TW202123924A - 鳳梨釋迦萃取物用於製備肌膚美白、抵禦紫外線損傷及提升肌膚彈性之組合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本案係關於一種鳳梨釋迦萃取物的用途，特別是關於一用於製備肌膚美白、抵禦紫外線損傷及提升肌膚彈性之組合物的用途，其中該鳳梨釋迦萃取物係由一含水之溶劑所萃取而得。
Description
本案係關於一種鳳梨釋迦萃取物的用途，特別是關於一用於製備肌膚美白、抵禦紫外線損傷及提升肌膚彈性之組合物的用途。
鳳梨釋迦(Annona cherimola
×Annona squamosa
)又稱為蜜釋迦、旺來釋迦、奇美釋迦，是冷子番荔枝（Annona cherimola
）與番荔枝（Annona squamosa
）之雜交種，最早係於1908年在美國佛羅里達洲所育成。鳳梨釋迦為多年生小喬木，莖高 3~10 公尺；葉屬單葉互生，葉柄長約 1.5~2 公分，葉緣平滑；花瓣 3 枚，呈3稜角長形，淡綠色下垂。鳳梨釋迦之果肉係相連，與釋迦（番荔枝）瓣狀之果肉不同。一般而言，鳳梨釋迦果實可達600公克以上。
皮膚對於人類個體之保護具有不可或缺之重要性，其提供了對抗陽光中紫外線輻射、病原體、摩擦力等環境因子的第一階段保護。通常，年輕的肌膚具有較佳的支撐性以及彈性，然隨年齡增長或環境因子，皮膚會逐漸老化。舉例而言，皮膚可能會因為膠原蛋白裂解，導致肌膚彈力下降或因黑色素沉澱，使肌膚整體較為暗沈等老化狀態。
有鑑於此，研究或開發一種可提升肌膚白皙度與彈性之組合物，來維持或改善肌膚外觀乃有其必要。
緣此，本發明的一目的在於提供一種鳳梨釋迦萃取物用於製備肌膚美白、提升肌膚彈性、及抵禦紫外線損傷之組合物的用途。
具體而言，本發明的一目的在於提供一種鳳梨釋迦萃取物用於製備抑制肌膚細胞內酪胺酸酶活性、降低肌膚細胞內黑色素生成、提升肌膚細胞抵抗紫外線損傷、及提升肌膚彈性之組合物的用途。
在一些實施例中，該組合物係為醫藥組合物。
在一些實施例中，該組合物係進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、或化妝品組合物。
在一些實施例中，該鳳梨釋迦萃取物係以一含水之溶劑萃取一鳳梨釋迦果實所獲得。在一些實施例中，該含水之溶劑為純水。在一些實施例中，該含水之溶劑另包含一糖解酵素。在一些實施例中，該糖解酵素之濃度為0.1wt%。
在一些實施例中，鳳梨釋迦萃取物是以含水之溶劑形成初萃液，初萃液經糖化酵素酵解而形成鳳梨釋迦萃取物。
在一些實施例中，該鳳梨釋迦萃取物係透過抑制酪胺酸酶活性以提升肌膚之白皙度。
在一些實施例中，該鳳梨釋迦萃取物係透過減少肌膚細胞內黑色素生成以提升肌膚之白皙度。在一些實施例中，該黑色素生成係由紫外線所造成。
在一些實施例中，該鳳梨釋迦萃取物係透過提升肌膚細胞內粒線體活性相關基因之表現量以達到提升細胞抵禦紫外線之能力。
在一些實施例中，該粒線體活性相關基因為PARP1基因（Gene ID: 142）、PARP2（Gene ID: 10038）及NADSYN（Gene ID: 55191）。
在一些實施例中，該鳳梨釋迦萃取物係透過肌膚細胞之彈力蛋白分泌以達到提升肌膚彈力。
在一些實施例中，該鳳梨釋迦萃取物之濃度至少為0.25mg/mL。
在一些實施例中，該鳳梨釋迦萃取物的白利糖度（Degrees Brix）值為8±0.5。
綜上所述，任一實施例的鳳梨釋迦萃取物可用於製備肌膚美白之組合物。任一實施例的鳳梨釋迦萃取物可用於製備抑制酪胺酸酶活性之組合物。任一實施例的鳳梨釋迦萃取物可用於製備抑制黑色素生成之組合物。任一實施例的鳳梨釋迦萃取物可用於製備提升肌膚細胞抵禦紫外線之能力之組合物。任一實施例的鳳梨釋迦萃取物可用於製備提升肌膚細胞內粒線體活性相關基因之表現量之組合物。任一實施例的鳳梨釋迦萃取物可用於製備提升肌膚細胞內彈力蛋白之分泌量之組合物。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t檢驗（student’s t-test）進行分析。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。
本文中之「wt%」係指重量百分比，而「vol%」係指體積百分比。
如本文中所使用，術語「萃取物」係指藉由萃取作用所製備之產物。該萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現。
如本文所用「鳳梨釋迦原料」通常係指植物果實，其中果實可為含皮或不含皮之果實、經乾燥或以其他物理方式加工以利於處理之果實，其可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之果實。
參考圖1。在一些實施例中，一種鳳梨釋迦萃取物，其是由一種含水之溶劑對鳳梨釋迦原料進行萃取。在一些實施例中，鳳梨釋迦萃取物係將鳳梨釋迦原料依序進行粉碎程序S01、加熱程序S02、過濾程序S04、及濃縮程序S05後得到。
在一些實施例中，鳳梨釋迦原料可以是含皮或不含皮的鳳梨釋迦果實。在一些實施例中，鳳梨釋迦原料可以是新鮮或乾燥的鳳梨釋迦果實。
在一些實施例中，粉碎程序S01是指將鳳梨釋迦原料攪打至分裂為碎狀。舉例而言，粉碎可以採用果汁機、調理機或均質機。
在一些實施例中，加熱程序S02是指將碎狀的鳳梨釋迦原料與含水之溶劑混合後加熱一段固定時間。在一些實施例中，加熱是指將鳳梨釋迦原料與含水之溶劑的溫度提升到50℃~100℃。在一些實施例中，一段固定時間是指0.5小時到3小時。舉例而言，將鳳梨釋迦原料與含水之溶劑的溫度提升到85℃進行提取1小時。
在一些實施例中，加熱程序S02中的重量比例（含水之溶劑：鳳梨釋迦原料）為5：1~20：1。舉例而言，含水之溶劑：鳳梨釋迦原料為10:1。
舉例而言，採用90公斤重的鳳梨釋迦原料、900公斤重的水及0.63公斤重的檸檬酸混合後持續加熱到100℃，並維持100℃持續0.5小時。舉例而言，採用90公斤重的鳳梨釋迦原料、900公斤重的水及0.7公斤重的檸檬酸混合後持續加熱到85℃，並維持85℃持續1小時。
在一些實施例中，含水之溶劑可以是純水或含有有機酸之水溶劑。在一些實施例中，有機酸之濃度為0.05%到1.00%。在一些實施例中，有機酸可是可食用酸。在一些實施例中，可食用酸可以是檸檬酸（Citric Acid）、蘋果酸、酒石酸、乳酸、葡萄糖酸、醋酸等，並不以此為限。
在一些實施例中，含水之溶劑可另包含澱粉糖化酵素（Amylase）。在一些實施例中，加熱程序S02中是指將鳳梨釋迦原料與水及澱粉糖化酵素攪拌充分混合後，將其提升到50℃~100℃，持續一段時間。其中，藉由酵素的酵解作用可進一步提升鳳梨釋迦萃取物內有效成分的含量。在一些實施例中，澱粉糖化酵素可以是α-澱粉酶、β-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、異澱粉酶至少一或其混合。在一些實施例中，澱粉糖化酵素可以是葡萄糖澱粉酶（glucan 1,4-alpha-glucosidase）。在一些實施例中，澱粉糖化酵素的添加量為含水之溶劑的0.05%至0.15%，在一些實施例中，該含水之溶劑可為水。在一些實施例中，加熱程序S02是將鳳梨釋迦原料與水1:5混合後，添加0.1 %澱粉糖化酵素並加熱到55℃之後維持1小時。
在一些實施例中，過濾程序S04是指將加熱後（或降溫後）的鳳梨釋迦原料及溶劑通過篩網以將溶劑內的固體濾除形成過濾液。舉例而言，篩網可以是400網目（mesh）的篩網。
參考圖2。在一些實施例中，加熱程序S02與過濾程序S04之間還包括二次加熱程序S03，二次加熱程序S03是指將經加熱程序S02後的鳳梨釋迦原料，進行二次加熱，其中該二次加熱之溫度高於加熱程序S02之溫度。舉例而言，加熱程序S02之溫度為65℃持續30分鐘，二次加熱程序S03之溫度為95℃持續50分鐘。
在一些實施例中，濃縮程序S05是指將過濾程序S04所得到的過濾液進行減壓濃縮（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100）以得到初萃液。在一些實施例中，濃縮程序S05所得的初萃液可即為鳳梨釋迦萃取物。在濃縮程序S05的一些實施例中，在40℃~70℃之間進行減壓濃縮。舉例而言，鳳梨釋迦萃取物是將鳳梨釋迦原料依序進行粉碎程序S01、加熱程序S02、過濾程序S04及濃縮程序S05後得到。
在另一些實施例中，濃縮程序S05則是將過濾程序S04所得到的濾液進行減壓濃縮以得到濃縮液。
在一些實施例中，濃縮程序S05之後更包括再過濾程序S06是指將濃縮液通過400網目（mesh）的篩網以將濃縮液內的固形物濾除形成鳳梨釋迦萃取物。舉例而言，鳳梨釋迦萃取物是將鳳梨釋迦原料依序進行粉碎程序S01、加熱程序S02、二次加熱程序S03、過濾程序S04、濃縮程序S05及再過濾程序S06後得到。
在一些實施例中，鳳梨釋迦萃取物用於製備肌膚美白組合物之用途，其中鳳梨釋迦萃取物是透過抑制酪胺酸酶活性、或減少細胞黑色素生成以達到肌膚酶美白，且鳳梨釋迦萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。在一些實施例中該細胞黑色素生成係源自紫外線照射所產生。在一些實施例中，該紫外線為UVA。
肌膚之所以會呈現較深的顏色係因黑色素之生成，而在黑色素生成的過程中，酪胺酸酶（Tyrosinase）佔據舉足輕重之地位。酪胺酸酶是一種氧化酶，係調控黑色素生成的限速酶。具體而言，酪胺酸酶參與了黑色素合成的兩個反應：（1） 將單酚羥基化為二酚，（2） 將鄰二酚氧化為鄰二醌。酪胺酸酶係存在於皮膚黑色素細胞中，係由TYR基因轉錄所形成。因此，透過酪胺酸酶活性的抑制，可以達到減少黑色素之生成，以達到肌膚美白之功效。
在一些實施例中，鳳梨釋迦萃取物可以透過抑制酪胺酸酶之形成以達到抑制、預防或減緩肌膚黑色素之形成，進而達到肌膚美白及/或提升肌膚光澤之功效。
在一些實施例中，濃度為0.5 mg/mL以上的鳳梨釋迦萃取物可以用於提升肌膚光澤及/或提升肌膚之白皙程度。
在一些實施例中，白利糖度（Degrees Brix）值為8.0以上的鳳梨釋迦萃取物可以用於提升肌膚光澤及/或提升肌膚之白皙程度。
在一些實施例中，鳳梨釋迦萃取物用於製備提升肌膚抵禦紫外線能力之組合物之用途，其中鳳梨釋迦萃取物是透過提升細胞內粒線體活性以達到肌膚抵禦紫外線能力，且該鳳梨釋迦萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。在一些實施例中，該鳳梨釋迦萃取物係透過提升粒線體活性相關基因以達到該粒線體活性之提升。
在一些實施例中，粒線體活性相關基因為PARP1基因（Gene ID: 142）、PARP2（Gene ID: 10038）及NADSYN（Gene ID: 55191）。
其中， PARP1基因與PARP2基因各自所轉錄之蛋白質PARP1與PARP2具有抑制NAD+的功能，因此若該些基因表現降低，NAD+的含量將提升。而NAD+是提供細胞能量的分子，可用於代謝、構建新的細胞、抵抗自由基和DNA損傷等，其亦協助粒線體產生身體維持功能所需的能量。因此，透過PARP1與PARP2的抑制，粒線體可保持較佳活性，除了能增加個體之體力亦可減緩細胞衰老或死亡。而PARP1為PARP家族的主要組成，PARP2則較為輔助性的腳色，其可在PARP1喪失功能後作為替補使用。
NADSYN則為NAD合成路徑重要的催化因子，其主要作用是將NaAD催化為NAD。而如上所述，NAD是身體產生能量的重要分子，因此透過NADSYN基因表現量的提升，粒線體活性將增加，進而提升細胞存活率。
換言之，鳳梨釋迦萃取物可藉由提高上述基因表現量，提升肌膚粒線體之活性、進而提升肌膚抵禦紫外線之能力。
在一些實施例中，濃度為0.5 mg/mL以上的鳳梨釋迦萃取物可以提升肌膚抵禦紫外線之能力。
在一些實施例中，白利糖度（Degrees Brix）值為8.0以上的鳳梨釋迦萃取物可以提升肌膚抵禦紫外線之能力。
在一些實施例中，鳳梨釋迦萃取物可以用於製備提升肌膚彈性之用途。
在一些實施例中，該鳳梨釋迦萃取物係透過提升肌膚細胞之彈力蛋白分泌能力，以達到肌膚彈性之提升。
在一些實施例中，濃度為0.5 mg/mL以上的鳳梨釋迦萃取物可以提升肌膚彈性，且該鳳梨釋迦萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。
在一些實施例中，白利糖度（Degrees Brix）值為8.0以上的鳳梨釋迦萃取物可以提升肌膚彈性。
在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有有效含量的鳳梨釋迦萃取物。換言之，此醫藥品包含有有效含量的鳳梨釋迦萃取物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）以及類似之物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）以及類似之物。在一些實施例中，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，醫藥品可進一步包含有被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之組合物可為可食用組合物。在一些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或可為食品添加物（food additive），意即藉由習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。
在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。
[
例
1]
鳳梨釋迦萃取物之製備
將鳳梨釋迦的果實經粉碎（Osterizer 品牌的10 speed blender）並以10目數（mesh）的篩網將其過篩，去除過大顆粒後取得鳳梨釋迦果實粗碎物。在另一些實施例中，篩網的目數可為8目或12目。
接著，加熱程序中，以水為溶劑與鳳梨釋迦果實粗碎物以5:1的重量比混合，加入混合液0.1wt%之澱粉糖化酵素並於55 ±5℃下萃取約60分鐘以形成含有固體的第一萃取液。於此，採用市售AMG品牌的300L酵素。
在另一些實施例中，溶劑與鳳梨釋迦果實的重量比亦可為10:1~20:1，浸泡時的溫度可為45℃-75℃，萃取時間可為30-90分鐘。若溶劑過少或萃取時間過短，則萃取效率將會明顯下降；若萃取時間過長，則萃取物中的有效成分可能會產生降解。
將前述第一萃取液進行二次加熱，該加熱溫度為85 ±5℃，並以此溫度維持60分鐘，以形成第二萃取液，其中該第二萃取液之Brix值大於2.5。
將前述第二萃取液進行過濾，以濾除較大之固形物，其中該過濾所使用之篩網為400網目（mesh）的篩網。
將過濾後之濾液以濃縮機（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100），在60℃±5℃下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值（Degrees Brix）為8±0.5時停止濃縮，得到本案之鳳梨釋迦萃取物。在另一些實施例中，可於45℃-70℃下進行減壓濃縮。
[
例
2]
多醣定量實驗
標準曲線繪製：
首先，精密秤取D-葡萄糖（D-Glucose）（購自J.T. Baker，料號：1916-01） 10 mg，置於10 mL 容量瓶中，以二次蒸餾水（ddH2
O）定量至10 mL，配置成1 mg/mL濃度之D-葡萄糖溶液。
接著，將上述標準品進行系列稀釋，以二次蒸餾水稀釋為0, 20, 50, 100, 150, 200 μg/mL 之D-葡萄糖溶液。可參酌下表1之方式配置標準溶液。
表1：D-葡萄糖溶液標準溶液配置方法
| 濃度（ μg/mL ） | 0 | 20 | 50 | 100 | 150 | 200 |
| D- 葡萄糖溶液 （ 1 mg/mL ） | 0μL | 20μL | 50μL | 100μL | 150μL | 200μL |
| ddH2 O | 1000μL | 980μL | 950μL | 900μL | 850μL | 800μL |
之後，取標準溶液各100 μL放置於玻璃試管中，再各加入500μL濃度為5%的苯酚溶液（Phenol）（購自Merck，料號：1.00206.0250）。
接著緩慢加入2.5 mL濃度為95.5%，比重1.84之濃硫酸溶液（H2
SO4
）（購自Showa，料號：1970-5250）。經由渦旋（vortex）確保無氣泡後，靜置20分鐘。最後，取200 μL樣品放入96孔培養盤，於490 nm下測定其吸光值，並繪製標準曲線。
樣品總多醣定量實驗：
另外，將例1所得的鳳梨釋迦萃取物與水稀釋20倍至1200μL並取100μL的體積至玻璃試管中，每組樣品需三重複。之後，加入500 μL 濃度為5%的苯酚溶液（Phenol）（購自Merck，料號：1.00206.0250）。
接著緩慢加入2.5 mL濃度為95.5%，比重1.84之濃硫酸溶液（H2
SO4
）（購自Showa，料號：1970-5250）。經由渦旋（vortex）確保無氣泡後，靜置20 分鐘。最後，取200 μL樣品放入96孔培養盤，於490 nm下測定其吸光值，並以內插法算出濃度後再乘回稀釋倍數以取得原萃取液濃度。
實驗結果：
根據前述實驗之結果，本發明之鳳梨釋迦多醣含量為50000 ppm。
[ 例
3] 細胞實驗 - 抑制酪胺酸酶活性
酪胺酸酶是生物體內黑色素合成的關鍵，酪胺酸酶會催化酪胺酸轉變為L-Dopa，接著產生Dopaquinone進而形成黑色素。於此，藉由檢測酪胺酸酶活性來了解鳳梨釋迦萃取物對於黑色素細胞產生黑色素的能力影響，當酪胺酸酶活性低時，黑色素細胞產生黑色素的能力就會相對降低。
材料與儀器
1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞B16F10，購自美國典型培養物保存中心（American Type CμLtureCollection，ATCC®
，No.6475），以下簡稱B16F10細胞。
2. 培養基：將DMEM改良培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，購自Gibco，Cat. 12100-038）添加額外成分使其含有10 vol% FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10438-026）及1% 青黴素-鏈黴素 (購自Gibco，Cat. 15140122)。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. 麴酸（Kojic acid）：購自Sigma-Aldrich，產品編號K3125-5G。
5. 全稱放射免疫沉澱法緩衝液蛋白質裂解液（RIPA Lysis Buffer （PMSF））：購自Sigma-Aldrich，產品編號10837091001。
6. Bio-rad Protein Assay，購自Biotek，產品編號Epoch。
7. 10 mM L-多巴（L-Dopa）：將9.8 mg 的 L-多巴（購自Sigma-Aldrich，產品編號D9628-5G。）溶於5mL的0.1mM，pH值7.0的PBS溶液中。
8. 胰蛋白酶：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco）以1X PBS溶液稀釋10倍。
9. 鳳梨釋迦萃取物：由本案例1之製備方式所製得。
實驗步驟：
於每一孔中加入2mL上述培養基，並將B16F10細胞以1.5 x 105
的每孔密度種入一6孔盤中，於37°C下，培養24小時。
本實驗分為控制組、對照組、實驗組。其中，各組加入2mL的新鮮DMEM培養液。而對照組之培養液額外加入麴酸(Kojic acid)，使其濃度為0.5 mg/mL，其中麴酸已被廣泛認知為具有抑制細胞酪胺酸酶活性之物質；實驗組之培養液額外加入鳳梨釋迦萃取物，使其濃度為0.5 mg/mL。各組進行三重複，並反應培養48小時。
培養完畢後，將培養液移除，以1x PBS（Gibco）清洗兩次。再加入胰蛋白酶-EDTA對細胞作用3分鐘，回收懸浮的細胞於15 mL離心管，以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。
再將沉澱細胞以1x PBS清洗兩次後，以200 μL細胞裂解液讓細胞懸浮，震盪混合後以12,000 xg離心20分鐘。
將上清液取出至1.5 mL離心管中，進行蛋白質濃度的檢測：
先將Bio-rad染劑與去離子水混合（體積比為1:4），分裝500 μL至微量離心管中。而後，分別於前述微量離心管中，加入10、8、6、4、2、1與0 μL 2mg/mL的BSA以製備標準濃度蛋白質。再加入2 μL測試樣本進行檢測。取出前述反應後之測試樣本200 μL於96孔盤中，以ELISA讀取儀（BioTek）測定595 nm的吸光值。
接著，於每孔中加入400 μg蛋白質，再加入90 μL細胞裂解液，包括控制組及對照組。在避光環境下，在37°C下加入10 μL10M的L-Dopa，每10分鐘觀察一次，直到懸浮液變黑。之後再測定405 nm的吸光值。
酪胺酸酶含量的分析公式為：酪胺酸酶抑制性（%）=（樣本吸光值/控制組吸光值）×100%。所得數值再以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定進行統計分析，其結果如圖3所示。
實驗結果：
由圖3之結果可知，在本發明之鳳梨釋迦萃取物的處理下，可達到抑制酪胺酸酶活性的功效。具體而言，對照組相對控制組之酪胺酸酶活性為79.66%，實驗組(鳳梨釋迦萃取物)相對控制組之酪胺酸酶活性為67.88%，由此可知，本案鳳梨釋迦萃取物於抑制酪胺酸之功效更甚於麴酸之抑制酪胺酸酶活性效果。因此，藉由本發明實施例所製備之鳳梨釋迦萃取物，確實可降低酪胺酸酶活性，進而可減少黑色素的生成，故可應用於減少皮膚黑斑、提升肌膚光澤、白皙度肌膚美白的相關組合物的成分中。
[ 例
4] 細胞實驗 - 鳳梨釋迦萃取物降低黑色素生成
於此，以ELISA讀盤機（enzyme-linked immunosorbent assay reader）測定黑色素瘤細胞株B16F10經鳳梨釋迦萃取物處理後，其黑色素含量的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞B16F10，購自美國典型培養物保存中心（American Type CμLtureCollection，ATCC®，No.6475），以下簡稱B16F10細胞。
2. 培養基：將Dulbecco's modified minimal essential medium（DMEM，購自Gibco，Cat. 12100-038）添加額外成分使其含有1 vol%的抗生素溶液（Antibiotic Antimycotic Solution，購自Gibco，15240-062）及10 vol%的FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. 以二次蒸餾水配製1N NaOH（購自Sigma，產品編號221465）溶液。
5. ELISA reader（購自BioTek，產品編號FLx 800）。
6. 鳳梨釋迦萃取物：由本案例1之製備方式所製得。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組、控制組及對照組三組進行，各組分別進行三重複試驗：
1. 將B16F10細胞以每孔1.5×105
個的方式，接種於每孔含3ml培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5%CO2
、37℃環境下，培養24小時。
3. 而後，在不干擾附著細胞的情況下，移除每孔之培養基。
4. 本實驗分為控制組、對照組、實驗組。其中，各組加入2mL的新鮮DMEM培養液。而對照組之培養液額外加入麴酸(Kojic acid)，使其濃度為0.5 mg/mL，其中麴酸已被廣泛認知為具有降低黑色素生成效果之物質；實驗組之培養液額外加入例1之鳳梨釋迦萃取物，使其濃度為0.5mg/mL。各組進行三重複，並使其於37℃下培養24小時。
5. 將反應完畢之實驗組及對照組移至藍光箱中，使其在室溫（25±5℃）下接受藍光照射3小時。另外，控制組移至暗室中，使其在室溫下靜置3小時。
6. 反應後，將細胞於37℃下培養48小時。
7. 而後，移除培養基，並以PBS溶液清洗細胞2次。
8. 將200μl胰蛋白酶（Trypsin-EDTA （10X），購自Gibco；產品編號15400-054）加至每孔中反應3分鐘。反應後，添加6 mL培養基溶液終止反應。而後收集各孔中之懸浮細胞與培養基至對應的15ml離心試管內，將各離心試管以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。
9. 以PBS溶液清洗沉澱細胞二次後，再以200μL PBS溶液重新懸浮細胞。
10. 將細胞懸浮液以液態氮冷凍10分鐘，再置於室溫約30分鐘至完全解凍。
11. 完全解凍後，將試管以12,000g離心3分鐘。
12. 移除上清液，再以120μL 1N氫氧化鈉溶液重新懸浮細胞沉澱後，使試管於60℃乾浴1小時，以獲得待檢測樣本。
13. 將100μL待檢測樣本移入一96孔盤，使用ELISA讀盤機測量細胞溶液在450nm的吸光值。
實驗結果
實驗組以及控制組的黑色素相對表現量係依下列公式計算：黑色素相對表現量（%）=（各組OD450
值/控制組OD450
值）×100%。因實驗係進行三重複，故將三重複實驗之結果平均後，顯示於圖4。
如圖4所示，在本發明之鳳梨釋迦萃取物的處理下，可達到降低黑色素生成的功效。具體而言，對照組相對控制組之黑色素生成量為79.32%，實驗組(鳳梨釋迦萃取物)相對控制組之黑色素生成量為81.01%，亦即實驗組與控制組相比黑色素生成降低約18.99%，且本案鳳梨釋迦萃取物之功效近似於麴酸之降低黑色素生成之效果。因此，本發明實施例所製備之鳳梨釋迦萃取物，確實可有效減少黑色素細胞所生成之黑色素，故可應用於減少皮膚黑斑、提升肌膚光澤、白皙度肌膚美白的相關組合物的成分中。
[ 例
5] 細胞實驗 - 鳳梨釋迦萃取物 抵抗與防禦 UVA 能力
於此測定人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經鳳梨釋迦萃取物處理後，其抵抗UVA之能力。
材料與儀器
1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966sk（生物資源保存及研究中心（BCRC），No. 60153）。
2. 培養基：將Eagle’s最低限度基本培養基（minimum essential medium，MEM，購自Gibco，15188-319）添加額外成分使其含有10 vol% FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）、90 vol% 1mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，11360-070）、1.5g/L 碳酸氫鈉（購自Sigma）、0.1mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，11140-050）。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. DMSO溶液：購自ECHO，產品編號DA1101-000000-72EC。
5. MTT溶液：購自Amresco，產品編號0793。
6. 紫外線鏈結箱：購自Cleaver Scientific，產品編號CL-508。
7. EpochTM
微孔板分光光度計：購自BioTek。
8. 倒立式顯微鏡搭載照相系統：購自ZEISS，產品編號：Vert.A1。
9. 本發明之鳳梨釋迦萃取物：此實驗中所使用的鳳梨釋迦萃取物，係以例1之方式製備而成。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組、控制組（未添加鳳梨釋迦萃取物、亦無經過紫外線照射的組別）、以及對照組（未添加鳳梨釋迦萃取物，但經紫外線照射的組別）三組進行，各組分別進行三重複試驗：
1. 將CCD-966sk細胞以每孔5×103
個的方式，接種於每孔含100ml培養基之96孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5%CO2
、37℃下，培養24小時。
3. 移除培養基。
4. 實驗組：添加含有0.625 μL的實施例1得到的鳳梨釋迦萃取物之0.1 mL細胞培養基（即鳳梨釋迦萃取物佔細胞培養基的體積百分比為0.625%），於37℃下，培養24小時。
控制組：添加單純的2 mL細胞培養基（即不含鳳梨釋迦萃取物），於37℃下，培養24小時。
對照組：添加單純的2 mL細胞培養基（即不含鳳梨釋迦萃取物），於37℃下，培養24小時。
5. 實驗組：將培養盤移紫外線鏈結箱，以 12 J/cm2
的 UVA 照射 1 小時。
控制組：將培養盤置於暗處，於室溫下靜置1小時。
對照組：將培養盤移紫外線鏈結箱，以 12 J/cm2
的 UVA 照射 1 小時。
6. 於每孔加入15μl的 MTT溶液，於37℃下，作用4小時。
7. 移除培養液，於每孔加入50μl的DMSO溶液，於軌道震盪器上搖晃10分鐘。
8. 以分光光度計測得O.D.570。
9. 透過以下公式計算細胞存活率：
細胞存活率 (%) = (O.D.UVA
/O.D.控制組
)
100%
因實驗係進行三重複，故將三重複實驗之結果平均後，顯示於圖5。
實驗結果
如圖5所示，由控制組、對照組的結果可知，在經過紫外線照射後，細胞死亡率增加，顯示紫外光照射確實會導致細胞之存活率降低。另一方面，根據對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過鳳梨釋迦萃取物處理後，其細胞存活率相較於對照組即明顯增加約42.26％，顯示鳳梨釋迦萃取物可有效提升細胞在面對紫外線照射後之存活率，可用於製備一種防禦或抵抗紫外線傷害之組合物。
[ 例
6] 細胞實驗 - 鳳梨釋迦萃取物降低黑色素生成
於此，以ELISA讀盤機（enzyme-linked immunosorbent assay reader）測定黑色素瘤細胞株B16F10經鳳梨釋迦萃取物處理後，其黑色素含量的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞株B16F10（ATCC CRL-6475），購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。
2. 培養基：將Dulbecco's modified minimal essential medium（DMEM，購自Gibco）添加額外成分使其含有1 vol%的抗生素溶液（Antibiotic Antimycotic Solution，購自Gibco，15240-062）、10 vol%的FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. 以二次蒸餾水配製1N NaOH（購自Sigma，產品編號221465）溶液。
5. ELISA reader（BioTek，FLx 800）。
6. 紫外線(UVA)鏈結箱（VILBER , BLX-254）。
7. 鳳梨釋迦萃取物：此實驗所使用的鳳梨釋迦萃取物係以例1之方式製備而成。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組、控制組（未添加鳳梨釋迦萃取物、亦無經過UVA照射的組別）、以及對照組（未添加鳳梨釋迦萃取物，但經UVA照射的組別）三組進行，各組分別進行三重複試驗：
1. 將B16F10細胞以每孔1.5×105
個的方式，接種於每孔含3ml培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5%CO2
、37℃環境下，培養24小時。
3. 而後，在不干擾附著細胞的情況下，移除每孔之培養基。
4. 控制組、對照組、實驗組各組加入2mL的新鮮DMEM培養液。其中，對照組與實驗組之培養液分別額外加入例1之鳳梨釋迦萃取物，使其濃度為0.5 mg/mL。接著，各組均於37℃下培養24小時。
5. 實驗組：將經過鳳梨釋迦萃取物培養基溶液處理步驟的6孔培養盤移至紫外線鏈結箱中，使其在室溫（25±5℃）下接受10 J/cm2
的 UVA 照射，照射3小時。控制組：將6孔培養盤移至暗室中，使其在室溫下靜置3小時。對照組：將6孔培養盤移至紫外線鏈結箱中，使其在室溫下接受10 J/cm2
的 UVA 照射照射3小時。
6. 反應後，將細胞於37℃下培養48小時。
7. 而後，移除培養基，並以PBS溶液清洗細胞2次。
8. 將200μl胰蛋白酶（Trypsin-EDTA (10X)，購自Gibco；產品編號15400-054）加至每孔中反應3分鐘。反應後，添加6 mL培養基溶液終止反應。而後收集各孔中之懸浮細胞與培養基至對應的15ml離心試管內，將各離心試管以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。
9. 以PBS溶液清洗沉澱細胞二次後，再以200μL PBS溶液重新懸浮細胞。
10. 將細胞懸浮液以液態氮冷凍10分鐘，再置於室溫約30分鐘至完全解凍。
11. 完全解凍後，將試管以 12,000xg 離心3分鐘。
12. 移除上清液，再以120μL 1N氫氧化鈉溶液重新懸浮細胞沉澱後，使試管於60℃乾浴1小時，以獲得待檢測樣本。
13. 將100μL待檢測樣本移入一96孔盤，使用ELISA讀盤機測量細胞溶液在450nm的光密度值（optical density，OD450
），作為吸光度。
實驗結果
實驗組、控制組、以及對照組的黑色素相對表現量係依下列公式計算：黑色素相對表現量（%）=（各組OD450
值/控制組OD450
值）×100%。因實驗係進行三重複，故將三重複實驗之結果平均後，顯示於圖6。
如圖6所示，由控制組、對照組的結果可知，在經過UVA光照射後，細胞中的黑色素表現量將明顯增加，顯示UVA光照射確實會促使黑色素瘤細胞產生黑色素，而這將使得肌膚產生斑點、或使肌膚整體較為暗沈，具體而言，經UVA照光後之黑色素與控制組相比增加12.06%.。而另一方面，根據對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過鳳梨釋迦萃取物處理後，其在UVA光下的黑色素表現量低於未經過鳳梨釋迦萃取物處理的對照組（降低約10.08％），顯示鳳梨釋迦萃取物可有效減少黑色素細胞因UVA所生成之黑色素。
[ 例
7] 細胞實驗 - 鳳梨釋迦萃取物提升彈力蛋白增生
於此，以ELISA讀盤機（enzyme-linked immunosorbent assay reader）測定黑色素瘤細胞株B16F10經鳳梨釋迦萃取物處理後，其黑色素含量的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966sk（生物資源保存及研究中心（BCRC），No. 60153）。
2. 培養基：將Eagle’s最低限度基本培養基（minimum essential medium，MEM，購自Gibco，15188-319）添加額外成分使其含有10 vol% FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）、90 vol% 1mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，11360-070）、1.5g/L 碳酸氫鈉（購自Sigma）、0.1mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，11140-050）。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. ELISA reader（BioTek，FLx 800）。
5. Fastin™ 彈力蛋白檢測試劑盒（Fastin™ Elastin Assay kit (Biocolor)）。
6. 鳳梨釋迦萃取物：此實驗所使用的鳳梨釋迦萃取物係以例1之方式製備而成。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組以及對照組（未添加鳳梨釋迦萃取物之組別）二組進行，各組分別進行三重複試驗：
1. 將CCD-966sk細胞以每孔1×105
個的方式，接種於每孔含2ml培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5%CO2
、37℃環境下，培養24小時。
3. 而後，在不干擾附著細胞的情況下，移除每孔之培養基。
4. 控制組及實驗組均加入2mL的新鮮DMEM培養液。其中，實驗組之培養液額外加入以例1之方式所製備之鳳梨釋迦萃取物，使其濃度為0.5mg/mL。
5. 反應後，將細胞於37℃下培養48小時。
6. 而後，移除培養基，並以PBS溶液清洗細胞1次。
7. 將200μl胰蛋白酶（Trypsin-EDTA (10X)，購自Gibco；產品編號15400-054）加至每孔中反應3分鐘。反應後，添加6 mL培養基溶液終止反應。而後收集各孔中之懸浮細胞與培養基至對應的1.5 ml離心試管內，將各離心試管以300 xg離心5分鐘使細胞沉澱。
8. 以PBS溶液清洗沉澱細胞二次後，再以200μL PBS溶液重新懸浮細胞。
9. 再次將各離心試管以300 xg離心5分鐘使細胞沉澱，再以約300μL PBS溶液重新懸浮細胞。
10. 接著，於前述細胞懸浮液中加入100 μL 1.0M的草酸（oxalic acid）後，將其於100℃中培養1小時。
11. 於每個試管中加入等體積的彈性蛋白沉澱試劑。蓋上離心管並短暫渦旋混合。靜置15分鐘以完成沉澱並將其以10,000 xg離心10分鐘。
12. 去除離心管內的液體後，添加1毫升染料試劑。將試管放在機械振盪器上，孵育90分鐘。
13. 去除剩餘染劑。而在管的底部和內部下壁中的紅棕色沉積物正是彈性蛋白-染料複合物。
14. 向每個試管中加入250μl染料解離試劑。蓋上管子，借助渦旋混合器將染料釋放到溶液中。確保所有結合的染料都已進入溶液。
15. 將每個試管的內容物轉移到96孔板中，然後將板放入ELISA讀數器中。在513nm處測量吸光度。
16. 通過Microsoft Excel中的Student t檢驗確定兩個樣本總體之間差異的統計顯著性。 （*：p ＜0.05； **：p ＜0.01； ***：p ＜0.001）。
17. 將100μL待檢測樣本移入一96孔盤，使用ELISA讀盤機測量細胞溶液在513nm的光密度值（optical density，OD450
），作為吸光度。
實驗結果
實驗組以及控制組的黑色素相對表現量係依下列公式計算：黑色素相對表現量（%）=（各組OD450
值/控制組OD450
值）×100%。因實驗係進行三重複，故將三重複實驗之結果平均後，顯示於圖7。
如圖7所示，由控制組以及實驗組的結果可知，當細胞經過鳳梨釋迦萃取物處理後，其彈力蛋白分泌量有所提升（較控制組高約4.79％），顯示鳳梨釋迦萃取物可有效提升彈力蛋白分泌量。而彈力蛋白是細胞外基質的關鍵蛋白，其具有很大的彈性，一重要功能便是使體內許多組織在拉伸或收縮後恢復其形狀。除此之外，彈性蛋白還是體內重要的承重組織，亦可用於儲存機械能。同時，彈性蛋白亦能使肌膚保持彈性，隨著年齡老化而喪失肌膚彈性的原因之一便是彈性蛋白的流失。因此，本發明之鳳梨釋迦萃取物可用於製備提升肌膚彈力、減緩肌膚老化、或提升肌膚儲存機械能之能力之組合物。
[ 例
8] 基因實驗 - 粒線體活性相關基因
此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類皮膚纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966sk經本發明之鳳梨釋迦萃取物處理後，細胞中粒線體活性相關基因的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966sk（生物資源保存及研究中心（BCRC），No. 60153）。
2. 培養基：將Eagle’s最低限度基本培養基（minimum essential medium，MEM，購自Gibco，15188-319）添加額外成分使其含有10 vol% FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）、90 vol% 1mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，11360-070）、1.5g/L碳酸氫鈉（購自Sigma）、0.1mM非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，11140-050）。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）。
5. 反轉錄酶（SuperScript® III Reverse Transcriptase） （Invitrogen公司，美國，編號18080-051）。
6. 測量標的基因引子，其中包含HAS2基因、HAS3基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、GBA基因及FLG基因，另包括內部控制組（TBP基因）。
7. KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）。
8. ABI StepOnePlusTM即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））。
9. 鳳梨釋迦萃取物：由本案例1所述之製備方式所得之鳳梨釋迦萃取物。
實驗步驟
細胞培養的實驗流程如下：
1. 首先以每孔1×105
個細胞量培養於含有2 mL上述培養液之六孔培養盤中，並在37℃下培養16小時，然後將CCD-966sk細胞分為實驗組與控制組。
2. 實驗組：每毫升培養液含有0.25 mg範例一之方式製備而成之鳳梨釋迦萃取物的比例（即，濃度為0.25 mg/mL）製得含萃取物的培養液，將CCD-966sk細胞更換為含萃取物的培養液中繼續培養。
3. 控制組：不做任何處理，即不額外添加其他化合物至含有培養後的CCD-966sk細胞的培養液中。
4. 實驗組與控制組於培養6小時後，將培養後的實驗組與控制組細胞以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。
聚合酶連鎖反應的實驗流程如下：
1. 使用RNA萃取試劑套組分別收集二組細胞溶液內之RNA。
2. 接著，每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶以表2中之引子（primer）黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。
3. 後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以及KAPA SYBR FAST將二組反轉錄後產物分別以表2之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察實驗組和控制組的CCD-966sk細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95 °C反應1秒，60 °C反應20秒，總共40個迴圈。
4. 爾後，使用2-ΔΔCt
方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之一目標基因相對於控制組或對照組之同一基因的RNA表現量倍數變化。該方法以GAPDH基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化：
△Ct = Ct實驗組之目標基因 / 控制組或對照組之目標基因
- Ct GAPDH
△△Ct= △Ct實驗組之目標基因
- △Ct控制組之目標基因
倍數變化 = 2-ΔΔCt 平均值
5. 最終，利用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾Student t-test分析是否具有統計上顯著差異 （*p值＜0.05; **p值＜0.01; ***p值＜0.001）。其中，PARP1基因對應的引子對為PARP1-F以及PARP1-R，PARP2基因對應的引子對為PARP2-F以及PARP2-R，NADSYN基因對應的引子對為NADSYN-F以及NADSYN-R，GAPDH基因對應的引子對為GAPDH-F以及GAPDH-R。相關引子之名稱、序列編號、序列、基因長度及基因ID可參見以下表2。
表2
| 引子名稱 | 序列編號 | 序列 | 長度 | 基因 ID |
| PARP1-F | SEQ ID NO:1 | AGCGTGTTTCTAGGTCGTGG | 20 | 142 |
| PARP1-R | SEQ ID NO:2 | CATCAAACATGGGCGACTGC | 20 | |
| PARP2-F | SEQ ID NO:3 | AGCAAGATGAATCTGTGAAGGC | 22 | 10038 |
| PARP2-R | SEQ ID NO:4 | CACTGAAGTTCCTCTGGGCA | 20 | |
| NADSYN-F | SEQ ID NO:5 | GCAAAATGTGCAGGCTCGAA | 20 | 55191 |
| NADSYN-R | SEQ ID NO:6 | GCACTGGAGCAGTCGTACTT | 20 | |
| GAPDH-F | SEQ ID NO:7 | CTGGGCTACACTGAGCACC | 19 | 2597 |
| GAPDH-R | SEQ ID NO:8 | AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG | 21 |
實驗結果
參照圖8。圖8為經本發明鳳梨釋迦萃取物處理之實驗組與未經本發明鳳梨釋迦萃取物處理之控制組的PARP1基因、PARP2基因以及NADSYN基因之相對表現量之長條圖（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
由該圖可知，當控制組之PARP1基因、PARP2基因以及NADSYN基因的表現量為100%時，實驗組之PARP1基因、PARP2基因以及NADSYN基因的表現量分別約為74%、68%及113%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的人類皮膚纖維母細胞中的之之PARP1基因、PARP2基因以及NADSYN基因表現量分別降低26%、降低32%與提升13%，且均達統計學上之顯著差異。
如前所述，PARP1基因與PARP2基因各自所轉錄之蛋白質PARP1與PARP2具有抑制細胞能量分子提供者NAD+的功能。因此當PARP1與PARP2的表現量受到抑制，粒線體可保持較佳活性。而NADSYN則為NAD合成路徑重要的催化因子，其主要作用是將NaAD催化為NAD。當NADSYN表現量提升時，粒線體之活性亦將隨之提升。遂此，本發明之鳳梨釋迦萃取物具有提升粒線體活性、提升個體體力、減緩肌膚老化等功能。
無
圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
圖1是一實施例的鳳梨釋迦萃取物製備方法流程圖。
圖2是另一實施例的鳳梨釋迦萃取物製備方法流程圖。
圖3是範例三中實驗組、對照組及控制組的酪胺酸酶抑制性比例圖。
圖4是範例四中實驗組、對照組及控制組的黑色素生成比例圖。
圖5是範例五中實驗組、對照組及控制組的細胞在經紫外線照射後存活率比例圖。
圖6是範例六中實驗組、對照組及控制組的細胞在經紫外線照射後之黑色素生成比例圖。
圖7是範例七中實驗組及控制組的細胞的彈力蛋白分泌量比較圖。
圖8是範例八中實驗組及控制組粒線體活性相關基因表現量比例圖。
Claims (10)
- 一種鳳梨釋迦果實(Annona cherimola ×Annona squamosa )萃取物用於製備改善肌膚狀態之組合物之用途，其中該鳳梨釋迦萃取物係以一含水之溶劑萃取一鳳梨釋迦果實所獲得。
- 如請求項1所述之用途，其中該改善肌膚狀態包含提升肌膚白皙度、提升肌膚彈性及/或提升肌膚抵禦紫外線之能力。
- 如請求項2所述之用途，其中該鳳梨釋迦萃取物係透過減少酪胺酸酶生成或抑制黑色素生成以達到該提升肌膚白皙度。
- 如請求項3所述之用途，其中該黑色素係由一紫外光或一藍光所造成。
- 如請求項2所述之用途，其中該鳳梨釋迦萃取物係透過提升肌膚細胞內粒線體活性以達到該提升肌膚抵禦紫外線之能力。
- 如請求項5所述之用途，其中該鳳梨釋迦萃取物係透過提升粒線體活性相關基因以達到該提升肌膚細胞內粒線體活性。
- 如請求項6所述之用途，其中該粒線體活性相關基因包含PARP1基因、PARP2基因、及/或NADSYN基因。
- 如請求項1所述之用途，其中該組合物之總多酚含量為50000 ppm 以上。
- 如請求項1所述之用途，其中該組合物係進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、或化妝品組合物。
- 如請求項1所述之用途，其中該含水之溶劑與該鳳梨釋迦果實之液固比為5：1~20：1，且其中該萃取係於50°C ~100°C進行，且其中該含水之溶劑包含水及澱粉糖化酵素。
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