TW202012925A - 改善因老化或缺氧所致的皮膚狀態之成分篩選方法、以及以皮下組織之黏彈性作爲指標之皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法 - Google Patents

改善因老化或缺氧所致的皮膚狀態之成分篩選方法、以及以皮下組織之黏彈性作爲指標之皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法 Download PDF

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Abstract

本發明之所欲解決的第一課題係提供用以篩選具有抑制活體中的膠原蛋白結構之惡化的效果的成分之新穎技術。
解決第一課題的本發明係一種抑制因低氧條件及/或老化所致的膠原蛋白結構之惡化的成分之篩選方法，其特徵為於分散有細胞之含有膠原蛋白的組成物中添加受測成分，且以於低氧條件培養時之膠原蛋白纖維的集束度(binding degree)的上升減少效果作為指標。

Description

改善因老化或缺氧所致的皮膚狀態之成分篩選方法、以及以皮下組織之黏彈性作為指標之皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法
本發明係關於抑制膠原蛋白結構惡化的成分之篩選方法。
又，本發明係關於抑制組織之纖維化的成分之篩選方法。
又，本發明係關於抑制細胞黏著器(cell adhesion apparatus)之機能降低的成分之篩選方法。
又，本發明係關於以皮下組織之黏彈性作為指標之皮下組織之氧量之估算方法、估算裝置及估算程式、以及皮下組織之黏彈性之估算方法、估算裝置及估算程式。
又，本發明係關於以皮下組織之黏彈性作為指標之皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法、估算裝置及估算程式、以及皮下組織之黏彈性之估算方法、估算裝置及估算程式。
近年，以抑制伴隨老化之人體各組織的機能降低為目的，即以抑制老化現象為目的之與抗老化有關的研究盛行。尤其於美容、化妝品的技術領域，正探索抑制伴隨老化之皮膚的皺紋、鬆弛、斑點等的老化現象的有效成分。
例如，於專利文獻1已揭示以與真皮之結構形成的控制有關的基因表現作為指標，藉此篩選改善皮膚的皺紋、鬆 弛、張力降低的材料的方法。
於專利文獻2已揭示以細胞的核膜異常狀態作為指標，而篩選具有皺紋之預防或改善效果的成分的方法。
又，於專利文獻3已揭示以細胞中的皮支持帶(retinacula cutis)成分之表現量作為指標，而篩選具有皺紋改善、下垂改善、張力降低防止、皮膚的彈性降低的防止等之效果的有效成分的方法。
又，亦正進行著眼於存在於皮下組織的皮下脂肪細胞，而瞄準鬆弛的改善的研究。於專利文獻4已揭示以皮下脂肪細胞之黏著分子的活性作為指標，而篩選鬆弛改善成分的方法(專利文獻4)。
於多細胞生物，除了血液細胞等之游離細胞以外的全部細胞，係與其他細胞或細胞外基質結合而形成組織或器官。細胞係於結合部位形成特殊的結構(結合器)作為結合的器。將此結合通稱為細胞連結(cell junction)。
脊椎動物之細胞連結(cell junction)被分類為錨定型連結(anchoring junction)、通訊型連結(communicating junction)、及封閉型連結(occluding junctions)之三種類。
而且，作為被分類為錨定型連結之實現細胞黏著的細胞黏著器，已知有黏著連結(AJ：Adherence-junction)；作為被分類為封閉型連結的實現細胞黏著的細胞黏著器，已知有緊密連結(TJ：Tight-junction)。
緊密連結及黏著連結係藉由於細胞周圍呈帶狀地存在並使相鄰的細胞彼此密接，而封閉間隙的同時，連續地將細胞固定住的細胞間黏著結構體。於皮膚組織，TJ存在於顆粒層之 表皮細胞，防止水或物質穿透細胞間隙，發揮用以維持皮膚障壁機能(skin barrier function)的重要作用(例如，參照非專利文獻1)。又，亦已知黏著連結的正常形成係於緊密連結的形成上發揮重要的作用。
已知由於隨著老化而皮膚障壁機能減弱，皮膚呈現乾燥狀態(非專利文獻2)。
使緊密連結及黏著連結的機能提升的成分的探索亦為盛行，例如，專利文獻5已揭示以TRPV受體之活性化作用作為指標的皮膚障壁機能提升成分之篩選方法。
另一方面，藉由利用血液氣體分析的解析，已知動脈血之pO2(氧分壓)會降低(非專利文獻3)。此表示隨著老化而人體之各組織處於低氧的狀態。
由此種知識見解，暗示低氧狀態與老化現象的關連，但於低氧狀況下因引起何種生理學的變化而引起老化，其機制的全部內容並不清楚。
另一方面，已知隨著老化而結締組織逐漸失去柔軟性、彈性而變硬。可認為此係起因於為結締組織的主要成分之膠原蛋白纖維老化的同時會交聯並結成束(非專利文獻4)。
然而，關於伴隨老化的膠原蛋白纖維的結成束係由於何種機制所產生的則不清楚。
伴隨老化之皮膚的老化現象，即皺紋、鬆弛、斑點等之外觀上的變化，係起因於皮膚的內部結構的生理化學的變化。近年來，以此種皮膚的老化現象的抑制作為目的，而關注皮膚的內部結構中的老化變化的機制闡明。
皮膚大致分成包含表皮、真皮、以及皮下組織之三 個層。表皮進一步可分類成角質層、顆粒層、有棘層(stratum spinosum)及基底層之四個層，位於下層的真皮可分類成乳頭層、乳頭下層及網狀層之三個層。負責支撐此等表皮、真皮的作用者為皮下組織。
皮下組織之大部分為由脂肪細胞形成集塊的脂肪小葉所構成的皮下脂肪，具有保溫、對抗外力的緩衝作用等。脂肪小葉藉由膠原蛋白纖維或彈性蛋白(elastin)纖維等之結締組織等而周圍被網目狀地包圍，藉此形成纖維結構。
就判斷皮膚的硬度等之手法而言，過去已有進行觸診，但藉由超音波彈性成像(ultrasound elastography)技術(例如專利文獻6)之發展，而構成皮膚的各別層之物理學的特性，特別是黏彈性的定量的測定成為可能。
另一方面，作為病理上診斷體組織的纖維化的方法，一般進行活體組織診斷(所謂的「生檢」)。然而，生檢由於伴隨對受試者的侵略，而難以頻繁地進行。已揭示以超音波彈性成像作為原理的「肝纖維化掃描(FibroScan)」，可非侵略性地進行肝纖維化的評價(專利文獻7)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2018-093743號公報
[專利文獻2]日本特開2013-257347號公報
[專利文獻3]日本特開2017-112918號公報
[專利文獻4]日本特開2016-187324號公報
[專利文獻5]日本特開2011-115152號公報
[專利文獻6]日本特表2009-539528號公報
[專利文獻7]國際公開2011/081214號小冊
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Denda M. et al., J. Invest. Dermatol, 127(3), 654-659 (2007)
[非專利文獻2]Journal of Geriatric Dermatology (1993) Vol. 1, 111-120
[非專利文獻3]日本老年醫學會雜誌/15卷(1978)1號，「健康老年者之動脈血氣體分析值」，田口悅子等人，1978年
[非專利文獻4]Connective Tissue, Vol. 16, No. 1, 25-28 (1984)
由活體採取的組織片有使用作為探索新穎材料的工具的情形。於探索對活體中的膠原蛋白結構有影響的成分時，理論上亦可自活體採取包含膠原蛋白結構的真皮組織等之組織片，並將其使用作為模式。
然而，組織片由於採取自活體的緣故，有不能確保其品質的均一性、違背再現性這樣的問題點。
鑑於此種問題，本發明所欲解決的第一課題係提供用以篩選有抑制活體中的膠原蛋白結構之惡化的效果之成分的新穎技術。
又，本發明之所欲解決的第二課題係提供用以篩選有改善或預防皮膚的老化現象，尤其是改善或預防鬆弛的效果的 成分之新穎技術。
又，本發明之所欲解決的第三課題係提供用以篩選有改善或預防皮膚之老化現象，尤其是改善或預防伴隨老化的皮膚障壁機能降低的效果的成分之新穎技術。
又，本發明之所欲解決的第四課題係提供能估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度及氧量之新穎技術。
又，本發明之所欲解決的第五課題係提供能由皮膚的內部之物理的測定值，估算皮下組織之黏彈性或包含脂肪細胞的纖維結構之纖維化程度之新穎技術。
關於本發明之第一課題，藉由本發明人等得深入研究，而令人驚訝地判明將分散有細胞之含有膠原蛋白的組成物於低氧條件下培養的結果，膠原蛋白纖維的集束度(binding degree)上升。
此結果係與隨著老化而人體各組織暴露於低氧條件(非專利文獻3)、以及隨著老化而結締組織中的膠原蛋白纖維的結成束係亢進(非專利文獻4)這樣的2個知識見解一致。
即，清楚得知本發明者構築的上述試驗系統，可活用作為可再現人體之結締組織中的膠原蛋白纖維之伴隨老化的集束度提升的良好模式。
基於該知識見解，本發明者完成本發明。
即，解決上述第一課題的本發明係一種抑制因低氧條件及/或老化所致的膠原蛋白結構的惡化的成分之篩選方法，其特徵為於分散有細胞之含有膠原蛋白的組成物中添加受測成分，並以於 低氧條件培養時之膠原蛋白纖維的集束度的上升減少效果作為指標。
若依據本發明，可簡便地篩選抑制伴隨低氧條件或老化的膠原蛋白結構之惡化的成分。
於本發明之較佳形態，其特徵為於前述受測成分之存在下及不存在下，將前述含有膠原蛋白的組成物於低氧條件下培養， 於受測成分之存在下培養後之膠原蛋白纖維之集束度，較於受測成分之不存在下培養後之膠原蛋白纖維之集束度為更低的情形， 判定前述受測成分為抑制因低氧條件及/或老化所致的膠原蛋白結構的惡化的成分。
藉由設成此種實施對照試驗的形態，而更正確的篩選成為可能。
本發明可應用於抑制伴隨低氧條件或老化的結締組織之膠原蛋白結構的惡化的成分之篩選。
於本發明之較佳形態，前述細胞為結締組織細胞。藉由使用構成結締組織的結締組織細胞，可精密度更佳地篩選結締組織中的膠原蛋白結構之惡化抑制成分。
於本發明之較佳形態，其特徵為基於前述培養後之膠原蛋白纖維之顯微鏡拍攝影像，評價前述膠原蛋白纖維之集束度。
藉由設成基於顯微鏡拍攝影像的形態，可容易地進行膠原蛋白纖維之集束度之評價。
於本發明之較佳形態，其特徵為對前述顯微鏡拍攝 影像施加影像解析處理，基於定量化前述膠原蛋白纖維之集束度的影像解析處理結果，評價前述膠原蛋白纖維之集束度。
藉由設成此種定量評價的形態，可實現更高精密度的篩選。
於本發明之較佳形態，其特徵為於前述影像解析處理，對前述顯微鏡拍攝影像施加傅立葉轉換(Fourier transform)處理而取得表示二維空間頻率功率譜(Two-dimensional space frequency power spectrum)的傅立葉轉換影像，並獲得：設定至少通過該傅立葉轉換影像之原點的直線，對於該直線之長度方向，將該直線上的該傅立葉轉換影像之功率作圖而獲得的波形；或自該傅立葉轉換影像，切出至少包含其原點的略矩形區域影像，將切出的略矩形區域影像的短徑方向的功率之平均值，對於該略矩形區域影像之長徑方向作圖而獲得的波形。
藉由使用傅立葉轉換，而複雜的顯微鏡拍攝影像之定量的評價成為容易。
於本發明之較佳形態，其特徵為切出前述波形之傾斜部分的至少一部分，作成前述傾斜部分之近似直線，相對於該近似直線，構成前述波形的數據的離差(dispersion)的程度越小，判斷抑制前述膠原蛋白結構之惡化的效果越優異。
藉由基於所謂數據的離差程度之一維的尺度而評價膠原蛋白結構之集束度，可更簡便的篩選。
於本發明之較佳形態，其特徵為藉由標準偏差而評價前述離差的程度。
藉由以標準偏差評價，而由統計學的觀點，精密度高的評價 成為可能。
於本發明之較佳形態，其特徵為前述低氧條件係細胞培養氣體環境中的氧濃度為5%以下之條件。
藉由於此種條件下進行培養，可更有效果地進行篩選。
本發明可應用於抗老化成分之篩選方法。
又，本發明可應用於伴隨老化的皺紋、鬆弛或張力降低之改善或預防成分之篩選方法。
又，本發明亦關於包含以屬於錦葵科錦葵屬(Malvaceae Malva)的植物之萃取物作為有效成分之因低氧條件及/或老化所致的膠原蛋白結構的惡化的抑制劑。
關於本發明之第二課題，本發明者等人之深入研究的結果，清楚得知皮下脂肪層之相對的黏彈性係隨著老化而降低。基於此知識見解，進一步進行詳細的解析，結果清楚得知包覆存在於皮下組織的皮下脂肪細胞的膠原蛋白纖維係老化同時纖維化。因已知隨著老化而動脈血之氧濃度降低(非專利文獻3)，故本發明人等著眼於皮下脂肪細胞之纖維化係因低氧條件所引起的可能性。然後，進一步解析的結果，本發明者等人發現處於低氧條件下的皮下脂肪細胞中，觀察到為與膠原蛋白纖維之交聯有關的基因之lox的表現量的上升，而完成本發明。
解決上述第二課題的本發明係一種抑制因低氧條件及/或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分之篩選方法，其係以於低氧條件培養的細胞中的lox基因之表現上升的減少效果作為指標。
若依據本發明之方法，可容易篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分。
於本發明之較佳形態，前述細胞為脂肪細胞。藉此，可精密度更佳地篩選抑制皮下脂肪細胞之纖維化的成分。
本發明較佳為應用於抗老化成分之篩選方法。
又，本發明較佳為應用於伴隨老化的鬆弛之改善或預防成分之篩選方法。
於本發明之較佳形態，與於受測成分之不存在下且於低氧條件培養的細胞比較，而於受測成分之存在下且於低氧條件下培養的細胞中的lox基因之表現量為更低的情形，將該受測成分判定為抑制因低氧條件及/或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分。
藉由進行此種對照實驗，可精密度更佳地進行篩選。
於本發明之較佳形態，前述低氧條件係細胞培養氣體環境中的氧濃度為5%以下之條件。
藉由於此種條件下進行細胞培養，可更有效果地進行篩選。
於本發明之較佳形態，將vegf基因之表現量的上升，作為於低氧條件培養的細胞中產生缺氧反應(hypoxia response)的指標。
藉由設置此種指標，可確認試驗系統的適當性，且可更正確地進行篩選。
又，本發明亦關於藉由上述之篩選方法而發現的有效成分。具體而言，本發明亦關於一種因低氧條件及/或老化所致的lox基因之表現的上升抑制劑及皮下脂肪細胞之纖維化抑制劑、以及伴隨老化的鬆弛之改善或預防劑，其特徵為含有屬於石竹科肥皂草屬(Caryophyllaceae Saponaria)的植物之萃取物作為有效成分。
如上述，皮膚的障壁機能係隨著老化而降低(非專利文獻2)。另一方面，已知隨著老化而動脈血的氧濃度降低(非專利文獻3)，因此本發明人等著眼於皮膚障壁機能的降低係因低氧條件所引起的可能性。深入研究的結果，關於本發明之第三課題，本發明者等人發現處於低氧條件下的表皮細胞中，觀察到為與緊密連結的形成有關的基因之緊連蛋白(occuludin)、密連蛋白(claudin)及zo-1、以及為與黏著連結之形成有關的基因之鈣黏蛋白(cadherin)基因之表現量的降低，而完成本發明。
解決上述第三課題的本發明係一種抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之細胞黏著器的機能降低的成分之篩選方法，其係以於低氧條件培養的細胞中的選自緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因及鈣黏蛋白基因之基因的表現降低之抑制效果作為指標。
若依據本發明，可簡便地篩選抑制伴隨低氧條件或老化的細胞黏著器之機能的降低的成分。
於本發明之較佳形態，係以於低氧條件培養的細胞中的選自緊連蛋白基因、密連蛋白基因及zo-1基因的基因之表現降低的抑制效果作為指標。
藉此，可篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之緊密連結的機能降低的成分。
又，於本發明之較佳形態，係以於低氧條件培養的細胞中的鈣黏蛋白基因之表現降低的抑制效果作為指標。
藉此，可篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之黏著連結之機能降低的成分。
於本發明之較佳形態，前述細胞為角質細胞 (keratinocyte)。
藉由使用角質細胞，可精密度更佳地篩選抑制表皮之緊密連結機能的降低的成分。
本發明較佳為應用於抗老化成分之篩選方法。
本發明較佳為應用於伴隨老化的皮膚障壁機能的降低的改善或預防成分之篩選方法。
於本發明之較佳形態，與於受測成分之不存在下且於低氧條件培養的細胞比較，而於受測成分之存在下且於低氧條件下培養的細胞中的選自緊連蛋白基因、密連蛋白基因及zo-1基因的基因之表現量為更高的情形，將該受測成分判定為抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之緊密連結機能降低的成分。
藉由設成此種進行對照試驗的實施形態，可實現精密度高的篩選。
於本發明之較佳實施形態，前述低氧條件係細胞培養氣體環境中的氧濃度為5%以下之條件。
藉由於此種條件下進行細胞培養，可更有效果地篩選抑制伴隨低氧條件或老化之緊密連結機能的降低的成分。
於本發明之較佳形態，將vegf基因之表現量的上升作為於低氧條件培養的細胞中產生缺氧反應的指標。
如此，藉由同時測定此種缺氧反應的標記(marker)，可確認精密度高，同時進行篩選。
又，本發明亦關於包含藉由上述之篩選方法而確認有效性的成分的藥劑。具體而言，本發明亦關於一種因低氧條件及/或老化所致的密連蛋白基因之表現降低抑制劑、表皮之細胞黏著器之機能降低抑制劑、及伴隨老化的皮膚障壁機能之降低的 改善或預防劑，其特徵為包含屬於唇形花科薄荷屬(Lamiaceae Mentha)的植物之萃取物作為有效成分。
關於本發明之第四課題，本發明者等人深入研究的結果發現，皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與氧量之間有相關關係，而完成本發明。
即，解決上述第四課題的本發明係一種氧量之估算方法，其特徵為利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將前述皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標，而估算前述氧量。
若依據本發明，可由皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度這種物理特性或生理特性，估算皮下組織之氧量。
於本發明之較佳形態，其特徵為使用將皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值設為解釋變數(explanatory variable)，將皮下組織之氧量之評價值設為目的變數(objective variable)的迴歸方程式，由前述皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值，算出前述氧量。
藉由使用事先準備的迴歸方程式，可更正確地估算皮下組織之氧量。
於本發明之較佳形態，其特徵為藉由超音波彈性成像而測定前述皮下組織之黏彈性。
藉此，可非侵略性且定量地獲得皮下組織之黏彈性之測定結果，且可精密度更佳地估算皮下組織之氧量。
於本發明之較佳形態，其特徵為前述黏彈性係皮下組織上層之黏彈性。
尤其藉由將皮下組織上層之黏彈性作為指標，可更正確地估 算皮下組織之氧量。
又，本發明係一種氧量估算裝置，其係利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將前述皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值作為指標，而估算前述氧量，其特徵為具備：記憶顯示前述相關關係的相關數據的記憶手段；及將受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度，與記憶於前述記憶手段的前述相關數據比對，而算出前述氧量的氧量算出手段。
又，本發明係一種氧量估算程式，其係利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的的相關關係，將前述皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值作為指標，而估算前述氧量，其特徵為：使電腦作為氧量算出手段而發揮作用，該氧量算出手段係將受試者之皮膚之皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度，與顯示前述相關關係的相關數據比對，而算出前述氧量。
又，本發明亦關於一種皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法，其特徵為利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將前述皮下組織之氧量作為指標，而估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度。
本發明係與上述的皮下組織之氧量之估算方法互為表裏。若依據本發明，可由皮下組織之氧量這樣的生理學的特性，估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度。
於本發明之較佳形態，其特徵為使用將皮下組織之氧量之評價值設為解釋變數，將皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值設為目的變數的迴歸方程式，由前述皮下組織之氧量之評價值，算出皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度。
藉由使用事先準備的迴歸方程式，可更正確地估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度。
於本發明之較佳形態，其特徵為藉由近紅外線分光法而測定前述皮下組織之氧量。
藉此，可非侵略性且定量地獲得皮下組織之氧量之測定結果，且可精密度更佳地估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度。
於本發明之較佳形態，其特徵為前述黏彈性係皮下組織上層之黏彈性。
本發明特別有用於皮下組織上層之黏彈性之估算。
又，本發明係一種皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度估算裝置，其係利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將前述皮下組織之氧量作為指標，而估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度，其特徵為具備：記憶顯示前述相關關係的相關資料的記憶手段；及將受試者之皮下組織之氧量，與記憶於前述記憶手段的前述相關數據比對，而算出前述黏彈性或纖維化程度的黏彈性或纖維化程度算出手段。
又，本發明係一種皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細 胞之纖維化程度估算程式，其係利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將前述皮下組織之氧量作為指標，而估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度，其特徵為：使電腦作為黏彈性或纖維化程度算出手段而發揮作用，該黏彈性或纖維化程度算出手段係將受試者之皮下組織之氧量，與顯示前述相關關係的相關數據比對，而算出前述黏彈性或纖維化程度。
關於本發明之第五課題，本發明者等人之深入研究的結果，清楚得知包覆存在於皮下組織的皮下脂肪細胞的膠原蛋白纖維係老化同時纖維化。然後，進一步解析的結果，本發明者等人發現皮下組織之黏彈性與包覆脂肪細胞的纖維結構之纖維化程度之間有相關關係，而完成本發明。
即，解決上述第五課題的本發明係一種纖維化程度之估算方法，其特徵為利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將前述皮下組織之黏彈性作為指標，而估算前述纖維化程度。
若依據本發明，可由皮下組織之黏彈性這樣的物理特性，估算皮下脂肪細胞之纖維化程度。
於本發明之較佳形態，其特徵為使用將皮下組織之黏彈性之測定值設為解釋變數，將皮下脂肪細胞之纖維化程度之評價值設為目的變數的迴歸方程式，由前述皮下組織之黏彈性之測定值，算出前述纖維化程度。
藉由使用事先準備的迴歸方程式，可更正確地估算皮下脂肪細胞之纖維化程度。
於本發明之較佳形態，其特徵為藉由超音波彈性成像而測定前述皮下組織之黏彈性。
藉此，可非侵略性且定量地獲得皮下組織之黏彈性之測定結果，且可精密度更佳地估算皮下脂肪細胞之纖維化程度。
於本發明之較佳形態，其特徵為前述黏彈性係皮下組織上層之黏彈性。
尤其藉由將皮下組織上層之黏彈性作為指標，可更正確地估算皮下脂肪細胞之纖維化程度。
又，本發明亦關於利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將前述皮下組織之黏彈性作為指標而估算前述纖維化程度的纖維化程度估算裝置。
本發明之纖維化程度估算裝置，其特徵為具備：記憶顯示前述相關關係的相關數據的記憶手段；及將受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性，與記憶於記憶手段的前述相關數據比對，而算出前述纖維化程度的纖維化程度算出手段。
又，本發明亦關於利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將前述皮下組織之黏彈性作為指標而估算前述纖維化程度的纖維化程度估算程式。
本發明之纖維化程度估算程式，其特徵為：使電腦作為纖維化程度算出手段而發揮作用，該纖維化程度算出手段係將受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性，與顯示前述相關關係的相關數據比對，而算出前述纖維化程度。
又，本發明亦關於一種皮下組織之黏彈性之估算方 法，其特徵為利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將前述皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標而估算皮下組織之黏彈性。
本發明係與上述皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法互為表裏。若依據本發明，可由皮下脂肪細胞之纖維化程度這樣的生理學的‧解剖學的特性，估算皮下組織之黏彈性。
於本發明之較佳形態，其特徵為使用將皮下脂肪細胞之纖維化程度之評價值設為解釋變數，將皮下組織之黏彈性之測定值設為目的變數的迴歸方程式，由前述皮下脂肪細胞之纖維化程度之評價值，算出皮下組織之黏彈性。
藉由使用事先準備的迴歸方程式，可更正確地估算皮下組織之黏彈性。
於本發明之較佳形態，其特徵為藉由超音波診斷裝置而測定前述皮下脂肪細胞之纖維化程度。
藉此，可非侵略性且定量地獲得皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定結果，且可精密度更佳地估算皮下組織之黏彈性。
於本發明之較佳形態，其特徵為藉由超音波診斷裝置而取得皮下組織之回波影像，由該影像生成直方圖，將皮下脂肪細胞之纖維化程度作為該直方圖的偏度(skewness)而算出。
藉由將由直方圖算出的偏度作為指標，可客觀地評價皮下脂肪細胞之纖維化程度，且可精密度更佳地估算皮下組織之黏彈性。
於本發明之較佳形態，其特徵為前述黏彈性係皮下組織上層之黏彈性。
本發明尤其有用於皮下組織上層之黏彈性之估算。
又，本發明亦關於利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將前述皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標而估算皮下組織之黏彈性的皮下組織之黏彈性估算裝置。
本發明之黏彈性估算裝置，其特徵為具備：記憶顯示前述相關關係的相關數據的記憶手段；及將受試者之皮下脂肪細胞之纖維化程度，與記憶於前述記憶手段的前述相關數據比對，而算出前述黏彈性的黏彈性算出手段。
又，本發明亦關於利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將前述皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標而估算皮下組織之黏彈性的皮下組織之黏彈性估算程式。
本發明之黏彈性估算程式，其特徵為：使電腦作為黏彈性算出手段而發揮作用，該黏彈性算出手段係將受試者之皮下脂肪細胞之纖維化程度，與顯示前述相關關係的相關數據比對，而算出前述黏彈性。
若依據本發明，可容易地篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的膠原蛋白結構之惡化的成分。
若依據本發明，可容易地篩選抗老化成分，具體而言可容易地篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的組織之纖維化的成分。
又，包含經本發明之篩選法確認其有效性的屬於石竹科肥皂草屬的植物之萃取物作為有效成分的藥劑，發揮因低氧條件及/ 或老化所致的lox基因之表現的上升抑制效果、皮下脂肪細胞之纖維化抑制效果、以及伴隨老化的鬆弛之改善效果或預防效果。
若依據本發明，可容易地篩選抗老化成分，具體而言可容易地篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之緊密連結機能的降低的成分。
若依據本發明，可由皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度，估算皮下組織之氧量。
又，若依據本發明，可由皮下組織之氧量，估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度。
若依據本發明，可由皮下組織之黏彈性，估算皮下脂肪細胞之纖維化程度。
又，若依據本發明，可由皮下脂肪細胞之纖維化程度，估算皮下組織之黏彈性。
1‧‧‧纖維化程度估算裝置
2‧‧‧黏彈性估算裝置
11‧‧‧CPU
12‧‧‧ROM
13‧‧‧黏彈性測定部
14‧‧‧纖維化程度顯示部
21‧‧‧CPU
22‧‧‧ROM
23‧‧‧纖維化程度測定部
24‧‧‧黏彈性顯示部
111‧‧‧數值化手段
112‧‧‧纖維化程度算出手段
121‧‧‧記憶手段
211‧‧‧數值化手段
212‧‧‧黏彈性算出手段
221‧‧‧記憶手段
[圖1]為表示隨著老化而全身之氧飽和度降低的圖表。
[圖2]為表示隨著老化而局部組織之氧飽和度降低的圖表。
[圖3]設定通過傅立葉轉換影像(上半部分)之原點的直線，對於該直線的長度方向，將直線上的傅立葉轉換影像之功率作圖而獲得的波形(下半部分)。
[圖4]自傅立葉轉換影像(上半部分)切出中心包含其原點的矩形區域影像，將切出的矩形區域影像的短徑(縱)方向之功率之平均值，對於略矩形區域影像的長徑(橫)方向作圖而獲得的波形(下半部分)。
[圖5]表示切出波形數據(上半部分)之傾斜部分(下半部 分)，對於構成波形的數據作成近似直線的示意圖。
[圖6]拍攝於通常氧狀態或低氧狀態培養的含有膠原蛋白的組成物中的膠原蛋白纖維之電子顯微鏡拍攝影像。
[圖7]為表示二維空間頻率功率譜的傅立葉轉換影像。選擇影像所顯示的長方形區域，針對此區域獲得波形數據。
[圖8]為表示由傅立葉轉換影像選擇的區域中的二維空間頻率功率譜之功率的波形。
[圖9]表示波形之傾斜部分中的構成波形的數據及針對該數據算出的近似直線。
[圖10]為將圖9所示的近似直線與構成波形的數據之功率之差分(△功率)於縱軸作圖的圖表。
[圖11]為顯示於通常之氧濃度條件及低氧條件所培養的細胞中的皮下脂肪細胞之纖維結構的不同的顯微鏡照片。
[圖12]為表示於通常之氧濃度條件及低氧條件所培養的細胞中的vegf基因、col1a1基因、col3a1基因、tgf-β基因、及lox基因之表現量的長條圖。
[圖13]為表示添加肥皂草(Saponaria officinalis)葉萃取物或葡萄葉萃取物，並於低氧條件培養的細胞中的lox基因之表現量的長條圖。
[圖14]為表示於通常之氧濃度條件及低氧條件所培養的細胞中的緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因、及鈣黏蛋白基因之表現量的長條圖。
[圖15]為表示添加西洋薄荷(Mentha piperita)葉萃取物或虎耳草(Saxifraga)萃取物，並於低氧條件所培養的細胞中的密連蛋白基因之表現量的長條圖。
[圖16]為表示局部組織之氧飽和度與皮下組織之黏彈性之相關關係的圖表。
[圖17]為表示本發明之纖維化程度估算裝置之一實施形態的硬體方塊圖。
[圖18]為表示本發明之黏彈性估算裝置之一實施形態的硬體方塊圖。
[圖19]為用以評價皮下脂肪細胞之纖維化程度所使用的藉由電子顯微鏡取得的基準照片。纖維化之進行程度最低者為分數1的照片，纖維化之進行程度最高者為分數5的照片。
[圖20]為表示觀察9名供給者(donor)的皮下脂肪細胞，並基於基準照片評分的結果的散布圖。
[圖21]為顯示藉由彈性成像解析所獲得的皮膚之內部剖面中的黏彈性之分布的成像影像。
[圖22]為顯示藉由超音波解析所獲得的皮下脂肪層中的纖維化狀態的影像、及藉由影像處理所獲得的直方圖。(A)表示纖維化之程度低的影像、(B)表示纖維化程度高的影像。又，(C)表示對應(A)之直方圖的偏度大的影像、(D)表示對應(B)之直方圖的偏度小的影像。
[圖23]為表示對於試驗例11之解析結果的回歸分析之結果的圖表。
[用以實施發明的形態]
解決第一~第三課題的本發明為一種改善因低氧條件及/或老化所致之皮膚狀態或機能的成分之篩選方法，其係以包含受測成分的培養基，於低氧條件下培養細胞，並將培養系 統的狀態之變化作為指標。
其中，「培養系統的狀態之變化」係指於指定條件下培養的細胞內的皮膚狀態關連基因之表現的變化、及細胞之培養液或支架(scaffold)等細胞外的環境之變化。
又，所謂「皮膚之狀態或機能」係皮膚之皺紋、鬆弛或張力降低、膠原蛋白結構之變化(包含纖維化)、障壁機能等。
以下，各自詳細地說明對應各課題的本發明之實施形態。
<1>篩選方法
解決第一課題的本發明係篩選抑制因於低氧條件進行的膠原蛋白纖維之交聯化所致的膠原蛋白結構之惡化的成分的方法。又，因隨著老化而組織處於低氧條件(非專利文獻3)，本發明亦可將抑制因老化所致的膠原蛋白結構之惡化的成分作為篩選對象。
此外，骨、齒、軟骨、脂肪、腱、韌帶、真皮、皮下組織等之結締組織之主成分為膠原蛋白。因此，本發明可應用於抑制結締組織之膠原蛋白結構之惡化的成分之篩選方法。
尤其，若真皮組織之膠原蛋白纖維的交聯進展，膠原蛋白結構惡化，則以皮膚之皺紋、鬆弛或張力降低為代表的老化係進展。
據此，本發明較佳係應用於抗老化成分之篩選方法，更具體而言，係應用於伴隨老化的皺紋、鬆弛或張力降低之改善或預防成分之篩選方法。
以下，針對本發明之構成加以詳述。
(1)含有膠原蛋白之組成物
於本發明，使用分散有細胞之含有膠原蛋白的組成物。含有膠原蛋白的組成物係含有膠原蛋白之組成物，且只要不為如抑制細胞培養的組成者，則其具體的構成並未限定。
含有膠原蛋白的組成物較佳為包含用以細胞培養之各種成分。可例示例如：MEM(最低必需培養基(Minimum Essential Medium))、BME(伊格爾基本培養基(Basal Medium Eagle))、DMEM(達爾伯克氏改良之伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium))、EMEM(伊格爾氏最低必需培養基(Eagle's minimal essential medium))、IMDM(伊斯科夫氏改良之達爾伯克氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium))、GMEM(格拉斯科氏MEM(Glasgow's MEM))、F12(漢姆氏F12培養基(Ham's F12 Medium))、DMEM/F12、RPMI1640、BMOC-3(布林斯特氏BMOC-3培養基(Brinster's BMOC-3 Medium))、CMRL-1066、L-15培養基(萊柏維茲氏L-15培養基(Leibovitz's L-15 medium))、邁克伊氏5A(McCoy’s 5A)、Media 199、MEM αMedia、MCDB105、MCDB131、MCDB153、MCDB201、威廉斯氏培養基E(Williams’medium E)等細胞培養常用的基本培養基；FBS等之血清；KSR等之血清代替品；NaHCO3、HEPES等之緩衝劑；在pH調製之目的下的鹼或酸；FGF等之各種成長因子等。
依分散於含有膠原蛋白的組成物的細胞之種類，可適當選擇上述任意成分之種類及其濃度。
含有膠原蛋白的組成物可為液體狀，亦可為凝膠狀。由活體內的膠原蛋白之存在態樣，更具體而言，由接近結締 組織之態樣的觀點來看，含有膠原蛋白的組成物較佳為作成膠原蛋白凝膠之形態。
含有膠原蛋白的組成物中所含的膠原蛋白之種類並未特別限定，但較佳可例示第I型~第III型、第V型、第XI型等之纖維性膠原蛋白。膠原蛋白可由動物之皮膚等之結締組織萃取而獲得。
就膠原蛋白而言，可無特別限制地使用市售品。可列舉例如：去端肽膠原蛋白/天然膠原蛋白酸性溶液(Atelocollagen/Native Collagen Acidic Solutions)(高研社股份有限公司製)、Cellmatrix Type I-A(Nitta Gelatin股份有限公司製)、源自牛真皮的膠原蛋白第III型(Nippi股份有限公司製)等。
含有膠原蛋白的組成物中的膠原蛋白之濃度並未特別限定，較佳為0.01~10質量%，更佳為0.05~8質量%，進一步較佳為0.1~5質量%，進一步較佳為0.3~2質量%，進一步較佳為0.5~1.5質量%。
(2)細胞
分散於含有膠原蛋白的組成物的細胞之種類並未特別限定，可使用自活體採取的初代培養細胞、株化培養細胞。
此外，膠原蛋白為結締組織之主要成分。因此，由使作為再現活體中的結締組織的模式之精密度提升的觀點來看，較佳為使用纖維母細胞、網狀細胞、組織細胞(histiocyte)、漿細胞、淋巴球、脂肪細胞、肥胖細胞、顆粒性白血球、色素細胞等之結締組織細胞，其中特佳為使用纖維母細胞。
關於此等細胞，已市售有初代培養細胞或株化細胞，可無限制地將其使用於本發明。
分散於含有膠原蛋白的組成物的細胞之數目並未特別限定。就含有膠原蛋白的組成物之每1mL之細胞數而言，可將較佳為1×102個~1×106個，更佳為1×103個~1×105個，進一步較佳為5×103個~5×104個作為基準。
含有膠原蛋白的組成物之調製方法並未特別限定。
較佳為藉由下述而調製含有膠原蛋白的組成物：首先，調製構成含有膠原蛋白的組成物之膠原蛋白溶液，於其中添加另外準備的細胞之懸浮液而混合。
(3)受測成分
將受測成分添加於含有膠原蛋白的組成物之際之態樣並未限定。較佳為作成將包含受測成分的溶液添加至含有膠原蛋白的組成物的形態。包含受測成分的溶液，較佳為包含：與含有膠原蛋白的組成物之調製所使用者相同之基本培養基或血清等之培養基成分。
將含有膠原蛋白的組成物作成膠原蛋白凝膠之形態而實施本發明的情形，較佳為將含有膠原蛋白的組成物凝膠化前之溶液填充至培養容器，於CO2培養箱內靜置數小時，成為完全凝膠化的狀態後，添加受測成分。
又，較佳於受測成分之添加前，使含有凝膠化的膠原蛋白的組成物自培養容器之內壁剝離後添加受測成分。
相對於含有膠原蛋白的組成物，受測成分之溶液之添加量亦未特別限定。受測成分之溶液相對於含有膠原蛋白的組 成物的體積比可將較佳為0.1~10，更佳為0.2~5，進一步較佳為0.3~2作為基準。
(4)培養
受測成分之添加後，將含有膠原蛋白的組成物於低氧條件下培養。
於通常之細胞培養中的CO2培養箱，氧濃度為18~19%左右，因此於較其更低的氧濃度下培養。具體而言，於較佳為15%以下，更佳為10%以下，更佳為7%以下，進一步較佳為5%以下，進一步較佳為3%以下之氧濃度下培養。
氧濃度之下限，只要分散於含有膠原蛋白的組成物的細胞不死亡，則並未特別限制，但較佳為0.1%以上，更佳為0.5%以上之氧濃度。
於低氧條件之培養中，可使用除了碳酸氣體之外，亦一併設有氮氣或混合氣體等之高壓罐的低氧濃度培養用CO2培養箱(例如，池本理化工業公司製)，亦可使用包含具備氣體濃度調節劑的氣體障壁性袋的低氧培養器具(例如，Sugiyama Giken製)。
培養期間並未特別限制，可考慮分散於含有膠原蛋白的組成物的細胞之種類或數量、基於此所預測達到鋪滿(confluent)的時間等而適當設計。具體而言，可將較佳為12小時~10日、更佳為1日~9日、進一步較佳以3日~8日作為基準。
於此培養期間中，可使用包含受測成分的培養基而進行培養基交換。
此外，作為對照，較佳為未添加受測成分而培養含有膠原蛋白的組成物。藉由與對照之比較，而後述的膠原蛋白纖維之集束度之上升減少效果的確認變得容易。
(5)膠原蛋白纖維之集束度之觀察
於活體內，隨著老化而結締組織之膠原蛋白之交聯進展，膠原蛋白纖維之集束度提升。將分散有細胞之含有膠原蛋白的組成物於低氧條件下培養時，亦與於此活體內的現象相同，含有膠原蛋白的組成物中之膠原蛋白纖維之集束度上升。
於本發明，將添加受測成分時之含有膠原蛋白的組成物中的膠原蛋白纖維之集束度的上升減少效果作為指標。
培養後之含有膠原蛋白的組成物中的膠原蛋白纖維之集束度的確認方法並未特別限定，但較佳可例示利用顯微鏡，尤其是利用電子顯微鏡的觀察。
就電子顯微鏡而言，使用掃描式電子顯微鏡(SEM)、穿透式電子顯微鏡(TEM)、及掃描穿透式電子顯微鏡(STEM)之任一者皆無妨。
於本發明，較佳為設成基於顯微鏡拍攝影像，而評價含有膠原蛋白的組成物中的膠原蛋白纖維之集束度的形態。
以顯微鏡觀察時，膠原蛋白纖維看起來如成束而凝集之處即為膠原蛋白纖維之集束部分。觀察此集束部分之數目或大小等，於其程度大的情形，可評價為集束度高。
基於顯微鏡拍攝影像的評價的實施形態並未特別限制。
例如，可設成基於事先準備的基準照片，而官能性地評價集 束度的形態。
又，亦可設成對顯微鏡拍攝影像施加影像解析處理，基於將膠原蛋白纖維之集束度定量化的影像解析處理結果，而評價集束度的形態。
其中所謂的影像解析處理之手法並未特別限定。於顯微鏡拍攝影像，集束部分有以高強度(高光度、高明度、高亮度等)表示的傾向。因此，藉由影像解析處理，而將強度(光度、明度、亮度等)之參數進行計算處理，藉此可定量地評價集束度。
以下，具體說明利用作為影像解析處理之傅立葉轉換處理的手法。
傅立葉轉換為周期性之評價手法。對二維的影像進行傅立葉轉換的情形，可獲得表示功率以濃淡表示的二維空間頻率功率譜的傅立葉轉換影像。此傅立葉轉換影像之中心為波數0之原點，越遠離原點的位置表示越高波數。
就傅立葉轉換之手法而言，可列舉離散傅立葉轉換(DFT)、減少演算量的快速傅立葉轉換(FFT)等。
此外，能以傅立葉轉換處理者通常為灰階的影像，因此較佳為將顯微鏡拍攝影像變換為灰階後，進行傅立葉轉換。
接著，基於傅立葉轉換影像，獲得與功率之波形有關的數據。
功率之波形可藉由以下之任一方法算出。
(i)設定至少通過傅立葉轉換影像之原點的直線，對於該直線之長度方向，將該直線上的該傅立葉轉換影像之功率作圖而獲得(於圖3顯示示意圖)。
(ii)由傅立葉轉換影像，將至少包含該原點的略矩形區域影 像切出，將切出的略矩形區域影像之短徑方向的功率之平均值，對於該略矩形區域影像的長徑方向作圖而獲得(於圖4顯示示意圖)。
於圖3及圖4之下半部分，縱軸為功率，但於傅立葉轉換影像，功率係藉由濃淡表現。據此，可基於傅立葉轉換影像之光度或亮度、明度，算出功率。
又，於圖3及圖4之下半部分，橫軸為頻率數，但因傅立葉轉換影像係呈數位影像而於電腦上處理，故係作為基於畫素(pixel)的位置情報而取得。
於為原始數據的顯微鏡拍攝影像，如上述，膠原蛋白結構之集束部分有以高光度、高明度或高亮度表示的傾向。即，膠原蛋白結構之集束度高的情形，變得於顯微鏡拍攝影像中高光度、高明度或高亮度之區域高頻度地出現。因此，於將其作傅立葉轉換的二維空間頻率功率譜，各頻率數的功率有變得容易發生離差的傾向。
據此，以波形表示的功率之離差之程度越高，可評價為原始數據的顯微鏡拍攝影像所表示的膠原蛋白纖維之集束度越高。
此離差之程度，藉由相對於波形之傾斜部分的近似直線(圖5)之構成波形的數據的離差可加以評價。
例如，算出近似直線與構成波形的數據之功率之差分(△功率)，藉由關於△功率之數據集合之標準偏差，可客觀地評價構成波形的數據之離差。
<2>膠原蛋白結構之惡化之抑制劑
於屬於錦葵科錦葵屬(Malvaceae Malva)的植物之萃取物， 有抑制因低氧條件或老化所致的膠原蛋白結構之惡化的效果。
即，屬於錦葵科錦葵屬的植物之萃取物於以膠原蛋白作為主成分的組織之骨、齒、軟骨、脂肪、腱、韌帶、真皮、皮下組織等之結締組織的機能降低的改善或預防上發揮效果。
又，若真皮組織之膠原蛋白結構惡化，則以皮膚之皺紋、鬆弛或張力降低為代表的老化係進展。
據此，於屬於錦葵科錦葵屬的植物之萃取物，伴隨抑制膠原蛋白結構之惡化的效果，可謂具有抗老化作用，更具體而言，可謂具有伴隨老化的皮膚之皺紋、鬆弛或張力降低的改善或預防效果。
就為本發明之有效成分的屬於錦葵科錦葵屬的植物而言，可列舉埃及錦葵(Malva aegyptia L.)、小錦葵(Malva alcea L.)、狹冠小錦葵(Malva alcea var.fastigiata(Cav.)K.Koch)、阿爾博雷亞錦葵(Malva arborea(L.)Webb & Berthel.)、朝天大錦(Malva assurgentiflora(Kellogg)M.F.Ray)、北方錦葵(Malva borealis Wallman)、加那利錦葵(Malva canariensis M.F.Ray)、華錦葵(Malva cathayensis M.G.Gilbert,Y.Tang & Dorr)、大葉錦葵(Malva cretica Cav.)、克里特島錦葵(Malva cretica subsp.althaeoides(Cav.)Dalby)、迪里厄錦葵(Malva durieui Spach)、直立錦葵(Malva erecta J.Presl & C.Presl)、西班牙錦葵(Malva hispanica L.)、小白錦葵((Malva iljinii Riedl)、林氏錦葵(Malva lindsayi(Moran)M.F.Ray)、麝香錦葵(Malva moschata L.)、多花錦葵(Malva multiflora(Cav.)Soldano,Banfi & Galasso)、圓葉錦葵(Malva neglecta Wallr.)、紅柄 錦葵(Malva nicaeensis All.)、西洋錦葵(Malva occidentalis(S.Watson)M.F.Ray)、太平洋錦葵(Malva pacifica M.F.Ray)、小花錦葵(Malva parviflora L.(兔葵))、澳洲錦葵(Malva preissiana Miq.)、假花錦葵(Malva pseudolavatera Webb & Berthel.)、圓葉錦葵(Malva pusilla Sm.)、托葉錦葵(Malva stipulacea Cav.)、近卵形錦葵(Malva subovata(DC.)Molero & J.M.Monts.)、歐錦葵(Malva sylvestris L.)、紫花錦葵(Malva sylvestris var.mauritiana(L.)Boiss.(錦葵))、Malva tournefortiana L.、冬葵(Malva verticillata L.)、Malva vidalii(Pau)Molero & J.M.Monts.等。
特佳可例示錦葵(Malva sylvestris var.mauritiana(L.)Boiss.)。
獲得屬於錦葵科錦葵屬的植物之萃取物之際之萃取部位並未特別限定，可使用選自植物之花、葉、莖、根、種子之1種或2種以上，而獲得萃取物。其中，特佳為由花獲得的萃取物。
本發明中的前述之植物之萃取物可使用於日本自然生長或繁殖的植物、作為漢方中草藥原料等販售的日本產者而製作萃取物，亦可購買由丸善股份有限公司等之銷售植物萃取物的公司所市售的萃取物而使用。
萃取之際，植物較佳為事先以進行粉碎或細切而使萃取效率提升的方式加工。萃取物係相對於植物或其乾燥物1質量份，添加溶媒1~30質量份，若於室溫則浸漬數日，若於沸點附近的溫度則浸漬數小時。浸漬後，冷卻至室溫，依期望去除不溶物後，可藉由減壓濃縮等而將溶媒去除。之後，以填充有矽膠 或離子交換樹脂的管柱層析等進行分級純化，可獲得期望的萃取物。
就萃取溶媒而言，較佳為極性溶媒，可較佳例示選自水、乙醇、異丙醇、丁醇等之醇類、1,3-丁二醇、聚丙二醇等之多元醇類、丙酮、甲基乙基酮等之酮類、二乙基醚、四氫呋喃等之醚類之1種至2種以上。
本發明較佳為作成外用劑或口服劑之形態。
就外用劑而言，可較佳例示化妝品、類藥品(quasi drug)、醫藥品等，於無損本發明之效果的限度下，亦可含有通常使用的任意成分。
就此種任意成分而言，較佳可例示例如：澳洲堅果油(macadamia nut oil)、鱷梨油、玉米油、橄欖油、菜籽油、芝麻油、蓖麻油、紅花油(safflower oil)、棉籽油、荷荷巴油、椰子油、棕櫚油、液態羊毛脂、硬化椰子油、硬化油、木蠟(Japan wax)、硬化蓖麻油、蜂蠟、小燭樹蠟(candelilla wax)、巴西棕櫚蠟(carnauba wax)、蟲蠟(insects wax)、羊毛脂、還原羊毛脂、硬質羊毛脂、荷荷巴蠟(jojoba wax)等之油、蠟類；液態石蠟、鯊烷(squalane)、姥鮫烷(pristane)、地蠟(ozokerite)、石蠟、地蠟精(ceresin)、凡士林、微晶蠟等之烴類；油酸、異硬脂酸、月桂酸、肉荳蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十二酸(behenic acid)、十一烯酸等之高級脂肪酸類；鯨蠟醇、硬脂醇、異硬脂醇、二十二醇、辛基十二醇、肉荳蔻醇、鯨蠟硬脂醇等之高級醇等；異辛酸鯨蠟酯、肉荳蔻酸異丙酯、異硬脂酸己基癸酯、己二酸二異丙酯、癸二酸二-2-乙基己酯、乳酸鯨蠟酯、蘋果酸二異硬脂酯、乙二醇二-2-乙基己酸酯、新戊二醇二癸酸酯、甘油二-2-庚基十 一酸酯、甘油三-2-乙基己酸酯、三羥甲基丙烷三-2-乙基己酸酯、三羥甲基丙烷三異硬脂酸酯、新戊四醇四-2-乙基己酸酯等之合成酯油類等之油劑類；脂肪酸皂(fatty acid soap)(月桂酸鈉、棕櫚酸鈉等)、月桂基硫酸鉀、烷基硫酸三乙醇胺醚等之陰離子界面活性劑類；氯化硬脂基三甲銨、氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)、氧化月桂胺等之陽離子界面活性劑類；咪唑啉系兩性界面活性劑(2-椰油基-2-咪唑啉氫氧化物-1-羧乙氧基二鈉鹽(2-cocoyl-2-imidazolinium hydroxide-1-carboxyethyloxy disodium salt)等)、甜菜鹼系界面活性劑(烷基甜菜鹼、醯胺甜菜鹼、磺基甜菜鹼等)、醯基甲基牛磺酸等之兩性界面活性劑類；山梨糖醇酐脂肪酸酯類(山梨糖醇酐單硬脂酸酯、山梨糖醇酐倍半油酸酯(sorbitan sesquioleate)等)、甘油脂肪酸類(甘油單硬脂酸酯等)、丙二醇脂肪酸酯類(丙二醇單硬脂酸酯等)、硬化蓖麻油衍生物、甘油烷基醚、POE山梨糖醇酐脂肪酸酯類(POE山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧伸乙基山梨糖醇酐單硬脂酸酯等)、POE山梨糖醇脂肪酸酯類(POE-山梨糖醇單月桂酸酯等)、POE甘油脂肪酸酯類(POE-甘油單異硬脂酸酯等)、POE脂肪酸酯類(聚乙二醇單油酸酯、POE二硬脂酸酯等)、POE烷基醚類(POE2-辛基十二基醚等)、POE烷基苯基醚類(POE壬基苯基醚等)、Pluronic型類、POE‧POP烷基醚類(POE‧POP2-癸基十四基醚等)、Tetronic類、POE蓖麻油‧硬化蓖麻油衍生物(POE蓖麻油、POE硬化蓖麻油等)、蔗糖脂肪酸酯、烷基葡萄糖苷等之非離子界面活性劑類；聚乙二醇、甘油、赤藻糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、丙二醇、2,4-己二醇等之多元醇類；吡咯啶酮甲酸鈉(sodium pyrrolidone carboxylate)、乳酸、乳酸鈉等之保濕成 分類；對胺苯甲酸系紫外線吸收劑；鄰胺苯甲酸系紫外線吸收劑；水楊酸系紫外線吸收劑；桂皮酸系紫外線吸收劑；二苯基酮系紫外線吸收劑；糖系紫外線吸收劑；2-(2'-羥基-5'-三級辛基苯基)苯并三唑、4-甲氧基-4'-三級丁基二苯甲醯甲烷等之紫外線吸收劑類；乙醇、異丙醇等之低級醇類苯氧基乙醇等之抗菌劑等。
就口服劑而言，可例示例如，糕點或麵包、麵等之一般食品、採取飲料製劑、膠囊劑或錠劑之形態之具有增進健康之目的的食品群(例如，特定保健用食品等)、採取顆粒劑、粉末劑、膠囊劑或錠劑之形態的經口投予醫藥品等。
於作成口服劑之形態的情形，可含有可容許的任意成分。就此種任意成分而言，若為食品，可較佳例示鹽、砂糖、麩胺酸鈉、肌苷酸鈉、醋等之調味成分、著色成分、香料等之矯臭成分、增黏劑、乳化‧分散劑、保存料、安定劑、各種維生素類等；若為具有增進健康之目的的食品群或醫藥品，較佳可例示結晶纖維素、乳糖等之賦形劑、阿拉伯膠或羥丙基纖維素等之黏合劑、交聯羧甲基纖維素鈉(croscarmellose sodium)、澱粉等之崩散劑、硬脂酸鎂等之助滑劑、矯味、矯臭劑、著色劑、各種維生素類等。藉由按照通常方法處理此等，可製造本發明之經口投予組成物。
口服劑中的前述植物之萃取物之總含量，就固體含量而言，可作成0.05~100質量%，更佳為30~80質量%。
又，就固體含量而言，較佳為設成將前述植物之萃取物每1日10~1000mg以1次或分數次飲用的形態。
解決第二課題的本發明係篩選抑制於低氧條件進行的皮下脂肪細胞之纖維化的成分的方法。又，隨著老化而組織 處於低氧條件，因此本發明亦可將抑制因老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分作為篩選對象。
其中，「纖維化」係指因包圍組織的膠原蛋白之異常增加、或膠原蛋白纖維彼此交聯，而組織變硬的現象。
就纖維化之要因而言，可假設膠原蛋白本身之表現量的增加、與膠原蛋白纖維結構之交聯反應有關的基因之表現量的增加，而本發明者之深入研究的結果，清楚得知於低氧條件所發生的皮下脂肪細胞之纖維化與lox基因之表現量的上升密切相關。
為lox基因之產物的LOX(離胺酸氧化酶)，係催化於膠原蛋白與彈性蛋白前驅物之離胺酸殘基形成醛基的反應的細胞外酵素。此等醛係反應性高，與源自其它之氧化離胺酸的醛基或無修飾之離胺酸殘基發生自發性化學反應。其結果，產生對於膠原蛋白纖維之安定化、成熟彈性蛋白之完全性與彈性為重要的膠原蛋白與彈性蛋白之交聯。
lox基因本身對於組織之安定化發揮重要作用，但因表現亢進而使纖維化發生。如上述，低氧下的皮下脂肪細胞之纖維化，要因並非膠原蛋白之表現上升，而為lox基因之表現上升。因此，抑制低氧條件下的lox基因之表現上升的成分，即可謂為抑制因低氧條件或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分。
由以上，本發明之必須的構成，係以於低氧條件培養的細胞中的lox基因之表現上升的減少效果作為指標。
如上述，皮下脂肪細胞係隨著老化(動脈血中之氧濃度的降低)而纖維化進行。據此，本發明可適合應用於抑制因低氧條件及/或老化所致之皮下脂肪細胞之纖維化的成分之篩選方 法。
又，若皮下脂肪層中的包覆脂肪細胞的膠原蛋白纖維結構之纖維化進展，則皮下組織之物理學的特性惡化，支撐皮膚重量變得困難，而以皮膚之鬆弛為代表的老化進展。
據此，本發明較佳為應用於抗老化成分之篩選方法，更具體而言，應用於伴隨老化的鬆弛之改善或預防成分之篩選方法。
以下，對於本發明之具體的構成加以說明。
本發明所使用的細胞可為已建立的培養細胞株，又，亦可為初代培養細胞。
細胞之種類亦未特別限定，較佳使用脂肪細胞。可為褐色脂肪細胞，亦可為白色脂肪細胞，但較佳使用白色脂肪細胞。
可將藉由使皮下脂肪前驅細胞分化而獲得之成熟的皮下脂肪細胞用於本發明。
細胞培養所使用的培養基可無限制地使用適合於所使用的細胞之周知者。使皮下脂肪前驅細胞分化為皮下脂肪細胞的情形所使用的增殖培養基、分化培養基、維持培養基可為周知之任一者，亦可使用市售之套組。
於本發明，必須於低氧條件培養細胞。於通常之細胞培養中的CO2培養箱，氧濃度為18~19%左右，因此於較其更低的氧濃度下培養細胞。具體而言，較佳為於15%以下，更佳為10%以下，更佳為7%以下，進一步較佳為5%以下，進一步較佳為3%以下之氧濃度下培養細胞。
氧濃度之下限，只要培養細胞不死亡，則並未特別限制，但較佳為於0.1%以上，更佳為0.5%以上之氧濃度下培養細胞。
於低氧條件之細胞培養中，可使用除了碳酸氣體之 外，亦一併設有氮氣或混合氣體等之高壓罐的低氧濃度培養用CO2培養箱(例如，池本理化工業公司製)，亦可使用包含具備氣體濃度調節劑的氣體障壁性袋的低氧培養器具(例如，Sugiyama Giken製)。
於本發明，將受測成分添加至低氧條件下培養的細胞之培養基中，繼續指定期間培養後，測定lox基因之表現量。
lox基因之表現量之測定方法並未限定，較佳可例示藉由RT-PCR測定回收的細胞中的lox基因之mRNA量的方法。
若於低氧條件培養細胞，則lox基因之表現量上升。於本發明，將受測成分添加至培養基時，於低氧條件中的lox基因之表現上升的程度減少的情形，判定該受測成分為抑制因低氧條件及/或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分而加以選擇。
為了正確判定受測成分是否具有低氧條件中的lox基因之表現上升的減少效果，較佳為亦實施對照實驗。
即，將於受測成分之不存在下且於低氧條件培養的細胞作為對照，而比較於受測成分之存在下且於低氧條件下所培養的細胞中的lox基因之表現量。較佳為相較於前者，後者的lox基因之表現量更低的情形，將該受測成分判定為抑制因低氧條件及/或老化所致的組織之纖維化的成分。
除了lox基因之表現量之測定之外，為了確認細胞發生缺氧反應，較佳係亦測定為缺氧反應的標記之vegf基因之表現量。
若可確認vegf基因之表現量與於通常之氧濃度培養細胞時相比為更高，可評價為試驗系統適當，並可使篩選之正確性提升。
若依據本發明之篩選方法，可篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分。而且，本發明亦關於包含藉由上述篩選方法所發現的成分作為有效成分的藥劑。
就抑制因低氧條件及/或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分而言，可列舉屬於石竹科肥皂草屬(Caryophyllaceae Saponaria)的植物之萃取物。
就屬於石竹科肥皂草屬的植物而言，並未特別限定，但可例示肥皂草(Saponaria officinalis)。
本發明中的前述植物之萃取物可使用於日本或外國自然生長或繁殖的植物、作為漢方中草藥原料等販售者而製作萃取物，亦可購買由丸善股份有限公司等之銷售植物萃取物的公司所市售的萃取物而使用。
植物萃取物係設成不僅意指植物萃取物本身，亦意指萃取物的流份(fraction)、純化的流份、萃取物乃至流份、純化物之溶媒去除物的總稱，源自植物的萃取物可列舉使用自然生長或繁殖的植物、作為漢方中草藥原料等所販售者的萃取物、市售的萃取物等。
萃取操作除了使用植物部位的整株植物之外，亦可使用植物體、地上部、根莖部、樹幹部、葉部、莖部、花穂、花蕾等之部位，較佳為事先將此等粉碎或細切而使萃取效率提升。
就萃取溶媒而言，可例示選自水、乙醇、異丙醇、丁醇等之醇類；1,3-丁二醇、聚丙二醇等之多元醇類；丙酮、甲基乙基酮等之酮類；二乙基醚、四氫呋喃等之醚類等之極性溶媒的1種至2種以上作為適合者。
就具體的萃取方法而言，可列舉例如：相對於植物 體等之萃取所使用的部位或其乾燥物1質量份，添加1~30質量份之溶媒，若為室溫則浸漬數日，若為沸點附近之溫度則浸漬數小時，冷卻至室溫後，依期望去除不溶物及/或溶媒，以管柱層析法等加以分級純化的方法。
本發明之藥劑較佳為與製劑化所使用的任意之成分適當組合，而作成外用劑或口服劑之形態。
就外用劑而言，可列舉例如化妝品、類藥品、皮膚外用醫藥等之形態。又，彼等之劑型並未特別限制。其中，由與改善或預防伴隨老化的皮膚之鬆弛這樣的用途之關係來看，較佳為可繼續使用的化妝品之形態，其中，較佳為化妝水、美容液、乳液、乳霜、凝膠、防曬品等之形態。
又，作成口服劑的情形，較佳為作成包含本發明之藥劑作為有效成分的食品用組成物之形態。更具體而言，較佳為作成一般食品、具有錠劑、顆粒劑、飲料劑等之劑型的營養補充品之形態。
外用劑中的植物萃取物之含量(萃取物的情形為乾燥質量)，通常為0.00001質量%以上，較佳為0.0001質量%以上，更佳為0.001質量%以上，且通常為80質量%以下，較佳為30質量%以下，更佳為10質量%以下。
又，於口服劑的情形，因應劑型，每1次之攝取量就萃取物之乾燥質量而言，通常為0.1mg以上，較佳為1mg以上，更佳為10mg以上，且通常為2000mg以下，較佳為1000mg以下，更佳為500mg以下。
作成化妝品的形態的情形，可含有通常於化妝品使用的任意成分。就任意成分而言，可列舉聚乙二醇、甘油、1,3- 丁二醇、赤藻糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、丙二醇、二丙二醇、二甘油、異戊二醇(isoprene glycol)、1,2-戊二醇、2,4-己二醇、1,2-己二醇、1,2-辛二醇等之多元醇；脂肪酸皂(月桂酸鈉、棕櫚酸鈉等)、月桂基硫酸鉀、烷基硫酸三乙醇胺醚等之陰離子界面活性劑類；氯化硬脂基三甲銨、氯化苄烷銨、氧化月桂胺等之陽離子界面活性劑類；咪唑啉系兩性界面活性劑(2-椰油基-2-咪唑啉氫氧化物-1-羧乙氧基二鈉鹽等)、甜菜鹼系界面活性劑(烷基甜菜鹼、醯胺甜菜鹼、磺基甜菜鹼等)、醯基甲基牛磺酸等之兩性界面活性劑類；山梨糖醇酐脂肪酸酯類(山梨糖醇酐單硬脂酸酯、山梨糖醇酐倍半油酸酯等)、甘油脂肪酸類(甘油單硬脂酸酯等)、丙二醇脂肪酸酯類(丙二醇單硬脂酸酯等)、硬化蓖麻油衍生物、甘油烷基醚、POE山梨糖醇酐脂肪酸酯類(POE山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧伸乙基山梨糖醇酐單硬脂酸酯等)、POE山梨糖醇脂肪酸酯類(POE-山梨糖醇單月桂酸酯等)、POE甘油脂肪酸酯類(POE-甘油單異硬脂酸酯等)、POE脂肪酸酯類(聚乙二醇單油酸酯、POE二硬脂酸酯等)、POE烷基醚類(POE2-辛基十二基醚等)、POE烷基苯基醚類(POE壬基苯基醚等)、Pluronic型類、POE‧POP烷基醚類(POE‧POP2-癸基十四基醚等)、Tetronic類、POE蓖麻油‧硬化蓖麻油衍生物(POE蓖麻油、POE硬化蓖麻油等)、蔗糖脂肪酸酯、烷基葡萄糖苷等之非離子界面活性劑類；吡咯啶酮甲酸鈉、乳酸、乳酸鈉等之保濕成分類；可經表面處理之雲母、滑石、高嶺土、合成雲母、碳酸鈣、碳酸鎂、無水矽酸(二氧化矽)、氧化鋁、硫酸鋇等之粉體類；可經表面處理之氧化鈷、群青、普魯士藍、氧化鋅之無機顏料類；可經表面處理之氧化鐵二氧化鈦燒結體等之複合顏料；可經表面處理 之雲母鈦、魚鱗箔(fish scale foil)、氧氯化鉍(III)(bismuth oxychloride)等之珠光劑(pearling agent)類；可經色澱化的紅色202號、紅色228號、紅色226號、黃色4號、藍色404號、黃色5號、紅色505號、紅色230號、紅色223號、橙色201號、紅色213號、黃色204號、黃色203號、藍色1號、綠色201號、紫色201號、紅色204號等之有機色素類；聚乙烯粉末、聚甲基丙烯酸甲酯、耐綸粉末、有機聚矽氧彈性體等之有機粉體類；乙醇、異丙醇等之低級醇類；維生素A或其衍生物、維生素B6鹽酸鹽、維生素B6三棕櫚酸酯、維生素B6二辛酸酯、維生素B2或其衍生物、維生素B12、維生素B15或其衍生物等之維生素B類、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、維生素E乙酸酯等之維生素E類、維生素D類、維生素H、泛酸、泛雙硫醇(pantethine)、吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)等之維生素類。
解決第三課題之本發明為篩選抑制於低氧條件進行的表皮之細胞黏著器之機能的降低的成分之方法。又，隨著老化而組織處於低氧條件，因此本發明亦可將抑制因老化所致的表皮之細胞黏著器之機能降低的成分作為篩選對象。
本發明之必須的構成，係以選自於低氧條件培養的細胞中的緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因及鈣黏蛋白基因的基因之表現降低的抑制效果作為指標。
藉由設成以此等4種之基因中2種以上、更佳為3種以上、進一步較佳為全部種類之表現降低的抑制效果作為指標的形態，可精密度更佳地進行篩選。
表皮之細胞黏著器，特別是緊密連結機能，係於皮 膚之障壁機能上發揮重要作用。
據此，本發明較佳應用於抗老化成分之篩選方法，更具體而言，應用於伴隨老化的皮膚障壁機能之降低的改善或預防成分之篩選方法。
以下，對於本發明之具體的構成加以說明。
本發明所使用的細胞可為已建立的培養細胞株，又，亦可為初代培養細胞。細胞之種類亦未特別限定，但較佳使用角質細胞。
細胞培養所使用的培養基可無限制地使用適合於所使用的細胞的周知者。
又，於本發明，可使用自活體採取的皮膚、或使用培養皮膚三維模式。就皮膚而言，較佳為視期望去除體毛並自活體採取的皮膚片段，且為去除角層等之包含表皮顆粒層、表皮基底層及真皮部分者，較佳為小鼠、大鼠、天竺鼠、豬、兔之皮膚片段。
就培養皮膚三維模式而言，較佳為培養自人類或除了人類以外的動物之皮膚採取之正常(未癌化)的角質細胞、纖維母細胞等之皮膚細胞，並構築三維結構使其疑似皮膚結構者，亦可購買此種形態之市售品來使用。就較佳市售品而言，可適當例示例如由倉敷紡績股份有限公司所販售的「EPI-200」(正常培養人類三維皮膚模式)等。
於本發明，必須於低氧條件培養細胞。於通常之細胞培養中的CO2培養箱，氧濃度為18~19%左右，因此於較其更低的氧濃度下培養細胞。具體而言，較佳為於15%以下，更佳為10%以下，更佳為7%以下，進一步較佳為5%以下，進一步較佳為3%以下之氧濃度下培養細胞。
氧濃度之下限，只要培養細胞不死亡，則並未特別限制，但較佳為於0.1%以上，更佳為於0.5%以上之氧濃度下培養細胞。
於低氧條件之細胞培養中，可使用除了碳酸氣體之外，亦一併設有氮氣或混合氣體等之高壓罐的低氧濃度培養用CO2培養箱(例如，池本理化工業公司製)，亦可使用包含具備氣體濃度調節劑的氣體障壁性袋的低氧培養器具(例如，Sugiyama Giken製)。
於本發明，將受測成分添加至低氧條件下培養的細胞之培養基中，繼續指定期間培養後，測定選自緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因及鈣黏蛋白基因的基因之表現量。
此等基因之表現量之測定方法並未限定，較佳可例示藉由RT-PCR測定回收的細胞中的此等基因之mRNA量的方法。
若於低氧條件培養細胞，則緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因及鈣黏蛋白基因之表現量降低。於本發明，將受測成分添加至培養基時，於低氧條件中的選自此等基因群的至少1種、較佳為2種、更佳為3種、進一步較佳為4種之基因之表現降低的程度減少的情形，判定該受測成分為抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之細胞黏著器機能的降低的成分而加以選擇。
為了正確判定受測成分是否具有低氧條件中的此等基因之表現降低的抑制效果，較佳為亦實施對照實驗。
即，將於受測成分之不存在下且於低氧條件培養的細胞作為對照，而比較於受測成分之存在下且於低氧條件下所培養的細胞中的此等基因之表現量。較佳為相較於前者，後者的此等基因之表現量更高的情形，將該受測成分判定為抑制因低氧條件及/或 老化所致的表皮之細胞黏著器之機能降低的成分。
若依據本發明之篩選方法，可篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的細胞黏著器之機能降低的成分。而且，本發明亦關於包含藉由上述篩選方法所發現的成分作為有效成分的藥劑。
就抑制因低氧條件及/或老化所致的細胞黏著器之機能降低的成分而言，可列舉屬於唇形花科薄荷屬(Lamiaceae Mentha)的植物之萃取物。
就屬於唇形花科薄荷屬的植物而言，並未特別限定，但可例示西洋薄荷(Mentha piperita)。
本發明中的前述植物之萃取物可使用於日本或外國自然生長或繁殖的植物、作為漢方中草藥原料等販售者而製作萃取物，亦可購買由丸善股份有限公司等之銷售植物萃取物的公司所販售的萃取物而使用。
植物萃取物係設成不僅意指植物萃取物本身，亦意指萃取物的流份、純化的流份、萃取物乃至流份、純化物之溶媒去除物的總稱，源自植物的萃取物可列舉使用自然生長或繁殖的植物、作為漢方中草藥原料等所販售者的萃取物、市售的萃取物等。
萃取操作除了使用植物部位的整株植物之外，亦可使用植物體、地上部、根莖部、樹幹部、葉部、莖部、花穂、花蕾等之部位，較佳為事先將此等粉碎或細切而使萃取效率提升。
就萃取溶媒而言，可例示選自水、乙醇、異丙醇、丁醇等之醇類；1,3-丁二醇、聚丙二醇等之多元醇類；丙酮、甲基乙基酮等之酮類；二乙基醚、四氫呋喃等之醚類等之極性溶媒的1種至2種以上作為適合者。
就具體的萃取方法而言，可列舉例如：相對於植物體等之萃取所使用的部位或其乾燥物1質量份，添加1~30質量份之溶媒，若為室溫則浸漬數日，若為沸點附近之溫度則浸漬數小時，冷卻至室溫後，依期望去除不溶物及/或溶媒，以管柱層析法等加以分級純化的方法。
本發明之藥劑較佳為與製劑化所使用的任意之成分適當組合，而作成外用劑或口服劑之形態。
就外用劑而言，可列舉例如化妝品、類藥品、皮膚外用醫藥等之形態。又，彼等之劑型並未特別限制。其中，由與改善或預防伴隨老化的皮膚之鬆弛這樣的用途之關係來看，較佳為可繼續使用的化妝品之形態，其中，較佳為化妝水、美容液、乳液、乳霜、凝膠、防曬品等之形態。
又，作成口服劑的情形，較佳為作成包含本發明之藥劑作為有效成分的食品用組成物之形態。更具體而言，較佳為作成一般食品、具有錠劑、顆粒劑、飲料劑等之劑型的營養補充品之形態。
外用劑中的植物萃取物之含量(萃取物的情形為乾燥質量)，通常為0.00001質量%以上，較佳為0.0001質量%以上，更佳為0.001質量%以上，且通常為80質量%以下，較佳為30質量%以下，更佳為10質量%以下。
又，於口服劑的情形，因應劑型，每1次之攝取量就萃取物之乾燥質量而言，通常為0.1mg以上，較佳為1mg以上，更佳為10mg以上，且通常2000mg以下，較佳為1000mg以下，更佳為500mg以下。
作成化妝品的形態的情形，可含有通常於化妝品使 用的任意成分。就任意成分而言，可列舉聚乙二醇、甘油、1,3-丁二醇、赤藻糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、丙二醇、二丙二醇、二甘油、異戊二醇、1,2-戊二醇、2,4-己二醇、1,2-己二醇、1,2-辛二醇等之多元醇；脂肪酸皂(月桂酸鈉、棕櫚酸鈉等)、月桂基硫酸鉀、烷基硫酸三乙醇胺醚等之陰離子界面活性劑類；氯化硬脂基三甲銨、氯化苄烷銨、氧化月桂胺等之陽離子界面活性劑類；咪唑啉系兩性界面活性劑(2-椰油基-2-咪唑啉氫氧化物-1-羧乙氧基二鈉鹽等)、甜菜鹼系界面活性劑(烷基甜菜鹼、醯胺甜菜鹼、磺基甜菜鹼等)、醯基甲基牛磺酸等之兩性界面活性劑類；山梨糖醇酐脂肪酸酯類(山梨糖醇酐單硬脂酸酯、山梨糖醇酐倍半油酸酯等)、甘油脂肪酸類(甘油單硬脂酸酯等)、丙二醇脂肪酸酯類(丙二醇單硬脂酸酯等)、硬化蓖麻油衍生物、甘油烷基醚、POE山梨糖醇酐脂肪酸酯類(POE山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧伸乙基山梨糖醇酐單硬脂酸酯等)、POE山梨糖醇脂肪酸酯類(POE-山梨糖醇單月桂酸酯等)、POE甘油脂肪酸酯類(POE-甘油單異硬脂酸酯等)、POE脂肪酸酯類(聚乙二醇單油酸酯、POE二硬脂酸酯等)、POE烷基醚類(POE2-辛基十二基醚等)、POE烷基苯基醚類(POE壬基苯基醚等)、Pluronic型類、POE‧POP烷基醚類(POE‧POP2-癸基十四基醚等)、Tetronic類、POE蓖麻油‧硬化蓖麻油衍生物(POE蓖麻油、POE硬化蓖麻油等)、蔗糖脂肪酸酯、烷基葡萄糖苷等之非離子界面活性劑類；吡咯啶酮甲酸鈉、乳酸、乳酸鈉等之保濕成分類；可經表面處理之雲母、滑石、高嶺土、合成雲母、碳酸鈣、碳酸鎂、無水矽酸(二氧化矽)、氧化鋁、硫酸鋇等之粉體類；可經表面處理之氧化鈷、群青、普魯士藍、氧化鋅之無機顏料類；可經表面處理之氧化鐵二氧化鈦 燒結體等之複合顏料；可經表面處理之雲母鈦、魚鱗箔、氧氯化鉍(III)等之珠光劑類；可經色澱化的紅色202號、紅色228號、紅色226號、黃色4號、藍色404號、黃色5號、紅色505號、紅色230號、紅色223號、橙色201號、紅色213號、黃色204號、黃色203號、藍色1號、綠色201號、紫色201號、紅色204號等之有機色素類；聚乙烯粉末、聚甲基丙烯酸甲酯、耐綸粉末、有機聚矽氧彈性體等之有機粉體類；乙醇、異丙醇等之低級醇類；維生素A或其衍生物、維生素B6鹽酸鹽、維生素B6三棕櫚酸酯、維生素B6二辛酸酯、維生素B2或其衍生物、維生素B12、維生素B15或其衍生物等之維生素B類、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、維生素E乙酸酯等之維生素E類、維生素D類、維生素H、泛酸、泛雙硫醇、吡咯喹啉醌等之維生素類。
<1>皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法
以下，對於解決第四及五課題的本發明之實施形態加以詳述。
皮下組織之黏彈性(以下，亦簡稱為黏彈性)與皮下組織之氧量(以下，亦簡稱為氧量)之間，成立正的相關關係。即，處於氧量越高，黏彈性越大的關係。
另一方面，皮下組織之黏彈性與包覆脂肪細胞的纖維結構之纖維化程度(以下，亦簡稱為纖維化程度)之間，成立負的相關關係。即，處於纖維化程度越小，黏彈性越大的關係。
本發明係利用該相關關係而由黏彈性估算皮下組織之氧量或包覆脂肪細胞的纖維結構之纖維化程度。
皮下組織，對於黏彈性略均一的部分，於深度方向 可大致分類成3個層。具體而言，將皮下組織於深度方向以1：2：1之比率分割時，將位於最上方的層(與真皮鄰接的層)者稱為皮下組織上層。
於本發明，較佳為以最接近真皮的層之皮下組織上層的黏彈性作為指標。
上述相關關係較佳為以方程式或模式表示。就方程式或模型而言，較佳可列舉單回歸方程式(simple regression equation)或單回歸模型(simple regression model)。
黏彈性係指合併黏性與彈性兩者的性質。據此，於黏彈性之評價時，成為評價黏性與彈性兩者。然而，於活體組織，難以明確區別黏性與彈性，黏彈性一般係主要藉由彈性模數(楊氏模數(Young's modulus))來評價。
又，基於虎克定律(Hooke’s law)(下述式1)，亦可藉由「應變」來評價黏彈性。
Figure 108118116-A0202-12-0049-2
因此，於本發明被作為指標的黏彈性，可設成作為彈性模數(楊氏模數)或應變而算出的形態。
於上述之迴歸方程式或回歸模型的作成時，亦可將解釋變數設為皮下組織之楊氏模數或應變，將目的變數設為氧量或纖維化程度。
氧量係指血液中之氧飽和度。氧飽和度可為將動脈 血直接採血而測定的動脈血氧飽和度(SaO2)，亦可為使用脈衝式血氧測量器(pulse oximeter)等之測定裝置而測定的經皮的氧飽和度(SpO2)。又，可為使用近紅外線分光法(Near-infrared spectroscopy；NIRS)的局部組織氧飽和度(rSO2)。
於本說明書，皮下組織之氧量係指循環全身的動脈血中，尤其是指循環末梢區域的皮下組織之毛細血管的局部組織之氧飽和度。
皮下脂肪細胞係指構成皮下組織之大部分的脂肪細胞。脂肪細胞形成集塊，作為其周圍被膠原蛋白或彈性蛋白等之結締組織網目狀地包覆的脂肪小葉而存在。
於脂肪小葉之周圍，進一步有血管、神經網目狀地運行，進行營養物質或老廢物的搬運。如此，將藉由結締組織或血管等而網目狀地包圍脂肪小葉所形成的分葉狀之結構，稱為包覆脂肪細胞的纖維結構。包覆脂肪細胞的纖維結構，如形成脂肪小葉本身的纖維結構整體、或存在於各個脂肪細胞之周圍的結締組織之部分的局部結構，可分成不同的構成單元。
利用本發明之皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法，係有用於特別是存在於各個脂肪細胞之周圍的纖維結構之纖維化程度之估算。
其中，纖維化係指因包圍組織的膠原蛋白之異常增加、或膠原蛋白纖維彼此交聯，而組織變硬的現象。
就纖維化之要因而言，可假設膠原蛋白本身的表現量增加、與膠原蛋白纖維結構之交聯反應有關的基因之表現量增加。
於本說明書，纖維化程度係指纖維化之進行度或程度。
皮下組織之黏彈性可藉由超音波彈性成像而測定。 就超音波彈性成像之手法而言，可無限制使用：自外部施加應力σ而使皮膚變形，測定應變ε，藉由虎克定律求得楊氏模數E的應變成像(strain imaging)；或使剪力波於皮膚傳遞，並藉由測定其傳遞速度CS，求得楊氏模數E的剪力波成像(shear wave imaging)等周知之手法。
就超音波彈性成像裝置而言，可使用例如日立製作所製「ARIETTA E70」或「Noblus」、Siemens Healthcare製「Acuson S2000e」等。
若依據超音波彈性成像，可將皮膚的內部剖面中的黏彈性(楊氏模數(取決於機種，或為應變))之分布作為影像而獲得。於本發明之實施時，可將於皮下組織不均一分布的黏彈性之平均作為測定值而使用。
於皮下組織之黏彈性之測定時，將皮下組織於深度方向分成上層、中層、下層之3層，較佳為設成求得各自之層中的黏彈性之平均的形態。特佳為設成將皮下組織上層之黏彈性之平均作為測定值使用，而估算皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度的實施形態。
<2>皮下組織之黏彈性之估算方法
如上述，皮下組織之黏彈性與氧量之間，成立正的相關關係，且於皮下組織之黏彈性與包覆脂肪細胞的纖維結構之纖維化程度之間，成立負的相關關係。本發明係利用該相關關係而由氧量或纖維化程度估算皮下組織之黏彈性。
上述相關關係較佳為以方程式或模型表示。就方程式或模型而言，較佳可列舉單回歸方程式或單回歸模型。
氧量之評價方法並未特別限制。
如上述，就侵略性的方法而言，可列舉將受試者之動脈血採血而測定氧分壓的方法。又，就非侵略性的方法而言，可列舉：使用脈衝式血氧測量器而檢測指尖部之動脈之血流，來測定SpO2的方法；或使用NIRS而測定頰部等之rSO2的方法。
使用脈衝式血氧測量器的情形，探針的種類並未特別限制，可使用穿透型者，亦可使用反射型者。此等可適當使用市售者。
使用NIRS的情形亦同樣，未特別限制而可適當使用市售的製品。
纖維化程度之評價方法並未特別限定。
就侵略性的方法而言，可列舉使用照片比例尺(photo scale)算出相對的評價值的方法。更詳言之，事先準備複數個纖維化程度不同的皮下脂肪細胞之影像。將其作為基準照片，對由受試者採取的皮下脂肪細胞之影像進行評分。
侵略性的方法因成為對受試者強加負担，故較佳為以非侵略性的方法評價皮下脂肪細胞之纖維化程度。
就非侵略性的方法而言，可列舉使用超音波的方法。更詳言之，係自藉由超音波獲得的皮膚之斷層面之影像，切出皮下脂肪層部分，作為解析用影像。對於取得的解析用影像，可自使用影像處理軟體而獲得的特徵量而評價纖維化程度。
就此種特徵量而言，可例示為將影像灰階化、直方圖化、二值化(binarization)等而算出的參數。
於本發明，較佳為將解析用影像直方圖化，將此直方圖之偏度作為纖維化程度之評價值而採用。
偏度小的直方圖(顯示略常態分布)因表示應變小，而判定為皮下脂肪細胞之纖維化程度高的狀態。相反地，由偏度大的直方圖(顯示非常態分布)可判定為皮下脂肪細胞之纖維化程度低的狀態。
影像處理軟體可使用開放原始碼(open source)的「ImageJ」等周知之任一種軟體。
用以評價纖維化程度所使用的超音波裝置可使用供上述皮下組織之黏彈性測定用之相同者。
此外，說明於上述<1>之項目及本項目，作為用以估算之指標之黏彈性、氧量或纖維化程度之測定或評價之方法。此說明亦適用於用以作成迴歸方程式或回歸模型之黏彈性、氧量或纖維化程度之測定或評價之方法。
<3>皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算裝置
以下，對於皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算裝置，一邊參照圖17一邊加以說明。此外，本發明之估算裝置係用以實施上述<1>之項目所說明的皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法的裝置。據此，有關於以下之估算裝置，亦適用上述<1>之項目之說明。又，皮下組織之氧量之估算裝置因具有與皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算裝置相同的構成，而省略與該估算裝置有關之說明。可藉由準用皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算裝置之說明，而理解該估算裝置之構成。
本發明之皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算裝置1具備：記憶顯示皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程 度之相關關係的纖維化程度相關數據的記憶手段121；及將受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性與記憶於記憶手段121的纖維化程度相關數據比對，而算出前述纖維化程度的纖維化程度算出手段112。
如圖17所示，皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算裝置1具有黏彈性測定部13、具備記憶手段121的ROM(唯讀記憶體(Read Only Memory))12、具備纖維化程度算出手段112的CPU(中央處理單元(Central Processing Unit))11、及纖維化程度顯示部14。
於本發明之較佳實施形態，較佳為具備將藉由黏彈性測定部13所測定的受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性加以數值化的數值化手段111。CPU 11具備數值化手段111。
纖維化程度顯示部14係顯示纖維化程度算出手段112所算出的皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算值的顯示器。
呈此種構成的本發明之皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算裝置1，僅藉由測定受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性，可容易地算出受試者之皮下脂肪細胞之纖維化程度。
此外，於其它之實施形態，亦可具備輸入另外測定的黏彈性之測定值的黏彈性輸入部，而代替黏彈性測定部13及數值化手段111。
<4>皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算程式
本發明亦關於使上述之皮下組織之氧量或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法於電腦上實行的估算程式。本發明之程式因對應於上述本發明之纖維化程度之估算裝置所含的CPU中的 各手段，而一邊附加圖17之符號一邊進行說明。此外，因與上述<3>之項目所述理由相同的理由，而省略與皮下組織之氧量之估算程式有關之說明。可藉由準用皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算程式之說明，而理解該估算程式之機能。
本發明之皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算程式，其特徵為：使電腦作為纖維化程度算出手段112而發揮作用，該纖維化程度算出手段112係將受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性，與顯示皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度的相關關係的纖維化程度相關數據比對，而作為算出前述纖維化程度。
本發明之纖維化程度之估算程式係如圖17之方塊圖所示，較佳為以使電腦作為數值化手段111而發揮作用的方式構成。
<5>皮下組織之黏彈性之估算裝置
以下，對於皮下組織之黏彈性之估算裝置，一邊參照圖18一邊加以說明。此外，本發明之皮下組織之黏彈性之估算裝置係用以實施上述<2>之項目所說明的皮下組織之黏彈性之估算方法之裝置。據此，有關於以下之皮下組織之黏彈性之估算裝置，亦適用上述<2>之項目之說明。又，可藉由於以下之說明中將「皮下脂肪細胞之纖維化程度」或「纖維化程度」替換用語為「皮下組織之氧量」或「氧量」，而理解基於皮下組織之黏彈性與氧量之相關關係的皮下組織之黏彈性之估算裝置之構成。
本發明之皮下組織之黏彈性之估算裝置2係具備：記憶顯示皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之相 關關係的黏彈性相關數據的記憶手段221；及將受試者之皮下脂肪細胞之纖維化程度與記憶於記憶手段221的黏彈性相關數據比對，而算出前述黏彈性的黏彈性算出手段212。
如圖18所示，皮下組織之黏彈性之估算裝置2具有：纖維化程度測定部23、具備記憶手段221的ROM 22、具備黏彈性算出手段212的CPU 21、及黏彈性顯示部24。
於本發明之較佳實施形態，較佳為具備將藉由纖維化程度測定部23所測定的受試者之皮下脂肪細胞之纖維化程度加以數值化的數值化手段211。CPU 21具備數值化手段211。
黏彈性顯示部24為顯示黏彈性算出手段212所算出的皮下組織之黏彈性之估算值的顯示器。
呈此種構成的本發明之皮下組織之黏彈性之估算裝置2，僅藉由測定受試者之皮下脂肪細胞之纖維化程度，可容易地算出受試者之皮下組織之黏彈性。
此外，於其它之實施形態，可具備輸入另外測定的纖維化程度之測定值的纖維化程度輸入部，而代替纖維化程度測定部23及數值化手段211。
<6>皮下組織之黏彈性之估算程式
本發明亦關於使上述之皮下組織之黏彈性之估算方法於電腦上實行的皮下組織之黏彈性之估算程式。本發明之程式，因對應上述本發明之黏彈性估算裝置所含的CPU中的各手段，而一邊附加圖18之符號一邊說明。此外，如上述<5>之項目所述，可藉由將「皮下脂肪細胞之纖維化程度」替換用語為「皮下組織之氧量」，而理解基於皮下組織之黏彈性與氧量之相關關係的皮 下組織之黏彈性之估算程式之機能。
本發明之皮下組織之黏彈性之估算程式係特徵為：使電腦作為黏彈性算出手段212而發揮作用，該黏彈性算出手段212係將受試者之皮下脂肪細胞之纖維化程度，與顯示皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之相關關係的黏彈性相關數據比對，而算出前述黏彈性。
本發明之黏彈性估算程式係如圖18之方塊圖所示，較佳為以使電腦作為數值化手段211而發揮作用的方式構成。
[實施例] <試驗例1>老化及氧量之回歸分析
對60位受試者，使用脈衝式血氧測量器(KONICA MINOLTA公司)而測定全身之動脈血之氧飽和度。又，對60名之受試者，使用NIRS(靜岡大學‧工學部庭山副教授製作)而測定頰部之動脈血之氧飽和度。對於獲得的氧飽和度之測定值(全身：SpO2、頰部：rO2)及各受試者之年齡，各自進行回歸分析。將結果示於圖1及2。
如圖1及2所示，確認受試者之年齡與全身之氧飽和度、及局部的氧飽和度之間，同時成立負的相關關係。
此結果顯示，因老化而不僅引起全身之氧狀態之惡化，於如頰部之局部的皮膚亦引起氧狀態之惡化。
<試驗例2>抑制膠原蛋白結構之惡化的成分的評價 <1>含有膠原蛋白的組成物之調製
將表1上半部分所示成分，以同表所示的質量比於冰冷下混合，調製膠原蛋白溶液A。將膠原蛋白溶液A與水以表1中間部分所示質量比混合，而調製膠原蛋白溶液B。於24孔盤中以250μL/孔添加膠原蛋白溶液B，於CO2培養箱內靜置15分鐘。
另一方面，回收事先培養的細胞，將調製為1×105個細胞/mL的細胞懸浮液、及膠原蛋白溶液A，以表1下半部分記載之比率混合，獲得包含細胞的膠原蛋白溶液C。
將膠原蛋白溶液C以1mL/孔添加至上述說明的置入有250μL/孔的膠原蛋白溶液B的孔中，藉由於CO2培養箱內靜置4小時，調製分散有細胞的凝膠狀之含有膠原蛋白的組成物。
Figure 108118116-A0202-12-0058-31
以微量刮勺將含有膠原蛋白的組成物自盤之內壁剝離。對其添加含有受測成分的溶液(10% FBS DMEM)750μL/孔。
將此24孔盤封入具備脫氧劑的低氧培養器具(BIONIX， Sugiyama Giken製)中，於調整為氧濃度1%的狀態，開始於CO2培養箱內之培養(低氧狀態)。
自培養開始72小時後，再次將孔內之培養基以含有受測成分的溶液(10% FBS DMEM)750μL/孔交換。之後，再次將盤封入低氧培養器具中，培養96小時(低氧狀態)。
此外，於本試驗例，使用錦葵花萃取物作為受測成分。
又，作為對照試驗，將添加培養基(10% FBS DMEM)來代替受測成分溶液的含有膠原蛋白的組成物，於封入低氧培養器具(低氧狀態)或未封入低氧培養器具(通常氧狀態)的狀態下同樣地培養。
<2>顯微鏡觀察
回收培養後之凝膠狀之含有膠原蛋白的組成物，以表2所示的流程，進行固定、脫水、真空冷凍乾燥，藉由掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察膠原蛋白結構。將電子顯微鏡拍攝影像示於圖6。
Figure 108118116-A0202-12-0060-4
如圖6所示，與於通常氧狀態培養者比較，於低氧狀態所培養的含有膠原蛋白的組成物中，顯著地觀察到膠原蛋白纖維結成束並凝集的部分(圖6之以箭頭表示的部分)。
另一方面，添加錦葵花萃取物的含有膠原蛋白的組成物，與未添加相同萃取物者相比，未見到膠原蛋白纖維之顯著的結成束。
其結果顯示，藉由以於分散有細胞之含有膠原蛋白的組成物中添加受測成分而於低氧條件下培養時的膠原蛋白纖維之集束度的上升減少效果作為指標，可篩選抑制因低氧條件所致的膠原蛋白結構之惡化的成分。
又，隨著老化而組織處於低氧條件(非專利文獻3)，因此顯示上述試驗系統亦可應用於抑制因老化所致的膠原蛋白結構之惡化的成分之篩選。
又，本試驗例之結果顯示，於屬於錦葵科錦葵屬的植物之萃取物，有抑制於低氧條件中的膠原蛋白結構之惡化的效果。
<3>影像解析
對於圖6所示的顯微鏡拍攝影像，使用影像解析軟體(ImageJ)，施加快速傅立葉轉換(FFT)，取得表示二維空間頻率功率譜的傅立葉轉換影像(FFT影像)(圖7)。
選擇將FFT影像之中心(即，二維空間頻率功率譜之波數0之原點)作為中心的矩形區域(圖7)。
將選擇的區域之縱方向之強度(即相當於二維空間頻率功率譜之功率)加以平均，抽出將該數值對於相同區域的橫方向作圖而成的波形數據(圖8)。
切出此波形數據中的傾斜部分之一部份(圖8中的254像素~381像素之區域)，對於構成此傾斜部分之波形的數據作成近似直線(圖9)。
算出此近似直線與構成波形的數據之功率的差分(△功率、△power)(圖10)，並計算標準偏差(表3)。
Figure 108118116-A0202-12-0061-5
如表3所示，與於通常氧狀態培養者比較，於低氧狀態培養的含有膠原蛋白的組成物之藉由電子顯微鏡拍攝影像之解析所算出的標準偏差顯著地更大。
另一方面，於添加錦葵花萃取物的含有膠原蛋白的組成物， 與未添加相同萃取物者相比，其標準偏差顯著地更小。
其結果顯示，基於由顯微鏡拍攝影像所獲得的傅立葉轉換影像所表示的二維空間頻率功率譜之功率之值的離差，可評價受測成分之膠原蛋白纖維之集束度的提升減少效果。
<試驗例3>因低氧條件所致的膠原蛋白結構之變化之觀察
將人類皮下脂肪前驅細胞(HPAd)，與增殖培養基一起接種於24孔多孔盤(2.0×104個細胞/孔)後，培養至鋪滿為止。之後，交換成分化培養基，一邊每3日交換分化培養基一邊培養14日，使其成熟化為皮下脂肪細胞。之後，交換成維持培養基，將盤封入具備脫氧劑的低氧培養器具(BIONIX，Sugiyama Giken製)中，調節為氧濃度1%而繼續培養。此時，作為對照，亦準備將盤封入除去脫氧劑的低氧培養器具中而繼續培養的細胞。培養後，藉由掃描式電子顯微鏡拍攝膠原蛋白纖維之結構。將結果示於圖11。
如圖11所示，得知於低氧條件培養的細胞，與於通常之氧濃度所培養的細胞相比，其膠原蛋白纖維的粗細不均一，形成不定形的結構。
<試驗例4>低氧條件中的細胞培養(1)
將人類皮下脂肪前驅細胞(HPAd)，與增殖培養基一起接種於24孔多孔盤(2.0×104個細胞/孔)後，培養至鋪滿為止。之後，交換成分化培養基，一邊每3日交換分化培養基一邊培養14日，使其成熟化為皮下脂肪細胞。之後，交換成維持培養基，將盤封入具備脫氧劑的低氧培養器具(BIONIX，Sugiyama Giken製) 中，調節為氧濃度1%而繼續培養。此時，作為對照，亦準備將盤封入除去脫氧劑的低氧培養器具中而繼續培養的細胞。自交換成維持培養基起1日後，集束培養，依以下順序，萃取mRNA。
藉由PBS將孔內之細胞洗淨後，添加RNeasy Lipid Tissue Kit(QIAGEN公司)之QIAzol溶胞試劑(1mL/孔)，自細胞萃取mRNA。
藉由Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Life Technologies公司)，將萃取的mRNA作成cDNA。
使用QuantiTect Primer Assay，進行即時PCR，測定col1a1基因、col3a1基因、tgf-β基因、及lox基因之表現量。此時亦一併測定為缺氧反應的標記之vegf基因之表現量。將結果示於圖12。
如圖12所示，於低氧條件進行培養的細胞，觀察到vegf基因之表現量的上升。即，確認因低氧條件中的培養而細胞引起缺氧反應。
又，如圖12所示，可知col1a1基因及col3a1基因之表現量，於低氧條件之培養無變化。
另一方面，tgf-β基因及lox基因之表現量，因低氧條件之培養而顯著地上升(圖12)。
為lox基因之產物的LOX，係與膠原蛋白纖維之交聯有關的酵素。又，TGF-β係與膠原蛋白纖維之產生有關的因子。即，圖12所示的結果顯示，於低氧條件，與膠原蛋白纖維有關的LOX及TGF-β之生產量增加，纖維化被促進。
<考察>
試驗例4之結果顯示，若因老化而皮下脂肪細胞處於低氧條件，則因lox基因之表現上升，為其基因產物的LOX促進膠原蛋白纖維之交聯等，而纖維化進行。此顯示，可抑制於低氧條件lox基因之表現上升的成分，可抑制皮下脂肪細胞之纖維化。
即，試驗例4之結果顯示，藉由將於低氧條件培養的細胞中的lox基因之表現上升的減少效果作為指標，可篩選抑制因低氧條件或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分。
<試驗例5>抑制皮下脂肪細胞之纖維化的成分之評價
將人類皮下脂肪前驅細胞(HPAd)，與增殖培養基一起接種於24孔多孔盤(1.5×104個細胞/孔)。48小時後，使用增殖培養基進行培養基交換。
其48小時後，交換成分化培養基，而開始分化。一邊以2日1次的步調實施培養基交換，一邊進行17日的分化培養。
進行培養基交換成維持培養基，於其中添加為篩選對象的肥皂草葉萃取物及葡萄葉萃取物。準備未添加萃取物的盤作為對照。
將盤封入具備脫氧劑的低氧培養器具(BIONIX，Sugiyama Giken製)中，調節氧濃度為1%後繼續培養。
培養72小時後，以與試驗例4同樣之方法回收mRNA，藉由反轉錄而製作cDNA庫後，藉由即時PCR解析LOX基因之表現量。將結果示於圖13。
如圖13所示，肥皂草葉萃取物發揮顯著抑制低氧條件下的lox基因之表現量的上升的效果。另一方面，於葡萄葉萃取物未見到此種顯著效果。
依據本試驗例可確認，藉由將於低氧條件培養的細胞中的lox基因之表現上升的減少效果作為指標，可篩選抑制因低氧條件或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分。
又，此結果顯示，包含屬於石竹科肥皂草屬的植物之萃取物作為有效成分的藥劑，發揮因低氧條件及/或老化所致的lox基因之表現的上升抑制效果、皮下脂肪細胞之纖維化抑制效果、以及伴隨老化的鬆弛之改善效果或預防效果。
<試驗例6>低氧條件中的細胞培養(2)
將新生兒人類正常角質細胞，以KG2培養基接種於4孔盤，培養一日。
為了使角質細胞分化，於培養基中添加Ca(Ca終濃度：1.45mM))，將盤封入具備脫氧劑的低氧培養器具(BIONIX，Sugiyama Giken製)中，調節氧濃度為1%後繼續培養。此時，作為對照，亦準備將盤封入去除脫氧劑的低氧培養器具中而繼續培養的細胞。自之後繼續2日培養的細胞，依以下順序萃取mRNA。
藉由PBS將孔內之細胞洗淨後，添加RNeasy Lipid Tissue Kit(QIAGEN公司)之QIAzol溶胞試劑(1mL/孔)，自細胞萃取mRNA。
藉由Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Life Technologies公司)，將萃取的mRNA作成cDNA。
使用QuantiTect Primer Assay，進行即時PCR，測定緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因及鈣黏蛋白基因之表現量。將結果示於圖14。
如圖14所示，緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因及鈣黏蛋白基因之表現量，因於低氧條件之培養而顯著降低。
為緊連蛋白基因、密連蛋白基因及zo-1基因之產物的緊連蛋白(occludin)、密連蛋白(claudin)及ZO-1，係緊密連結之構成蛋白質。又，為鈣黏蛋白基因之產物的鈣黏蛋白(cadherin)，係黏著連結之構成蛋白質。
即，圖14所示的結果顯示，於低氧條件，構成緊密連結、黏著連結的緊連蛋白、密連蛋白、ZO-1及鈣黏蛋白之生產量降低，緊密連結及黏著連結這樣的細胞黏著器之機能降低。
其結果顯示，若因老化而表皮處於低氧條件時，則構成緊密連結或黏著連結的緊連蛋白、密連蛋白、ZO-1及鈣黏蛋白之生產量降低，表皮之細胞黏著器的機能降低。此顯示，於低氧條件可抑制緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因及鈣黏蛋白基因之表現降低的成分，可抑制細胞黏著器之機能降低。
即，其結果顯示，藉由將於低氧條件培養的細胞中的緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因及鈣黏蛋白基因之表現降低的抑制效果作為指標，可篩選抑制因低氧條件或老化所致的表皮之細胞黏著器之機能的降低的成分。
<試驗例7>抑制表皮之細胞黏著器之機能降低的成分之評價
將新生兒人類正常角質細胞以1.07×105個細胞/孔接種於24孔盤。24小時後，交換成高Ca2+培養基(於KG2培養基中添加1/1000量之1.3M CaCl2水溶液者)，於其中添加為受測成分的西洋薄荷葉萃取物及虎耳草萃取物，將盤封入具備脫氧劑的低 氧培養器具(BIONIX，Sugiyama Giken製)中，將氧濃度調整為1%後，繼續培養。此時，準備未添加受測成分的盤作為對照，同樣地進行培養。
48小時後，以與試驗例6同樣之方法萃取mRNA，將其反轉錄，而製作cDNA庫，藉由即時PCR，測定密連蛋白基因之表現量。將結果示於圖15。
如圖15所示，西洋薄荷葉萃取物，發揮顯著抑制於低氧條件下的密連蛋白基因之表現量的降低的效果。另一方面，於虎耳草萃取物，未見到此種顯著效果。
依據本試驗例，可確認藉由將於低氧條件培養的細胞中的密連蛋白基因之表現量的降低的抑制效果作為指標，可篩選抑制因低氧條件或老化所致的表皮之細胞黏著器之機能的降低的成分。
又，其結果顯示，包含屬於唇形花科薄荷屬的植物之萃取物作為有效成分的藥劑，發揮因低氧條件及/或老化所致的密連蛋白基因之表現的降低抑制效果、表皮之細胞黏著器之機能降低抑制效果、以及伴隨老化的皮膚障壁機能之改善效果或預防效果。
<試驗例8>皮下組織之黏彈性之解析及局部組織之氧飽和度之測定
對58名之受試者，使用彈性成像(日立製作所)而取得皮膚內部之彈性成像影像，測定黏彈性。此外，關於黏彈性之測定，將測定區域分成皮膚之表層部分(真皮)、皮下組織上層、皮下組織中層及皮下組織下層之合計四層，算出層別之相對的黏彈性。關於皮下組織上層、皮下組織中層及皮下組織下層，係藉由將皮 下組織於深度方向以1：2：1之比率分割而設定。
其次，對相同受試者，使用NIRS(靜岡大學‧工學部庭山副教授製作)而測定頰部之動脈血之氧飽和度。測定之際使用的近紅外線波長為770nm及830nm。
<試驗例9>黏彈性及氧飽和度之回歸分析
對於試驗例8所獲得的黏彈性與氧飽和度之測定值進行回歸分析。將結果示於圖16。
如圖16所示，氧飽和度與黏彈性之間，確認成立正的相關關係。由此結果顯示，將皮下組織之黏彈性作為指標，可估算皮下組織之氧量。同樣地顯示，將皮下組織之氧量作為指標，可估算皮下組織之黏彈性。
又，依據試驗例1及4，顯示隨著老化而局部組織之氧狀態惡化，而且於低氧條件下皮下脂肪細胞之纖維化進行，若基於此而考察，則可認為於皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間，成立負的相關關係。據此，亦可認為將皮下組織之氧量作為指標，可估算皮下脂肪細胞之纖維化程度，同樣地，將皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標，可估算皮下組織之氧量。
<試驗例10>伴隨老化的膠原蛋白結構之變化之觀察
將20歲以上之9名之供給者所提供的皮下組織中的皮下脂肪細胞藉由掃描式電子顯微鏡拍攝。使熟練之評價者評價此電子顯微鏡照片，並對皮下脂肪細胞之纖維化程度評分1~5的分數。評價係將纖維化之進行度不同的5階段之基準照片(圖19)作為 基準而進行。將結果示於圖20。
如圖20所示，供給者之年齡與皮下脂肪細胞之纖維化程度為顯著相關。此結果顯示，隨著老化而皮下脂肪細胞之纖維化進行。
<試驗例11>皮下組織之黏彈性及皮下脂肪細胞之纖維化程度之解析
對140名之受試者，使用彈性成像(日立製作所)取得皮膚內部之彈性成像影像，並測定黏彈性(圖21)。此外，對於黏彈性之測定，將測定區域分成皮膚之表層部分(真皮)、皮下組織上層、皮下組織中層及皮下組織下層之合計四層，算出層別之相對的黏彈性。關於皮下組織上層、皮下組織中層及皮下組織下層，係藉由將皮下組織於深度方向以1：2：1之比率分割而設定。
又，自同一受試者之超音波影像切出皮下脂肪部分，將其作為解析用影像而使用影像解析軟體(ImageJ)作成直方圖。對於此直方圖，使用影像解析軟體(ImageJ)而算出偏度(圖22)。此外，於圖22所示直方圖，表示纖維化之程度低的影像的左圖之偏度為1.62，表示纖維化之程度高的影像的右圖之偏度為0.84。
<試驗例12>黏彈性及纖維化程度之回歸分析
對於試驗例11所獲得的皮下組織上層之黏彈性之測定值、及顯示相同試驗所獲得的皮下脂肪細胞之纖維化程度的偏度，進行回歸分析。將結果示於圖23。
如圖23所示，皮下組織之黏彈性、與皮下脂肪層之超音波 影像之直方圖的偏度之間，成立正的相關關係。
若纖維化程度高，則前述偏度變小，因此圖23所示的結果清楚得知，皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間，成立負的相關關係。
由此結果顯示，將皮下組織之黏彈性作為指標，可估算皮下脂肪細胞之纖維化程度。同樣地顯示，將皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標，可估算皮下組織之黏彈性。
[產業上利用之可能性]
本發明可應用於與抗老化有關的有效成分之探索。
本發明可應用於皮膚解析技術。

Claims (60)

  1. 一種改善因低氧條件及/或老化所致的皮膚之狀態或機能的成分之篩選方法，其係於包含受測成分的培養基中，於低氧條件下培養細胞，並以培養系統的狀態的變化作為指標。
  2. 一種抑制因低氧條件及/或老化所致的膠原蛋白結構之惡化的成分之篩選方法，其係如請求項1記載之方法，其特徵為於分散有細胞之含有膠原蛋白的組成物中添加受測成分，並以於低氧條件培養時之膠原蛋白纖維的集束度(binding degree)的上升減少效果作為指標。
  3. 如請求項2之篩選方法，其係於該受測成分之存在下及不存在下，將該含有膠原蛋白的組成物於低氧條件下培養，於受測成分之存在下培養後之膠原蛋白纖維之集束度，較於受測成分之不存在下培養後之膠原蛋白纖維之集束度為更低的情形，判定該受測成分為抑制因低氧條件及/或老化所致的膠原蛋白結構之惡化的成分。
  4. 如請求項2或3之篩選方法，其中該膠原蛋白結構為結締組織之膠原蛋白結構。
  5. 如請求項2至4中任一項之篩選方法，其中該細胞為結締組織細胞。
  6. 如請求項2至5中任一項之篩選方法，其中基於該培養後之膠原蛋白纖維之顯微鏡拍攝影像，評價該膠原蛋白纖維之集束度。
  7. 如請求項6之篩選方法，其中對該顯微鏡拍攝影像施加影像解析處理，基於將該膠原蛋白纖維之集束度定量化的影像 解析處理結果，評價該膠原蛋白纖維之集束度。
  8. 如請求項7之篩選方法，其中於該影像解析處理，對該顯微鏡拍攝影像施加傅立葉轉換處理，而取得表示二維空間頻率功率譜的傅立葉轉換影像，並獲得：設定至少通過該傅立葉轉換影像之原點的直線，對於該直線之長度方向，將該直線上的該傅立葉轉換影像之功率作圖而獲得的波形；或自該傅立葉轉換影像，切出至少包含其原點的略矩形區域影像，將切出的略矩形區域影像之短徑方向的功率的平均值，對於該略矩形區域影像之長徑方向作圖而獲得的波形。
  9. 如請求項8之篩選方法，其中將該波形之傾斜部分之至少一部分切出，作成該傾斜部分之近似直線，相對於該近似直線，構成該波形的數據的離差之程度越小，判斷抑制該膠原蛋白結構之惡化的效果越優異。
  10. 如請求項9之篩選方法，其中藉由標準偏差而評價該離差之程度。
  11. 如請求項2至10中任一項之篩選方法，其中該低氧條件係細胞培養氣體環境中之氧濃度為5%以下之條件。
  12. 如請求項2至11中任一項之篩選方法，其係抗老化成分之篩選方法。
  13. 如請求項2至12中任一項之篩選方法，其係伴隨老化的皺紋、鬆弛或張力降低之改善或預防成分之篩選方法。
  14. 一種因低氧條件及/或老化所致的膠原蛋白結構之惡化之抑制劑，其包含屬於錦葵科錦葵屬(Malvaceae Malva)的植物之萃取物作為有效成分。
  15. 一種抑制因低氧條件及/或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分之篩選方法，其係如請求項1記載之方法，並以於低氧條件培養的細胞中的lox基因之表現上升的減少效果作為指標。
  16. 如請求項15之篩選方法，其中該細胞為脂肪細胞。
  17. 如請求項15或16之篩選方法，其係抗老化成分之篩選方法。
  18. 如請求項15至17中任一項之篩選方法，其係伴隨老化的鬆弛之改善或預防成分之篩選方法。
  19. 如請求項15至18中任一項之篩選方法，其中與於受測成分之不存在下且於低氧條件培養的細胞比較，而於受測成分之存在下且於低氧條件下培養的細胞中的lox基因之表現量為更低的情形，將該受測成分判定為抑制因低氧條件及/或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化的成分。
  20. 如請求項15至19中任一項之篩選方法，其中該低氧條件係細胞培養氣體環境中的氧濃度為5%以下之條件。
  21. 如請求項15至20中任一項之篩選方法，其中將vegf基因之表現量的上升，作為於低氧條件培養的細胞中產生缺氧反應的指標。
  22. 一種因低氧條件及/或老化所致的lox基因之表現之上升抑制劑，其特徵為含有屬於石竹科肥皂草屬(Caryophyllaceae Saponaria)的植物之萃取物作為有效成分。
  23. 一種因低氧條件及/或老化所致的皮下脂肪細胞之纖維化抑制劑，其特徵為含有屬於石竹科肥皂草屬(Caryophyllaceae Saponaria)的植物之萃取物作為有效成分。
  24. 一種伴隨老化的鬆弛之改善或預防劑，其特徵為含有屬於石竹科肥皂草屬(Caryophyllaceae Saponaria)的植物之萃取物作為有效成分。
  25. 一種抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之細胞黏著器(cell adhesion apparatus)的機能降低的成分之篩選方法，其係如請求項1記載之方法，並以於低氧條件培養的細胞中的選自緊連蛋白(occuludin)基因、密連蛋白(claudin)基因、zo-1基因及鈣黏蛋白(cadherin)基因的基因之表現降低的抑制效果作為指標。
  26. 如請求項25之篩選方法，其係以於低氧條件培養的細胞中的選自緊連蛋白基因、密連蛋白基因及zo-1基因的基因之表現降低的抑制效果作為指標，而篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之緊密連結(tight-junction)之機能降低的成分。
  27. 如請求項25之篩選方法，其係以於低氧條件培養的細胞中的鈣黏蛋白基因之表現降低的抑制效果作為指標，而篩選抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之黏著連結(adherence-junction)之機能降低的成分。
  28. 如請求項25至27中任一項之篩選方法，其中該細胞為角質細胞。
  29. 如請求項25至28中任一項之篩選方法，其係抗老化成分之篩選方法。
  30. 如請求項25至29中任一項之篩選方法，其係伴隨老化的皮膚障壁機能(skin barrier function)降低的改善或預防成分之篩選方法。
  31. 如請求項25至30中任一項之篩選方法，其中與於受測成分之不存在下且於低氧條件培養的細胞比較，而於受測成分之存在下且於低氧條件下培養的細胞中的選自緊連蛋白基因、密連蛋白基因、zo-1基因及鈣黏蛋白基因的基因之表現量為更高的情形，將該受測成分判定為抑制因低氧條件及/或老化所致的表皮之細胞黏著器的機能降低的成分。
  32. 如請求項25至31中任一項之篩選方法，其中該低氧條件係細胞培養氣體環境中之氧濃度為5%以下之條件。
  33. 一種因低氧條件及/或老化所致的密連蛋白基因之表現降低抑制劑，其特徵為包含屬於唇形花科薄荷屬(Lamiaceae Mentha)的植物之萃取物作為有效成分。
  34. 一種因低氧條件及/或老化所致的表皮之細胞黏著器的機能降低抑制劑，其特徵為包含屬於唇形花科薄荷屬(Lamiaceae Mentha)的植物之萃取物作為有效成分。
  35. 一種伴隨老化的皮膚障壁機能降低之改善或預防劑，其特徵為包含屬於唇形花科薄荷屬(Lamiaceae Mentha)的植物之萃取物作為有效成分。
  36. 一種氧量之估算方法，其特徵為利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將該皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標而估算該氧量。
  37. 如請求項36之氧量之估算方法，其中使用將皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值設為解釋變數，將皮下組織之氧量之評價值設為目的變數的迴歸方程式，由該皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值，算 出該氧量。
  38. 如請求項36或37之氧量之估算方法，其中藉由超音波彈性成像(ultrasound elastography)而測定該皮下組織之黏彈性。
  39. 如請求項36至38中任一項之氧量之估算方法，其中該黏彈性為皮下組織上層之黏彈性。
  40. 一種氧量估算裝置，其係利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將該皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值作為指標而估算該氧量的氧量估算裝置，其特徵為具備：記憶顯示該相關關係的相關數據的記憶手段；及將受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度，與記憶於該記憶手段的該相關數據比對，而算出該氧量的氧量算出手段。
  41. 一種氧量估算程式，其係利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將該皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值作為指標而估算該氧量的氧量估算程式，其特徵為：使電腦作為氧量算出手段而發揮作用，該氧量算出手段係將受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度，與顯示該相關關係的相關數據比對，而算出該氧量。
  42. 一種皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之估算方法，其特徵為利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將該皮下組織 之氧量作為指標而估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度。
  43. 如請求項42之黏彈性或纖維化程度之估算方法，其中使用將皮下組織之氧量之評價值設為解釋變數，將皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度之測定值設為目的變數的迴歸方程式，由該皮下組織之氧量之評價值，算出皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度。
  44. 如請求項42或43之黏彈性或纖維化程度之估算方法，其中藉由近紅外線分光法而測定該皮下組織之氧量。
  45. 如請求項42至44中任一項之黏彈性或纖維化程度之估算方法，其中該黏彈性為皮下組織上層之黏彈性。
  46. 一種皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度估算裝置，其係利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將該皮下組織之氧量作為指標而估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度的皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度估算裝置，其特徵為具備：記憶顯示該相關關係的相關數據的記憶手段；及將受試者之皮下組織之氧量，與記憶於該記憶手段的該相關數據比對，而算出該黏彈性或纖維化程度的黏彈性或纖維化程度算出手段。
  47. 一種皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度估算程式，其係利用皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度與皮下組織之氧量之間的相關關係，將該皮下組織之氧量作為指標而估算皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程 度的皮下組織之黏彈性或皮下脂肪細胞之纖維化程度估算程式，其特徵為：使電腦作為黏彈性或纖維化程度算出手段而發揮作用，該黏彈性或纖維化程度算出手段係將受試者之皮下組織之氧量，與顯示該相關關係的相關數據比對，而算出該黏彈性或纖維化程度。
  48. 一種纖維化程度之估算方法，其特徵為利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將該皮下組織之黏彈性作為指標而估算該纖維化程度。
  49. 如請求項48之纖維化程度之估算方法，其中使用將皮下組織之黏彈性之測定值設為解釋變數，將皮下脂肪細胞之纖維化程度之評價值設為目的變數的迴歸方程式，由該皮下組織之黏彈性之測定值，算出該纖維化程度。
  50. 如請求項48或49之纖維化程度之估算方法，其中藉由超音波彈性成像而測定該皮下組織之黏彈性。
  51. 如請求項48至50中任一項之纖維化程度之估算方法，其中該黏彈性為皮下組織上層之黏彈性。
  52. 一種纖維化程度估算裝置，其係利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將該皮下組織之黏彈性之測定值作為指標而估算該纖維化程度的纖維化程度估算裝置，其特徵為具備：記憶顯示該相關關係的相關數據的記憶手段；及將受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性，與記憶於該記憶手段的該相關數據比對，而算出該纖維化程度的纖維化程度算出手段。
  53. 一種纖維化程度估算程式，其係利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將該皮下組織之黏彈性之測定值作為指標而估算該纖維化程度的纖維化程度估算程式，其特徵為：使電腦作為纖維化程度算出手段而發揮作用，該纖維化程度算出手段係將受試者之皮膚的皮下組織之黏彈性，與顯示該相關關係的相關數據比對，而算出該纖維化程度。
  54. 一種皮下組織之黏彈性之估算方法，其特徵為利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將該皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標而估算皮下組織之黏彈性。
  55. 如請求項54之黏彈性之估算方法，其中使用將皮下脂肪細胞之纖維化程度之評價值設為解釋變數，將皮下組織之黏彈性之測定值設為目的變數的迴歸方程式，由該皮下脂肪細胞之纖維化程度之評價值，算出皮下組織之黏彈性。
  56. 如請求項54或55之黏彈性之估算方法，其中藉由超音波診斷裝置而測定該皮下脂肪細胞之纖維化程度。
  57. 如請求項56之黏彈性之估算方法，其中藉由超音波診斷裝置而取得皮下組織之回波影像，由該影像生成直方圖，將皮下脂肪細胞之纖維化程度作為該直方圖之偏度而算出。
  58. 如請求項54至57中任一項之黏彈性之估算方法，其中該黏彈性為皮下組織上層之黏彈性。
  59. 一種皮下組織之黏彈性估算裝置，其係利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將該皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標而估算皮下組織之黏彈性 的皮下組織之黏彈性估算裝置，其特徵為具備：記憶顯示該相關關係的相關數據的記憶手段；及將受試者之皮下脂肪細胞之纖維化程度，與記憶於該記憶手段的該相關數據比對，而算出該黏彈性的黏彈性算出手段。
  60. 一種皮下組織之黏彈性估算程式，其係利用皮下組織之黏彈性與皮下脂肪細胞之纖維化程度之間的相關關係，將該皮下脂肪細胞之纖維化程度作為指標而估算皮下組織之黏彈性的皮下組織之黏彈性估算程式，其特徵為：使電腦作為黏彈性算出手段而發揮作用，該黏彈性算出手段係將受試者之皮下脂肪細胞之纖維化程度，與顯示該相關關係的相關數據比對，而算出該黏彈性。
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