TW201738372A - 類胡蘿蔔素的製造方法 - Google Patents

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Abstract

含有下述的(a)至(c)的任一項的基因的變異型類胡蘿蔔素產生細菌。(a)編碼包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第225個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因；(b)編碼包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的十聚異戊二烯二磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第305個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因；(c)上述(a)及(b)二者的基因。

Description

類胡蘿蔔素的製造方法
本發明是關於使用類胡蘿蔔素產生細菌的變異株的類胡蘿蔔素的製造方法。
類胡蘿蔔素是作為飼料添加物、食品添加物、醫藥品等使用的有用的天然色素。類胡蘿蔔素中，包含有蝦紅素、角黃素、玉米黃素(zeaxanthin)、β-隱黃質(cryptoxanthin)、番茄紅素、β-胡蘿蔔素、金盞花紅素(adonirubin)、側金盞花黃質(adonixanthin)、海膽烯酮(echinenone)、海星酮(asteroidenone)及3-羥基海膽烯酮(hydroxyechinenone)等。其中，蝦紅素是有用於做為養殖魚的鮭魚、鱒魚、嘉臘魚等的體色改善劑、家禽類的卵黃色改善劑等飼料添加物。又，天然的蝦紅素是作為安全的食品添加物或健康食品素材而在產業上的價值高。側金盞花黃質(adonixanthin)及金盞花紅素(adonirubin)，與蝦紅素同樣作為飼料添加物、食品添加物、醫藥品等的用途而受期待。
再者，β-胡蘿蔔素是使用作為飼料添加物、食品添加物、醫藥品等，角黃素是使用作為飼料添加 物、食品添加物、化粧品等，玉米黃素(zeaxanthin)是使用作為食品添加物、飼料添加物等。再者，番茄紅素、海膽烯酮(echinenone)、β-隱黃質(cryptoxanthin)、3-羥基海膽烯酮(echinenone)、海星酮等也是作為飼料添加物、食品素材等的使用而受期待。這些類胡蘿蔔素的製造方法而言，已知有化學合成法，由天然物的萃取法，由微生物的培養的產生方法等。
蝦紅素的化學合成法而言，已知有將β-胡蘿蔔素的改變的方法(Pure Appl.Chem.,57,741,1985(非專利文獻1))及由C15膦鎓鹽合成的方法(Helv.Chim.Acta,64,2436,1981(非專利文獻2))。由天然物的萃取法而言，蝦紅素是存在於鮭魚、嘉臘魚等魚類及蝦、蟹、磷蝦等甲殼類，所以也可以由這些萃取而採取。
由微生物的類胡蘿蔔素的生產方法而言，已報告由綠藻類雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)的培養法(特開2007-97584號公報(專利文獻1))、由紅色酵母紅法酵母(Phaffia rhodozyma)的發酵法(特開平11-69969號公報(專利文獻2))、由屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌(以下，也稱為「副球菌(Paracoccus)屬細菌」)的發酵法、由屬於短波單胞菌(Brevundimonas)屬細菌的發酵法(特開2006-340676號公報(專利文獻3))、由屬於赤桿菌(Erythrobacter)屬細菌的發酵法(特開2008-259449號公報(專利文獻4))的報告。生產類胡蘿蔔素的副球菌(Paracoccus)屬細菌的例而言，可舉E-396株及A-581-1株(特開平 7-79796號公報(專利文獻5))及International Journal of Systematic Bacteriology(1999),49,277-282(非專利文獻3))。其他的類胡蘿蔔素生產性的屬於副球菌(Paracoccus)屬細菌而言，可舉馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)MH1株(特表2001-512030號公報(專利文獻6))、海雲台副球菌(Paracoccus haeundaensis)BC74171株(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2004),54,1699-1702(非專利文獻4))、副球菌屬(Paracoccus)屬細菌N-81106株(特開2007-244205號公報(專利文獻7))、玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2003),53,231-238(非專利文獻5))及副球菌(Paracoccus sp.)PC-1株(WO2005/118812號小冊(專利文獻8))等。
但是，在前述的類胡蘿蔔素的製造方法中有幾個要解決課題，例如，由化學合成法製造的類胡蘿蔔素，即使是安全的也會給予消費者不良的印象。由天然物萃取的類胡蘿蔔素與化學合成法相比，製造成本格外地高。由微生物的製造中，由綠藻類或酵母的培養的產生是生產性低，加上這些微生物是有堅固的細胞壁，因此由培養物的類胡蘿蔔素的萃取有困難。
另一方面，由屬於副球菌(Paracoccus)屬細菌的類胡蘿蔔素的製造，有該菌體的增殖速度快速、類胡蘿蔔素的生產性高、由培養物的類胡蘿蔔素的萃取容易等優點，已報告有幾個培養方法及製造方法。
例如，特開2007-143492號公報(專利文獻9)是說明培養中添加鐵鹽的方法，WO2010/044469號小冊(專利文獻10)是說明在培養基添加胺基酸的方法，特開2011-188795號公報(專利文獻11)是說明在培養基添加生物素(biotin)的方法，又，特開2012-139164號公報(專利文獻12)是說明在培養基添加鈣化合物達3.6mM以上的方法。
但是，產生類胡蘿蔔素的細菌中，哪一個基因對生產效率的提高有貢獻，則其詳細情況不明。
[先前技術文獻]
[專利文獻1]日本特開2007-97584號公報
[專利文獻2]日本特開平11-69969號公報
[專利文獻3]日本特開2006-340676號公報
[專利文獻4]日本特開2008-259449號公報
[專利文獻5]日本特開平7-79796號公報
[專利文獻6]日本特表2001-512030號公報
[專利文獻7]日本特開2007-244205號公報
[專利文獻8]WO2005/118812號小冊
[專利文獻9]日本特開2007-143492號公報
[專利文獻10]WO2010/044469號小冊
[專利文獻11]日本特開2011-188795號公報
[專利文獻12]日本特開2012-139164號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985
[非專利文獻2]Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981
[非專利文獻3]International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282
[非專利文獻4]International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702
[非專利文獻5]International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238
本發明是以提供變異型類胡蘿蔔素產生細菌，及使用該細菌的類胡蘿蔔素的製造方法為目的。
本發明者為了解決上述課題而精心進行檢討的結果，由經變異處理的細菌中成功於取得蝦紅素高生產細菌，而達到本發明的完成。
(1)一種變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其係含有下述(a)至(c)的任一項基因。
(a)編碼包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第225個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因；(b)編碼包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的十聚異戊二 烯二磷酸合成酶(decaprenyl diphosphate synthase)的胺基酸序列中，至少第305個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因；(c)上述(a)及(b)二者的基因。
(2)如在(1)項中所述的細菌，其中，1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的胺基酸序列是序列編號2所示者。
(3)如在(1)項或(2)項中所述的細菌，其中，第225個胺基酸殘基是由甘胺酸經取代為天門冬胺酸者。
(4)如在(1)項至(3)項的任一項中所述的細菌，其中，十聚異戊二烯二磷酸合成酶的胺基酸序列是序列編號4所示者。
(5)如在(1)項至(4)項的任一項中所述的細菌，其中，第305個胺基酸殘基是由丙胺酸經取代為纈胺酸者。
(6)如在(1)項至(5)項的任一項中所述的細菌，其獲得比沒有編碼包含有變異型胺基酸序列的蛋白質的基因的類胡蘿蔔素產生細菌的胡蘿蔔素產生能力，為更高的產生能力。
(7)如在(6)項所述的細菌，其獲得相較於沒有編碼包含有變異型胺基酸序列的蛋白質的基因的類胡蘿蔔素產生細菌的類胡蘿蔔素產生量，為至少5倍以上的產生能力。
(8)如在(1)項至(7)項的任一項中所述的細菌，其中，類胡蘿蔔素產生細菌是屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌。
(9)如在(8)項中所述的細菌，其中，屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌是E-396株。
(10)如在(1)項至(9)項的任一項中所述的細菌，其中，類胡 蘿蔔素是蝦紅素。
(11)類胡蘿蔔素的製造方法，其特徵為培養如在(1)項至(10)項的任一項中所述的細菌，由所得的培養物採取類胡蘿蔔素。
(12)如在(11)項所述的方法，其中，類胡蘿蔔素的產生量，相較於沒有編碼包含有變異型胺基酸序列的蛋白質的基因的類胡蘿蔔素產生細菌的類胡蘿蔔素產生量，為至少5倍以上的產生量。
(13)如在(11)項或(12)項所述的方法，其中，類胡蘿蔔素是蝦紅素。
(14)類胡蘿蔔素產生細菌的篩選方法，其特徵為對於類胡蘿蔔素產生細菌施行變異處理，由經變異處理的細菌中選擇具有下述的(a)至(c)的任一項的特徵的細菌。
(a)1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的活性比變異處理前的細菌中的活性更為提高的特徵；(b)十聚異戊二烯二磷酸合成酶的活性比變異處理前的細菌中的活性更降低的特徵；(c)上述(a)及(b)二者的特徵。
(15)類胡蘿蔔素的製造方法，其特徵為培養由(14)項所述的方法選擇的細菌，由所得的培養物採取類胡蘿蔔素。
(16)編碼蛋白質的基因，該蛋白質包含有在1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第225個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列。
(17)含有下述的(a)或(b)的DNA的基因。
(a)含有序列編號5表示的鹼基序列的DNA；(b)編碼蛋白質的DNA，該蛋白質係和包含與上述(a)的DNA互補的鹼基序列而成的DNA在嚴苛的條件下雜交，並且具有1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶活性。
(18)編碼蛋白質的基因，該蛋白質包含有在十聚異戊二烯二磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第305個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列。
(19)含有下述的(a)或(b)的DNA的基因。
(a)含有序列編號7表示的鹼基序列的DNA；(b)編碼蛋白質的DNA，該蛋白質係和包含與上述(a)的DNA互補的鹼基序列而成的DNA在嚴苛的條件下雜交，並且十聚異戊二烯二磷酸合成酶活性降低。
(20)含有下述的(a)至(c)的任一項的基因的重組載體(recombinant vector)。
(a)如在(16)項或(17)項中所述的基因；(b)如在(18)項或(19)項中所述的基因；(c)上述(a)及(b)的基因。
(21)含有如在(20)項中所述的重組載體的形質轉換體。
(22)類胡蘿蔔素的製造方法，其特徵為培養如在(21)項中所述的形質轉換體，由所得的培養物採取類胡蘿蔔素。
由本發明，提供類胡蘿蔔素的高生產細菌。由本發明的細菌的使用，可以有效率的製造類胡蘿蔔素。
第1圖為顯示E-396株及ASB-57株的總類胡蘿蔔素及蝦紅素的比生產性圖。
第2圖為顯示酵素A的模板(template)構造圖。
第3A圖為顯示酵素A及模板構造(201X)的對準(alignment)圖。將推測的活性部位以綠色表示。將紊亂(disordered)區域以藍色棒表示。
第3B圖為顯示酵素A與模板構造(201X)的對準圖。將推測的活性部位以綠色表示。將紊亂(disordered)區域以藍色棒表示。
第4圖為顯示模板構造及酵素A及輔酶TPP複合體的模型構造圖。模板的源自抗輻射奇異球菌(D.radiodurans)的1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶(DXS)及TPP複合體的構造(2O1X)(左)及所構築的酵素A的模型構造(右)。形成同型二聚體(homodimer)，各次單元(subunit)與TPP及Mg鍵結。將TPP及Mg以空間填充(space-filling)表示。
第5圖為顯示酵素A與TPP中間體及基質的複合體的模型構造圖。表示在所構築的酵素A，有在輔酶TPP附加丙酮酸的羥乙基-TPP中間體及甘油醛3磷酸(GAP)鍵結的複合體模型。
第6圖為顯示酵素A及輔酶TPP的相互作用圖。
第7圖為顯示推測由酵素A與TPP的相互作用的胺基酸殘基圖。推測與TPP的相互作用的殘基以棒表示。
第8圖為顯示推測酵素A及與羥乙基-TPP中間體的羥乙基的相互作用的胺基酸殘基圖。推測與羥乙基的相互作用的殘基以棒表示。
第9圖為顯示推測酵素A及甘油醛3磷酸(GAP)的相互作用的胺基酸殘基圖。
第10圖為顯示酵素A及基質丙酮酸的相互作用圖。
第11圖為顯示酵素A及基質甘油醛3磷酸的相互作用圖。
第12圖為顯示酵素A及其他種DXS的對準圖。EnzymeA：酵素A,DXS_ECOLI：DXS(E.coli),DXS_VITVI：DXS葡萄(Vitis vinifera),DXS_DEIRA：抗輻射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)。模板構造(DXS_DEIRA)的紊亂區域以藍色棒表示。活性部位以綠色方塊表示，DXS_ECOLI及DXS_VITVI看到有活性提高的變異以▲表示。
第13圖為顯示酵素A的紊亂區域的位置圖。紊亂區域(藍色的點線)的N末端側的環的Asn180,Met182是與Mg鍵結，Ile184是與TPP鍵結。
第14圖為顯示酵素A的紊亂區域的模型構造圖。酵素A在紊亂區域(青色)的模型構造(左)及紊亂區域的模型構造的靜電電位圖(右)。
第15圖為顯示蝦紅素合成途徑中所推測的酵素A變異體的效果圖。
第16圖為顯示酵素C的模板構造圖。表示源自莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)的十聚異戊二烯二磷酸合 成酶(PDB ID：3MZV)。
第17圖為顯示酵素C及模板構造(3MZV)的對準圖。推測的活性部位以綠色表示。
第18圖為顯示模板構造、以及酶與IPP及FPP的複合體的模型構造圖。模板的源自莢膜紅細菌(R.capsulatus)的十聚異戊二烯二磷酸合成酵素C(3MZV)(左)及所構築的酵素C的模型構造(右)。FPP及IPP以空間填充表示。
第19圖為顯示模板構造、以及酵素C與IPP及FPP的複合體的模型構造圖。FPP及IPP是頭對尾的鍵結，縮合反應是IPP的異戊二烯基與FPP的磷酸基之間(左圖，箭頭)發生。在長鏈異戊二烯焦磷酸合成酶(prenyl diphosphate synthase)中，反應生成物是再與IPP鍵結，向基質鍵結部位的深處(右圖，箭頭)伸長。
第20圖顯示模板構造與酵素C的模型構造的比較圖。模板源自莢膜紅細菌(R.capsulatus)的十聚異戊二烯二磷酸合成酶(左)及酵素C(右)的基質複合體模型。有一致的胺基酸殘基的構造以綠色表示。基質鍵結區域及其周邊的構造是全部一致。
第21圖為顯示酵素C與十聚異戊二烯二磷酸合成酶(玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens))的對準圖。
第22圖為顯示酵素C與FPP及IPP的複合體模型圖。以色帶(ribbon)表示(左)及表面形狀(右)。A鏈(淡紅)、B鏈(淡藍)表示。將FPP及IPP以空間填充表示。
第23圖為顯示推測酵素C與FPP(上)、IPP(中)、Mg(下) 的相互作用的胺基酸殘基圖。
第24圖為顯示酵素A與基質FPP及IPP的相互作用圖。
第25圖為顯示酵素A與Mg的相互作用圖。
第26圖為顯示酵素C的野生型及變異體A305V的立體構造模型圖。將Ala305(綠)及Val305(洋紅)以空間填充表示。
第27圖為顯示野生型的Ala305(左)與變異體的Val305(右)的周邊的構造圖。Ala305是與周邊的胺基酸殘基相接。由往Val305的變異，引起周邊的構造及立體障礙。將Ala305以綠，Val305以洋紅表示。
第28圖為顯示野生型(藍)與變異體A305V(紅)的分子內能量的比較圖。
第29圖為顯示野生型與變異體A305V的構造比較圖。由A305V的變異、Ala305(綠)與Val305(洋紅)的周邊的胺基酸殘基的構造起變化(左)。此構造變化也會影響鄰接的α螺旋(右)。
第30圖為顯示酵素C的A305V的影響圖。
第31圖為顯示酵素C的A305V的影響圖。
第32圖為顯示酵素C的A305V的影響圖。
第33圖為顯示蝦紅素合成途徑中推測的酵素C變異體的效果圖。
以下，詳細說明本發明。
1.概要
本發明是關於高生產類胡蘿蔔素的細菌，是含有以下的(a)及(b)的任一項的基因，或含有該兩基因的細菌。
(a)編碼包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第225個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因
(b)編碼包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的十聚異戊二烯二磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第305個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因
本發明者為了要開發類胡蘿蔔素的生產能力高的菌，檢討E-396株及其變異處理後的菌株的類胡蘿蔔素產生能力，同時解析這些菌株中，編碼參予類胡蘿蔔素合成途徑的酵素的基因的變異。
其結果，取得比使用作為親株的E-396株具有更高的類胡蘿蔔素產生能力的菌株(名為「ASB-57株」。)。解析ASB-57株的基因體的結果，確認在1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶(DXS)的胺基酸序列，及十聚異戊二烯二磷酸合成酶(DPS)的胺基酸序列有發生變異。於是，進行經由胺基酸立體構造解析所預測的功能解析，而推測，至少，在DXS的第225個胺基酸殘基及/或DPS的第305個胺基酸殘基發生變異，此變異對類胡蘿蔔素的高生產有貢獻。
本發明是根據上述知識見解而完成的。
2. 變異型類胡蘿蔔素產生細菌
本發明的類胡蘿蔔素產生細菌是將親株變異處理，在DXS的第225個胺基酸殘基及/或DPS的第305個胺基酸殘基產生變異作為指標而得的變異型細菌，是可將類胡蘿蔔素以高效率產生的細菌。將本發明的類胡蘿蔔素產生細菌，在本說明書中稱為「變異型類胡蘿蔔素產生細菌」。
(1)親株
本發明中，使用作為用以獲得變異型類胡蘿蔔素產生細菌的親株的細菌而言，如是會產生類胡蘿蔔素的細菌則無任何限定，例如可舉屬於副球菌(Paracoccus)屬、短波單胞菌(Brevundimonas)屬、赤桿菌(Erythrobacter)屬細菌。
理想是使用屬於副球菌(Paracoccus)屬細菌、屬於短波單胞菌(Brevundimonas)屬細菌或屬於赤桿菌(Erythrobacter)屬細菌，較理想是使用屬於副球菌(Paracoccus)屬細菌。副球菌(Paracoccus)屬、赤桿菌(Erythrobacter)屬及短波單胞菌(Brevundimonas)屬，各者均被分類於變形菌(Proteobacteria)門、α-變形菌(Alphaproteobacteria)綱，在細菌分類學上有共通性，所以本發明中，可以使用屬於這些屬的細菌。
屬於副球菌屬細菌之中，較佳使用類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)、馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)、海雲台副球菌(Paracoccus haeundaensis)及玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)，尤其較佳使用類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)。作為屬 於副球菌屬細菌的具體的菌株的例，可舉類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)E-396株(FERM BP-4283)及副球菌屬細菌A-581-1株(FERM BP-4671)，這些變異株也較佳使用在本發明。
屬於赤桿菌屬類胡蘿蔔素產生細菌而言、例如可舉赤桿菌JPCC M種(特開2008-259452)、赤桿菌JPCC O種(特開2008-259449)等。
屬於短波單胞屬類胡蘿蔔素產生細菌而言，例如可舉短波單胞菌SD212株(特開2009-27995)、短波單胞菌FERM P-20515、20516株(特開2006-340676)、泡囊短波單胞菌(Brevundimonas vesicularis)(Gene,Vol.379,p.101-108,1 Sep 2006)等。
又，作為類胡蘿蔔素產生細菌，理想是使用與16S核糖體RNA對應的DNA鹼基序列是與序列編號9所記載的E-396株的鹼基序列有高相同性的細菌。這裡所謂的鹼基序列的相同性，理想是95%以上，較理想是96%以上，更理想是97%以上，特別理想是98%以上，最理想是99%以上。
與16S核糖體RNA對應的DNA鹼基序列，意指16S核糖體RNA的鹼基序列中的U(尿嘧啶)以T(胸腺嘧礎)取代的鹼基序列。
根據此16S核糖體RNA鹼基序列的相同性的微生物的分類法，近年來成為主流。以往的微生物的分類法是根據以往的運動性、營養需求性、糖的利用性等菌 學的性質，所以由自然突然變異而發生形質的變化等時，有將微生物分類錯誤的情況。與此相比，根據16S核糖體RNA鹼基序列是遺傳上極為安定之故，根據其相同性的分類法是比以往的分類法將其分類的信頼度提高很多。
類胡蘿蔔素副球菌E-396株的16S核糖體RNA鹼基序列，與其他的類胡蘿蔔素產生細菌馬氏副球菌DSM 11574株、副球菌屬細菌N-81106株、海雲台副球菌BC 74171株、副球菌屬細菌A-581-1株、玉米素副球菌ATCC 21588株、及副球菌屬PC-1株的16S核糖體RNA鹼基序列的相同性，各分別為99.7%、99.7%、99.6%、99.4%、95.7%、及95.4%，可知這些是在分類學上極為近緣的菌株。因此，這些菌株作為產生類胡蘿蔔素的細菌可說是形成一個群組。因此，這些菌株是在本發明優先使用，可有效率的產生類胡蘿蔔素。
本發明中，也可使用類胡蘿蔔素的生產性受改良的公知的變異株。該公知的變異株的例而言，可舉蝦紅素生產能力高的菌株(特開2001-95500)、選擇性的產生多量的角黃素的菌株(特開2003-304875)、選擇性的產生多量的玉米黃素及β-隱黃質的菌株(特開2005-87097)、選擇性的產生番茄紅素的菌株(特開2005-87100)。
在本發明使用作為親株的類胡蘿蔔素產生細菌的例而舉的E-396株，在獨立行政法人製品評估技術基盤機構(NITE)專利生物寄託中心(NITE-IPOD)受國際寄託如下述。
國際寄託當局：獨立行政法人製品評估技術基盤機構(NITE)專利生物寄託中心
郵遞區號292-0818日本國千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8
識別表示：E-396
受託編號：FERM BP-4283
原寄託日：平成5年(1993年)4月27日
又，在本發明使用作為親株的類胡蘿蔔素產生細菌的其他例而舉的A-581-1株，在上述機關受國際寄託如下述。
識別表示：A-581-1
受託編號：FERM BP-4671
原寄託日：平成6年(1994年)5月20日
(2)變異處理及篩選
本發明的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，係於前述親株施行變異處理，在DXS的第225個胺基酸殘基及/或DPS的第305個胺基酸殘基產生變異作為指標而得。
變異處理的方法是能誘發變異則沒有特別的限定，例如，可使用由N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)及甲磺酸乙酯(EMS)等變異劑的化學的方法、紫外線照射及X線照射等物理的方法、由基因重組及轉位子(transposon)等生物學的方法等。接受變異處理的細菌是沒有特別的限定，但以類胡蘿蔔素產生細菌為理想。
又，在本發明中，為了要調製上述的有變異的蛋白質，可在編碼該蛋白質的基因(DNA)導入點突然變異。作為其變異導入方法，有利用Kunkel法或Gapped duplex法等部位特異性的突然變異誘發法的變異導入用套件，例如可使用QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司製)、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司製)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：Takara Bio公司製)等而實施。又，可使用「Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))等所述的部位特異性的變異誘發法等方法。
變異株的篩選方法是沒有特別的限定，但使用公知的基因體解析工具PacBio RS II(Pacific Biosciences公司製)、MiSeq(Ilumina公司製)等而做基因解析，確認在DXS的第225個胺基酸殘基及/或DPS的第305個胺基酸殘基對應的鹼基序列有無變異即可。
再者，與上述基因體解析平行，例如，由在洋菜培養基上的菌落的色調選擇目的之變異株的方法之外，也可選擇以試管、燒瓶、發酵槽等培養變異株，由利用吸光度、高速液體層析法、薄層層析法等的類胡蘿蔔素色素分析，以類胡蘿蔔素的生產量作為指標。
變異及篩選的製程可為1次，又，例如也可由突然變異處理及篩選而得變異株，將其再由變異處理及篩選而取得生產性經改良的變異株，如此將變異及篩選製程重複2 次以上。
如此篩選的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，具有編碼在DXS的第225個胺基酸殘基變異為其他的胺基酸，及/或DPS的第305個胺基酸殘基變異為其他的胺基酸殘基的胺基酸序列的基因。
由DXS的第225個胺基酸殘基變異為其他的胺基酸，對DXS的酶活性的提高有貢獻。由此，促進由丙酮酸至1-去氧-D木酮糖-5-磷酸的合成，甚至提高成為蝦紅素合成的基質的異戊二烯二磷酸(IPP)的生產。
由DPS的第305個胺基酸殘基變異為其他的胺基酸殘基，對DPS的酵素活性的降低有貢獻。此變異抑制由法呢基二磷酸(FPP)至十聚異戊二烯二磷酸(DPP)的合成。由FPP至DPP的合成使用IPP，所以由上述變異，用於DPP合成的IPP的量減少，該IPP是被利用作為前述的蝦紅素合成的基質。
在這裡，在本發明中，只要是具有編碼下述蛋白質的基因：包含在DXS的第225個胺基酸殘基變異為其他的胺基酸，及/或在DPS的第305個胺基酸殘基變異為其他的胺基酸殘基的胺基酸序列，且為具有此等之DXS活性的胺基酸序列的蛋白質，及/或包含上述胺基酸序列且為DPS活性被降低(抑制)的胺基酸序列的蛋白質，則在該DXS及/或DPS的胺基酸序列的其他的區域的胺基酸序列中，亦可在1個以上的胺基酸殘基發生取代、缺失或附加等變異。
因此，本發明的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，可以含有以下的(a)的基因、以下的(b)的基因、或以下的(a)及(b)的基因的兩者。
(a)編碼包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的DXS的胺基酸序列中，至少第225個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因
上述變異型DXS基因而言，例如可舉下述者。
(i)編碼蛋白質的基因，該蛋白質包含有在DXS的胺基酸序列(例如序列編號2)中第225個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列，並且具有DXS活性的基因
作為如此的變異型胺基酸序列，可舉序列編號6所示者，作為上述基因，可舉序列編號5所示者。在本發明中，在序列編號2所示的胺基酸序列中，第225個胺基酸殘基的甘胺酸經天門冬胺酸取代的胺基酸序列為理想。
(ii)包含有在DXS的胺基酸序列(例如序列編號2)中第225個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代，並且該第225個胺基酸殘基以外的1個或複數(例如1至數個)個胺基酸殘基經缺失、取代或附加的變異型胺基酸序列，並且具有DXS活性的蛋白質
(iii)包含DNA的基因，該DNA包含序列編號5表示的鹼基序列
(iv)包含DNA的基因，該DNA編碼和包含與序列編號5表示的鹼基序列的DNA為互補的鹼基序列而成的DNA 在嚴苛的條件下雜交，並且具有DXS活性的蛋白質
上述序列編號5表示的鹼基序列係編碼蛋白質者，該蛋白質包含有在類胡蘿蔔素產生細菌之編碼DXS的胺基酸序列的DNA(序列編號1)中，第225個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的胺基酸序列。
(b)編碼蛋白質的基因，該蛋白質包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的DPS胺基酸序列中，至少第305個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列
如此的基因而言、例如可舉下述者。
(i)編碼蛋白質的基因，該蛋白質包含有在DPS的胺基酸序列(例如序列編號4)中第305個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列，並且降低DPS活性
作為如此的變異型胺基酸序列，可舉序列編號8所示者，作為上述基因，可舉序列編號7所示者。本發明中，在序列編號4所示的胺基酸序列中，第305個胺基酸殘基的丙胺酸經纈胺酸取代的胺基酸序列為理想。
(ii)包含有在DPS的胺基酸序列(例如序列編號4)中第305個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代，同時該第305個胺基酸殘基以外的1個或複數個(例如1至數個)胺基酸殘基有缺失、取代或附加的變異型胺基酸序列，並且DPS活性降低的蛋白質
(iii)包含DNA的基因，該DNA包含序列編號7表示的鹼基序列
(iv)包含DNA的基因，該DNA編碼和包含與序列編 號7表示的鹼基序列的DNA互補的鹼基序列的DNA在嚴苛的條件下雜交，並且降低DPS活性的蛋白質
上述序列編號7表示的鹼基序列係編碼蛋白質者，該蛋白質包含有在類胡蘿蔔素產生細菌中編碼DPS的胺基酸序列的DNA(序列編號3)中，第305個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的胺基酸序列。
在這裡，雜交可遵照公知的方法(例如，Sambrook J.et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))實施。高嚴苛的條件是指形成所謂特異性的雜交，不會形成非特異性的雜交的條件而言，例如，鈉濃度在10mM至300mM，理想是20mM至100mM，溫度是25℃至70℃，理想是42℃至55℃的條件之謂。
作為如此的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，例如可舉ASB-57株、ASK-8株、ASH-66株等。
ASB-57株具有編碼蛋白質的基因，該蛋白質包含DXS的第225個胺基酸殘基的甘胺酸變異為天門冬胺酸，DPS的第305個胺基酸殘基的丙胺酸變異為纈胺酸的胺基酸序列。將ASB-57株中的DXS的胺基酸序列及基因的鹼基序列各分別表示在序列編號6、5。又，將ASB-57株中DPS的胺基酸序列及基因的鹼基序列各分別表示在序列編號8、7。
(4)基因重組物的製作
在本發明中，將編碼上述變異型DXS的基因，及/或編碼上述變異型DPS的基因導入宿主進行形質轉換，而可得基因重組型的變異型類胡蘿蔔素產生細菌。
將變異型DXS基因及/或變異型DPS基因導入載體而得重組載體，以及將該重組載體導入宿主所得的形質轉換體，可採用任意的公知方法，例如，可遵照Sambrook J.et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)而實施。
將上述DXS基因及DPS基因以基因工學的方式合成時，首先，設計合成編碼該酵素的DNA。DNA的設計及合成，例如，含有全長的基因的載體等作為鑄模，使用為合成所求的DNA區域而設計的引子(primer)，由PCR法而可實施。然後，將上述DNA與適當的載體連結而得蛋白質表現用重組載體，將此重組載體導入宿主而使目的基因表現而得形質轉換體(Sambrook J.et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))。
載體係使用在宿主微生物中可自律性的增殖的噬菌體或質體。再者，也可使用動物病毒、昆蟲病毒載體。重組載體的製作是將精製過的DNA以適當的限制酶切斷，插入於適當的載體DNA的限制酶部位等而與載體連結即可。使用於形質轉換的宿主而言，能表現目的基因者則沒有特定的限定。例如，可舉細菌(枯草菌、副球菌屬(Paracoccus)細菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、植物 細胞、昆蟲細胞或昆蟲。對宿主的重組載體的導入方法是公知的。
又，對基因的變異的導入方法，與前述相同。
(3)類胡蘿蔔素的生產
本發明中，由將上述的類胡蘿蔔素產生細菌或形質轉換體以規定的培養基培養，而可使高濃度的類胡蘿蔔素安定的生產。
所產生的類胡蘿蔔素是沒有特別的限定，例如，蝦紅素、角黃素、玉米黃素、β-隱黃質、番茄紅素、β-胡蘿蔔素、金盞花紅素、側金盞花黃質、海膽烯酮、海星酮或3-羥基海膽烯酮，理想是蝦紅素、角黃素、玉米黃素或β-隱黃質，較理想是蝦紅素或玉米黃素。由本發明製造的類胡蘿蔔素可為一種也可以，亦可為複數種組合。
以下說明本發明之培養變異型類胡蘿蔔素產生細菌或形質轉換體的方法。
在本發明的培養所使用的類胡蘿蔔素生產用培養基，可添加類胡蘿蔔素產生細菌或形質轉換體能生育、生產類胡蘿蔔素者的任意成分。含有這種添加物的培養基可為任一種，但使用含有碳源、氮源、無機鹽類及必要時的維生素類等的培養基為理想。
碳源而言，例如，可舉葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、繭糖、甘露糖、甘露糖醇及麥芽糖等糖類，乙酸、富馬酸、檸檬酸、丙酸、蘋果酸、丙二酸及丙酮酸等 有機酸，乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、異丁醇及甘油等醇類，大豆油、米糠油、橄欖油、玉米油、胡麻油及亞麻仁油等油脂類等，其中尤其理想是使用葡萄糖或蔗糖。這些的碳源之中，可使用1種或2種以上。添加於培養前的培養基(起始培養基)的量是隨碳源的種類而有不同但可適宜調整，通常，每1L培養基1至100g，理想是2至50g。又，碳源不僅是添加在起始培養基，較佳亦可進行在培養中途逐次的或連續的追加供給。
氮源而言，作為無機鹽，在硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等銨鹽類，硝酸鉀等的硝酸鹽類，氨及尿素等之中，使用1種或2種以上。添加量是隨氮源的種類而有不同但可適宜調整，通常，對培養基1L為0.1g至20g，理想是0.2至10g。
又，有機氮源而言，例如，玉米浸液(包含過濾處理物)，PHARMAMEDIATM、大豆粕、大豆粉、花生粕、大豆蛋白腖、可溶酒糟(distiller’s solubles)、乾燥酵母、酵母萃取物、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、麩胺酸、天門冬胺酸等之中，使用1種或2種以上。添加濃度是隨氮源的種類而有不同但可適宜調整，通常，0至80g/L，理想是1至30g/L。
無機氮源及有機氮源，通常添加於起始培養基，較佳亦可進行逐次或連續的追加供給。
無機鹽類而言，例如，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉等磷酸鹽類，硫酸鎂、氯化鎂等鎂鹽類，硫酸鐵、 氯化鐵等鐵鹽類，氯化鈣、碳酸鈣等鈣鹽類，碳酸鈉、氯化鈉等鈉鹽類，硫酸錳等錳鹽類，硫酸銅等銅鹽類，硫酸鋅等鋅鹽類，鉬酸鈉等鉬鹽類，硫酸鎳等鎳鹽類，硒酸鈉等硒鹽類，鎢酸鈉等鎢鹽類，氯化鋁等鋁鹽類，氯化鉻等鉻鹽類，硼酸及碘化鉀等之中，使用1種或2種以上。添加量是隨無機鹽的種類而有不同但可適宜調整，通常，對培養基1L為0.0001至15g。在磷酸鹽類、鎂鹽類、鈣鹽類、鈉鹽類及鐵鹽類，0.02至15g/L為理想，添加錳鹽類、銅鹽類、鋅鹽類、鉬鹽類、鎳鹽類、硒鹽類、鎢鹽類、鋁鹽類、鉻鹽類、硼酸、碘化鉀等時，0.1至15mg/L為理想濃度。無機鹽類通常添加於起始培養基，亦可逐次或連續的追加供給。
維生素類而言，例如，可使用氰鈷胺、核黃素、泛酸、吡哆醇、噻胺、抗壞血酸、葉酸、菸鹼酸、p-胺基安息香酸、生物素、肌醇、膽鹼等。添加比率是隨維生素類的種類而有不同但可適宜調整，通常，對培養基1L為0.001至1000mg，理想是0.01至100mg。維生素類通常添加於起始培養基，亦可逐次或連續的追加供給。
本發明中，為了抑制培養液的發泡較佳使用消泡劑。消泡劑的種類只要有抑制泡的發生或消除發生的泡的作用，並且對產生細菌的抑制作用的少者則任一種都可以。例如可例示，醇系消泡劑、聚醚系消泡劑、酯系消泡劑、脂肪酸系消泡劑、矽氧烷系消泡劑、磺酸系消泡劑等。添加量是隨消泡劑的種類而有不同但可適宜調整， 通常，對培養基1L為0.01g至10g。
消泡劑通常添加於殺菌前的起始培養基。再者，亦可在培養中途連續性的或間竭性的追加。在培養中途添加消泡劑的方法而言，可例示以感測器感知泡而自動添加的方法、以程序定時計在一定時間添加的方法、以與生育速度連動之方式與加料用碳源、氮源或pH調整劑等混合而添加的方法等。添加於起始培養基的消泡劑與在培養中途添加於培養液的消泡劑可為同種，但配合作用亦可使用不同種類。
本發明中，培養基的初期pH調整為2至12，理想是6至9，較理想是6.5至8.0。在培養中也維持上述範圍的pH為理想。pH調整劑而言，可例示氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、碳酸鈉水溶液、氨水、氨氣、硫酸水溶液或這些的混合物。
本發明中，培養基是經滅菌處理後，用於細菌的培養。滅菌處理，如是本行業者，則可適宜實施，例如，在適當的容器中的培養基以高壓釜加熱滅菌即可。或者，以滅菌過濾器過濾滅菌即可。
本發明的變異型類胡蘿蔔素產生細菌或形質轉換體，在如上述的方式調製的培養基植菌，以規定的條件培養。植菌是使用試管、燒瓶或發酵槽等藉由種培養而適宜增加菌株，將所得的培養液添加於類胡蘿蔔素生產用培養基而實施。使用於種培養的培養基，如類胡蘿蔔素產生細菌可良好增殖的培養基則沒有特別的限定。
培養是在適當的培養容器中實施。培養容器是依培養容量而可適宜選擇，例如，可舉試管、燒瓶、發酵槽等。
培養溫度是15至40℃，理想是20至35℃，較理想是25℃至32℃，通常是1日至18日，理想是2至12日，較理想是3至8日，在好氣條件實施培養。好氣條件而言，例如，可舉振盪培養或通氣攪拌培養等，將溶存氧濃度調控在一定的範圍為理想。溶存氧濃度的調控，例如，可藉由改變攪拌迴轉數、通氣量、內壓等而實施。溶存氧濃度理想是調控制在0.3至10ppm，較理想是0.5至7ppm，更理想是1至5ppm。
本發明的變異型類胡蘿蔔素產生細菌或形質轉換體經培養後的類胡蘿蔔素產生細菌的菌體數或形質轉換體數可藉由OD測定。又，由培養類胡蘿蔔素產生細菌或形質轉換體所得的培養物中的類胡蘿蔔素、或培養物採取的類胡蘿蔔素的定量，可藉由高速液體層析法實施。如上述的方式培養類胡蘿蔔素產生細菌或形質轉換體之後，可由所得的培養物採取類胡蘿蔔素。
培養物，例如，可舉培養液、培養上清液、菌體濃縮液、濕菌體、乾燥菌體、菌體溶解物等。培養上清液是將培養液以離心處理或過濾處理，由培養液除去菌體而調製即可。菌體濃縮液可將培養液藉由離心分離或膜過濾濃縮而得。濕菌體可將培養液藉由離心或過濾而得。乾燥菌體可將濕菌體或菌體濃縮液經由一般性的乾燥方法乾燥而 得。如此所得的含有類胡蘿蔔素的乾燥菌體可直接使用作為飼料添加物。
發酵培養時的收量，至少是150mg/L，例如含有150mg/L、400mg/L、2000mg/L、4000mg/L的類胡蘿蔔素。隨所使用的菌體而培養液中所含的類胡蘿蔔素的量變動，但例如含有400mg/L至4000mg/L，更理想是含有500mg/L至3500mg/L的類胡蘿蔔素。
本發明的細菌，比不具有編碼包含DXS及/或DPS的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因的類胡蘿蔔素產生細菌的類胡蘿蔔素產生量，至少有5倍，理想是10倍以上的量的產生能力。
本發明中由上述培養物採取類胡蘿蔔素的方法是沒有特別的限定，能將類胡蘿蔔素安定而有效率的回收的任何方法都可以。這些方法，如是本行業者則可由公知的萃取、精製技術適宜選擇而實施。又，在本發明中，也可將上述培養物使用作為含有類胡蘿蔔素的組成物。
實施萃取之前，亦可將培養物以使用鹼試藥或界面活性劑等化學的處理，使用溶菌酶、脂質分解酶及蛋白質分解酶等生化學處理，或使用超音波或粉碎等的物理的處理之中，實施1種或2種以上的處理。
例如，將類胡蘿蔔素由培養物萃取時，用於萃取及清洗的溶媒是沒有特別的限定，但可舉甲醇、乙醇、異丙醇等低級醇類，丙酮、四氫呋喃、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲醯胺、二甲基亞碸等。
想要極力防止萃取操作中的類胡蘿蔔素的氧化時，在氮氣等惰性氣體環境中處理即可。又，亦可選擇醫藥品或食品所使用的氧化防止劑添加於萃取溶媒。或者，亦可組合這些處理。又，為了極力防止因光的類胡蘿蔔素的分解，亦可在不照光的條件下實施。
如此所得的萃取物可直接使用作為類胡蘿蔔素，亦可再精製而使用。
分離殘留在萃取操作後的萃取物的細菌等的方法是沒有特別的限定，但可使用膜濾過、離心分離、傾析等。
由萃取液取得類胡蘿蔔素沉澱物的方法而言，一般的是可舉加熱及/或減壓濃縮或晶析。此外，也可在低溫藉由類胡蘿蔔素色素的析出、由酸.鹼藥劑或各種鹽類的析出，不濃縮類胡蘿蔔素色素而分離。工業上使用時，實施晶析為理想。
所得的類胡蘿蔔素沉澱物是，為了清洗必要時亦可使用少量的低級醇類等溶媒使其懸濁攪拌。清洗的手法是沒有特別的限定，但例如，將懸濁攪拌後濾取的方法或由沉澱物之上通液的方法等在實用上可舉為理想的方法。
如上述的方式所得的培養物、萃取物或精製物，可各分別單獨使用作為類胡蘿蔔素，也可將這些以任意的比率混合而使用。
2. 參與蝦紅素合成途徑的酵素的立體構造解析
為了顯示前述DXS的第225個胺基酸殘基，及DPS的第305個胺基酸殘基的變異對類胡蘿蔔素合成扮演重要的角色，可實施這些的酵素的立體構造解析。
本發明中，鑑定蝦紅素合成途徑上的酵素2種(稱為酵素A、酵素C)的點變異。蝦紅素的產生的增加，可推想是在這些的酵素發生的變異為原因，將變異經鑑定的酵素2種構築立體構造模型，推論由變異的胺基酸取代的影響。
酵素A推論為1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶(DXS)。經鑑定的胺基酸的變異G225D，在活性部位的近旁的位置的紊亂區域。由立體構造模型，酵素A的變異G225D，推測與已知使DXS活性提高的既知的紊亂區域的變異，在酵素A引起同樣的構造變化，預測變異G225D酵素的酵素活性提高。考慮DXS因IPP的回饋抑制而受到調控，則在變異G225D酵素中，回饋抑制變成無效，暗示IPP的產生量增加。咸信由酵素A的變異G225D，蝦紅素的原料的IPP的供給量增加，是蝦紅素產生量的增加的主要原因。
酵素C，推論是十聚異戊二烯二磷酸合成酶。由立體構造模型，推論經受鑑定的變異A305V，與周邊的胺基酸殘基引起立體障礙，不安定化酵素C的立體構造。酵素C的基質的十聚異戊二烯二磷酸的原料的FPP及IPP，也是蝦紅素合成的原料。由於不安定化而酵素C的活性降低，暗示由酵素C所消費的FPP及IPP的量減少。其 結果，可用於蝦紅素合成的FPP、IPP的量增加，咸信蝦紅素的產生量增加。
如以上所述，這次經鑑定的變異對蝦紅素合成途徑產生的效果，推論有因酵素A的活性提高的IPP產生量的增加，及因酵素C的活性減少而對蝦紅素合成途徑的IPP供給量的增加之2者。咸信這些效果是蝦紅素產生量增加的主要原因。
(實施例)
以下，由實施例將本發明再具體的說明。但，本發明的範圍不受這些的實施例所限定。
[實施例1] (1)副球菌屬細菌的變異處理及基因體解析 變異處理方法
對親株(E-396株)使用UV及NTG(亞硝基胍)等作為變異源，使用種種選汰壓力而實施數次的篩選。篩選是以蝦紅素的收量作為指標而實施。
基因體解析法
基因體解析是使用PacBio RS II(Pacific Biosciences公司製)及MiSeq(Ilumina公司)的序列分析儀，讀出基因體序列後，使用SMART Cell 8 Pac V3(Pacific Biosciences公司製)，及MiSeq Control Software(MCS)v2.4.1.3、Real Time Analysis(RTA)v1.18.54,bcl2fastq v 1.8.4(Ilumina公司)等 解析軟體進行。
基因體解析結果(變異部位的鑑定)
變異部位的鑑定，可想是持有這些基因體解析結果的變異點的蛋白質的區域的胺基酸序列，與在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)所收錄的酵素基因胺基酸序列之間相同性高者之中，細查出包含在副球菌屬者，再者，由這些的資訊進行酵素的立體構造解析，找出與序列有一致的模板，決定持有變異部位的蛋白質的胺基酸序列的最終的酵素名。
(2)蝦紅素的收量 (i)培養條件
試管衝程-330rpm、28℃、pH7.2、培養基量8ml/支
培養時間-72小時。
培養基-
將以下的組成的培養基8mL裝入於內徑18mm的附綿栓的試管，在121℃高壓釜滅菌15分鐘，而調製種用試管培養基。種用試管培養基的原料是使用有確認菌體充分生育的批次。
pH7.2
其次將以下的組成的培養基7.2mL裝入於內徑18mm的附綿栓試管的生產用試管培養基，準備5支。生產用試管培養基的原料是使用確認菌體不充分生育的批次。
(ii)結果
將各株的比生產性示於第1圖。
由本實施例，取得與E-396株比較有10倍以上的類胡蘿蔔素產生能力的ASB-57株。
[實施例2]
參與蝦紅素合成途徑的酵素的立體構造解析
1.立體構造數據及手法
酵素A、酵素C的立體構造模型是由同源模擬法(homology modeling)構築。模擬是使用軟體工具Swiss-Pdb viewer及SWISS-MODEL[1,2]。變異體模型是由Swiss-Pdb viewer製作。胺基酸殘基的取代是使用mutate指令，分子內能量的算出是使用compute energy指令，又，能量最小化計算是使用energy minimization指令。與基質等的複合體模型的製作、基質附近殘基的檢出、原子間距離的測定、立體構造的表示，是使用軟體工具Waals(Altif Labs.Inc.)進行。低分子化合物的立體構造模型是由MarvinSketch(ChemAxon Ltd.)製作。
模板構造的立體構造的座標數據，由蛋白質立體構造數據庫的Protein Data Base(PDB)(http：//www.rcsb.org/pdb/)取得。模板構造是，在登錄於PDB的數據之中，使用與酵素A、酵素C各分別胺基酸一致度最高者。將作為同源模擬法的模板而使用的立體構造數據示於第1表。
2. 酵素A的立體構造模型的構築及變異體的解析
酵素A是將成為蝦紅素合成原料的異戊二烯二磷酸(IPP)生合成的類異戊二烯(isoprenoid)生合成途徑之一的去氧木酮糖途徑中，由丙酮酸及D-甘油醛三磷酸，合成1-去氧-D木酮糖5磷酸的，1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶：1-deoxy-D-xylurose-5-phosphate synthase(DXS)。
由所構築的酵素A的立體構造模型，知悉由基因體解析受鑑定的變異G225D，如有多數報告的產生變異則DXS的酵素活性提高的例，在活性部位附近的紊亂區域。由變異體模型的解析結果，推知酵素A的變異G225D，與會提高DXS的活性的已知變異，引起同樣的構造變化，預測變異G225D酵素也與已知變異同樣，提高DXS的酵素活性。由於DXS的活性提高，隨著蝦紅素的原料的IPP的供給量增加，咸信蝦紅素的產生量增加。
2.1. 1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的酵素反應
酵素A、1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶：1-deoxy-D-xylurose-5-phosphate synthase(DXS)，由丙酮酸及D-甘油醛三磷酸，在鎂離子(Mg)存在下，合成1-去氧-D-木酮糖5磷酸。觸媒反應，必須有做為輔酶的噻胺焦磷酸(Thiamine pyrophosphate,TPP)，首先，輔酶TPP附加於基質的丙酮酸，產生羥乙基-TPP中間體。此中間體與甘油醛三磷酸反應而生成1-去氧-D-木酮糖5磷酸。下面表示酵素 A的酶反應。
2.2. 酵素A的立體構造模型的構築 (1)由同源模擬法的酵素A的立體構造模型的構築
酵素A的立體構造模型，根據有輔酶TPP與複合體的立體構造由X線結晶構造解析而決定的源自抗輻射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)(D.radiodurans)的1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS、模板)的立體構造(PDB ID：2O1X)[3](第2圖)，由同源模擬法構築。
同源模擬法是根據酵素A及模板構造的立體構造對準而進行(第3A、3B圖)。
酵素A與源自抗輻射奇異球菌DXS的胺基酸一致度是44.1%。在模板的DXS的立體構造，胺基酸編號199至242殘基的區域(44殘基)是紊亂，由X線結晶構造解析不能特定原子的位置。因此，除去相當於酵素A的紊亂區域的196至238殘基(43殘基)，而構築胺基酸殘基編號7至630殘基的立體構造模型。其次，由酵素A的立體構造模型與模板構造重疊，將TPP及Mg嵌入，而製作酵素A與TPP的複合體模型。在第4圖顯示模板構造及所構築的模型構造。
酵素A，與模板構造同樣，形成同型二聚體，在各分 別的次單元持有TPP鍵結部位及基質鍵結部位。酵素A的單體，由域I(1至319殘基)、域II(320至495殘基)、域III(496至629殘基)的3個域所構成。
(2)酵素A的基質複合體模型的製作
為了要推測參與酵素A的基質鍵結的胺基酸殘基，而構築基質與酵素A鍵結的複合體模型。在模板構造的201X中，不能確定基質的丙酮酸及甘油醛3磷酸的座標，所以首先，為了檢出丙酮酸鍵結部位，將在輔酶TPP經附加丙酮酸的羥乙基-TPP中間體的複合體模型，根據類似的源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(S.cerevisiae)的轉酮醇酶Transketolase(TK)與羥乙基-TPP中間體鍵結的立體構造(PDB ID：1GPU)[6]，藉由重疊，將羥乙基-TPP中間體嵌入，而製作複合體模型。同樣根據源自釀酒酵母的TK與赤藻糖-4-磷酸的立體構造(PDB ID：1NGS)[7]，將赤藻糖-4-磷酸嵌入，再由赤藻糖-4-磷酸製作甘油醛3磷酸模型，而製作酵素A與甘油醛三磷酸的複合體模型。
在第5圖顯示酵素A與基質複合體的模型構造。
2.3. 酵素A的活性部位的推測
為了要推定與輔酶及基質鍵結的胺基酸殘基，在酵素A與輔酶的複合體模型中，調查TPP中間體、GAP及Mg的相互作用。
(1)輔酶TPP的鍵結部位
在酵素A與TPP的複合體模型，與模板構造同樣，TPP是在域I及域II之間的位置，TPP的嘧啶環是在域II鍵結，磷酸基是在域I鍵結。
TPP是由胺基嘧啶(aminopyrimidine)環、噻唑啉(thiazoline)環、焦磷酸所構成(第6圖)。胺基嘧啶環是酵素A的鍵結口袋的內部剛好收進去的方式鍵結。Phe396及Ile369的側鏈，將胺基嘧啶環由兩側挾住一樣的以疏水性相互作用而鍵結。尤其是可推測Phe396側鏈的環狀苯基與胺基嘧啶環是π堆疊的強鍵結。Gly120主鏈的氧與Glu371側鏈的氧是與胺基嘧啶環的1位的氮原子形成氫鍵結。TPP的嘧啶環的1位的氮原子與Glu殘基的氫鍵結，對經由TPP的觸媒反應是重要的，已知由將TPP作為輔酶而使用的酵素所保存。Arg399的側鏈，不只是疏水性鍵結，可推測與周邊的胺基酸殘基Glu371、Ser122的側鏈的氫鍵結，形成鍵結口袋。與噻唑啉環的相互作用而言，看到與Ile184、Ile369的疏水性鍵結。與焦磷酸的相互作用而言、Gly152主鏈、Lys285側鏈及His79側鏈之間推測有氫鍵結。
在輔酶TPP的鍵結需要Mg。Mg配位在TPP的2個磷酸基之間，推測Asp151與Asn180的側鏈及Met182的主鏈與Mg鍵結。關於DXS是已知作為TPP鍵結模式，而GDGX25-30N的序列受保存[3]。在酵素A推測有Mg鍵結的含有Asp151及Asn180的胺基酸序列Gly150-Asp151-Gly152-Asn180的序列，與此模式吻合。
如以上所述，TPP的胺基嘧啶環及噻唑啉環的碳，推測與酵素A的疏水性殘基Ile184、Ile369、Phe396、Arg399之間有疏水性相互作用。又，胺基嘧啶環的2個氮原子推測與Gly120、Glu371形成氫鍵結。與焦磷酸之間除His79、Gly152、Lys285的氫鍵結之外，推測由Asp151、Asn180、Met182有經由Mg的氫鍵結。在第7圖顯示推測參與TPP的鍵結的胺基酸殘基。
(2)與丙酮酸的相互作用
基質的丙酮酸與TPP反應，成為羥乙基-TPP中間體。由酵素A與羥乙基-TPP中間體的複合體模型，作為與源自丙酮酸的羥乙基的相互作用，而推測與Val77的疏水性相互作用及與His432的氫鍵結。可想這些胺基酸殘基有參與丙酮酸的鍵結。在第8圖顯示推測與羥乙基有相互作用的胺基酸殘基。
(3)與甘油醛3磷酸的相互作用
作為與基質的甘油醛3磷酸(GAP)有相互作用的胺基酸殘基，而推測與His48、Tyr393、Arg421、Asp428、Arg479的氫鍵結(第9圖)。
His48及Asp428是與GAP的醛形成氫鍵結。Tyr393、Arg421、Arg479是推測與GAP的磷酸基形成氫鍵結。
以上，將所推測的活性部位示於第2表至第4表。
又，將酵素A與輔酶TPP的鍵結樣式、酵素A與丙酮酸的鍵結樣式、酵素A與甘油醛3磷酸的鍵結樣式的圖各分別示於第6圖、第10圖、第11圖。
酵素A是，由於保持模板的源自抗輻射奇異球菌的DXS而已明瞭的輔酶的TTP、基質的丙酮酸及GAP鍵結的 活性部位，因而推測具有DXS的酵素活性。這些胺基酸殘基，源自抗輻射奇異球菌的DXS之外，在大腸菌等的DXS及源自釀酒酵母的TK中的保存性也高，是已知的[3]。
在大腸菌DXS，已知如將酵素A的相當於Glu370、Arg399、Arg479的胺基酸殘基經Ala取代，則失去活性[3]。又，在文獻[8]，有說明在由大腸菌DXS的相當於酵素A的His48、Glu371、Asp428的胺基酸殘基使其變異的實驗，各個都使酵素活性大概失去活性。酵素A中也可推測這些的胺基酸殘基是對DXS的活性是重要的。
2.4. 酵素A的變異G225D的影響
酵素A的變異G225D是存在於立體構造不能特定的紊亂區域(196至238殘基)。為了推測此變異對酵素A的立體構造給予的影響，調查以往的知識見解及立體構造上的紊亂區域的位置與活性部位的關連。
(1)關於既知的紊亂區域的變異
以往，對於圓葉葡萄(muscat)及大腸菌的DXS，有報告在其紊亂區域發生的變異，各分別在2處、計4種都使酶活性增加。
有報告指出，在源自圓葉葡萄(Vitis vinifera)的DXS中，K284N的變異與野生型比較時，Vmax及Kcat/Km帶來約2倍的活性增大，由於過多呈現，單萜的產生量大幅度增加[9]。
又，圓葉葡萄中K284N及R306C的變異，已知與大腸菌中K213N及K234C的變異有關的發明(特表2014-500710、US20130276166)。此發明是關於藉由DXS的活性提高而增加萜的產生量的方法，4例的各者都由各分別的一殘基的變異而增加萜的產生量。
在第12圖顯示在酵素A及大腸菌及圓葉葡萄的DXS的酶活性增加的變異的位置。
圓葉葡萄的K284N及R306C、大腸菌的K213N及K234C，各者都存在於紊亂區域(藍)。酵素A的變異G225D也與這些一樣存在於紊亂區域。由胺基酸序列的對準，推測有保存DXS的活性部位(綠)，酵素A也與這些的DXS持有同樣的反應樣式。又，在紊亂區域的N末端側(洋紅)，有活性部位的存在。
如以上所述，在DXS的紊亂區域有提升DXS酵素活性的變異為複數個存在，在本區域導入變異，推測對DXS的活性多少有某些影響。
(2)酵素A的變異G225D(紊亂區域)在立體構造中的位置
在第13圖以藍色的點線顯示酵素A的變異G225D存在的紊亂區域(196至238殘基)位置。
本區域位置在於對DXS的活性是必須的輔酶TPP的鍵結部位附近。在本區域的N末端側的環(洋紅)有活性部位的Asn180、Met182及Ile184存在。Asn180的側鏈及Met182的主鏈鍵結Mg。Ile184的側鏈與TPP為疏水性鍵結。對 DXS的活性是必須的TPP與Mg鍵結，可想此環取適當的構造是重要的。在文獻[9]中，生理的角色是不明，但有考察本區域存在於活性部位的附近，本區域內的變異是否合理的影響酵素的活性。如第12、13圖所示，本區域在胺基酸序列上及立體構造上，都存在於TPP鍵結部位的附近，所以本區域的變異對這些的活性部位給予影響，可想確實有可能發生的。
(3)酵素A的紊亂區域的模式及變異G225D酵素的製作
其次，為了要調查酵素A的變異G225D對紊亂區域的立體構造所給予的影響，而製作酵素A的196至238殘基(43殘基)的紊亂區域的模型構造。在報告圓葉葡萄的變異K284N的文獻[9]中，對於圓葉葡萄DXS的紊亂區域，製作模式，查看由變異引起的靜電電位的變化。為了做為參考起見，對於酵素A也做同樣的解析。由同源模擬法，基於與酵素A的紊亂區域的相同性高的胺基酸序列的片段構造而製作立體構造模型。作為模板構造，使用登錄在PDB的立體構造之中有最高的胺基酸一致度(34%)的1AL7的片段。紊亂區域是推測有搖動的構造，但可想本區域作為容易形成摺疊(folding)而言是可供參考的。將所製作的模型顯示於第14圖(左)。
再者，將變異處的Gly225取代為Asp而製作變異G225D酵素的立體構造模型。Gly225位置在表面，因取代為Asp而Asp的側鏈在表面露出。將在所製作的立 體構造模型的表面形狀測繪靜電電位圖的結果顯示於第14圖(右)。藍色表示positive(正電荷)區域，紅色表示negative(負電荷)的區域。
野生型中，有強的正電荷的區域存在，但可確認在變異G225D酵素中正電荷減弱，而負電荷增強。野生型中，持有正電荷的Arg227、Arg228、Lys230、K234的側鏈聚集，形成強的正電荷的區域。可想由於在此區域存在的不具電荷的Gly225經持有負電荷的Asp取代，而Asp225附近的正電荷減弱。此結果，與在文獻[9]所示的圓葉葡萄的變異K284N的靜電電位的變化，即，與在紊亂區域的表面由正電荷變成負電荷的靜電電位的變化，顯示有相同的傾向。因酵素A的G225D的紊亂區域的構造變化，可預料在含有TPP鍵結部位的活性部位給予與圓葉葡萄的變異同樣的影響，暗示因其影響，酵素A的變異體G225D也與圓葉葡萄的變異體K284N同樣，酵素活性增加。
2.5. 蝦紅素合成途徑中酵素A的變異G225D的影響
如以上所述，可確認酵素A的變異G225D是在酵素A的紊亂區域發生，本區域存在於對活性是必須的TPP鍵結部位的附近。又，在本區域至今發現複數的使DXS的酶活性提高的變異，G225D的變異，可預料與使DXS的活性提高的既知的變異，發生同樣的構造變化。
在立體構造模型確認的紊亂區域的位置，至少如在文獻上所述，可想對紊亂區域的變異在TPP鍵結 區域多少給予某種影響，而使酶活性提高。在圓葉葡萄的例，藉由體外的酵素學的實驗顯示變異體的Kcat/Km成為野生型的約2倍，可預料在紊亂區域的變異由TPP的鍵結帶來合適的構造變化。
要在細胞內帶來各種的單萜的大幅度的增加，則成為單萜的原料的異戊二烯二磷酸(IPP)的增加是必要的。有報告指出，DXS受到由去氧木酮糖途徑的產生物的IPP的回饋抑制(feedback inhibition)時，IPP與TPP競爭抑制(competitive inhibition)[10]。又，已知IPP的量達一定量以上時，去氧木酮糖途徑的最初的酵素的DXS受到抑制，而調控IPP不再更增加。
由此回饋抑制，所供給的IPP的量藉由DXS調控為一定，所以單只有DXS的酵素活性Kcat/Km增加的話，IPP的供給量不增加，萜的量不能大幅度增加。在既知的例中，因紊亂區域的變異之萜的合成量增加，可預測由此變異之IPP的供給量增加，即，暗示DXS受IPP的回饋抑制變成無效。
在體外，已明瞭IPP與TPP互相競爭與DXS鍵結，而抑制DXS[10]。因在紊亂區域的變異，在TPP鍵結區域發生構造變化，不只是變成更適於TPP鍵結的構造，由於對IPP的鍵結給予影響，暗示由IPP的回饋抑制變成無效的可能性。
酵素A的變異G225D也是同樣，可推測對TPP鍵結區域給予構造變化，因IPP的回饋抑制變成無效， 而IPP的產生量增加。其結果，咸信成為蝦紅素合成的原料的IPP的供給量的增加，因而蝦紅素的合成量增加(第5圖)。
3.酵素C的立體構造模型的構築及變異體的解析
酵素C，由胺基酸序列的相同性及立體構造比較解析，是聚異戊二烯二磷酸合成酶(polyisoprenyl diphosphate synthase)的一種，是由法呢基二磷酸(farnesyl diphosphate)(FPP)及7個異戊二烯二磷酸(IPP)合成十異戊二烯二磷酸的十聚異戊二烯二磷酸合成酶：Decaprenyl diphosphate synthase。
由所構築的酵素C的立體構造模型，經基因體解析受鑑定的變異A305V，可推測由於與周邊的胺基酸殘基的原子的衝突引起立體障礙，不安定化酵素C的立體構造。由立體構造的不安定化而酵素C的活性減少，被酵素C消費的FPP及IPP的量減少。其結果，由於可使用於蝦紅素合成的FPP、IPP的量增加，可想蝦紅素的產生量增加。
3.1.十聚異戊二烯二磷酸合成酶的酵素反應
十聚異戊二烯二磷酸合成酶，持有縮合FPP與IPP的活性，重複與IPP的縮合，而由FPP及7個IPP合成十聚異戊二烯二磷酸(DPP)的酵素。十聚異戊二烯二磷酸合成酶的酶反應如下。
3.2. 酵素C的立體構造模型的構築 (1)由同源模擬法的酵素C的立體構造模型的構築
為了要調查酵素C的活性部位及變異的影響，作為模板構造，使用在PDB的立體構造上胺基酸一致度最高(胺基酸一致度是76.2%)，立體構造經X線結晶構造解析而決定的源自莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)(R.capsulatus)的十聚異戊二烯二磷酸合成酶的立體構造(PDB ID：3MZV)，由同源模擬法構築立體構造模型(第16圖)[4]。
同源模擬法，根據酵素C及模板構造的立體構造對準而進行(第17圖)。
(2)酵素C的基質複合體模型的製作
模板構造的3MZV是沒有基質的鍵結，所以使用源自大腸菌(Escherichia coli)的octaprenyl pyrophosphate synthase(八異戊二烯二磷酸合成酶)(PDB ID：3WJN，3WJO)的立體構造數據[11]，在酵素C的立體構造模型重疊3WJN，將基質的FPP嵌入酵素C的立體構造模型，而製作酵素C及FPP的複合體模型。其次，同樣地，將3WJO重疊，嵌入IPP，而製作酵素C及FPP、IPP複合體模型。
第18圖顯示模板構造及所構築的模型構造。酵素C是與模板構造同樣形成同型二聚體。
3.3. 關於酵素C (1)由立體構造的比較
酵素C的十聚異戊二烯二磷酸合成酶，屬於聚異戊二烯二磷酸合成酶的家族(Pfam PF00348 Polyprenyl synthetase)。第19圖顯示酵素C的基質鍵結的樣子。
聚異戊二烯二磷酸合成酶，由FPP將IPP以頭對尾(此處是依照文獻[4]，將磷酸基側稱為頭，異戊二烯基側稱為尾。)方向縮合，而合成各種的聚異戊二烯二磷酸。十聚異戊二烯二磷酸合成酶，繼續FPP與IPPG的縮合反應，往基質鍵結部位的深部(第19圖右以箭印表示)伸長異戊二烯鏈，而合成C50的十聚異戊二烯二磷酸。
酵素C與模板的源自莢膜紅細菌(R.capsulatus)的十聚異戊二烯二磷酸合成酶的胺基酸一致度為76.3%之高，活性部位也有保存(第17圖)。立體構造的由C α的重疊的RMSD是0.063Å，2種酵素是非常類似，將胺基酸殘基的一致分顏色表示，則胺基酸殘基的種類不同的區域限於分子表面，在活性部位及鍵結基質的區域，由全部一致的胺基酸殘基所構成(第20圖)。
(2)由胺基酸序列的比較
其次，對於酵素C的胺基酸序列，實施與源自副球菌 (Paracoccus)的十聚異戊二烯二磷酸合成酶的比較。作為源自副球菌的十聚異戊二烯二磷酸合成酶，作為已經明瞭的胺基酸序列，而在UniProt(http：//www.uniprot.org)，有源自玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)(Q8L1I6)及脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)(A1B3M9)的胺基酸序列的登錄。這些與酵素C的胺基酸序列比較的結果，胺基酸一致度是75.1%(類似度89.2%)，表示高的相同性(第5表)。
由胺基酸序列也可推測酵素C是十聚異戊二烯二磷酸合成酶。在第21圖顯示對準。
3.4. 酵素C的活性部位的推測
在酵素C與基質的複合體模型中，推測對基質的FPP鍵結部位及IPP鍵結部位、觸媒所必要的Mg鍵結部位。由這些的結果推測的活性部位及其他的聚異戊二烯二磷酸合成酶的活性中心及基質鍵結部位的保存性高，推測酵素C是持有與聚異戊二烯二磷酸合成酶同樣的反應樣式。
酵素C與基質的複合體模型示於第22圖。
酵素C是與模板構造的十聚異戊二烯二磷酸合成酶同樣，推測形成同型二聚體。在第22圖，顯示A鏈(淡紅)的FPP與IPP的鍵結部位。FPP是與A鏈的隧道狀的區域鍵結，FPP及IPP是向IPP的異戊二烯基，將FPP的磷酸基以頭對尾的形式鍵結。觸媒反應是在Mg存在下，在FPP的磷酸基與IPP的異戊二烯基之間發生。
為了推測酵素C的活性部位，在酵素C與基質的複合體模型中，檢出存在於FPP、IPP附近的胺基酸殘基，推測基質與胺基酸殘基有相互作用。對於FPP，推測磷酸基與Arg102、Lys179、Lys244之間有氫鍵結，聚異戊二烯基與Ala88、Thr89、His92、Phe125之間推測有疏水性相互作用(第23圖上方圖)。
對於IPP，推測磷酸基與Lys54、Arg57、His86、Arg103之間有氫鍵結，異戊二烯基與Phe216之間有疏水性相互作用(第23圖中央圖)。
在本觸媒反應中，Mg是必要的。作為Mg鍵結部位，在既知的聚異戊二烯二磷酸合成酶中，已知有2處的DDXXD模體(motief)[11]。在模板構造中沒有決定Mg的座標，但在酵素C中，DDXXD模體相當的Asp93、Asp94、Asp97及Asp220、Asp221、Asp224，與既知的Mg鍵結部位同樣存在於磷酸基的附近，推測這些胺基酸殘基將Mg鍵結(第23圖下方圖)。
以上，將推測的活性部位示於附加資料的第6表至第8表中。又，酵素C與FPP及IPP的鍵結樣式， 以及酵素C與Mg的鍵結樣式的圖則各分別示於第24圖、第25圖。
推測有鍵結的各胺基酸殘基，與模板構造的源自莢膜紅細菌(R.capsulatus)的十聚異戊二烯二磷酸合成酶一致(第17圖)。又，酵素C的FPP鍵結部位、IPP鍵結部位、Mg鍵結部位，由於保持用於基質複合體模型的製成所使用的源自大腸菌(E.coli)的八異戊二烯二磷酸合成酶的鍵結部位，咸信酵素C與八異戊二烯二磷酸合成酶有同樣的反應樣式。
尤其是，與FPP的磷酸基鍵結的Arg102、 Lys179、Lys244，與Mg鍵結的Asp93、Asp94、Asp97、Asp220、Asp221、Asp224，可想是直接參與將磷酸基轉移的觸媒活性的重要的殘基。有報告指出，在大鼠及酵母的FPP合成酶的變異體製作的實驗中，在相當於酵素C的磷酸鍵結部位的Arg102、Arg103及Mg鍵結部位的Asp94、Asp97、Asp220、Asp221、及Asp224的胺基酸殘基，對酵素活性是重要的，在聚異戊二烯二磷酸合成酶之間這些的胺基酸殘基有高度被保存[14,15]。
又，在FPP合成酶中，由在酵素C的相當於Phe216、Gln217的胺基酸殘基的變異體的製作，闡明了Phe及Gln的支鏈在基質鍵結為重要的[16]。在酵素C的複合體模型中，也可預料Phe216、Gln217是在活性部位的區域，對活性是重要的。
3.5. 由酵素C的變異A305V的影響
為了要推測在酵素C受鑑定的由Ala305至Val的變異對立體構造的影響，而製作酵素C的變異A305V酵素的立體構造模型。
(1)由A305V的一殘基取代的變異模型的製作
為了查看Ala經Val取代的影響，首先，固定其他的胺基酸殘基的立體構造，(假定為剛性體)，製作Ala305經Val一殘基取代的模型，與野生型做比較。
第26圖顯示野生型及變異A305V酵素的立 體構造模型。野生型的Ala305，在α螺旋(粉紅)存在，側鏈是與鄰接的α螺旋(青藍)的胺基酸殘基經由疏水性相互作用而堆積(packing)。
第27圖顯示與Ala305鄰接的胺基酸殘基的構造。
Ala305側鏈的甲基的碳原子與周邊的胺基酸殘基，Tyr208、Ala211、His301、Ala302相接，碳的原子間的距離是各者都未達4.0Å。由Ala305成為Val的取代而側鏈的甲基增加2個。在Ala305經Val取代的立體構造模型中，Val側鏈的甲基的碳與Tyr208及Ala211的碳的原子間距離是2.42Å及2.47Å。
碳間的非共價鍵接觸距離的極限下限值是2.9Å。在Val305測定的碳的原子間的距離是未達此值，所以這些的碳原子會衝突，可想與周邊的胺基酸殘基引起立體障礙。以空間填充的表示中，原子間的距離比凡得瓦氏半徑短，可確認原子間有衝突。由以上所述，A305V的變異，可預料由於原子的衝突而引起酵素C的立體障礙，招致立體構造的不安定化。
(2)由A305V的變異的分子內能量的變化
為了評估由A305V的構造的不安定化，將酵素C的野生型與變異體A305V的分子內能量由原子間的鍵結的長度、鍵結角、扭轉、鍵結能量等的合計，以單位千焦耳/mol(KJ/mol)算出。
其結果，相對於野生型的-17,912(KJ/mol)，在變異A305V酵素是-16,295(KJ/mol)，變異A305V的分子內能量增加9.02%之多，確認構造會不安定化。此分子內能量的增加，尤其是在Tyr208、Ala211、Val305的各胺基酸殘基確認，可想這些胺基酸殘基有引起衝突是起因於分子內能量的增加。第28圖示酵素C的野生型與變異體A305V的分子內能量的比較。
(3)由變異A305V的構造變化
其次，對變異體模型實施能量最小化計算，由變動周邊的胺基酸殘基的立體構造，調查能否迴避A305V的衝突。其結果，獲知為了要迴避Val305側鏈的衝突，而容許側鏈的話，需要將與Val305存在的α螺旋鄰接的α螺旋的胺基酸殘基的立體構造變動。即，其構造變化不只是側鏈，也涉及主鏈，在變異A305V酵素中，不能做α螺旋間的本來的堆積，可預料2支的螺旋周邊的構造不安定化。又，在與變異A305V鄰接的α螺旋，存在基質的IPP及鍵結Mg的活性部位(Phe216、Gln217、Asp220)。由於活性部位的基礎的α螺旋的主鏈構造的構造變化，活性部位的胺基酸殘基無法採取本來的位置，其結果，可想對基質鍵結或活性本身有影響(第29圖右圖)。
第29圖顯示野生型及能量最小化計算後的變異體A305V的Ala305及Val305周邊的構造，第30、31、32圖顯示變異體A305V的構造變化。
(4)由構造的不安定化的酵素C的活性的減少
如以上所述，由A305V的立體構造模型，推測有發生與周邊的胺基酸殘基的立體障礙、分子內能量的增加及鄰接的2支的α螺旋的構造變化，暗示A305V的變異使酵素C的立體構造不安定化。關於因點變異的立體構造的不安定化，在遺傳病等也有為數不少的報告。例如，持有引起不安定化的變異的蛋白質，不能在溶媒中維持本來的立體構造，而比通常較短的時間失去活性，或，在細胞內，被認為不能做本來的堆積的變異體蛋白質，由細胞本身的功能而被排除。因此之故，不具備本來的活性的，不安定的構造的變異A305V酵素，在細菌內有被排除的可能性，結果而言，可推測在細菌內的酵素C的活性減少。
3.6. 在蝦紅素合成途徑中的酵素C的變異A305V的效果
十聚異戊二烯二磷酸合成酶是輔酵素C10(CoQ10)合成途徑的酶之一。這一次，被確認與酵素C有高的相同性的源自玉米黃素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)或脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的十聚異戊二烯二磷酸合成酶，已明瞭其為在CoQ10的產生上是必要的酶[特開2005-211020、特表2006-517794]。十聚異戊二烯二磷酸合成酶的基質的FPP及IPP，也是蝦紅素合成途徑的香葉基香葉基二磷酸(Geranyl-geranyl pyrophosphate；GGPP)合成酶的CrtE的基質。因此，可想在通常的副球菌(Paracoccus) 的細胞內，十聚異戊二烯二磷酸合成酶及CrtE，與基質的FPP互爭IPP的使用。
在酵素C受鑑定的變異A305V，由使分子的立體構造不安定化，推測可減少酵素C的活性。如酵素C的活性減少時，使用的基質的FPP及IPP的量也減少，其結果，可想蝦紅素合成途徑中可使用的FPP、IPP的量增加。
CrtE是由1分子的FPP及1分子的IPP合成1分子的GGPP。另一方面，酵素C要合成1分子的十聚異戊二烯二磷酸時，需要1分子的FPP及7分子的IPP。由IPP視之，則酵素C是1個反應中消費比CrtE的7倍多的IPP。因此、可想酵素C的活性減少，對在蝦紅素合成途徑供給的IPP的增加是極為有效。
其結果，可推測蝦紅素的合成量顯著的增加(第33圖)。
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由於本案的圖為實驗結果圖，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (22)

  1. 一種變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其係含有下述的(a)至(c)的任一項的基因，(a)編碼包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第225個胺基酸殘基是經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因；(b)編碼包含有在類胡蘿蔔素產生細菌的十聚異戊二烯二磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第305個胺基酸殘基是經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質的基因；(c)上述(a)及(b)的二者的基因。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其中，1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的胺基酸序列是序列編號2所示者。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其中，第225個胺基酸殘基是由甘胺酸經取代為天門冬胺酸者。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其中，十聚異戊二烯二磷酸合成酶的胺基酸序列是序列編號4所示者。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其中，第305個胺基酸殘基是由丙胺酸經取代為纈胺酸者。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其獲得相較於沒有編碼包含有變異型胺基酸序列的蛋白質的基因的類胡蘿蔔素產生細菌的類胡蘿蔔素產生能力，為更高的產生能力。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其獲得相較於沒有編碼有包含變異型胺基酸序列的蛋白質的基因的類胡蘿蔔素產生細菌的類胡蘿蔔素產生量，為至少5倍以上的量的產生能力。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其中，該類胡蘿蔔素產生細菌是屬於副球菌屬(Paracoccus)屬的細菌。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其中，該屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌是E-396株。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，其中該類胡蘿蔔素是蝦紅素。
  11. 一種類胡蘿蔔素的製造方法，其特徵為，培養如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的變異型類胡蘿蔔素產生細菌，並由所得的培養物採取類胡蘿蔔素。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的類胡蘿蔔素的製造方法，其中，該類胡蘿蔔素的產生量，相較於沒有編碼包含有變異型胺基酸序列的蛋白質的基因的類胡蘿蔔素產生細菌的類胡蘿蔔素產生量，為至少5倍以上的產生量。
  13. 如申請專利範圍第11項或第12項所述的類胡蘿蔔素的製造方法，其中，該類胡蘿蔔素是蝦紅素。
  14. 一種類胡蘿蔔素產生細菌的篩選方法，其特徵為，對類胡蘿蔔素產生細菌施以變異處理，由經變異處理的細菌選出有下述的(a)至(c)的任一項的特徵的細菌：(a)1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的活性比變異處理前的細菌中之活性更為提高的特徵；(b)十聚異戊二烯二磷酸合成酶的活性比變異處理前的細菌中之活性更為降低的特徵；(c)上述(a)及(b)的二者的特徵。
  15. 一種類胡蘿蔔素的製造方法，其特徵為，培養由申請專利範圍第14項所述的類胡蘿蔔素產生細菌的篩選方法選擇的細菌，由所得的培養物採取類胡蘿蔔素。
  16. 一種基因，其編碼包含有在1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第225個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列的蛋白質。
  17. 一種基因，其係含有下述的(a)或(b)的DNA，(a）含有序列編號5表示的鹼基序列的DNA；(b)編碼蛋白質的DNA，該蛋白質係和包含與上述(a)的DNA互補的鹼基序列而成的DNA在嚴苛的條件下雜交，並且具有1-去氧-D-木酮糖5磷酸合成酶活性。
  18. 一種編碼蛋白質的基因，該蛋白質包含有在十聚異戊二烯二磷酸合成酶的胺基酸序列中，至少第305個胺基酸殘基經其他的胺基酸殘基取代的變異型胺基酸序列。
  19. 一種基因，其係含有下述的(a)或(b)的DNA，(a）含有序列編號7表示的鹼基序列的DNA；(b)編碼蛋白質的DNA，該蛋白質係和包含與上述(a)的DNA互補的鹼基序列而成的DNA在嚴苛的條件下雜交，並且十聚異戊二烯二磷酸合成酶活性降低。
  20. 一種重組載體，其係含有下述的(a)至(c)的任一項的基因，(a)如申請專利範圍第16項或第17項所述的基因；(b)如申請專利範圍第18項或第19項所述的基因；(c)上述(a)及(b)的基因。
  21. 一種形質轉換體，其係含有如申請專利範圍第20項所述的重組載體。
  22. 一種類胡蘿蔔素的製造方法，其特徵為，培養如申請專利範圍第21項所述的形質轉換體，由所得的培養物採取類胡蘿蔔素。
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