KR101980068B1 - 발효 식초의 향미 개선 방법 및 이를 통해 제조된 진주발효물을 포함하는 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효 식초 고유의 향을 화장품 적용에 적합하도록, 발효 과정 중에 생성되는 발효 고유의 강한 향 물질을 제거/감소시켜 개선시키고, 이에 따라 얻어진 진주발효물을 이용하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 진주발효물은 일반 식초에 비해 아미노산, 폴리페놀 등의 성분 함량이 높을 뿐 아니라 이온화되어 체내 흡수가 용이한 칼슘 이온의 함량이 현저하게 높으며, 식초 발효 과정에서 다량 생성되는 강한 향미 물질(예컨대, 초산, 이소발레르산, 옥타노익산, 등)이 급감되어 개선된 향을 나타낸다. 또한, 본 발명의 진주발효물을 포함하는 조성물은 멜라닌 생성 억제, 그리고 각질세포 분화 및 이의 탈각 촉진 활성을 가져 피부 상태를 현저하게 개선시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 조성물은 화장품 조성물에 간편하고 효과적으로 적용할 수 있다.

Description

발효 식초의 향미 개선 방법 및 이를 통해 제조된 진주발효물을 포함하는 피부상태 개선용 조성물{Methods for Improving Flavors of Fermented Vinegar and Composition for Improving Skin Conditions Comprising Pearl Fermentation Products Thereby}

본 발명은 발효 식초 고유의 향을 화장품 적용에 적합하도록 개선시키고, 이에 따라 얻어진 진주발효물을 이용하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

양조 발효는 기질과 발효 미생물의 반응 기작에 따라, 발효 과정 중 다양한 종류의 휘발성 및 비휘발성 유기산, 당류, 아미노산, 에스테르, 등을 함유한 독특한 방향성을 생성한다. 양조 발효 향미는 발효 미생물인 효모, 박테리아 등이 기질과의 반응에 의해 형성되는데, 이때 초기에 대부분 생성되고 생성되는 농도에 따라 각 적용 분야에서 원하는 향(desire flavor) 또는 이취(off flavor)로 결정된다.

발효 식초는 발효 과정 중 저분자화 형태로 되어 유효성분이 체내 흡수가 용이한 형태로 전환될 뿐만 아니라, 아미노산, 비타민, 칼륨 또는 미네랄 성분이 풍부하여 발효 조건 및 환경에 따라 60여 가지의 유기산이 다르게 형성되어 그 맛과 향도 매우 달라진다.

원료 기질의 종류에 따라 영양성분이 다양해지고 맛과 향이 달라질 수 있으나, 발효 식초가 가진 고유의 향에 의해 그 용도는 식품에 대부분 한정적이고, 화장품에 적용하는데 사용 용량의 한계를 가진다.

발효 식초는 초산에 의한 향이 대부분을 형성하는데, 이러한 발효 식초 고유의 강한 향을 화장품 적용에 적합하도록 개선하여 발효 식초에 포함된 유용한 성분을 충분한 양으로 화장품에 활용할 수 있도록 하는 방법의 개발이 지속적으로 요구되고 있다.

진주에는 칼슘이 다량 함유되어 있는데, 조개 외피막의 상피세포가 분비하는 탄산칼슘으로써 조개 속에 이물이 들어가면 콘키올린 단백질이 이것을 탄산칼슘의 결정인 아라고나이트의 작은 입자로 여러 층을 만들어 진주층이 형성된다. 따라서, 진주의 주성분은 90-95%가 탄산칼슘(CaCO₃)과 약 5%의 단백질(콘키올린), 그리고 기타 20여종의 미네랄과 각종 생리활성 물질인 아미노산으로 구성된다. 이러한 구성 성분으로, 진주는 건강 보조식품이나 피부 미용 재료로 폭넓게 사용되고 있다. 칼슘의 공급원으로 진주 가루를 섭취하거나, 피부 노화 방지 및 미백 효과로서 진주를 사용할 경우 피부를 약산성 상태로 유지하여 피부 면역력을 증가시켜 준다고 알려져 있다.

한편, 사람의 피부색을 결정하는 요인들에는 멜라닌, 각질층의 두께, 말초혈관과 혈색소, 카로틴, 등이 있으며 이들 중 피부 색깔을 결정하는 가장 중요한 요인은 멜라닌이다. 멜라닌 색소를 생성하는 멜라닌 생성세포의 수는 민족이나 피부색에 관계없이 일정하지만, 멜라닌화의 정도, 멜라닌 소체의 크기와 수 그리고 분포상태, 각질형성세포 내에서의 멜라닌 소체의 분해능, 등이 달라서 피부색의 차이가 나타난다. 특히 흰 피부에서는 단계 과 의 멜라닌소체(melanosome)가 많으며 검은 피부에는 단계 와 의 멜라닌소체가 많다(이승헌 등, 피부 장벽학, 여문각, 2010). 이러한 멜라닌의 성숙에는 PMEL17(pre-melanosomal protein 17) 단백질이 관여되어 있어, 멜라닌의 생성 효능은 미백을 나타내는 주요 인자로 활용할 수 있다.

피부의 가장 중요한 기능 중 하나는 장벽으로서의 기능이다. 외부 환경에 직접 노출되는 피부는 체액의 손실을 막고 유해한 환경으로부터 신체를 보호하는 가장 중요한 일차 방어선이다. 피부의 가장 최외곽에 위치하여 외부와 직접적으로 접촉하고 있는 각질층은 핵이 없는 상태이지만 피부 장벽 기능에서 가장 중요한 역할을 수행한다. 즉, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다.

각질세포는 기저층에서 생성된 후 성숙되면서 각화되어 결국은 세포의 형태가 편평하게 되고, 세포내의 소기관 소실, 섬유성 단백질의 생성, 탈수 및 세포막이 비후된 후에 탈각된다. 이러한 과정은 표피의 증식, 분화, 탈각의 과정을 거치게 되고, 피부 재생 항상성 유지에 가장 중요하다. 특히, 각질형성세포의 분화과정에 있어서, 표피의 기저층에서 생성된 각질세포는 과립층에 도달하면서 세포 내 기관들이 사라지기 시작하고, 칼슘 이온이 세포 내부로 유입되면서 트랜스글루타미나제(transglutaminase)를 활성화시켜서 인볼루크린(involucrin), 로리크린(loricrin), 코니핀(cornifin) 등의 각질세포막을 구성하는 단백질의 비가역적 결합을 유도하게 된다. 이러한 과정을 통해 정상적으로 일어난 표피 분화 과정은 피부 장벽 기능에 중요한 역할을 한다.

분화 과정의 최종적으로 최상부 층에서 각질 세포는 탈각되어 피부로부터 박리된다. 각질층의 정상적인 탈각 과정은 피부를 윤기있고 건강하게 유지시켜 준다. 탈각 과정은 외부로부터 발생한 유해 미생물 및 바이러스 등을 각질과 함께 제거하는 데 있어서도 의미를 가진다. 이러한 과정에서 각종 프로테아제가 관여하게 되는데, 약산성 상태에서 이러한 프로테아제가 정상적으로 활성화된다. 칼리크레인-관계된 펩티다제(Kallikrein-related peptidase) 5와 7이 피부 각질층 박리의 조절자로 중요한 역할을 한다. 따라서 표피층의 분화와 탈각의 정상화는 피부 최외곽층을 건강하게 유지시켜 피부 장벽기능을 원활하게 수행함에 따라 수분 증발량을 낮추게 되는 것이다.

본 발명자들은 식초의 발효 과정에서 미생물에 의해 생성되는 발효 식초 고유의 향을 화장품 적용에 적합하도록 개선하기 위한 방법을 찾기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 발효 식초에 진주 분말을 첨가하여 후 발효시키는 방법을 통해 얻어진 최종 산물에서 발효 식초의 특징적인 강한 향 성분(예컨대, 초산, 이소발레르산, 헥사노익산, 옥타노익산, 등)이 현저하게 적게 포함되어 화장품 적용에 적합하지 않은 향 성분이 개선되고, 진주 분말로부터 유래된 생체로 흡수율이 높은 고농도의 칼슘을 포함할 뿐 아니라, 피부 투여 시 멜라닌 생성 억제 및 각질세포의 분화를 촉진하여 피부미백 및 피부보습 같은 피부 상태 개선에 탁월한 활성을 나타낼 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 발효 식초의 향미 개선 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 향미가 개선된 진주발효물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 발효 식초에 진주 분말을 첨가하고 후 발효(after-fermentation)하여 진주발효물을 제조하는 단계를 포함하는 발효 식초의 향미 개선 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조된, 향미가 개선된 진주발효물을 제공한다.

본 발명자들은 식초의 발효 과정에서 미생물에 의해 생성되는 발효 식초 고유의 향을 화장품 적용에 적합하도록 개선하기 위한 방법을 찾기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 발효 식초에 진주 분말을 첨가하여 후 발효시키는 방법을 통해 얻어진 최종 산물에서 발효 식초의 특징적인 강한 향 성분(예컨대, 초산, 이소발레르산, 헥사노익산, 옥타노익산, 등)이 현저하게 적게 포함되어 화장품 적용에 적합하지 않은 향 성분이 개선되고, 진주 분말로부터 유래된 생체로 흡수율이 높은 고농도의 칼슘을 포함할 뿐 아니라, 피부 투여 시 멜라닌 생성 억제 및 각질세포의 분화를 촉진하여 피부미백 및 피부보습 같은 피부 상태 개선에 탁월한 활성을 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다.

식초는 동서양의 대표적 발효식품으로 주요성분은 유기산인 초산이며, 체내에서 무기질의 흡수를 도와주고, 체내에서 대사과정을 돕기 때문에 신진대사를 촉진시킨다. 또한, 식초는 젖산의 분해를 가속화시켜 과격한 운동에 의한 피로회복에 좋을 뿐 아니라, 동맥경화 및 고혈압의 예방, 방사능의 제거효과, 식품의 부패방지에 관여하는 방부제로 쓰이는데, 특히 소화흡수 촉진효과가 인정되어 많은 식품과 함께 이용되고 있다.

상술한 바와 같이, 식초는 매우 유익한 활성을 가지고 있지만 발효 식초 특유의 향미는 화장품 조성물에 적용하는데 큰 장애 요인이다. 이와 관련된 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 발효 식초 고유의 향을 화장품 적용에 적합하도록 개선하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 발효 식초에 진주 분말을 첨가하여 후 발효시켜서 최종적인 발효 산물(즉, 진주발효물; 이하 ‘진주발효물’로 명명함)을 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 진주 분말의 첨가는 생체 흡수가 용이한 고농도의 칼슘(예컨대, 100-1,000,000 ppm)을 가짐과 동시에 향이 개선되어 화장료 조성물로서 용도를 확대할 수 있는 원료인 진주발효물을 생산한다(참고: 표 1 및 표 3).

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명에서 이용될 수 있는 발효 식초는 당업계에 알려진 어떠한 천연 발효 산물, 보다 구체적으로는 천연 발효 식초(예컨대, 사과, 감, 매실, 유자 및 포도 같은 과실 발효 식초; 쌀, 보리, 밀, 옥수수, 조 및 율무 같은 곡물 발효 식초, 등)를 포함하고, 보다 더 구체적으로는 사과 발효 식초를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 발효 식초의 향미 개선 방법은 먼저 사과 발효 식초 원액에 진주 분말을 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 진주 분말의 양은 용도에 따라 적절하게 조절되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 반응시간도 유연하게 조정될 수 있으며, 예를 들어 진주 분말의 첨가 후 3일 내지 7일 동안 후 발효를 실시할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 진주 분말은 발효 식초의 용량을 기준으로 약 0.01-30%(w/v), 보다 구체적으로는 약 0.03-25%(w/v) 및 보다 더 구체적으로는 약 0.05-20%(w/v)의 범위로 첨가될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

칼슘은 골격조직의 성장, 뼈와 치아의 구성성분일 뿐 아니라, 생체 내 각종 효소의 활성화, 신경흥분의 조절, 근육 수축과 이완, 심장의 규칙적인 박동 그리고 혈액응고 등 체내의 생리조절 기능에 중요한 무기질이지만, 생체 내로 흡수가 잘 되지 않는다. 상기 후 발효 단계를 거쳐 얻어진 진주발효물에는 진주 분말로부터 다양한 무기질 및 아미노산들, 특히 이온화된 고농도의 칼슘 이온이 함유되어 있다. 따라서, 본 발명에서 최종적으로 얻어진 진주발효물을 발효식초의 유용한 성분 및 칼슘 성분을 포함하는 화장품 원료로서 적용할 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 진주발효물은 상기 발효 식초에 비해 칼슘 함량이 증가될 수 있으며, 구체적으로, 상기 발효 식초와 비교하여 100배 내지 4000배 증가된 칼슘 함량을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따르면, 발효 식초에서 향을 유발하는 주된 화합물들의 함유량이 본 발명의 진주발효물에서 현저하게 감소되거나 또는 완전히 제거되었다.(참고: 표 3)

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 진주발효물은 상기 일차 발효 식초와 비교하여 초산, 이소발레르산, 페닐에틸 아세테이트, 헥사노익산, 옥타노익산, 카프르산 또는 9-데센산의 함량을 감소시키거나 또는 완전히 제거한 진주발효물이고, 보다 구체적으로는 상기 초산, 이소발레르산, 헥사노익산, 옥타노익산, 카프르산 또는 9-데센산의 함량을 적어도 5배 이상 감소시키거나 또는 완전히 제거한 진주발효물이며, 보다 더 구체적으로는 상기 초산, 이소발레르산, 헥사노익산, 옥타노익산, 카프르산 또는 9-데센산의 함량을 적어도 7배 이상 감소시키거나 또는 완전히 제거한 진주발효물이다.

한편, 본 발명의 방법은, 보다 많은 향미 성분의 제거에 도움을 줄 수 있는 한, 탈취 공정을 추가적으로 실시할 수도 있지만, 생략할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 진주발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 진주발효물을 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 세포 투여 시 멜라닌 생성을 억제하는 활성을 갖는다(참고: 도 3). 또한, 본 발명의 조성물은 각질세포의 분화를 촉진하는 활성도 나타냈을 뿐 아니라, 각질층의 탈각(즉, 표피 턴오버)도 효과적으로 개선시켰다(참고: 도 4a-4d 및 도 5). 이러한 결과를 통해, 본 발명의 조성물이 피부 상태의 개선에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 진주발효물에 의한 피부 상태의 개선은 피부재생, 피부미백, 피부보습, 피부탄력, 피부노화 또는 주름 개선일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 피부 상태 개선용 조성물은 (a) 상술한 진주발효물의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 진주발효물과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 발효 식초 고유의 향이 화장품 적용에 적합하도록 개선된 진주발효물 및 이의 용도에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 진주발효물은 일반 식초에 비해 아미노산, 폴리페놀 등의 성분 함량이 높을 뿐 아니라 이온화되어 체내 흡수가 용이한 칼슘 이온의 함량이 현저하게 높다.

(c) 또한, 본 발명의 진주발효물은 식초 발효 과정에서 특징적으로 생성되는 발효 고유의 향 성분(예컨대, 초산, 이소발레르산, 옥타노익산, 등)이 급감되어 화장품 원료로서 적용이 가능하도록 개선된 향을 나타낸다.

(d) 또한, 본 발명의 진주발효물을 포함하는 조성물은 멜라닌 생성 억제, 그리고 각질세포 분화 및 이의 탈각 촉진 활성을 가져 피부 상태를 현저하게 개선시킬 수 있다.

(e) 따라서, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 조성물은 화장품 조성물에 간편하고 효과적으로 적용할 수 있다.

도 1은 향이 개선된 진주발효물의 제조 공정도를 보여준다.
도 2는 본 발명의 진주발효물 내 향미 성분에 대한 분석 결과로, 가로축은 정체시간(Retention time, RT)으로, 물질을 구성하는 성분에 따라 각기 다른 RT에서 피크가 검출되며, 세로축은 함량(Abundance)으로 각 물질에 함유된 성분의 함량을 나타낸다.
도 3은 처리된 쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)에서의 멜라닌 함량의 측정 결과이다.
도 4a 내지 도 4d는 실시간 PCR에 의해 확인된 각 유전자(IVL, LOR, KLK-5 및 KLK-7)의 발현 정도를 보여주는 결과이다. 음성 대조군에 대하여 *: p<0.05, **: p<0.01.
도 5는 인공 피부에서 각질층의 탈각 정도를 관찰한 염색 결과이다. con은 대조군을 의미한다.
도 6은 실시간 PCR에 의해 확인된 제 1형 전구 콜라겐 유전자(type 1 procollagen)의 발현 정도를 보여주는 결과이다. 음성 대조군에 대하여 *: p<0.05, **: p<0.01.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 진주발효물의 제조

사과 발효초 원액에 10%(w/v)의 진주 분말을 첨가한 후 25℃에서 3-7일 동안 후 발효하였다. 발효가 완료되면 미세 여과(동공 크기: 0.1μL)를 통해 이온화된 칼슘이 고농도로 함유하는 이취가 개선된 ‘진주발효물’을 제조하였다. 선택적으로, 경우에 따라 향을 풍부하게 하기 위해 살균을 실시할 수 있다.

실시예 2: 탈취 공정을 거친 진주발효물의 제조

실시예 1에서 제조된 진주발효물을 화장품 원료로서 사용이 적합하도록 잔존 향을 추가적으로 감소시키기 위해 탈취 공정을 진행 하였다. 탈취 공정을 거쳐 향이 더욱 완화된 진주발효물을 제조하였다.

실험예 1: 진주발효물의 성분 분석

실시예 1에서 조제된 진주발효물의 유효성분 변화를 확인하였다(표 1).

항목	비교예 1 (주정초)	비교예 2 (사과 발효초)	실시예 1 (진주발효물)
총 아미노산(ppm)	170	372	441
칼슘(ppm)	3	92	11,148
총 폴리페놀(ppm)	0	130	125

실험예 2: 진주발효물의 향 성분 분석

상기 실시예 1에서 조제된 진주발효물의 향 성분을 분석하였다(표 3).

구체적으로, 상기 비교예 1, 비교예 2, 실시예 1 및 실시예 2의 향 성분 변화를 관찰하기 위해 각각의 물질을 agilent社의 GC/MS 장비를 이용해 분석하였고, 40℃에서 30분간 CAR/PDMS 흡착을 진행하여 GC-MS 분석을 수행하였다. 기타 수행 조건은 하기 표 2와 같다.

인젝터(Injector)	250
컬럼(Column)	DB-WAX
가스 유속(Gas flow rate)	0.8mL/min
오븐 온도(Oven temp.)	40℃(3min) → 5℃/min → 200℃(10min)

RT(분)	향 성분	풍부(mV)
		비교예 1	비교예 2	실시예 1	실시예 2
2.659	이소아밀 아세테이트	-	3,900,000	2,900,000	300,000
3.391	이소아밀 알코올	-	2,700,000	3,900,000	3,600,000
5.880	초산	9,000,000	8,600,000	1,200,000	1,700,000
6.288	퍼퓨랄	-	-	-	300,000
6.638	2-에틸 헥사놀	-	300,000	1,500,000	500,000
7.016	벤즈알데하이드	1,200,000	3,800,000	4,600,000	600,000
8.690	이소발레르산	420,000	2,300,000	-	400,000
10.338	페닐에틸 아세테이트	-	5,500,000	3,400,000	-
10.424	다마스콘	-	800,000	1,100,000	-
10.623	헥사노익산	-	650,000	-	-
11.283	페네칠알코올	-	2,700,000	5,200,000	800,000
12.852	옥타노익산	-	5,300,000	-	100,000
14.809	카프르산	-	800,000	-	-
15.343	9- 데센산	-	200,000	-	-

상기 표 3 및 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 진주발효물은 비교예 1의 주정초 및 비교예 2의 사과 발효초와 비교하여 초산, 이소발레르산, 헥사노익산, 옥타노익산, 카프르산 또는 9-데센산의 함량이 현저하게 감소되거나 완전히 제거됨을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 진주발효물은 발효 식초 고유의 향이 유의적으로 개선되어 화장품 적용에 적합함을 확인하였다.

나아가, 실시예 2의 추가 탈취 공정을 거친 진주발효물은 실시예 1의 진주발효물과 비교하여 이소아밀 아세테이트, 이소아밀 알코올, 2-에틸 헥사놀, 벤즈알데하이드, 페닐에틸 아세테이트, 다마스콘, 페네칠알코올의 함량이 현저하게 감소되거나 완전히 제거되었으나, 초산, 이소발레르산 및 옥타노익산의 함량이 다소 증가함을 확인하였다. 따라서, 추가 탈취 공정은 필요에 따라 실시하여 적합한 향미를 유도할 수 있으나, 생략해도 무방하다.

실험예 3: 미백-멜라닌 생성 억제 평가

마우스의 색소세포(B16 melanoma cells, ATCC,CRL-6475™)를 이용하여 비교예 1, 2 및 실시예 1의 조성물 처리에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였으며, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴(arbutin; 100 μg/ml)에 의한 멜라닌 생성 억제효과와 비교하였다.

마우스 색소세포(B16 F10)를 10% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 DMEM에 현탁시켜 웰 당 1×10⁵ 세포로 6-웰 플레이트에 접종하여 웰 바닥에 부착될 때까지 배양시켰다. 멜라닌 생성 유도를 위하여, 0.1 μM α-MSH를 처리하고 시료를 첨가한 후 3일 동안 배양하였다. 물질 처리의 농도는 100 μg/ml로 하였다. 멜라닌 생성능 실험의 양성대조군으로 알부틴을 사용하였다. 배양한 세포는 인산완충화된 염 용액(PBS)으로 세척하고 트립신으로 회수하였다. 회수한 세포를 혈구계(hematocytometer)로 계수하여 각 처리 그룹별로 1×10⁶ 세포/ml로 동일한 세포수가 되도록 모아 1,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다. 상기 회수된 세포를 60℃에서 1시간 건조시킨 후 10% DMSO가 포함된 1M NaOH 용액 400 ㎕을 가하여 세포 내 멜라닌을 얻었다. 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 상기 멜라닌 용액의 490 nm 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성 저해율을 평가하였다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 비교예 1, 2 및 실시예 1의 조성물 처리에 의해 멜라닌 양이 감소함을 알 수 있었다. 모든 처리구에서 멜라닌 생성억제를 확인하였고, 특히 실시예 1의 진주발효물이 가장 우수한 멜라닌 생성 억제를 보였다.

실험예 4: 각질형성세포주에서 유전자 발현 분석

4-1. 인간피부 각질형성세포주 HaCaT 세포 배양

인간 피부의 구성 세포주인 각질형성세포 HaCaT(CLS, 300493)는 10% FBS와 항생제가 들어있는 DMEM 배양액을 사용하여 배양하였다. 배양 용기는 75T-플라스크를 사용하였으며 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양액은 3-4일마다 교환해 주었으며 세포가 과다하게 증식되었을 때 계대배양하였다. HaCaT을 6웰 플레이트에 분주(5×10⁵/웰)하고 DMEM을 이용하여 24시간 동안 배양시킨 후, 인산 완충화된 염 용액(PBS)으로 세척하였다. 각 웰에 FBS를 넣지 않은 Ca-프리 DMEM 배지에 염화칼슘 1.2 mM, 비교예 1, 비교예 2, 실시예 1의 조성물이 각각 1%가 되도록 희석시켜 각 웰에 첨가하였다. 24시간 후 cDNA를 합성하고 PCR을 실시하여 유전자 발현 정도를 평가하였다.

4-2. 실시간 PCR을 이용한 각질형성세포 분화 및 탈각 인자 발현 영향 시험

합성된 cDNA를 프라이머 및 시아닌 염료인 SYBR 그린 마스터 혼합물을 사용하여 실시간(real-time) PCR을 실시하여 최종적으로 유전자 발현 정도를 평가하였다. 유전자에 관한 발현은 C_t(threshold cycle) 방법에 따라 내부 대조 유전자 β-액틴의 보정 정량화를 통한 상대적인 값으로 비교되었으며 이용된 프라이머 서열은 하기 표 4에 기재되어 있다.

프라이머 명칭	서 열(5’-> 3’)
IVL	정방향	TGAAACAGCCAACTCCACTG
	역방향	GGAGCTCCAACAGTTGCTCT
LOR	정방향	AATAGATCCCCCAGGGTACCA
	역방향	CGGTGCCCCTGGAAAAC
KLK-5	정방향	GCCACACTGCAGGAAGAAA
	역방향	GGATTTGACCCCCTGGAA
KLK-7	정방향	GCATCCCCGACTCCAAGAA
	역방향	CAGGGTACCTCTGCACACCAA
β-액틴	정방향	GGCCATCTCTTGCTCGAAGT
	역방향	GACACCTTCAACACCCCAGC

도 4a 내지 도 4d에서 볼 수 있듯이, 1%의 진주발효물 처리에 따라 인볼루크린(IVL), 로리크린(LOR), 칼리크레인-연관 펩티다제-5(kallikrein-related peptidase, KLK-5) 및 KLK-7의 발현양이 다른 처리군과 비교하여 유의하게 증가하였음을 확인하였다. 보다 구체적으로, IVL 및 LOR의 발현 증가는 표피 각질형성세포의 분화가 촉진하여 피부 턴오버를 정상적으로 일어나게 한다는 것을 의미한다. 또한, KLK-5 및 KLK-7의 증가는 최외곽의 각질층이 정상적으로 탈각된다는 것을 의미한다. 상기 결과를 통해, 실시예 1의 진주발효물은 표피 분화와 탈각 능력을 증진시켜 피부 장벽 강화 및 보습 기능에 탁월한 효과를 유도할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 5: 피부의 조직학적 관찰

5-1. 인공피부 배양

상기 실시예 1의 진주발효물 의한 표피 분화 및 탈각 인자 발현 정도를 인간피부와 유사하도록 재현한 삼차원 배양피부 모델(RHE: Reconstructed Human Epidermis)에서 확인하였다. RHE가 도착하면 안정화를 위해 성장 배지에서 24시간 동안 배양시킨 후, 염화칼슘 1.2 mM 및 실시예 1의 진주발효물을 각각 1% 처리하였다.

5-2: H&E 염색을 이용한 각질층 탈각 효과 실험

배양 2일 후 적출한 피부 조직을 10% 포르말린 용액에 고정시킨 후, 파라핀 절편을 잘라 조직면역염색법을 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 CON 대조군에 비해 실시예 1의 진주발효물을 처리한 군은 시간이 지남에 따라 각질층이 정상적으로 탈각되어 두꺼워진 각질층이 형성되지 않았음을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 피부조직학적으로 실시예 1의 진주발효물이 표피 턴오버를 효과적으로 유도하여 피부 장벽기능을 개선하는 효과를 가진다는 것을 보여준다.

실험예 6: 섬유아세포주에서 유전자 발현 분석

6-1. 인간피부 섬유아세포주 Hs68 세포 배양

인간 피부의 구성 세포주인 섬유아세포주 Hs68(ATCC, CRL-1635^TM)은 10% FBS와 항생제가 들어있는 DMEM 배양액을 사용하여 배양하였다. 배양 용기는 75T-플라스크를 사용하였으며 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양액은 3-4일마다 교환해 주었으며 세포가 과다하게 증식되었을 때 계대배양하였다. Hs68을 6웰 플레이트에 분주(4×10⁵/웰)하고 DMEM을 이용하여 24시간 동안 배양시킨 후, 인산 완충화된 염 용액(PBS)으로 세척하였다. FBS를 넣지 않은 Ca-프리 DMEM 배지에 비교예 1, 비교예 2, 실시예 1의 조성물이 각각 1%가 되도록 희석시켜 각 웰에 첨가하였다. 24시간 후 cDNA를 합성하고 PCR을 실시하여 유전자 발현 정도를 평가하였다.

6-2. 실시간 PCR을 이용한 섬유아세포에서의 전구 콜라겐 생성 확인

합성된 cDNA를 프라이머 및 시아닌 염료인 SYBR 그린 마스터 혼합물을 사용하여 실시간(real-time) PCR을 실시하여 최종적으로 전구 콜라겐 유전자 발현 정도를 평가하였다. 유전자에 관한 발현은 C_t(threshold cycle) 방법에 따라 내부 대조 유전자 β-액틴의 보정 정량화를 통한 상대적인 값으로 비교되었으며 이용된 프라이머 서열은 하기 표 5에 기재되어 있다.

프라이머 명칭	서 열(5’-> 3’)
제 1형 전구콜라겐 (type 1 procollagen)	정방향	CTCGAGGTGGACACCACCCT
	역방향	CAGCTGGATGGCCACATCGG
β-액틴	정방향	GGCCATCTCTTGCTCGAAGT
	역방향	GACACCTTCAACACCCCAGC

도 6에서 볼 수 있듯이, 1%의 진주발효물 처리에 따라 제 1형 전구콜라겐의 발현량이 다른 처리군과 비교하여 유의하게 증가하였음을 확인하였다. 보다 구체적으로, 제 1형 전구콜라겐의 발현 증가는 섬유아세포에서 주로 생성하는 제 1형 콜라겐의 전구 물질로서 피부 진피층의 두께를 결정하는 주요원인이 되며, 주름 생성을 억제한다는 것을 의미한다. 상기 결과를 통해, 상기 실시예 1의 진주발효물은 진피 내의 지지대 역할을 하는 제 1형 콜라겐의 생성을 증가시켜 피부 노화의 대표적인 양상인 주름 및 쳐짐 현상을 억제할 수 있는 효과를 유도할 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SEMPIO FOODS COMPANY COSMAX, INC. <120> Methods for Improving Flavors of Fermented Vinegar and Composition for Improving Skin Conditions Comprising Pearl Fermentation Products Thereby <130> 1061144 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVL forward primer <400> 1 tgaaacagcc aactccactg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVL reverse primer <400> 2 ggagctccaa cagttgctct 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOR forward primer <400> 3 aatagatccc ccagggtacc a 21 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOR reverse primer <400> 4 cggtgcccct ggaaaac 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLK-5 forward primer <400> 5 gccacactgc aggaagaaa 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLK-5 reverse primer <400> 6 ggatttgacc ccctggaa 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLK-7 forward primer <400> 7 gcatccccga ctccaagaa 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLK-7 reverse primer <400> 8 cagggtacct ctgcacacca a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin forward primer <400> 9 ggccatctct tgctcgaagt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin reverse primer <400> 10 gacaccttca acaccccagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Type 1 procollagen forward primer <400> 11 ctcgaggtgg acaccaccct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Type 1 procollagen reverse primer <400> 12 cagctggatg gccacatcgg 20

Claims (10)

1. 발효 식초에 진주 분말을 0.05-20%(w/v) 범위로 첨가하고, 25℃에서 3일 내지 7일 동안 후-발효(after-fermentation)하여 제조되며,
   상기 발효 식초의 향료 성분 중에서
   i) 이소발레르산, 헥사노익산, 옥타노익산, 카프르산 및 9-데센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항료 성분이 완전히 제거되고,
   ii) 초산이 감소되며,
   iii) 이소아밀 아세테이트 및 페닐에틸 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 향료 성분이 잔존하며,
   iv) 이소아밀 알코올, 2-에틸 헥사놀, 다마스콘 및 페네칠알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 향료 성분이 1.38배 내지 5배로 증가된 진주발효물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 진주발효물은 총 폴리페놀 함량이 100 내지 1,000ppm이고, 총 아미노산 함량이 300 내지 1,000ppm이며, 총 칼슘 함량이 1,000 내지 20,000ppm인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 피부 상태 개선은 피부재생, 피부미백, 피부보습, 피부탄력, 피부노화 또는 주름개선인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 각질세포의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 각질층의 제거를 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

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