorbancia del sobrenadante a 260 nm tras 2 h de incubacion.
2- Evaluacion de la liberacion de ADN de las microesferas
A los tapones de gel, se anadio 1 ml de tampon fosfato salino y se realizo la incubacion a 37°C con agitacion. Se determino la liberacion de ADN midiendo la absorbancia del medio a 260 nm. Como control, se trataron tapones de gel con ADN en las mismas condiciones para determinar la liberacion de sustancias de geles que interfieren con la medicion del ADN a 260 nm (tabla 14).
Tabla 14. Carga de ADN sobre geles reabsorbibles que contienen polietilenimina e intentos de liberacion de ADN
G n.° 6 G n.° 7 G n.° 2
PEI/PEG475ma (p/p)
1/250 1/100 0
Carga de ADN a las 2 h (mg)
88 116 5
% de carga de ADN (2 h)
70 92 4
Liberacion de ADN (mG) en PBS (30 min)
48 1,5 5
Liberacion de ADN (mG) en PBS (24 h)
5 2,5 0
Cantidad total de ADN liberado ( mg)
53 (75% de carga inicial) 4 (4% de carga inicial) 5 (100% de carga inicial)
Se logro una buena eficacia de inmovilizacion de ADN con geles que contenfan PEI (G n.° 6 y G n.° 7) en comparacion con gel sin PEI (G n.° 2).
Los experimentos de liberacion en tampon salino neutro muestran una rafaga para el gel que contiene la concentracion de PEI inferior (G n.° 6) mientras se logro una liberacion de ADN mas sostenida con el gel que contenfa mas PEI (1%, p/p) (G n.° 7).
La rafaga rapida observada con G n.° 6 puede corresponder a la elucion del ADN unido al gel a traves de interacciones electrostaticas, mientras que en el gel que contenfa mas PEI (G n.° 7) se habfa producido probablemente compactacion de ADN con PEI lo que conduce a la formacion de poliplexos. La liberacion de los poliplexos probablemente fue mas lenta que la elucion del ADN desnudo. En conclusion, variando la concentracion de PEI en geles reabsorbibles, podrfan obtenerse diferentes patrones de liberacion de ADN.
Ejemplo 15: Incorporacion de protefnas sin desnaturalizacion en geles degradables. Tripsina bovina como protefna modelo.
Evaluacion de la liberacion de tripsina de geles degradables
Utilizando un punzon de biopsia, se prepararon tapones de 6 mm de diametro (200 - 300 mg) a partir de los geles. A los tapones de gel humedo (por duplicado), se les anadio 1 ml de PBS (tampon fosfato 10 mM, NaCl al 0,9%, pH 7,2) y se produjo la incubacion a 37°C con agitacion. Se determino la actividad de la tripsina mediante la adicion de 80 ml de sustrato sintetico de tripsina (clorhidrato de benzoil-DL-arginina-4-nitroalinida 1 mM en bicarbonato de sodio 50 mM) a 20 ml de medio de PBS retirado tras 5 min, 1 h, 3 h y 24 h de incubacion. Se midio la actividad de la tripsina en el medio de liberacion a 405 nm tras una hora de incubacion a 37°C. Se normalizo la actividad de la tripsina en el medio de liberacion (DO 405 nm) con la masa de gel humedo (DO 405 nm para 100 mg de gel) (tabla 15).
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35
Tabla 15. Liberacion de protefna activa de hidrogel degradable durante la incubacion en tampon salino
Actividad de la tripsina (DO 45 nm para 100 mg de gel) medida en PBS durante experimentos de liberacion
Tripsina (mg/g de gel) 5 min 1 h 3 h 24 h
G n.° 10
0,9 0,11 ± 0,006 0,22 ± 0,014 0,21 ± 0,009 0,042 ± 0,003
G n.° 11
1,8 0,27 ± 0,019 (p = 0,202)* 0,34 ± 0,03 (p = 0,029) 0,303 ± 0,029 (p = 0,0209) 0,096 ± 0,014 (p = 0,0209)
* Se realizaron comparaciones entre G n.° 11 y G n.° 10 segun la prueba de Mann-Whitney no parametrica. (La significacion se fijo a p < 0,05).
La incubacion de geles reabsorbibles que contienen tripsina en tampon conduce a la liberacion de moleculas de tripsina activas hasta 24 h. La liberacion de tripsina en el medio fue proporcional a la cantidad de enzima incorporada en los geles. La medicion de la actividad enzimatica en los diferentes tiempos de toma de muestras (5 min, 1 h, 3 h, 24 h) mostro que puede lograrse la preparacion de geles reabsorbibles cargados con tripsina y que la carga no inactiva a las protefnas.
Ejemplo 16: Analisis de citotoxicidad in vitro (tabla 16)
Se analizo la citotoxicidad de las microesferas utilizando extractos de microesferas preparados en medio cultivo celular. Brevemente, se mantuvieron cultivos de fibroblastos de raton (L929) en medio dMeM con alta cantidad de glucosa con FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, estreptomicina 50 mg/ml, 50 unidades/ml de penicilina en un incubador de CO2 a 37°C. Se realizo la recogida de las celulas L929 utilizando tripsina-EDTA (Lonza) y comenzaron los subcultivos en placas de 96 pocillos (NUNC) a densidades de 5,103 celulas/pocillo. Se prepararon extractos de microesferas en tubos esteriles, se anadieron 500 ml de granulos de microesferas en DMEM y se completo el volumen hasta 3 ml con medio de cultivo celular. Se incubaron las muestras a 37°C con agitacion hasta la degradacion completa de las microesferas. La concentracion del material fue de aproximadamente 25 mg/ml en los extractos de microesferas. Se utilizaron fragmentos de guantes quirurgicos (latex) como control positivo de la citotoxicidad. El dfa tras la siembra de las celulas, se completaron los extractos de microesferas en medio de cultivo celular con suero bovino y se ajusto el pH (aproximadamente pH 7) antes de la adicion hasta obtener fibroblastos no confluentes (de 6 a 8 pocillos/condicion). Los extractos obtenidos con guantes quirurgicos tambien se anadieron a los fibroblastos de raton. Tras 72 h de cultivo (37°C, 5% de CO2), se retiro el medio, se lavaron las celulas con 100 mL de PBS, antes de la adicion de 100 mL de disolucion de acido bicinconico (BCA protein Reagent, Sigma) que contiene CuSO4 al 0,08% (p/v) y Triton-X-100 al 0,05%. Tras la incubacion (1 h a 37°C), se midio la absorbancia a 570 nm y se obtuvo la cantidad de protefnas mediante extrapolacion de la curva patron utilizando albumina serica bovina (tabla 16).
Tabla 16. Citotoxicidad de microesferas reabsorbibles
Codigo
Agente de reticulacion (% en moles) MDO (% en moles) Comonomero (% en moles) Protefnas de celulas L929 totales (% de control) Estado citotoxico
Medio de cultivo celular (control no citotoxico)
- - - 100 No citotoxico
Latex (control citotoxico)
- - - 22,73 +/- 5,74 Citotoxico
MS n.° 2
PEG13PLGA12 (5%) 0 - 71,36 +/- 6,14 * p = 0,0003 No citotoxico
MS n.° 3
PEG1aPLA12 (5%) 0 - 83,80 +/- 3,99 * p = 0,0003 No citotoxico
MS n.° 4
PEG22PLGA12 (5%) 0 - 85,09 +/- 4,5 * p = 0,0003 No citotoxico
MS n.° 10
PEG13-PLGA12 (5%) 0 Acrilato de b- carboxietilo (10%) 61,59 +/- 7,7 * p = 0,0008 Levemente citotoxico
MS n.° 12
PEG13-PLA12 (5%) 0 Acido metacrflico (10%) 74,94 +/- 7,04 * p = 0,0003 No citotoxico
MS n.° 14
PEG13-PLGA12 (5%) 0 Acido metacrflico (10%) 72,34 +/- 4,26 * p = 0,0003 No citotoxico
MS n.° 5
PEG22PLGA12 (5%) 5 - 86,31 +/- 4,44 * p = 0,0039 No citotoxico
MS n.° 6
PEG22PLGA12 (5%) 10 - 88,46 +/-7,67 * p = 0,0007 No citotoxico
MS n.° 8
PEG22PLGA12 (5%) 30 - 73,65 +/- 5,16 * p = 0,0039 No citotoxico
MS n.° 16
PEG22-PLGA12/ 5 Acido metacrflico (50%) 22,79 +/- 3,32 * p = 0,0039 Citotoxico
*: comparacion entre microesferas y latex (prueba de Mann-Whitney no parametrica). La significacion se fijo a p < 0,05.
Se definio citotoxicidad significativa como un efecto que conduce a una inhibicion del crecimiento celular de mas del 5 30% en comparacion con los cultivos control (Lin et al 2009 Colloid Surface B, 70: 132-41).
La adicion de 2-metilen-1,3-dioxepano (MDO) dentro de la matriz de polfmero (desde el 5 hasta el 30%) no indujo citotoxicidad durante el periodo de cultivo. En conclusion, la adicion de MDO en microesferas reduce el peso molecular de los productos de degradacion sin induccion de citotoxicidad.
10
El acido metacrflico al 10% en moles (MS n.° 12 y MS n.° 14) en microesferas reabsorbibles no fue citotoxico en comparacion con microesferas preparadas sin acido metacrflico (MS n.° 3 y MS n.° 2). Por el contrario, la incorporacion de un alto contenido de acido metacrflico (50% en moles) dentro de las microesfera (MS n.° 16) genero toxicidad, atribuible a una rapida reabsorcion dando una alta liberacion de protones (el pH disminuyo por 15 debajo de 7) que puso en peligro la supervivencia de la celula.
La adicion de acrilato de b-carboxietilo (10% en moles) en microesferas (MS n.° 10) indujo una toxicidad limitada; la inhibicion del crecimiento fue proxima al valor umbral para la citotoxicidad (70%). El acido metacrflico parece ser un comonomero anionico mejor en comparacion con el acrilato de b-carboxietilo para la preparacion de microesferas 20 anionicas con respecto a los resultados de toxicidad. A excepcion de MS n.° 10 y MS n.° 16, los valores de proliferacion celular obtenidos con las microesferas reabsorbibles enumeradas en la tabla 12 fueron superiores al 70%, por tanto se consideran no citotoxicas hacia las celulas cultivadas.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
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    40
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    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Polfmero reticulado biorreabsorbible cargado con macromoleculas en el que el polfmero puede obtenerse a partir de la polimerizacion de:
    (i) por lo menos un monomero de formula (I)
    (CH2=CRi)CO-K (I)
    en el que:
    - K representa O-Z o NH-Z, representando Z (CR2R3)m-CH3, (CH2-CH2-0)m-H, (CH2-CH2-0)m-CH3, (CH2)m- NR4R5 representando m un numero entero desde 1 hasta 30;
    - R1, R2, R3, R4 y R5 representan independientemente H o un alquilo C1-C6;
    y
    (ii) por lo menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible,
    en el que el agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible es lineal y presenta unos grupos (CH2=(cR6))- en ambas de sus extremidades, en el que R6 representa independientemente H o un alquilo C1- C6,
    y en el que la macromolecula se se selecciona de entre el grupo que consiste en protefnas y acidos nucleicos.
  2. 2. Polfmero segun la reivindicacion 1, en el que el agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible es de la formula (II) siguiente:
    (CH2=CR7)C0-(Xn)j-PEGp-Yk-C0-(CRs=CH2) (II)
    en el que:
    - R7 y R8 representan independientemente H o un alquilo C1-C6;
    - X e Y representan independientemente poli(acido lactico) (PLA), poli(acido glicolico) (PGA), poli(acido lactico-glicolico) (PLGA), o poli(caprolactona) (PCL);
    - n, p y k representan respectivamente el grado de polimerizacion de X, PEG e Y, siendo n y k independientemente unos numeros enteros desde 1 hasta 150, y siendo p un numero entero desde 1 hasta 100;
    - j representa 0 o 1.
  3. 3. Polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible es de una formula seleccionada de entre el grupo que consiste en:
    (CH2=CR7)C0-PLAn-PEGp-PLAk-C0-(CR8=CH2),
    (CH2=CR7)C0-PGAn-PEGp-PGAk-C0-(CR8=CH2),
    (CH2=CR7)C0-PLGAn-PEGp-PLGAk-C0-(CR8=CH2),
    (CH2=CR7)C0-PEGp-PLAk-C0-(CR8=CH2),
    (CH2=CR7)C0-PEGp-PGAk-C0-(CR8=CH2), y
    (CH2=CR7)C0-PEGp-PLGAk-C0-(CR8=CH2);
    en el que que R7, R8, n, p y k son como se definio en la reivindicacion 2.
  4. 4. Polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el monomero de formula (I) se selecciona de entre el grupo que consiste en acrilato de sec-butilo, acrilato de n-butilo, acrilato de t-butilo, metacrilato de t-butilo, metacrilato de metilo, acrilato de N-dimetil-aminoetil(metilo), (met)acrilato de N,N-dimetilaminopropilo, (met)acrilato de t-butilaminoetilo, acrilato de N,N-dietilamino, poli(oxido de etileno) terminado en acrilato, poli(oxido de etileno) terminado en metacrilato, metacrilato de metoxi-poli(oxido de etileno), metacrilato de butoxi-poli(oxido de etileno), poli(etilenglicol) terminado en acrilato, poli(etilenglicol) terminado en metacrilato, metacrilato de metoxipoli(etilenglicol), metacrilato de butoxipoli(etilenglicol), ventajosamente, el monomero de formula (I) es metacrilato de metil eter de poli(etilenglicol).
  5. 5. Polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que puede obtenerse a partir de la polimerizacion de
    5
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    50
    55
    dicho por lo menos un monomero de formula (I), dicho por lo menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible, y ademas por lo menos un agente de transferencia de cadena que es ventajosamente un tiol cicloalifatico o alifatico que presenta tfpicamente desde 2 hasta aproximadamente 24 atomos de carbono, y que presenta opcionalmente un grupo funcional adicional seleccionado de entre los grupos amino, hidroxi y carboxi.
  6. 6. Polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que puede obtenerse a partir de la polimerizacion de dicho por lo menos un monomero de formula (I), dicho por lo menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible, (iii) opcionalmente al menos un agente de transferencia de cadena como se define en la reivindicacion 5, y (iv) adicionalmente por lo menos un monomero cfclico que presenta un grupo exo-metileno de formula (III):
    imagen1
    en la que:
    - R6, R7, R8 y R9 representan independientemente H o un grupo arilo C5-C7 o R6 y R9 estan ausentes y R7 y Rs forman junto con el atomo de carbono sobre el que se unen un grupo arilo C5-C7;
    - i y j representan independientemente un numero entero seleccionado entre 0 y 2, ventajosamente i y j se seleccionan entre 0 y 1, mas ventajosamente i=j, todavfa mas ventajosamente, i=j=1; y
    - X representa o bien O o bien X no esta presente y en este ultimo caso, CR6R7 y CRsR9 se unen a traves de un enlace sencillo C-C,
    seleccionandose ventajosamente dicho por lo menos un monomero cfclico de formula (III) de entre el grupo que consiste en 2-metilen-1,3-dioxolano, 2-metilen-1,3-dioxano, 2-metilen-4-fenil-1,3-dioxolano, 2-metilen-1,3- dioxepano, 5,6-benzo-2-metilen-1,3-dioxepano y 2-metilen-1,3,6-trioxocano, ventajosamente de entre el grupo que consiste en 2-metilen-1,3-dioxepano, 5,6-benzo-2-metilen-1,3-dioxepano y 2-metilen-1,3,6-trioxocano.
  7. 7. Polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, obtenido a partir de la polimerizacion de dicho por lo menos un monomero, dicho por lo menos un agente de reticulacion de copolfmero de bloque biorreabsorbible, opcionalmente por lo menos un agente de transferencia de cadena como se define en la reivindicacion 5, opcionalmente por lo menos un monomero cfclico que presenta un grupo exo-metileno como se define en la reivindicacion 6 y por lo menos un monomero adicional que es un monomero cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo de la formula (V) siguiente:
    (CH2=CR-i1)CO-M-F (V)
    en la que:
    - R11 representa H o un alquilo C1-C6;
    - M representa un enlace sencillo o un resto de union que presenta desde 1 hasta 20 atomos de carbono;
    - F representa un grupo cargado, ionizable, hidrofilo o hidrofobo que presenta 100 atomos a lo sumo, seleccionandose F ventajosamente de entre el grupo constituido por COOH, COO-, SO3H, SO3', PO4H2, PO4H', PO42", NR9R10, NR9R12R10+, representando R9, R12 y R10 independientemente H o un alquilo C1-C6, un grupo alquilo C1-C20, un grupo arilo C5-C20, un grupo heteroarilo (de 5-30 miembros) que contiene un heteroatomo seleccionado de entre el grupo que consiste en O, N o S, un grupo O-arilo C5-C20 y un grupo O-heteroarilo (de 5-30 miembros), un eter en corona y una ciclodextrina.
  8. 8. Polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la macromolecula se selecciona en el grupo que consiste en enzimas, anticuerpos, citocinas, factor de crecimiento, factores de coagulacion, hormonas, en particular hormonas de crecimiento, plasmidos, oligonucleotidos antisentido, ARNip, ribozimas, ADNzimas, aptameros, polfmeros cationicos para la carga de acido nucleico tal como poli(clorhidrato de alilamina), polidialildimetilamonio, polietilenimina, poli(L-lisina), polidopamina, quitosano y dendrfmeros de poliamidoamina,
    5
    10
    15
    20
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    30
    35
    40
    45
    50
    ventajosamente de entre el grupo que consiste en protefnas antiinflamatorias tales como infliximab y rilonacept, protefnas morfogeneticas oseas, factores angiogenicos tales como factores de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento endoteliales vasculares y TGF-beta, inhibidores de la angiogenesis tales como bevacizumab o pegaptanib.
  9. 9. Procedimiento para la preparacion del polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que comprende la etapa de impregnacion del polfmero preformado con la macromolecula.
  10. 10. Procedimiento para la preparacion del polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que comprende la etapa de mezclar la macromolecula con una disolucion que contiene los monomeros y el agente de reticulacion como se describe en las reivindicaciones 1 a 8 antes de la reaccion de reticulacion.
  11. 11. Composicion farmaceutica que comprende por lo menos un polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en asociacion con un vehfculo farmaceuticamente aceptable, destinada ventajosamente a la administracion mediante inyeccion.
  12. 12. Composicion farmaceutica inyectable que comprende
    - (a) un polfmero que puede obtenerse como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que
    presenta una forma esferica de un diametro de entre 50 y 500 mm y un tiempo de reabsorcion de entre 2 dfas
    y 3 semanas;
    - (b) un polfmero que puede obtenerse como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que
    presenta una forma esferica de un diametro de entre 50 y 500 mm y un tiempo de reabsorcion de entre uno y
    3 meses; y
    - (c) por lo menos un excipiente farmaceuticamente aceptable
    en la que por lo menos uno del polfmero (a) o (b) esta cargado con una macromolecula como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
    en la que tfpicamente las partfculas esfericas de los polfmeros (a) y (b) no presentan el mismo diametro, siendo ventajosamente el diametro de las partfculas esfericas del polfmero (a) de entre 100 y 300 mm y el diametro de las partfculas esfericas del polfmero (b) de entre 300 y 500 mm.
  13. 13. Implante que contiene el polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, para su implantacion en tejidos, cerebro, medula espinal, defectos oseos, espacios anatomicos internos, cavidades corporales, conductos y vasos.
  14. 14. Utilizacion del implante segun la reivindicacion 13, del polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, para el llenado y/o el camuflaje y/o la correccion de arrugas, lfneas finas, grietas de la piel, depresiones cutaneas, lipodistrofias, hemiatrofia facial y/o cicatrices, en particular cicatrices de acne y/o el alisado de irregularidades de la piel y/o como una matriz para el cultivo celular y/o para ingenierfa tisular, y/o para la correccion del envejecimiento de la piel.
  15. 15. Implante segun la reivindicacion 13 o polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12 para su utilizacion como especialidad farmaceutica, destinada ventajosamente a la cicatrizacion de heridas y/o para la reconstruccion tisular y/o para la reparacion de tejidos blandos, y/o para el tratamiento de la inflamacion, tumores benignos o malignos, malformaciones arteriovenosas, sangrado gastrointestinal, epistaxis, hemorragia posparto primaria y/o hemorragia quirurgica y/o para regenerar tejido en un ser humano o un animal.
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