TW202031655A - 對抗b型肝炎病毒(hbv)之新穎6,7-二氫-4h-吡唑并[4,3-c]吡啶脲活性劑 - Google Patents

對抗b型肝炎病毒(hbv)之新穎6,7-二氫-4h-吡唑并[4,3-c]吡啶脲活性劑 Download PDF

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Abstract

本發明大體上係關於新穎抗病毒劑。具體而言，本發明係關於可抑制由B型肝炎病毒(HBV)編碼之一或多種蛋白質或干擾HBV複製週期之功能之化合物、包含該等化合物之組合物、用於抑制HBV病毒複製之方法、用於治療或預防HBV感染之方法，以及用於製造該等化合物之製程及中間物。

Description

對抗B型肝炎病毒(HBV)之新穎6,7-二氫-4H-吡唑并[4,3-C]吡啶脲活性劑
本發明大體上係關於新穎抗病毒劑。具體而言，本發明係關於可抑制由B型肝炎病毒(HBV)編碼之一或多種蛋白質或干擾HBV複製週期之功能之化合物、包含該等化合物之組合物、用於抑制HBV病毒複製之方法、用於治療或預防HBV感染之方法，以及用於製造該等化合物之製程。
慢性HBV感染為重大的全球健康問題，影響超過5%的世界人口(全世界超過3.5億人，且美國125萬名個體)。由於在大部分發展中世界中之次佳治療選項及新型感染之持續速率，不管預防性HBV疫苗之可用性如何，慢性HBV感染之負荷仍為顯著未滿足之世界性醫學問題。當前治療不提供治癒且僅限於兩類藥劑(干擾素α及核苷類似物/病毒聚合酶之抑制劑)；耐藥性、低功效及耐受性問題限制其影響。
HBV之低治癒率至少部分地歸因於以下事實：難以用單一抗病毒劑實現病毒產生之完全抑制，且歸因於共價閉合環狀DNA (cccDNA)在經感染肝細胞之細胞核中之存在及存留。然而，HBV DNA之持續性遏制減緩肝病進展且有助於預防肝細胞癌(HCC)。
經HBV感染之患者之當前療法目標係針對將血清HBV DNA降至低水平或不可偵測的水平，且最終減少或預防肝硬化及HCC發展。
HBV為嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)科(嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae))之包膜部分雙股DNA (dsDNA)病毒。HBV衣殼蛋白(HBV-CP)在HBV複製中起重要作用。HBV-CP之主要生物功能係充當用衣殼包裹前基因組RNA且形成未成熟衣殼顆粒之結構蛋白，該等顆粒係由細胞質中之衣殼蛋白二聚體之多種複本自發地自裝配。
HBV-CP亦經由其C端磷酸化位點之差別磷酸化狀態調節病毒DNA合成。此外，HBV-CP可能藉助於位於HBV-CP之C端區之富含精胺酸之結構域中的細胞核定位信號來促進病毒鬆環基因組(viral relaxed circular genome)的細胞核易位。
在細胞核中，作為病毒cccDNA微型染色體之組分，HBV-CP可在cccDNA微型染色體之功能性中起結構性及調整性作用。HBV-CP亦與內質網(ER)中之病毒大型包膜蛋白相互作用，且觸發完整病毒顆粒自肝細胞中之釋放。
已報導HBV-CP相關之抗HBV化合物。舉例而言，苯基丙烯醯胺衍生物，包括名為AT-61及AT-130之化合物(Feld J.等人 Antiviral Res. 2007, 76, 168)，及一類來自Valeant之噻唑啶-4-酮(W02006/033995)，已顯示可抑制前基因組RNA (pgRNA)封裝。
F. Hoffmann-La Roche AG已揭示用於HBV療法之一系列3取代之四氫-吡唑并[1,5-a]吡嗪(WO2016/113273、WO2017/198744、WO2018/011162、WO2018/011160、WO2018/011163)。
雜芳基二氫嘧啶(HAP)係發現於基於組織培養之篩選中(Weber等人, Antiviral Res. 2002, 54, 69)。此等HAP類似物充當合成異位活化劑且能夠誘導引起HBV-CP降解之異常衣殼形成(WO 99/54326、WO 00/58302、WO 01/45712、WO 01/6840)。亦已描述另外的HAP類似物(J. Med. Chem. 2016, 59 (16), 7651-7666)。
來自F. Hoffman-La Roche之HAP子類別亦展示抗HBV之活性(WO2014/184328、WO2015/132276及WO2016/146598)。來自Sunshine Lake Pharma之類似子類別亦展示抗HBV之活性(WO2015/144093)。其他HAP亦展示為具有抗HBV之活性(WO2013/102655，Bioorg. Med. Chem. 2017, 25(3) 第1042-1056頁)，且來自Enanta Therapeutics之類似子類別展示類似活性(WO2017/011552)。來自MedshineDiscovery之另一子類別展示類似活性(WO2017/076286)。另一子類別(Janssen Pharma)展示類似活性(WO2013/102655)。
子類別之噠嗪酮及三嗪酮(F. Hoffman-La Roche)亦展示抗HBV之活性(WO2016/023877)，子類別之四氫吡啶并吡啶亦如此(WO2016/177655)。來自Roche的子類別之三環4-吡啶酮-3-甲酸衍生物亦展示類似抗HBV活性(WO2017/013046)。
來自Novira Therapeutics (現為Johnson & Johnson Inc.之一部分)之子類別之胺磺醯基-芳基醯胺亦展示抗HBV之活性(W02013/006394、W02013/096744、WO2014/165128、W02014/184365、WO2015/109130、WO2016/089990、WO2016/109684、WO2016/109689、WO2017/059059)。
類似子類別之硫醚-芳基醯胺(亦來自Novira Therapeutics)展示抗HBV之活性(WO2016/089990)。另外，子類別之芳基-氮雜環庚烷(亦來自Novira Therapeutics)展示抗HBV之活性(WO2015/073774)。來自Enanta Therapeutics之類似子類別之芳基醯胺展示抗HBV之活性(WO2017/015451)。
來自Janssen Pharma之胺磺醯基衍生物亦已展示具有抗HBV之活性(WO2014/033167、WO2014/033170、WO2017001655，J. Med. Chem, 2018, 61(14) 6247-6260)。
亦來自Janssen Pharma的子類別之乙二醛胺取代之吡咯醯胺衍生物亦已展示具有抗HBV之活性(WO2015/011281)。來自Gilead Sciences之類似類別之乙醛醯胺亦具有抗HBV活性(WO2018/039531)。
來自Enanta Therapeutics的子類別之胺磺醯基-雜聯芳基化合物及草醯基-雜聯芳基化合物亦展示抗HBV之活性(WO2016/161268、WO2016/183266、WO2017/015451、WO2017/136403及US20170253609)。
來自Assembly Biosciences的子類別之苯胺-嘧啶亦展示抗HBV之活性(WO2015/057945、WO2015/172128)。來自Assembly Biosciences的子類別之稠合三環化合物(二苯并-噻氮呯酮、二苯并-二氮呯酮、二苯并-噁氮呯酮)展示抗HBV之活性(WO2015/138895、WO2017/048950)。
一系列環狀磺醯胺已由Assembly Biosciences描述為HBV-CP功能之調節劑(WO2018/160878)。
Arbutus Biopharma已揭示用於HBV療法之一系列苯甲醯胺(WO2018/052967、WO2018/172852)。
亦顯示小分子bis-ANS充當分子「楔」且干擾正常衣殼-蛋白質幾何形狀及衣殼形成(Zlotnick A等人 J. Virol. 2002, 4848)。
特別相關的為WO2016/109663，其揭示密切相關之化合物(Novira Therapeutics)。
HBV直接作用抗病毒劑可能遭遇之問題為毒性、突變誘發性、選擇性缺乏、不良功效、不良生物可用性、低溶解度及合成困難。因此，需要用於治療、改善或預防HBV之額外的抑制劑，其可克服此等缺點中之至少一者或具有諸如增加之效力或增加之安全窗口的額外優點。
以單一療法或與其他HBV治療或輔助治療組合向HBV感染患者投與該等治療劑將導致病毒負荷顯著降低、預後改良、疾病進程減弱及/或血清轉化率增強。
本文提供適用於治療或預防有需要之個體之HBV感染的化合物及適用於其製備的中間物。本發明之主題為式I化合物：
Figure 02_image003
其中 -   R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N -   R2為H或甲基 -   R3為H或C1-C4烷基，其中C1-C4烷基視情況經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次 -   R4選自包含以下之群：C1-C2烷基(限制條件為R4連接至R3)、C1-C2烷基-O-C1-C4烷基、C1-C2羥烷基、C1-C2烷基-O-C1-C4鹵烷基、C1-C2烷基-O-C3-C6環烷基、C1-C2烷基-S-C1-C4烷基、C1-C2烷基-SO2 -C1-C4烷基、C1-C2烷基-C≡N、C1-C2烷基-C3-C7雜環烷基、C1-C2烷基-O-C(=O)(C3-C7-環烷基)NH2 、C1-C2烷基-O-C(=O)(C1-C13烷基)NH2 、C3-C7雜環烷基、芳基及雜芳基，其中C3-C7雜環烷基、芳基或雜芳基視情況經鹵素、NH2 或C1-C6烷基取代一次、兩次或三次 -   R3及R4視情況連接以形成五員、六員或七員雜環烷基環，該雜環烷基環未經取代或經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、羧基、OH、C1-C4烷氧基、OCF3 、OCHF2 或C≡N -   X為O、CH2 或NR11 -   m為0、1或2 -   R11為H或C1-C4烷基。
在本發明之一個實施例中，本發明之主題為式I化合物，其中R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N。
在本發明之一個實施例中，本發明之主題為式I化合物，其中R2為H或甲基。
在本發明之一個實施例中，本發明之主題為式I化合物，其中R3為H或C1-C4烷基，其中C1-C4烷基視情況經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次。
在本發明之一個實施例中，本發明之主題為式I化合物，其中R4選自包含以下之群：C1-C2烷基(限制條件為R4連接至R3)、C1-C2烷基-O-C1-C4烷基、C1-C2羥烷基、C1-C2烷基-O-C1-C4鹵烷基、C1-C2烷基-O-C3-C6環烷基、C1-C2烷基-S-C1-C4烷基、C1-C2烷基-SO2 -C1-C4烷基、C1-C2烷基-C≡N、C1-C2烷基-C3-C7雜環烷基、C1-C2烷基-O-C(=O)(C3-C7-環烷基)NH2 、C1-C2烷基-O-C(=O)(C1-C13烷基)NH2 、C3-C7雜環烷基、芳基及雜芳基，其中C3-C7雜環烷基、芳基或雜芳基視情況經鹵素、NH2 或C1-C6烷基取代一次、兩次或三次。
在本發明之一個實施例中，本發明之主題為式I化合物，其中R3及R4視情況連接以形成五員、六員或七員雜環烷基環，該雜環烷基環未經取代或經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、羧基、OH、C1-C4烷氧基、OCF3 、OCHF2 或C≡N。
在本發明之一個實施例中，本發明之主題為式I化合物，其中X為O、CH2 或NR11。
在本發明之一個實施例中，本發明之主題為式I化合物，其中m為0、1或2。
在本發明之一個實施例中，本發明之主題為式I化合物，其中R11為H或C1-C4烷基。
本發明之一個實施例為本發明之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療個體之HBV感染。
本發明之一個實施例為一種醫藥組合物，其包含本發明之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之一個實施例為一種治療有需要之個體的HBV感染之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之另一實施例為本發明之式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療有需要之個體的HBV感染。
Figure 02_image005
其中 -   R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N -   R2為H或甲基 -   R3為C1-C4烷基，該C1-C4烷基未經取代或經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次。 -   R5為H、甲基、乙基、異丙基、環丙基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、2,2-二氟乙基或1,1,1-三氘甲基。
在一個實施例中，本發明之主題為式II化合物，其中R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N。
在一個實施例中，本發明之主題為式II化合物，其中R2為H或甲基。
在一個實施例中，本發明之主題為式II化合物，其中R3為C1-C4烷基，該C1-C4烷基未經取代或經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次。
在一個實施例中，本發明之主題為式II化合物，其中R5為H、甲基、乙基、異丙基、環丙基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、2,2-二氟乙基或1,1,1-三氘甲基。
本發明之一個實施例為本發明之式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療個體之HBV感染。
本發明之一個實施例為一種醫藥組合物，其包含本發明之式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之一個實施例為一種治療有需要之個體的HBV感染之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之另一實施例為本發明之式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療有需要之個體的HBV感染。
Figure 02_image007
其中 -   R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N -   R2為H或甲基 -   R3為C1-C4烷基；該C1-C4烷基未經取代或經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次 -   R6為C3-C7雜環烷基、芳基或雜芳基，其視情況經鹵素、NH2 或C1-C4烷基取代一次、兩次或三次。
在一個實施例中，本發明之主題為式III化合物，其中R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N。
在一個實施例中，本發明之主題為式III化合物，其中R2為H或甲基。
在一個實施例中，本發明之主題為式III化合物，其中R3為C1-C4烷基，該C1-C4烷基未經取代或經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次。
在一個實施例中，本發明之主題為式III化合物，其中R6為C3-C7雜環烷基、芳基或雜芳基，其視情況經鹵素、NH2 或C1-C4烷基取代一次、兩次或三次。
本發明之一個實施例為本發明之式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療個體的HBV感染。
本發明之一個實施例為一種醫藥組合物，其包含本發明之式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之一個實施例為一種治療有需要之個體的HBV感染之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之式III化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之另一實施例為本發明之式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療有需要之個體的HBV感染
Figure 02_image009
其中 -   R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N -   R2為H或甲基 -   n為1、2或3 -   R7、R8、R12及R13係各自獨立地選自包含以下之群：H、鹵素、OH、C1-C4烷氧基、OCHF2 、OCF3 及C≡N。
在一個實施例中，本發明之主題為式IV化合物，其中R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N。
在一個實施例中，本發明之主題為式IV化合物，其中R2為H或甲基。
在一個實施例中，本發明之主題為式IV化合物，其中R7、R8、R12及R13係獨立地選自H、鹵素、OH、C1-C4烷氧基、OCHF2 、OCF3 及C≡N。
在一個實施例中，本發明之主題為式IV化合物，其中n為1、2或3。
本發明之一個實施例為本發明之式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療個體的HBV感染。
本發明之一個實施例為一種醫藥組合物，其包含本發明之式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之一個實施例為一種治療有需要之個體的HBV感染之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之式IV化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之另一實施例為本發明之式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療有需要之個體的HBV感染
Figure 02_image011
其中 -   R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N -   R2為H或甲基 -   R3為C1-C4烷基，該C1-C4烷基未經取代或經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次 -   R9及R10係各自獨立地選自H及C1-C6烷基 -   R9及R10視情況連接以形成C3-C7環烷基環。
在一個實施例中，本發明之主題為式V化合物，其中R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N。
在一個實施例中，本發明之主題為式V化合物，其中R2為H或甲基。
在一個實施例中，本發明之主題為式V化合物，其中R3為C1-C4烷基，該C1-C4烷基未經取代或經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次。
在一個實施例中，本發明之主題為式V化合物，其中R9及R10係獨立地選自H及C1-C6烷基。
在一個實施例中，本發明之主題為式V化合物，其中R9及R10視情況連接以形成C3-C7環烷基環。
本發明之一個實施例為本發明之式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療有需要之個體的HBV感染。
本發明之一個實施例為一種醫藥組合物，其包含本發明之式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之一個實施例為一種治療有需要之個體的HBV感染之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之式V化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，本發明化合物之劑量為約1 mg至約2,500 mg。在一些實施例中，用於本文所描述之組合物中之本發明化合物之劑量小於約10,000 mg，或小於約8,000 mg，或小於約6,000 mg，或小於約5,000 mg，或小於約3,000 mg，或小於約2,000 mg，或小於約1,000 mg，或小於約500 mg，或小於約200 mg，或小於約50 mg。類似地，在一些實施例中，如本文所描述之第二化合物(亦即，用於HBV治療之另一藥物)之劑量小於約1,000 mg，或小於約800 mg，或小於約600 mg，或小於約500 mg，或小於約400 mg，或小於約300 mg，或小於約200 mg，或小於約100 mg，或小於約50 mg，或小於約40 mg，或小於約30 mg，或小於約25 mg，或小於約20 mg，或小於約15 mg，或小於約10 mg，或小於約5 mg，或小於約2 mg，或小於約1 mg，或小於約0.5 mg，且為其任何及所有整體或部分增量。所有之前所提及之劑量係指每位患者之日劑量。
一般而言，預期抗病毒有效每日量將為每公斤體重約0.01至約50 mg或約0.01至約30 mg。在一天內以適當時間間隔以兩次、三次、四次或更多次亞劑量形式投與所需劑量可為適當的。該等亞劑量可調配為單位劑型，例如含有每單位劑型約1至約500 mg、或約1至約300 mg、或約1至約100 mg、或約2至約50 mg活性成分。
本發明化合物可視其結構而定以鹽、溶劑合物或水合物之形式存在。因此本發明亦涵蓋鹽、溶劑合物或水合物及其各別混合物。
本發明化合物可視其結構而定以互變異構或立體異構形式(對映異構體、非對映異構體)存在。因此，本發明亦涵蓋互變異構體、對映異構體或非對映異構體及其各別混合物。立體異構均一組分可以已知方式自對映異構體及/或非對映異構體之此類混合物分離。
定義
下文列舉用於描述本發明之各種術語之定義。此等定義適用於術語，因為其單獨地或作為較大群組的一部分而用於整個本說明書及申請專利範圍中，除非在特定情況下以其他方式加以限制。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語一般具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。一般而言，本文所使用之命名法及細胞培養、分子遺傳學、有機化學及肽化學中之實驗室程序為此項技術中眾所周知且通常採用之彼等者。
如本文所用，冠詞「一(a/an)」係指該冠詞之一個或多於一個(亦即至少一個)文法對象。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或多於一個要素。此外，術語「包括(including)」以及諸如「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(included)」之其他形式之使用不具限制性。
如本文所使用之術語「衣殼裝配調節劑」係指破壞、或加速、或抑制、或阻礙、或延遲、或減少、或修改正常衣殼裝配(例如在成熟期間)或正常衣殼拆卸(例如在感染力期間)或擾動衣殼穩定性，由此誘導異常衣殼形態或異常衣殼功能。在一個實施例中，衣殼裝配調節劑加速衣殼裝配或拆卸，因而誘導異常衣殼形態。在另一實施例中，衣殼裝配調節劑與主要衣殼裝配蛋白(HBV-CP)相互作用(例如在活性位點處結合，在異位位點處結合，或修改及/或阻礙摺疊及其類似者)，因而破壞衣殼裝配或拆卸。在又另一實施例中，衣殼裝配調節劑引起HBV-CP之結構或功能(例如減弱病毒感染力及/或對病毒具有致死性的HBV-CP裝配、拆卸、結合至受質、摺疊成適合構形之能力或其類似者)之擾動。
如本文所用，術語「治療(treatment/treating)」經定義為向患者施加或投與治療劑，亦即本發明化合物(單獨或與另一醫藥劑組合)；或向來自具有HBV感染、HBV感染之症狀或產生HBV感染之可能性之患者的經分離組織或細胞株施加或投與治療劑(例如用於診斷或離體施加)，目的為治癒、癒合、減輕、緩解、改變、醫治、改善、改良或影響HBV感染、HBV感染之症狀或產生HBV感染之可能性。該等治療可基於獲自藥物基因組學領域之知識而經特定調整或修改。
如本文所用，術語「預防(prevent/prevention)」意謂在無病症或疾病出現之情況下無病症或疾病發展，或在已存在病症或疾病發展之情況下無進一步病症或疾病發展。亦考慮吾人預防與病症或疾病相關之一些或所有症狀之能力。
如本文所用，術語「患者」、「個體(individual)」或「個體(subject)」係指人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括例如家畜及寵物，諸如綿羊科動物、牛科動物、豬科動物、貓科動物及鼠類哺乳動物。患者、個體(subject或individual)較佳為人類。
如本文所用，術語「有效量」、「醫藥學上有效量」及「治療有效量」係指藥劑提供所需生物結果之無毒性但充足之量。彼結果可為疾病之徵兆、症狀或病因之減少及/或減輕或生物系統之任何其他所需改變。在任何個別情況下之適當治療量可由一般熟習此項技術者使用常規實驗來確定。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係指諸如載劑或稀釋劑之材料不消除化合物之生物活性或特性且相對無毒，亦即材料可在不產生非所需生物效應或以有害方式與含有其之組合物之組分中之任一者相互作用的情況下向個體投與。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示化合物之衍生物，其中母化合物藉由將現存酸或鹼部分轉化為其鹽形式而受到修飾。醫藥學上可接受之鹽的實例包括但不限於諸如胺之鹼性殘基之礦物酸鹽或有機酸鹽；諸如羧酸之酸性殘基之鹼金屬鹽或有機鹽；及其類似鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽包括例如由無毒無機酸或有機酸形成之母化合物的習知無毒鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法自含有鹼性或酸性部分之母化合物合成。一般而言，該等鹽可藉由使此等化合物之游離酸或鹼形式與化學計量之適當鹼或酸在水中或在有機溶劑中或在二者之混合物中反應來製備；一般而言，非水性介質如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈為較佳的。適合鹽之清單見於Remington's Pharmaceutical Sciences 第17版 Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985 第1418頁及Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
如本文所用，術語「組合物」或「醫藥組合物」係指在本發明內有用之至少一種化合物與醫藥學上可接受之載劑之混合物。醫藥組合物有助於向患者或個體投與化合物。存在於此項技術中之投與化合物之多種技術包括但不限於靜脈內、經口、霧劑、經直腸、非經腸、經眼、經肺及局部投與。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」意謂參與在患者體內攜載或輸送在本發明內有用之化合物或將其攜載或輸送至患者以使其可執行其預期功能的醫藥學上可接受之材料、組合物或載劑，諸如液體或固體填充劑、穩定劑、分散劑、懸浮劑、稀釋劑、賦形劑、增稠劑、溶劑或囊封材料。通常，該等構築體係自身體之一個器官或部分攜載或輸送至身體之另一器官或部分。各載劑必須在與包括在本發明內有用且對患者無害之化合物之調配物的其他成分相容之意義上「可接受」。可充當醫藥學上可接受之載劑之材料的一些實例包括：糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及醋酸纖維素；粉末黃蓍膠；麥芽、明膠、滑石；賦形劑，諸如可可豆油及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如丙三醇、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；表面活性劑；褐藻酸；無熱原質水；等張生理食鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液及醫藥調配物中所採用的其他無毒相容物質。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」亦包括與在本發明內有用之化合物之活性相容且患者生理學上可接受的任何及所有包衣、抗細菌劑及抗真菌劑及吸收延遲劑及其類似物。亦可將補充活性化合物併入組合物中。「醫藥學上可接受之載劑」可進一步包括在本發明內有用之化合物之醫藥學上可接受之鹽。可包括於用於本發明之實施中之醫藥組合物中的其他額外成分為此項技術中已知的且描述於例如以引用的方式併入本文中之Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro編, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985)中。
如本文所用，術語「經取代」意謂一原子或一組原子已置換氫作為連接至另一基團之取代基。
如本文所用，術語「包含」亦涵蓋選項「由……組成」。
除非另外規定，否則如本文所用的單獨或作為另一取代基之一部分的術語「烷基」意謂具有指定碳原子數之直鏈或分支鏈烴(亦即C1-C6烷基意謂一至六個碳原子)且包括直鏈及分支鏈。實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、戊基、新戊基及己基。另外，單獨或作為另一取代基之部分的術語「烷基」亦可意謂經C3-C5碳環取代之C1-C3直鏈烴。實例包括(環丙基)甲基、(環丁基)甲基及(環戊基)甲基。為避免疑問，在兩個烷基部分存在於一基團中之情況下，烷基部分可為相同或不同的。
如本文所用，術語「烯基」指示衍生自含有至少兩個碳原子及具有E或Z立體化學之至少一個碳-碳雙鍵之烴部分之單價基團。雙鍵可為或可不為與另一基團的連接點。烯基(例如C2-C8烯基)包括(但不限於)例如乙烯基、丙烯基、丙-1-烯-2-基、丁烯基、甲基-2-丁烯-1-基、庚烯基及辛烯基。為避免疑問，在兩個烯基部分存在於一基團中之情況下，烷基部分可為相同或不同的。
如本文所用，C2-C6炔基或部分為含有2至6個碳原子之直鏈或分支鏈炔基或部分，例如含有2至4個碳原子之C2-C4炔基或部分。例示性炔基包括-C≡CH或-CH2 -C≡C以及1-丁炔基及2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基及5-己炔基。為避免疑問，在兩個炔基部分存在於一基團中之情況下，其可為相同或不同的。
除非另外規定，否則如本文所用，單獨或作為另一取代基之一部分的術語「鹵基」或「鹵素」意謂氟、氯、溴或碘原子，較佳為氟、氯或溴，更佳為氟或氯。為避免疑問，在兩個鹵基部分存在於一基團中之情況下，其可為相同或不同的。
如本文所用，C1-C6烷氧基或C2-C6烯基氧基通常分別為連接至氧原子之該C1-C6烷基(例如C1-C4烷基)或該C2-C6烯基(例如C2-4烯基)。
除非另外規定，否則如本文所用之單獨或與其他術語組合採用之術語「芳基」意謂含有一或多個環(通常一個、兩個或三個環)之碳環芳族系統，其中該等環可以側接方式連接在一起，諸如聯苯基；或可稠合，諸如萘。芳基之實例包括苯基、蒽基及萘基。較佳實例為苯基(例如C6芳基)及聯苯基(例如C12芳基)。在一些實施例中，芳基具有六個至十六個碳原子。在一些實施例中，芳基具有六個至十二個碳原子(例如C6-C12芳基)。在一些實施例中，芳基具有六個碳原子(例如C6芳基)。
如本文所用，術語「雜芳基」及「雜芳族」係指含有一或多個環(通常一個、兩個或三個環)之具有芳族特徵之雜環。雜芳基取代基可由碳原子數目定義，例如，Cl-C9雜芳基指示雜芳基中所含有的碳原子數目，而不包括雜原子數目。舉例而言，Cl-C9雜芳基將包括額外一個至四個雜原子。多環雜芳基可包括一或多個部分飽和之環。雜芳基之非限制性實例包括：
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。
雜芳基之額外非限制性實例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基(包括例如2-嘧啶基及4-嘧啶基)、噠嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(包括例如2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基(包括例如3-吡唑基及5-吡唑基)、異噻唑基、1,2,3-三唑基、l,2,4-三唑基、1,3,4-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基，1,3,4-噻二唑基及1,3,4-噁二唑基。多環雜環及雜芳基之非限制性實例包括吲哚基(包括3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基及7-吲哚基)、吲哚啉基、喹啉基、四氫喹啉基、異喹啉基(包括例如1-異喹啉基及5-異喹啉基)、1,2,3,4-四氫異喹啉基、㖕啉基、喹喏啉基(包括例如2-喹喏啉基及5-喹喏啉基)、喹唑啉基、酞嗪基、1,8-㖠啶基、1,4-苯并二噁烷基、香豆素、二氫香豆素、1,5-㖠啶基、苯并呋喃基(包括例如3-苯并呋喃基、4-苯并呋喃基、5-苯并呋喃基、6-苯并呋喃基及7-苯并呋喃基)、2,3-二氫苯并呋喃基、1,2-苯并異噁唑基、苯并噻吩基(包括例如3-苯并噻吩基、4-苯并噻吩基、5-苯并噻吩基、6-苯并噻吩基及7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(包括例如2-苯并噻唑基及5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基(包括例如2-苯并咪唑基)、苯并三唑基、硫代黃嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯聯啶基及喹嗪基。
如本文所用，術語「鹵烷基」通常分別為其中任一或多個碳原子經一或多個如上所定義之該鹵基原子取代的該烷基、烯基、烷氧基或烯氧基。鹵烷基包含單鹵烷基、二鹵烷基及全鹵烷基。術語「鹵烷基」包括但不限於氟甲基、1-氟乙基、二氟甲基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、二氟甲氧基及三氟甲氧基。
如本文所用，C1-C6羥烷基為經一或多個羥基取代之該C1-C6烷基。其通常經一個、兩個或三個羥基取代。其較佳經單個羥基取代。
如本文所用，C1-C6胺基烷基為經一或多個胺基取代之該C1-C6烷基。其通常經一個、兩個或三個胺基取代。其較佳經單個胺基取代。
如本文所用，C1-C4羧基烷基為經羧基取代之該C1-C4烷基。
如本文所用，C1-C4甲醯胺基烷基為被經取代或未經取代之甲醯胺基取代之該C1-C4烷基。
如本文所用，C1-C4醯基磺醯胺基-烷基為經通式C(=O)NHSO2 CH3 或C(=O)NHSO2 -c-Pr之醯基磺醯胺基取代的該C1-C4烷基。
如本文所用，術語「環烷基」係指單環或多環非芳族基，其中形成環之原子(亦即骨架原子)中之每一者為碳原子。在一個實施例中，環烷基為飽和或部分不飽和的。在另一實施例中，環烷基與芳環稠合。環烷基包括具有3至10個環原子之基團(C3-C10環烷基)、具有3至8個環原子之基團(C3-C8環烷基)、具有3至7個環原子之基團(C3-C7環烷基)及具有3至6個環原子之基團(C3-C6環烷基)。環烷基之說明性實例包括(但不限於)以下部分：
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單環環烷基包括(但不限於)環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。雙環環烷基包括(但不限於)四氫萘基、二氫茚基及四氫并環戊二烯。多環環烷基包括金剛烷及降冰片烷。術語環烷基包括「不飽和非芳族碳環基」或「非芳族不飽和碳環基」，二者均係指如本文所定義之含有至少一個碳-碳雙鍵或一個碳-碳參鍵之非芳族碳環。
如本文所用，術語「雜環烷基」及「雜環基」係指含有一或多個環(通常一個、兩個或三個環)之雜脂環基，其含有一至四個各自選自氧、硫及氮之環雜原子。在一個實施例中，各雜環基於其環系統中具有3至10個原子，其限制條件為該基團之環不含有兩個鄰接氧或硫原子。在一個實施例中，各雜環基具有於環系統中有3至10個原子之稠合雙環系統，此外其限制條件為該基團之環不含有兩個鄰接氧或硫原子。在一個實施例中，各雜環基具有於環系統中有3至10個原子之橋接雙環系統，此外其限制條件為該基團之環不含有兩個鄰接氧或硫原子。在一個實施例中，各雜環基具有於環系統中有3至10個原子之螺雙環系統，此外其限制條件為該基團之環不含有兩個鄰接氧或硫原子。雜環基取代基可替代地由碳原子數定義，例如C2-C8雜環基指示雜環基中所含之碳原子數而不包括雜原子數。舉例而言，C2-C8雜環基將包括額外一至四個雜原子。在另一實施例中，雜環烷基與芳環稠合。在另一實施例中，雜環烷基與雜芳基環稠合。在一個實施例中，氮及硫雜原子可視情況經氧化，且氮原子可視情況經四級銨化。除非另外規定，否則雜環系統可在提供穩定結構之任何雜原子或碳原子處連接。3員雜環基之實例包括且不限於氮丙啶。4員雜環烷基之實例包括且不限於氮雜環丁烷及β-內醯胺。5員雜環基之實例包括且不限於吡咯啶、噁唑啶及噻唑啶二酮。6員雜環烷基之實例包括且不限於哌啶、嗎啉、哌嗪、N-乙醯基哌嗪及N-乙醯基嗎啉。雜環基之其他非限制性實例為
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雜環之實例包括單環基團，諸如氮丙啶、環氧乙烷、環硫乙烷、氮雜環丁烷、氧雜環丁烷、硫雜環丁烷、吡咯啶、吡咯啉、吡唑啶、咪唑啉、二氧雜環戊烷、環丁碸、2,3-二氫呋喃、2,5-二氫呋喃、四氫呋喃、噻吩烷、哌啶、1,2,3,6-四氫吡啶、1,4-二氫吡啶、哌嗪、嗎啉、硫代嗎啉、哌喃、2,3-二氫哌喃、四氫哌喃、1,4-二噁烷、1,3-二噁烷、1,3-二氧雜環戊烷、高哌嗪、高哌啶、1,3-二氧雜環庚烷、4,7-二氫-l,3-二氧呯及六甲環氧己烷。
如本文所用，術語「芳族」係指具有一或多個多不飽和環且具有芳族特徵(亦即具有其中n為整數之(4n + 2)個非定域π(pi)電子)的碳環或雜環。
除非另外規定，否則如本文所用的單獨或與其他術語組合採用之術語「醯基」意欲意謂經由羰基連接之烷基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基。
除非另外規定，否則如本文所用的單獨或與其他術語組合採用之術語「胺甲醯基」及「經取代之胺甲醯基」意欲意謂連接至胺基之羰基，其視情況經以下單取代或二取代：氫、烷基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基。在一些實施例中，氮取代基將連接以形成如上文所定義之雜環。
除非另外規定，否則如本文所用，單獨或作為另一取代基之一部分之術語「羧基」意謂式C(=O)OH之基團。
除非另外規定，否則如本文所用，單獨或作為另一取代基之一部分之術語「羧酯」意謂式C(=O)OX之基團，其中X選自由以下組成之群：C1-C6烷基、C3-C7環烷基及芳基。
如本文所用，術語「前藥」表示式I或式II或式III或式IV或式V之化合物之衍生物，該衍生物係以一旦投與則在活體內代謝成同樣式I或式II或式III或式IV或式V之活性代謝物之形式投與。
前藥之各種形式為此項技術中所已知。對於該等前藥之實例，參見：Design of Prodrugs，由H. Bundgaard編輯，(Elsevier，1985)及Methods in Enzymology，第42卷, 第309-396頁，由K. Widder等人編輯(Academic Press，1985)；A Textbook of Drug Design and Development，由Krogsgaard-Larsen及H. Bundgaard編輯，第5章，H. Bundgaard之「Design and Application of Prodrugs」第1l3-191頁(1991)；H. Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews 8, 1-38 (1992)；H. Bundgaard,等人, Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988)；及N. Kakeya,等人, Chem. Pharm. Bull., 32, 692 (1984)。
前藥之實例包括式I或式II或式III或式IV或式V之化合物之可裂解酯。
含有羧基之本發明化合物之活體內可裂解酯為例如在人類或動物身體中裂解以產生母酸之醫藥學上可接受之酯。用於羧基之合適的醫藥學上可接受之酯包括C1-C6烷基酯，例如甲酯或乙酯；C1-C6烷氧基甲酯，例如甲氧基甲酯；C1-C6醯氧基甲酯；酞酯；C3-C8環烷氧基羰氧基C1-C6烷酯，例如1-環己基羰氧基乙基；1-3-二氧雜環戊烷-2-基甲酯，例如5-甲基-1,3-二氧雜環戊烷-2-基甲基；C1-C6烷氧基羰氧基乙酯，例如1-甲氧基羰氧基乙基；胺基羰基甲酯及其單或二-N-(C1-C6烷基)型式，例如N,N-二甲基胺基羰基甲酯及N-乙基胺基羰基甲酯；且可在本發明化合物中之任何羧基處形成。
含有羥基之本發明化合物之活體內可裂解酯為例如在人類或動物身體中裂解以產生母羥基之醫藥學上可接受之酯。用於羥基之合適的醫藥學上可接受之酯包括C1-C6醯基酯，例如乙醯酯；及苯甲醯酯，其中苯基可經胺基甲基或N取代之單或二-C1-C6烷基胺基甲基取代，例如4-胺基甲基苯甲醯酯及4-N,N-二甲基胺基甲基苯甲醯酯。
本發明之較佳前藥包括乙醯氧基及碳酸酯衍生物。舉例而言，式I或式II或式III或式IV或式V之化合物之羥基可以-O-CORi 或-O-C(O)ORi 形式存在於前藥中，其中Ri 為未經取代或經取代之Cl-C4烷基。烷基上之取代基係如前文所定義。較佳地，Ri 中之烷基為未經取代的，較佳甲基、乙基、異丙基或環丙基。
本發明之其他較佳前藥包括胺基酸衍生物。合適的胺基酸包括經由其C(O)OH基團連接至式I或式II或式III或式IV或式V化合物的α-胺基酸。該等前藥在活體內裂解以產生攜帶羥基之式I或式II或式III或式IV或式V化合物。因此，該等胺基酸基團為式I或式II或式III或式IV或式V之較佳採用位置，在該等位置中羥基為最終所需的。因此，本發明之此實施例之例示性前藥為攜帶式-OC(O)-CH(NH2 )Rii 基團之式I或式II或式III或式IV或式V化合物，其中Rii 為胺基酸側鏈。較佳胺基酸包括甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸及絲胺酸。胺基酸亦可官能化，例如胺基可烷基化。合適的官能化胺基酸為N,N-二甲基甘胺酸。胺基酸較佳為纈胺酸。
本發明之其他較佳前藥包括胺基磷酸酯衍生物。胺基磷酸酯前藥之各種形式為此項技術中已知的。對於該等前藥之實例，參見Serpi等人, Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2013, 第15章, 第15.5單元及Mehellou等人, ChemMedChem, 2009年4月，第1779-1791頁。合適的胺基磷酸酯包括經由其-OH基團連接至式I化合物之(苯氧基)-α-胺基酸。該等前藥在活體內裂解以產生攜帶羥基之式I或式II或式III或式IV或式V化合物。因此，該等胺基磷酸酯基團為式I之較佳採用位置，在該等位置中羥基為最終所需的。因此，本發明之此實施例之例示性前藥為攜帶式-OP(O)(ORiii )Riv 基團之式I或式II或式III或式IV或式V化合物，其中Riii 為烷基、環烷基、芳基或雜芳基，且Riv 為式-NH-CH(Rv )C(O)ORvi 基團，其中Rv 為胺基酸側鏈且Rvi 為烷基、環烷基、芳基或雜環基。較佳胺基酸包括甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸及絲胺酸。胺基酸較佳為丙胺酸。Rv 較佳為烷基，最佳異丙基。
本發明之主題亦為式I或式II或式III或式IV或式V之化合物之前藥，無論呈一般化形式或呈下文所特定提及之形式。
本發明之主題亦為一種製備本發明化合物之方法。因此，本發明之主題為用於製備本發明之式I化合物之方法，其係藉由以下進行：使式VI化合物
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其中R1係上文所定義，與式VII化合物反應
Figure 02_image023
其中R2、R3、R4、X及m係如上文所定義。實例
現參考以下實例描述本發明。僅出於說明之目的提供此等實例，且本發明不限於此等實例，而實際上涵蓋由於本文所提供之教示內容而顯而易見之所有變化形式。
HBV核心蛋白調節劑可以多種方式製備。流程1至3說明出於本申請案之目的用於其製備之主要途徑。對於本領域之普通化學技術人員將顯而易見的係，存在亦達成此等中間物及實例之製備之其他方法。
Figure 02_image025
流程 1 ： 式 I 化合物之合成 在步驟1中，利用文獻(A. El-Faham, F. Albericio, Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602)中已知之方法，例如利用HATU使流程1中所描述之N-保護之吡唑化合物1 (經繪製為但不限於SEM)與胺偶合，得到具有通用結構2之化合物。在步驟2中，例如利用HCl對流程1中之化合物2之兩個氮保護基(繪製為但不限於Boc及SEM)進行去保護(WO2004/014374, A. Isidro-Llobet等人，Chem. Rev., 2009, 109, 2455-2504)，得到具有通用結構3之胺。步驟3中利用文獻(Pearson, A. J.; Roush, W. R.; Handbook of Reagents for Organic Synthesis, Activating Agents and Protecting Groups)中所熟知之方法，例如，利用異氰酸苯酯進行脲形成產生式I化合物。
Figure 02_image027
流程 2 ： 式 I 化合物之合成 在步驟1中利用文獻(Pearson, A. J.; Roush, W. R.; Handbook of Reagents for Organic Synthesis, Activating Agents and Protecting Groups)中熟知之方法，例如，利用異氰酸苯酯將流程2中所描述之化合物1轉化為具有通用結構2之脲。在步驟2中，使用文獻中已知之方法，例如利用LiOH將化合物2 (經繪製為但不限於甲酯)之酯基水解(WO20150133428)，得到具有通用結構3之羧酸。步驟3中利用文獻(A. El-Faham, F. Albericio, Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602)中已知之方法，例如利用HATU進行醯胺偶合產生式I化合物。
Figure 02_image029
流程 3 ： 式 I 化合物之合成 在步驟1中，流程3中所描述之化合物1利用文獻(A. El-Faham, F. Albericio, Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602)中已知之方法，例如利用HATU與胺偶合，得到具有通用結構2之化合物。在步驟2中，例如用HCl對流程1中之化合物2之氮保護基(經繪製為但不限於Boc)進行去保護(WO2016/109663, A. Isidro-Llobet等人，Chem. Rev., 2009, 109, 2455-2504)，得到具有通用結構3之胺。步驟3中利用文獻(Pearson, A. J.; Roush, W. R.; Handbook of Reagents for Organic Synthesis, Activating Agents and Protecting Groups)中所熟知之方法，例如，利用異氰酸苯酯進行脲形成產生式I化合物。
使用以下縮寫： A—DNA核鹼基腺嘌呤 ACN—乙腈 Ar—氬氣 BODIPY-FL—4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a-二氮-s-二環戊二烯并苯-3-丙酸(螢光染料) Boc—第三丁氧基羰基 BnOH—苯甲醇n -BuLi—正丁基鋰t -BuLi—第三丁基鋰 C—DNA核鹼基胞嘧啶 CC50 —半最大細胞毒性濃度 CO2 —二氧化碳 CuCN—氰化銅(I) DCE—二氯乙烷 DCM—二氯甲烷 戴斯-馬丁高碘烷—1,1,1-三乙醯氧基-1,1-二氫-1,2-苯并碘氧雜環戊-3(1H)-酮 DIPEA—二異丙基乙胺 DIPE—二異丙基醚 DMAP—4-二甲基胺基吡啶 DMF— N,N- 二甲基甲醯胺 DMP—戴斯-馬丁高碘烷 DMSO—二甲亞碸 DNA—去氧核糖核酸 DPPA—二苯基磷醯基疊氮化物 DTT—二硫蘇糖醇 EC50 —半最大有效濃度 EDCI—N-(3-二甲胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽 Et2 O—二乙醚 EtOAc—乙酸乙酯 EtOH—乙醇 FL—經螢光素標記之5'端 NEt3 —三乙胺 ELS—蒸發光散射 g—公克 G—DNA核鹼基鳥嘌呤 HBV—B型肝炎病毒 HATU—六氟磷酸2-(1H-7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基
Figure 108139835-A0304-12-01
HCl—鹽酸 HEPES—4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸 HOAt—1-羥基-7-氮雜苯并三唑 HOBt—1-羥基苯并三唑 HPLC—高效液相層析 IC50 —半最大抑制濃度 LC640—用螢光染料LightCycler® Red 640進行之3'端修飾 LC/MS—液相層析/質譜法 LiAlH4 —氫化鋁鋰 LiOH—氫氧化鋰 MeOH—甲醇 MeCN—乙腈 MgSO4 —硫酸鎂 mg—毫克 min—分鐘 mol—莫耳 mmol—毫莫耳 mL—毫升 MTBE—甲基第三丁基醚 N2 —氮氣 Na2 CO3 —碳酸鈉 NaHCO3 —碳酸氫鈉 Na2 SO4 —硫酸鈉 NdeI—限制酶識別CA^TATG位點 NEt3 —三乙胺 NaH—氫化鈉 NaOH—氫氧化鈉 NH3 —氨 NH4 Cl—氯化銨 NMR—核磁共振 PAGE—聚丙烯醯胺凝膠電泳 PCR—聚合酶鏈反應 qPCR—定量PCR Pd/C—鈀/碳 -PH—3'端磷酸鹽修飾 pTSA—4-甲苯-磺酸Rt— 滯留時間 r.t.—室溫 sat.—飽和水溶液 SDS—十二烷基硫酸鈉 SEM—[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基 SI—選擇性指數(= CC50 / EC50 ) STAB—三乙醯氧基硼氫化鈉 T—DNA核鹼基胸腺嘧啶 TBAF—氟化四丁銨 TFA—三氟乙酸 THF—四氫呋喃 TLC—薄層層析法 Tris—參(羥甲基)-胺基甲烷 XhoI—限制酶識別C^TCGAG位點
化合物鑑別 —NMR 對於多種化合物，使用對於質子在400 MHz下操作且對於碳在100 MHz下操作的配備有5 mm反向三重共振探頭之Bruker DPX400光譜儀記錄NMR光譜。氘化溶劑為氯仿-d (氘化氯仿，CDCl3 )或d6-DMSO (氘化DMSO，d6-二甲亞碸)。相對於用作內標物之四甲基矽烷(TMS)而言以百萬分率(ppm)為單位報導化學位移。
化合物鑑別 —HPLC/MS 對於多種化合物，使用以下分析方法記錄LC-MS光譜。
方法 A 管柱—逆相Waters Xselect CSH C18 (50×2.1 mm，3.5微米) 流速—0.8 mL/min，25攝氏度 溶離劑A—95%乙腈 + 5% 10 mM碳酸銨水溶液(pH 9) 溶離劑B—10 mM碳酸銨水溶液(pH 9) 線性梯度t=0 min 5% A，t=3.5 min 98% A。t=6 min 98% A
方法 A2 管柱—逆相Waters Xselect CSH C18 (50×2.1 mm，3.5微米) 流速—0.8 mL/min，25攝氏度 溶離劑A—95%乙腈 + 5% 10 mM碳酸銨水溶液(pH 9) 溶離劑B—10 mM碳酸銨水溶液(pH 9) 線性梯度t=0 min 5% A，t=4.5 min 98% A。t=6 min 98% A
方法 B 管柱—逆相Waters Xselect CSH C18 (50×2.1 mm，3.5微米) 流速—0.8 mL/min，35攝氏度 溶離劑A—含0.1%甲酸之乙腈 溶離劑B—0.1%甲酸水溶液 線性梯度t=0 min 5% A，t=3.5 min 98% A。t=6 min 98% A
方法 B2 管柱—逆相Waters Xselect CSH C18 (50×2.1 mm，3.5微米) 流速—0.8 mL/min，40攝氏度 溶離劑A—含0.1%甲酸之乙腈 溶離劑B—0.1%甲酸水溶液 線性梯度t=0 min 5% A，t=4.5 min 98% A。t=6 min 98% A
方法 C 管柱—逆相Waters Xselect CSH C18 (50×2.1 mm，3.5微米) 流速—1 mL/min，35攝氏度 溶離劑A—含0.1%甲酸之乙腈 溶離劑B—0.1%甲酸水溶液 線性梯度t=0 min 5% A，t=1.6 min 98% A。t=3 min 98% A
方法 D 管柱—Phenomenex Gemini NX C18 (50×2.0 mm，3.0微米) 流速—0.8 mL/min，35攝氏度 溶離劑A—95%乙腈+5% 10 mM碳酸氫銨水溶液 溶離劑B—10 mM碳酸氫銨水溶液pH=9.0 線性梯度t=0 min 5% A，t=3.5 min 98% A。t=6 min 98% A
方法 E 管柱—Phenomenex Gemini NX C18 (50×2.0 mm，3.0微米) 流速—0.8 mL/min，25攝氏度 溶離劑A—95%乙腈+5% 10 mM碳酸氫銨水溶液 溶離劑B—10 mM碳酸氫銨水溶液(pH 9) 線性梯度t=0 min 5% A，t=3.5 min 30% A。t=7 min 98% A，t=10 min 98% A
方法 F 管柱—Waters XSelect HSS C18 (150×4.6 mm，3.5微米) 流速—1.0 mL/min，25攝氏度 溶離劑A—含0.1% TFA之乙腈 溶離劑B—0.1% TFA水溶液 線性梯度t=0 min 2% A，t=1 min 2% A，t=15 min 60% A，t=20 min 60% A
方法 G 管柱—Zorbax SB-C18 1.8 µm 4.6×15 mm快速分離濾筒(PN 821975-932) 流速—3 mL/min 溶離劑A—含0.1%甲酸之乙腈 溶離劑B—0.1%甲酸水溶液 線性梯度t=0 min 0% A，t=1.8 min 100% A
方法 H 管柱—Waters Xselect CSH C18 (50×2.1 mm，2.5微米) 流速—0.6 mL/min 溶離劑A—含0.1%甲酸之乙腈 溶離劑B—0.1%甲酸水溶液 線性梯度t=0 min 5% A，t=2.0 min 98% A，t=2.7 min 98% A
方法 J 管柱—逆相Waters Xselect CSH C18 (50×2.1 mm，2.5微米) 流速—0.6 mL/min 溶離劑A—100%乙腈 溶離劑B—10 mM碳酸氫銨水溶液(pH 7.9) 線性梯度t=0 min 5% A，t=2.0 min 98% A，t=2.7 min 98% A
製備 6,6- 二氟 -4- 氮螺 [2.4] 庚烷
Figure 02_image031
步驟 A ： 向丁二酸酐(100 g，1000 mmol)於甲苯(3000 mL)中之溶液中添加苯甲胺(107 g，1000 mmol)。在室溫下攪拌溶液24 h，隨後在回流下用迪恩-斯達克裝置(Dean-Stark apparatus)加熱16小時。隨後在減壓下濃縮混合物，得到1-苯甲基吡咯啶-2,5-二酮(170 g，900 mmol，90%產率)。
步驟 B ： 在氬氣氛圍下向1-苯甲基吡咯啶-2,5-二酮(114 g，600 mmol)及Ti(Oi-Pr)4 (170.5 g，600 mmol)於無水THF (2000 mL)中之經冷卻(0℃)混合物中逐滴添加3.4M溴化乙基鎂於THF (1200 mmol)中之溶液。使混合物升溫至室溫且攪拌4 h。隨後逐滴添加BF3 .Et2 O (170 g，1200 mmol)且攪拌溶液6 h。冷卻混合物(0℃)且添加3N鹽酸(500 mL)。用Et2 O萃取混合物兩次，且將經合併之有機萃取物用鹽水洗滌，乾燥且在減壓下濃縮，得到4-苯甲基-4-氮螺[2.4]庚-5-酮(30.2 g，150 mmol，25%產率)。
步驟 C ： 在氬氣下向4-苯甲基-4-氮螺[2.4]庚-5-酮(34.2 g，170 mmol)於無水THF (1000 mL)中之經冷卻(-78℃)溶液中添加含LiHMDS之THF (1.1M溶液，240 mmol)。攪拌混合物1 h，隨後逐滴添加N-氟苯磺醯亞胺(75.7 g，240 mmol)於THF(200 mL)中之溶液。使混合物升溫至室溫且攪拌6 h。隨後再冷卻混合物(-78℃)且添加LiHMDS (1.1M於THF中之溶液，240 mmol)。攪拌溶液1h，隨後逐滴添加含N-氟苯磺醯亞胺(75.7 g，240 mmol)之THF (200 mL)。使混合物升溫至室溫且攪拌6 h。將混合物倒入NH4 Cl飽和溶液(300 mL)中且用Et2 O萃取兩次。將經合併之有機萃取物用鹽水洗滌且在減壓下濃縮。藉由管柱層析純化產物，得到4-苯甲基-6,6-二氟-4-氮螺[2.4]庚-5-酮(18 g，75.9 mmol，45%產率)。
步驟 D ：向BH3 .Me2 S (3.42 g，45 mmol)於THF (200 mL)中之溫熱(40℃)溶液逐滴添加4-苯甲基-6,6-二氟-4-氮螺[2.4]庚-5-酮(11.9 g，50 mmol)。在40℃下攪拌混合物24 h，隨後冷卻至室溫。逐滴添加水(50 mL)，且用Et2 O (2×200 mL)萃取混合物。將經合併之有機萃取物用鹽水洗滌，用10% HCl於二噁烷(50 mL)中之溶液稀釋且在減壓下蒸發，得到4-苯甲基-6,6-二氟-4-氮螺[2.4]庚烷(3 g，13.4 mmol，27%產率)。
步驟 E ： 在室溫下在H2 氛圍下將4-苯甲基-6,6-二氟-4-氮螺[2.4]庚烷(2.68 g，12 mmol)及含氫氧化鈀(0.5 g)之甲醇(500 mL)攪拌24 h。過濾混合物且隨後在減壓下濃縮濾液，獲得6,6-二氟-4-氮螺[2.4]庚烷(0.8 g，6.01 mmol，50%產率)。
製備 7,7- 二氟 -4- 氮螺 [2.4] 庚烷
Figure 02_image033
步驟 A ： 經30分鐘向1-苯甲基吡咯啶-2,3-二酮(8 g，42.3 mmol)於DCM (100 mL)中之經冷卻(0℃)溶液中逐滴添加DAST (20.4 g，127 mmol)。在室溫下攪拌混合物隔夜，隨後藉由逐滴添加飽和NaHCO3 淬滅。分離有機層，且用DCM (2×50 mL)萃取水性溶離份兩次。將經合併之有機層經Na2 SO4 乾燥且在減壓下濃縮，得到1-苯甲基-3,3-二氟吡咯啶-2-酮(26.0 mmol，61%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟中。
步驟 B ：在氬氣氛圍下向粗1-苯甲基-3,3-二氟吡咯啶-2-酮(5.5 g，26 mmol)及Ti(Oi-Pr)4 (23.4 mL，78 mmol)於THF (300 mL)中之溶液逐滴添加3.4 M EtMgBr於2-MeTHF (45.8 mL，156 mmol)中之溶液。在攪拌12 h之後，添加水(10 mL)以獲得白色沈澱物。用MTBE (3×50 mL)洗滌沈澱物。將經合併之有機溶離份經Na2 SO4 乾燥，濃縮且藉由急驟層析(己烷-EtOAc 9:1)純化，獲得呈淡黃色油狀物之4-苯甲基-7,7-二氟-4-氮螺[2.4]庚烷(1.3 g，5.82 mmol，22%產率)。
步驟 C ： 將4-苯甲基-7,7-二氟-4-氮螺[2.4]庚烷(0.55 g，2.46 mmol)溶解於CHCl3 (1 mL)及MeOH (20 mL)溶液中，且添加Pd/C (0.2 g，10%)。在H2 氛圍下攪拌此混合物5 h，隨後過濾。濃縮濾液，得到7,7-二氟-4-氮螺[2.4]庚烷(0.164 g，1.23 mmol，50%產率)。
合成 1-[( 二氟甲氧基 ) 甲基 ]-N- 甲基環丙 -1- 胺
Figure 02_image035
步驟 A ： 在N2 下向1-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)環丙烷-1-甲酸甲酯(1.05 g，4.58 mmol)於無水THF (5 ml)中之溶液中添加硼氫化鋰(1.259 mL，4 M於THF中，5.04 mmol)。在室溫下攪拌混合物4天。添加硫酸鈉及水，經由用二氯甲烷沖洗之硫酸鈉墊過濾混合物。濃縮濾液，得到呈白色固體之(1-(羥甲基)環丙基)(甲基)胺基甲酸第三丁酯(0.904 g，95%產率)。
步驟 B ： 向(1-(羥甲基)環丙基)(甲基)胺基甲酸第三丁酯(0.100 g，0.497 mmol)及(溴二氟甲基)三甲基矽烷(0.155 ml，0.994 mmol)於二氯甲烷(0.5 ml)中之溶液中添加一滴乙酸鉀(0.195 g，1.987 mmol)於水(0.5 ml)中之溶液。攪拌混合物40 h。用二氯甲烷及水稀釋混合物，分離有機層且濃縮。藉由急驟層析(20%乙酸乙酯/庚烷)進行之純化得到呈無色油狀物之N-{1[(二氟甲氧基)甲基]環丙基}-N-甲基胺基甲酸第三丁酯(0.058 g，46%產率)。
步驟 C ： 向(1-((二氟甲氧基)甲基)環丙基)(甲基)胺基甲酸第三丁酯(0.058 g，0.231 mmol)中添加含HCl之二噁烷(4 M溶液，2 ml，8.00 mmol)。在室溫下攪拌混合物30 min，隨後濃縮，得到所需產物，其不經進一步純化即使用。 LC-MS: m/z 152.2 (M+H)+
合成 -[( 第三丁氧基 ) 羰基 ]-1-[2-( 三甲基矽烷基 ) 乙氧基 ] 甲基 -1H ,4H ,5H ,6H ,7H - 吡唑并 [4,3-c ] 吡啶 -3- 羧酸
Figure 02_image037
步驟 1 ：將LiHMDS (8.4 g，50.21 mmol，50.21 mL)溶解於無水二乙醚(50 mL)中且冷卻至-78℃ (乾冰/丙酮)。向所獲得的混合物中分批添加4-側氧基哌啶-1-甲酸第三丁酯(10.0 g，50.21 mmol)於無水二乙醚/無水THF 3:1 (60 mL)中之溶液。攪拌所得混合物30 min，隨後經10分鐘逐滴添加乙二酸二乙酯(7.34 g，50.21 mmol，6.82 mL)於無水二乙醚(20 mL)中之溶液。在-78℃下攪拌反應混合物15 min，隨後升溫至室溫且在20℃下攪拌隔夜。將混合物倒入1M KHSO4 (200 mL)中且分離各層。用EtOAc (2 × 100 mL)萃取水相。分離經合併之有機層，用水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮，得到呈橙色油狀物之粗產物3-(2-乙氧基-2-側氧基乙醯基)-4-側氧基哌啶-1-甲酸第三丁酯(14.1 g，47.11 mmol，93.8%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟。1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 1.37 (t, 3H), 1.46 (m, 9H), 2.57 (s, 2H), 3.63 (m, 2H), 4.35 (q, 2H), 4.43 (s, 2H), 15.31 (s, 1H)。 GCMS: [M+H]+ m/z: 計算值299.1; 實驗值300.1; Rt = 7.53 min.
步驟 2 ：向3-(2-乙氧基-2-側氧基乙醯基)-4-側氧基哌啶-1-甲酸第三丁酯(14.11 g，47.14 mmol)於純EtOH (150 mL)中之經攪拌溶液分批添加乙酸(4.53 g，75.43 mmol，4.36 ml)，接著添加水合肼(2.36 g，47.14 mmol，3.93 ml)。在45℃下攪拌所得混合物5小時，隨後真空移除溶劑，用NaHCO3 飽和水溶液稀釋殘餘物且用EtOAc (2×100 mL)萃取產物。將經合併之有機層經Na2 SO4 乾燥，過濾，且在減壓下濃縮，得到呈黃色泡沫之5-3-乙基1H ,4H ,5H ,6H ,7H -吡唑并[4,3-c ]吡啶-3,5-二甲酸第三丁酯(11.2 g，37.92 mmol，80.4%產率)。1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 1.38 (t, 3H), 1.49 (m, 9H), 2.82 (s, 2H), 3.71 (m, 2H), 4.38 (q, 2H), 4.64 (m, 2H), 11.56 (m, 1H)。 LCMS(ESI): [M+H]+ m/z: 計算值295.1; 實驗值296.2; Rt = 1.21 min.
步驟 3 ：在氬氣下向氫化鈉(1.82 g，0.045 mol，60%分散液於礦物油中)與無水THF (250 mL)中之經冷卻(0℃)懸浮液逐滴添加5-3-乙基1H ,4H ,5H ,6H ,7H -吡唑并[4,3-c ]吡啶-3,5-二甲酸第三丁酯(11.2 g，37.92 mmol)於無水THF (50 mL)中之溶液。在0℃下攪拌所得混合物30 min，接著逐滴添加[2-(氯甲氧基)乙基]三甲基矽烷(7.59 g，45.51 mmol)。在0℃下攪拌反應混合物30 min。使所得混合物升溫至室溫且倒入水(250 mL)中。用EtOAc (2×200 mL)萃取產物。將經合併之有機層用鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且真空濃縮，得到呈黃色油狀物之粗5-3-乙基1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基-1H ,4H ,5H ,6H ,7H -吡唑并[4,3-c ]吡啶-3,5-二甲酸第三丁酯(15.3 g，35.95 mmol，94.8%產率)。1 H NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 0.03 (m, 11H), 0.88 (m, 2H), 1.39 (t, 3H), 1.49 (s, 9H), 2.78 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 4.41 (q, 2H), 4.63 (m, 2H), 5.44 (s, 2H), LCMS(ESI): [M+H]+ m/z: 計算值425.2; 實驗值426.2; Rt = 1.68 min.
步驟 4 ：將5-3-乙基1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基-1H,4H,5H,6H,7H -吡唑并[4,3-c]吡啶-3,5-二甲酸第三丁酯(15.3 g，35.95 mmol)溶解於THF (100 mL)/水(50 mL)混合物中且添加單水合氫氧化鋰(5.28 g，125.82 mmol)。在50℃下攪拌反應混合物3h。真空濃縮反應混合物，小心地用KHSO4 飽和水溶液將殘餘物酸化至pH 4-5且用EtOAc (2×200 mL)萃取產物。分離有機相，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。用己烷濕磨殘餘物，且藉由過濾收集所形成之沈澱物且乾燥，得到呈黃色固體之5-[(第三丁氧基)羰基]-1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基-1H ,4H ,5H ,6H ,7H -吡唑并[4,3-c ]吡啶-3-羧酸(7.5 g，18.87 mmol，52.5%產率)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 0.05 (s, 9H), 0.86 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 2.77 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.71 (s, 2H), 4.62 (s, 2H), 5.43 (s, 2H)。 LCMS(ESI): [M+H]+ m/z: 計算值397.2; 實驗值398.2; Rt = 1.42 min.
合成 3-7- 氧雜 -4- 氮螺 [2.6] 壬烷 -4- 羰基 -1-[2-( 三甲基矽烷基 ) 乙氧基 ]- 甲基 -1H ,4H ,5H ,6H ,7H - 吡唑并 [4,3-c ] 吡啶 -5- 甲酸第三丁酯
Figure 02_image039
向5-[(第三丁氧基)羰基]-1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基-1H ,4H ,5H ,6H ,7H -吡唑并[4,3-c ]吡啶-3-羧酸(728.85 mg，1.83 mmol)於無水DMF (3 mL)中之溶液添加HATU (697.11 mg，1.83 mmol)。攪拌所得混合物30 min，接著添加7-
Figure 108139835-A0304-12-02
雜-4-氮螺[2.6]壬烷鹽酸鹽(300.0 mg，1.83 mmol)及三乙胺(742.09 mg，7.33 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。將混合物分配於EtOAc (50 mL)與水(30 mL)之間。將有機相用水(2×20 mL)、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮。藉由HPLC純化殘餘物，得到呈棕色油狀物之3-7-氧雜-4-氮螺[2.6]壬烷-4-羰基-1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基-1H,4H,5H,6H,7H -吡唑并[4,3-c ]吡啶-5-甲酸第三丁酯(451.7 mg，891.44 µmol，48.6%產率)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 0.01 (s, 8H), 0.85 (m, 6H), 1.47 (s, 9H), 1.58 (s, 1H), 1.93 (m, 2.H), 2.72 (s, 2H), 3.58 (m, 2H), 3.89 (m, 8H), 4.61 (m, 2H), 5.35 (m, 2H)。 LCMS(ESI): [M+H]+ m/z: 計算值506.3; 實驗值507.4; Rt = 4.47 min.
合成 3-8- 氧雜 -4- 氮螺 [2.6] 壬烷 -4- 羰基 -1-[2-( 三甲基矽烷基 ) 乙氧基 ] 甲基 -1H ,4H ,5H ,6H ,7H - 吡唑并 [4,3-c ] 吡啶 -5- 甲酸第三丁酯 (0030-11)
Figure 02_image041
向5-[(第三丁氧基)羰基]-1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基-1H ,4H ,5H ,6H ,7H -吡唑并[4,3-c ]吡啶-3-羧酸(728.85 mg，1.83 mmol)於無水DMF (5 mL)中之溶液添加HATU (697.11 mg，1.83 mmol)。攪拌所得混合物30 min，接著添加8-氧雜-4-氮螺[2.6]壬烷鹽酸鹽(300.0 mg，1.83 mmol)及三乙胺(742.09 mg，7.33 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。將混合物分配於EtOAc (50 mL)與水(30 mL)之間。將有機相用水(2×20 mL)、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮。藉由HPLC純化殘餘物，得到呈棕色油狀物之3-8-氧雜-4-氮螺[2.6]壬烷-4-羰基-1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基-1H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-5-甲酸第三丁酯(317.8 mg，627.18 µmol，34.2%產率)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 0.05 (s, 8H), 0.8 (m, 6H), 1.47 (s, 9H), 2.08 (m, 2H), 2.73 (s, 2H), 3.59 (m, 2H), 3.90 (m, 8H), 4.55 (m, 2H), 5.31 (s, 2H)。 LCMS(ESI): [M+H]+ m/z: 計算值506.3; 實驗值507.2; Rt = 4.82 min.
合成 3-7- 羥基 -4- 氮螺 [2.5] 辛烷 -4- 羰基 -1-[2-( 三甲基矽烷基 ) 乙氧基 ] 甲基 -1H ,4H ,5H ,6H ,7H - 吡唑并 [4,3-c ] 吡啶 -5- 甲酸第三丁酯 (0030-14)
Figure 02_image043
向5-[(第三丁氧基)羰基]-1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基-1H ,4H ,5H ,6H ,7H -吡唑并[4,3-c ]吡啶-3-羧酸(728.85 mg，1.83 mmol)於無水DMF (3 mL)中之溶液中添加HATU (697.11 mg，1.83 mmol)。攪拌所得混合物30 min，接著添加4-氮螺[2.5]辛-7-醇鹽酸鹽(300.0 mg，1.83 mmol)及三乙胺(742.09 mg，7.33 mmol，1.02 mL)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。將混合物分配於EtOAc (50 mL)與水(30 mL)之間。將有機相用水(2×20 mL)、鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮。藉由HPLC純化殘餘物，得到呈棕色固體之3-7-羥基-4-氮螺[2.5]辛烷-4-羰基-1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基-1H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-5-甲酸第三丁酯(422.0 mg，832.82 µmol，45.4%產率)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) 0.01 (s, 9H), 0.5 (m, 2H), 0.85 (m, 3H), 1.12 (m, 2H), 1.48 (s, 10H), 2.73 (m, 2H), 3.72 (m, 6H), 4.68 (m, 4H), 5.32 (m, 2H)。 LCMS(ESI): [M+H]+ m/z: 計算值506.3; 實驗值507.4; Rt = 3.98 min.
以下實例說明本發明之一些特定化合物之製備及特性。
實例 1 N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-{1-[(二氟甲氧基)甲基]環丙基}-N3-甲基-1H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,5-二甲醯胺
Figure 02_image045
Rt (方法B) 3.236 mins, m/z 472 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.95 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 7.73 (dd, J = 6.9, 2.6 Hz, 1H), 7.42 (ddd, J = 9.1, 4.4, 2.7 Hz, 1H), 7.28 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 6.70 (t, J = 75.8 Hz, 1H), 4.62 - 4.48 (m, 2H), 4.08 - 3.45 (m, 3H), 3.42 - 3.34 (m, 2H), 3.02 (s, 2H), 2.79 - 2.69 (m, 2H), 1.01 - 0.59 (m, 4H)。
實例 2 N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-[1-(甲氧基甲基)環丙基]-N3-甲基-1H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,5-二甲醯胺
Figure 02_image047
Rt (方法A) 3.16 mins, m/z 436 / 438 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.05 - 12.79 (m, 1H), 9.00 - 8.75 (m, 1H), 7.73 (dd, J = 6.9, 2.6 Hz, 1H), 7.48 - 7.35 (m, 1H), 7.28 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 23.5 Hz, 2H), 4.45 - 3.44 (m, 4H), 3.43 - 3.22 (m, 4H), 3.02 (s, 2H), 2.73 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 1.03 - 0.35 (m, 4H)
實例 3 N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-[1-(羥甲基)環丙基]-N3-甲基-1H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,5-二甲醯胺
Figure 02_image049
Rt (方法A) 3.01 mins, m/z 422 / 424 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.90 - 12.16 (m, 1H), 9.00 - 8.74 (m, 1H), 7.73 (dd, J = 6.9, 2.7 Hz, 1H), 7.45 - 7.38 (m, 1H), 7.32 - 7.25 (m, 1H), 4.85 - 4.45 (m, 3H), 4.02 - 3.47 (m, 4H), 3.05 - 2.98 (m, 2H), 2.77 - 2.70 (m, 2H), 0.92 - 0.44 (m, 4H), 一個信號(1H)與水信號一致。
實例 4 N5-(3-氰基-4-氟苯基)-N3-[1-(甲氧基甲基)環丙基]-N3-甲基-1H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,5-二甲醯胺
Figure 02_image051
Rt (方法A) 2.9 mins, m/z 427 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.11 - 12.79 (m, 1H), 9.19 - 8.86 (m, 1H), 7.96 - 7.90 (m, 1H), 7.83 - 7.75 (m, 1H), 7.42 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.66 - 4.44 (m, 2H), 3.80 - 3.44 (m, 3H), 3.29 - 3.22 (m, 5H), 3.07 - 2.91 (m, 2H), 2.78 - 2.69 (m, 2H), 0.89 - 0.59 (m, 4H)。
實例 5 N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-甲基-N3-{1-[(丙-2-基氧基)甲基]環丙基}-1H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,5-二甲醯胺
Figure 02_image053
Rt (方法B) 3.28 mins, m/z 464 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.87 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 7.73 (dd, J = 6.9, 2.6 Hz, 1H), 7.42 (ddd, J = 9.1, 4.3, 2.7 Hz, 1H), 7.28 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.54 (m, 2H), 3.69 (m, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.03 (m, 2H), 2.73 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 1.08 (m, 6H), 0.94 - 0.44 (m, 4H)。
實例 6 N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-[1-(乙氧基甲基)環丙基]-N3-甲基-1H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,5-二甲醯胺
Figure 02_image055
Rt (方法B) 3.18 mins, m/z 450 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.90 (m, 1H), 8.85 (m, 1H), 7.73 (dd, J = 6.9, 2.6 Hz, 1H), 7.42 (ddd, J = 9.1, 4.3, 2.6 Hz, 1H), 7.28 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.54 (m, 2H), 3.69 (m, 2H), 3.55 (m, 1H), 3.45 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 3.03 (m, 2H), 2.73 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.11 (m, 3H), 0.96 - 0.50 (m, 4H)。
實例 7 N-(3-氯-4-氟苯基)-3-{6,6-二氟-4-氮螺[2.4]庚烷-4-羰基}-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-5-甲醯胺
Figure 02_image057
Rt (方法A) 3.48 mins, m/z 454 / 456 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.94 (s, 1H), 8.88 (s, 1H), 7.72 m, 1H), 7.41 (m, 1H), 7.28 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.56 (m, 2H), 4.47 (t, J = 13.3 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.74 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.47 (m, 2H), 1.96 (m, 2H), 0.66 (m, 2H)。
實例 8 N-(3-氯-4-氟苯基)-3-{6,6-二氟-4-氮螺[2.4]庚烷-4-羰基}-6-甲基-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-5-甲醯胺
Figure 02_image059
Rt (方法H) 1.6 mins, m/z 468 / 470 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.24 - 12.94 (m, 1H), 8.84 (s, 1H), 7.71 (dd, J = 6.9, 2.7 Hz, 1H), 7.43 - 7.36 (m, 1H), 7.28 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.96 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 4.87 - 4.77 (m, 1H), 4.58 - 4.38 (m, 2H), 4.09 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 2.96 - 2.87 (m, 1H), 2.63 - 2.43 (m, 3H), 2.04 - 1.88 (m, 2H), 1.06 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.71 - 0.59 (m, 2H)。
實例 9 N-(3-氯-4-氟苯基)-3-{6,6-二氟-4-氮螺[2.4]庚烷-4-羰基}-6-甲基-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-5-甲醯胺
Figure 02_image061
Rt (方法H) 1.6 mins, m/z 468 / 470 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.24 - 12.94 (m, 1H), 8.84 (s, 1H), 7.71 (dd, J = 6.9, 2.7 Hz, 1H), 7.43 - 7.36 (m, 1H), 7.28 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.96 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 4.87 - 4.77 (m, 1H), 4.58 - 4.38 (m, 2H), 4.09 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 2.96 - 2.87 (m, 1H), 2.63 - 2.43 (m, 3H), 2.04 - 1.88 (m, 2H), 1.06 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.71 - 0.59 (m, 2H)。
實例 10 (1-{N-甲基5-[(3-氯-4-氟苯基)胺甲醯基]-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-醯胺基}環丙基)甲基1-胺基環丙烷-1-甲酸酯
Figure 02_image063
步驟 1 ：將5-(第三丁氧基羰基)-4,5,6,7-四氫-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-羧酸(422 mg，1.579 mmol)及HATU (600 mg，1.578 mmol)於無水DMF (5 mL)中之溶液攪拌10分鐘。隨後添加[1-(甲基胺基)環丙基]甲醇鹽酸鹽(0.239 g，1.73 mmol)及NEt3 (520 µL，3.74 mmol)無水DMF (5mL)中之懸浮液。1h後，再添加含5-(第三丁氧基羰基)-4,5,6,7-四氫-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-羧酸(84 mg，0.314 mmol)及HATU (120 mg，0.316 mmol)之無水DMF (0.5 mL) (預攪拌10分鐘)。在攪拌隔夜之後，添加5-(第三丁氧基羰基)-4,5,6,7-四氫-2H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-羧酸(84 mg，0.314 mmol)及HATU (120 mg，0.316 mmol)於無水DMF (0.5 mL)中之第三部分 (再預攪拌10分鐘)。再攪拌溶液1h，隨後分配於碳酸氫鈉飽和水溶液(25 mL)與EtOAc (25 mL)之間。用EtOAc (2×20 mL)萃取水相。將經合併之有機萃取物用鹽水(50 mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥，濃縮且藉由層析純化，得到呈白色固體之3-{[1-(羥甲基)環丙基](甲基)胺甲醯基}-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-5 -甲酸第三丁酯(0.270 g，49%產率)。
步驟 2 ：向3-{[1-(羥甲基)環丙基](甲基)胺甲醯基}-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-5-甲酸第三丁酯(0.103 g，0.29 mmol)及DIPEA (250 µL，1.435 mmol)於無水DMF (8 mL)中之經攪拌溶液添加異氰酸3-氯-4-氟苯酯(33 µL，0.265 mmol)。在室溫下攪拌所得溶液2h，接著分配於NaHCO3 飽和水溶液(30 mL)與EtOAc (30 mL)之間。分離各層，且過濾水相且用EtOAc (2×30 mL)萃取兩次。將經合併之有機相用鹽水(50 mL)洗滌，乾燥且濃縮並藉由急驟層析(0-6% MeOH/DCM)純化，得到呈白色固體之N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-[1-(羥甲基)環丙基]-N3-甲基-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,5-二甲醯胺(0.139 g，57%產率)。
步驟 3 ：將1-(Boc-胺基)環丙烷羧酸(30.2 mg，0.150 mmol)及N,N'-二環己基碳化二亞胺(23.4 mg，0.113 mmol)之經冷卻(0℃)溶液攪拌10 min，隨後添加N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-(1-(羥甲基)環丙基)-N3-甲基-2,4,6,7-四氫-5H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,5-二甲醯胺(35 mg，0.083 mmol)於無水THF (12 ml)中之懸浮液，接著添加4,4-(二甲基胺基)吡啶(1.014 mg，8.30 µmol)。攪拌混合物2h且升溫至室溫。24h後，再將1-(Boc-胺基)環丙烷羧酸(15.6 mg，0.078 mmol)及N,N'-二環己基碳化二亞胺(21.0 mg，0.102 mmol)添加於無水THF (2 mL)中(預攪拌20分鐘)。濃縮混合物，懸浮於EtOAc中且過濾。濃縮濾液，溶解於DCM中且依序用水(20 mL)、NaHCO3 飽和水溶液(20 mL)及鹽水(20 mL)洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥且濃縮。將殘餘物溶解於DCM (3 mL)中，接著添加含4M鹽酸之1,4-二噁烷(0.310 mL，1.240 mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌3h，隨後濃縮，與甲苯共蒸發且藉由層析純化，得到呈白色固體之(1-{N-甲基5-[(3-氯-4-氟苯基)胺甲醯基]-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-醯胺基}環丙基)甲基1-胺基環丙烷-1-甲酸酯(12.4 mg，28%產率)。 Rt (方法B) 2.45 mins, m/z 505 [M+H]+ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.95 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 7.77 - 7.68 (m, 1H), 7.47 - 7.37 (m, 1H), 7.28 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.65 - 4.45 (m, 2H), 4.29 - 4.06 (m, 1H), 4.00 - 3.63 (m, 2H), 3.55 (s, 1H), 3.29 - 3.27 (m, 3H), 3.06 - 2.98 (m, 1H), 2.81 - 2.70 (m, 2H), 2.30 - 2.15 (m, 1H), 1.22 - 1.06 (m, 2H), 1.00 - 0.58 (m, 6H)。
實例 11 N-(3-氯-4-氟苯基)-3-{8-氧雜-4-氮螺[2.6]壬烷-4-羰基}-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-5-甲醯胺
Figure 02_image065
Rt (方法B2) 3.24 mins, m/z 448 / 450 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.63 - 11.96 (m, 1H), 9.18 - 8.57 (m, 1H), 7.73 (dd, J = 6.9, 2.6 Hz, 1H), 7.42 (ddd, J = 9.0, 4.4, 2.7 Hz, 1H), 7.29 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.64 - 4.46 (m, 2H), 4.07 - 3.48 (m, 8H), 2.74 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.04 - 1.77 (m, 2H), 0.98 - 0.63 (m, 4H)。
實例 12 N-(3-氯-4-氟苯基)-3-{7-羥基-4-氮螺[2.5]辛烷-4-羰基}-2H,4H,5H,6H,7H-吡唑并[4,3-c]吡啶-5-甲醯胺
Figure 02_image067
Rt (方法B2) 3.01 mins, m/z 448 / 450 [M+H]+1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.92 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 7.73 (dd, J = 6.9, 2.6 Hz, 1H), 7.42 (ddd, J = 9.1, 4.4, 2.7 Hz, 1H), 7.29 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.91 - 4.28 (m, 4H), 3.92 - 3.49 (m, 3H), 2.73 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 1.95 - 1.66 (m, 2H), 1.46 - 1.08 (m, 2H), 1.07 - 0.36 (m, 4H)。一個信號(1H)與水信號一致。
在衣殼裝配及HBV複製分析中分析所選擇之本發明化合物，如下文所描述，且此等活性化合物之代表性基團示於表1中。
生物化學衣殼裝配分析 針對裝配效應子活性之篩選係基於由Zlotnick等人(2007)所公開之螢光淬滅分析進行。N端裝配結構域之含有149種胺基酸之C端截短核心蛋白在位置150處稠合至獨特之半胱胺酸殘基，且在大腸桿菌(E. coli )中使用pET表現系統(Merck Chemicals, Darmstadt)表現。核心二聚體蛋白之純化係使用一連串尺寸排外層析法步驟來執行。簡言之，在冰上用天然裂解緩衝液(Qproteome細菌蛋白製備型套組；Qiagen, Hilden)處理來自表現選殖NdeI/XhoI成表現質體pET21b之核心蛋白之編碼序列的1 L BL21 (DE3) Rosetta2培養物之細胞集結粒1 h。在離心步驟之後，在於冰上與0.23 g/ml固體硫酸銨一起攪拌2 h期間沈澱上清液。在進一步離心之後，將所得集結粒溶解於緩衝液A (100 mM Tris，pH 7.5；100 mM NaCl；2 mM DTT)中，且隨後裝載至緩衝液A平衡CaptoCore 700管柱(GE HealthCare, Frankfurt)上。用緩衝液N (50 mM NaHCO3 pH 9.6；5 mM DTT)透析含有經裝配HBV衣殼之管柱流過物，隨後添加脲至3M最終濃度以在冰上將衣殼解離成核心二聚體，持續1.5 h。隨後將蛋白溶液裝載至1L Sephacryl S300管柱上。在用緩衝液N溶離之後，藉由SDS-PAGE鑑別含有核心二聚體之溶離份，且隨後彙集並用50 mM HEPES pH 7.5；5 mM DTT透析。為改良經純化核心二聚體之裝配能力，執行第二輪裝配及拆卸，其開始於添加5 M NaCl且包括上文所描述之尺寸排外層析步驟。自最後一個層析步驟，將含有核心二聚體之溶離份彙集且以等分試樣以在1.5與2.0 mg/ml之間的濃度儲存在-80℃下。
即將標記之前，藉由添加新製備之呈20 mM最終濃度之DTT還原核心蛋白。在於冰儲存緩衝器上培育40 min之後，且使用Sephadex G-25管柱(GE HealthCare, Frankfurt)及50 mM HEPES、pH 7.5移除DTT。為進行標記，在4℃及黑暗下用呈1 mM最終濃度之BODIPY-FL順丁烯二醯亞胺(Invitrogen, Karlsruhe)隔夜培育1.6 mg/ml核心蛋白。在標記之後，藉由額外的去鹽步驟使用Sephadex G-25管柱移除游離染料。將經標記核心二聚體以等分試樣儲存在4℃下。在二聚狀態下，經標記核心蛋白之螢光信號較高且在核心二聚體裝配成高分子衣殼結構期間淬滅。在黑色384孔微量滴定盤中以10 µl總分析體積使用50 mM HEPES pH 7.5及1.0至2.0 µM經標記核心蛋白執行篩選分析。使用以100 µM、31.6 µM或10 µM之最終濃度起始之0.5對數單位的連續稀釋液以8種不同濃度添加各篩選化合物。在任何情況下，整個微量滴定盤上之DMSO濃度為0.5%。藉由注射NaCl至300 µM之最終濃度開始裝配反應，該注射誘導裝配過程至最大淬滅信號之約25%。在開始反應之後6 min，使用Clariostar盤式讀取器(BMG Labtech, Ortenberg)在477 nm之激勵及525 nm之發射下量測螢光信號。作為100%及0%裝配對照，使用含有2.5 M及0 M NaCl之HEPES緩衝液。實驗一式三份執行三次。藉由非線性回歸分析，使用Graph Pad Prism 6軟體(GraphPad Software, La Jolla, USA)計算EC50 值。
測定來自 HepAD38 細胞之上清液之 HBV DNA 在穩定經轉染細胞株HepAD38中分析抗HBV活性，已描述該細胞株分泌高含量之HBV病毒粒子顆粒(Ladner等人，1997)。簡言之，將HepAD38細胞在37℃、5% CO2 及95%濕度下在200 µl維持培養基中培養，該維持培養基為達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基/養分混合物F-12 (Gibco, Karlsruhe)、補充有50 µg/ml青黴素/鏈黴素(Gibco, Karlsruhe)之10%胎牛血清(PAN Biotech Aidenbach)、2 mM L-麩醯胺酸(PAN Biotech, Aidenbach)、400 µg/ml G418 (AppliChem, Darmstadt)及0.3 µg/ml四環素。以1:5比率一週一次繼代培養細胞，但通常不繼代超過十代。對於分析，將60,000個細胞接種至96孔盤之各孔中之無任何四環素的維持培養基中，且用連續半對數稀釋之測試化合物處理。為將邊緣效應降至最低，不使用盤之外部36個孔，但填充有分析培養基。在各分析培養盤上，分別配置病毒對照之六個孔(未經處理之HepAD38細胞)及細胞對照之六個孔(經0.3 µg/ml四環素處理之HepAD38細胞)。另外，在各實驗中準備盤套件以及參考抑制劑如BAY 41-4109、因提弗(entecavir)及拉米夫定(lamivudine)而非篩選化合物。一般而言，實驗一式三份執行三次。在第6天，根據製造商之說明書，在MagNa Pure LC儀器上使用MagNA Pure 96 DNA及病毒NA小體積套組(Roche Diagnostics, Mannheim)自動地純化來自100 µl經過濾細胞培養上清液(AcroPrep Advance 96濾板，0.45 μM Supor膜，PALL GmbH, Dreieich)之HBV DNA。由HBV DNA之相對複本數計算EC50值。簡言之，使100 μl含有HBV DNA之溶離液中之5 μl經受PCR LC480探針主套組(Roche)以及1 μM反義引子tgcagaggtgaagcgaagtgcaca、0.5 μM正義引子gacgtcctttgtttacgtcccgtc、0.3 μM雜交探針acggggcgcacctctctttacgcgg-FL及LC640-ctccccgtctgtgccttctcatctgc-PH (TIBMolBiol, Berlin)至12.5 μl之最終體積。PCR係在Light Cycler 480即時系統(Roche Diagnostics, Mannheim)上使用以下方案執行：在95℃下預培育1 min，擴增：40個循環×(在95℃下10 sec，在60℃下50 sec，在70℃下1 sec)，在40℃下冷卻10 sec。使用pCH-9/3091之HBV質體DNA (Nassal等人，1990, Cell 63: 1357-1363)及LightCycler 480 SW 1.5軟體(Roche Diagnostics, Mannheim)對照已知標準定量病毒負荷，且使用非線性回歸，利用GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA)計算EC50 值。
細胞生存力分析 使用AlamarBlue生存力分析，在0.3 µg/ml四環素之存在下在HepAD38細胞中評估細胞毒性，該四環素阻斷HBV基因組之表現。分析條件及盤佈局類似於抗HBV分析，但使用其他對照。在各分析培養盤上，含有未經處理之HepAD38細胞之六個孔用作100%生存力對照，且僅填充有分析培養基之六個孔用作0%生存力對照。另外，以60 µM最終分析濃度起始之幾何濃度系列之環己醯亞胺用作各實驗中之陽性對照。在六天培育期之後，以1/11稀釋將Alamar Blue Presto細胞生存力試劑(ThermoFisher, Dreieich)添加至分析配培養盤之各孔中。在於37℃下培育30至45 min之後，使用分別具有激發濾波器550 nm及發射濾波器595 nm之Tecan Spectrafluor Plus盤式讀取器讀取與活細胞之數目成比例之螢光信號。將資料標準化成未經處理之對照(100%生存力)及分析培養基(0%生存力)之百分比，隨後使用非線性回歸及GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA)計算CC50值。平均EC50 及CC50 值用於計算各測試化合物之選擇指數(SI = CC50 /EC50 )。表 1 ： 生物化學及抗病毒活性 在表1中，「+++」表示EC50 ＜ 1 µM；「++」表示1 µM ＜ EC50 ＜ 10 µM；「+」表示EC50 ＜ 100 µM (細胞活性分析) 在表1中，「A」表示IC50 ＜ 5 µM；「B」表示5 µM ＜ IC50 ＜ 10 µM；「C」表示IC50 ＜ 100 µM (裝配分析活性)
實例 CC50 (µM) 細胞活性 裝配活性
實例1 ＞ 10 +++ A
實例2 ＞ 10 +++ A
實例3 ＞ 10 +++ A
實例4 ＞ 10 +++ A
實例5 ＞ 10 +++ A
實例6 ＞ 10 +++ A
實例7 ＞ 10 +++ A
實例8 ＞ 10 +++ B
實例9 ＞ 10 +++ C
實例10 ＞ 10 +++ A
實例11 ＞ 10 +++ A
實例12 ＞ 10 +++ A
活體內功效模型 抗病毒劑之HBV研究及臨床前測試受到以下限制：病毒之狹窄的物種及組織向性、可用感染模型之缺乏及由使用黑猩猩(唯一對HBV感染具有充分敏感性的動物)施加之限制。替代性動物模型係基於HBV相關肝炎病毒之使用，且已在經土撥鼠肝炎病毒(WHV)感染之土撥鼠中或在經鴨B型肝炎病毒(DHBV)感染之鴨中或在經絨毛猴HBV (WM-HBV)感染之樹鼩中測試各種抗病毒化合物(Dandri等人, 2017, Best Pract Res Clin Gastroenterol 31, 273-279中之概述)。然而，代替病毒之使用具有若干限制。舉例而言，在最遠相關之DHBV與HBV之間的序列同源性僅為約40%，且此為HAP族之核心蛋白裝配修飾劑對DHBV及WHV呈現為無活性但有效地抑制HBV之原因(Campagna等人, 2013, J. Virol. 87, 6931-6942)。小鼠不具有HBV容許性，但主要努力聚焦於HBV複製及感染之小鼠模型之開發，諸如針對人類HBV轉殖基因之小鼠(HBV tg小鼠)之產生、小鼠中之HBV基因組之流體動力學注射(HDI)、或具有人類化肝及/或人類化免疫系統之小鼠之產生，以及基於含有HBV基因組之腺病毒(Ad-HBV)或腺相關病毒(AAV-HBV)之病毒載體向免疫勝任小鼠中之靜脈內注射(Dandri等人, 2017, Best Pract Res Clin Gastroenterol 31, 273-279中之概述)。使用針對完整HBV基因組轉殖基因之小鼠，可展現鼠類肝細胞產生感染性HBV病毒粒子之能力(Guidotti等人, 1995, J. Virol., 69: 6158-6169)。因為轉殖基因小鼠對病毒蛋白具有免疫耐受性且在產生HBV之小鼠中未觀測到肝損傷，故此等研究證實HBV自身不具有細胞病變性。HBV轉殖基因小鼠已用於測試若干抗HBV劑如聚合酶抑制劑及核心蛋白裝配修飾劑之功效(Weber等人, 2002, Antiviral Research 54 69-78；Julander等人, 2003, Antivir. Res., 59: 155-161)，因此證明HBV轉殖基因小鼠非常適合於多種類型之活體內臨床前抗病毒測試。
如Paulsen等人, 2015, PLOSone, 10: e0144383中所描述，2916/2917位置處攜載讀框轉移突變(GC)之HBV-轉殖基因小鼠(Tg [HBV1.3 fsX- 3'5'])可用於證實活體內核心蛋白裝配修飾劑之抗病毒活性。簡言之，在實驗之前藉由qPCR檢查HBV-轉殖基因小鼠之血清中之HBV特異性DNA (參見「測定來自HepAD38細胞之上清液之HBV DNA」章節)。各處理組由約10週齡之五隻雄性動物及五隻雌性動物組成，效價為107 至108 個病毒粒子/毫升血清。將化合物調配為諸如2% DMSO/98%泰勒纖維素(0.5%甲基纖維素/99.5% PBS)或50% PEG400之適合媒劑中之懸浮液，且一至三次/天經口投與至動物，持續10天時段。媒劑充當陰性對照，而適合媒劑中之1 µg/kg因提弗為陽性對照。藉由使用異氟醚蒸發器進行延髓後血液抽樣來獲得血液。為了收集最後一次處理血液或器官之後六小時的最終心臟穿刺，使小鼠經異氟醚麻醉且隨後藉由CO2 暴露處死。將延髓後(100-150 μl)及心臟穿刺(400-500 μl)血液樣本分別收集至Microvette 300 LH或Microvette 500 LH中，之後經由離心分離血漿(10 min，2000 g，4℃)。採集肝臟組織且速凍於液體N2 中。所有樣本均儲存在-80℃下直至進一步使用。將病毒DNA自50 μl血漿或25 mg肝臟組織中提取，且根據製造商之說明書在50 μl AE緩衝液(血漿)中使用DNeasy 96血液及組織套組(Qiagen, Hilden)或在320 μl AE緩衝液(肝臟組織)中使用DNeasy組織套組(Qiagen, Hilden)進行溶離。根據製造商之說明書使用LightCycler 480探針主PCR套組(Roche, Mannheim)使經溶離病毒DNA經受qPCR以測定HBV複本數。所使用之HBV特異性引子包括正向引子5'-CTG TAC CAA ACC TTC GGA CGG-3'、反向引子5'-AGG AGA AAC GGG CTG AGG C-3'及FAM標記之探針FAM-CCA TCA TCC TGG GCT TTC GGA AAA TT-BBQ。總體積為20 μl之一個PCR反應樣本含有5 μl DNA溶離液及15 μl主混合物(包含0.3 μM正向引子、0.3 μM反向引子、0.15 μM FAM標記之探針)。在Roche LightCycler1480上使用以下方案進行qPCR：在95℃下預培育1 min，擴增：(在95℃下10 sec，在60℃下50 sec，在70℃下1 sec)×45個循環，在40℃下冷卻10 sec。如上文所描述產生標準曲線。所有樣本均一式兩份地測試。分析之偵測極限為約50個HBV DNA複本(使用在250-2.5×107 複本數範圍內之標準)。結果表示為HBV DNA複本數/10 μl血漿或HBV DNA複本數/100 ng總肝DNA(針對陰性對照標準化)。
已在多項研究中顯示，不僅轉殖基因小鼠為證明新型化學實體活體內抗病毒活性之適合模型，小鼠中之HBV基因組之流體動力學注射的使用以及感染HBV陽性患者血清之免疫缺乏人類肝嵌合小鼠的使用亦常用於描繪靶向HBV之藥物(Li等人, 2016, Hepat. Mon. 16: e34420；Qiu等人, 2016, J. Med. Chem. 59: 7651-7666；Lutgehetmann等人, 2011, Gastroenterology, 140: 2074-2083)。另外，亦已藉由接種低劑量之腺病毒載體(Huang等人, 2012, Gastroenterology 142: 1447-1450)或含有HBV基因組之腺相關病毒(AAV)載體(Dion等人, 2013, J Virol. 87: 5554-5563)在免疫勝任小鼠中成功地確立慢性HBV感染。此模型亦可用於證實新穎抗HBV劑之活體內抗病毒活性。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 108139835-A0101-11-0002-1

Claims (11)

  1. 一種式I化合物
    Figure 03_image001
    其中 R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N R2為H或甲基 R3為H或C1-C4烷基，其中C1-C4烷基視情況經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次 R4選自包含以下之群：C1-C2烷基(限制條件為R4連接至R3)、C1-C2烷基-O-C1-C4烷基、C1-C2羥烷基、C1-C2烷基-O-C1-C4鹵烷基、C1-C2烷基-O-C3-C6環烷基、C1-C2烷基-S-C1-C4烷基、C1-C2烷基-SO2 -C1-C4烷基、C1-C2烷基-C≡N、C1-C2烷基-C3-C7雜環烷基、C1-C2烷基-O-C(=O)(C3-C7-環烷基)NH2 、C1-C2烷基-O-C(=O)(C1-C13烷基)NH2 、C3-C7雜環烷基、芳基及雜芳基，其中C3-C7雜環烷基、芳基或雜芳基視情況經鹵素、NH2 或C1-C6烷基取代一次、兩次或三次，R3及R4視情況連接以形成五員、六員或七員雜環烷基環，該雜環烷基環未經取代或經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、羧基、OH、C1-C4烷氧基、OCF3 、OCHF2 或C≡N X為O、CH2 或NR11 m為0、1或2 R11為H或C1-C4烷基 或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物。
  2. 如請求項1之式I化合物，其中芳基為C6芳基，及/或雜芳基為C1-C9雜芳基，且其中雜芳基及雜環烷基各自具有1至4個各自獨立地選自N、O及S之雜原子， 或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物。
  3. 如請求項1或2中任一項之式I化合物， 或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物， 其中該前藥選自包含以下之群：酯、碳酸酯、乙醯基氧基衍生物、胺基酸衍生物及胺基磷酸酯衍生物。
  4. 如請求項1至3中任一項之式I化合物，其為式II化合物
    Figure 03_image070
    其中 R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N R2為H或甲基 R3為C1-C4烷基，該C1-C4烷基未經取代或經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次 R5為H、甲基、乙基、異丙基、環丙基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、2,2-二氟乙基或1,1,1-三氘甲基 或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物。
  5. 如請求項1至3中任一項之式I化合物，其為式III化合物
    Figure 03_image072
    其中 R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N R2為H或甲基 R3為C1-C4烷基；該C1-C4烷基未經取代或經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次 R6為C3-C7雜環烷基、芳基或雜芳基，其視情況經鹵素、NH2 或C1-C4烷基取代一次、兩次或三次 或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物。
  6. 如請求項1至3中任一項之式I化合物，其為式IV化合物
    Figure 03_image074
    其中 R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N R2為H或甲基 n為1、2或3 R7、R8、R12及R13係各自獨立地選自包含以下之群：H、鹵素、OH、C1-C4烷氧基、OCHF2 、OCF3 及C≡N 或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物。
  7. 如請求項1至3中任一項之式I化合物，其為式V化合物
    Figure 03_image076
    其中 R1為苯基或吡啶基，其視情況經以下取代一次、兩次或三次：鹵素、C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C1-C4鹵烷基或C≡N R2為H或甲基 R3為C1-C4烷基，該C1-C4烷基未經取代或經氘、鹵素或C≡N取代一次、兩次或三次 R9及R10係各自獨立地選自H及C1-C6烷基 R9及R10視情況連接以形成C3-C7環烷基環 或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽，或式I化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物。
  8. 如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、或該化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽、或該化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物，其用於預防或治療個體之HBV感染。
  9. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、或該化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽、或該化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物；以及醫藥學上可接受之載劑。
  10. 一種治療有需要之個體之HBV感染的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、或該化合物之溶劑合物或水合物或其醫藥學上可接受之鹽、或該化合物之前藥或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物或水合物。
  11. 一種用於製備如請求項1至3中任一項之式I化合物之方法，其藉由以下進行：使式VI化合物
    Figure 03_image078
    其中R1係如請求項1中所定義，與式VII化合物反應，
    Figure 03_image080
    其中R2、R3、R4、X及m係如請求項1至3中任一項所定義。
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