TWI814026B

TWI814026B - 釋迦果皮萃取物於製備抑制基質金屬蛋白酶、玻尿酸酶、脂氧合酶活性、一氧化氮生成組成物的用途

Info

Publication number: TWI814026B
Application number: TW110124108A
Authority: TW
Inventors: 呂昆霖; 張俊麟
Original assignee: 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2023-09-01
Also published as: TW202302130A

Abstract

本發明關於一種釋迦(Annona squamosa L.)果皮萃取物於製備抑制基質金屬蛋白酶、玻尿酸酶、脂氧合酶活性、一氧化氮生成組成物的用途，釋迦果皮萃取物是將釋迦果皮材料，以水為萃取溶劑，於壓力1.02atm、溫度121℃之作用條件萃取後所獲得；釋迦果皮萃取物具有清除自由基、抗發炎、抑制玻尿酸酶、基質金屬蛋白酶的活性；藉此，本發明之釋迦果皮萃取物可應用於製備抑制基質金屬蛋白酶、玻尿酸酶、脂氧合酶活性、一氧化氮生成的組成物。

Description

釋迦果皮萃取物於製備抑制基質金屬蛋白酶、玻尿酸酶、脂氧合酶活性、一氧化氮生成組成物的用途

本發明係關於釋迦果皮萃取物及其於製備抑制基質金屬蛋白酶、玻尿酸酶、脂氧合酶活性、一氧化氮生成組成物的用途。

臺灣盛產多種水果，素有水果王國的美譽。水果中富含纖維素與多種維生素，因此食用水果被認為對健康大有益處；但是水果的果皮纖維通常較粗大，且入口常有澀味，因此多被做為廢棄物棄置。然而，近年來已有研究指出，水果的果皮中也含有對人體有益的物質，例如中華民國專利第TW 202110458(A)號公開案便揭露自葡萄皮萃取錦葵素-3,5-二葡萄糖苷的技術；又如中華民國專利第TWI558697(B)號專利也揭露自柑橘類果皮製備多甲氧基黃酮去單甲基形式的方法，顯然以往被視為廢棄物的果皮，具有極大的開發價值。

今，發明人有鑑於現有關於果皮利用的相關研究仍較為不足，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。

本發明揭露一種釋迦(Annona squamosa L.)果皮萃取物，其係將一釋迦果皮材料，以水為萃取溶劑，於壓力1.02atm、溫度121℃之作用條件萃取後所獲得。

本發明也揭露一種釋迦果皮萃取物於製備抑制基質金屬蛋白酶、玻尿酸酶、脂氧合酶活性、一氧化氮生成組成物的用途，其中該釋迦果皮萃取物係將一釋迦果皮材料，以水為萃取溶劑，於壓力1.02atm、溫度121℃之作用條件萃取後所獲得，且該釋迦果皮萃取物具有抑制基質金屬蛋白酶、玻尿酸酶、脂氧合酶活性、一氧化氮生成之功效。

於本發明之一實施例中，釋迦果皮萃取物包含150~200mg GAE/克-萃取物之總類黃酮以及50~100mg CE/克-萃取物。

於本發明之一實施例中，釋迦果皮萃取物抑制一氧化氮生合成。

於本發明之一實施例中，釋迦果皮萃取物抑制脂氧合酶活性。

於本發明之一實施例中，釋迦果皮萃取物抑制玻尿酸酶的活性。

於本發明之一實施例中，釋迦果皮萃取物保護DNA不受到自由基傷害。

於本發明之一實施例中，釋迦果皮萃取物抑制基質金屬蛋白酶的活性。

藉此，本發明之釋迦果皮萃取物，具有抗氧化、抗發炎的能力，且能抑制玻尿酸酶、基質金屬蛋白酶等等與皮膚老化相關的酵素，而可應用於製備抗老化組成物。

第一圖：果皮萃取物之DPPH自由基清除率分析圖。

第二圖：釋迦果皮萃取物還原力分析圖。

第三圖：釋迦果皮萃取物亞鐵離子螯合能力分析圖。

第四圖：釋迦果皮萃取物抑制一氧化氮生成分析圖。

第五圖：釋迦果皮萃取物抑制5-脂氧合酶活性分析圖。

第六圖：釋迦果皮萃取物抑制玻尿酸酶活性分析圖。

第七圖：釋迦果皮萃取物保護DNA結構分析圖。

第八圖：釋迦果皮萃取物抑制基質金屬蛋白酶活性分析圖。

為令本發明之技術手段其所能達成之效果，能夠有更完整且清楚的揭露，茲藉由下述具體實施例，詳細說明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍，請一併參閱揭露之圖式。

一、果皮萃取物的製備

本試驗使用的水果包含釋迦(Annona squamosa L.)、鳳梨釋迦(Annona atemoya Hort)、葡萄柚(Citrus paradise)、木瓜(Carica papaya Linn.)、芒果(Mangifera indica L.)、酪梨(Persea americana Miller)、紅火龍果(Hylocereus.undatus(Weber)Britt.& Rose)與哈密瓜(Cucumis melo Linn.)。將各水果的果肉分離，並留下果皮；將果皮放入烘箱，以50℃的溫度烘乾5天，以獲得乾燥果皮，將乾燥果皮以磨碎機磨成粉末，並保存於防潮箱中。

萃取時，取10克的乾燥果皮粉末放入血清瓶中，加入200mL去離子水，浸泡20分鐘後，再以高溫高壓萃取法萃取20分鐘，萃取壓力為1.02atm、萃取溫度為121℃，高溫高壓萃取法可避免萃取溶劑在萃取溫度下沸騰，以確保溶劑與欲萃取物保持緊密接觸、提高溶劑對於欲萃取物的滲透性、進而提高萃取效率；將萃取後的產物以濾紙搭配以抽氣過濾方法，分離萃取液與殘渣，再將萃取液進行冷凍乾燥，以得到一凍乾粉末，秤量凍乾粉末的重量以計算萃取產率；凍乾粉末儲存於-20℃冰箱，欲使用時再取出並溶解於純水中，配製成所需濃度使用。

於以下說明書內容中，釋迦果皮萃取物簡稱為AWPP、鳳梨釋迦果皮萃取物簡稱為FPAP、葡萄柚果皮萃取物簡稱為CWAP、木瓜果皮萃取物簡稱為CPP、芒果果皮萃取物簡稱為MIP、酪梨果皮萃取物簡稱為PAWP、紅龍果果皮萃取物簡稱為RHUP、以及哈密瓜果皮萃取物簡稱為CMP。

萃取產率的計算公式為：(凍乾粉末重量/乾燥果皮重量)X 100%。

請參見表一，為八種水果果皮萃取物的產率，其中鳳梨釋迦果皮萃取物(FPAP)的萃取產率最高為44.14%，木瓜果皮萃取物(CPP)萃取產率次高為37.31%，哈密瓜果皮萃取物(CMP)萃取產率為36.05%，芒果果皮萃取物(MIP)的萃取產率為34%，葡萄柚果皮萃取物(CWAP)的萃取產率為17.79%，酪梨果皮萃取物(PAWP)的萃取產率為16.8%，釋迦果皮萃取物(AWPP)的萃取產率為16.2%，以及紅龍果果皮萃取物(RHUP)的萃取產率最低為10.2%。

二、果皮萃取物功效測試

(一)、DPPH自由基清除率試驗

DPPH為一種脂溶性、帶有不成對電子自由基的分子，當DPPH自由基溶解於有機溶劑，例如甲醇或乙醇時，溶液呈現深紫色；當DPPH自由基溶液中同時存在抗氧化物時，抗氧化物會提供氫原子給DPPH自由基，會使溶液顏色轉變成淺黃色，當溶液變成淡黃色時，代表DPPH自由基被清除，也代表溶液中抗氧化物的抗氧化能力佳。

DPPH自由基清除率的試驗方法簡述如下：取2~80μL的樣品與40μL的DPPH甲醇溶液(1mM)混合，再以甲醇將總體積調整至200μL並混合均勻，以獲得一混合溶液，將混合溶液靜置於室溫下，避光反應30分鐘，再測量混合溶液對於波長517nm的吸光值，並計算可清除一半DPPH自由基的樣品濃度(EC₅₀)；本試驗中以1mg/mL的抗壞血酸(ascorbic acid)作為標準品。

DPPH自由基清除率的計算公式為：清除率(%)={[(Ac-Acb)-(As-Asb)]/Ac-Acb}×100%

其中Ac代表DPPH自由基甲醇溶液於波長517nm的吸光值，Acb為甲醇溶液於波長517nm的吸光值，As為樣品與DPPH自由基甲醇溶液作用後於波長517nm的吸光值，以及Asb為未與DPPH甲醇溶液混合的樣品於波長517nm的吸光值。

請參見第一圖，為各種果皮萃取物的DPPH自由基清除率試驗結果，其中AWPP的DPPH自由基清除率最佳，於使用濃度80μg/mL時，其反應就達到飽和狀態；其餘果皮萃取物的DPPH自由基清除能力由高至低排列依序為PAWP、FPAP、MIP、RHUP、CWAP、CMP以及CPP，且其中CWAP、CMP、CPP的使用濃度增加到達400μg/mL時，仍無法達到較佳的DPPH自由基清除效果。

表二為各果皮萃取物清除50%DPPH自由基(EC₅₀)的濃度，以「平均值±標準偏差」呈現，其中AWPP的EC₅₀為八種水果皮萃取物中最低為19.49±4.11μg/mL，代表其具有最佳的DPPH自由基清除能力；又本試驗中以抗壞血酸(ascorbic acid)作為標準品，其EC₅₀為10.21±0.24μg/mL，表示AWPP清除DPPH自由基的能力約為抗壞血酸的一半。

(二)、總酚與總類黃酮含量測試

因上述試驗中，AWPP具有最佳的DPPH自由基清除能力，故此試驗中進一步測量AWPP內總酚與總類黃酮的含量。

總酚含量的測量是以沒食子酸(gallic acid)作為對照指標，測量結果以每克樣品相當於多少毫克沒食子酸(mg GAE/g extract)表示，且測量結果以「平均值±標準偏差」呈現。測量步驟簡述如下：先以不同濃度的沒食子酸為標準品，與Folin-Ciocalteu試劑、Na₂CO₃(20wt%)溶液與去離子水混合均勻，靜置並避光作用後測量其於波長750nm的吸光值，以製作一檢量線；待測樣品也與Folin-Ciocalteu試劑、Na₂CO₃(20wt%)溶液與去離子水混合均勻並作用後，測量於波長750nm的吸光值，再將待測樣品的吸光值與檢量線進行比對，以換算每克待測樣品中含有多少相當於沒食子酸的總酚含量，並以毫克沒食子酸(mg GAE)/克-樣品(g-extract)表示。試驗結果顯示，AWPP的總酚含量為176.48±3.85mg GAE/g-extract。

又，總類黃酮含量是以兒茶素(Catechin)作為對照指標，測量結果以每克樣品相當於多少毫克兒茶素(mg CE)/克-樣品(g-extract)表示；測量步驟簡述如下：將不同濃度的兒茶素與5% NaNO₂溶液以及去離子水混合，避光作用6分鐘後，再加入10%AlCl₃溶液並混合均勻，室溫下避光靜置反應5分鐘，最後加入1M的NaOH溶液以中止反應；測量最終獲得的溶液於波長510nm的吸光值，以製作一檢量線；將待測樣品以同樣的方法進行反應，並測量其於波長510nm的吸光值，再將待測樣品的吸光值與檢量線進行比對，以獲得每克待測樣品中含有多少相當於兒茶素的總類黃酮含量，並以毫克兒茶素(mg CE)/克-樣品(g-extract)表示。根據試驗結果，AWPP的總類黃酮含量為61.54±1.14mg CE/g-extract。。

(三)、還原力測試

此試驗是檢測樣本將三價鐵離子(Fe³⁺)還原成二價鐵離子(Fe²⁺)的能力，當赤血鹽(K₃Fe(CN)₆)與檢測樣品作用、被還原成黃血鹽(Fe(CN)₆ ^-4)後，黃血鹽(Fe(CN)₆ ^-4)再與氯化鐵(FeCl₃)反應產生Fe₄[Fe(CN)₆]₃，Fe₄[Fe(CN)₆]₃呈現普魯士藍，在波長700nm有強烈吸收光譜，因此當普魯士藍生成量越高、於波長700nm的吸光值就會越高，便代表檢測樣品的還原力越強。本試驗中以抗壞血酸做為標準品，並計算檢測樣品(AWPP)的還原力；請參見第二圖，為不同濃度的AWPP以上述試驗步驟處理後、最終溶液於波長700nm的吸光值變化；又根據實驗結果計算AWPP的50%還原力濃度，為52.2±3.74μg/mL，又作為標準品的抗壞血酸(ascorbic acid)的50%還原力濃度為6.70±0.3μg/mL。

(四)、總抗氧化能力測試

本試驗藉由樣品清除ABTS自由基的能力，作為評估樣品抗氧化能力(trolox equivqlent antioxidant capacity，TEAC)的指標，其單位為每單位樣品中含有多少水溶性維生素E(trolox)當量(TE)；因ABTS與過硫酸鉀(K₂S₂O₈)反應後，會產生呈現藍綠色的ABTS自由基，若將具有抗氧化能力的樣品與ABTS自由基作用，則會降低藍綠色的顏色，而在波長734nm具有吸收光譜，因此可以藉由顏色的變化判斷ABTS自由基被清除的情形，且可進一步將樣品作用後的吸光值與標準品(trolox)進行比對，以獲得樣品的水溶性維生素E當量(TE)；檢測方式簡述如下：先將7mM ABTS水溶液和2.4mM過硫酸鉀水溶液混合，於室溫避光反應12小時，以產生藍綠色的ABTS自由基水溶液；將1mL ABTS自由基水溶液以0.2M磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer，pH6.6)稀釋，使其波長734nm處的吸光值為0.7±0.02，以獲得穩定的藍綠色ABTS自由基水溶液；將不同體積的樣品或標準品(trolox)，分別與ABTS自由基水溶液混合，於室溫避光反應10分鐘，再測定在波長734nm的吸光值。實驗結果顯示，AWPP的TEAC當量為34.46±0.9μM TE/克-樣本。

(五)、亞鐵離子螯合測試

因菲咯(Ferrozine)與亞鐵離子(Fe²⁺)螯合後，會產生藍紫色錯化合物，在波長562nm具有吸收光譜，但是若亞鐵離子被螯合後，則會降低藍紫色錯合物之產生，因而降低測試液於波長562nm的吸光值，因此若於波長562nm的吸光值越低，表示亞鐵離子被一檢測樣品螯合的比例越高；測試方法簡述如下：將檢測樣品與1mM之氯化亞鐵水溶液、5mM之菲咯(Ferrozine)溶液混合均勻，以獲得一混合溶液，將混合溶液靜置並避光反應10分鐘，再測量混合溶液於波長 562nm的吸光值，並將試驗結果換算成50%亞鐵離子螯合率(EC₅₀)；本試驗中以乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)作為正對照組。

亞鐵離子螯合率(%)={[(Ac-Acb)-(As-Asb)]/Ac-Acb}×100%

其中Ac代表菲咯-亞鐵離子水溶液的吸光值，Acb代表純水的吸光值，As代表檢測樣品與菲咯-亞鐵離子水溶液作用後的吸光值，以及Asb代表未與菲咯-亞鐵離子水溶液作用的檢測樣品的吸光值。

請參見第三圖，為亞鐵離子螯合率的試驗結果，且經計算，AWPP螯合50%亞鐵離子濃度為2.429±0.0195mg/mL，而標準品乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)的50%還原力的濃度為0.008±0.0003mg/mL。

(六)、一氧化氮(NO)生成測試

本試驗的檢測原理為，硝普鈉(Sodium nitroprusside)溶液會持續釋放出一氧化氮(NO)、而NO會與Griess試劑作用而產生紅色的偶氮苯，偶氮苯於波長540nm處有吸收波峰，因此藉由測量溶液於波長540nm處的吸光值，便可以判斷一氧化氮的含量高低。試驗方法簡述如下：將檢測樣品、100mM硝普鈉溶液、PBS緩衝液混合均勻，並於室溫下反應2.5小時；反應完成後，加入Griess reagent，混合均勻之後在室溫下反應20分鐘，最後測量混合溶液於波長540nm的吸光值，以計算檢測樣品對於一氧化氮生成的抑制率，並進一步計算抑制50%一氧化氮的檢測樣品濃度(IC₅₀)；本試驗中作為正對照組的標準品為芸香苷(Rutin)；一氧化氮生合成的抑制率計算公式為：抑制率(%)={[(Ac-Acb)-(As-Asb)]/Ac-Acb}×100%

其中Ac代表未與檢測樣品作用的硝普鈉溶液的吸光值，Acb代表純水的吸光值，As代表檢測樣品與硝普鈉溶液作用後的吸光值，以及Asb代表未與硝普鈉溶液作用的檢測樣品的吸光值。

請參見第四圖，為一氧化氮生成抑制率的計算結果，AWPP抑制一氧化氮的IC₅₀為80.09±0.82μg/mL，而芸香苷的IC₅₀為492.52±5.8μg/mL。

(七)、5-脂氧合酶(5-lipoxygenase)活性試驗

人體的發炎反應中，花生四烯酸會先被水解，接著經過5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)催化後，最後產生發炎物質白三烯(Leukotriene)，因此只要抑制5-脂氧合酶的活性，便可以減緩發炎反應的發生；本試驗中是以亞麻油酸(Linoleic acid)做為檢測原料，當亞麻油酸被5-脂氧合酶催化後，其結構中的Diene 1,4會轉變成Diene 1,3，因而在波長234nm處會有強吸收波峰。

本試驗的檢測流程簡述如下：將檢測樣品、亞麻油酸溶液、5-脂氧合酶溶液以及Tris緩衝溶液混合均勻，於室溫下(約25℃)靜置並反應10分鐘，再測量其於波長234nm的吸光值；當吸光值越低，表示抑制5-脂氧合酶活性的效果越好；本試驗中使用α甜沒藥醇(α-Bisabolol)作為正對照組。5-脂氧合酶抑制率的計算公式如下：抑制率(%)={[(Ac-Acb)-(As-Asb)]/Ac-Acb}×100%

其中Ac代表5-脂氧合酶水溶液的吸光值，Acb代表純水的吸光值，As代表檢測樣品本與5-脂氧合酶水溶液作用後的吸光值，以及Asb代表沒有與5-脂氧合酶水溶液作用的檢測樣品的吸光值。又，根據抑制率結果，計算出檢測樣品的5-脂氧合酶50%抑制率濃度(IC50)。

請參見第五圖，為5-脂氧合酶抑制率的試驗結果，AWPP的5-脂氧合酶IC₅₀為50.12±1.05μg/mL，又α甜沒藥醇(α-Bisabolol)的5-脂氧合酶IC₅₀為25.60±1.27μg/mL。

(八)、玻尿酸酶(hyaluronidase，HAase)抑制測試

本試驗的檢測流程簡述如下：待檢測樣品與玻尿酸酶混合，放置於微量離心管，以轉速10000rpm離心20秒，再將微量離心管於37℃恆溫作用18 小時；本試驗中的正對照組為甜沒藥醇，負對照組為0.15M氯化鈉-0.1M甲酸鈉緩衝液；將反應後的混合溶液注入電泳凝膠片中，進行電泳凝膠分析。

電泳完成後，先將電泳凝膠片先浸泡於HEPES(pH7.4)溶液，並在室溫中搖晃清洗10分鐘，重複清洗三次；接著將電泳凝膠片浸泡於0.15M氯化鈉-0.1M甲酸鈉溶液(pH5.7)中，於37℃恆溫作用18小時；移除0.15M氯化鈉-0.1M甲酸鈉溶液，再將電泳凝膠片浸泡於0.5%阿爾辛藍(alcian blue)醋酸溶液中進行染色，染色時間為15分鐘；移除0.5%阿爾辛藍(alcian blue)醋酸溶液，再將電泳凝膠片浸泡於以考馬斯亮藍R250(coomassie brilliant blue R250)溶液，染色15分鐘；移除考馬斯亮藍R250溶液，以褪染劑褪染電泳凝膠片，直到電泳凝膠片上是否出現透明條帶，以觀察玻尿酸酶的活性是否有被抑制。

請參見第六圖，於注入水對照組(負對照組)的電泳凝膠片處明顯觀察到透明條帶，此代表水對照組中的玻尿酸酶的活性完全沒有被抑制；而注入1%兒茶素對照組(正對照組)的電泳凝膠片，透明條帶的面積減少許多，表示此組別中玻尿酸酶的活性被抑制了；使用不同濃度AWPP的組別中，低濃度的AWPP具有些許抑制玻尿酸酶活性的現象，在2000μg/mL AWPP組別中，玻尿酸酶的活性明顯受到抑制。

(九)、DNA保護

本實驗使用含有自由基的Fenton’s試劑(Fenton’s reagent)破壞DNA分子，並檢測當本案的AWPP存在時，是否能保護DNA分子被Fenton’s試劑傷害的情形。檢測方法簡述如下：將Tris-HCl緩衝液(pH7.8)、400μM之氯化鐵(FeCl₃)溶液、800μM之抗壞血酸溶液、8mM之過氧化氫溶液、質體DNA(plasmid DNA)以及帶檢測樣品混合均勻，並於37℃恆溫水浴槽中作用30分鐘；30分鐘之後再於混合液中加入0.5M的EDTA溶液中止反應；將反應物進行洋菜膠電泳，觀察質體DNA的樣態，若質體DNA未受到破壞，則會呈現緊密纏繞的超螺旋(supercoiled)型結構，障礙較小，於洋菜膠中移動較快；若質體DNA受到自由基攻擊後，會呈現較為鬆散的直線型(linear circular)結構，於洋菜膠中移動較慢。

請參見第七圖，為洋菜膠電泳後的實驗結果，與無添加AWPP以及Fenton’s試劑的組別相比，只添加Fenton’s試劑的組別中，可以明顯觀察到直線型質體DNA；但是隨著AWPP的添加濃度增加，直線型質體DNA的比例有下降的趨勢、且超螺旋型質體DNA的比例也有增加的情形；當AWPP使用濃度為25μg/mL時，就具有保護DNA的效果，AWPP使用濃度提高到100μg/mL則DNA保護效果更為明顯。

(十)、基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)抑制測試

本試驗的進行步驟簡述如下：將檢測樣品或是純水、MPPs溶液於微量離心管中混合，以轉速10000rpm離心20秒，再將微量離心管於37℃恆溫下反應24小時，其中使用純水的組別作為無法抑制MMPs活性的負對照組；將反應後的產物注入電泳凝膠片中，進行電泳分析；將電泳後的電泳凝膠片浸泡於2.5%的Triton X-100溶液中，於室溫中搖晃清洗30分鐘，以恢復蛋白質活性；再將電泳凝膠片浸泡developing緩衝溶液，並於37℃恆溫作用24小時；移除developing緩衝溶液，再將電泳凝膠片浸泡於10mM之EDTA溶液20分鐘，以終止反應；移除EDTA溶液，並以無菌水清洗電泳凝膠片，再以考馬斯亮藍R250染色，最後再進行褪染步驟，直至肉眼觀察到電泳凝膠片中、負對照組中藍紫色背景出現透明條帶為止；將退染完成的電泳凝膠片浸泡於去離子水中10分鐘，最後以透明玻璃紙封片固定。其中，本實驗所使用的金屬基質蛋白酶(MMPs)，為3T3老鼠胚胎纖維母細胞之細胞株(細胞編號為BCRC60071)分泌所獲得。

請參見第八圖，於水對照組(負對照組)中，可以觀察到透明條帶，表示水對照組中的MMPs活性並沒有被抑制；而添加AWPP的組別，尤其是添加濃度高於100μg/mL的組別中，並沒有觀察到透明條帶，表示這些添加AWPP的組別中，MMPs的活性都被抑制了，且於添加250μg/mL AWPP的組別，幾乎能完全抑制MMPs的活性。

綜上所述，本發明提供了一種含有高量的總酚與總類黃酮、可有效清除自由基、減緩發炎、抑制玻尿酸酶與基質金屬蛋白酶功效的釋迦果皮萃取物，因此釋迦果皮萃取物可應用於製備抗老化的組成物。

本發明之釋迦果皮萃取物及其於製備抗老化組成物的用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims

一種釋迦(Annona squamosa L.)果皮萃取物於製備抑制基質金屬蛋白酶、玻尿酸酶、脂氧合酶活性、一氧化氮生成組成物的用途，其中該釋迦果皮萃取物是將一釋迦果皮材料，以水為萃取溶劑，於壓力1.02atm、溫度121℃之作用條件萃取後所獲得，該釋迦果皮萃取物用於抑制基質金屬蛋白酶、以及脂氧合酶活性、一氧化氮生成之功效的作用濃度介於100~250μg/mL，用於抑制玻尿酸酶活性之功效的作用濃度為2000μg/mL。
如請求項1所述之用途，其中該釋迦果皮萃取物包含150~200mg沒食子酸/克-萃取物之總類黃酮以及50~100mg兒茶素/克-萃取物。
如請求項1所述之用途，其中該釋迦果皮萃取物係保護DNA不受到自由基傷害。