TW201809658A - 聚山梨醇酯之層析 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於定量包含多肽及非離子型表面活性劑之組合物中之該非離子型表面活性劑的方法，其中該定量展現該非離子型表面活性劑與該多肽之間的干擾減少。亦提供其中該組合物進一步包括N-乙醯基色胺酸且該定量展現該非離子型表面活性劑、該多肽及該N-乙醯基色胺酸之問的干擾減少之方法。

Description

聚山梨醇酯之層析
本發明提供用於分析多肽調配物中聚山梨醇酯之存在的方法。
聚山梨醇酯20(PS20)係一種通常用於多肽調配物中以在加工及儲存期間保護產物免遭物理破壞之表面活性劑(Kerwin,B.,2007,J.Pharm.Sci.,97(8)：2924-2935)。由於PS20對產物穩定性而言具有重要意義，所以必須在各產物之控制系統中準確定量PS20。PS20可藉由分光光度分析法、螢光膠束分析法或高效能液相層析-蒸發光散射偵測器(HPLC-ELSD)分析法定量(參見例如Kim,J.及Qiu,J.,Analytica chimica acta 806：144-151,2014；Hewitt等人，Journal of Chromatography A,1215(1)：156-160,2008)。
蒸發光散射偵測器(ELSD)分析法較佳作為控制系統分析法，因為相對於螢光膠束分析法，其無需長調節時間。ELSD方法亦不要求使用與生產中所用相同之聚山梨醇酯批料來製作標準曲線。另外，螢光膠束分析法容易受非特定蛋白干擾，特別是疏水性蛋白質及抗體藥物結合物(ADC)。ADC之vcMMAE連接子-藥物為蛋白質引入額外疏水性，此可能導致在定量PS20時蛋白質干擾增加。在一些情況下，此非特定蛋白干擾可藉由使用HPLC-ELSD分析法減輕。
雖然HPLC-ELSD分析法可降低蛋白質干擾程度，但此干擾不會完全消除。在低聚山梨醇酯濃度下以及疏水性更高及/或濃縮之蛋白質下，蛋白質干擾問題尤其成問題。另外，蛋白質干擾之影響高度取決於所用濾 筒樹脂批次。減輕此等問題之策略包括a)外加PS20以減輕蛋白質干擾，同時不減少PS20響應；及b)藉由蛋白質沈澱自樣品移除蛋白質。
外加法需要用調配物目標濃度下之PS20原液稀釋樣品。此樣品製備稀釋蛋白質濃度，同時維持近乎未改變之PS20濃度。接著在數據分析期間減去外加至樣品之PS20之量。因為ELSD響應與在偵測器中分析之質量之間的關係遵循冪定律，所以PS20外加不成比例地降低蛋白質對ELSD信號之影響。外加法已展示在一些情況下提高PS20定量之準確度，但在此法並非可行之解決方案的情況下，必須使用蛋白質沈澱。雖然HPLC-ELSD沈澱法有效移除蛋白質干擾，但由於隔夜樣品製備時間、樣品體積大以及樣品製備變化性，故其並非理想的。相比之下，移除蛋白質使用相同HPLC-ELSD條件，但無重大樣品製備程序。需要一種更穩固之解決方案，其消除蛋白質干擾且在所有層析條件之間得到一致的PS20定量。
本文中引用之所有參考文獻，包括專利申請案及公開案，均以引用之方式整體併入本文中。
在一些態樣中，本發明提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中在定量期間非離子型表面活性劑與多肽之間的干擾有所減少，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將組合物在包含移動相A及移動相B之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇，其中多肽特異性及非特異性地結合於層析材料；b)用包含移動相A及移動相B之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析特異性結合之多肽，其中移動相B與移動相A之比率同步驟a)相比有所增加；c)用包含移動相A及移動相B之溶液自層析材料溶析非離子型 表面活性劑及非特異性結合之多肽，其中移動相B與移動相A之比率同步驟c)相比有所增加；d)對非離子型表面活性劑進行定量，其中在定量期間非離子型表面活性劑與多肽之間的干擾有所減少。在一些實施例中，步驟a)中移動相B與移動相A之比率為約10：90。在一些實施例中，步驟b)中移動相B與移動相A之比率增加至約40：60。在一些實施例中，步驟c)中移動相B與移動相A之比率增加至約100：0。在一些實施例中，移動相A包含含約2%酸之水。在一些實施例中，移動相B包含含約2%酸之甲醇。在一些實施例中，酸為甲酸。在一些實施例中，酸為乙酸。在一些實施例中，層析之流速為約1.25毫升/分鐘。在一些實施例中，步驟b)在層析開始後約1分鐘開始且在層析開始後約3.4分鐘結束。在一些實施例中，步驟c)在層析開始後約3.5分鐘開始且在層析開始後約4.6分鐘結束。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆(poloxamer)(P188)或聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內。在一些實施例中，組合物中之蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL。在一些實施例中，調配物具有約4.5至約7.5之pH值。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料 包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
在一些態樣中，本發明提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含移動相A及移動相B之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含移動相A及移動相B之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析該多肽，其中移動相B與移動相A之比率同步驟a)相比有所增加；c)用包含移動相A及移動相B之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中移動相B與移動相A之比率同步驟c)相比有所增加；d)對非離子型表面活性劑進行定量。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，步驟a)中移動相B與移動相A之比率為約10：90。在一些實施例中，步驟b)中移動相B與移動相A之比率增加至約45：55。在一些實施例中，步驟c)中移動相B與移動相A之比率增加至約100：0。在一些實施例中，移動相A包含含約2%氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含含約2%氫氧化銨之甲醇。在一些實施例中，層析中之流速為約1.4毫升/分鐘。在一些實施例中，步驟b)在層析開始後約1分鐘開始且在層析開始後約4.4分鐘結束。在一些實施例中，步驟c)在層析開始後約4.5分鐘開始且在層析開始後約7.6分鐘結束。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組 合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，步驟a)中移動相B與移動相A之比率為約10：90。在一些實施例中，步驟b)中移動相B與移動相A之比率增加至約40：60。在一些實施例中，步驟c)中移動相B與移動相A之比率增加至100：0。在一些實施例中，移動相A包含含約2%氫氧化銨之水或含約2%氫氧化銨之43%甲醇。在一些實施例中，移動相B包含含約2%氫氧化銨之乙腈。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。在一些實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。在一些實施例中，組合物中之泊洛沙姆濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內。在一些實施例中，組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸及/或甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL。在一些實施例中，調配物具有約4.5至約7.5之pH值。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些 實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
圖1為使用甲醇5%遞增之多階段梯度的無PS20之A1 ADC及0.6mg/ml PS20標準物的覆蓋圖。溶析溶劑含有2%甲酸。
圖2展示不同濾筒上甲醇多階段梯度實驗與異丙醇階段梯度實驗(均含有2%甲酸)之比較。對於每個覆蓋圖，第一濾筒上存在無PS20之A1 ADC(跡線1)，第二濾筒上存在無PS20之A1 ADC(跡線2)及PS20標準物(跡線3)。
圖3展示實驗設計方法最佳化之結果。實線展示根據JMP10軟體與數據擬合之統計模型的方向性。約束各實線之點線指示與擬合有關之誤差。直線斜率指示各因子對PS20峰面積及PS20峰寬之影響。
圖4展示來自利用40% MeOH洗滌及50% MeOH洗滌之DoE方法最佳化之PS20方法層析譜的比較。對於此等實驗，流速為1.25mL/min，裝載12μg PS20，且洗滌持續時間為3分鐘。
圖5展示無PS20之10mg/ml A10 ADC及0.6mg/ml PS20標準物，其中移動相中具有0.2%三氟乙酸。
圖6展示無PS20之20mg/ml A1 ADC及0.6mg/ml PS20標準物，其中移動相中具有2%甲酸。
圖7展示無PS20之20mg/ml A1 ADC及0.7mg/ml PS20標準物，其中移動相中具有2%乙酸。
圖8展示使用以下樣品，含有甲酸及乙酸之移動相之間的比較：水(跡線1)、無PS20之A1 ADC、20mg/mL(跡線2)及外加0.2mg/mL PS20之A1 ADC 20mg/mL(跡線3)。
圖9展示使用甲醇/乙酸溶析，在不同OASIS® MAX濾筒上操作之PS20標準物之多種分佈曲線。典型分佈曲線(跡線1)、具有拖尾之峰(跡線2)、展示分裂之峰(跡線3)及具有輕微拖尾之峰(跡線4)。分佈曲線上之此變化性不影響標準物、對照物或蛋白質樣品之定量。
圖10展示MeOH/乙酸法。典型20μL注射用水(跡線1)、無PS20之A1 ADC調配緩衝液(跡線2)、無PS20之A1 ADC(跡線3)及0.1mg/mL之最低PS20標準物(跡線4)。
圖11A及11B展示使用實例1之方法1評估無PS20之A16/A17。圖1A展示ELSD且圖1B展示UV(280nm)。使用實例1之方法1評估水(跡線1)、無PS20之A16/A17調配緩衝液(跡線2)及無PS20之A16/A17蛋白質(跡線3)。
圖12A及12B展示使用實例1之方法的不同A16/A17緩衝液組分之ELSD層析圖。圖12A展示具有NAT之緩衝液：20mM組胺酸-HCl、1mM NAT、5mM甲硫胺酸、240mM蔗糖(跡線1)；20mM組胺酸-HCl、1mM NAT、240mM蔗糖(跡線2)；20mM組胺酸-HCl、5mM NAT(跡線3)。圖12B展示無NAT之緩衝液：20mM組胺酸-HCl、5mM甲硫胺酸、240mM蔗糖(跡線1)；20mM組胺酸-HCl、25mM甲硫胺酸(跡線2)；20mM組胺酸-HCl(跡線3)。注射50μL緩衝液。
圖13A及13B展示使用經修改之方法的不同緩衝液組分之ELSD層析圖(MCX濾筒及移動相中氫氧化銨)。圖13A展示具有NAT之緩衝液：20mM組胺酸-HCl、1mM NAT、5mM甲硫胺酸、240mM蔗糖(跡線1)； 20mM組胺酸-HCl、1mM NAT、240mM蔗糖(跡線2)；20mM組胺酸-HCl、5mM NAT(跡線3)；及具有NAT之無PS20之蛋白質(跡線4)。圖13B展示無NAT之緩衝液：20mM組胺酸-HCl、5mM甲硫胺酸、240mM蔗糖(跡線1)；20mM組胺酸-HCl、25mM甲硫胺酸(跡線2)；20mM組胺酸-HCl(跡線3)。注射50μL。
圖14A及14B展示在移動相中添加0.15-1.50%氫氧化銨下，評估無PS20之A16/A17蛋白質。圖14A展示ELSD層析圖。圖14B展示UV(280nm)層析圖。注射50μL於移動相中具有0.15%、0.29%、0.73%及1.5%氫氧化銨的無PS20之A16/A17蛋白質(分別跡線1、2、3及4)以及具有1.5%氫氧化銨的無PS20之A16/A17調配緩衝液(跡線5)。
圖15A及15B展示20%-60%移動相B洗滌步驟之評估。圖15A展示ELSD層析圖。圖15B展示UV(280nm)層析圖。注射15μL無PS20之A16/A17蛋白質。20%、30%、40%、50%及60%移動相B(洗滌步驟)，分別展示為跡線1、2、3、4及5。
圖16展示藉由ELSD層析法，評估無PS20之A16/A17蛋白質的洗滌時間及注射體積。注射25μL無PS20之A16/A17樣品：3.4分鐘洗滌步驟(跡線1)。注射50μL無PS20之A16/A17樣品：3.4分鐘洗滌步驟(跡線2)及2.4分鐘洗滌步驟(跡線3)。
圖17A及17B展示針對無PS20之A18/A19評估不同流速。圖17A展示ELSD層析圖。圖17B展示UV(280nm)層析圖。以不同流速注射25μL無PS20之A18/A19(150mg/mL)：1.6、1.4、1.25、1.0及0.8mL/min，分別對應於跡線1、2、3、4及5。
圖18展示藉由ELSD層析法評估PS20在水中之不同溶析時間。注射50μL含0.1mg/mL PS20之水，3.1分鐘溶析步驟(跡線1)或1.1分鐘溶析步驟(跡線2)。
圖19展示藉由ELSD層析法評估最終確定之方法2。使用針對方法2最終確定之參數，注射25μL水(跡線1)、150mg/mL無PS20之A18/A19(跡線2)、外加0.2mg/mL PS20之水(跡線3)及外加0.2mg/mL PS20之A18/A19(跡線4)。
圖20A-20F展示三種不同產物之特異性的評估。圖20A(A18/A19)、20C(A16/A17)及20E(A14/A20)展示ELSD層析圖。圖20B(A18/A19)、20D(A16/A17)及20F(A14/A20)展示UV(280nm)層析圖。無PS20之調配物(跡線1)、無PS20之蛋白質(跡線2)及含0.1mg/mL PS20之水(跡線3)。
圖21展示藉由ELSD層析法，使用外加PS20之水或無PS20之A18/A19，評估濾筒之間的變化性。濾筒2，外加0.1mg/mL PS20之無PS20之A18/A19(跡線1)；濾筒6，外加0.1mg/mL PS20之無PS20之A18/A19(跡線2)；濾筒2，外加0.2mg/mL PS20之水(跡線3)；及濾筒6，外加0.2mg/mL PS20之水(跡線4)。
圖22展示藉由ELSD層析法，使用外加PS20之水或無PS20之A18/A19，評估濾筒之間的變化性。濾筒4，外加0.2mg/mL PS20之無PS20之A18/A19(跡線1)；濾筒6，外加0.2mg/mL PS20之無PS20之A18/A19(跡線2)；濾筒4，外加0.2mg/mL PS20之水(跡線3)；及濾筒6，外加0.2mg/mL PS20之水(跡線4)。
圖23展示在單個濾筒上包括100次A18/A19注射之序列中所用的對照樣品之ELSD層析圖。整個序列中注射之11種對照樣品之覆蓋圖。
圖24展示在單個濾筒上包括100次A18/A19注射之序列中所用的A18/A19樣品之ELSD層析圖。整個序列中100次A18/A19樣品注射之覆蓋圖。
圖25A及25B展示來自在單個濾筒上包括100次A18/A19注射之一個序列的第1次、第50次及第100次蛋白質注射的層析圖。
圖26A及26B展示使用濾筒4，來自A18/A19樣品(標稱0.2mg/mL PS20)之100次注射的定量結果。圖26A展示PS20面積對比注射次數。圖26B展示PS20濃度對比注射次數。
圖27A及27B展示使用濾筒5，來自A18/A19調配緩衝液(標稱0.2mg/mL PS20)之100次注射的定量結果。圖27A展示PS20面積對比注射次數。圖27B展示PS20濃度對比注射次數。
圖28A及28B展示使用濾筒3，來自外加0.2mg/mL PS20之水之100次注射的定量結果。圖28A展示PS20面積對比注射次數。圖28B展示PS20濃度對比注射次數。
圖29A-29F展示藉由ELSD層析法，使用方法1及方法2評估三種低pI產物。圖29A、29C及29E分別展示利用A21、A14/A15及A14之方法1的層析圖。圖29B、29D及29F分別展示利用A21、A14/A15及A14之方法2的層析圖。
本申請案主張2016年8月15日申請之美國臨時專利申請案第62/375,373號之權益，該申請案之揭示內容以引用之方式併入本文中。
本發明提供定量包含多肽及非離子型表面活性劑之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該定量展現非離子型表面活性劑與多肽 之間的干擾減少。亦提供其中組合物進一步包括N-乙醯基色胺酸且定量展現非離子型表面活性劑、多肽及N-乙醯基色胺酸之間的干擾減少之方法。
I.定義
術語「多肽」或「蛋白質」在本文中可互換使用，係指任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可為線性或分支的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可間雜非胺基酸。該等術語亦涵蓋已天然或藉由介入進行修飾之胺基酸聚合物；舉例而言，形成二硫鍵、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分或毒素結合。該定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及本領域中已知之其他修飾的多肽。如本文所用之術語「多肽」及「蛋白質」特定涵蓋抗體。
「經純化」多肽(例如抗體或免疫黏附素)意謂多肽純度已增加，使得其呈比其在自然環境中存在時及/或開始合成及/或在實驗室條件下擴增時更純的形式存在。純度係相對術語且不一定意謂絕對純度。
術語「拮抗劑」以最廣泛之意義使用，且包括部分或完全阻斷、抑制或中和天然多肽之生物活性的任何分子。以類似方式，術語「促效劑」以最廣泛之意義使用且包括模擬天然多肽之生物活性的任何分子。合適促效劑或拮抗劑分子特定包括促效劑或拮抗劑抗體或抗體片段、天然多肽之片段或胺基酸序列變異體等等。用於鑑別多肽之促效劑或拮抗劑之方法可包含使多肽與候選促效劑或拮抗劑分子接觸且量測正常與多肽有關之一或多種生物活性的可偵測之變化。
「結合」相關抗原，例如腫瘤相關之多肽抗原標靶的多肽係以足夠親和力結合抗原，使得多肽適用作靶向表現抗原之細胞或組織的診斷劑及/或治療劑且不與其他多肽顯著交叉反應的多肽。在此類實施例中，如藉 由螢光活化細胞分選(FACS)分析或放射免疫沈澱(RIA)所測定，多肽與「非標靶」多肽之結合程度將少於多肽與其特定標靶多肽之結合的約10%。
關於多肽與標靶分子之結合，術語「特異性結合」或「特異性結合於」特定多肽標靶或特定多肽標靶上之抗原決定基或對其「具有特異性」意謂結合可量測程度地不同於非特異性相互作用。特異性結合可例如藉由與對照分子之結合相比測定分子之結合來量測，對照分子一般係不具有結合活性的具有類似結構之分子。舉例而言，特異性結合可藉由與類似於標靶之對照分子，例如過度未標記標靶競爭來測定。在此情況下，若標記標靶與探針之結合受過度未標記標靶競爭性地抑制，則表明特異性結合。
本文中術語「抗體」以最廣泛之意義使用，且特定覆蓋單株抗體、多株抗體、由至少兩種完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要抗體片段展現所需生物活性即可。本文中術語「免疫球蛋白」(Ig)與抗體可互換使用。
抗體係具有變化結構(均基於免疫球蛋白摺疊)的天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，IgG抗體具有經二硫鍵鍵結以形成功能抗體的兩條「重」鏈及兩條「輕」鏈。各重鏈及輕鏈本身包含「恆定」(C)區及「可變」(V)區。V區決定抗體之抗原結合特異性，而C區提供結構支撐且在與免疫效應因子之非抗原特異性相互作用中起作用。抗體或抗體之抗原結合片段之抗原結合特異性係抗體特異性結合於特定抗原之能力。
抗體之抗原結合特異性由V區之結構特性決定。可變性在可變域之全長110個胺基酸跨度間並非均勻分佈。實際上，V區由稱為構架區(FR)之具有15-30個胺基酸之相對恆定延伸組成，構架區經稱為「高變區」(HVR)之各9-12個胺基酸長的極具可變性之較短區域分隔。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含四個FR，基本上採用β-片狀組態，由三個高變區連接，形成環 連接，且在一些情況下成為β-片狀結構之一部分。各鏈中之高變區藉由FR緊密固持在一起，且與來自另一鏈之高變區一起促成抗體之抗原結合位點的形成(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。抗體與抗原之結合不直接涉及恆定域，但恆定域展現多種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
各V區通常包含三個HVR，例如互補決定區(「CDR」，各含有「高變環」)，及四個構架區。抗體結合位點為以相當大親和力與特定所需抗原結合所需要的最小結構單位，因此通常包括三個CDR且至少三個、較佳四個構架區，該等構架區間雜在三個CDR之間以保持CDR呈適當構形且以此構形呈現CDR。經典四鏈抗體具有由VH及VL域合作界定的抗原結合位點。諸如駱駝及鯊魚抗體之某些抗體缺乏輕鏈且依賴於僅僅由重鏈形成之結合位點。可製備單域工程改造之免疫球蛋白，其中結合位點係在VH與VL之間缺乏合作下由單獨重鏈或輕鏈形成。
術語「可變」係指如下實情：在抗體之間，可變域之某些部分在序列上廣泛地不同，且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。然而，可變性在整個抗體可變域中並非均勻分佈。其集中在輕鏈及重鏈可變域中稱為高變區之三個區段中。可變域之較高保守部分稱為構架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含四個FR，基本上採用β-片狀組態，由三個高變區連接，形成環連接，且在一些情況下成為β-片狀結構之一部分。各鏈中之高變區藉由FR緊密固持在一起，且與來自另一鏈之高變區一起促成抗體之抗原結合位點的形成(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。抗體與抗原之結合不直接涉及恆定域，但恆定域展現多種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
術語「高變區」(HVR)在用於本文中時係指負責抗原結合之抗體胺基酸殘基。高變區可包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如VL中約殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)附近以及VH中31-35B(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)附近(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))及/或來自「高變環」之彼等殘基(例如VL中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)以及VH中之26-32(H1)、52A-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
「構架」或「FR」殘基係除如本文中定義之高變區殘基外的彼等可變域殘基。
「抗體片段」包含較佳包含抗體之抗原結合區的完整抗體一部分。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab)2及Fv片段；雙功能抗體；串聯雙功能抗體(taDb)、線性抗體(例如美國專利第5,641,870號實例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；單臂抗體、單可變域抗體、微型抗體、單鏈抗體分子；由抗體片段形成之多特異性抗體(例如包括(但不限於)Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、di-scFv、bi-scFv或串聯(di,tri)-scFv)；及雙特異性T-細胞銜接分子(BiTE)。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個一致的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各具有單個抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映其容易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生F(ab')2片段，F(ab')2片段具有兩個抗原結合位點且仍然能夠交聯抗原。
「Fv」係含有完整抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。此區域由一個重鏈及一個輕鏈可變域呈緊密非共價締合之二聚物組成。各可變域之三個高變區呈此組態相互作用，從而在VH-VL二聚物之表面上界定抗原結合位點。總體而言，六個高變區賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單個可變域(或對抗原具有特異性的僅僅包含三個高變區之Fv一半)亦能夠識別及結合抗原，但親和力低於整個結合位點。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在重鏈CH1域之羧基端添加包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的幾個殘基。Fab'-SH為本文中關於其中恆定域之半胱胺酸殘基載有至少一個游離硫醇基之Fab'的名稱。F(ab')2抗體片段最初呈其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列，分配至稱為卡巴(κ)及拉姆達(λ)的兩個明顯不同之類型之一。
視其重鏈之恆定域之胺基酸序列而定，抗體可分配至不同類別。完整抗體存在五個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干類別可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於抗體之不同類別之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。熟知不同類別之免疫球蛋白之子單元結構及三維組態。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL域，其中此等結構域存在於單個多肽鏈中。在一些實施例中，Fv多肽在VH與VL域之間進一步包含能夠使scFv形成抗原結合所需結構的多肽連接子。關於scFv 之綜述參見Plückthun之The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小型抗體片段，該等片段包含連接至同一多肽鏈(VH-VL)中之輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)。藉由使用過短而無法使同一鏈上之兩個結構域之間成對的連接子，迫使結構域與另一鏈之互補結構域成對，且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更完全地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)。
術語「多特異性抗體」以最廣泛之意義使用，且特定覆蓋具有多抗原決定基特異性之抗體。此類多特異性抗體包括(但不限於)包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)之抗體，其中VHVL單元具有多抗原決定基特異性；具有兩個或更多個VL及VH結構域之抗體，其中各VHVL單元結合於不同抗原決定基；具有兩個或更多個單一可變域之抗體，其中各單一可變域結合於不同抗原決定基；全長抗體；抗體片段，諸如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三鏈抗體、三功能抗體、共價或非共價連接之抗體片段。「多抗原決定基特異性」係指特異性結合於相同或不同標靶上兩種或更多種不同抗原決定基的能力。「單特異性」係指僅僅結合一種抗原決定基之能力。根據一個實施例，多特異性抗體為以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM之親和力結合於各抗原決定基的IgG抗體。
表述「單域抗體」(sdAb)或「單一可變域(SVD)抗體」泛指其中單個可變域(VH或VL)可賦予抗原結合之抗體。換言之，單個可變域不需要與另一可變域相互作用即可識別標靶抗原。單域抗體之實例包括來源於駱駝科動物(美洲駝及駱駝)及軟骨魚(例如須鯊)之單域抗體以及來源於人類 及小鼠抗體之重組方法的單域抗體(Nature(1989)341：544-546；Dev Comp Immunol(2006)30：43-56；Trend Biochem Sci(2001)26：230-235；Trends Biotechnol(2003)：21：484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；Febs Lett(1994)339：285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自一群基本上均質之抗體獲得的抗體，亦即除在單株抗體產生期間可能出現之可能變異體外，構成該群之個別抗體一致及/或結合相同抗原決定基，此類變異體一般少量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相比，各單株抗體針對抗原上之單個決定子。除其特異性之外，單株抗體之有利之處在於其未經其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體如自基本上均質之抗體群體獲得的特徵，且不應視為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本文中提供之方法使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述之雜交瘤法製備，或可藉由重組DNA方法製備(參見例如美國專利第4,816,567號)。亦可使用例如Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述之技術，將「單株抗體」與噬菌體抗體文庫分離。
本文中單株抗體特定包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重鏈及/或輕鏈與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中對應序列一致或同源，而鏈之剩餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中對應序列一致或同源，以及此類抗體之片段，只要其展現所需生物活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中相關嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，其包含來源於非人類靈長類動物(例如舊大陸猴，諸如狒狒、恆河猴 或食蟹獼猴)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列(美國專利第5,693,780號)。
非人類(例如鼠科)抗體之「人類化」形式為含有來源於非人免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在很大程度上，人類化抗體為其中來自接受者之高變區之殘基經來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種的高變區之殘基(供體抗體)替代的具有所需特異性、親和力及能力之人類免疫球蛋白(接受者抗體)。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基經對應非人類殘基替代。此外，人類化抗體可包含未在接受者抗體中或供體抗體中發現之殘基。進行此等修飾以進一步改善抗體效能。一般而言，人類化抗體將基本上包含至少一個及通常兩個可變域的全部，其中除如上所述之FR取代外，全部或基本上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環且全部或基本上全部FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，通常人類免疫球蛋白之恆定區。關於進一步細節，參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
出於本文之目的，「完整抗體」為包含重鏈及輕鏈可變域以及Fc區之抗體。恆定域可為天然序列恆定域(例如人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。較佳地，完整抗體具有一或多個效應功能。
「天然抗體」一般為約150,000道爾頓之雜四聚體醣蛋白，由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈構成。各輕鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重鏈，而在不同免疫球蛋白同型之重鏈之間二硫鍵數目變化。各重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫鍵。各重鏈在一端具有可變域(VH)，後面為許多恆定域。各輕鏈在一端具有可變域(VL)且在其另一端具有恆定域；輕鏈之 恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈之可變域與重鏈之可變域對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。
「裸抗體」為未結合於諸如細胞毒性部分或放射性同位素示蹤劑之異源分子的抗體(如本文中定義)。
在一些實施例中，抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列可變Fc區)的彼等生物活性，且隨抗體同型而變。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下調細胞表面受體。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」及「ADCC」係指一種細胞介導之反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)識別標靶細胞上結合之抗體且隨後引起標靶細胞溶解。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464頁上之表3。為評估相關分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC分析法，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述之分析法。用於此類分析法之適用效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，相關分子之ADCC活性可在活體內，例如在諸如Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656(1998)中揭示之動物模型的動物模型中評估。
「人類效應細胞」為表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球。在一些實施例中，細胞至少表現FcγRIII且實現ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括周圍血液單核細胞(PBMC)、自然殺手(NK)細胞、單核球、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球；其中PBMC及NK細胞為較佳。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下分子使標靶溶解之能力。補體活化途徑自補體系統之第一組分(C1q)結合於與同源抗原複合之分子(例如多肽(例如抗體))開始。為評估補體活化，可執行CDC分析法，例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。
術語「Fc受體」或「FcR」用於描述結合於抗體之Fc區之受體。在一些實施例中，FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括對偶基因變異體及此等受體之交替剪接形式。FcγRII受體包括具有類似胺基酸序列，主要不同在於細胞質域之FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)。(參見Daëron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR在以下中綜述：Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。本文中術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括有待在將來鑑別之FcR。該術語亦包括新生受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。
「雜質」係指不同於所需多肽產物之物質。在本發明之一些實施例中，雜質包括多肽之電荷變異體。在本發明之一些實施例中，雜質包括抗體或抗體片段之電荷變異體。在本發明之其他實施例中，雜質包括(不限於)：宿主細胞物質，諸如CHOP；浸出蛋白A；核酸；所需多肽之變異體、 片段、聚集物或衍生物；另一多肽；內毒素；病毒污染物；細胞培養基組分等。
如本文所用，術語「免疫黏附素」表示將異源多肽之結合特異性與免疫球蛋白恆定域之效應功能組合的抗體樣分子。在結構上，免疫黏附素包含除抗體之抗原識別及結合位點外(亦即「異源」)的具有所需結合特異性之胺基酸序列與免疫球蛋白恆定域序列的融合物。免疫黏附素分子之黏附素部分通常為至少包含受體或配位體之結合位點的連續胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可自任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1及IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
如本文所用，「表面活性劑」係指表面活性劑，較佳非離子型表面活性劑。本文中表面活性劑之實例包括聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆寇基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼或硬脂醯基-磺基甜菜鹼；月桂基-肌胺酸、肉豆寇基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸或硬脂醯基-肌胺酸；亞油基-甜菜鹼、肉豆寇基-甜菜鹼或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、椰油醯胺基丙基-甜菜鹼、油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆寇醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼(例如椰油醯胺基丙基)；肉豆寇醯胺基丙基-二甲胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲胺或異硬脂醯胺基丙基-二甲胺；甲基椰油醯基-牛磺酸鈉或甲基油烯基牛磺酸二鈉；及MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)；聚乙二醇、聚丙二醇及乙二醇與丙二醇之共聚物(例如Pluronics、PF68等)；等等。在一個實施例中，本文中表面活性劑為聚山梨醇酯20。在又一實施例中，本文中表面活性劑為泊洛沙姆188。
如本文中關於層析法所用之術語「依序」係指先進行第一層析法，接著第二層析法。可在第一層析法與第二層析法之間包括額外步驟。
如本文中關於層析法所用之術語「連續」係指第一層析法物質及第二層析法物質直接連接，或者允許兩種層析物質之間連續流動之一些其他機制。
「裝載密度」係指與一定體積(例如公升)層析物質接觸之組合物的量，例如公克。在一些實例中，裝載密度用g/L表示。
如本文中關於物質(例如非離子型表面活性劑)定量所用之術語「干擾」係指除定量之物質(例如多肽)外的一些組分之影響。舉例而言，含有聚山梨醇酯20與多肽之層析溶析份的ELSD信號將具有來自聚山梨醇酯20與多肽之影響，且溶析份中聚山梨醇酯20之定量將具有來自多肽之干擾。
如本文所用，「基本上相同」指示值或參數未改變達顯著影響。舉例而言，若離子強度未顯著改變，則在管柱出口之層析移動相之離子強度基本上與移動相之初始離子強度相同。舉例而言，在初始離子強度10%、5%或1%內的管柱出口處離子強度基本上與初始離子強度相同。
本文中對「約」值或參數之提及包括(及描述)針對該值或參數本身之變化。舉例而言，關於「約X」之描述包括「X」之描述。
如本文及隨附申請專利範圍中所用，除非上下文另外清楚規定，否則單數形式「一種」、「或」及「該」包括複數個指示物。應瞭解本文中描述之本發明之態樣及變化包括「由態樣及變化組成」及/或「基本上由態樣及變化組成」。
II.層析法
在一些態樣中，本發明提供分析包含多肽及非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯20或PS20)之組合物之方法，該方法包含使用裝載緩衝液使多肽及非離子型表面活性劑結合於混合模式離子交換層析材料，且使用緩衝液自層析材料溶析多肽及非離子型表面活性劑，使得多肽及非離子型表面活性劑在不同溶析份中自層析材料溶析。在一些實施例中，層析方法適合於包含多種多肽(例如多肽產物)，包括具有變化pI之多肽的組合物。舉例而言，該等方法可用於分析包含非離子型表面活性劑及許多不同抗體產物，諸如pI在6.0至9.5範圍內之抗體產物的組合物。在其他實施例中，層析方法包括使用藉由本文中描述之方法鑑別之最佳條件(例如層析材料、緩衝液、梯度、步驟持續時間、流速、樣品裝載)。
在本文中描述之任何方法之一些實施例中，層析材料為包含能夠具有一或多種以下功能性之官能基團的混合模式材料：陰離子交換、陽離子交換、氫鍵鍵結及疏水性相互作用。在一些實施例中，混合模式材料為混合模式陰離子交換層析材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，混合模式材料為混合模式陽離子交換層析材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，混合模式材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式材料含於管柱或濾筒中。在上述一些實施例中，混合材料為混合模式層析管柱或濾筒，諸如混合模式陰離子交換層 析管柱或濾筒，或混合模式陽離子交換層析管柱或濾筒。在一些實施例中，混合模式材料為高效能液相層析(HPLC)材料。
在本文中描述之任何方法之一些實施例中，離子交換材料可利用習知層析材料或對流層析材料。習知層析材料包括例如灌注材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂)及擴散材料(例如交聯瓊脂糖樹脂)。在一些實施例中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂可為Poros®樹脂。在一些實施例中，交聯瓊脂糖樹脂可為磺丙基-Sepharose® Fast Flow(「SPSFF」)樹脂。對流層析材料可為膜(例如聚醚碸)或單塊材料(例如交聯聚合物)。聚醚碸膜可為Mustang。交聯聚合物單塊材料可為交聯聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-同-二甲基丙烯酸伸乙酯)。
在本發明之任何方法之一些實施例中，層析材料處於層析管柱或濾筒中；舉例而言，混合模式陽離子交換層析管柱或濾筒或混合模式陰離子交換層析管柱或濾筒。在一些實施例中，層析管柱或濾筒用於液相層析。在一些實施例中，層析管柱或濾筒用於高效能液相層析(HPLC)。在一些實施例中，層析管柱或濾筒為HPLC層析管柱或濾筒；舉例而言，混合模式陽離子交換HPLC管柱或濾筒或混合模式陰離子交換HPLC管柱或濾筒。
舉例而言，在一些實施例中，本發明提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率； 以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約30：70與約50：50之間(諸如約32：68、34：66、36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54及48：52中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之甲醇。在一些實施例中，酸為甲酸。在一些實施例中，酸為乙酸。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40 及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM 藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱中或濾筒。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量，其中非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出 液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約30：70與約50：50之間(諸如約32：68、34：66、36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54及48：52中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之甲醇。在一些實施例中，酸為甲酸。在一些實施例中，酸為乙酸。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、 1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換 層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量，其中洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約30：70與約50：50之間(諸如約32：68、34：66、36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54及48：52中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之 任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之甲醇。在一些實施例中，酸為甲酸。在一些實施例中，酸為乙酸。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括 介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含乙酸之水且移動相B包含含乙酸之甲醇；b)用包含第二比率之移動 相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約30：70與約50：50之間(諸如約32：68、34：66、36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54及48：52中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含乙酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含乙酸之甲醇。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的 任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融 合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇；b)用包含介於約35：65與約45：55之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率為約10：90。在一些實施例中，第二比率為約40：60。在一些實施例中，第三比率為約100：0。 在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之甲醇。在一些實施例中，酸為甲酸。在一些實施例中，酸為乙酸。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或 更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約 10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯及多肽之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約30：70與約50：50之間(諸如約32：68、34：66、36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54及48：52中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5% 與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之甲醇。在一些實施例中，酸為甲酸。在一些實施例中，酸為乙酸。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一 者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯及多肽之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自 混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約30：70與約50：50之間(諸如約32：68、34：66、36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54及48：52中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之甲醇。在一些實施 例中，酸為甲酸。在一些實施例中，酸為乙酸。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例 中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯及多肽之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、 16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約30：70與約50：50之間(諸如約32：68、34：66、36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54及48：52中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之甲醇。在一些實施例中，酸為甲酸。在一些實施例中，酸為乙酸。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5之間(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分 鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、 8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯及多肽之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含乙酸之水且移動相B包含含乙酸之甲醇；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約30：70與約50：50之間(諸如約32：68、34：66、36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54及48：52中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5% 與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含乙酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含乙酸之甲醇。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例 中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯及多肽之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇；b)用包含介於約35：65與約45：55之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離 子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率為約10：90。在一些實施例中，第二比率為約40：60。在一些實施例中，第三比率為約100：0。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含酸之甲醇。在一些實施例中，酸為甲酸。在一些實施例中，酸為乙酸。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、 2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液 相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯及多肽之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含乙酸之水且移動相B包含含乙酸之甲醇；b)用包含介於約35：65與約45：55之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率為約10：90。在一些實施例中，第二比率為約40：60。在一些實施例中，第三比率為約100：0。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、 0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含乙酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含乙酸之甲醇。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、 180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯及多肽之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含乙酸之水且移動相B包含含乙酸之甲醇；b)用包含介於約35：65與約45：55之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第 三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率為約10：90。在一些實施例中，第二比率為約40：60。在一些實施例中，第三比率為約100：0。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含乙酸之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含乙酸之甲醇。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯 20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，該組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯20及多肽之組合物中之聚山梨醇酯20的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中組合物在包含比率為約10：90之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含約2%乙酸之水且移動相B包含含約2%乙酸之甲醇；b)用包含比率為約40：60之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含比率為約100：0之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯20；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.2、1.25、1.3、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，層析中之流速為約1.25mL/min。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積為約20μL。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約1(諸如至少約1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、 3中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，組合物中聚山梨醇酯20之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱或濾筒中。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相 A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之有機溶劑(例如甲醇或乙腈)。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5之間(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。在一些實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些 實施例中，組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸(亦稱為N-乙醯基-DL-色胺酸)及/或甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD) 或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量，其中非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、 10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之有機溶劑(例如甲醇或乙腈)。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在 一些實施例中，非離子型表面活性劑為聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。在一些實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸及/或甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離 子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量，其中來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48 及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之有機溶劑(例如甲醇或乙腈)。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。在一些實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。在一 些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸及/或甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層 析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之甲醇；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率 之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之甲醇。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或 聚山梨醇酯80。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。在一些實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸及/或甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含 磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之乙腈；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、 8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之乙腈。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表 面活性劑為聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。在一些實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸及/或甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強 陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含介於約40：60與約50：50之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之 總肽。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之有機溶劑(例如甲醇或乙腈)。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、 0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。在一些實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸及/或甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、 單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型表面活性劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
當使用HPLC-ELSD條件測試調配物中含有N-乙醯基色胺酸(NAT)之產物時，在PS20區中觀測到顯著干擾。因此，在一些情況下需要替代性條件以消除NAT與蛋白質相關干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的非離子型表面活性劑進行定 量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之有機溶劑(例如甲醇或乙腈)。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等 值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0，06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為聚山梨醇酯。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。在一些實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。在一些實施例中，組合物中非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如 約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，非離子型清潔劑之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯及多肽之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水 且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範 圍)的含氫氧化銨之有機溶劑(例如甲醇或乙腈)。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸及/或甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250 mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A 包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽及NAT之干擾。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相 A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之有機溶劑(例如甲醇或乙腈)。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中， 組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a) 將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽及少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此 等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之有機溶劑(例如甲醇或乙腈)。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250 mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽及NAT之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A 包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之甲醇；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、 2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之甲醇。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽 濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽及NAT之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將組合物在包含第 一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之乙腈；b)用包含第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽，其中第二比率大於第一比率；c)用包含第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯，其中第三比率大於第二比率；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率介於約0：100與約20：80之間(諸如約2：98、4：96、6：94、8：92、10：90、12：88、14：86、16：84及18：82中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第二比率介於約35：65與約55：45之間(諸如約36：64、38：62、40：60、42：58、44：56、46：54、48：52、50：50、52：48及54：46中之任一者，包括介於此等比率之間的任何範圍)。在一些實施例中，第三比率介於約80：20與約100：0之間(諸如約82：18、84：16、86：14、88：12、90：10、92：8、94：6、96：4及98：2中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移 動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之乙腈。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一 者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽及NAT之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a) 將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含介於約40：60與約50：50之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。在一些實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率為約10：90。在一些實施例中，第二比率為約45：55。在一些實施例中，第三比率為約100：0。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之有機溶劑(例如甲醇或乙腈)。在一些實施例中，層析中之流速介於約 0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL 中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽及NAT之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化 銨之甲醇；b)用包含介於約40：60與約50：50之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽及NAT之干擾。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率為約10：90。在一些實施例中，第二比率為約45：55。在一些實施例中，第三比率為約100：0。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之甲醇。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例 中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、 6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之甲醇；b)用包含介於約40：60與約50：50之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、 5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽及少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率為約10：90。在一些實施例中，第二比率為約45：55。在一些實施例中，第三比率為約100：0。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之甲醇。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0% (w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合 模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之乙腈；b)用包含介於約40：60與約50：50之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽及NAT之干擾。在一些實施例中，多肽特異性及非特異性地結合於層析材料，且步驟b)中溶析至少約90%(諸如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含非特異性結合之多肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更 少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率為約10：90。在一些實施例中，第二比率為約45：55。在一些實施例中，第三比率為約100：0。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之乙腈。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組 合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中組合物在包含介於約5：95與約15：85之間的第一比率之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之乙腈；b)用包含介於約40：60與約50：50之間的第二比率之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含介於約90：10與約100：0之間的第三比率之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯進行定量，其中來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽及少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，移動相B與移動相A之第一比率為約10：90。在一些實施例中，第二比率為約45：55。在一些實施例中，第三比率為約100：0。在一些實施例中，移動相A包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之水。在一些實施例中，移動相B包含介於約0.5%與約5%(v/v)之間(諸如約0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%及4.5%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的含氫氧化銨之乙腈。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、 40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一 或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯20、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯20的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中組合物在包含比率為約10：90之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含約1.5%氫氧化銨之水且移動相B包含含約1.5%氫氧化銨之甲醇；b)用包含比率為約45：55之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含比率為約100：0之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯20；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯20進行定量。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於 約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，層析中之流速為約1.40mL/min。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積為約25μL。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，組合物中聚山梨醇酯20之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺 酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽及NAT之干擾。
在一些實施例中，提供一種定量包含聚山梨醇酯20、多肽及N-乙醯基色胺酸之組合物中之聚山梨醇酯20的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中組合物在包含比率為約10：90之移動相B與移動相A之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含約1.5%氫氧化銨之水且移動相B包含含約1.5%氫氧化銨之乙腈；b)用包含比率為約45：55之移動相B與移動相A之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析多肽；c)用包含比率為約100：0之移動相B與移動相A之溶液自層析材料溶析聚山梨醇酯20；以及d)對步驟c)之洗出液中的聚山梨醇酯20進行定量。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總肽。在一些實施例中，來自步驟c)之洗出液包含少於約5%(諸如少於約4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的組合物中之總NAT。在一些實施例中，層析中之流速介於約0.5與2.5(諸如約0.7、0.9、1.1、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.1及2.3中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)毫升/分鐘之間。在一些實施例中，層析中之流速為約1.40mL/min。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積介於約1與約50(諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40及45中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)μL之間。在一些實施例中，施加至層析材料之組合物體積為約25μL。在一些實施例中，步驟b)在步驟a)開始後至少約0.5(諸如至少約0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，步驟c)在步驟b)結束後至少約0.05(諸如至 少約0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2中之任一者，或更多)分鐘開始且持續至少約2(諸如至少約2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.1、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5中之任一者，或更多)分鐘。在一些實施例中，組合物中聚山梨醇酯20之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內(諸如約0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及0.9%中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內(諸如約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或90mM中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL(諸如約2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220及240mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物具有約4.5至約7.5之pH值(諸如約4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)。在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。在一些實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。在一些實施 例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。在一些實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。在一些實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。在一些實施例中，聚山梨醇酯之定量包含少於約10%(諸如少於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者，或更少)的來自多肽及NAT之干擾。
在上述任何方法之一些實施例中，在添加多肽至組合物前對包含非離子型表面活性劑之組合物中之非離子型表面活性劑進行定量。在一些實施例中，在添加多肽前，組合物中非離子型表面活性劑之濃度將更大(例如在添加多肽後稀釋組合物中之非離子型表面活性劑)。在上述任何方法之一些實施例中，先對包含非離子型表面活性劑之組合物中之非離子型表面活性劑進行定量，但多肽未添加至組合物。此類定量可用作包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物的對照物或比較物。
在上述任何方法之一些實施例中，將待分析之組合物之樣品添加至層析儀器(例如HPLC儀器)之自動取樣器。在一些實施例中，將自動取樣器中之樣品冷藏(例如5±3℃)。在一些實施例中，包含層析材料之一或多個管柱置放於層析儀器之管柱隔室。在一些實施例中，溫度控制部件可用於保持分析期間管柱隔室溫度在設定點之狹窄範圍(例如±1℃)內。在一些實施例中，在280nm下監測管柱流出物。
在上述任何方法之一些實施例中，待分析之組合物之樣品用裝載緩衝液稀釋至介於約0.1mg/mL與約75mg/mL之間(諸如約0.2、0.4、0.6、 0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70mg/mL中之任一者，包括介於此等值之間的任何範圍)的目標多肽濃度。
在上述任何方法之一些實施例中，層析儀器包括梯度泵(例如低壓四元梯度泵)、自動取樣器(例如具有溫度控制能力之自動取樣器)、管柱隔室(例如熱控制管柱隔室)、UV偵測器(例如二極管陣列UV偵測器)及蒸發光散射偵測器(ELSD)。在一些實施例中，層析儀器進一步包含pH值及導電率監測器(例如PCM-3000)以即時收集pH值及導電率數據。使用適當軟體(例如JMP10)進行儀器控制、數據獲取及數據分析。
在本發明之一些實施例中，藉由移動相之導電率量測例如溶析緩衝液之移動相的離子強度。導電率係指水溶液在兩個電極之間傳導電流之能力。在溶液中，電流藉由離子遷移流動。因此，在水溶液中存在之離子的量遞增下，溶液將具有更高導電率。導電率量度之基本單位為西門子(或mho)、mho(mS/cm)，且可使用諸如Orion電導率儀之多種型號電導率儀量測。因為電解電導率為溶液中離子傳送電流之能力，所以溶液之導電率可藉由改變其中離子之濃度來改變。舉例而言，可改變溶液中緩衝劑之濃度及/或鹽(例如氯化鈉、乙酸鈉或氯化鉀)之濃度以實現所需導電率。較佳改變多種緩衝液之鹽濃度以實現所需導電率。
在一些實施例中，層析法之移動相的初始導電率不超過約以下中之任一者：0.0mS/cm、0.5mS/cm、1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm、18.0mS/cm、19.0mS/cm或20.0mS/cm。 在一些實施例中，在層析過程中，移動相之導電率例如按離子強度梯度增加。在一些實施例中，在溶析結束時移動相之導電率超過約以下中任一者：1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm、18.0mS/cm、19.0mS/cm或20.0mS/cm。在一些實施例中，移動相之導電率按線性梯度增加。在一些實施例中，移動相之導電率按包含一或多個階段之階段梯度增加。
在本文中描述之任何方法之一些實施例中，包含多肽及非離子型表面活性劑之組合物以超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000μg中之任一者的多肽的量裝載在層析材料上。在一些實施例中，組合物以超過約0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mg/mL中之任一者之濃度裝載至層析材料上。在一些實施例中，組合物在裝載至層析材料上前稀釋；舉例而言，1：1、1：2、1：5、1：10或超過1：10稀釋。在一些實施例中，組合物稀釋至層析之移動相中。在一些實施例中，組合物稀釋成裝載緩衝液中。
在本文中描述之方法之一些實施例中，層析材料處於管柱或濾筒中。在一些實施例中，管柱為HPLC管柱或濾筒。管柱或濾筒可具有與層析儀器相容之任何尺寸。舉例而言，在一些實施例中，管柱或濾筒具有以下尺寸中之任一者：2.1×20mm、4×50mm、4×100mm、4×150mm、4×200mm、4×250mm或2×250mm。
III.多肽
提供多肽用於其中分離條件如本文中所述最佳化之任何離子交換層析方法中。在本發明之一些實施例中，多肽之組合物藉由離子交換層析法來分析。此類方法可用於鑑別組合物內多肽之電荷變異體。在一些實施例中，多肽為抗體或其片段。在一些實施例中，多肽具有在約6.0至約9.5範圍內之pI。在一些實施例中，多肽為具有在約6.0至約9.5範圍內之pI的抗體。在一些實施例中，藉由本發明之方法提供多肽之電荷對比pH值之曲線中的拐點(IP)。在一些實施例中，藉由本發明之方法提供溫度改變下之IP改變(dIP/dT)。
在一些實施例中，多肽為治療性多肽。在一些實施例中，多肽為抗體。在一些實施例中，多肽為免疫黏附素。
在一些實施例中，多肽具有超過約以下任一者的分子量：5,000道爾頓、10,000道爾頓、15,000道爾頓、25,000道爾頓、50,000道爾頓、75,000道爾頓、100,000道爾頓、125,000道爾頓或150,000道爾頓。多肽可具有介於約50,000道爾頓至200,000道爾頓或100,000道爾頓至200,000道爾頓中任一者之間的分子量。或者，用於本文中之多肽可具有約120,000道爾頓或約25,000道爾頓之分子量。
pI為等電點且為特定分子或表面未運載淨電荷所處之pH值。在一些實施例中，本發明之方法可用於包含多肽之複數種組合物，其中組合物中多肽(例如抗體)之pI在約6.0至約9.5範圍內。在一些實施例中，多肽具有超過約9.5，例如約9.5至約12之pI。在本文中描述之任何方法之一些實施例中，多肽，例如抗體之pI可小於約7；例如約4至約7。
在本文中描述之任何方法之實施例中，包含多肽及一或多種污染物之組合物中的一或多種污染物為多肽電荷變異體。在一些實施例中，多 肽電荷變異體為已自天然狀態進行修飾，使得多肽電荷發生改變之多肽。在一些實施例中，電荷變異體酸性大於親本多肽；亦即，pI低於親本多肽。在其他實施例中，電荷變異體鹼性大於親本多肽；亦即，pI高於親本多肽。在一些實施例中，多肽電荷變異體經工程改造。在一些實施例中，多肽電荷變異體為自然過程之結果；例如氧化、脫醯胺、離胺酸殘基之C端加工、N端焦麩胺酸鹽形成及糖化。在一些實施例中，多肽電荷變異體為一種醣蛋白，其中附接於蛋白質之聚糖經修飾，使得與親本醣蛋白相比，醣蛋白之電荷發生改變；例如藉由添加唾液酸或其衍生物。在一些實施例中，多肽電荷變異體為抗體電荷變異體。
待使用本文中描述之方法分析的多肽一般使用重組技術產生。用於產生重組蛋白之方法描述於例如美國專利第5,534,615號及第4,816,567號(以引用之方式特定併入本文中)中。在一些實施例中，相關蛋白質在CHO細胞中產生(參見例如WO 94/11026)。在一些實施例中，相關多肽在大腸桿菌細胞中產生。參見例如美國專利第5,648,237號；美國專利第5,789,199號及美國專利第5,840,523號，其描述用於使表現及分泌最佳化之轉譯起始區(TIR)及信號序列。亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,N.J.,2003)，第245-254頁，其描述大腸桿菌中抗體片段之表現。當使用重組技術時，多肽可在細胞內、在周質間隙中產生或直接分泌至培養基中。
多肽可自培養基回收，或自宿主細胞溶解產物回收。用於多肽表現之細胞可藉由諸如凍融循環、音波處理、機械破壞或細胞溶解劑之多種物理或化學方式破壞。若多肽在細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾移除微粒碎片-宿主細胞或溶解片段。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述一種用於分離分泌至大腸桿菌之周質間隙中之多肽 的程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下細胞糊狀物經約30分鐘解凍。可藉由離心移除細胞碎片。在多肽分泌至培養基中的情況下，來自此類表現系統之上清液一般首先使用市售多肽濃縮過濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元進行濃縮。諸如PMSF之蛋白酶抑制劑可包括在任何上述步驟中以抑制蛋白水解且可包括抗生素以防外來污染物生長。
在一些實施例中，在藉由本發明之方法分析之前包含多肽及一或多種污染物之組合物中的多肽已純化或部分純化。舉例而言，該等方法之多肽處於來自親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析及疏水性相互作用層析之洗出液中。在一些實施例中，多肽處於來自蛋白A層析之洗出液中。
可藉由本發明之方法分析的多肽之實例包括(但不限於)免疫球蛋白、免疫黏附素、抗體、酶、激素、融合蛋白、含Fc之蛋白質、免疫結合物、細胞介素及白細胞介素。
(A)抗體
在本文中描述之任何方法之一些實施例中，用於藉由本文中描述之方法分析多肽及包含多肽之調配物之任何方法中的多肽為抗體。
抗體之分子標靶包括(i)CD蛋白及其配位體，諸如(但不限於)：CD3、CD4、CD8、CD19、CD11a、CD20、CD22、CD27、CD28、CD34、CD40、CD79α(CD79a)、CD79β(CD79b)、CD122及CD137；(ii)細胞介素，諸如(但不限於)：IL-13、IL-17、IL-22及IL-33；(iii)ErbB受體家族成員，諸如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；(iv)細胞黏著分子，諸如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及αv/β3整合素，包括其α或β子單元(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；(v)生長因子，諸如VEGF； TGFβ、IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；蛋白C、BR3、c-met、組織因子、β7等等；(vi)免疫調節蛋白質，諸如OX40、GITR、ICOS、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM-3及VISTA；及(vii)細胞表面及跨膜腫瘤相關抗原(TAA)，諸如美國專利第7,521,541號中描述之抗原，包括(不限於)NaPi2b。
其他示例性抗體包括選自且不限於以下之抗體：抗雌激素受體抗體、抗孕酮受體抗體、抗p53抗體、抗HER-2/neu抗體、抗EGFR抗體、抗TGFβ抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體、抗ICOS抗體、抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗TIM-3抗體、抗VISTA抗體、抗組織蛋白酶D抗體、抗Bcl-2抗體、抗E-鈣黏附蛋白抗體、抗CA125抗體、抗CA15-3抗體、抗CA19-9抗體、抗c-erbB-2抗體、抗P-醣蛋白抗體、抗CEA抗體、抗視網膜母細胞瘤蛋白質抗體、抗ras腫瘤蛋白抗體、抗路易斯(Lewis)X抗體、抗Ki-67抗體、抗PCNA抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD7抗體、抗CD8抗體、抗CD9/p24抗體、抗CD10抗體、抗CD11a抗體、抗CD11c抗體、抗CD13抗體、抗CD14抗體、抗CD15抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD23抗體、抗CD27抗體、抗CD28抗體、抗CD30抗體、抗CD31抗體、抗CD33抗體、抗CD34抗體、抗CD35抗體、抗CD38抗體、抗CD40抗體、抗CD41抗體、抗LCA/CD45抗體、抗CD45RO抗體、抗CD45RA抗體、抗CD39抗體、抗CD100抗體、抗CD95/Fas抗體、抗CD99抗體、抗CD106抗體、抗CD122抗體、抗CD137抗體、抗泛素抗體、抗CD71抗體、抗StaphA抗體、抗FcRH5抗體、抗Ly6E抗體、抗STEAP抗體、抗FluB抗體、抗VEGF抗體、抗Ang2抗體、抗FGFR1抗體、抗KLB抗體、抗c-myc抗體、抗細胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、抗HPV蛋白質 抗體、抗κ輕鏈抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑色素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗S-100抗體、抗τ抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體、抗Tn-抗原抗體及MetMab。
(i)單株抗體
在一些實施例中，抗體為單株抗體。單株抗體自一群基本上均質之抗體獲得，亦即除在單株抗體產生期間出現之可能變異體外，構成該群之個別抗體一致及/或結合相同抗原決定基，此類變異體一般少量存在。因此，修飾語「單株」指示不為離散或多株抗體之混合物的抗體特徵。
舉例而言，單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述之雜交瘤法製備，或可藉由重組DNA方法製備(美國專利第4,816,567號)。
在雜交瘤方法中，小鼠或諸如倉鼠之其他適當宿主動物如本文中所述進行免疫接種，以引起產生或能夠產生將特異性結合於用於免疫接種之多肽之抗體的淋巴細胞。或者，淋巴細胞可在活體外免疫接種。接著使用合適融合劑，諸如聚乙二醇，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103頁(Academic Press,1986))。
由此製備之雜交瘤細胞接種在合適培養基中且在其中生長，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤細胞之生長或存活的物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質預防HGPRT不足之細胞生長。
在一些實施例中，骨髓瘤細胞為有效融合，支持所選之產生抗體之細胞穩定高水準地產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的細胞。 其中，在一些實施例中，骨髓瘤細胞株為鼠科骨髓瘤株系，諸如來源於可得自索爾克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center)(San Diego,California USA)之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤株系，及可得自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(Rockville,Maryland USA)之SP-2或X63-Ag8-653細胞。亦已描述人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株用於產生人類單株抗體(Kozbor,J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
對雜交瘤細胞生長所在之培養基分析針對抗原之單株抗體的產生。在一些實施例中，由雜交瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性藉由免疫沈澱法或藉由活體外結合分析法，諸如放射免疫分析法(RIA)或酶聯免疫吸附分析法(ELISA)測定。
單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人，Anal.Biochem.107：220(1980)之斯卡查德分析(Scatchard analysis)來測定。
在鑑別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的雜交瘤細胞之後，純系可藉由有限稀釋程序次選殖且藉由標準方法生長(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice第59-103頁(Academic Press,1986))。用於達成此目的之合適培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可在動物中活體內生長為腹水瘤。
藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如多肽A-Sepharose®、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、滲析或親和層析法，將次純系分泌之單株抗體適當與培養基、腹水或血清分離。
容易使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠科抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離編碼單株抗體之DNA且測序。 在一些實施例中，雜交瘤細胞充當此類DNA之來源。一旦分離，即可將DNA置於表現載體中，接著轉染至諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞的另外不產生免疫球蛋白多肽之宿主細胞中，以在重組宿主細胞中合成單株抗體。關於編碼抗體之DNA在細菌中重組表現之綜述包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)及Plückthun,Immunol.Revs.,130：151-188(1992)。
在另一實施例中，抗體或抗體片段可自使用McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)中描述之技術產生的抗體噬菌體文庫中分離。Clackson等人Nature 352：624-628(1991)及Marks等人J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分別描述使用噬菌體文庫分離鼠科及人類抗體。隨後的公開案描述藉由鏈改組(Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及組合感染及活體內重組作為構築極大噬菌體文庫之策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266(1993))產生高親和力(nM範圍)人類抗體。因此，此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體雜交瘤技術的可行的替代技術。
DNA亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代同源鼠科序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 81：6851(1984))或藉由將非免疫球蛋白多肽之全部或一部分編碼序列共價接合至免疫球蛋白編碼序列來修飾。
通常，此類非免疫球蛋白多肽取代抗體之恆定域，或其取代抗體之一個抗原組合位點的可變域以產生包含對一抗原具有特異性之一個抗原組合位點及對不同抗原具有特異性之另一抗原組合位點的嵌合二價抗體。
在本文中描述之任何方法之一些實施例中，抗體為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些實施例中，抗體為IgG單株抗體。
(ii)人類化抗體
在一些實施例中，抗體為人類化抗體。已在本領域中描述用於人類化非人類抗體之方法。在一些實施例中，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基經常稱為「輸入」殘基，其通常取自「輸入」可變域。可基本上遵循Winter及同事(Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988))之方法，藉由用高變區序列取代人類抗體之對應序列，進行人類化。因此，此類「人類化」抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中基本上少於完整之人類可變域由來自非人類物種之對應序列取代。實際上，人類化抗體通常為人類抗體，其中一些高變區殘基及可能一些FR殘基經來自囓齒類動物抗體中之類似位點的殘基取代。
用於製造人類化抗體之人類輕鏈與重鏈可變域的選擇對於降低抗原性而言非常重要。根據所謂的「最佳配合」法，針對已知之人類可變域序列之整個文庫篩選囓齒類動物抗體之可變域之序列。接著與囓齒類動物最接近之人類序列當作人類化抗體之人類構架區(FR)(Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一方法使用來源於具有輕鏈或重鏈可變區之特定子群的所有人類抗體之共同序列的特定構架區。相同構架可用於若干不同人類化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993))。
更重要地，抗體經人類化，保持對抗原之高親和力及其他有利生物性質。為實現此目標，在方法之一些實施例中，人類化抗體藉由分析親本序列及多種概念人類化產物之方法，使用親本及人類化序列之三維模型 來製備。本領域技術人員通常可利用且熟悉三維免疫球蛋白模型。可利用說明及顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。對此等顯示之檢查允許分析該等殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自接受者及輸入序列選擇FR殘基且組合，以便實現所需抗體特徵，諸如增加的對標靶抗原之親和力。一般而言，高變區殘基直接且幾乎基本上參與影響抗原結合。
(iii)人類抗體
在一些實施例中，抗體為人類抗體。作為人類化之替代，可產生人類抗體。舉例而言，現可產生能夠在免疫接種後在缺乏內源性免疫球蛋白產生下產生人類抗體之完整譜系的轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈接合區(JH)基因之同型接合缺失引起內源性抗體產生之完全抑制。此類生殖系突變小鼠中人類生殖系免疫球蛋白基因陣列之轉移將在抗原激發後產生人類抗體。參見例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.7：33(1993)；及美國專利第5,591,669號、第5,589,369號及第5,545,807號。
或者，噬菌體呈現技術(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))可用於在活體外自來自未經免疫接種之供體的免疫球蛋白可變(V)域基因譜系產生人類抗體及抗體片段。根據此技術，抗體V域基因同框選殖至諸如M13或fd之絲狀噬菌體之主要或次要外殼多肽基因，且在噬菌體粒子之表面上呈現為功能性抗體片段。因為絲狀粒子含有噬菌體基因組之單股DNA複本，所以基於抗體功能性之選擇亦引起編碼展現彼等特性之抗體之基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細胞之一些特性。噬菌體呈現可以多 種格式進行；其評論參見例如Johnson,Kevin S.及Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。V-基因區段之若干來源可用於噬菌體呈現。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)自來源於免疫小鼠之脾之V基因的小型隨機組合文庫分離一系列各種抗噁唑酮抗體。可構築來自未免疫接種之人類供體的V基因譜系，且遵循Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)所述之技術，可基本上分離針對一系列不同抗原(包括自體抗原)之抗體。亦參見美國專利第5,565,332號及第5,573,905號。
人類抗體亦可藉由活體外活化B細胞產生(參見美國專利5,567,610及5,229,275)。
(iv)抗體片段
在一些實施例中，抗體為抗體片段。已研發多種技術用於產生抗體片段。傳統上，此等片段經由完整抗體之蛋白水解消化而衍生(參見例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)及Brennan等人，Science 229：81(1985))。然而，此等片段現可直接藉由重組宿主細胞產生。舉例而言，抗體片段可自上文論述之抗體噬菌體文庫分離。或者，Fab'-SH片段可直接自大腸桿菌回收，且化學偶合，形成F(ab')2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根據另一方法，F(ab')2片段可直接自重組宿主細胞培養物分離。熟練從業者將顯而易見用於產生抗體片段之其他技術。在其他實施例中，所選抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；及美國專利第5,587,458號。抗體片段亦可為「線性抗體」，例如如美國專利5,641,870中所述。此類線性抗體片段可為單特異性或雙特異性的。
在一些實施例中，提供本文中描述之抗體之片段。在一些實施例中，抗體片段為抗原結合分段。在一些實施例中，抗原結合片段係選自由以下組成之群：Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv、Fv及雙功能抗體。
(v)雙特異性抗體
在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性之抗體。示例性雙特異性抗體可結合於兩種不同抗原決定基。或者，雙特異性抗體結合臂可與結合於白血球上之觸發分子(諸如T細胞受體分子(例如CD2或CD3)或IgG之Fc受體(FcγR)，諸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16))之臂組合，以將細胞防禦機制集中於細胞。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。
本領域中已知用於製造雙特異性抗體之方法。全長雙特異性抗體之傳統產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共同表現，其中兩條鏈具有不同特異性(Millstein等人，Nature 305：537-539(1983))。因為免疫球蛋白重鏈及輕鏈隨機分配，所以此等雜交瘤(四體瘤)產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅僅一個具有正確的雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟進行的正確分子之純化相當繁重，且產物產率低。類似程序揭示於WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.,10：3655-3659(1991)中。
根據一種不同方法，具有所需結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。在一些實施例中，與包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈恆定域融合。在一些實施例中，含有輕鏈結合所需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於至少一種融合物。編碼免疫球蛋白重鏈融合物及必要時免疫球蛋白輕鏈之DNA插入分開之表現載體中，且共轉染至合適宿主生物體中。此在不等比率之用於構築 之三個多肽鏈提供最佳產率的實施例中提供調整三個多肽片段之相互比例的巨大靈活性。然而，當同等比率之至少兩個多肽鏈的表現產生高產率時或當比率無特定意義時，可將兩個或全部三個多肽鏈之編碼序列插入一個表現載體中。
在此方法之一些實施例中，雙特異性抗體由一臂中具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂中雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。發現此不對稱結構促進所需雙特異性化合物自不需要之免疫球蛋白鏈組合分離，因為雙特異性分子僅僅一半中存在免疫球蛋白輕鏈提供一種容易分離方式。此方法揭示於WO 94/04690。關於產生雙特異性抗體之其他細節，參見例如Suresh等人，Methods in Enzymology 121：210(1986)。
根據美國專利第5,731,168號中描述之另一方法，一對抗體分子之間的界面可經工程改造以將自重組細胞培養物回收之雜二聚體百分比最大化。在一些實施例中，界面包含抗體恆定域之CH3域之至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子之界面的一或多個小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替換。藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替換大胺基酸側鏈，在第二抗體分子之界面上創造與大側鏈尺寸相同或類似的補償「腔」。此提供一種增加雜二聚體之產率超過諸如同二聚體之非所需最終產物的機制。
雙特異性抗體包括交聯或「雜結合物」抗體。舉例而言，雜結合物中之抗體之一可偶合至抗生物素蛋白，另一抗體偶合至生物素。已例如提出此類抗體將免疫系統細胞靶向非所需細胞(美國專利第4,676,980號)及治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。可使用任何合 宜的交聯方法製備雜結合物抗體。合適交聯劑為本領域中所熟知，且與許多交聯技術一起揭示於美國專利第4,676,980號中。
亦已在文獻中描述用於自抗體片段產生雙特異性抗體之技術。舉例而言，可使用化學連接來製備雙特異性抗體。Brennan等人，Science 229：81(1985)描述一種其中完整抗體經蛋白水解裂解以產生F(ab')2片段之程序。此等片段在二硫醇複合劑亞砷酸鈉存在下還原，以使附近二硫醇穩定且防止形成分子間二硫鍵。接著所產生之Fab'片段轉變成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著Fab'-TNB衍生物之一藉由用巰基乙胺還原而再轉變成Fab'-硫醇且與等莫耳量之其他Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作選擇性固定酶之試劑。
亦已描述用於直接自重組細胞培養物製造及分離雙特異性抗體片段之多種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。來自Fos及Jun蛋白質之白胺酸拉鏈肽藉由基因融合而連接至兩種不同抗體之Fab'部分。抗體同二聚體在鉸鏈區經還原，形成單體，接著再氧化形成抗體雜二聚體。此方法亦可用於產生抗體同二聚體。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述之「雙功能抗體」技術提供一種用於製造雙特異性抗體片段之替代機制。該等片段包含藉由過短而無法在同一鏈上之兩個結構域之間進行配對的連接子連接至輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)。因此，一個片段之VH及VL域被迫與另一片段之互補VL及VH域配對，從而形成兩個抗原結合位點。亦已報導藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚物製造雙特異性抗體片段之另一策略。參見Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。
涵蓋超過兩價之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。
(vi)多價抗體
在一些實施例中，抗體為多價抗體。多價抗體由表現抗體所結合之抗原的細胞內在化(及/或分解代謝)之速度比二價抗體快。本文中提供之抗體可為具有三個或更多個抗原結合位點(例如四價抗體)之多價抗體(除IgM類別外)，其容易藉由編碼抗體多肽鏈之核酸的重組表現產生。多價抗體可包含二聚結構域及三個或更多個抗原結合位點。較佳二聚結構域包含Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。在此情況下，抗體將包含Fc區及三個或更多個處於Fc區之胺基端的抗原結合位點。本文中之較佳多價抗體包含三個至約八個，但較佳四個抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一個多肽鏈(且較佳兩個多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或更多個可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區之一個多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含：VH-CH1-可撓性連接子-VH-CH1-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中之多價抗體較佳進一步包含至少兩種(且較佳四種)輕鏈可變域多肽。本文中之多價抗體可例如包含約兩種至約八種輕鏈可變域多肽。此處涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情況進一步包含CL域。
在一些實施例中，抗體為多特異性抗體。多特異性抗體之實例包括(但不限於)包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)之抗體，其中VHVL單元具有多抗原決定基特異性；具有兩個或更多個VL及VH域之抗體，其中各VHVL單元結合於不同抗原決定基；具有兩個或更多個單一可變域之抗體，其中各單一可變域結合於不同抗原決定基；全長抗體；抗體片段，諸如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三鏈抗體、三功能抗體、共價或非共價連接之抗體片段。在一些實施例中，抗體具有多抗原決 定基特異性；舉例而言，特異性結合於相同或不同標靶上兩種或更多種不同抗原決定基的能力。在一些實施例中，抗體為單特異性的；舉例而言，僅僅結合一種抗原決定基之抗體。根據一個實施例，多特異性抗體為以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM之親和力結合於各抗原決定基的IgG抗體。
(vii)其他抗體修飾
可能希望在效應功能方面修飾本文中提供之抗體，例如以便增強抗體之抗原依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。此可藉由將一或多個胺基酸取代引入抗體之Fc區中來實現。或者或另外，半胱胺酸殘基可引入Fc區中，從而允許此區中形成鏈間二硫鍵。由此產生之同二聚體抗體可具有提高之內在化能力及/或增強之補體介導之細胞殺死及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)及Shopes,B.J.,Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增強之抗腫瘤活性的同二聚體抗體亦可使用如Wolff等人，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中所述之異雙官能交聯劑來製備。或者，抗體可經工程改造，以具有雙重Fc區且從而具有增強之補體介導之溶解及ADCC能力。參見Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
為增強抗體之血清半衰期，可如US 2006/0067930(其以引用之方式整體併入本文中)中所述在抗體中進行胺基酸改變。
(B)多肽變異體及修飾
本文中描述之多肽(包括抗體)的胺基酸序列修飾可用於純化本文中描述之多肽(例如抗體)的方法中。
(i)變異多肽
「多肽變異體」意謂如本文中所定義之多肽、較佳活性多肽，其與多肽之全長天然序列、缺乏信號肽之多肽序列、有或無信號肽之多肽之細胞外域至少約80%胺基酸序列一致。此類多肽變異體包括例如其中在全長天然胺基酸序列之N端或C端添加或缺失一或多個胺基酸殘基的多肽。通常，TAT多肽變異體與全長天然序列多肽序列、缺乏信號肽之多肽序列、有或無信號肽之多肽之細胞外域至少約80%胺基酸序列一致，或者至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中任一百分比的胺基酸序列一致。視情況，變異多肽與天然多肽序列相比，僅僅具有一個保守胺基酸取代，或者與天然多肽序列相比，僅僅具有約2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個中任一個數的保守胺基酸取代。
舉例而言，當與全長天然多肽相比時，變異多肽可在N端或C端截短，或可缺乏內部殘基。某些變異多肽可缺乏對所需生物活性而言非必需之胺基酸殘基。此等具有截短、缺失及插入之變異多肽可藉由許多習知技術中之任一技術製備。所需變異多肽可化學合成。另一合適技術包括藉由聚合酶鏈反應(PCR)分離及擴增編碼所需變異多肽之核酸片段。界定核酸片段之所需末端的寡核苷酸用於PCR中之5'及3'引子上。較佳地，變異多肽與本文揭示之天然多肽共享至少一種生物及/或免疫活性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或與細胞毒性多肽融合之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與增加抗體血清半衰期之酶或多肽的融合物。
舉例而言，可能希望提高多肽之結合親和力及/或其他生物特性。多肽之胺基酸序列變異體藉由將適當核苷酸變化引入抗體核酸中或藉由肽 合成來製備。此類修飾包括例如多肽之胺基酸序列內殘基的缺失及/或插入及/或取代。缺失、插入及取代進行任何組合以實現最終構築體，條件是最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變多肽(例如抗體)之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置。
藉由比較多肽序列與同源的已知多肽分子之序列且將在具有高同源性之區域中進行之胺基酸序列變化的數目最小化，來確定哪個胺基酸殘基可插入、取代或缺失而不會不利地影響所需活性。
一種可用於鑑別作為誘變較佳位置之多肽(例如抗體)之某些殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells,Science 244：1081-1085(1989)所述。此處，鑑別殘基或一組標靶殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且經中性或帶負電胺基酸(最佳丙胺酸或聚丙胺酸)替換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點或針對取代位點引入進一步或其他變異體，細化對取代顯示功能敏感性之彼等胺基酸位置。因此，雖然用於引入胺基酸序列變異之位點預先確定，但突變性質本身無需預先確定。舉例而言，為分析既定位點處突變之效能，在標靶密碼子或區域進行ala掃描或隨機誘變且針對所需活性篩選所表現之抗體變異體。
另一類型變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中具有至少一個經不同殘基替換之胺基酸殘基。取代誘變最相關之位點包括高變區，但亦涵蓋FR改變。保守性取代在下表1中展示在標題「保守性取代」下。若此類取代引起生物活性變化，則可引入更大變化，表1中稱為「示例性取代」或如以下關於胺基酸類別進一步描述，且對產物進行篩選。
多肽之生物特性之大量修飾藉由選擇對以下的作用差別顯著之取代來實現：(a)取代區域內多肽主鏈之結構，例如呈片狀或螺旋構象；(b)在標靶位點處分子之電荷或疏水性；或(c)側鏈體積。根據側鏈特性之相似性，可將胺基酸分組(A.L.Lehninger,Biochemistry第二版，第73-75頁，Worth Publishers,New York(1975))：
(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)未帶電、極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H) 或者，天然存在之殘基可基於常見側鏈特性分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要此等類別之一的成員換成另一類別。
不參與維持抗體之適當構象的任何半胱胺酸殘基亦可一般經絲胺酸取代，以提高分子之抗氧化性且防止異常交聯。相反地，半胱胺酸鍵可添加至多肽以提高其穩定性(尤其在抗體為抗體片段，諸如Fv片段之情況下)。
一種尤其較佳類型之取代變異體包括取代親本抗體之一或多個高變區殘基(例如人類化抗體)。一般而言，選擇用於進一步發展之所得變異體將相對於產生其之親本抗體具有提高的生物特性。一種適於產生此類取代變異體之方式包括使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在各位點產生全部可能的胺基取代。由此產生之抗體變異體以單價方式自絲狀噬菌體粒子呈現為與包裝在各粒子內之M13之基因III產物的融合物。接著如本文中揭示，針對生物活性(例如結合親和力)篩選噬菌體呈現之變異體。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描誘變以鑑別顯著影響抗原結合之高變區殘基。或者或另外，宜分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與標靶之間的接觸點。根據本文中詳細說明之技術，此類接觸殘基及鄰近殘基為候選取代殘基。一旦 產生此類變異體，該組變異體如本文中所述進行篩選，且可選擇在一或多個相應分析法中具有優良特性之抗體用於進一步發展。
多肽之另一類型胺基酸變異體改變抗體之原始糖基化模式。多肽可包含非胺基酸部分。舉例而言，多肽可經糖基化。在多肽在宿主細胞或宿主生物體中表現期間此類糖基化可天然存在，或可為由人類介入產生之故意修飾。改變意謂多肽中發現之一或多個碳水化合物部分缺失，及/或添加一或多個在多肽中不存在之糖基化位點。
多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化物部分附接於天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為碳水化物部分經酶附接於天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列中任一種的存在產生潛在糖基化位點。O連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接於羥基胺基酸，最常為絲胺酸或蘇胺酸，不過亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
糖基化位點添加至多肽宜藉由改變胺基酸序列，使得其含有一個或多個上述三肽序列(對於N連接之糖基化位點)來實現。改變亦可藉由添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基至原始抗體序列或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來進行(對於O連接之糖基化位點)。
存在於多肽上的碳水化合物部分之移除可藉由化學方式或酶促方式或藉由編碼充當糖基化標靶之胺基酸殘基的密碼子之突變取代來實現。多肽上碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用多種內切糖苷酶及外切糖苷酶實現。
其他修飾包括麩醯胺基及天冬醯胺基殘基分別脫醯胺成對應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基、脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯 基殘基之羥基的磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化、N端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。
(ii)嵌合多肽
本文中描述之多肽可以一種方式修飾以形成包含多肽與另一異源多肽或胺基酸序列融合之嵌合分子。在一些實施例中，嵌合分子包含多肽與提供抗標記抗體可選擇性地結合之抗原決定基之標記多肽的融合物。抗原決定基標記一般位於多肽之胺基端或羧基端。多肽之此類抗原決定基標記形式之存在可使用針對標記多肽之抗體偵測。此外，抗原決定基標記之提供使多肽能夠容易藉由親和力純化，使用抗標記抗體或結合於抗原決定基標記之另一類型親和力基質來純化。
在一替代實施例中，嵌合分子可包含多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區域之融合物。嵌合分子之二價形式稱為「免疫黏附素」。
如本文所用，術語「免疫黏附素」表示將異源多肽之結合特異性與免疫球蛋白恆定域之效應功能組合的抗體樣分子。在結構上，免疫黏附素包含除抗體之抗原識別及結合位點外(亦即「異源」)的具有所需結合特異性之胺基酸序列與免疫球蛋白恆定域序列的融合物。免疫黏附素分子之黏附素部分為至少包含受體或配位體之結合位點的連續胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可自任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1及IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
Ig融合物較佳包括多肽之可溶形式(跨膜域缺失或失活)代替Ig分子內至少一種可變區之取代。在一尤其較佳實施例中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子之鉸鏈、CH2及CH3或鉸鏈、CH1、CH2及CH3區。
(iii)多肽結合物
用於多肽調配物之多肽可結合於細胞毒性劑，諸如化學治療劑、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)。
可使用適用於產生此類結合物之化學治療劑。另外，可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麯黴素、油桐蛋白質、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒素、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲林黴素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及單端孢黴烯。多種放射性核素可用於產生放射性結合之多肽。實例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。使用諸如以下之多種雙官能蛋白質偶合劑製造多肽與細胞毒性劑之結合物：N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基四氫噻吩(IT)、亞醯胺基酯之雙官能衍生物(諸如二甲基己二醯亞胺酯HCL)、活性酯(諸如二丁二醯亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如伸甲苯基2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述製備。碳-14標記之1-異硫氰酸基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於將放射性核苷酸結合於多肽之示例性螯合劑。
本文中亦涵蓋多肽與一或多種小分子毒素，諸如卡奇黴素(calicheamicin)、美登素類(maytansinoid)、單端孢黴烯及CC1065以及具有毒素活性之此等毒素之衍生物的結合物。
美登素類為藉由抑制微管蛋白聚合起作用之有絲分裂抑制劑。首先自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離美登素。隨後，發現某些微生物亦產生美登素類，諸如美登醇及C-3美登醇酯。亦涵蓋合成美登醇及其衍生物及類似物。本領域中已知許多用於製造多肽-美登素類結合物之連接基團，包括例如美國專利第5,208,020號中揭示之連接基團。連接基團包括二硫醚基團、硫醚基團、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、肽酶不穩定性基團或酯酶不穩定性基團，如以上鑑別之專利中揭示，二硫醚基團及硫醚基團為較佳。
連接子可在多個位置附接於美登素類分子，視連接子類型而定。舉例而言，酯鍵可藉由使用習知偶合技術與羥基反應來形成。反應可發生在具有羥基之C-3位、經羥甲基修飾之C-14位、經羥基修飾之C-15位及具有羥基之C-20位。在一較佳實施例中，連接在美登醇或美登醇類似物之C-3位形成。
另一相關結合物包含結合於一或多個卡奇黴素分子之多肽。卡奇黴素家族抗生素能夠在低於皮莫耳濃度下產生雙股DNA斷裂。關於卡奇黴素家族之結合物之製備，參見例如美國專利第5,712,374號。可使用之卡奇黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1 I,α2 I,α3 I,N-乙醯基-γ1 I,PSAG及θ1 I。抗體可結合之另一抗腫瘤藥物為作為抗葉酸劑之QFA。卡奇黴素與QFA均具有胞內作用位點且不易跨越質膜。因此，此等藥劑經由多肽(例如抗體)介導之內在化的細胞吸收大大增強其細胞毒性作用。
可結合於本文中描述之多肽的其他抗癌劑包括BCNU、鏈脲黴素(streptozoicin)、長春新鹼(vincristine)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、通稱為LL-E33288複合物之藥劑家族以及埃斯培拉黴素(esperamicin)。
在一些實施例中，多肽可為多肽與具有核酸溶解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如去氧核糖核酸酶；DNase)之間的結合物。
在另一實施例中，多肽(例如抗體)可結合於「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)以用於腫瘤預先靶向，其中向患者投與多肽受體結合物，接著使用清除劑自循環中移除未結合之結合物，然後投與結合於細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)之「配位體」(例如抗生物素蛋白)。
在一些實施例中，多肽可結合於前藥活化酶，前藥活化酶將前藥(例如肽基化學治療劑)轉變成活性抗癌藥物。免疫結合物之酶組分包括能夠以將前藥轉變成更具活性之細胞毒性形式的方式作用於前藥之任何酶。
適用之酶包括(但不限於)適用於將含有磷酸酯之前藥轉變成游離藥物之鹼性磷酸酶；適用於將含有硫酸酯之前藥轉變成游離藥物之芳基硫酸酯酶；適用於將無毒5-氟胞嘧啶轉變成抗癌藥物5-氟尿嘧啶之胞嘧啶脫胺酶；適用於將含有肽之前藥轉變成游離藥物之蛋白酶，諸如沙雷氏菌屬(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L)；適用於將含有D-胺基酸取代基之前藥轉變成游離藥物之D-丙胺醯基羧肽酶；使碳水化合物裂解之酶，諸如β-半乳糖苷酶，及適用於將糖基化前藥轉變成游離藥物之神經胺糖酸苷酶；適用於將經β-內醯胺衍生化之藥物轉變成游離藥物之β-內醯胺酶；及適用於將在胺氮處分別經苯氧基乙醯基或苯乙醯基衍生化之藥物轉變成游離藥物之青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶。或者，本領域中亦稱為「抗體酶」之具有酶活性之抗體可用於將前藥轉變成游離活性藥物。
(iv)其他
多肽之另一類型共價修飾包含多肽連接至多種非蛋白質聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物。多肽亦可包封在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)製備之微膠囊中，包封在膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中，或包封在粗乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro,A.R.編輯，(1990)中。
IV.獲得用於調配物及方法之多肽
用於本文中描述之分析方法的多肽可使用本領域中熟知之方法，包括重組方法獲得。以下章節提供關於此等方法之指導。
(A)聚核苷發
如本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸聚合物，且包括DNA及RNA。
編碼多肽之聚核苷酸可自包括(但不限於)cDNA文庫之任何來源獲得，cDNA文庫由咸信具有多肽mRNA且以可偵測水準表現其之組織製備。因此，編碼多肽之聚核苷酸宜自由人類組織製備之cDNA文庫獲得。編碼多肽之基因亦可自基因組文庫或藉由已知之合成程序(例如自動核酸合成)獲得。
舉例而言，聚核苷酸可編碼整個免疫球蛋白分子鏈，諸如輕鏈或重鏈。完整重鏈不僅包括重鏈可變區(VH)，且亦包括重鏈恆定區(CH)，重鏈恆定區通常將包含三個恆定域：CH1、CH2及CH3；及「鉸鏈」區。在一些情況下，希望存在恆定區。
可藉由聚核苷酸編碼之其他多肽包括抗原結合抗體片段，諸如單域抗體(「dAbs」)、Fv、scFv、Fab'及F(ab')2及「微型抗體」。微型抗體為 (通常)二價抗體片段，其中已切除CH1及CK或CL域。因為微型抗體小於習知抗體，所以其在臨床/診斷用途中將實現更好的組織穿透，但在二價下，其將保持比諸如dAbs之單價抗體片段更高的結合親和力。因此，除非上下文另外規定，否則如本文所用之術語「抗體」不僅涵蓋整個抗體分子，且亦涵蓋上文論述之類型之抗原結合抗體片段。較佳地，相對於對應人類接受者構架，存在於編碼多肽中之各構架區將包含至少一個胺基酸取代。因此，舉例而言，相對於接受者構架區，構架區可包含總計三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個或十五個胺基酸取代。
V.示例性實施例
實施例1. 在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中在定量期間非離子型表面活性劑與多肽之間的干擾有所減少，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中組合物在包含移動相A及移動相B之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇，其中多肽特異性及非特異性地結合於層析材料；b)用包含移動相A及移動相B之溶液自混合模式陰離子交換層析材料溶析多肽，其中移動相B與移動相A之比率同步驟a)相比有所增加；c)用包含移動相A及移動相B之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑及非特異性結合之多肽，其中移動相B與移動相A之比率同步驟c)相比有所增加；d)對非離子型表面活性劑進行定量，其中在定量期間非離子型表面活性劑與多肽之間的干擾有所減少。
實施例2. 在實施例1之一些其他實施例中，步驟a)中移動相B與移動相A之比率為約10：90。
實施例3. 在實施例1或2之一些其他實施例中，步驟b)中移動相B與移動相A之比率增加至約40：60。
實施例4. 在實施例1至3中任一項之一些其他實施例中，步驟c)中移動相B與移動相A之比率增加至約100：0。
實施例5. 在實施例1至4中任一項之一些其他實施例中，移動相A包含含約2%酸之水。
實施例6. 在實施例1至5中任一項之一些其他實施例中，移動相B包含含約2%酸之甲醇。
實施例7. 在實施例1至6中任一項之一些其他實施例中，酸為甲酸。
實施例8. 在實施例1至6中任一項之一些其他實施例中，酸為乙酸。
實施例9. 在實施例1至8中任一項之一些其他實施例中，層析中之流速為約1.25毫升/分鐘。
實施例10. 在實施例9之一些其他實施例中，步驟b)在層析開始後約1分鐘開始且在層析開始後約3.4分鐘結束。
實施例11. 在實施例9或10之一些其他實施例中，步驟c)在層析開始後約3.5分鐘開始且在層析開始後約4.6分鐘結束。
實施例12. 在實施例1至11中任一項之一些其他實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。
實施例13. 在實施例12之一些其他實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
實施例14. 在實施例1至13中任一項之一些其他實施例中，組合物中非離子型表面活性劑之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內。
實施例15. 在實施例1至14中任一項之一些其他實施例中，組合物中蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL。
實施例16. 在實施例1至15中任一項之一些其他實施例中，調配物具有約4.5至約7.5之pH值。
實施例17. 在實施例1至16中任一項之一些其他實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。
實施例18. 在實施例1至17中任一項之一些其他實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。
實施例19. 在實施例1至18中任一項之一些其他實施例中，多肽為治療性多肽。
實施例20. 在實施例16之一些其他實施例中，治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。
實施例21. 在實施例1至20中任一項之一些其他實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。
實施例22. 在實施例1至21中任一項之一些其他實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。
實施例23. 在實施例1至22中任一項之一些其他實施例中，混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。
實施例24. 在實施例1至23中任一項之一些其他實施例中，混合模式陰離子交換層析材料含於管柱中。
實施例25. 在實施例1至24中任一項之一些其他實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。
實施例26. 在實施例1至25中任一項之一些其他實施例中，混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。
實施例27. 在實施例1至26中任一項之一些其他實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
實施例28. 在一些實施例中，提供一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中組合物在包含移動相A及移動相B之溶液中裝載至層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含移動相A及移動相B之溶液自混合模式陽離子交換層析材料溶析該多肽，其中移動相B與移動相A之比率同步驟a)相比有所增加；c)用包含移動相A及移動相B之溶液自層析材料溶析非離子型表面活性劑，其中移動相B與移動相A之比率同步驟c)相比有所增加；d)對非離子型表面活性劑進行定量。
實施例29. 在實施例28之一些其他實施例中，移動相B之有機溶劑為甲醇。
實施例30. 在實施例28或29之一些其他實施例中，步驟a)中移動相B與移動相A之比率為約10：90。
實施例31. 在實施例28至30中任一項之一些其他實施例中，步驟b)中移動相B與移動相A之比率增加至約45：55。
實施例32. 在實施例28至31中任一項之一些其他實施例中，步驟c)中移動相B與移動相A之比率增加至約100：0。
實施例33. 在實施例28至32中任一項之一些其他實施例中，移動相A包含含約2%氫氧化銨之水。
實施例34. 在實施例28至33中任一項之一些其他實施例中，移動相B包含含約2%氫氧化銨之甲醇。
實施例35. 在實施例28至34中任一項之一些其他實施例中，層析中之流速為約1.4毫升/分鐘。
實施例36. 在實施例35之一些其他實施例中，步驟b)在層析開始後約1分鐘開始且在層析開始後約4.4分鐘結束。
實施例37. 在實施例35或36之一些其他實施例中，步驟c)在層析開始後約4.5分鐘開始且在層析開始後約7.6分鐘結束。
實施例38. 在實施例28至37中任一項之一些其他實施例中，非離子型表面活性劑為聚山梨醇酯。
實施例39. 在實施例38之一些其他實施例中，聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
實施例40. 在實施例38或39之一些其他實施例中，組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內。
實施例41. 在實施例28之一些其他實施例中，移動相B之有機溶劑為乙腈。
實施例42. 在實施例41之一些其他實施例中，步驟a)中移動相B與移動相A之比率為約10：90。
實施例43. 在實施例41或42之一些其他實施例中，步驟b)中移動相B與移動相A之比率增加至約40：60。
實施例44. 在實施例41至43中任一項之一些其他實施例中，步驟c)中移動相B與移動相A之比率增加至100：0。
實施例45. 在實施例41至44中任一項之一些其他實施例中，移動相A包含含約2%氫氧化銨之水。
實施例46. 在實施例41至45中任一項之一些其他實施例中，移動相B包含含約2%氫氧化銨之乙腈。
實施例47. 在實施例41至46中任一項之一些其他實施例中，非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。
實施例48. 在實施例48之一些其他實施例中，泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。
實施例49. 在實施例48或49之一些其他實施例中，組合物中之泊洛沙姆濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內。
實施例50. 在實施例28至49中任一項之一些其他實施例中，組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸及/或甲硫胺酸。
實施例51. 在實施例50之一些其他實施例中，組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內。
實施例52. 在實施例50之一些其他實施例中，組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1mM至約100mM範圍內。
實施例53. 在實施例28至52中任一項之一些其他實施例中，組合物中之多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL。
實施例54. 在實施例28至53中任一項之一些其他實施例中，調配物具有約4.5至約7.5之pH值。
實施例55. 在實施例28至54中任一項之一些其他實施例中，組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。
實施例56. 在實施例28至55中任一項之一些其他實施例中，組合物為適於投與個體之醫藥調配物。
實施例57. 在實施例28至56中任一項之一些其他實施例中，多肽為治療性多肽。
實施例58. 在實施例57之一些其他實施例中，治療性蛋白為多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。
實施例59. 在實施例28至58中任一項之一些其他實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。
實施例60. 在實施例28至59中任一項之一些其他實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。
實施例61. 在實施例28至60中任一項之一些其他實施例中，混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。
實施例62. 在實施例28至61中任一項之一些其他實施例中，混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。
實施例63. 在實施例28至62中任一項之一些其他實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。
實施例64. 在實施例28至63中任一項之一些其他實施例中，混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。
實施例65. 在實施例28至64中任一項之一些其他實施例中，非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
本說明書中揭示之所有特徵均可呈任何組合進行組合。本說明書中揭示之各特徵可經達成相同、相等或類似目的之替代特徵替換。因此，除非另外明確地陳述，否則所揭示之各特徵僅為同類別之一系列相等或類似特徵之實例。
藉由以下非限制性實例說明本發明之更多細節。本說明書中所有參考文獻之揭示內容以引用之方式明確地併入本文中。
實例
以下實例意欲僅僅說明本發明且因此不視為以任何方式限制本發明。以下實例及詳細描述藉助於說明來提供而非限制。
實例之材料與方法
除非另作說明，否則以下材料及方法用於實例。
材料
使用穩定中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株或大腸桿菌細胞製造所有mAb(A1-A20)。
Waters Oasis® MAX濾筒(2.1×20mm，30μm粒度，PN# 186002052)及Waters Oasis® MCX濾筒(2.1×20mm，30μm粒度，PN# 186002051)係購自Waters。聚山梨醇酯20自Sigma(P/N T2700-100ML)獲得。蟻酸自Fluka(P/N 94318-250ML-F)獲得。HPLC級冰醋酸自JT Baker(P/N 9515-03)獲得。HPLC級異丙醇(P/N PX1834-1)及甲醇(P/N MX0488-1)自OmniSolv獲得。HPLC級水自HoneyWell(目錄號365-4)獲得。27%-31%氨溶液自Spectrum Chemicals(P/N AM180)獲得。
實例1. 最佳化
需要更穩固之解決方案以消除蛋白質干擾且在所有HPLC濾筒貨號之間產生一致的PS20定量。作為起始點，在用本發明之方法評估其他分子前，抗體藥物結合物(ADC)調配物用於評估前述方法之修改之有效性。實驗之目標係研發一種PS分析法，以藉由最小化或完全移除來自蛋白質之干擾，在多種產物調配物中穩固地定量PS20；證明與先前分析法相比，本發明之分析法提高PS20定量之準確度及再現能力，包括在多個濾筒貨號之間的穩固性；以及進行鑑定研究以評估PS20在所選產物調配物中之準確度、精確度、特異性、可重複性及中間精確度。
方法
對於所有實驗，使用以下ELSD設置：光源強度(LED)設置為75%
偵測器增益(PMT)設置為1。
在HPLC分析法中，PS20酯滯留在濾筒上，而其他賦形劑、蛋白質及未酯化之PS20物質在流過或洗滌步驟中溶析。在洗滌步驟後，使用轉移閥將蒸發光散射偵測器(ELSD)串聯置放，且用較高%有機相之階段梯度溶析酯化之聚山梨醇酯物質。未酯化之PS20物質佔總PS20組合物之約20%(Hewitt,D.等人，2011,J.Chromatography A,1218：2138-2145)。HPLC-ELSD分析法僅僅定量PS20酯，此為足夠的，只要用於製備標準物之PS20批料與樣品中之PS20相比含有類似量之PS20酯即可。標準物之類似PS20酯組成可藉由相等方案(Hewitt,D.等人，2011,J.Chromatography A,1215：156-160)或藉由將用於製造標準物之PS20批料與用於樣品之批料匹配來確定。
亦稱為方法0之原始方法之HPLC-ELSD條件如下：Agilent 1200 HPLC及Varian 380 ELSD；濾筒為Waters Oasis MAX線上濾筒；移動相A 為含2%甲酸之水；移動相B為含2%甲酸之異丙醇；流速為1mL/min；且注射體積為20μL。所用梯度展示於表2中。
以下概述亦稱為方法1之最終方法，其中對原始方法之修改以粗體/下劃線標出。表3展示LC梯度且表4展示此分析法之典型注射順序。HPLC-ELSD條件如下：Agilent 1200 HPLC及Varian 380 ELSD；濾筒為Waters Oasis MAX線上濾筒；移動相A為含2%甲酸之水或含2%乙酸之水；移動相B為含2%甲酸之異丙醇或含2%乙酸之甲醇；流速為1.25mL/min；且注射體積為20μL(視PS20濃度範圍而定)。雖然最終選擇乙酸用於最終條件，但最初在移動相中使用2%甲酸，進行一些鑑定及穩固性工作。
方法最佳化 1.最初嘗試之條件：
在方法1發展過程中，在選擇最終基於甲醇之移動相前，評估許多不同實驗條件，其中目標為最小化蛋白質干擾之影響。此等實驗概述於表5中。
方法穩固性實驗
表6及表7描述用於在多種產物之間測試方法穩固性之產物及濾筒。
1.濾筒之間的方法穩固性：
表8描述使用兩個不同濾筒，在12個參考標準物(表9中所示)上評估方法穩固性之濾筒：一個濾筒提供方法0中可接受之特異性，且另 一濾筒提供方法0中不可接受之特異性。表8中提供之濾筒編號對應於表7中提供之彼等編號。
方法鑑定
藉由評估線性度、準確度、精確度(包括中間精確度)及特異性，完成方法鑑定。表10描述用於中間精確度之儀器及濾筒。
結果： 方法最佳化 多階段梯度實驗：
在評估不同移動相期間，需要一種方法來確定聚山梨醇酯是否可完全與典型蛋白質調配物之其他成分分離。為進行此分析，進行多階段梯度實驗(圖1)。此等實驗需要用由含2%揮發性酸(甲酸、三氟乙酸或乙酸)之10%有機溶劑組成之移動相平衡濾筒，移動相中有機溶劑之濃度以5%逐階遞增，且保持在各濃度下1分鐘以模擬PS20定量方法之洗滌步驟。重複此等5%階段，直至達到98%有機(+2%揮發性酸)移動相。在此方法期間維持1mL/min之恆定流速。用無PS20之蛋白質之樣品進行此等實驗以確定完全溶析除PS20外之調配物之所有成分的移動相組成，且用含PS20標準物之水進行此等實驗以確定開始溶析PS20酯物質之移動相組成。比較此兩個移動相有機溶劑濃度以確定是否可發現完全分離蛋白質基質成分與聚山梨醇酯之最佳移動相組成。在分析法之洗滌步驟期間將使用此最佳移動相組成以移除可能滯留於濾筒之任何蛋白質。出於兩個原因，多階段梯度比線性梯度更為所需。首先，線性梯度未模擬方法之洗滌步驟，且其次，很難確定在線性梯度期間引起各成分溶析之離散移動相組成。
多階段梯度實驗揭露自濾筒洗滌蛋白質，但保持PS20酯物質之最佳甲醇濃度在40%與50%之間(圖1及圖2)。注意到2%甲酸仍然在移動相中。測試40%與50%甲醇洗滌步驟且兩者均消除來自A1 ADC之蛋白質干擾。利用40%甲醇洗滌之PS20峰面積平均比利用50%甲醇洗滌之PS20峰大38%(n=8)。因此，選擇40%甲醇來提高PS20靈敏度。利用50%洗滌之峰面積較低可能指示在蛋白質洗滌步驟期間溶析一些疏水性較小之PS20酯，但未進一步調查此可能性。
圖1展示典型階段梯度覆蓋圖之一實例(無PS20之產物及PS20標準物)。此覆蓋圖說明所有蛋白質均用40%-50%甲醇溶析，且PS20酯在50%甲醇下開始溶析。注意到HPLC與ELSD之間的閥在蛋白質樣品第一分 鐘期間處於轉向模式以避免偵測器浸透。PS20標準物中所示之多個峰很可能歸於按疏水性遞增次序自濾筒溶析之不同聚山梨醇酯物質。在各階段改變溶析的不同蛋白質峰未表徵。此覆蓋圖提供一種迅速發現自濾筒洗滌蛋白質，同時保持PS20酯蛋白質之最佳甲醇濃度的方式。
使用異丙醇重複多階段梯度實驗，以相對於甲醇比較蛋白質及PS20區之溶析。圖2說明在兩個不同濾筒上無PS20之A1 ADC及PS20標準物的甲醇及異丙醇之不同多階段溶析曲線圖。先前已評估第一濾筒(跡線1)；第一濾筒正常在方法0下進行(跡線1)，然而，第二濾筒非最佳(跡線2)。利用異丙醇之多階段梯度實驗展示洗滌步驟中之最佳異丙醇濃度為20%。此與方法0一致，方法0在1與3.4分鐘之間使用20%異丙醇洗滌。然而，在不同濾筒之間利用異丙醇洗滌使蛋白質與PS20酯分離不一致，且說明蛋白質干擾隨濾筒而變化。在某些濾筒(例如圖2中所用之濾筒)上，在與PS20酯相同的異丙醇濃度下一部分蛋白質溶析。此行為表明當用異丙醇法定量PS20時此等特定濾筒將展現顯著量之蛋白質干擾且實驗上證實此影響。
與圖2之下圖相反，上圖證明在不同濾筒上甲醇多階段梯度至40%甲醇步驟仍一致地溶析所有蛋白質，且PS20酯在50%甲醇下開始，說明與異丙醇階段梯度相比，蛋白質區至PS20區之分離窗口更寬。此結果表明使用40%甲醇洗滌將一致地分離蛋白質與PS20酯且因此減少濾筒之間PS20定量之變化性。
多階段梯度實驗用於迅速地評估在不同濾筒及移動相組成之間PS20與蛋白質之分離(圖1及圖2)。
此方法成功地確定PS20分析法之洗滌條件且可用於評估洗滌步驟對於使用不同濾筒及移動相分離其他分析物之有效性。
實驗設計：
二級全因子實驗設計(DoE)用於將含有甲酸之經修改之PS20法最佳化。所調查之參數如下：在洗滌步驟期間之甲醇濃度(40%、50%)
洗滌持續時間(1.8分鐘、3.0分鐘)
流速(0.75mL/min、1.25mL/min)
裝載之PS20質量(4μg、12μg)
注意「洗滌」步驟係指其中有機物之濃度保持不變以自濾筒洗滌任何殘餘蛋白質的HPLC方法之一部分。除二級全因子變換之外，在順序開始及結束時測試中點(45%有機物洗滌，2.4分鐘洗滌持續時間，1mL/min流速，8μg PS20裝載)。此實驗針對以下三個樣品分開操作：含PS20之水、無PS20之A1 ADC及外加PS20的無PS20之A1 ADC。對於無PS20之A1 ADC樣品，PS20裝載參數不適用。
用於最佳化之標準如下：使PS20之滯留時間時之蛋白質干擾最小化(僅僅對於無PS20之A1 ADC樣品)
使蛋白質與PS20峰之間的解析度最大化(對於PS20+A1 ADC樣品)
使10%峰高下PS20峰寬最小化(含PS20之水樣品)
使PS20峰面積最大化(含PS20之水樣品)
DoE之結果展示所有測試條件均消除蛋白質干擾。當注射無PS20之A1 ADC時未觀察到蛋白質干擾。類似地，發現對於所有狀況，蛋白質與PS20峰之間的解析度均超過3，其中解析度藉由以下等式(等式1)計算： 其中t為各峰之滯留時間且W50%為50%高度下之峰寬。
因為對於所有測試條件均未觀察到對蛋白質干擾或解析之影響，所以針對靈敏度及峰形使PS20峰面積及寬度最佳化。圖3中說明流速、甲醇洗滌濃度及洗滌時間對PS20峰面積及寬度之影響的概述。流速增加使PS20峰寬減小，且洗滌步驟中甲醇濃度自50%減少至40%使PS20峰面積增加38%。在50%甲醇洗滌下，在洗滌步驟期間溶析額外PS20峰，滯留時間比未酯化之PS20物質遲，且懷疑此額外峰係由疏水性較小之PS20酯的較早溶析產生。大部分相關發現為PS20峰面積隨洗滌階段之MeOH濃度增加而減小，且流速增加使峰寬減小。
圖4中說明40%及50%甲醇洗滌液之比較。在45%甲醇洗滌下，不存在大致1.8-3.5分鐘之此額外峰。發現所測試之PS20裝載對任何評價標準均無影響。選擇最低甲醇洗滌濃度(40%)、最高流速(1.25mL/min)及中點洗滌時間2.4分鐘)作為方法1之最佳化參數。表3中展示所選最終條件。
方法穩固性實驗
一旦使用多階段梯度實驗確定最佳甲醇洗滌濃度，則測試方法1(甲酸+甲醇)相對於方法0(甲酸+異丙醇)之改善。
產物之間的方法穩固性
為在方法1(甲酸+甲醇)與方法0(甲酸+異丙醇)之間進一步比較蛋白質干擾之影響，在12種不同參考標準物中使用2個濾筒將PS20定量。濾筒經選擇，以便一個濾筒(濾筒)視為可接受的，在方法0下產生準確結果，且由於在方法0下蛋白質干擾程度高，一個濾筒(濾筒5)視為不可接受的。此實驗之目標係證明方法1使多種產物在「可接受」與「不可接受」之濾筒之間的變化性減少的程度。在分別描述於表8及表9中之方法中的濾筒及參考標準物上比較使用各方法定量PS20之一致性。
各方法之參考標準物及其量測之PS20濃度列於表11中。不計算各方法之準確度，因為針對各參考標準物之A之C中所列的PS20濃度無法當做如外加樣品之情況下時的理論值。因此，無法針對此等參考標準物評估各方法之準確度。
表11中之資料展示在移動相中使用甲醇的兩個濾筒之間的PS20定量之差異一致小於5%。相比之下，當移動相中使用異丙醇時PS20定量之差異展示濾筒之間的變化程度大得多。方法0(甲酸+異丙醇)對濾筒變化更敏感。表11中之資料展示對於所有產物，移動相中使用甲酸+甲醇在不 同濾筒之間產生更一致的PS20定量，不管方法0中濾筒如何執行。PS20定量的絕對%差異使用等式2計算：等式2：PS20定量的絕對%差異｜100*([濾筒5濃度]-[濾筒1濃度])/[濾筒1濃度]｜
濾筒之間的方法穩固性
藉由利用四種產物，在九個濾筒之間測試兩種條件來比較方法0及方法1(甲酸+甲醇)。PS20以各產物之目標調配物濃度之50%外加至無PS20之蛋白質基質中。此方法代表分析基於分析合格驗收準則定量各產物所需之最低PS20濃度。藉由PS20外加至水中來製備標準物及對照物。兩個HPLC/ELSD系統(Agilent 1200/Agilent 380及Waters 2695/Varian 380)用於測試。所測試之產物及濾筒分別詳細描述於方法章節表6及表7。特意選擇所測試之濾筒以覆蓋大範圍的貨號、年代及歷史效能。
測試無PS20之產物之樣品及外加PS20之樣品以分別評估PS20分析之蛋白質干擾及PS20定量之準確性。在9個濾筒上，利用甲酸+甲醇與甲酸+異丙醇(方法0)測試A1 ADC、A2、A3及A4樣品。表12中展示在所有濾筒之間使用兩種方法的平均回收率、相對標準偏差及範圍。
表12說明移動相中使用甲醇提高PS20定量之準確性(平均回收率更接近100%)且減少濾筒之間的變化性(% RSD減小)。此等資料展示在移動相中使用甲醇代替異丙醇對A1 ADC及A2調配物中PS20定量尤其有效。A4調配物中PS20之偏倚之超量回收率可能是由於信雜比降低，其中僅僅1μg PS20裝載至濾筒上(注射20μL，0.05mg/mL PS20濃度)。在R & D方法鑑定(甲酸+甲醇)期間使用增加之PS20裝載(注射50μL)，且未觀察到超量回收率。
當移動相中使用甲醇時觀察到A3之超量回收率，然而，此仍然優於異丙醇移動相。假定此分子之低pI引起蛋白質藉由靜電引力滯留在固定相之帶正電之四級胺基上，此分子之低pI係部分由於其聚糖上唾液酸基之豐度增加。
進一步方法最佳化 移動相酸之選擇
使用階段梯度，利用基於甲醇之移動相及不同移動相有機酸進行實驗，以確定該方法關於最小化蛋白質干擾之最佳添加劑。甲醇階段梯度實驗係用無PS20之A1 ADC及無PS20之A10 ADC，使用甲酸、乙酸或三氟乙酸進行，進行ELSD偵測以監測酸對蛋白質溶析之影響。含PS20標準物之水用於監測PS20之滯留。
改變移動相添加劑可深入瞭解蛋白質如何保持在濾筒上。圖5、6及7展示在移動相中分別使用三氟乙酸、甲酸及乙酸的無PS20之ADC及PS20標準物之甲醇多階段梯度覆蓋圖。對於所有移動相添加劑，PS20酯均在50%甲醇下開始溶析。圖5展示在移動相中使用三氟乙酸的無PS20之A10 ADC及PS20標準物。蛋白質溶析在大致80%甲醇下結束。因此，許多蛋白質將與PS20酯共同溶析且干擾PS20定量。圖6展示在移動相中使用甲酸的無PS20之A1 ADC及PS20標準物。蛋白質在約40%甲醇下完全溶析，指示40%甲醇洗滌將蛋白質與聚山梨醇酯分離。此結果與已研發之方法1一致。圖7展示在移動相中使用乙酸的無PS20之A1 ADC及PS20標準物。在此情況下，蛋白質藉由15%甲醇完全溶析。此發現表明蛋白質可藉由在15%-50%範圍內之任何甲醇洗滌與PS20酯分離。此等移動相添加劑之離子配對強度如下：三氟乙酸>甲酸>乙酸。相應地，如蛋白質經由疏水性相互作用與逆相固定相結合的情況下所預期，蛋白質隨著移動相中離子配對劑之強度增加而更強地保持。
不受理論限制，酸性移動相之低pH值在蛋白質上產生淨正電荷。帶正電之蛋白質與帶正電之Oasis® MAX固定相之相互作用將為庫倫定律上不利的，導致蛋白質未由固定相保持。相比之下，離子配對移動相添加劑可與蛋白質相互作用以有效地使蛋白質更具疏水性(Xindu,G.及Regnier,F.E.Journal of Chromatography A,296：15-30,1984)。此相互作用將藉由與足夠強之離子配對劑(例如TFA)之疏水性相互作用機制引起蛋白質保持於濾筒。降低移動相中離子配對劑之強度隨後將減少蛋白質/固定相相互作用。作為三種測試之離子配對劑中最弱的離子配對劑，移動相中之乙酸似乎顯著減少蛋白質滯留在濾筒上。因此，乙酸作為移動相添加劑允許蛋白質與PS20酯之間的分離比其他測試添加劑更佳。
圖8展示作為移動相添加劑之乙酸與甲酸之間的分析法效能之比較。如圖8中所見，在甲酸作為移動相添加劑下，與注射水相比，觀察到蛋白質注射之基線極細微增加(約3mV)。雖然認為此干擾最小，但觀察到當乙酸為移動相中之添加劑時，蛋白質基質注射未增加ELSD基線。此外，出於診斷目的，監測280nm下之吸光度，以觀察蛋白質滯留及清除。當移動相中使用乙酸時，空體積中蛋白質幾乎完全清除，而當甲酸用作添加劑時，蛋白質微弱地保持在濾筒上且在1-2分鐘之間的滯留時間溶析。因為LC流在2.4分鐘轉向ELSD，所以當甲酸為添加劑時蛋白質不會完全清除的機率增加，允許一定蛋白質干擾。
圖9中展示使用不同濾筒(關於貨號細節參考表7)自乙酸+甲醇溶析條件之代表性層析圖。雖然來自濾筒1之峰形為典型的(跡線1)，但此等資料證明在不同濾筒之間PS20峰輪廓可變化。在諸如濾筒4(跡線2)之某些濾筒上，PS20峰傾向於拖尾；進一步使用此濾筒，拖尾最終可變成PS20峰分裂(跡線3)。此行為尚不常見，因為濾筒2(資料未示)及4為僅有的在方法發展期間展現峰分裂之測試濾筒。在其他情況下，諸如濾筒5(跡線4)，觀察到輕微峰拖尾。附帶言之，在甲醇移動相下展示峰拖尾及峰分裂增加之濾筒在異丙醇用於移動相中時蛋白質干擾程度亦增加。此發現可表明展示峰拖尾增加之濾筒更強地保持疏水性分子。不管峰形如何，PS20定量及整合處理方法均不受影響。
PS20定量之最終方法1將在移動相中用2%乙酸執行，因為其顯示相對於Oasis® MAX濾筒上之甲酸，蛋白質與PS20之分離獲得改善(圖9)。
方法鑑定
在使用階段梯度實驗來最佳化洗滌步驟且進行方法穩固性實驗之後，發現在移動相中使用2%乙酸代替2%甲酸改善蛋白質與PS20酯之分離。因此，本實例描述用甲酸/甲醇移動相(來自初始方法發展)與乙酸/甲醇移動相(最終方法)兩者進行的鑑定實驗。
除以下參數外，用於鑑定分析法之方法與方法0中之HPLC-ELSD分析法一致：流速=1.25mL/min
移動相A=含2%甲酸之水或含2%乙酸之水
移動相B=含2%甲酸之甲醇或含2%乙酸之甲醇
使用表3中之梯度
注射體積視調配物中PS20之濃度而調整，以對濾筒產生類似裝載。參見表13。
鑑定研究用無PS20之A1 ADC、無PS20之A1、無PS20之A4、無PS20之A5及無PS20之A11進行。已知量之PS20外加至各樣品中以確定分析法之準確性。評估分析法(關於每個產品所用之添加劑參考表13)之準確性、精確度、特異性、可重複性及中間精確度。
準確性及精確度：
PS20(貨號MKBL2646V)以已知濃度(視產物而定；參見表13)外加至無PS20之蛋白質樣品以確定分析法之準確性。使用高濃度PS20儲備溶液(25mg/ml)進行此實驗，以便使外加對蛋白質之稀釋程度最低。對於各濃度，除非另作說明，否則一式三份地注射外加PS20之樣品。PS20回收率用於確定PS20定量之準確性。平均回收率之範圍用於確定精確度。亦確定指定範圍內之線性度(表13)。表13展示外加至各產物之PS20之濃度。注意DNIB0600S之2個範圍用於覆蓋第III階段調配鎖定前之最壞情況(亦即 最低)PS20濃度(0.4mg/ml)及較高濃度(0.7mg/ml)。使用兩個分開的範圍，因為ELSD設置將需要改變，以在0.2mg/ml-1mg/ml PS20之範圍內準確地定量PS20。對於各範圍，改變注射體積，而非改變偵測器設置。在調配鎖定後，針對最終調配物(1.2mg/mL PS20)及較高蛋白質濃度(40mg/mL)，使用單個範圍，進行另一評估。
每組濃度之標準物由含PS20之水製成。標準物在蛋白質樣品前一式兩份地注射。測試物品每第6次注射包括含PS20之水的對照樣品。PS20對照物與標準物(來自PS20貨號MKBJ7237V)分開製備。選擇標準物之濃度以覆蓋外加至各無PS20之蛋白質產物的PS20濃度之範圍。
基於各產物之原料藥調配的可能或實際PS20濃度，選擇PS20對照物之濃度。表14展示在各濃度範圍內用於分析之標準及對照PS20樣品之濃度。
測試多種產物之方法1之準確性及精確度。準確性之可接受結果將展示各外加濃度下平均回收率為80%-120%。各產物之結果展示於表15中。
如表15中所示，所有測試產物在所有濃度下之平均回收率%均滿足驗收準則(80%-120%)且在82.4%至114.8%範圍內。因此，此分析證明在測試之PS20範圍內所有產物之準確性及精確度均可接受。
因為注射體積變化，所以分析範圍亦可根據PS20質量(而非調配物中之PS20濃度)來表示。此等結果展示1.25μg(0.025μg/μL×50μL)-16μg(1.60μg/μL×10μL)PS20可裝載至濾筒上且準確地定量。
線性度
藉由確定皮爾森相關係數(r)>0.99來評估線性度。表16中展示針對PS20濃度之各範圍的此等值。
對於所測試之PS20範圍，皮爾森相關係數之所有值0.99。因此，在多種產物之間此分析之線性度可接受。
特異性：
藉由證實注射無PS20之調配緩衝液及無PS20之產物不會影響PS20峰來確定九種產物之特異性。一式兩份地注射調配緩衝液及無PS20之蛋白質樣品。無PS20之調配緩衝液及無PS20之蛋白質基質的峰面積與在各產品目標PS20濃度之50%下之標準物的反應相比。若無PS20之樣品 中峰面積最低標準物中峰面積之10%，則滿足驗收準則。當PS20區中存在明顯一些蛋白質干擾時，以下等式用於推導特異性之數值估計值：等式3：計算特異性特異性=(無PS20之蛋白質之面積/PS20規格50%之面積)×100
如圖10中所示(在A1 ADC下)，無PS20之調配緩衝液與無PS20之蛋白質樣品均不干擾PS20峰。表17中給出所有其他產物之特異性值。因為在甲酸方法鑑定實驗之後針對A1 ADC選擇目標PS20濃度，所以較低目標PS20濃度用於計算樣品之特異性(用星號表示)。使用較低目標PS20濃度將產生較高特異性值，但所有報導之值仍完全低於10%。
可重複性：
含有外加0.4mg/mL PS20之20mg/mL無PS20之A1 ADC及外加0.3mg/mL PS20之150mg/mL無PS20之A14/A15的樣品注射6次。表18中展示此等注射及對應濃度之PS20峰面積。重複注射之面積及濃度的% RSD證明可接受之注射可重複性。
重複注射之面積及濃度的% RSD證明可接受之分析可重複性。
中間精確度：
在兩個不同HPLC-ELSD系統上，利用3種不同PS20標準物及緩衝液製劑且藉由2個不同分析員，針對三個濾筒測定中間精確度(僅僅甲酸+甲醇)。對於每天之各樣品，表19中報導2次注射之平均值。在表19底部，報導所有注射之平均值及標準偏差。注射之樣品為外加0.4mg/ml PS20之20mg/mL無PS20之A1 ADC、外加0.1mg/ml PS20之無PS20之A1及外加0.1mg/ml PS20之無PS20之A4。在方法章節中表10中展示每天之條件。在乙酸最終作為方法1之改質劑前，使用甲酸進行中間精確度。在移動相中乙酸下不重複中間精確度，因為在兩種改質劑之間所有其他鑑定參數均可比較且因為每一條件之樣品製備一致。
在測試中間精確度之3天之間所有三種樣品之% RSD小於10%。此等結果展示對於多種濾筒、樣品製劑、HPLC-ELSD系統及分析員而言，分析一致。注意到第2天濃度存在略微較低趨勢。
結論：
在新版本方法發展期間對ELSD方法0分析進行以下修改：移動相B自異丙醇轉換成甲醇
添加劑自2%甲酸變成2%乙酸
1-3.4分鐘之洗滌步驟中有機物之濃度自20%移動相B轉換成40%移動相B流速自1.00mL/min變成1.25mL/min
總而言之，此等修改顯著減少蛋白質干擾與濾筒之間的效能變化性。與先前條件相比，移動相B有機物自異丙醇變成甲醇(圖2)改善蛋白質與PS20之分離。來自甲醇/FA與異丙醇/FA比較實驗之結果(表11及表12)展示方法1顯著改善PS20定量及濾筒之間的可再現性。用乙酸替換甲酸(圖8)作為移動相添加劑進一步減少蛋白質滯留於濾筒。此外，有機洗滌步驟自20%變成40%顯著最小化蛋白質干擾。
關於多種產品之此修改分析之鑑定結果展示此分析適合於在多種分子格式、蛋白質濃度及PS20濃度間定量PS20，因此表明方法1為平台PS20定量分析之候選方法。
實例2. 含有N-乙醯基色胺酸之調配物的HPLC-ELSD聚山梨醇酯20定量方法之發展
在評估上述PS20方法(方法1)的過程中，發現N-乙醯基色胺酸(NAT)在作為調配物中額外賦形劑存在時顯著干擾聚山梨醇酯20(PS20)。雖然對於已測試之大多數調配物，實例1之方法1展示最小化之蛋白質干 擾以及減小的濾筒間變化性，但在此方法之條件下N-乙醯基色胺酸保持在濾筒上且在與PS20相同之滯留時間溶析。不受理論束縛，NAT可由於分子上存在與用於方法1之混合模式陰離子交換樹脂(MAX)濾筒相互作用之羧酸酯基而保持在濾筒上。
如下所述，方法1進行修改以藉由以下來消除NAT干擾：
1)濾筒自MAX樹脂變成混合模式陽離子交換樹脂(MCX)
2)移動相添加劑自乙酸變成氫氧化銨
另外，藉由將有機洗滌自40% B增加至45% B且分別使洗滌步驟時間增加1分鐘及溶析步驟時間增加2分鐘，來將該方法進一步最佳化，亦稱為方法2。本實例中描述允許PS20定量用於用NAT調配之計劃的條件的發展。使用調配物中含有NAT之三種產物，藉由評估方法2之準確性、精確度、線性度、特異性、可重複性及穩固性，來評估新的條件。
使用MAX濾筒之前述LC-ELSD分析觀察到低pI分子下蛋白質干擾較高。因此，對方法1與方法2進行低pI分子之評估，以確定哪種方法更適合於正確的PS20定量。
材料
HPLC/ELSD系統：例如Agilent 1200 HPLC-Varian 380 ELSD
聚山梨醇酯20：Sigma P/N：T2700-100ML
HPLC級冰醋酸：JT Baker
濃氨溶液，27-31%：Spectrum Chemicals
HPLC級水HoneyWell
HPLC級甲醇：OmniSolv
Waters Oasis® MAX濾筒2.1×20mm，30μm粒徑
Waters Oasis® MCX濾筒2.1×20mm，30μm粒徑(表20) 含NAT之產物(表21)
方法：
對於所有實驗，ELSD光源強度(LED)設置為75%且偵測器增益(PMT)設置為1。使分析與含NAT之調配物相容的對方法之最終修改的概述如下：Agilent 1200 HPLC(或同等物)及Varian 380 ELSD(或同等物)
濾筒：Waters Oasis® MCX線上濾筒
移動相A：含1.5%氫氧化銨之水
移動相B：含1.5%氫氧化銨之甲醇
流速：1.40mL/min
轉向閥時間選擇：在4.00分鐘流向ELSD
注射體積：25 * μL(*依賴於產物)
結果： 干擾之測定
方法發展之初始焦點係確定NAT是否為前述分析中觀察到之干擾之來源。此工作藉由研究含有NAT或不含NAT之一系列緩衝液(緩衝液細節提供於材料章節(表21)及結果章節(表23)中)來進行。
無PS20之A16/A17調配緩衝液(20mM組胺酸-HCl、1mM NAT、5mM甲硫胺酸、240mM蔗糖，pH 5.5)及目標濃度(標稱=80mg/mL)之無PS20之A16/A17最初使用實例1之方法1評估。以下提供各樣品之組成：無PS20之調配緩衝液-20mM組胺酸-HCl、1mM NAT、5mM甲硫胺酸、240mM蔗糖，pH 5.5。
無PS20之A16/A17樣品-80mg/mL(標稱)，於20mM組胺酸-HCl、1mM NAT、5mM甲硫胺酸、240mM蔗糖中，pH 5.5。
圖11A顯示此評估之ELSD結果，其中對於兩種樣品，在ELSD中在PS20之滯留時間(約4.5分鐘)觀察到顯著干擾。展示水(跡線1)、無PS20之調配緩衝液(跡線2)及無PS20之蛋白質樣品(跡線3)的注射。另外，圖11B 顯示各樣品之UV(280nm)信號，其中在大約PS20之滯留時間偵測到組分。因為注射無PS20之調配物時觀察到之干擾程度大致與蛋白質樣品相同，所以顯然，該來源不僅僅是因為蛋白質，且將吾人引向如下假設：緩衝液中存在由濾筒保持之賦形劑。
出於以下原因，確定n-乙醯基色胺酸(NAT)為在圖11A及11B中觀察到之干擾物：1)先前尚未用方法1測試含NAT之調配物，因此，此突顯為與先前評估之重要差別；2)NAT具有4.1之表觀pKa且具有羧酸酯基，羧酸酯基可能引起其呈去質子化之陰離子形式保持於MAX濾筒之銨陽離子樹脂；及3)NAT吸光度最大值靠近280nm(H.Edelhoch,Biochemistry，第6卷，第7期，1967年7月)，且在NAT調配物樣品下，在PS20滯留時間(約4.3分鐘)觀察到280nm吸光度(圖11B)。
為證實NAT干擾PS20，如上所述，測試有或者無NAT之一系列A16/A17調配緩衝液。圖12A及12B展示在圖12A中顯示之含有NAT之緩衝液及圖12B中顯示之無NAT之緩衝液下此評估的HPLC-ELSD結果。圖12A中各含NAT之緩衝液亦展現PS20之滯留時間下的峰。相比之下，不含NAT之所有緩衝液均未展現干擾峰。總而言之，圖11A、11B、12A及12B中之資料表明NAT保持在Oasis® MAX濾筒上，且與PS20共同溶析，而非干擾由蛋白質或其他賦形劑引起。
NAT含有羧酸酯基，且可經由陰離子交換保持於濾筒中發現之樹脂。探索替代Oasis®濾筒(Oasis® MCX)之使用以更好地將NAT與PS20分開。不同於含有基於銨之陽離子樹脂的Oasis® MAX濾筒，Oasis® MCX濾筒含有陰離子亞硫酸鹽樹脂。最初，使用與方法1中所用相同的移動相(甲醇+乙酸)，評估MCX濾筒。然而，在此等條件下發現蛋白質干擾上升至不可接受之程度(資料未示)。Waters Oasis®樣品提取方法推薦使用氫氧化銨作為MCX樹脂之盤格式中固相提取程序中之移動相添加劑(Waters,「Oasis Sample Extraction Products」,2011)。因此，藉由2%乙酸替換為1.5%氫氧化銨來修改移動相，以更好地模擬製造商所推薦之條件。在此等方法修改下，使用MCX濾筒評估A16/A17緩衝液之不同衍生物且資料展示於圖13A及13B中。
不同於用方法1獲得之結果，在有或無NAT下，在PS20之滯留時間均未觀察到干擾，且所有賦形劑均在1分鐘前自濾筒溶析(圖13A及13B)。另外，當注射50μL無PS20之A16/A17蛋白質(圖13A，跡線4)時在ELSD中在PS20區中未觀察到干擾，表明該方法能夠將蛋白質與PS20分離。選擇MCX濾筒與氫氧化銨作為移動相添加劑一起用於評估含有NAT之調配物的PS20定量。
方法修改
一旦建立用於分析含NAT之調配物的初步條件，則如上所述，進一步詳細地檢查以下參數：移動相中氫氧化銨%
洗滌步驟中所用之%B(測試20-60% B)
洗滌時間(2.4分鐘及3.4分鐘)及注射體積(25及50μL注射體積)
流速(0.8mL/min至1.6mL/min)
溶析時間(1.1分鐘、3.1分鐘)
移動相中氫氧化銨%
Waters Oasis®樣品提取方法推薦使用氫氧化銨作為MCX樹脂之盤格式中固相提取程序中之移動相添加劑(Waters,「Oasis Sample Extraction Products」,2011)。實驗藉由用ELSD(圖14A)與UV(圖14B)兩者偵測來進行。無PS20之A16/A17蛋白質為用於評估在移動相中使用0.15%、0.29%、0.73%或1.5%氫氧化銨將蛋白質與NAT自濾筒溶析之樣品(圖14A及14B，分別為跡線1、2、3及4)。因為UV偵測器串聯在轉向閥前，所以可偵測在PS20前溶析之具有發色團(例如NAT及蛋白質)之分析物。為評估清除NAT之能力，亦注射無PS20之A16/A17調配緩衝液(圖14A及14B，跡線5)。
當藉由轉換轉向閥在2.4分鐘將濾筒流出物引入ELSD時，在移動相中利用0.15%氫氧化銨下，觀察到輕微干擾(圖14A，跡線1)，如略微更高之基線所證明；UV跡線亦展示在流出物進入ELSD前蛋白質及/或NAT大部分自濾筒溶析。大多數此等潛在干擾物在空體積中溶析。當氫氧化銨添加劑之百分比增加時(0.29%至1.5%)，藉由ELSD觀察到的蛋白質或NAT干擾程度的差異最小(圖14A，跡線2-4)。另外，UV跡線展示在所有測試之氫氧化銨含量下該方法充分清除蛋白質及NAT(圖14B，跡線2-4)。當無PS20之蛋白質與移動相中1.5%氫氧化銨一起注射時(圖14A，跡線4)，在流出物在2.4分鐘引入PS20區(4.0-5.5分鐘)中時，似乎蛋白質干擾少於與較低氫氧化銨百分比一起注射之相同蛋白質。無PS20之調配緩衝液(圖14B跡線5)之UV跡線展示移動相中利用1.5%氫氧化銨有效地清除NAT。因此，選擇此百分比之添加劑用於方法中。
280nm下之吸光度(圖14B)展示當移動相中使用0.15%-1.5%氫氧化銨時充分清除蛋白質及NAT，其中此等干擾物之一些拖尾存在於約2.5分鐘下。因為此發現，故將甲醇+氫氧化銨方法變成在3.0分鐘而非2.4分鐘將流動轉向ELSD，以免偵測器遭到污染且確保ELSD中最低程度之蛋白質及NAT干擾。因為PS20之溶析係在約4.5分鐘下，所以此變化不會影響該峰。
洗滌步驟中所用之%B(測試20-60%)
先前，對於在無NAT之調配物中方法1之發展，使用階段梯度法，將在洗滌步驟期間用以將蛋白質與PS20分開之甲醇%最佳化。由於方法之若干關鍵變化對蛋白質滯留存在未知影響，所以重新考慮方法2發展中所用之甲醇%；固定相變成MCX樹脂，且移動相添加劑修改成氫氧化銨。在此實驗中，在20%-60%之濃度範圍內測試四種不同含量，該等含量以10%(v/v)%B(甲醇+1.5%氫氧化銨)增量增加。ELSD與UV偵測用於監測各測試條件下之蛋白質溶析。無聚山梨醇酯之A16/A17樣品用於評估，且ELSD及UV資料分別展示於圖15A及15B中。
在圖15B中，280nm吸光度層析圖展現在PS2-(約4.5分鐘)之滯留時間的輪廓分明的峰，表明當注射15μL無PS20之A16/A17蛋白質時在20% B洗滌(跡線1)下蛋白質及/或NAT滯留在濾筒上。亦在空體積中觀察到大得多之峰，其可能為蛋白質與NAT之混合物。針對此相同條件，亦在ELSD中偵測到輪廓分明的峰，為PS20區之干擾(圖15A)。當洗滌步驟之%B增加至30%時，提高NAT及蛋白質清除率(跡線2)，如UV與ELSD跡線中PS20區中峰減小所證明。在40% B下更有效地清除NAT及蛋白質，然而，ELSD中PS20區中仍然存在輕微干擾(圖15A)。在50%及60% B洗滌(分別跡線4及5)下最有效地清除NAT及蛋白質，其中存在最低程度之干 擾。選擇洗滌步驟中45% B用於方法中。在方法1之先前發展期間，亦測試多達50%甲醇作為洗滌條件，但觀察到在此等條件下少部分PS20將較早溶析(在45%甲醇下未觀察到此小峰)。此等峰可為較短鏈長之酯，具有較小疏水性，且指示50%甲醇條件近乎為酯化物質將溶析之點。歸因於此前述觀察及展示40% B足夠移除蛋白質之發明結果，決定洗滌步驟之45% B條件以在穩固蛋白質移除與PS20滯留之間達成平衡。此外，圖15B中之UV資料展示蛋白質在50% B洗滌條件下略微更早溶析。
洗滌時間(2.4分鐘及3.4分鐘)及注射體積(25及50μL注射體積)
為進一步最小化PS20區中之干擾，評估2.4分鐘及3.4分鐘洗滌步驟。如圖16中所示，在2.4或3.4分鐘洗滌(分別跡線3及跡線2)之間PS20區類似。因為在更長洗滌時間下特異性稍微提高且無明顯負面影響，所以選擇3.4分鐘洗滌用於方法中。另外，選擇在4.0分鐘下代替在2.4分鐘下流動轉向ELSD。
注射體積對基線之影響亦藉由將樣品體積自50μL減少至25μL(分別圖16跡線2及跡線1)來評估。25μL注射跡線之基線稍微更乾淨地出現，此在預料中，因為較少蛋白質及賦形劑自濾筒移除。最終，注射體積未顯著影響關於特異性之效能。
流速(0.8mL/min至1.6mL/min)
評估流速以確保蛋白質及NAT有效地清除。流速在0.8-1.6mL/min之間變化。圖17A及17B展示使用1.60、1.40、1.25、1.00及0.80mL/min流速(分別跡線1、2、3、4及5)注射150mg/ml無PS20之A18/A19蛋白質之25μL樣品。
在最慢流速0.8mL/min(跡線5)下，如ELSD中之峰所指示(圖17A)，PS20區中仍然溶析蛋白質及賦形劑。此條件之UV跡線(圖17B)亦展 現溶析遲於較高流速下之增加干擾物。當流速增加至1.00mL/min(跡線4)時，干擾減小，且一旦流速增加至1.25mL/min(跡線3)，則變得幾乎可忽略。當流速增加至1.40及1.60mL/min(分別跡線2及1)時，UV跡線展示至2.0分鐘，大部分蛋白質及賦形劑比較低流速下更澈底地自濾筒溶析，且選擇1.40mL/min用於方法中。不增加至1.6mL/min，因為在1.4mL/min下效能幾乎相等，且因為欲將由1.6mL/min下較高背壓引起之滲漏風險降至最低。
溶析時間(1.1分鐘、3.1分鐘)
方法1中100% B下之溶析步驟保持1.1分鐘。存在身分未知之峰，在每次注射時觀察到其在約6.5分鐘下溶析，與樣品無關且包括水空白。未知峰似乎在移動相%B回至再平衡條件之後溶析。為測試峰是否可更佳地與PS20分離，延長溶析時間。圖18說明PS20峰之整合，該峰起始於約5.2分鐘且大約在此未知峰開始時結束(跡線2)。雖然此不顯著影響定量，但為防止此峰在將來可能產生干擾，將溶析步驟增加至3.1分鐘之保持時間(跡線1)，以允許更佳分離及PS20區之整合。圖19說明使用方法2，利用最終確定之參數的針對水、150mg/mL無PS20之A18/A19、外加0.2mg/mL PS20之水及外加0.2mg/mL PS20之A18/A19(分別跡線1、2、3及4)的結果。
方法鑑定實驗 特異性
藉由證實注射無PS20之調配緩衝液及無PS20之產物不會影響可能干擾PS20區之任何峰來確定特異性；此等與最低PS20校準標準相比，最低PS20校準標準通常為目標PS20濃度之50%。
圖20A-20F中展示無PS20之調配緩衝液、無PS20之蛋白質及外加0.1mg/mL PS20(50%目標)之水的典型層析圖。評估三種不同無PS20之 產物。A18/A19(圖20A及20B)、A16/A17(圖20C及20D)及A14/A20(圖20E及20F)分別具有150、80及150mg/mL之蛋白質濃度。關於此等產物之更多細節提供於表21中。在視覺上，當注射無PS20之蛋白質樣品時所有產品在ELSD中在PS20區中均具有一些干涉(圖20A、20C及20E，跡線2)。然而，無PS20之調配緩衝液未展示在PS20區中之可見干涉(圖20A、20C及20E，跡線1)，表明干擾主要來自蛋白質。
若無PS20之樣品中峰面積最低標準物中峰面積之10%，則滿足方法之驗收準則。因為PS20區中存在明顯的一些蛋白質干擾，所以必須使用等式確定特異性。存在用於確定特異性之不同方法。對於此研究，以下等式用於推導特異性之數值估計值：等式1：特異性干擾(%)=(無PS20之蛋白質之面積/50% PS20規格之面積)×100
使用此等式，計算三個產物之%干擾(表24)。確定與含0.1mg/mL PS20之水(50%目標)相比，無PS20之A16/A17(80mg/mL)(圖20C)具有7%特異性。無PS20之A18/A19(150mg/mL)(圖20A)僅僅具有4%干擾，而與含0.1mg/mL PS20之水相比(50%目標)，A14/A20(150mg/mL)(圖20E)具有13%干擾。
所有產物在280nm下之UV跡線(圖20B、20D及20F)均展示至4.0分鐘流動轉向ELSD時，有效清除蛋白質及NAT。雖然A14/A20具有13%之干擾，但是此產物之隨後評估中之可重複性、準確性及線性度為可接受的。
準確性
為確定分析之準確性，將已知量之PS20外加至無PS20之蛋白質且確定各濃度之回收率(表25)。典型的驗證驗收準則需要回收率%在80%-120%內。
藉由外加0.1-0.6mg/mL範圍內之PS20，評估無PS20之A18/A19(150mg/mL)及無PS20之A16/A17(80mg/mL)。表25中概述準確性資料。在測試之PS20濃度下，A16/A17及A18/A19之回收率範圍分別為94-100%及78-100%。0.4mg/mL PS20外加至無PS20之A18/A19下，樣品回收率為78%。括號內之PS20濃度(0.2及0.6mg/mL)之回收率在規定內，表明此一樣品之樣品製備或注射誤差。若排除0.4mg/mL樣品，則A18/A19之回收率範圍為88-100%。
藉由外加0.1-0.3mg/mL範圍之PS20來評估無PS20之A14/A20(150mg/mL)之準確性。A14/A20之PS20回收率在92%-109%範圍內。總而言之，所有三種測試產物之外加回收率實驗的資料證明該方法為準確的。另外，此等結果證明2.5μg(0.1μg/μL×25μL)-15μg(0.6μg/μL×25μL)之PS20可裝載至濾筒上且準確定量。
線性度
藉由在針對三種產物所測試之範圍內確定皮爾森相關係數(r)0.99來評估線性度。表26中展示針對各產物之PS20濃度之各範圍的此等值。對於所測試之PS20範圍，皮爾森相關係數之所有值均超過0.99。因此，在測試之三種產物間，此分析之線性度為可接受的。
可重複性
利用A18/A19樣品(標稱0.2mg/mL PS20)之六次重複注射及A16/A17樣品(標稱0.2mg/mL PS20)之六次重複注射且量測PS20峰面積之% RSD來評估可重複性。此評估之結果展現於表27中，且展示兩種產物之分析精確度為可接受的。
亦藉由測試五種濃度之三次重複且量測PS20峰面積之% RSD來評估可重複性。此實驗用外加0.10-0.30mg/mL PS20之無PS20之A14/A20進行。此評估之結果展現於表28中，且展示A14/A20之分析精確度為可接受的。
方法穩固性實驗 濾筒之間
先前在實例1之方法1下進行之工作展示即使濾筒之吸附劑批號相同，濾筒亦可能展現關於蛋白質清除及特異性之不同行為。評估三個MCX濾筒以確定濾筒之間的變化性。其中，MCX濾筒2及4具有相同吸附劑批號(0093)，而6為不同的(0103)(表20)。
用外加0.2mg/mL PS20之水及含有PS20之產物評估所有三個MCX濾筒。圖21及22展示來自此等評估之層析圖，且表29顯示結果之概述。圖21中之跡線3及4及圖22中之跡線3說明在三個濾筒之間，所注射之含0.2mg/mL PS20之水樣品的峰高及峰寬之差異。最顯著地，峰高及面積在濾筒之間變化，其中在濾筒2(圖21跡線1及3)與濾筒6(圖21跡線2及4)之間觀察到最大差異。在所測試之兩種樣品類型(亦即含PS20之水及含PS20之A18/A19)中，在濾筒2下峰面積大約為濾筒6下峰面積之60%。假定觀察到峰面積之差異與樣品類型(例如有或無蛋白質)無關，該變化性不 可能由蛋白質干擾引起。雖然在測試之兩個濾筒之間面積計數極為不同，但濾筒4與6之間的差異較小，其中濾筒4之面積大約為濾筒6之85%。濾筒之間PS20峰面積之變化性似乎不僅僅依賴於樹脂批號，因為兩個濾筒2及4享有相同樹脂批號，且亦產生不同峰面積。
雖然此變化性並不理想，但一旦執行標準物以獲得所計算之PS20量，則在所有濾筒之間，與理論濃度相比，由在相同管柱上分析之校準曲線確定的PS20之濃度為準確的。基於此等資料，利用注射量之PS20具有重要意義，其提供完全在ELSD偵測器之線性範圍內之響應。舉例而言，針對HPLC-ELSD法，一般推薦全標度之80%(例如800mV)之最大偵測器響應，但假定在濾筒之間觀察到變化性，則可能建議降低MCX方法之此目標響應，以進一步保證偵測器不會對某些濾筒飽和。總體上，針對所測試之樣品及濾筒，此方法之報導PS20量在濾筒之間的變化性最小。
A18/A19樣品之100次注射
雖然上述實驗證明OASIS® MCX濾筒可穩固且準確地定量PS20，但欲藉由用含有蛋白質之樣品操作長順序來測試濾筒持久性。最初研發此方法所針對之產物之一具有150mg/mL之極高標靶蛋白濃度且可能由於蛋白質累積在濾筒上而導致濾筒故障/過度壓力。通常，當進行該方法時壓力為約25-45巴。若壓力增加至超過此範圍，則濾筒可能累積蛋白質及/或賦形劑且應緊密監測或置換濾筒。若濾筒開始洩漏，則應丟棄且立即置換。
藉由使用新濾筒，注射蛋白質(150mg/mL)一百次(順序參看表30)，評估濾筒可重複性及一致清除蛋白質及NAT之能力。每第十次蛋白質注射，包括對照物(n=11)，且首先分析以確保順序有效。圖23展示對照之覆蓋圖。雖然在基線開始時(4.0-5.0分鐘，及8.5分鐘之後)及基線後端，存在增加(達至5mV)，但此等變化不影響整合或最終PS20定量(表31)，其中算得平均PS20量在0.2±0.005(2.8% RSD)mg/mL下。
因為對照物在整個操作期間在質量及數量上一致，所以將具有標稱0.2mg/mL PS20之一百個A18/A19樣品(150mg/mL)整合(圖24)且定量(圖26B，表32)。圖24說明與對照物相同之趨勢，其中在PS20區前、在4.0-5.0分鐘及在8.5分鐘之後基線增加(約5mV)。將面積對注射次數及量對注射次數繪圖，蛋白質之定量具有最小偏差，儘管針對開始二十次注射計算之面積及量存在輕微下降趨勢，此可能歸因於濾筒平衡(圖26A及26B)。最終，針對A18/A19樣品之一百次注射定量之PS20之平均面積及量分別為18.3±0.76(4.2% RSD)mV*min及0.2±0.005(2.6% RSD)mg/mL(表32)。注意在第100次注射下375mg蛋白質已裝載至濾筒上。如UV跡線中描繪(圖25B)，在整個順序中，該方法在流出物在4.0分鐘進入ELSD前一致地充分清除蛋白質及賦形劑(圖25A)。
因為下降趨勢，故用新MCX濾筒(濾筒5)評估具有標稱0.2mg/mL PS20之A18/A19調配緩衝液之一百次注射，以確定此影響是否由蛋白質或調配物或兩者引起。有趣地，開始49次注射存在類似的面積計數下降趨勢[n=100，平均值31.3±1.3(4.1% RSD)mv*min](圖27A)。此行為對定量無重大影響[n=100，平均值0.22±0.005(2.1% RSD)](圖27B及表32)。
當亦在全新濾筒(濾筒3)上評估外加0.2mg/mL PS20之水時，無此類下降趨勢。對於此樣品，面積計數[n=100，平均值20.7±0.3(1.5% RSD)mv*min](圖28A)以及定量[n=100，平均值0.20±0.002(0.9% RSD)](圖28B，表32)保持一致。來自水+PS20樣品之此結果可表明先前觀察到之下降趨勢(圖26A及27A)與調配物中其他賦形劑或存在蛋白質有關。另一可能性係其為與所用特定濾筒相關之影響，且不依賴於其他調配物組分。
表32：外加PS20之水、A18/A19調配緩衝液、A18/A19樣品之100次注射之定量
總體上，三個濾筒各能夠在100次PS20注射之後有效工作，說明MCX濾筒之可重現性及穩固性適合於QC環境下之常規使用。更重要地，一百次蛋白質注射之吸光度概況清楚表明在整個順序中蛋白質與NAT之類似清除(圖25B)。在整個順序中PS20定量保持統計學上恆定。
三個低pI產物之PS20定量評估
利用方法1(實例1中描述)及方法2評估三個不同低pI產物A21、A14/A15及A14(表33)。用於此評估之濾筒列於表34中。所測試之方法效能特徵為特異性、準確性、線性度及可重複性。
特異性
針對三種分子計算之特異性展示於表35中。對應層析圖展示於圖29A-29F中。與含0.1mg/mL PS20之水(50%目標)相比，當用方法1(Oasis® MAX，利用甲醇及乙酸)評估時，A21(150mg/mL)具有16%干擾，且當用方法2(Oasis® MCX，利用甲醇及氫氧化銨)評估時，具有7%干擾。此可歸因於低pI產物與陽離子交換樹脂(亞硫酸根陰離子基團)之較弱相互作用，使得蛋白質干擾最小化。與含0.15mg/mL PS20之水(50%目標)相比，當用方法1評估時，A14/A15(192mg/mL)具有3%干擾，且當用方法2評估時，具有2%干擾。與含0.15mg/mL PS20之水(50%目標)相比，當用兩種方法評估時，A14(161mg/mL)具有約1%干擾。此等產物之特異性未受方法顯著影響。
準確性
為確定分析之準確性，將已知量之PS20外加至無PS20之蛋白質且確定各濃度之回收率(表36)。典型的驗證驗收準則需要回收%在80%-120%內。
藉由外加0.10-0.30mg/mL範圍之PS20，評估無PS20之A21。準確性資料概述於表36中。在測試之PS20濃度下，當使用方法1及方法2分析樣品時，回收率之範圍分別為99%-108%及101%-110%。藉由外加0.15-0.45mg/mL範圍之PS20來評估無PS20之A14/A15及A14之準確性。當使用方法1及方法2分析樣品時，A14/A15之PS20回收率分別在97%-101%及92%-99%範圍內。當使用方法1及方法2分析樣品時，A14之PS20回收率分別在102%-108%及102%-110%範圍內。總而言之，所有三種測試產物之外加回收率實驗的資料證明兩種方法為準確的。
一式三份，注射20μL
線性度
藉由在針對用方法1及方法2評估之三種低pI產物所測試的範圍內確定皮爾森相關係數(r)0.99來評估線性度。表37中展示針對各產物之PS20濃度之各範圍的此等值。對於所測試之PS20範圍，皮爾森相關係數之所有值均超過0.99。因此，在測試之三種產物間，方法1及方法2之線性度為可接受的。
可重複性
亦藉由測試五種濃度之三次重複且量測PS20峰面積之% RSD來評估可重複性。此實驗係用外加0.10-0.30mg/mL PS20之無PS20之A21及外加0.15-0.45mg/mL PS20之無PS20之A14/A15及A14進行。此評估之結果展現於表38中，且展示在所測試之三種產物之間，方法1與方法2之分析精確度為可接受的。
一式三份，注射20μL
結論：
對當前ELSD分析，自實例1之方法1進行以下修改，方法2：移動相添加劑自2%乙酸變成1.5%氫氧化銨
流速自1.25mL/min變成1.40mL/min
自廢物至ELSD之LC流自2.4分鐘變成4.0分鐘
洗滌步驟中B%之濃度自40%變成45%移動相B
洗滌步驟中有機物之時間自1.0-3.4分鐘變成1.0-4.4分鐘
溶析步驟之時間自3.5-4.6分鐘變成4.5-7.6分鐘
平衡步驟之時間自4.7-6.6分鐘變成7.7-9.6分鐘
此等修改消除NAT與蛋白質干擾且濾筒之間的定量變化性最小。針對三種含有NAT之產物進行此修改分析之鑑定的結果說明此分析適合於定量此等調配物中之聚山梨醇酯20。
三種低pI分子用方法1與方法2評估。當使用方法1與A21時，唯一不能滿足驗收準則之情況為特異性。除此之外，對於三種低pI產物，兩種方法均通過準確性、線性度及可重複性準則。此等結果進一步表明方法2亦能夠定量PS20，且尤其適用於不含NAT之產物。

Claims (65)

  1. 一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之該非離子型表面活性劑的方法，其中在定量期間該非離子型表面活性劑與該多肽之間的干擾有所減少，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陰離子交換層析材料，其中將該組合物在包含移動相A及移動相B之溶液中裝載至該層析材料上，其中移動相A包含含酸之水且移動相B包含含酸之甲醇，其中該多肽特異性及非特異性地結合於該層析材料；b)用包含移動相A及移動相B之溶液自該混合模式陰離子交換層析材料溶析該特異性結合之多肽，其中移動相B與移動相A之比率同步驟a)相比有所增加；c)用包含移動相A及移動相B之溶液自該層析材料溶析該非離子型表面活性劑及該非特異性結合之多肽，其中移動相B與移動相A之比率同步驟c)相比有所增加；d)對該非離子型表面活性劑進行定量，其中在定量期間該非離子型表面活性劑與該多肽之間的干擾有所減少。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟a)中移動相B與移動相A之比率為約10：90。
  3. 如請求項1或2之方法，其中步驟b)中移動相B與移動相A之比率增加至約40：60。
  4. 如請求項1或2之方法，其中步驟c)中移動相B與移動相A之比率增加至約100：0。
  5. 如請求項1或2之方法，其中移動相A包含含約2%酸之水。
  6. 如請求項1或2之方法，其中移動相B包含含約2%酸之甲醇。
  7. 如請求項1或2之方法，其中該酸為甲酸。
  8. 如請求項1或2之方法，其中該酸為乙酸。
  9. 如請求項1或2之方法，其中該層析中之流速為約1.25毫升/分鐘。
  10. 如請求項9之方法，其中步驟b)在該層析開始後約1分鐘開始且在該層析開始後約3.4分鐘結束。
  11. 如請求項9之方法，其中步驟c)在該層析開始後約3.5分鐘開始且在該層析開始後約4.6分鐘結束。
  12. 如請求項1或2之方法，其中該非離子型表面活性劑為泊洛沙姆(P188)或聚山梨醇酯。
  13. 如請求項12之方法，其中該聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
  14. 如請求項1或2之方法，其中該組合物中非離子型表面活性劑之濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內。
  15. 如請求項1或2之方法，其中該組合物中之蛋白質濃度為約1mg/mL至約250mg/mL。
  16. 如請求項1或2之方法，其中該調配物具有約4.5至約7.5之pH值。
  17. 如請求項1或2之方法，其中該組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。
  18. 如請求項1或2之方法，其中該組合物為適於投與個體之醫藥調配物。
  19. 如請求項1或2之方法，其中該多肽為治療性多肽。
  20. 如請求項16之方法，其中該治療性多肽為融合蛋白、多株抗 體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM或THIOMABTM藥物結合物。
  21. 如請求項1或2之方法，其中該混合模式陰離子交換層析材料包含逆相強陰離子交換聚合物。
  22. 如請求項1或2之方法，其中該混合模式陰離子交換層析材料包含四級胺部分。
  23. 如請求項1或2之方法，其中該混合模式陰離子交換層析材料包含固體支撐物。
  24. 如請求項1或2之方法，其中該混合模式陰離子交換層析材料含於管柱中。
  25. 如請求項1或2之方法，其中該混合模式陰離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。
  26. 如請求項1或2之方法，其中該混合模式陰離子交換層析材料為Oasis® MAX層析材料。
  27. 如請求項1或2之方法，其中該非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
  28. 一種定量包含非離子型表面活性劑及多肽之組合物中之該非離子型表面活性劑的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將該組合物施加至混合模式陽離子交換層析材料，其中將該組合物在包含移動相A及移動相B之溶液中裝載至該層析材料上，其中移動相A包含含氫氧化銨之水且移動相B包含含氫氧化銨之有機溶劑；b)用包含移動相A及移動相B之溶液自該混合模式陽離子交換層析材料溶析該多肽，其中移動相B與移動相A之比率同步驟a)相比有所 增加；c)用包含移動相A及移動相B之溶液自該層析材料溶析該非離子型表面活性劑，其中移動相B與移動相A之比率同步驟c)相比有所增加；d)對該非離子型表面活性劑進行定量。
  29. 如請求項28之方法，其中移動相B之該有機溶劑為甲醇。
  30. 如請求項28或29之方法，其中步驟a)中移動相B與移動相A之比率為約10：90。
  31. 如請求項28或29之方法，其中步驟b)中移動相B與移動相A之比率增加至約45：55。
  32. 如請求項28或29之方法，其中步驟c)中移動相B與移動相A之比率增加至約100：0。
  33. 如請求項28或29之方法，其中移動相A包含含約2%氫氧化銨之水。
  34. 如請求項28或29之方法，其中移動相B包含含約2%氫氧化銨之甲醇。
  35. 如請求項28或29之方法，其中該層析中之流速為約1.4毫升/分鐘。
  36. 如請求項35之方法，其中步驟b)在該層析開始後約1分鐘開始且在該層析開始後約4.4分鐘結束。
  37. 如請求項35之方法，其中步驟c)在該層析開始後約4.5分鐘開始且在該層析開始後約7.6分鐘結束。
  38. 如請求項28或29之方法，其中該非離子型表面活性劑為聚山梨醇酯。
  39. 如請求項38之方法，其中該聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20或聚 山梨醇酯80。
  40. 如請求項38之方法，其中該組合物中之聚山梨醇酯濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內。
  41. 如請求項28之方法，其中移動相B之該有機溶劑為乙腈。
  42. 如請求項41之方法，其中步驟a)中移動相B與移動相A之比率為約10：90。
  43. 如請求項41或42之方法，其中步驟b)中移動相B與移動相A之比率增加至約40：60。
  44. 如請求項41或42之方法，其中步驟c)中移動相B與移動相A之比率增加至100：0。
  45. 如請求項41或42之方法，其中移動相A包含含約2%氫氧化銨之水或含2%氫氧化銨之43%甲醇。
  46. 如請求項41或42之方法，其中移動相B包含含約2%氫氧化銨之乙腈。
  47. 如請求項41或42之方法，其中該非離子型表面活性劑為泊洛沙姆。
  48. 如請求項47之方法，其中該泊洛沙姆為泊洛沙姆P188。
  49. 如請求項48之方法，其中該組合物中之泊洛沙姆濃度在約0.001%至1.0%(w/v)範圍內。
  50. 如請求項28或29之方法，其中該組合物進一步包含N-乙醯基色胺酸及/或甲硫胺酸。
  51. 如請求項50之方法，其中該組合物中之N-乙醯基色胺酸濃度在約0.1mM至約10mM範圍內。
  52. 如請求項50之方法，其中該組合物中之甲硫胺酸濃度在約0.1 mM至約100mM範圍內。
  53. 如請求項28或29之方法，其中該組合物中之該多肽濃度為約1mg/mL至約250mg/mL。
  54. 如請求項28或29之方法，其中該調配物具有約4.5至約7.5之pH值。
  55. 如請求項28或29之方法，其中該組合物進一步包含一或多種選自由穩定劑、緩衝劑及張力劑組成之群的賦形劑。
  56. 如請求項28或29之方法，其中該組合物為適於投與個體之醫藥調配物。
  57. 如請求項28或29之方法，其中該多肽為治療性多肽。
  58. 如請求項57之方法，其中該治療性多肽為融合蛋白、多株抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、糖基化工程改造之抗體、抗體片段、抗體藥物結合物、THIOMABTM、THIOMABTM藥物結合物。
  59. 如請求項28或29之方法，其中該混合模式陽離子交換層析材料包含逆相強陽離子交換聚合物。
  60. 如請求項28或29之方法，其中該混合模式陽離子交換層析材料包含磺酸部分。
  61. 如請求項28或29之方法，其中該混合模式陽離子交換層析材料包含固體支撐物。
  62. 如請求項28或29之方法，其中該混合模式陽離子交換層析材料含於管柱中。
  63. 如請求項28或29之方法，其中該混合模式陽離子交換層析材料為高效能液相層析(HPLC)材料。
  64. 如請求項28或29之方法，其中該混合模式陽離子交換層析材料為Oasis® MCX層析材料。
  65. 如請求項28或29之方法，其中該非離子型清潔劑藉由蒸發光散射(ELSD)或藉由使用電霧式偵測器(CAD)來定量。
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