WO2019225728A1

WO2019225728A1 - 加齢又は低酸素による皮膚の状態を改善する成分のスクリーニング方法並びに皮下組織の粘弾性を指標とする皮下組織の酸素レベル又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法

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Publication number: WO2019225728A1
Application number: PCT/JP2019/020590
Authority: WO
Inventors: 興治水越; 祥弘浜中; 元紀黒住; 麻里栗林; 麻友望月
Original assignee: ポーラ化成工業株式会社
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2019-11-28
Also published as: TW202012925A

Abstract

本発明の解決しようとする第1の課題は、生体におけるコラーゲン構造の悪化を抑制する効果のある成分をスクリーニングするための新たな技術を提供することにある。　第１の課題を解決する本発明は、細胞を分散させたコラーゲン含有組成物に、被検成分を添加して、低酸素条件でインキュベーションしたときの、コラーゲン線維の結束度の上昇低減効果を指標とすることを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢による、コラーゲン構造の悪化を抑制する成分のスクリーニング方法である。

Description

加齢又は低酸素による皮膚の状態を改善する成分のスクリーニング方法並びに皮下組織の粘弾性を指標とする皮下組織の酸素レベル又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法

　本発明は、コラーゲン構造の悪化抑制成分のスクリーニング方法に関する。

　また、本発明は、組織の線維化を抑制する成分のスクリーニング方法に関する。

　また、本発明は、細胞接着装置の機能の低下を抑制する成分のスクリーニング方法に関する。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性を指標とする皮下組織の酸素レベルの推定方法、推定装置及び推定プログラム、並びに、皮下組織の粘弾性の推定方法、推定装置及び推定プログラムに関する。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性を指標とする皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法、推定装置及び推定プログラム、並びに、皮下組織の粘弾性の推定方法、推定装置及び推定プログラムに関する。

　近年、加齢に伴う人体の各組織の機能低下、すなわち老化現象を抑制することを目的とするアンチエイジングに関する研究が盛んに行われている。特に美容、化粧料の技術分野においては加齢に伴う肌のしわ、たるみ、しみなどの老化現象を抑制する有効成分の探索がされている。

　例えば、特許文献１には、真皮の構造形成の制御に関わる遺伝子の発現を指標とすることで、皮膚のシワ、たるみ、ハリの低下を改善する素材をスクリーニングする方法が開示されている。
　特許文献２には、細胞の核膜異常状態を指標として、シワの予防又は改善効果を有する成分をスクリーニングする方法が開示されている。

　また、特許文献３には、細胞における皮膚支帯成分の発現量を指標として、シワ改善、タルミ改善、ハリの低下防止、肌の弾力性の低下防止などの効果を有する有効成分をスクリーニングする方法が開示されている。

　また、皮下組織に存在する皮下脂肪細胞に着目して、たるみの改善を狙う研究も行われている。特許文献４には、皮下脂肪細胞の接着分子の活性を指標としてたるみ改善成分をスクリーニングする方法が開示されている（特許文献４）。

　多細胞生物では、血液細胞などの浮遊細胞を除くすべての細胞は、他の細胞あるいは細胞外マトリックスに結合し組織や器官を形成している。細胞は、結合する装置として、結合部位に特殊な構造（結合装置）を形成する。この結合を総称して、細胞結合（ｃｅｌｌ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）という。
　脊椎動物の細胞結合（ｃｅｌｌ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）は、固定結合（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、連絡結合（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｎｇ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、及び閉鎖結合（ｏｃｃｌｕｄｉｎｇ　ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）の３種類に分類される。
　そして、固定結合に分類される細胞接着を実現する細胞接着装置としてアドヘレンスジャンクション（ＡＪ：ａｄｈｅｒｅｎｓ－ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、閉鎖結合に分類される細胞接着を実現する細胞接着装置としてタイトジャンクション（ＴＪ：Ｔｉｇｈｔ－ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が知られている。

　タイトジャンクション及びアドヘレンスジャンクションは、細胞の周囲にベルト状に存在し、隣り合った細胞同士を密着させることにより隙間を塞ぐと共に、連続的に細胞を繋ぎ止める細胞間接着構造体である。皮膚組織において、ＴＪは顆粒層の表皮細胞に存在しており、水や物質が細胞間隙を透過するのを防ぎ、皮膚バリア機能を維持するために重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献１を参照）。また、アドヘレンスジャンクションの正常な形成がタイトジャンクションの形成に重要な役割を果たすことも知られている。
　加齢に伴い皮膚バリア機能が弱まることで、肌が乾燥状態を呈することが知られている（非特許文献２）。

　タイトジャンクション及びアドヘレンスジャンクションの機能を向上させる成分の探索も盛んに行われており、例えば、特許文献５にはＴＲＰＶ受容体の活性化作用を指標とする皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング方法が開示されている。

　ところで、血液ガス分析による解析により、動脈血のｐＯ_２（酸素分圧）が低下することが知られている（非特許文献３）。これは加齢に伴い人体の各組織が低酸素の状態に置かれることを示している。
　このような知見により、低酸素状態と老化現象の関連が示唆されているが、低酸素状況下でどのような生理学的変化が起こることで老化が起こるのか、そのメカニズムの全容は明らかとなっていない。

　一方、加齢に伴い結合組織が次第に柔軟性、弾力性を失い硬くなっていくことが知られている。これは、結合組織の主要成分であるコラーゲン線維が加齢とともに架橋し、結束してしまうことに起因していると考えられている（非特許文献４）。
　しかし、加齢に伴うコラーゲン線維の結束がどのようなメカニズムで生じるのかについては明らかとなっていない。

　加齢に伴う肌の老化現象、すなわち皺、たるみ、しみなどの外見上の変化は、皮膚の内部構造の生理化学的変化に起因する。近年、このような肌の老化現象の抑制を目的として、皮膚の内部構造における加齢変化のメカニズム解明に関心が集まっている。

　皮膚は、大きく分けて表皮、真皮、そして皮下組織の３層よりなる。表皮はさらに角質層、顆粒層、有棘層及び基底層の４つの層に分類でき、下層に位置する真皮は乳頭層、乳頭下層及び網状層の３つの層に分類できる。これら表皮、真皮を支える役割を担うのが皮下組織である。

　皮下組織の大部分は脂肪細胞が集塊を形成した脂肪小葉から構成される皮下脂肪であり、保温や外力に対する緩衝作用などを有する。脂肪小葉はコラーゲン線維やエラスチン線維などの結合組織等によって周囲が網目状に取り囲まれることで、線維構造を形成する。

　皮膚の硬さなどを判断する手法として古くは触診が行われていたが、超音波エラストグラフィ技術（例えば特許文献６）の発展により、皮膚を構成するそれぞれの層の物理学的特性、とりわけ粘弾性の定量的測定が可能となっている。

　ところで、体組織の線維化を病理的に診断する方法として、生体組織診断（いわゆる「生検」）が一般に行われる。しかし、生検は被検者への侵襲を伴うことから頻回に行うことは困難であった。超音波エラストグラフィを原理とした「フィブロスキャン」では、肝線維化の評価を非侵襲的に行うことが可能であると開示されている（特許文献７）。

特開２０１８－０９３７４３号公報特開２０１３－２５７３４７号公報特開２０１７－１１２９１８号公報特開２０１６－１８７３２４号公報特開２０１１－１１５１５２号公報特表２００９－５３９５２８号公報国際公開２０１１／０８１２１４号パンフレット

Ｄｅｎｄａ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１２７（３），６５４－６５９（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　（１９９３）Ｖｏｌ．１，１１１－１２０日本老年医学会雑誌／１５巻（１９７８）１号、「健康老年者の動脈血ガス分析値」、田口悦子ら、１９７８年Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉｓｓｕｅ，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．１，２５－２８（１９８４）

　生体より採取した組織片は、新規の素材を探索する際のツールとして用いられることがある。生体におけるコラーゲン構造に影響を与える成分の探索に当たっても、コラーゲン構造を含む真皮組織等の組織片を生体より採取し、これをモデルとして用いることは理論上可能である。
　しかし、組織片は生体より採取されたものであるが故、その品質の均一性が担保されておらず、再現性に悖るという問題点がある。

　このような問題に鑑み、本発明の解決しようとする第1の課題は、生体におけるコラーゲン構造の悪化を抑制する効果のある成分をスクリーニングするための新たな技術を提供することにある。

　また、本発明の解決しようとする第２の課題は、肌の老化現象、特にたるみを改善又は予防する効果のある成分をスクリーニングするための新たな技術を提供することにある。

　また、本発明の解決しようとする第３の課題は、肌の老化現象、特に加齢に伴う皮膚バリア機能の低下を改善又は予防する効果のある成分をスクリーニングするための新たな技術を提供することにある。

　また、本発明の解決しようとする第４の課題は、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、酸素レベルの推定を可能とする、新規な技術を提供することにある。

　また、本発明の解決しようとする第５の課題は、肌の内部の物理的測定値から、皮下組織の粘弾性又は脂肪細胞を包む線維構造の線維化レベルの推定を可能とする、新規な技術を提供することにある。

　本発明の第1の課題に関して、細胞を分散させたコラーゲン含有組成物を低酸素条件下でインキュベーションしたところ、驚くべきことにコラーゲン線維の結束度が上昇することが、発明者の鋭意研究努力により判明した。
　この結果は、加齢に伴い人体の各組織が低酸素条件にさらされること（非特許文献３）、並びに、加齢に伴い結合組織におけるコラーゲン線維の結束が昂進すること（非特許文献４）、という２つの知見と合致するものである。
　つまり、本発明者が構築した上記試験系は、人体の結合組織におけるコラーゲン線維の加齢に伴う結束度の向上を再現できる良好なモデルとして活用できることが明らかとなった。

　かかる知見に基づき、本発明者は本発明を完成させた。
　すなわち、上記第１の課題を解決する本発明は、細胞を分散させたコラーゲン含有組成物に、被検成分を添加して、低酸素条件でインキュベーションしたときの、コラーゲン線維の結束度の上昇低減効果を指標とすることを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢による、コラーゲン構造の悪化を抑制する成分のスクリーニング方法である。
　本発明によれば、低酸素条件や加齢に伴うコラーゲン構造の悪化を抑制する成分を簡便にスクリーニングすることができる。

　本発明の好ましい形態では、前記被検成分の存在下及び非存在下で、前記コラーゲン含有組成物を低酸素条件下でインキュベーションし、
　被検成分の存在下でインキュベーションした後のコラーゲン線維の結束度が、被検成分の非存在下でインキュベーションした後のコラーゲン線維の結束度よりも低い場合に、
　前記被検成分が、低酸素条件及び／又は加齢による、コラーゲン構造の悪化を抑制する成分であると判定することを特徴とする。
　このように対照試験を実施する形態とすることにより、より正確なスクリーニングが可能となる。

　本発明は、低酸素条件や加齢に伴う結合組織のコラーゲン構造の悪化を抑制する成分のスクリーニングに応用することができる。

　本発明の好ましい形態では、前記細胞が結合組織細胞である。結合組織を構成する結合組織細胞を用いることで、結合組織におけるコラーゲン構造の悪化抑制成分をより精度よくスクリーニングすることができる。

　本発明の好ましい形態では、前記インキュベーション後のコラーゲン線維の顕微鏡撮影画像に基づき、前記コラーゲン線維の結束度を評価することを特徴とする。
　顕微鏡撮影画像に基づく形態とすることで、コラーゲン線維の結束度の評価を容易に行うことができる。

　本発明の好ましい形態では、前記顕微鏡撮影画像に対して画像解析処理を施し、前記コラーゲン線維の結束度を定量化した画像解析処理結果に基づき、前記コラーゲン線維の結束度を評価することを特徴とする。
　このように定量的に評価する形態とすることにより、より精度の高いスクリーニングが実現できる。

　本発明の好ましい形態では、前記画像解析処理において、前記顕微鏡撮影画像に対してフーリエ変換処理を施して２次元空間周波数パワースペクトルを表すフーリエ変換画像を取得し、
　該フーリエ変換画像の少なくとも原点を通過する直線を設定し、該直線の長さ方向について、該直線上における該フーリエ変換画像のパワーをプロットして得られる波形、又は、
　該フーリエ変換画像から、少なくともその原点を含む略矩形領域画像を切り出し、切り出された略矩形領域画像の短径方向のパワーの平均値を、該略矩形領域画像の長径方向についてプロットして得られる波形、
　を得ることを特徴とする。
　フーリエ変換を用いることにより、複雑な顕微鏡撮影画像の定量的な評価が容易となる。

　本発明の好ましい形態では、前記波形の傾斜部分の少なくとも一部を切り出し、前記傾斜部分の近似直線を作成し、該近似直線に対する前記波形を構成するデータのばらつきの程度が小さいほど、前記コラーゲン構造の悪化を抑制する効果に優れるものと判断することを特徴とする。
　データのばらつきの程度という一次元的な尺度に基づきコラーゲン構造の結束度を評価することで、より簡便なスクリーニングが可能である。

　本発明の好ましい形態では、前記ばらつきの程度を標準偏差により評価することを特徴とする。
　標準偏差により評価することにより、統計学的観点から精度の高い評価が可能となる。

　本発明の好ましい形態では、前記低酸素条件が、細胞培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件であることを特徴とする。
　このような条件下でインキュベーションを行うことにより、より効果的にスクリーニングを行うことができる。

　本発明は抗老化成分のスクリーニング方法に応用することができる。

　また本発明は、加齢に伴うシワ、たるみ又はハリの低下の改善又は予防成分のスクリーニング方法に応用することができる。

　また、本発明は、アオイ科ゼニアオイ属（Ｍａｌｖａｃｅａｅ　Ｍａｌｖａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含む、低酸素条件及び／又は加齢による、コラーゲン構造の悪化の抑制剤にも関する。

　本発明の第２の課題に関して、本発明者らの鋭意研究の結果、皮下脂肪層の相対的な粘弾性が加齢に伴い低下することが明らかとなった。この知見に基づき、さらに詳細な解析を行ったところ、皮下組織に存在する皮下脂肪細胞を包むコラーゲン線維が、加齢とともに線維化することが明らかとなった。加齢に伴い動脈血の酸素濃度が低下することが知られていることから（非特許文献３）、本発明らは皮下脂肪細胞の線維化は低酸素条件によって惹起されている可能性に着目した。そして、さらなる解析の結果、本発明者らは低酸素条件下に置かれた皮下脂肪細胞において、コラーゲン線維の架橋に関わる遺伝子であるｌｏｘの発現量の上昇が観察されることを見出し、本発明を完成させた。

　上記第２の課題を解決する本発明は、低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とする、
　低酸素条件及び／又は加齢による、皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分のスクリーニング方法である。

　本発明の方法によれば、低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分を容易にスクリーニングすることができる。

　本発明の好ましい形態では、前記細胞が脂肪細胞である。これにより、皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をより精度よくスクリーニングすることができる。

　本発明は、抗老化成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。

　また、本発明は、加齢に伴うたるみの改善又は予防成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。

　本発明の好ましい形態では、被検成分の非存在下において低酸素条件で培養した細胞と比較して、被検成分の存在下において低酸素条件下で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現量が低い場合に、該被検成分を低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分であると判定する。
　このように対照実験を行うことにより、より精度よくスクリーニングを行うことができる。

　本発明の好ましい形態では、前記低酸素条件が、細胞培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件である。
　このような条件下で細胞培養を行うことにより、より効果的にスクリーニングを行うことができる。

　本発明の好ましい形態では、ｖｅｇｆ遺伝子の発現量の上昇を、低酸素条件で培養した細胞において低酸素応答が生じていることの指標とする。
　このような指標を置くことにより、試験系の適正性を確認することができ、より正確にスクリーニングを行うことができる。

　また、本発明は上述のスクリーニング方法により見出された有効成分にも関する。具体的には、本発明はナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ　Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢によるｌｏｘ遺伝子の発現の上昇抑制剤及び皮下脂肪細胞の線維化抑制剤、並びに加齢に伴うたるみの改善又は予防剤にも関する。

　上述の通り、皮膚のバリア機能は加齢に伴い低下する（非特許文献２）。一方、加齢に伴い動脈血の酸素濃度が低下することが知られていることから（非特許文献３）、本発明らは皮膚バリア機能の低下が低酸素条件によって惹起されている可能性に着目した。鋭意研究の結果、本発明の第３の課題に関して、本発明者らは低酸素条件下に置かれた表皮細胞において、タイトジャンクションの形成に関わる遺伝子であるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ及びｚｏ－１、並びにアドヘレンスジャンクションの形成に関わる遺伝子であるｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の発現量の低下が観察されることを見出し、本発明を完成させた。

　上記第３の課題を解決する本発明は、低酸素条件で培養した細胞におけるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子から選ばれる遺伝子の発現低下の抑制効果を指標とする、
低酸素条件及び／又は加齢による表皮の細胞接着装置の機能低下を抑制する成分のスクリーニング方法である。
　本発明によれば、低酸素条件ないし加齢に伴う細胞接着装置の機能の低下を抑制する成分を簡便にスクリーニングすることができる。

　本発明の好ましい形態では、低酸素条件で培養した細胞におけるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子及びｚｏ－１遺伝子から選ばれる遺伝子の発現低下の抑制効果を指標とする。
　これにより、低酸素条件及び／又は加齢による表皮のタイトジャンクションの機能低下を抑制する成分をスクリーニングすることができる。

　また、本発明の好ましい形態では、低酸素条件で培養した細胞におけるｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の発現低下の抑制効果を指標とする。
　これにより、低酸素条件及び／又は加齢による表皮のアドヘレンスジャンクションの機能低下を抑制する成分をスクリーニングすることができる。

　本発明の好ましい形態では、前記細胞がケラチノサイトである。
　ケラチノサイトを用いることにより、より精度よく表皮のタイトジャンクション機能の低下を抑制する成分をスクリーニングすることができる。

　本発明は抗老化成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。

　本発明は加齢に伴う皮膚バリア機能の低下の改善又は予防成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。

　本発明の好ましい形態では、被検成分の非存在下において低酸素条件で培養した細胞と比較して、被検成分の存在下において低酸素条件下で培養した細胞におけるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子及びｚｏ－１遺伝子から選ばれる遺伝子の発現量が高い場合に、該被検成分を低酸素条件及び／又は加齢による表皮のタイトジャンクション機能低下を抑制する成分であると判定する。
　このように対照試験を行う実施形態とすることにより、精度の高いスクリーニングを実現することができる。

　本発明の好ましい実施の形態では、前記低酸素条件が、細胞培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件である。
　このような条件下で細胞培養を行うことにより、より効果的に低酸素条件ないし加齢に伴うタイトジャンクション機能の低下を抑制する成分をスクリーニングすることができる。

　本発明の好ましい形態では、ｖｅｇｆ遺伝子の発現量の上昇を、低酸素条件で培養した細胞において低酸素応答が生じていることの指標とする。
　このように低酸素応答反応のマーカーを同時に測定することにより、精度が高いことを確認しながらスクリーニングを行うことができる。

　また、本発明は上述のスクリーニング方法により有効性が確認された成分を含む剤にも関する。具体的には、本発明は、シソ科ハッカ属（Ｌａｍｉａｃｅａｅ　Ｍｅｎｔｈａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢によるｃｌａｕｄｉｎ遺伝子の発現低下抑制剤、表皮の細胞接着装置の機能低下抑制剤、及び加齢に伴う皮膚バリア機能の低下の改善又は予防剤にも関する。

　本発明の第４の課題に関して、本発明者らは、鋭意研究の結果、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、酸素レベルとの間には相関関係があることを見出し、本発明を完成させた。

　すなわち、上記第４の課題を解決する本発明は、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として前記酸素レベルを推定することを特徴とする、酸素レベルの推定方法である。
　本発明によれば、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルという物理特性ないし生理特性から、皮下組織の酸素レベルを推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値を説明変数、皮下組織の酸素レベルの評価値を目的変数とする回帰式を用いて、前記皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値から前記酸素レベルを算出することを特徴とする。
　予め用意した回帰式を用いることで、より正確に皮下組織の酸素レベルを推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、前記皮下組織の粘弾性を、超音波エラストグラフィにより測定することを特徴とする。
　これにより、非侵襲的かつ定量的に皮下組織の粘弾性の測定結果を得ることができ、より精度よく皮下組織の酸素レベルを推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、前記粘弾性が皮下組織上層の粘弾性であることを特徴とする。
　特に皮下組織上層の粘弾性を指標とすることで、より正確に皮下組織の酸素レベルを推定することができる。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値を指標として前記酸素レベルを推定する酸素レベル推定装置であって、
　前記相関関係を示す相関データを記憶する記憶手段と、
　被験者の肌の皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを、前記記憶手段に記憶された前記相関データと照合して、前記酸素レベルを算出する酸素レベル算出手段と、を備えることを特徴とする。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値を指標として前記酸素レベルを推定する酸素レベル推定プログラムであって、
　コンピュータを、
　被験者の肌の皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを、前記相関関係を示す相関データと照合して、前記酸素レベルを算出する酸素レベル算出手段として、
　機能させることを特徴とする。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の酸素レベルを指標として皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することを特徴とする、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法にも関する。
　本発明は、上述した皮下組織の酸素レベルの推定方法と表裏をなすものである。本発明によれば、皮下組織の酸素レベルという生理学的特性から、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、皮下組織の酸素レベルの評価値を説明変数、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値を目的変数とする回帰式を用いて、前記皮下組織の酸素レベルの評価値から皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを算出することを特徴とする。
　予め用意した回帰式を用いることで、より正確に皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、前記皮下組織の酸素レベルを、近赤外線分光法により測定することを特徴とする。
　これにより、非侵襲的かつ定量的に皮下組織の酸素レベルの測定結果を得ることができ、より精度よく皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、前記粘弾性が皮下組織上層の粘弾性であることを特徴とする。
　本発明は、特に皮下組織上層の粘弾性の推定に有用である。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の酸素レベルを指標として皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定する皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベル推定装置であって、
　前記相関関係を示す相関データを記憶する記憶手段と、
　被験者の皮下組織の酸素レベルを、前記記憶手段に記憶された前記相関データと照合して、前記粘弾性又は線維化レベルを算出する粘弾性又は線維化レベル算出手段と、を備えることを特徴とする。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の酸素レベルを指標として皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定する皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベル推定プログラムであって、
　コンピュータを、
　被験者の皮下組織の酸素レベルを、前記相関関係を示す相関データと照合して、前記粘弾性又は線維化レベルを算出する粘弾性又は線維化レベル算出手段として、
　機能させることを特徴とする。

　本発明の第５の課題に関して、本発明者らの鋭意研究の結果、皮下組織に存在する皮下脂肪細胞を包むコラーゲン線維が、加齢とともに線維化することが明らかとなった。そして、さらなる解析の結果、本発明者らは皮下組織の粘弾性と脂肪細胞を包む線維構造の線維化レベルとの間には相関関係があることを見出し、本発明を完成させた。

　すなわち、上記第５の課題を解決する本発明は、皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性を指標として前記線維化レベルを推定することを特徴とする、線維化レベルの推定方法である。
　本発明によれば、皮下組織の粘弾性という物理特性から、皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、皮下組織の粘弾性の測定値を説明変数、皮下脂肪細胞の線維化レベルの評価値を目的変数とする回帰式を用いて、前記皮下組織の粘弾性の測定値から前記線維化レベルを算出することを特徴とする。
　予め用意した回帰式を用いることで、より正確に皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、前記皮下組織の粘弾性を、超音波エラストグラフィにより測定することを特徴とする。
　これにより、非侵襲的かつ定量的に皮下組織の粘弾性の測定結果を得ることができ、より精度よく皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、前記粘弾性が皮下組織上層の粘弾性であることを特徴とする。
　特に皮下組織上層の粘弾性を指標とすることで、より正確に皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することができる。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性を指標として前記線維化レベルを推定する線維化レベル推定装置にも関する。
　本発明の線維化レベル推定装置は、
　前記相関関係を示す相関データを記憶する記憶手段と、
　被験者の肌の皮下組織の粘弾性を、記憶手段に記憶された前記相関データと照合して、前記線維化レベルを算出する線維化レベル算出手段と、を備えることを特徴とする。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性を指標として前記線維化レベルを推定する線維化レベル推定プログラムにも関する。
　本発明の線維化レベル推定プログラムは、
　コンピュータを、
　被験者の肌の皮下組織の粘弾性を、前記相関関係を示す相関データと照合して、前記線維化レベルを算出する線維化レベル算出手段として、
　機能させることを特徴とする。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として皮下組織の粘弾性を推定することを特徴とする、皮下組織の粘弾性の推定方法にも関する。
　本発明は、上述した皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法と表裏をなすものである。本発明によれば、皮下脂肪細胞の線維化レベルという生理学的・解剖学的特性から、皮下組織の粘弾性を推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、皮下脂肪細胞の線維化レベルの評価値を説明変数、皮下組織の粘弾性の測定値を目的変数とする回帰式を用いて、前記皮下脂肪細胞の線維化レベルの評価値から皮下組織の粘弾性を算出することを特徴とする。
　予め用意した回帰式を用いることで、より正確に皮下組織の粘弾性を推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、前記皮下脂肪細胞の線維化レベルを、超音波診断装置により測定することを特徴とする。
　これにより、非侵襲的かつ定量的に皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定結果を得ることができ、より精度よく皮下組織の粘弾性を推定することができる。

　本発明の好ましい形態では、超音波診断装置により皮下組織のエコー画像を取得し、該画像よりヒストグラムを生成し、皮下脂肪細胞の線維化レベルを該ヒストグラムの歪度として算出することを特徴とする。
　ヒストグラムから算出した歪度を指標とすることで、皮下脂肪細胞の線維化レベルを客観的に評価することができ、より精度よく皮下組織の粘弾性を推定することができる。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として皮下組織の粘弾性を推定する皮下組織の粘弾性推定装置にも関する。
　本発明の粘弾性推定装置は、
　前記相関関係を示す相関データを記憶する記憶手段と、
　被験者の皮下脂肪細胞の線維化レベルを、前記記憶手段に記憶された前記相関データと照合して、前記粘弾性を算出する粘弾性算出手段と、を備えることを特徴とする。

　また、本発明は、皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として皮下組織の粘弾性を推定する皮下組織の粘弾性推定プログラムにも関する。
　本発明の粘弾性推定プログラムは、
　コンピュータを、
　被験者の皮下脂肪細胞の線維化レベルを、前記相関関係を示す相関データと照合して、前記粘弾性を算出する粘弾性算出手段として、
　機能させることを特徴とする。

　本発明によれば、低酸素条件及び／又は加齢によるコラーゲン構造の悪化を抑制する成分を容易にスクリーニングすることができる。

　本発明によれば、抗老化成分、具体的には低酸素条件及び／又は加齢による組織の線維化を抑制する成分を容易にスクリーニングすることができる。
　また本発明のスクリーニング法でその有効性が確認されたナデシコ科サボンソウ属に属する植物の抽出物を有効成分として含む剤は、低酸素条件及び／又は加齢によるｌｏｘ遺伝子の発現の上昇抑制効果、皮下脂肪細胞の線維化抑制効果、並びに加齢に伴うたるみの改善効果又は予防効果を発揮する。

　本発明によれば、抗老化成分、具体的には低酸素条件及び／又は加齢による表皮のタイトジャンクション機能の低下を抑制する成分を容易にスクリーニングすることができる。

　本発明によれば、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルから、皮下組織の酸素レベルを推定することができる。
　また、本発明によれば、皮下組織の酸素レベルから、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することができる。

　本発明によれば、皮下組織の粘弾性から、皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することができる。
　また、本発明によれば、皮下脂肪細胞の線維化レベルから、皮下組織の粘弾性を推定することができる。

加齢に伴い全身の酸素飽和度が低下することを示すグラフである。加齢に伴い局所組織の酸素飽和度が低下することを示すグラフである。フーリエ変換画像（上段）の原点を通過する直線を設定し、その直線の長さ方向について、直線上におけるフーリエ変換画像のパワーをプロットして得た波形（下段）。フーリエ変換画像（上段）から、その原点を中心に含む矩形領域画像を切り出し、切り出された矩形領域画像の短径（縦）方向のパワーの平均値を、略矩形領域画像の長径（横）方向についてプロットして得た波形（下段）。波形データ（上段）の傾斜部分を切り出し（下段）、波形を構成するデータについて近似直線を作成することを表す概略図。通常酸素状態、または低酸素状態においてインキュベーションしたコラーゲン含有組成物におけるコラーゲン線維を撮影した電子顕微鏡撮影画像。２次元空間周波数パワースペクトルを表すフーリエ変換画像である。画像に表された長方形領域を選択し、この領域について波形データを得る。フーリエ変換画像より選択された領域における、２次元空間周波数パワースペクトルのパワーを表す波形である。波形の傾斜部分における波形を構成するデータと、そのデータについて算出された近似直線を表す。図９に示した近似直線と波形を構成するデータとのパワーの差分（Δｐｏｗｅｒ）を縦軸にプロットしたグラフである。通常の酸素濃度条件、及び低酸素条件において培養した細胞における、皮下脂肪細胞の線維構造の相違を示す顕微鏡写真である。通常の酸素濃度条件、及び低酸素条件において培養した細胞におけるｖｅｇｆ遺伝子、ｃｏｌ１ａ１遺伝子、ｃｏｌ３ａ１遺伝子、ｔｇｆ－β遺伝子、及びｌｏｘ遺伝子の発現量を表す棒グラフである。サボンソウ葉エキス又はブドウ葉エキスを添加し、低酸素条件において培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現量を表す棒グラフである。通常の酸素濃度条件、及び低酸素条件において培養した細胞におけるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子、及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の発現量を表す棒グラフである。セイヨウハッカ葉エキス又はユキノシタエキスを添加し、低酸素条件において培養した細胞におけるｃｌａｕｄｉｎ遺伝子の発現量を表す棒グラフである。局所組織の酸素飽和度と皮下組織の粘弾性の相関関係を示すグラフである。本発明の線維化レベル推定装置の一実施形態を示すハードウェアブロック図である。本発明の粘弾性推定装置の一実施形態を示すハードウェアブロック図である。皮下脂肪細胞の線維化の程度を評価するために用いた、電子顕微鏡により取得された基準写真である。線維化の進行の程度が最も低いものがスコア１の写真であり、線維化の進行の程度が最も高いものがスコア５の写真である。９名のドナーの皮下脂肪細胞を観察し、基準写真をもとにスコアをつけた結果を表す散布図である。エラストグラフィ解析によって得られた、皮膚の内部断面における粘弾性の分布を表すイメージング画像である。超音波解析によって得られた、皮下脂肪層における線維化状態を表す画像、及び画像処理により得られたヒストグラムである。（Ａ）は線維化の程度が低い画像、（Ｂ）は線維化の程度が高い画像を表す。また、（Ｃ）は（Ａ）に対応するヒストグラムの歪度が大きい画像、（Ｄ）は（Ｂ）に対応するヒストグラムの歪度が小さい画像を表す。試験例１１の解析結果についての回帰分析の結果を表すグラフである。

　第１～第３の課題を解決する本発明は、被検成分を含む培地で細胞を低酸素条件下で培養し、培養系の状態の変化を指標とする、低酸素条件及び／又は加齢による、皮膚の状態又は機能を改善する成分のスクリーニング方法である。

　ここで、「培養系の状態の変化」とは、所定条件下で培養された細胞内における皮膚状態関連遺伝子の発現の変化、及び、細胞の培養液や足場など細胞外における環境の変化を指す。
　また、「皮膚の状態又は機能」とは、皮膚のシワ、たるみ又はハリの低下、コラーゲン構造の変化（線維化を含む）、バリア機能、等である。
　以下、各課題に対応する本発明の実施の形態を、それぞれ詳細に説明する。

＜１＞スクリーニング方法
　第１の課題を解決する本発明は、低酸素条件において進行するコラーゲン線維の架橋化による、コラーゲン構造の悪化を抑制する成分をスクリーニングする方法である。また、加齢に伴い組織が低酸素条件に置かれることから（非特許文献３）、本発明は、加齢によるコラーゲン構造の悪化を抑制する成分をもスクリーニングの対象とすることができる。

　なお、骨、歯、軟骨、脂肪、腱、靱帯、真皮、皮下組織などの結合組織の主成分はコラーゲンである。よって、本発明は結合組織のコラーゲン構造の悪化を抑制する成分のスクリーニング方法に応用することができる。

　特に、真皮組織のコラーゲン線維の架橋が進み、コラーゲン構造が悪化すると、皮膚のシワ、たるみ又はハリの低下に代表される老化が進む。
　したがって、本発明は、抗老化成分、より具体的には、加齢に伴うシワ、たるみ又はハリの低下の改善又は予防成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。
　以下、本発明の構成について詳述する。

（１）コラーゲン含有組成物
　本発明においては、細胞を分散させたコラーゲン含有組成物を用いる。コラーゲン含有組成物は、コラーゲンを含有する組成物であり、細胞培養を阻害するような組成のものでなければ、その具体的構成は限定されない。

　コラーゲン含有組成物は、細胞培養のための各種成分を含んでいることが好ましい。例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ´ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ´ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓ－　ｇｏｗ´ｓ　ＭＥＭ）、Ｆ１２（Ｈａｍ´ｓ　Ｆ１２　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＭＯＣ－３（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ´ｓ　ＢＭＯＣ－３　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＣＭＲＬ－１０６６、Ｌ－１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ´ｓ　Ｌ－１５　ｍｅｄｉｕｍ）、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ、Ｍｅｄｉａ　１９９、ＭＥＭ　αＭｅｄｉａ、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’　ｍｅｄｉｕｍ　Ｅなど細胞培養に常用される基本培地；ＦＢＳなどの血清；ＫＳＲなどの血清代替品；ＮａＨＣＯ_３、ＨＥＰＥＳなどの緩衝剤；ｐＨ調製の目的でのアルカリや酸；ＦＧＦなどの各種成長因子などを例示できる。
　コラーゲン含有組成物に分散させる細胞の種類により、上記任意成分の種類及びその濃度を適宜選択することができる。

　コラーゲン含有組成物は、液体状であってもゲル状であってもよい。生体内におけるコラーゲンの存在態様、より具体的には結合組織の態様に近づけるという観点から、コラーゲン含有組成物はコラーゲンゲルの形態とすることが好ましい。

　コラーゲン含有組成物に含まれるコラーゲンの種類は特に限定されないが、Ｉ型～ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型などの線維性コラーゲンが好適に例示できる。コラーゲンは、動物の皮膚などの結合組織より抽出することにより得ることができる。

　コラーゲンとしては、市販品を特に制限なく用いることができる。例えば、Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ／Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ａｃｉｄｉｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（株式会社高研社製）、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　Ｔｙｐｅ　Ｉ－Ａ（新田ゼラチン株式会社製）、コラーゲンタイプＩＩＩウシ真皮由来（株式会社ニッピ製）などが挙げられる。

　コラーゲン含有組成物におけるコラーゲンの濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１～１０質量％、より好ましくは０．０５～８質量％、さらに好ましくは０．１～５質量％、さらに好ましくは０．３～２質量％、さらに好ましくは０．５～１．５質量％である。

（２）細胞
　コラーゲン含有組成物に分散させる細胞の種類は特に限定されず、生体から採取した初代培養細胞や、株化された培養細胞を用いることができる。
　なお、コラーゲンは結合組織の主要成分である。よって、生体における結合組織を再現したモデルとしての精度を向上させる観点からは、線維芽細胞、細網細胞、組織球、形質細胞、リンパ球、脂肪細胞、肥満細胞、顆粒白血球、色素細胞などの結合組織細胞を用いることが好ましく、中でも線維芽細胞を用いることが特に好ましい。
　これら細胞については、初代培養細胞や株化細胞が市販されており、これを本発明のために制限無く使用することができる。

　コラーゲン含有組成物に分散させる細胞の数は特に限定されない。コラーゲン含有組成物の１ｍＬ当たりの細胞数としては、好ましくは１×１０^２個～１×１０^６個、より好ましくは１×１０^３個～１×１０^５個、さらに好ましくは５×１０^３個～５×１０^４個を目安とすることができる。

　コラーゲン含有組成物の調製方法は特に限定されない。
　まず、コラーゲン含有組成物を構成するコラーゲン溶液を調製し、これに別途用意した細胞の懸濁液を加えて混合することでコラーゲン含有組成物を調製することが好ましい。

（３）被検成分
　被検成分をコラーゲン含有組成物に添加する際の態様は限定されない。好ましくは被検成分を含む溶液をコラーゲン含有組成物に添加する形態とする。被検成分を含む溶液は、コラーゲン含有組成物の調製に使用したものと同じ基本培地や血清などの培地成分を含むことが好ましい。

　コラーゲン含有組成物をコラーゲンゲルの形態として本発明を実施する場合には、コラーゲン含有組成物がゲル化する前の溶液を培養容器に充填し、ＣＯ_２インキュベーター内で数時間静置し、完全にゲル化した状態となってから、被検成分を添加することが好ましい。
　また、被検成分の添加前に、ゲル化したコラーゲン含有組成物を培養容器の内壁から剥離させてから被検成分を添加することが好ましい。

　コラーゲン含有組成物に対する、被検成分の溶液の添加量も特に限定されない。コラーゲン含有組成物に対する被検成分の溶液の体積比は、好ましくは０．１～１０、より好ましくは０．２～５、さらに好ましくは０．３～２を目安とすることができる。

（４）インキュベーション
　被検成分の添加の後、コラーゲン含有組成物を低酸素条件下でインキュベーションする。
　通常の細胞培養におけるＣＯ_２インキュベーターにおいて酸素濃度は１８～１９％程度であるので、これよりも低い酸素濃度でインキュベーションする。具体的には、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは７％以下、さらに好ましくは５％以下、さらに好ましくは３％以下の酸素濃度でインキュベーションする。
　酸素濃度の下限は、コラーゲン含有組成物に分散された細胞が死滅しなければ特に制限されないが、好ましくは０．１％以上、より好ましくは０．５％以上の酸素濃度である。

　低酸素条件でのインキュベーションにおいては、炭酸ガスの他に窒素ガスや混合ガスなどのボンベを併設した低酸素濃度培養用ＣＯ_２インキュベーター（例えば、池本理化工業社製）を用いてもよいし、ガス濃度調節剤を備えるガスバリア性パウチからなる低酸素培養器具（例えば、スギヤマ技研製）を用いてもよい。

　インキュベーション期間は特に制限されず、コラーゲン含有組成物に分散した細胞の種類や数、これに基づき予想されるコンフルエントに達する時間等を考慮して適宜設計することができる。具体的には、好ましくは１２時間～１０日、より好ましくは１日～９日、さらに好ましくは３日～８日を目安とすることができる。
　このインキュベーションの期間中、被検成分を含む培地を用いて培地交換をしてもよい。

　なお、対照として、被検成分を添加せずにコラーゲン含有組成物をインキュベーションすることが好ましい。対照との比較によって、後述するコラーゲン線維の結束度の上昇低減効果の確認が容易となるからである。

（５）コラーゲン線維の結束度の観察
　生体内では加齢に伴い結合組織のコラーゲンの架橋が進み、コラーゲン線維の結束度が向上する。細胞が分散されたコラーゲン含有組成物を低酸素条件下でインキュベーションしたときにも、この生体内での事象と同じく、コラーゲン含有組成物中のコラーゲン線維の結束度が上昇する。
　本発明においては、被検成分を添加したときのコラーゲン含有組成物におけるコラーゲン線維の結束度の上昇低減効果を指標とする。

　インキュベーション後のコラーゲン含有組成物におけるコラーゲン線維の結束度の確認方法は特に限定されないが、顕微鏡、特に電子顕微鏡による観察を好適に例示することができる。
　電子顕微鏡としては走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、及び走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）の何れを用いても構わない。

　本発明においては顕微鏡撮影画像に基づき、コラーゲン含有組成物におけるコラーゲン線維の結束度を評価する形態とすることが好ましい。
　顕微鏡で観察したとき、コラーゲン線維が束になって凝集しているように見える箇所が、コラーゲン線維の結束部分である。この結束部分の数や大きさなどを観察し、その程度が大きい場合に、結束度が高いと評価することができる。

　顕微鏡撮影画像に基づく評価の実施の形態は特に制限されない。
　例えば、予め用意しておいた基準写真を基に官能的に結束度を評価する形態としてもよい。
　また、顕微鏡撮影画像に対して画像解析処理を施し、コラーゲン線維の結束度を定量化した画像解析処理結果に基づいて、結束度を評価する形態としてもよい。

　ここでいう画像解析処理の手法は特に限定されない。顕微鏡撮影画像において結束部分は高強度（高光度、高明度、高輝度など）で表示される傾向がある。そのため、画像解析処理によって、強度（光度、明度、輝度など）のパラメータを計算処理することで、結束度を定量的に評価することができる。

　以下、画像解析処理としてフーリエ変換処理による手法を具体的に説明する。
　フーリエ変換は周期性の評価手法である。２次元の画像に対してフーリエ変換を行った場合、パワーが濃淡で表された２次元空間周波数パワースペクトルを表すフーリエ変換画像が得られる。このフーリエ変換画像の中心は波数０の原点であり、原点より離れた位置ほど高波数を表す。

　フーリエ変換の手法としては、離散フーリエ変換（ＤＦＴ）や、演算量を減らした高速フーリエ変換（ＦＦＴ）などが挙げられる。
　なお、フーリエ変換で扱えるのは通常グレースケールの画像なので、顕微鏡撮影画像をグレースケールに変換してからフーリエ変換することが好ましい。

　次に、フーリエ変換画像に基づき、パワーの波形に関するデータを得る。
　パワーの波形は、以下の何れかの方法により算出することができる。
　（ｉ）フーリエ変換画像の少なくとも原点を通過する直線を設定し、該直線の長さ方向について、該直線上における該フーリエ変換画像のパワーをプロットして得る（図３に概略図を示す）。
　（ｉｉ）フーリエ変換画像から、少なくともその原点を含む略矩形領域画像を切り出し、切り出された略矩形領域画像の短径方向のパワーの平均値を、該略矩形領域画像の長径方向についてプロットして得る（図４に概略図を示す）。

　図３及び図４の下段において、縦軸はパワーであるが、フーリエ変換画像においてパワーは濃淡により表現される。したがって、パワーについてはフーリエ変換画像の光度や輝度、明度に基づき算出することができる。

　また、図３及び図４の下段において、横軸は周波数であるが、フーリエ変換画像はデジタル画像としてコンピュータ上で処理されるため、画素（ｐｉｘｅｌ）に基づく位置情報として取得される。

　元データである顕微鏡撮影画像においては、上述した通り、コラーゲン構造の結束部分は高光度、高明度又は高輝度で表示される傾向がある。すなわち、コラーゲン構造の結束度が高い場合には、顕微鏡撮影画像において高光度、高明度又は高輝度の領域が高頻度に出現することとなる。そのため、これをフーリエ変換した２次元空間周波数パワースペクトルにおいては、周波数ごとのパワーにばらつきが生じやすい傾向となる。
　したがって、波形で表されるパワーのばらつきの程度が高いほど、元データである顕微鏡撮影画像に表されたコラーゲン線維の結束度は高いと評価することができる。

　このばらつきの程度は、波形の傾斜部分における近似直線（図５）に対する、波形を構成するデータのばらつきにより評価可能である。
　例えば、近似直線と波形を構成するデータとのパワーの差分（Δパワー）を算出し、Δパワーのデータ集合についての標準偏差によって、波形を構成するデータのばらつきを客観的に評価することができる。

＜２＞コラーゲン構造の悪化の抑制剤
　アオイ科ゼニアオイ属（Ｍａｌｖａｃｅａｅ　Ｍａｌｖａ）に属する植物の抽出物には、低酸素条件や加齢による、コラーゲン構造の悪化を抑制する効果がある。
　つまり、アオイ科ゼニアオイ属に属する植物の抽出物は、コラーゲンを主成分とする組織である、骨、歯、軟骨、脂肪、腱、靱帯、真皮、皮下組織などの結合組織の機能低下の改善又は予防に効果を奏する。

　また、真皮組織のコラーゲン構造が悪化すると、皮膚のシワ、たるみ又はハリの低下に代表される老化が進む。
　したがって、アオイ科ゼニアオイ属に属する植物の抽出物には、コラーゲン構造の悪化を抑制する効果に付随して、抗老化作用、より具体的には、加齢に伴う皮膚のシワ、たるみ又はハリの低下の改善又は予防効果があると言える。

　本発明の有効成分であるアオイ科ゼニアオイ属に属する植物としては、Ｍａｌｖａ　ａｅｇｙｐｔｉａ　Ｌ．、Ｍａｌｖａ　ａｌｃｅａ　Ｌ．、Ｍａｌｖａ　ａｌｃｅａ　ｖａｒ．　ｆａｓｔｉｇｉａｔａ　（Ｃａｖ．）　Ｋ．　Ｋｏｃｈ、Ｍａｌｖａ　ａｒｂｏｒｅａ　（Ｌ．）　Ｗｅｂｂ　＆　Ｂｅｒｔｈｅｌ．、Ｍａｌｖａ　ａｓｓｕｒｇｅｎｔｉｆｌｏｒａ　（Ｋｅｌｌｏｇｇ）　Ｍ．Ｆ．Ｒａｙ、Ｍａｌｖａ　ｂｏｒｅａｌｉｓ　Ｗａｌｌｍａｎ、Ｍａｌｖａ　ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ　Ｍ．Ｆ．Ｒａｙ、Ｍａｌｖａ　ｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ　Ｍ．Ｇ．　Ｇｉｌｂｅｒｔ，　Ｙ．　Ｔａｎｇ　＆　Ｄｏｒｒ、Ｍａｌｖａ　ｃｒｅｔｉｃａ　Ｃａｖ．、Ｍａｌｖａ　ｃｒｅｔｉｃａ　ｓｕｂｓｐ．　ａｌｔｈａｅｏｉｄｅｓ　（Ｃａｖ．）　Ｄａｌｂｙ、Ｍａｌｖａ　ｄｕｒｉｅｕｉ　Ｓｐａｃｈ、Ｍａｌｖａ　ｅｒｅｃｔａ　Ｊ．　Ｐｒｅｓｌ　＆　Ｃ．　Ｐｒｅｓｌ、Ｍａｌｖａ　ｈｉｓｐａｎｉｃａ　Ｌ．、Ｍａｌｖａ　ｉｌｊｉｎｉｉ　Ｒｉｅｄｌ、Ｍａｌｖａ　ｌｉｎｄｓａｙｉ　（Ｍｏｒａｎ）　Ｍ．Ｆ．Ｒａｙ、Ｍａｌｖａ　ｍｏｓｃｈａｔａ　Ｌ．（ジャコウアオイ）、Ｍａｌｖａ　ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ　（Ｃａｖ．）　Ｓｏｌｄａｎｏ，　Ｂａｎｆｉ　＆　Ｇａｌａｓｓｏ、Ｍａｌｖａ　ｎｅｇｌｅｃｔａ　Ｗａｌｌｒ．、Ｍａｌｖａ　ｎｉｃａｅｅｎｓｉｓ　Ａｌｌ．、Ｍａｌｖａ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　（Ｓ．Ｗａｔｓｏｎ）　Ｍ．Ｆ．Ｒａｙ、Ｍａｌｖａ　ｐａｃｉｆｉｃａ　Ｍ．Ｆ．Ｒａｙ、Ｍａｌｖａ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ　Ｌ．（ウサギアオイ）、Ｍａｌｖａ　ｐｒｅｉｓｓｉａｎａ　Ｍｉｑ．、Ｍａｌｖａ　ｐｓｅｕｄｏｌａｖａｔｅｒａ　Ｗｅｂｂ　＆　Ｂｅｒｔｈｅｌ．、Ｍａｌｖａ　ｐｕｓｉｌｌａ　Ｓｍ．、Ｍａｌｖａ　ｓｔｉｐｕｌａｃｅａ　Ｃａｖ．、Ｍａｌｖａ　ｓｕｂｏｖａｔａ　（ＤＣ．）　Ｍｏｌｅｒｏ　＆　Ｊ．Ｍ．Ｍｏｎｔｓ．、Ｍａｌｖａ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　Ｌ．（ウスベニアオイ）、Ｍａｌｖａ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　ｖａｒ．　ｍａｕｒｉｔｉａｎａ　（Ｌ．）　Ｂｏｉｓｓ．（ゼニアオイ）、Ｍａｌｖａ　ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉａｎａ　Ｌ．、Ｍａｌｖａ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ　Ｌ．（フユアオイ）、Ｍａｌｖａ　ｖｉｄａｌｉｉ　（Ｐａｕ）　Ｍｏｌｅｒｏ　＆　Ｊ．Ｍ．Ｍｏｎｔｓ．などが挙げられる。
　特に好ましくはゼニアオイ（Ｍａｌｖａ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　ｖａｒ．　ｍａｕｒｉｔｉａｎａ　（Ｌ．）　Ｂｏｉｓｓ．）を例示できる。

　アオイ科ゼニアオイ属に属する植物の抽出物を得る際の抽出部位は、特に限定されず、植物の花、葉、茎、根、種から選ばれる１種又は２種以上を用いて、抽出物を得ることができる。このなかでも、特に花から得られる抽出物が好ましい。

　本発明における前記の植物の抽出物は、日本において自生又は生育された植物、漢方生薬原料などとして販売される日本産のものを用い抽出物を作製することもできるし、丸善株式会社などの植物抽出物を扱う会社より販売されている市販の抽出物を購入し、使用することもできる。

　抽出に際し、植物は予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出物は、植物またはその乾燥物１質量に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬する。浸漬後は、室温まで冷却し、所望により不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮するなどにより除去することができる。その後、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィ－などで分画精製し、所望の抽出物を得ることができる。

　抽出溶媒としては、極性溶媒が好ましく、水、エタノ－ル、イソプロピルアルコ－ル、ブタノ－ルなどのアルコ－ル類、１，３－ブタンジオ－ル、ポリプロピレングリコ－ルなどの多価アルコ－ル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエ－テル、テトラヒドロフランなどのエ－テル類から選択される１種乃至は２種以上が好適に例示できる。

　本発明は外用剤又は経口剤の形態とすることが好ましい。
　外用剤としては化粧料、医薬部外品、医薬品などが好適に例示でき、本発明の効果を損ねない限度において、通常使用される任意成分を含有することもできる。

　このような任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボカド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール等；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ－２－エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ－２－エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ－２－エチルヘキサン酸グリセリン、トリ－２－エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ－２－エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類等の油剤類；脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類；塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類；イミダゾリン系両性界面活性剤（２－ココイル－２－イミダゾリニウムヒドロキサイド－１－カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類；ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２－オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２－デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類；ポリエチレングリコール、グリセリン、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、２，４－ヘキサンジオール等の多価アルコール類；ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤；アントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸系紫外線吸収剤；桂皮酸系紫外線吸収剤；ベンゾフェノン系紫外線吸収剤；糖系紫外線吸収剤；２－（２'－ヒドロキシ－５'－ｔ－オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４－メトキシ－４'－ｔ－ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類フェノキシエタノール等の抗菌剤などが好ましく例示できる。

　経口剤としては、例えば、菓子やパン、麺などの一般食品、ドリンク製剤、カプセル剤や錠剤の形態をとる健康増進の目的を有する食品群（例えば、特定保健用食品等）、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤や、錠剤の形態をとる経口投与医薬品等が例示できる。

　経口剤の形態とする場合においては、許容される任意成分を含有することができる。この様な任意成分としては、食品であれば、塩、砂糖、グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸ナトリウム、酢等の調味成分、着色成分、フレーバー等の矯臭成分、増粘剤、乳化・分散剤、保存料、安定剤、各種ビタミン類等が好適に例示でき、健康増進の目的を有する食品群や医薬品であれば、結晶セルロース、乳糖等の賦形剤、アラビヤガムやヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、クロスカルメロースナトリウム、デンプン等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、矯味、矯臭剤、着色剤、各種ビタミン類等が好ましく例示できる。これらを常法に従って処理することにより、本発明の経口投与組成物を製造することができる。

　経口剤における前記植物の抽出物の総含有量は、固形分として、０．０５～１００質量％、より好ましくは３０～８０質量％とすることができる。
　また、固形分として前記植物の抽出物を１日あたり１０～１０００ｍｇを１回又は数回に分けて飲用する形態とすることが好ましい。

　第２の課題を解決する本発明は、低酸素条件において進行する皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をスクリーニングする方法である。また、加齢に伴い組織が低酸素条件に置かれることから、本発明は、加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をもスクリーニングの対象とすることができる。

　ここで、「線維化」とは、組織を取り巻くコラーゲンの異常な増加やコラーゲン線維同士が架橋することにより、組織が硬くなる現象のことをいう。
　線維化の要因としてはコラーゲンそのものの発現量の増加や、コラーゲン線維構造の架橋反応に関わる遺伝子の発現量の増加が想定できるが、発明者の鋭意研究の結果、低酸素条件で生じる皮下脂肪細胞の線維化にはｌｏｘ遺伝子の発現量の上昇が深く関わっていることが明らかとなった。

　ｌｏｘ遺伝子の産物であるＬＯＸ（リシンオキシダーゼ）は、コラーゲンとエラスチン前駆体のリシン残基にアルデヒド基を形成する反応を触媒する細胞外酵素である。これらアルデヒドは反応性が高く、他の酸化リシン由来アルデヒド基や無修飾のリシン残基と自発的な化学反応を起こす。その結果、コラーゲン線維の安定化や、成熟エラスチンの完全性と弾性に重要な、コラーゲンとエラスチンの架橋を生じさせる。

　ｌｏｘ遺伝子自体は組織の安定化に重要な役割を果たすが、発現が亢進することによって線維化を生じさせる。上述したとおり、低酸素下における皮下脂肪細胞の線維化は、コラーゲンの発現上昇ではなく、ｌｏｘ遺伝子の発現上昇が要因である。そのため、低酸素条件下におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇を抑制する成分は、すなわち、低酸素条件や加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分であるということができる。

　以上より、本発明は、低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とすることを必須の構成とする。

　上述したように、皮下脂肪細胞は、加齢（動脈血中の酸素濃度の低下）に伴い線維化が進行する。したがって、本発明は、低酸素条件及び／又は加齢による、皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分のスクリーニング方法に好適に応用することができる。

　また、皮下脂肪層における脂肪細胞を包むコラーゲン線維構造の線維化が進むと、皮下組織の物理学的特性が悪化し、皮膚の重みを支えることが困難になり、皮膚のたるみに代表される老化が進む。
　したがって、本発明は、抗老化成分、より具体的には、加齢に伴うたるみの改善又は予防成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。

　以下、本発明の具体的な構成について説明を加える。
　本発明に用いる細胞は、樹立された培養細胞株であってもよく、また、初代培養細胞であってもよい。
　細胞の種類も特に限定されないが、脂肪細胞を用いることが好ましい。褐色脂肪細胞であっても白色脂肪細胞であってもよいが、好ましくは白色脂肪細胞を用いる。
　皮下脂肪前駆細胞を分化させることで得た、成熟した皮下脂肪細胞を本発明に用いてもよい。

　細胞培養に用いる培地は使用する細胞に適した公知のものを制限なく用いることができる。皮下脂肪前駆細胞を皮下脂肪細胞に分化させる場合に使用する増殖培地、分化培地、維持培地は公知の何れのものであってもよく、市販のキットを用いてもよい。

　本発明においては低酸素条件で細胞を培養することが必須である。通常の細胞培養におけるＣＯ_２インキュベーターにおいて酸素濃度は１８～１９％程度であるので、これよりも低い酸素濃度で細胞を培養する。具体的には、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは７％以下、さらに好ましくは５％以下、さらに好ましくは３％以下の酸素濃度で細胞を培養する。
　酸素濃度の下限は培養細胞が死滅しなければ特に制限されないが、好ましくは０．１％以上、より好ましくは０．５％以上の酸素濃度で細胞を培養する。

　低酸素条件での細胞培養においては、炭酸ガスの他に窒素ガスや混合ガスなどのボンベを併設した低酸素濃度培養用ＣＯ_２インキュベーター（例えば、池本理化工業社製）を用いてもよいし、ガス濃度調節剤を備えるガスバリア性パウチからなる低酸素培養器具（例えば、スギヤマ技研製）を用いてもよい。

　本発明においては低酸素条件下で培養している細胞の培地に被検成分を添加し、所定の期間培養を継続した後にｌｏｘ遺伝子の発現量を測定する。
　ｌｏｘ遺伝子の発現量の測定方法は限定されず、回収した細胞におけるｌｏｘ遺伝子のｍＲＮＡ量をＲＴ－ＰＣＲによって測定する方法が好ましく例示できる。

　低酸素条件で細胞を培養するとｌｏｘ遺伝子の発現量が上昇する。本発明においては、被検成分を培地に添加したとき、低酸素条件におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の程度が低減した場合に、当該被検成分が低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分であると判定し選択する。

　被検成分が低酸素条件におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を有しているか否か正確に判定するために対照実験も実施することが好ましい。
　すなわち、被検成分の非存在下において低酸素条件で培養した細胞を対照として、被検成分の存在下において低酸素条件下で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現量を比較する。前者よりも後者の方がｌｏｘ遺伝子の発現量が低い場合に、該被検成分を低酸素条件及び／又は加齢による組織の線維化を抑制する成分であると判定することが好ましい。

　ｌｏｘ遺伝子の発現量の測定に加え、細胞が低酸素応答反応を起こしていることを確認するために、低酸素応答反応のマーカーであるｖｅｇｆ遺伝子の発現量を測定することも好ましい。
　ｖｅｇｆ遺伝子の発現量が、通常の酸素濃度で細胞を培養したときに比べて高いことが確認できれば、試験系が適正であると評価することができ、スクリーニングの正確性を向上させることができる。

　本発明のスクリーニング方法によれば、低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をスクリーニングすることができる。そして、本発明は、上記スクリーニング方法により見出された成分を有効成分として含む剤にも関する。

　低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分としては、ナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ　Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を挙げることができる。

　ナデシコ科サボンソウ属に属する植物としては、特に限定されないが、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）を例示することができる。

　本発明における前記植物の抽出物は、日本又は外国において自生又は生育された植物、漢方生薬原料などとして販売されるものを用い抽出物を作製することもできるし、丸善株式会社などの植物抽出物を扱う会社より販売されている市販の抽出物を購入し、使用することもできる。

　植物抽出物は、植物抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物ないしは画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。

　抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。
　抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３－ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。

　具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位又はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。

　本発明の剤は、製剤化に用いられる任意の成分と適宜組み合わせて、外用剤又は経口剤の形態とすることが好ましい。
　外用剤としては、例えば、化粧料、医薬部外品、皮膚外用医薬等の形態が挙げられる。また、それらの剤形は特に制限されない。中でも、加齢に伴う皮膚のたるみを改善又は予防するという用途との関係から、継続的に使用可能な化粧料の形態が好ましく、中でも、化粧水、美容液、乳液、クリーム、ジェル、サンケア品等の形態が好ましい。

　また、経口剤とする場合には、本発明の剤を有効成分として含む食品用組成物の形態とすることが好ましい。より具体的には、一般食品、錠剤、顆粒剤、ドリンク剤等の剤形を有するサプリメントの形態とすることが好ましい。

　外用剤における植物抽出物の含有量（抽出物の場合は乾燥質量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常８０質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。

　また、経口剤の場合には、剤形に応じて、１回あたりの摂取量が抽出物の乾燥質量として、通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上であり、通常２０００ｍｇ以下、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。

　化粧料の形態とする場合には、通常化粧料で使用される任意成分を含有していてもよい。任意成分としては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３－ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２－ペンタンジオール、２，４－ヘキシレングリコール、１，２－ヘキサンジオール、１，２－オクタンジオール等のポリオール、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２－ココイル－２－イミダゾリニウムヒドロキサイド－１－カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２－オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２－デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、表面処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面処理されていても良い、酸化コバルト、群青、紺青、酸化亜鉛の無機顔料類、表面処理されていても良い、酸化鉄二酸化チタン焼結体等の複合顔料、表面処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩，ビタミンＢ６トリパルミテート，ビタミンＢ６ジオクタノエート，ビタミンＢ２又はその誘導体，ビタミンＢ１２，ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α－トコフェロール，β－トコフェロール，γ－トコフェロール，ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類が挙げられる。

　第３の課題を解決する本発明は、低酸素条件において進行する表皮の細胞接着装置の機能の低下を抑制する成分をスクリーニングする方法である。また、加齢に伴い組織が低酸素条件に置かれることから、本発明は、加齢による表皮の細胞接着装置の機能の低下を抑制する成分をもスクリーニングの対象とすることができる。

　本発明は、低酸素条件で培養した細胞におけるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子から選ばれる遺伝子の発現低下の抑制効果を指標とすることを必須の構成とする。
　これら４種の遺伝子のうち２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは全種の発現低下の抑制効果を指標とする形態とすることによって、さらに精度よくスクリーニングを行うことができる。

　表皮の細胞接着装置、特にタイトジャンクション機能は皮膚のバリア機能に重要な役割を果たしている。
　したがって、本発明は、抗老化成分、より具体的には、加齢に伴う皮膚バリア機能の低下の改善又は予防成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。

　以下、本発明の具体的な構成について説明を加える。
　本発明に用いる細胞は、樹立された培養細胞株であってもよく、また、初代培養細胞であってもよい。細胞の種類も特に限定されないが、ケラチノサイトを用いることが好ましい。
　細胞培養に用いる培地は使用する細胞に適した公知のものを制限なく用いることができる。

　また、本発明においては生体より採取した皮膚、または培養皮膚三次元モデルを用いてもよい。皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、角層などを除いた、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。

　培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト又はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な（癌化していない）ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、このような形態の市販品を購入して使用することもできる。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「ＥＰＩ－２００」（正常培養ヒト三次元皮膚モデル）などが好適に例示できる。

　本発明においては低酸素条件下で培養している細胞の培地に被検成分を添加し、所定の期間培養を継続した後にｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子から選ばれる遺伝子の発現量を測定する。
　これら遺伝子の発現量の測定方法は限定されず、回収した細胞におけるこれら遺伝子のｍＲＮＡ量をＲＴ－ＰＣＲによって測定する方法が好ましく例示できる。

　低酸素条件で細胞を培養するとｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の発現量が低下する。本発明においては、被検成分を培地に添加したとき、低酸素条件におけるこれら遺伝子群から選ばれる少なくとも１種、好ましくは２種、より好ましくは３種、さらに好ましくは４種の遺伝子の発現低下の程度が低減した場合に、当該被検成分が低酸素条件及び／又は加齢による表皮の細胞接着装置の機能の低下を抑制する成分であると判定し選択する。

　被検成分が低酸素条件におけるこれら遺伝子の発現低下の抑制効果を有しているか否か正確に判定するために対照実験も実施することが好ましい。
　すなわち、被検成分の非存在下において低酸素条件で培養した細胞を対照として、被検成分の存在下において低酸素条件下で培養した細胞におけるこれら遺伝子の発現量を比較する。前者よりも後者の方がこれら遺伝子の発現量が高い場合に、該被検成分を低酸素条件及び／又は加齢による表皮の細胞接着装置の機能の低下を抑制する成分であると判定することが好ましい。

　本発明のスクリーニング方法によれば、低酸素条件及び／又は加齢による細胞接着装置の機能低下を抑制する成分をスクリーニングすることができる。そして、本発明は、上記スクリーニング方法により見出された、成分を有効成分として含む剤にも関する。

　低酸素条件及び／又は加齢による細胞接着装置の機能低下を抑制する成分としては、シソ科ハッカ属（Ｌａｍｉａｃｅａｅ　Ｍｅｎｔｈａ）に属する植物の抽出物を挙げることができる。
　シソ科ハッカ属に属する植物としては、特に限定されないが、セイヨウハッカ（Ｍｅｎｔｈａ　ｐｉｐｅｒｉｔａ）を例示することができる。

＜１＞皮下組織の酸素レベル又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法
　以下、第４及び５の課題を解決する本発明の実施の形態について詳述する。
　皮下組織の粘弾性（以下、単に粘弾性ともいう）と皮下組織の酸素レベル（以下、単に酸素レベルともいう）との間には、正の相関関係が成立する。つまり、酸素レベルが高いほど、粘弾性が大きい関係にある。
　一方、皮下組織の粘弾性と脂肪細胞を包む線維構造の線維化レベル（以下、単に線維化レベルともいう）との間には、負の相関関係が成立する。つまり、線維化レベルが小さいほど、粘弾性が大きい関係にある。
　本発明は、かかる相関関係を利用して粘弾性から皮下組織の酸素レベル又は脂肪細胞を包む線維構造の線維化レベルを推定する。

　皮下組織は、粘弾性が略均一な部分ごとに、深さ方向について大きく３つの層に分類することができる。具体的には、皮下組織を深さ方向に１：２：１の比率で分割したとき、一番上に位置する層（真皮に接する層）のことを皮下組織上層という。
　本発明においては、真皮に最も近い層である皮下組織上層の粘弾性を指標とすることが好ましい。

　上記相関関係は好ましくは式またはモデルで示される。式またはモデルとしては、単回帰式又は単回帰モデルが好ましく挙げられる。

　粘弾性は、粘性と弾性の両方を合わせた性質のことをいう。したがって、粘弾性の評価に当たっては粘性と弾性の両方を評価することになる。しかし、生体組織においては粘性と弾性を明確に区別することは困難であり、粘弾性は主として弾性率（ヤング率）により評価されることが一般的である。
　また、フックの法則（下記式１）に基づき、粘弾性を「ひずみ」により評価してもよい。

式１

　そのため、本発明において指標とされる粘弾性は、弾性率（ヤング率）又はひずみとして算出される形態としてもよい。
　上述の回帰式又は回帰モデルの作成に当たっても、説明変数を皮下組織のヤング率又はひずみ、目的変数を酸素レベル又は線維化レベルと置いてよい。

　酸素レベルは、血液中の酸素飽和度を指す。酸素飽和度は、動脈血を直接採血して測定した動脈血酸素飽和度（ＳａＯ_２）であってもよいし、パルスオキシメーター等の測定装置を用いて測定した経皮的酸素飽和度（ＳｐＯ_２）であってもよい。また、近赤外線分光法（Ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＮＩＲＳ）を用いた局所組織酸素飽和度（ｒＳＯ_２）であってもよい。

　本明細書において、皮下組織の酸素レベルとは、全身を循環する動脈血のうち、特に末梢領域における皮下組織の毛細血管を循環する局所組織の酸素飽和度のことをいう。

　皮下脂肪細胞は、皮下組織の大部分を構成する脂肪細胞を指す。脂肪細胞は集塊を形成し、コラーゲンやエラスチンなどの結合組織にその周囲が網目状に包まれた脂肪小葉として存在する。

　脂肪小葉の周囲には、さらに血管や神経が網目状に走行し、栄養物質や老廃物の運搬が行われる。このように、脂肪小葉が結合組織や血管などにより網目状に取り囲まれることで形成される分葉状の構造を、脂肪細胞を包む線維構造と呼ぶ。脂肪細胞を包む線維構造は、脂肪小葉それ自体を形成する線維構造全体、或いは個々の脂肪細胞の周囲に存在する結合組織の部分的な局所構造のように、異なる構成単位に分けることができる。
　本発明による皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法は、特に、個々の脂肪細胞の周囲に存在する線維構造の線維化レベルの推定に有用である。

　ここで、線維化とは、組織を取り巻くコラーゲンの異常な増加やコラーゲン線維同士が架橋することにより、組織が硬くなる現象のことをいう。
　線維化の要因としてはコラーゲンそのものの発現量の増加や、コラーゲン線維構造の架橋反応に関わる遺伝子の発現量の増加が想定できる。
　本明細書において線維化レベルとは、線維化の進行度ないし程度のことをいう。

　皮下組織の粘弾性は超音波エラストグラフィにより測定することができる。超音波エラストグラフィの手法としては、外部から応力σを加えて肌を変形させてひずみε測定し、フックの法則よりヤング率Ｅを求めるストレイン・イメージングや、肌にせん断波を伝搬させ、その伝搬速度Ｃ_Ｓを測定することでヤング率Ｅを求めるシアウェーブ・イメージングなど公知の手法を制限なく用いることができる。

　超音波エラストグラフィ装置としては、例えば日立製作所製「ＡＲＩＥＴＴＡ　Ｅ７０」や「Ｎｏｂｌｕｓ」、シーメンスヘルスケア製「アキュソンＳ２０００ｅ」などを用いることができる。

　超音波エラストグラフィによれば、肌の内部断面における粘弾性（ヤング率（機種によってはひずみ））の分布を画像として得ることができる。本発明の実施に当たっては皮下組織に不均一に分布する粘弾性の平均を測定値として用いてもよい。

　皮下組織の粘弾性の測定に当たっては、皮下組織を深さ方向について上層、中層、下層の３層に分け、それぞれの層における粘弾性の平均を求める形態とすることが好ましい。特に皮下組織上層の粘弾性の平均を測定値として用いて、皮下組織の酸素レベル又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定する実施の形態とすることが好ましい。

＜２＞皮下組織の粘弾性の推定方法
　上述したとおり、皮下組織の粘弾性と酸素レベルとの間には、正の相関関係が成立し、皮下組織の粘弾性と脂肪細胞を包む線維構造の線維化レベルとの間には、負の相関関係が成立する。本発明は、かかる相関関係を利用して酸素レベル又は線維化レベルから皮下組織の粘弾性を推定する。
　上記相関関係は好ましくは式またはモデルで示される。式またはモデルとしては、単回帰式又は単回帰モデルが好ましく挙げられる。

　酸素レベルの評価方法は特に制限されない。
　上述したように、侵襲的な方法としては、被験者の動脈血を採血して酸素分圧を測定する方法が挙げられる。また、非侵襲的な方法としては、パルスオキシメーターを用いて指尖部の動脈の血流を検知してＳｐＯ_２を測定する方法や、ＮＩＲＳを用いて頬部などのｒＳＯ_２を測定する方法が挙げられる。

　パルスオキシメーターを用いる場合、プローブの種類は特に制限されず、透過型のものを用いてもよいし、反射型のものを用いてもよい。これらは、市販されているものを適宜使用することができる。
　ＮＩＲＳを用いる場合も同様に、特段の制限なく市販されている製品を適宜使用することができる。

　線維化レベルの評価方法は特に限定されない。
　侵襲的な方法としてはフォトスケールを用いて相対的な評価値を算出する方法が挙げられる。より詳しくは、予め線維化レベルの異なる皮下脂肪細胞の画像を複数用意する。これを基準写真として、被験者より採取した皮下脂肪細胞の画像に評点をつける。

　侵襲的な方法は被験者に負担を強いることになるため、好ましくは非侵襲的な方法で皮下脂肪細胞の線維化レベルを評価する。
　非侵襲的な方法としては、超音波を用いる方法が挙げられる。より詳しくは、超音波により得られた皮膚の断層面の画像から、皮下脂肪層部分を切り出し、解析用画像とする。取得した解析用画像について、画像処理ソフトウェアを用いて得られる特徴量から線維化レベルを評価することができる。
　このような特徴量としては、画像をグレースケール化、ヒストグラム化、二値化などして算出されるパラメータが例示できる。

　本発明においては、解析用画像をヒストグラム化し、このヒストグラムの歪度を線維化レベルの評価値として採用することが好ましい。
　歪度の小さいヒストグラム（略正規分布を示す）はひずみが小さいことを表すため、皮下脂肪細胞の線維化レベルが高い状態であると判る。反対に、歪度の大きいヒストグラム（非正規分布を示す）からは皮下脂肪細胞の線維化レベルが低い状態であると判別可能となる。

　画像処理ソフトウェアはオープンソースの「ＩｍａｇｅＪ」など公知の何れのソフトウェアを用いてもよい。

　線維化レベルを評価するために用いる超音波装置は、上述した皮下組織の粘弾性測定の用に供するものと同一のものを用いることができる。

　なお、上記＜１＞の項目及び本項目において、推定のための指標としての粘弾性、酸素レベル又は線維化レベルの測定ないし評価の方法を説明した。この説明は、回帰式又は回帰モデルを作成するための粘弾性、酸素レベル又は線維化レベルの測定ないし評価の方法にも妥当する。

＜３＞皮下組織の酸素レベル又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定装置
　以下、皮下組織の酸素レベル又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定装置について図１７を参照しながら説明を加える。なお、本発明の推定装置は、上記＜１＞の項目で説明した皮下組織の酸素レベル又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法を実施するための装置である。したがって、上記＜１＞の項目の説明は、以下の推定装置に関しても妥当する。また、皮下組織の酸素レベルの推定装置は、皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定装置と同様の構成を有するため、当該推定装置に関しての説明は省略する。皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定装置の説明を準用することで、当該推定装置の構成を理解することができる。

　本発明の皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定装置１は、皮下組織の粘弾性と皮下脂肪細胞の線維化レベルとの相関関係を示す線維化レベル相関データを記憶する記憶手段１２１と、被験者の肌の皮下組織の粘弾性を、記憶手段１２１に記憶された線維化レベル相関データと照合して、前記線維化レベルを算出する線維化レベル算出手段１１２と、を備える。

　図１７に示すように、皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定装置１は、粘弾性測定部１３、記憶手段１２１を備えるＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）１２、線維化レベル算出手段１１２を備えるＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）１１、及び線維化レベル表示部１４を有している。

　本発明の好ましい実施の形態では、粘弾性測定部１３により測定された被験者の肌の皮下組織の粘弾性を数値化する数値化手段１１１を備えることが好ましい。ＣＰＵ１１が数値化手段１１１を備える。

　線維化レベル表示部１４は、線維化レベル算出手段１１２が算出した皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定値を表示するディスプレイである。

　このような構成とした本発明の皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定装置１は、被験者の肌の皮下組織の粘弾性を測定するだけで、容易に被験者の皮下脂肪細胞の線維化レベルを算出することができる。

　なお、他の実施形態では、粘弾性測定部１３及び数値化手段１１１に代えて、別途測定した粘弾性の測定値を入力する、粘弾性入力部を備えていてもよい。

＜４＞皮下組織の酸素レベル又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定プログラム
　本発明は上述の皮下組織の酸素レベル又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法をコンピュータに実行させる推定プログラムにも関する。本発明のプログラムは、上述した本発明の線維化レベルの推定装置に含まれるＣＰＵにおける各手段に対応するため、図１７の符号を付しながら説明する。なお、上記＜３＞の項目で述べた理由と同様の理由により、皮下組織の酸素レベルの推定プログラムに関しての説明は省略する。皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定プログラムの説明を準用することで、当該推定プログラムの機能を理解することができる。

　本発明の皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定プログラムは、被験者の肌の皮下組織の粘弾性を、皮下組織の粘弾性と皮下脂肪細胞の線維化レベルとの相関関係を示す線維化レベル相関データと照合して、前記線維化レベルを算出する線維化レベル算出手段１１２として、コンピュータを機能させることを特徴とする。

　本発明の線維化レベルの推定プログラムは、図１７のブロック図に示すように、コンピュータを数値化手段１１１として機能させるように構成することが好ましい。

＜５＞皮下組織の粘弾性の推定装置
　以下、皮下組織の粘弾性の推定装置について図１８を参照しながら説明を加える。なお、本発明の皮下組織の粘弾性の推定装置は、上記＜２＞の項目で説明した皮下組織の粘弾性の推定方法を実施するための装置である。したがって、上記＜２＞の項目の説明は、以下の皮下組織の粘弾性の推定装置に関しても妥当する。また、以下の説明において、「皮下脂肪細胞の線維化レベル」又は「線維化レベル」を、「皮下組織の酸素レベル」又は「酸素レベル」と読み替えることで、皮下組織の粘弾性と酸素レベルとの相関関係に基づく皮下組織の粘弾性の推定装置の構成を理解することができる。

　本発明の皮下組織の粘弾性の推定装置２は、皮下組織の粘弾性と皮下脂肪細胞の線維化レベルとの相関関係を示す粘弾性相関データを記憶する記憶手段２２１と、被験者の皮下脂肪細胞の線維化レベルを、記憶手段２２１に記憶された粘弾性相関データと照合して、前記粘弾性を算出する粘弾性算出手段２１２と、を備える。

　図１８に示すように、皮下組織の粘弾性の推定装置２は、線維化レベル測定部２３、記憶手段２２１を備えるＲＯＭ２２、粘弾性算出手段２１２を備えるＣＰＵ２１、及び粘弾性表示部２４を有している。

　本発明の好ましい実施の形態では、線維化レベル測定部２３により測定された被験者の皮下脂肪細胞の線維化レベルを数値化する数値化手段２１１を備えることが好ましい。ＣＰＵ２１が数値化手段２１１を備える。

　粘弾性表示部２４は、粘弾性算出手段２１２が算出した皮下組織の粘弾性の推定値を表示するディスプレイである。

　このような構成とした本発明の皮下組織の粘弾性の推定装置２は、被験者の皮下脂肪細胞の線維化レベルを測定するだけで、容易に被験者の皮下組織の粘弾性を算出することができる。

　なお、他の実施形態では、線維化レベル測定部２３及び数値化手段２１１に代えて、別途測定した線維化レベルの測定値を入力する、線維化レベル入力部を備えていてもよい。

＜６＞皮下組織の粘弾性の推定プログラム
　本発明は上述の皮下組織の粘弾性の推定方法をコンピュータに実行させる皮下組織の粘弾性の推定プログラムにも関する。本発明のプログラムは、上述した本発明の粘弾性推定装置に含まれるＣＰＵにおける各手段に対応するため、図１８の符号を付しながら説明する。なお、上記＜５＞の項目で述べたように、「皮下脂肪細胞の線維化レベル」を「皮下組織の酸素レベル」と読み替えることで、皮下組織の粘弾性と酸素レベルとの相関関係に基づく皮下組織の粘弾性の推定プログラムの機能を理解することができる。

　本発明の皮下組織の粘弾性の推定プログラムは、被験者の皮下脂肪細胞の線維化レベルを、皮下組織の粘弾性と皮下脂肪細胞の線維化レベルとの相関関係を示す粘弾性相関データと照合して、前記粘弾性を算出する粘弾性算出手段２１２として、コンピュータを機能させることを特徴とする。

　本発明の粘弾性推定プログラムは、図１８のブロック図に示すように、コンピュータを数値化手段２１１として機能させるように構成することが好ましい。

＜試験例１＞加齢及び酸素レベルの回帰分析
　６０の被験者に対し、パルスオキシメーター（コニカミノルタ社）を用いて全身の動脈血の酸素飽和度を測定した。また、６０名の被験者に対し、ＮＩＲＳ（静岡大学・工学部庭山准教授作製）を用いて頬部の動脈血の酸素飽和度を測定した。得られた酸素飽和度の測定値（全身：ＳｐＯ２、頬部：ｒＯ２）と各被験者の年齢について、それぞれ回帰分析を行った。結果を図１及び２に示す。

　図１及び２に示すように、被験者の年齢と全身の酸素飽和度、及び局所の酸素飽和度の間には、共に負の相関関係が成立することが確認された。
　この結果は、加齢により全身の酸素状態の悪化が引き起こされるのみならず、頬部のような局所の皮膚においても酸素状態の悪化が起こることを示すものである。

＜試験例２＞コラーゲン構造の悪化を抑制する成分の評価
＜１＞コラーゲン含有組成物の調製
　表１上段に示した成分を同表に示した質量比で氷冷しながら混合し、コラーゲン溶液Ａを調製した。コラーゲン溶液Ａと水を表１中段に示す質量比で混合し、コラーゲン溶液Ｂを調製した。２４ｗｅｌｌプレートにコラーゲン溶液Ｂを２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で１５分静置した。
　一方、予め培養していた細胞を回収し、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液と、コラーゲン溶液Ａとを表１下段に記載の割合で混合し、細胞を含むコラーゲン溶液Ｃを得た。
　コラーゲン溶液Ｃを上で説明した２５０μＬ／ｗｅｌｌのコラーゲン溶液Ｂが入ったｗｅｌｌに１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で４時間静置することで、細胞が分散されたゲル状のコラーゲン含有組成物を調製した。

　マイクロスパーテルでコラーゲン含有組成物をプレートの内壁から剥離した。ここへ被検成分を含有する溶液（１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭ）を７５０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。
　脱酸素剤を備えた低酸素培養器具（ＢＩＯＮＩＸ、スギヤマ技研製）に、この２４ｗｅｌｌプレートを封入し、酸素濃度１％に調整した状態で、ＣＯ_２インキュベーター内でのインキュベーション（低酸素状態）を開始した。
　インキュベーション開始から７２時間後、ｗｅｌｌ内の培地を再び被検成分を含有する溶液（１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭ）７５０μＬ／ｗｅｌｌで交換した。その後、再びプレートを低酸素培養器具に封入し、９６時間インキュベーション（低酸素状態）した。

　なお、本試験例においては被検成分としてゼニアオイ花エキスを用いた。
　また、対照試験として、被検成分溶液に代えて培地（１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭ）を添加したコラーゲン含有組成物を、低酸素培養器具へ封入（低酸素状態）又は未封入（通常酸素状態）の状態で同様にインキュベーションした。

＜２＞顕微鏡観察
　インキュベーション後のゲル状のコラーゲン含有組成物を回収し、表２に示すフローで固定、脱水、真空凍結乾燥を行い、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によりコラーゲン構造を観察した。電子顕微鏡撮影画像を図６に示す。

　図６に示すように、通常酸素状態でインキュベーションしたものと比較し、低酸素状態でインキュベーションしたコラーゲン含有組成物においては、コラーゲン線維が結束し凝集した部分（図６の矢印で示す部分）が顕著に観察された。
　一方、ゼニアオイ花エキスを添加したコラーゲン含有組成物は、同エキス非添加のものに比べてコラーゲン線維の顕著な結束が見られなかった。

　この結果は、細胞を分散させたコラーゲン含有組成物に、被検成分を添加して、低酸素条件でインキュベーションしたときの、コラーゲン線維の結束度の上昇低減効果を指標とすることで、低酸素条件によるコラーゲン構造の悪化を抑制する成分をスクリーニングできることを示している。

　また、加齢に伴い組織が低酸素条件に置かれることから（非特許文献３）、上記試験系は、加齢によるコラーゲン構造の悪化を抑制する成分のスクリーニングにも応用できることを示している。

　また、本試験例の結果は、アオイ科ゼニアオイ属に属する植物の抽出物には、低酸素条件におけるコラーゲン構造の悪化を抑制する効果があることを示している。

＜３＞画像解析
　図６に示す顕微鏡撮影画像について画像解析ソフト（IｍａｇｅＪ）を用いて高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を施し、２次元空間周波数パワースペクトルを表す、フーリエ変換画像（ＦＦＴ画像）を取得した（図７）。
　ＦＦＴ画像の中心（すなわち２次元空間周波数パワースペクトルの波数０の原点）を中心とした矩形領域を選択した（図７）。
　選択した領域の縦方向の強度（つまり２次元空間周波数パワースペクトルのパワーに相当）を平均した数値を、同領域の横方向についてプロットした波形データを抽出した（図８）。

　この波形データにおける傾斜部分の一部（図８における２５４ｐｉｘｅｌ～３８１ｐｉｘｅｌの領域）を切り出し、この傾斜部分の波形を構成するデータについて近似直線を作成した（図９）。

　この近似直線と波形を構成するデータとのパワーの差分（Δパワー、Δｐｏｗｅｒ）を算出し（図１０）、標準偏差を計算した（表３）。

　表３に示す通り、低酸素状態でインキュベーションしたコラーゲン含有組成物の電子顕微鏡撮影画像の解析により算出された標準偏差は、通常酸素状態でインキュベーションしたものと比較し、顕著に大きかった。
　一方、ゼニアオイ花エキスを添加したコラーゲン含有組成物においては、同エキス非添加のものに比べて、顕著に標準偏差が小さかった。

　この結果は、顕微鏡撮影画像より得られたフーリエ変換画像に表された、２次元空間周波数パワースペクトルのパワーの値のばらつきに基づき、被検成分のコラーゲン線維の結束度の向上低減効果を評価できることを示している。

＜試験例３＞低酸素条件によるコラーゲン構造の変化の観察
　ヒト皮下脂肪前駆細胞（ＨＰＡｄ）を、増殖培地とともに２４穴マルチウェルプレートに播種（２．０×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）した後、コンフルエントになるまで培養した。その後、分化培地に交換し、３日おきに分化培地を交換しながら１４日間培養して、皮下脂肪細胞へと成熟化させた。その後、維持培地に交換し、脱酸素剤を備えた低酸素培養器具（ＢＩＯＮＩＸ、スギヤマ技研製）にプレートを封入し、酸素濃度１％に調節したうえで培養を継続した。このとき、対照として脱酸素剤を除いた低酸素培養器具にプレートを封入し、培養を継続した細胞も用意した。培養後、コラーゲン線維の構造を走査型電子顕微鏡により撮影した。結果を図１１に示す。

　図１１に示すように、低酸素条件で培養した細胞では、通常の酸素濃度で培養した細胞に比べ、コラーゲン線維の太さが不均一であり、不定形な構造を形成することがわかった。

＜試験例４＞低酸素条件における細胞培養（１）
　ヒト皮下脂肪前駆細胞（ＨＰＡｄ）を、増殖培地とともに２４穴マルチウェルプレートに播種（２．０×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）した後、コンフルエントになるまで培養した。その後、分化培地に交換し、３日おきに分化培地を交換しながら１４日間培養して、皮下脂肪細胞へと成熟化させた。その後、維持培地に交換し、脱酸素剤を備えた低酸素培養器具（ＢＩＯＮＩＸ、スギヤマ技研製）にプレートを封入し、酸素濃度１％に調節したうえで培養を継続した。このとき、対照として脱酸素剤を除いた低酸素培養器具にプレートを封入し、培養を継続した細胞も用意した。維持培地への交換から１日後、培養を終了し、以下の手順によりｍＲＮＡを抽出した。

　ＰＢＳによってウェル内の細胞を洗浄したのち、ＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）のＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔを添加（１ｍＬ／ウェル）し、細胞からｍＲＮＡを抽出した。
　Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により、抽出したｍＲＮＡをｃＤＮＡとした。
　ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ｃｏｌ１ａ１遺伝子、ｃｏｌ３ａ１遺伝子、ｔｇｆ－β遺伝子、及びｌｏｘ遺伝子の発現量を測定した。このとき低酸素応答のマーカーであるｖｅｇｆ遺伝子の発現量も併せて測定した。結果を図１２に示す。

　図１２に示すように、低酸素条件で培養を行った細胞においてはｖｅｇｆ遺伝子の発現量の上昇が観察された。つまり、低酸素条件における培養により細胞が低酸素応答反応を起こしていることが確認できた。

　また、図１２に示すようにｃｏｌ１ａ１遺伝子及びｃｏｌ３ａ１遺伝子の発現量は、低酸素条件での培養では変化しないことがわかった。
　一方、ｔｇｆ－β遺伝子及びｌｏｘ遺伝子の発現量は低酸素条件での培養により顕著に上昇した（図１２）。

　ｌｏｘ遺伝子の産物であるＬＯＸはコラーゲン線維の架橋に関わる酵素である。また、ＴＧＦ－βはコラーゲン線維の産生に関わる因子である。つまり、図１２に示した結果は、低酸素条件においてはコラーゲン線維に関わるＬＯＸ及びＴＧＦ－βの生産量が増加し、線維化が促進されうることを示している。

＜考察＞
　試験例４の結果は、加齢によって皮下脂肪細胞が低酸素条件に置かれると、ｌｏｘ遺伝子の発現が上昇し、その遺伝子産物であるＬＯＸがコラーゲン線維の架橋を促進すること等によって、線維化が進行することを示している。これは、低酸素条件においてｌｏｘ遺伝子の発現上昇を抑制することができる成分は、皮下脂肪細胞の線維化を抑制できることを示している。
　つまり、試験例４の結果は、低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とすることで、低酸素条件ないし加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をスクリーニングできることを示している。

＜試験例５＞皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分の評価
　ヒト皮下脂肪前駆細胞（ＨＰＡｄ）を、増殖培地とともに２４穴マルチウェルプレートに播種（１．５×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）した。４８時間後に増殖培地を用いて培地交換を行った。
　その４８時間後、分化培地に交換し、分化を開始した。２日に１回のペースで培地交換を実施しながら、１７日間の分化培養を行った。
　維持培地に培地交換し、そこへスクリーニング対象であるサボンソウ葉エキス及びブドウ葉エキスを添加した。エキスを添加しないプレートを対照として用意した。
　脱酸素剤を備えた低酸素培養器具（ＢＩＯＮＩＸ、スギヤマ技研製）にプレートを封入し、酸素濃度１％に調節したうえで培養を継続した。
　７２時間培養後、試験例４と同様の方法でｍＲＮＡを回収し、逆転写によってｃＤＮＡライブラリーを作製したうえで、リアルタイムＰＣＲによりＬＯＸ遺伝子の発現量を解析した。結果を図１３に示す。

　図１３に示すように、サボンソウ葉エキスは、低酸素条件下におけるｌｏｘ遺伝子の発現量の上昇を有意に抑制する効果を発揮した。一方、ブドウ葉エキスには、このような有意な効果が見られなかった。
　本試験例により、低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とすることで、低酸素条件ないし加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をスクリーニングできることが確認できた。

　また、この結果は、ナデシコ科サボンソウ属に属する植物の抽出物を有効成分として含む剤は、低酸素条件及び／又は加齢によるｌｏｘ遺伝子の発現の上昇抑制効果、皮下脂肪細胞の線維化抑制効果、並びに加齢に伴うたるみの改善効果又は予防効果を発揮することを示している。

＜試験例６＞低酸素条件における細胞培養（２）
　新生児ヒト正常ケラチノサイトを、ＫＧ２培地で４穴プレートに播種し、一日培養した。
ケラチノサイトを分化させるため、培地にＣａを添加し（Ｃａ終濃度：１．４５ｍＭ））、脱酸素剤を備えた低酸素培養器具（ＢＩＯＮＩＸ、スギヤマ技研製）にプレートを封入し、酸素濃度１％に調節したうえで培養を継続した。このとき、対照として脱酸素剤を除いた低酸素培養器具にプレートを封入し、培養を継続した細胞も用意した。それから２日間培養を継続した細胞から、以下の手順によりｍＲＮＡを抽出した。

　ＰＢＳによってウェル内の細胞を洗浄したのち、ＲＮｅａｓｙ　Ｌｉｐｉｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）のＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔを添加（１ｍＬ／ウェル）し、細胞からｍＲＮＡを抽出した。
　Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により、抽出したｍＲＮＡをｃＤＮＡとした。
　ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の発現量を測定した。結果を図１４に示す。

　図１４に示すように、ｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の発現量は低酸素条件での培養により顕著に低下した。

　ｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子及びｚｏ－１遺伝子の産物であるオクルディン、クローディン及びＺＯ－１は、タイトジャンクションの構成タンパク質である。また、ｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の産物であるカドヘリンはアドヘレンスジャンクションの構成タンパク質である。
　つまり、図１４に示した結果は、低酸素条件においてはタイトジャンクション、アドヘレンスジャンクションを構成するオクルディン、クローディン、ＺＯ－１及びカドヘリンの生産量が低下し、タイトジャンクション及びアドヘレンスジャンクションといった細胞接着装置の機能が低下することを示している。

　この結果は、加齢によって表皮が低酸素条件に置かれると、タイトジャンクション又はアドヘレンスジャンクションを構成するオクルディン、クローディン、ＺＯ－１及びカドヘリンの生産量が低下し、表皮の細胞接着装置の機能が低下することを示している。これは、低酸素条件においてｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の発現低下を抑制することができる成分は、細胞接着装置の機能低下を抑制できることを示している。
　つまり、この結果は、低酸素条件で培養した細胞におけるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の発現低下の抑制効果を指標とすることで、低酸素条件ないし加齢による表皮の細胞接着装置の機能の低下を抑制する成分をスクリーニングできることを示している。

＜試験例７＞表皮の細胞接着装置の機能低下を抑制する成分の評価
　新生児ヒト正常ケラチノサイトを２４穴プレートに１．０７×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種した。２４時間後、高Ｃａ^２＋培地（ＫＧ２培地に１．３Ｍ　ＣａＣｌ_２水溶液を１／１０００量添加したもの）に交換し、そこへ被検成分であるセイヨウハッカ葉エキスとユキノシタエキスを添加し、脱酸素剤を備えた低酸素培養器具（ＢＩＯＮＩＸ、スギヤマ技研製）にプレートを封入し、酸素濃度１％に調節したうえで培養を継続した。このとき、被検成分を添加しなかったプレートを対照として用意し、同様に培養を行った。
　４８時間後、試験例６と同様の方法でｍＲＮＡを抽出し、これを逆転写してｃＤＮＡライブラリーを作製し、リアルタイムＰＣＲによってｃｌａｕｄｉｎ遺伝子の発現量を測定した。結果を図１５に示す。

　図１５に示すように、セイヨウハッカ葉エキスは、低酸素条件下におけるｃｌａｕｄｉｎ遺伝子の発現量の低下を有意に抑制する効果を発揮した。一方、ユキノシタエキスには、このような有意な効果が見られなかった。
　本試験例により、低酸素条件で培養した細胞におけるｃｌａｕｄｉｎ遺伝子の発現量の低下の抑制効果を指標とすることで、低酸素条件ないし加齢による表皮の細胞接着装置の機能の低下を抑制する成分をスクリーニングできることが確認できた。

　また、この結果は、シソ科ハッカ属に属する植物の抽出物を有効成分として含む剤は、低酸素条件及び／又は加齢によるｃｌａｕｄｉｎ遺伝子の発現の低下抑制効果、表皮の細胞接着装置の機能低下抑制効果、並びに加齢に伴う皮膚バリア機能の改善効果又は予防効果を発揮することを示している。

＜試験例８＞皮下組織の粘弾性の解析及び局所組織の酸素飽和度の測定
　５８名の被験者に対し、エラストグラフィ（日立製作所）を用いて皮膚内部のエラストグラフィ画像を取得し、粘弾性を測定した。なお、粘弾性の測定については、測定エリアを皮膚の表層部分（真皮）と、皮下組織上層、皮下組織中層及び皮下組織下層の合計４層に分け、層別の相対的な粘弾性を算出した。皮下組織上層、皮下組織中層及び皮下組織下層については、皮下組織を深さ方向において１：２：１の比率で分割することで設定した。

　次に、同被験者に対し、ＮＩＲＳ（静岡大学・工学部庭山准教授作製）を用いて頬部の動脈血の酸素飽和度を測定した。測定に際して使用した近赤外線波長は７７０ｎｍ及び８３０ｎｍであった。

＜試験例９＞粘弾性及び酸素飽和度の回帰分析
　試験例８で得られた粘弾性と酸素飽和度の測定値について回帰分析を行った。結果を図１６に示す。

　図１６に示すように、酸素飽和度と粘弾性の間には、正の相関関係が成立することが確認された。この結果より、皮下組織の粘弾性を指標として、皮下組織の酸素レベルを推定できることが示された。同様に、皮下組織の酸素レベルを指標として、皮下組織の粘弾性を推定できることが示された。

　また、試験例１及び４により、加齢に伴い局所組織の酸素状態が悪化すること、そして低酸素条件下では皮下脂肪細胞の線維化が進行することが示されたことを踏まえ考察すると、皮下脂肪細胞の線維化レベルと皮下組織の酸素レベルとの間には、負の相関関係が成立すると考えられる。したがって、皮下組織の酸素レベルを指標として、皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定でき、同様に、皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として、皮下組織の酸素レベルを推定できることも考えられる。

＜試験例１０＞加齢に伴うコラーゲン構造の変化の観察
　２０才以上の９名のドナーより提供された皮下組織における皮下脂肪細胞を走査型電子顕微鏡により撮影した。この電子顕微鏡写真を熟練の評価者に評価させ、皮下脂肪細胞の線維化の程度について１～５のスコアをつけさせた。評価は、線維化の進行度が異なる５段階の基準写真（図１９）を基準として行わせた。結果を図２０に示す。

　図２０に示すように、ドナーの年齢と皮下脂肪細胞の線維化の程度が有意に相関した。この結果は、加齢に伴い皮下脂肪細胞の線維化が進行することを示している。

＜試験例１１＞皮下組織の粘弾性及び皮下脂肪細胞の線維化レベルの解析
　１４０名の被験者に対し、エラストグラフィ（日立製作所）を用いて皮膚内部のエラストグラフィ画像を取得し、粘弾性を測定した（図２１）。なお、粘弾性の測定については、測定エリアを皮膚の表層部分（真皮）と、皮下組織上層、皮下組織中層及び皮下組織下層の合計４層に分け、層別の相対的な粘弾性を算出した。皮下組織上層、皮下組織中層及び皮下組織下層については、皮下組織を深さ方向において１：２：１の比率で分割することで設定した。

　また、同一被験者の超音波画像から皮下脂肪部分を切り出し、これを解析用画像として画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を使用してヒストグラムを作成した。このヒストグラムについて、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を使用して歪度を算出した（図２２）。なお、図２２に示すヒストグラムにおいては、線維化の程度が低い画像を表す左図の歪度は1.62、線維化の程度が高い画像を表す右図の歪度は0.84であった。

＜試験例１２＞粘弾性及び線維化レベルの回帰分析
　試験例１１で得られた皮下組織上層の粘弾性の測定値と、同試験で得られた皮下脂肪細胞の線維化レベルを示す歪度について回帰分析を行った。結果を図２３に示す。
　図２３に示すように、皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪層の超音波画像のヒストグラムの歪度の間には正の相関関係が成立する。
　線維化レベルが高ければ前記歪度は小さくなるため、図２３に示す結果は、皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルとの間には負の相関関係が成立することが明らかとなった。

　この結果より、皮下組織の粘弾性を指標として、皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定できることが示された。同様に、皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として、皮下組織の粘弾性を推定できることが示された。

　本発明はアンチエイジングに関する有効成分の探索に応用することができる。

　本発明は肌解析技術に応用することができる。

１　線維化レベル推定装置
１１　ＣＰＵ
１１１　数値化手段
１１２　線維化レベル算出手段
１２　ＲＯＭ
１２１　記憶手段
１３　粘弾性測定部
１４　線維化レベル表示部
２　粘弾性推定装置
２１　ＣＰＵ
２１１　数値化手段
２１２　粘弾性算出手段
２２　ＲＯＭ
２２１　記憶手段
２３　線維化レベル測定部
２４　粘弾性表示部

Claims

　被検成分を含む培地で細胞を低酸素条件下で培養し、培養系の状態の変化を指標とする、低酸素条件及び／又は加齢による、皮膚の状態又は機能を改善する成分のスクリーニング方法。
　請求項1に記載の方法であって、細胞を分散させたコラーゲン含有組成物に、被検成分を添加して、低酸素条件でインキュベーションしたときの、コラーゲン線維の結束度の上昇低減効果を指標とすることを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢による、コラーゲン構造の悪化を抑制する成分のスクリーニング方法。
　前記被検成分の存在下及び非存在下で、前記コラーゲン含有組成物を低酸素条件下でインキュベーションし、
　被検成分の存在下でインキュベーションした後のコラーゲン線維の結束度が、被検成分の非存在下でインキュベーションした後のコラーゲン線維の結束度よりも低い場合に、
　前記被検成分が、低酸素条件及び／又は加齢による、コラーゲン構造の悪化を抑制する成分であると判定することを特徴とする、請求項２に記載のスクリーニング方法。
　前記コラーゲン構造が、結合組織のコラーゲン構造であることを特徴とする、請求項２又は３に記載のスクリーニング方法。
　前記細胞が結合組織細胞であることを特徴とする、請求項２～４の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　前記インキュベーション後のコラーゲン線維の顕微鏡撮影画像に基づき、前記コラーゲン線維の結束度を評価することを特徴とする、請求項２～５の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　前記顕微鏡撮影画像に対して画像解析処理を施し、前記コラーゲン線維の結束度を定量化した画像解析処理結果に基づき、前記コラーゲン線維の結束度を評価することを特徴とする、請求項６に記載のスクリーニング方法。
　前記画像解析処理において、前記顕微鏡撮影画像に対してフーリエ変換処理を施して２次元空間周波数パワースペクトルを表すフーリエ変換画像を取得し、
　該フーリエ変換画像の少なくとも原点を通過する直線を設定し、該直線の長さ方向について、該直線上における該フーリエ変換画像のパワーをプロットして得られる波形、又は、
　該フーリエ変換画像から、少なくともその原点を含む略矩形領域画像を切り出し、切り出された略矩形領域画像の短径方向のパワーの平均値を、該略矩形領域画像の長径方向についてプロットして得られる波形、
　を得ることを特徴とする、請求項７に記載のスクリーニング方法。
　前記波形の傾斜部分の少なくとも一部を切り出し、前記傾斜部分の近似直線を作成し、該近似直線に対する前記波形を構成するデータのばらつきの程度が小さいほど、前記コラーゲン構造の悪化を抑制する効果に優れるものと判断することを特徴とする、請求項８に記載のスクリーニング方法。
　前記ばらつきの程度を標準偏差により評価することを特徴とする、請求項９に記載のスクリーニング方法。
　前記低酸素条件が、細胞培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件であることを特徴とする、請求項２～１０の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　抗老化成分のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項２～１１の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　加齢に伴うシワ、たるみ又はハリの低下の改善又は予防成分のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項２～１２の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　アオイ科ゼニアオイ属（Ｍａｌｖａｃｅａｅ　Ｍａｌｖａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含む、低酸素条件及び／又は加齢による、コラーゲン構造の悪化の抑制剤。
　請求項1に記載の方法であって、低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とする、
　低酸素条件及び／又は加齢による、皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分のスクリーニング方法。
　前記細胞が脂肪細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載のスクリーニング方法。
　抗老化成分のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載のスクリーニング方法。
　加齢に伴うたるみの改善又は予防成分のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項１５～１７の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　被検成分の非存在下において低酸素条件で培養した細胞と比較して、被検成分の存在下において低酸素条件下で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現量が低い場合に、該被検成分を低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分であると判定することを特徴とする、請求項１５～１８の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　前記低酸素条件が、細胞培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件であることを特徴とする、請求項１５～１９の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　ｖｅｇｆ遺伝子の発現量の上昇を、低酸素条件で培養した細胞において低酸素応答が生じていることの指標とすることを特徴とする、請求項１５～２０の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　ナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ　Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢によるｌｏｘ遺伝子の発現の上昇抑制剤。
　ナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ　Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化抑制剤。
　ナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ　Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、加齢に伴うたるみの改善又は予防剤。
　請求項1に記載の方法であって、低酸素条件で培養した細胞におけるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子から選ばれる遺伝子の発現低下の抑制効果を指標とする、
　低酸素条件及び／又は加齢による表皮の細胞接着装置の機能低下を抑制する成分のスクリーニング方法。
　低酸素条件で培養した細胞におけるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子及びｚｏ－１遺伝子から選ばれる遺伝子の発現低下の抑制効果を指標とし、
　低酸素条件及び／又は加齢による表皮のタイトジャンクションの機能低下を抑制する成分をスクリーニングすることを特徴とする、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
　低酸素条件で培養した細胞におけるｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子の発現低下の抑制効果を指標とし、
　低酸素条件及び／又は加齢による表皮のアドヘレンスジャンクションの機能低下を抑制する成分をスクリーニングすることを特徴とする、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
　前記細胞がケラチノサイトであることを特徴とする、請求項２５～２７の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　抗老化成分のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項２５～２８の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　加齢に伴う皮膚バリア機能の低下の改善又は予防成分のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項２５～２９の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　被検成分の非存在下において低酸素条件で培養した細胞と比較して、被検成分の存在下において低酸素条件下で培養した細胞におけるｏｃｃｕｌｕｄｉｎ遺伝子、ｃｌａｕｄｉｎ遺伝子、ｚｏ－１遺伝子及びｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子から選ばれる遺伝子の発現量が高い場合に、該被検成分を低酸素条件及び／又は加齢による表皮の細胞接着装置の機能低下を抑制する成分であると判定することを特徴とする、請求項２５～３０の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　前記低酸素条件が、細胞培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件であることを特徴とする、請求項２５～３１の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
　シソ科ハッカ属（Ｌａｍｉａｃｅａｅ　Ｍｅｎｔｈａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢によるｃｌａｕｄｉｎ遺伝子の発現低下抑制剤。
　シソ科ハッカ属（Ｌａｍｉａｃｅａｅ　Ｍｅｎｔｈａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢による表皮の細胞接着装置の機能低下抑制剤。
　シソ科ハッカ属（Ｌａｍｉａｃｅａｅ　Ｍｅｎｔｈａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする、加齢に伴う皮膚バリア機能の低下の改善又は予防剤。
　皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として前記酸素レベルを推定することを特徴とする、酸素レベルの推定方法。
　皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値を説明変数、皮下組織の酸素レベルの評価値を目的変数とする回帰式を用いて、前記皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値から前記酸素レベルを算出することを特徴とする、請求項３６に記載の酸素レベルの推定方法。
　前記皮下組織の粘弾性を、超音波エラストグラフィにより測定することを特徴とする、請求項３６又は３７に記載の酸素レベルの推定方法。
　前記粘弾性が皮下組織上層の粘弾性であることを特徴とする、請求項３６～３８の何れか一項に記載の酸素レベルの推定方法。
　皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値を指標として前記酸素レベルを推定する酸素レベル推定装置であって、
　前記相関関係を示す相関データを記憶する記憶手段と、
　被験者の肌の皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを、前記記憶手段に記憶された前記相関データと照合して、前記酸素レベルを算出する酸素レベル算出手段と、を備えることを特徴とする、酸素レベル推定装置。
　皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値を指標として前記酸素レベルを推定する酸素レベル推定プログラムであって、
　コンピュータを、
　被験者の肌の皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを、前記相関関係を示す相関データと照合して、前記酸素レベルを算出する酸素レベル算出手段として、
　機能させることを特徴とする、酸素レベル推定プログラム。
　皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の酸素レベルを指標として皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定することを特徴とする、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの推定方法。
　皮下組織の酸素レベルの評価値を説明変数、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルの測定値を目的変数とする回帰式を用いて、前記皮下組織の酸素レベルの評価値から皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを算出することを特徴とする、請求項４２に記載の粘弾性又は線維化レベルの推定方法。
　前記皮下組織の酸素レベルを、近赤外線分光法により測定することを特徴とする、請求項４２又は４３に記載の粘弾性又は線維化レベルの推定方法。
　前記粘弾性が皮下組織上層の粘弾性であることを特徴とする、請求項４２～４４の何れか一項に記載の粘弾性又は線維化レベルの推定方法。
　皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の酸素レベルを指標として皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定する皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベル推定装置であって、
　前記相関関係を示す相関データを記憶する記憶手段と、
　被験者の皮下組織の酸素レベルを、前記記憶手段に記憶された前記相関データと照合して、前記粘弾性又は線維化レベルを算出する粘弾性又は線維化レベル算出手段と、を備えることを特徴とする、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベル推定装置。
　皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルと、皮下組織の酸素レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の酸素レベルを指標として皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベルを推定する皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベル推定プログラムであって、
　コンピュータを、
　被験者の皮下組織の酸素レベルを、前記相関関係を示す相関データと照合して、前記粘弾性又は線維化レベルを算出する粘弾性又は線維化レベル算出手段として、
　機能させることを特徴とする、皮下組織の粘弾性又は皮下脂肪細胞の線維化レベル推定プログラム。
　皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性を指標として前記線維化レベルを推定することを特徴とする、線維化レベルの推定方法。
　皮下組織の粘弾性の測定値を説明変数、皮下脂肪細胞の線維化レベルの評価値を目的変数とする回帰式を用いて、前記皮下組織の粘弾性の測定値から前記線維化レベルを算出することを特徴とする、請求項４８に記載の線維化レベルの推定方法。
　前記皮下組織の粘弾性を、超音波エラストグラフィにより測定することを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の線維化レベルの推定方法。
　前記粘弾性が皮下組織上層の粘弾性であることを特徴とする、請求項４８～５０の何れか一項に記載の線維化レベルの推定方法。
　皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性の測定値を指標として前記線維化レベルを推定する線維化レベル推定装置であって、
　前記相関関係を示す相関データを記憶する記憶手段と、
　被験者の肌の皮下組織の粘弾性を、前記記憶手段に記憶された前記相関データと照合して、前記線維化レベルを算出する線維化レベル算出手段と、を備えることを特徴とする、線維化レベル推定装置。
　皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下組織の粘弾性の測定値を指標として前記線維化レベルを推定する線維化レベル推定プログラムであって、
　コンピュータを、
　被験者の肌の皮下組織の粘弾性を、前記相関関係を示す相関データと照合して、前記線維化レベルを算出する線維化レベル算出手段として、
　機能させることを特徴とする、線維化レベル推定プログラム。
　皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として皮下組織の粘弾性を推定することを特徴とする、皮下組織の粘弾性の推定方法。
　皮下脂肪細胞の線維化レベルの評価値を説明変数、皮下組織の粘弾性の測定値を目的変数とする回帰式を用いて、前記皮下脂肪細胞の線維化レベルの評価値から皮下組織の粘弾性を算出することを特徴とする、請求項５４に記載の粘弾性の推定方法。
　前記皮下脂肪細胞の線維化レベルを、超音波診断装置により測定することを特徴とする、請求項５４又は５５に記載の粘弾性の推定方法。
　超音波診断装置により皮下組織のエコー画像を取得し、該画像よりヒストグラムを生成し、皮下脂肪細胞の線維化レベルを該ヒストグラムの歪度として算出することを特徴とする、請求項５６に記載の粘弾性の推定方法。
　前記粘弾性が皮下組織上層の粘弾性であることを特徴とする、請求項５４～５７の何れか一項に記載の粘弾性の推定方法。
　皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として皮下組織の粘弾性を推定する皮下組織の粘弾性推定装置であって、
　前記相関関係を示す相関データを記憶する記憶手段と、
　被験者の皮下脂肪細胞の線維化レベルを、前記記憶手段に記憶された前記相関データと照合して、前記粘弾性を算出する粘弾性算出手段と、を備えることを特徴とする、皮下組織の粘弾性推定装置。
　皮下組織の粘弾性と、皮下脂肪細胞の線維化レベルと、の間の相関関係を利用して、前記皮下脂肪細胞の線維化レベルを指標として皮下組織の粘弾性を推定する皮下組織の粘弾性推定プログラムであって、
　コンピュータを、
　被験者の皮下脂肪細胞の線維化レベルを、前記相関関係を示す相関データと照合して、前記粘弾性を算出する粘弾性算出手段として、
　機能させることを特徴とする、皮下組織の粘弾性推定プログラム。