WO2017171098A1 - カロテノイドの製造方法 - Google Patents

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秀忠 永井
渉 佐藤
季之 高橋
温美 佐藤
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    • C12Y205/01086—Trans,polycis-decaprenyl diphosphate synthase (2.5.1.86)
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    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01091—All-trans-decaprenyl-diphosphate synthase (2.5.1.91)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing carotenoids using a mutant of a carotenoid-producing bacterium.
  • Carotenoids are useful natural pigments used as feed additives, food additives, pharmaceuticals and the like.
  • Carotenoids include astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, lycopene, ⁇ -carotene, adonilvin, adonixanthin, echinone, asteroidenone, 3-hydroxyechinenone, and the like.
  • astaxanthin is useful as a feed additive for body color improving agents such as salmon, trout and red sea bream that are farmed fish, and egg yolk improving agents for poultry.
  • Natural astaxanthin has high industrial value as a safe food additive and health food material. Similar to astaxanthin, adonixanthin and adonilvin are expected to be used as feed additives, food additives, pharmaceuticals and the like.
  • ⁇ -carotene is used as a feed additive, food additive, medicine, etc.
  • canthaxanthin is used as a feed additive
  • zeaxanthin is used as a food additive, feed additive, etc. ing.
  • lycopene, echinenone, ⁇ -cryptoxanthin, 3-hydroxyechinenone, asteroidenone and the like are expected to be used as feed additives, food materials, and the like.
  • Known methods for producing these carotenoids include chemical synthesis methods, extraction methods from natural products, and production methods by culturing microorganisms.
  • astaxanthin As a chemical synthesis method of astaxanthin, a method by conversion of ⁇ -carotene (Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985 (Non-patent Document 1)) and a method of synthesizing from C15 phosphonium salt (Helv. Chim. Acta, 64). 2436, 1981 (Non-Patent Document 2)).
  • As an extraction method from natural products astaxanthin is present in fish such as salmon and red sea bream and in crustaceans such as shrimp, crab and krill, and can be extracted and collected from these.
  • a culture method using the green alga Haematococcus pluvialis Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-97584 (Patent Document 1)
  • a fermentation method using red yeast Phaffia rhodozyma Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-69969 (Patent Document 2)).
  • Fermentation using bacteria belonging to the genus Paracoccus hereinafter also referred to as “paracoccus genus bacteria”
  • fermentation using bacteria belonging to the genus Brevundimonas Japanese Patent Laid-Open No.
  • Patent Document 6 2001-512030
  • Patent Document 7 Paracoccus haeundaensis BC74171 strain (International Journal of Symboletystol 4 System 200 Biostimol 4). 1699-1702 (Non-Patent Document 4)), Paracoccus genus bacteria N-81106 strain (Japanese Patent Laid-Open No. 2007-244205 (Patent Document 7)), Paracoccus zeaxanthinifaciens (International Journal of Systemic and Evolu iffy Microbiology (2003), 53,231-238 (Non-Patent Document 5)), and Paracoccus sp. PC-1 strain (WO2005 / 118812 pamphlet (Patent Document 8)) and the like.
  • carotenoids produced by chemical synthesis methods give consumers an unfavorable impression even though they are safe.
  • Carotenoids extracted from natural products are much more expensive to manufacture than chemical synthesis methods.
  • the production by microorganisms the production of green algae and yeast by cultivation is low in productivity, and these microorganisms have a strong cell wall, which makes it difficult to extract carotenoids from the culture.
  • the production of carotenoids by bacteria belonging to the genus Paracoccus has advantages such as a high growth rate of the cells, high productivity of carotenoids, and easy extraction of carotenoids from cultures. Culture methods and production methods have been reported.
  • JP 2007-143492 A is a method of adding an iron salt during culture
  • WO 2010/044469 pamphlet is a method of adding an amino acid to a culture medium
  • JP 2011-188895 A JP 2013-143492 A
  • Patent Document 11 discloses a method of adding biotin to the medium
  • Patent Document 12 discloses a method of adding a calcium compound to the medium so as to be 3.6 mM or more.
  • the details of which gene contributes to the increase in production efficiency in the bacteria producing carotenoids are unknown.
  • Patent Document 1 JP 2007-97584
  • Patent Document 2 JP 11-69969
  • Patent Document 3 JP 2006-340676
  • Patent Document 4 JP 2008-259449
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 7-7979
  • Patent Document 6 Japanese Patent Publication No. 2001-512030
  • Patent Document 7 Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Patent Document 8 Pamphlet of WO 2005/118812
  • Patent Document 9 JP 2007-143492 A
  • Patent Document 10 WO 2010/044469 Pamphlet
  • Patent Document 11 JP 2011-188895 A
  • Patent Document 12 JP 2012-139164 A [Non-patent Document]
  • Non-Patent Document 1 Pure Appl. Chem. , 57, 741, 1985
  • Non-Patent Document 2 Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981
  • Non Patent Literature 3 International Journal of Systemic Bacteriology (1999), 49, 277-282.
  • Non-Patent Document 4 International Journal of Systemic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702.
  • Non-Patent Document 5 International Journal of Systemic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238.
  • An object of the present invention is to provide a mutant carotenoid-producing bacterium and a method for producing carotenoid using the bacterium.
  • a mutant carotenoid-producing bacterium comprising any of the following genes (a) to (c): (A) a protein comprising a mutant amino acid sequence in which at least the 225th amino acid residue is substituted with another amino acid residue in the amino acid sequence of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase in a carotenoid-producing bacterium (B) Gene encoding a protein comprising a mutant amino acid sequence in which at least the 305th amino acid residue is substituted with another amino acid residue in the amino acid sequence of decaprenyl diphosphate synthase in a carotenoid producing bacterium (C) The bacterium according to (1), wherein the amino acid sequences of both genes (2) 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase of (a) and (b) above are those shown in SEQ ID NO: 2.
  • the bacterium according to (6) which has acquired the production ability of at least 5 times the amount of carotenoid production of a carotenoid production bacterium that does not have a gene encoding a protein containing a mutant amino acid sequence.
  • the bacterium according to (8), wherein the bacterium belonging to the genus Paracoccus is E-396 strain.
  • a method for producing a carotenoid comprising culturing the bacterium according to any one of (1) to (10) and collecting carotenoid from the obtained culture. (12) The method according to (11), wherein the amount of carotenoid produced is at least five times the amount of carotenoid produced by a carotenoid producing bacterium that does not have a gene encoding a protein containing a mutant amino acid sequence. . (13) The method according to (11) or (12), wherein the carotenoid is astaxanthin.
  • a method for screening a carotenoid-producing bacterium comprising subjecting the carotenoid-producing bacterium to a mutation treatment and selecting a bacterium having any of the following characteristics (a) to (c) from the mutated bacterium: .
  • (b) The activity of decaprenyl diphosphate synthase is higher than that in bacteria before mutation treatment
  • C Features of both (a) and (b) above (15) Culturing bacteria selected by the method according to (14), and collecting carotenoids from the resulting culture A method for producing carotenoids.
  • a gene encoding a protein comprising a mutant amino acid sequence in which at least the 225th amino acid residue is substituted with another amino acid residue in the amino acid sequence of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase is obtained from the following DNA (a) or (b): (A) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 (B) a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (a) above under stringent conditions and encodes a protein having 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase activity (18) A gene encoding a protein comprising a mutant amino acid sequence in which at least the 305th amino acid residue is substituted with another amino acid residue in the amino acid sequence of decaprenyl diphosphate synthase.
  • a gene comprising the following DNA (a) or (b): (A) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 (B) a DNA encoding a protein that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA of (a) above under stringent conditions and has a reduced decaprenyl diphosphate synthase activity (20)
  • a recombinant vector comprising any of the following genes (a) to (c): (A) the gene according to (16) or (17) (b) the gene according to (18) or (19) (c) the gene according to (a) and (b) above (21) according to (20) A transformant containing a recombinant vector.
  • (22) A method for producing a carotenoid, comprising culturing the transformant according to (21) and collecting carotenoid from the obtained culture.
  • the present invention provides a high-producing carotenoid bacterium. By using the bacterium of the present invention, carotenoids can be produced efficiently.
  • the active site is indicated by a green box, and mutations whose activity was improved in DXS_ECOLI and DXS_VITVI are indicated by ⁇ .
  • Rhodobacter capsulatus-derived decaprenyl diphosphate synthase (PDB ID: 3MZV) is shown. It is a figure which shows alignment with the enzyme C and a template structure (3MZV). Inferred active sites are shown in green. It is a figure which shows the template structure and the model structure of the composite_body
  • FPP and IPP are indicated by Space-filling. It is a figure which shows the template structure and the model structure of the composite_body
  • the structure of the matching amino acid residue is shown in green. The substrate binding region and the surrounding structure all match.
  • a chain (light red), B chain (light blue). FPP and IPP are indicated by Space-filling.
  • Ala305 is indicated by green, and Val305 is indicated by magenta. It is a figure which shows the comparison of the intramolecular energy of a wild type (blue) and variant A305V (red). It is a figure which shows the structure comparison of a wild type and variant A305V. Due to the mutation of A305V, the structure of amino acid residues around Ala305 (green) and Val305 (magenta) changes (left). This structural change also affects adjacent ⁇ -helices (right). It is a figure which shows the influence of A305V in the enzyme C. It is a figure which shows the influence of A305V in the enzyme C. It is a figure which shows the influence of A305V in the enzyme C. It is a figure which shows the effect of the enzyme C variant guessed by an astaxanthin synthetic pathway.
  • the present invention relates to a bacterium that highly produces carotenoids, and is a bacterium containing any one of the following genes (a) and (b), or both of these genes.
  • B Gene encoding a protein comprising a mutant amino acid sequence in which at least the 305th amino acid residue is substituted with another amino acid residue in the amino acid sequence of decaprenyl diphosphate synthase in a carotenoid producing bacterium
  • the present inventor examined carotenoid-producing ability in the E-396 strain and the strain after the mutation treatment, and in these strains, an enzyme involved in the carotenoid synthesis pathway was selected. Mutations in the encoded gene were analyzed. As a result, a strain (referred to as “ASB-57 strain”) having a higher carotenoid production ability than the E-396 strain used as the parent strain was obtained. As a result of genome analysis of the ASB-57 strain, the amino acid sequence of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) and the amino acid sequence of decaprenyl diphosphate synthase (DPS) are mutated.
  • DXS 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase
  • DPS decaprenyl diphosphate synthase
  • the carotenoid-producing bacterium of the present invention is obtained by performing mutation treatment on the parent strain and using as an indicator that a mutation has occurred in the 225th amino acid residue of DXS and / or the 305th amino acid residue of DPS. It is a bacterium that can produce carotenoids with high efficiency.
  • the carotenoid producing bacterium of the present invention is referred to herein as “mutant carotenoid producing bacterium”.
  • (1) Parent strain In the present invention, the bacterium used as a parent strain for obtaining a mutant carotenoid-producing bacterium is not limited as long as it is a bacterium that produces carotenoid.
  • bacteria belonging to the genus Paracoccus, Brevundimonas, and Erythrobacter can be mentioned.
  • a bacterium belonging to the genus Paracoccus, a bacterium belonging to the genus Brevundimonas, or a bacterium belonging to the genus Erythrobacter more preferably a bacterium belonging to the genus Paracoccus is used.
  • the Paracoccus genus, the Erythrobacter genus, and the Brevundimonas genus are all classified as Proteobacteria gates and Alphaproteobacteria steels, and since there is a common bacterial taxonomy, bacteria belonging to these genera can be used in the present invention. is there.
  • Paracoccus carotifaciens Among the bacteria belonging to the genus Paracoccus, Paracoccus carotifaciens, Paracoccus marcusii, Paracoccus haundaensis, and Paracoccus zeaxanthinifaciens are preferably used, and Paracoccus carotinis is particularly preferable.
  • specific strains of bacteria belonging to the genus Paracoccus include Paracoccus carotinifaciens E-396 strain (FERM BP-4283) and Paracoccus genus bacteria A-581-1 strain (FERM BP-4671), and these mutant strains Are also preferably used in the present invention.
  • Examples of the carotenoid-producing bacteria belonging to the genus Erythrobacter include the Erythrobacter JPCC M species (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-259542), the Erythrobacter JPCC O species (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-259449), and the like.
  • Examples of the carotenoid-producing bacteria belonging to the genus Brevundimonas include Brevundimonas SD212 strain (JP 2009-27995), Brevundimonas FERM P-20515, 20516 strain (JP 2006-340676), Brevundimonas vesicularis (Gene, Vol. -108,1 Sep 2006).
  • a bacterium having a DNA sequence corresponding to 16S ribosomal RNA having high homology with the base sequence of E-396 strain described in SEQ ID NO: 9 is preferably used.
  • the homology of the base sequence mentioned here is preferably 95% or more, more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the base sequence of DNA corresponding to 16S ribosomal RNA means a base sequence in which U (uracil) in the base sequence of 16S ribosomal RNA is replaced with T (thymine).
  • the classification method of microorganisms based on the homology of the base sequence of 16S ribosomal RNA has become mainstream.
  • the conventional classification method of microorganisms is based on bacteriological properties such as conventional motility, auxotrophy, and sugar assimilation. Sometimes classified.
  • the classification method based on the homology significantly improves the classification reliability compared to the conventional classification method.
  • Paracoccus carotinifaciens E-396 16S ribosomal RNA base sequence and other carotenoid producing bacteria Paracoccus marcusii DSM 11574, Paracoccus sp. Paracoccus zeaxanthinifaciens ATCC 21588 strain and Paracoccus sp.
  • the homology with the base sequence of 16S ribosomal RNA of the PC-1 strain is 99.7%, 99.7%, 99.6%, 99.4%, 95.7%, and 95.4%, respectively. These show that they are taxonomically closely related strains. Therefore, it can be said that these strains form one group as bacteria producing carotenoids. For this reason, these strains are preferably used in the present invention and can efficiently produce carotenoids.
  • known mutant strains with improved carotenoid productivity can also be used.
  • Examples of the known mutants include strains with high astaxanthin-producing ability (JP 2001-95500), strains that selectively produce a large amount of canthaxanthin (JP 2003-304875), and zeaxanthin and ⁇ -cryptoxanthin selectively. Strains that produce a large amount (JP-A-2005-87097) and strains that selectively produce lycopene (JP-A-2005-87100).
  • the E-396 strain mentioned as an example of a carotenoid-producing bacterium used as a parent strain in the present invention is internationally deposited at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Organism Depositary (NITE-IPOD) as follows. . International Depositary Authority: National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Organism Depositary Center 2-5-8 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818 Display for identification: E-396 Accession Number: FERM BP-4283 Original deposit date: April 27, 1993
  • A-581-1 strain mentioned as another example of the carotenoid-producing bacterium used as the parent strain in the present invention has been deposited internationally with the above institution as follows. Display for identification: A-581-1 Accession Number: FERM BP-4671 Original deposit date: May 20, 1994
  • the parent strain is subjected to mutation treatment, and a mutation occurs in the 225th amino acid residue of DXS and / or the 305th amino acid residue of DPS. Can be obtained as an index.
  • the method for mutation treatment is not particularly limited as long as it induces mutation.
  • chemical methods using mutants such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) and ethyl methanesulfonate (EMS), physical methods such as ultraviolet irradiation and X-ray irradiation, genetic recombination and Biological methods such as transposon can be used.
  • the bacterium to be mutated is not particularly limited, but is preferably a carotenoid-producing bacterium.
  • a point mutation can be introduced into a gene (DNA) encoding the protein.
  • a mutation introduction kit using a site-directed mutagenesis method such as Kunkel method or Gapped duplex method, for example, QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Detected Mute.
  • the screening method of the mutant strain is not particularly limited, but gene analysis is performed using a known genome analysis tool PacBio RS II (manufactured by Pacific Biosciences), MiSeq (manufactured by Illumina), etc., and the 225th amino acid residue of DXS And / or the presence or absence of a mutation in the base sequence corresponding to the 305th amino acid residue of DPS may be confirmed. Furthermore, in parallel with the above genomic analysis, for example, in addition to a method of selecting a target mutant strain by the color of a colony on an agar medium, the mutant strain is cultured in a test tube, a flask, a fermenter, etc.
  • Carotenoid production can be selected as an index by carotenoid pigment analysis using chromatography, thin layer chromatography, or the like.
  • the mutation and screening steps may be performed once, or, for example, a mutant strain is obtained by mutation treatment and screening, and a mutant strain with improved productivity is obtained by further mutation treatment and screening. Mutation and screening steps may be repeated twice or more.
  • the 225th amino acid residue of DXS is mutated to another amino acid and / or the 305th amino acid residue of DPS is changed to another amino acid residue. It has a gene encoding a mutated amino acid sequence.
  • a mutation from the 225th amino acid residue of DXS to another amino acid contributes to an increase in the enzyme activity of DXS.
  • combination from pyruvic acid to 1-deoxy-D xylulose-5-phosphate is accelerated
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • Mutation from the 305th amino acid residue of DPS to another amino acid residue contributes to a decrease in the enzyme activity of DPS.
  • This mutation inhibits the synthesis of farnesyl diphosphate (FPP) to decaprenyl diphosphate (DPP). Since IPP is used for the synthesis from FPP to DPP, the amount of IPP used for DPP synthesis decreases due to the mutation, and the IPP is used as a substrate for the astaxanthin synthesis.
  • FPP farnesyl diphosphate
  • DPP decaprenyl diphosphate
  • the amino acid sequence in which the 225th amino acid residue of DXS is mutated to another amino acid and / or the 305th amino acid residue of DPS is mutated to another amino acid residue.
  • the mutant carotenoid-producing bacterium of the present invention can contain the following gene (a), the following gene (b), or both the following genes (a) and (b).
  • Examples of such a mutant amino acid sequence include those shown in SEQ ID NO: 6, and examples of the gene include those shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is preferably an amino acid sequence in which glycine as the 225th amino acid residue is substituted with aspartic acid.
  • the 225th amino acid residue is substituted with another amino acid residue, and one or more (for example, 1) other than the 225th amino acid residue
  • a protein having a mutant amino acid sequence in which several amino acid residues are deleted, substituted or added, and having a DXS activity iii) a gene comprising a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • a gene encoding a protein comprising a mutant amino acid sequence in which at least the 305th amino acid residue is substituted with another amino acid residue is substituted with another amino acid residue.
  • DPS amino acid sequence of DPS
  • Examples of such a mutant amino acid sequence include those shown in SEQ ID NO: 8, and examples of the gene include those shown in SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is preferably an amino acid sequence in which alanine, which is the 305th amino acid residue, is substituted with valine.
  • the amino acid sequence of DPS for example, SEQ ID NO: 4
  • the 305th amino acid residue is substituted with another amino acid residue, and one or more (for example, 1) other than the 305th amino acid residue
  • a protein comprising a mutant amino acid sequence in which several amino acid residues have been deleted, substituted or added, and having a reduced DPS activity
  • iv a gene comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 and which encodes a protein having a reduced DPS activity.
  • the base sequence represented by No. 7 is the DNA (SEQ ID No. 3) encoding the amino acid sequence of DPS in carotenoid-producing bacteria.
  • the 305th amino acid residue encodes a protein containing an amino acid sequence substituted with another amino acid residue.
  • hybridization can be performed according to a known method (for example, Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition) (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)).
  • the conditions refer to conditions in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • the sodium concentration is 10 mM to 300 mM, preferably 20 mM to 100 mM
  • the temperature is 25 ° C. to 70 ° C., preferably Means conditions at 42 ° C. to 55 ° C.
  • mutant carotenoid producing bacteria examples include ASB-57 strain, ASK-8 strain, and ASH-66 strain.
  • the ASB-57 strain encodes a protein containing an amino acid sequence in which glycine, which is the 225th amino acid residue of DXS, is mutated to aspartic acid, and alanine, which is the 305th amino acid residue of DPS, is mutated to valine.
  • glycine which is the 225th amino acid residue of DXS
  • alanine which is the 305th amino acid residue of DPS
  • a gene recombinant type is obtained by introducing a gene encoding the mutant DXS and / or a gene encoding the mutant DPS into a host for transformation.
  • the mutant carotenoid-producing bacterium can be obtained. Any known method may be adopted for the recombinant vector obtained by introducing the mutant DXS gene and / or the mutant DPS gene into the vector, and the transformant obtained by introducing the recombinant vector into the host.
  • Sambrook J. et al. et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition) (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)).
  • a DNA encoding the enzyme is designed and synthesized.
  • the design and synthesis of DNA can be performed by the PCR method using primers designed to synthesize a desired DNA region using, for example, a vector containing a full-length gene as a template.
  • a recombinant vector for protein expression is obtained by ligating the above DNA to an appropriate vector, and a transformant is obtained by introducing this recombinant vector into a host so that the target gene can be expressed (Sambrook). J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition) (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)).
  • a phage or a plasmid capable of autonomously growing in a host microorganism is used.
  • animal virus and insect virus vectors can also be used.
  • the purified DNA may be cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or the like of an appropriate vector DNA, and ligated to the vector.
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the target gene. Examples include bacteria (Bacillus subtilis, Paracoccus bacteria, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CHO cells, etc.), plant cells, insect cells or insects. Methods for introducing a recombinant vector into a host are known. Moreover, the method for introducing a mutation into a gene is the same as described above.
  • a high concentration of carotenoid can be stably produced by culturing the above carotenoid-producing bacterium or transformant in a predetermined medium.
  • Carotenoid produced is not particularly limited, for example, astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, lycopene, ⁇ -carotene, adonilvin, adonixanthin, echinenone, asteroidenone or 3-hydroxyechinenone
  • it is astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin or ⁇ -cryptoxanthin, more preferably astaxanthin or zeaxanthin.
  • One kind of carotenoid produced from the present invention may be used, or a plurality of kinds may be combined.
  • the carotenoid production medium used for the culture of the present invention can be added with any components as long as carotenoid-producing bacteria or transformants grow and produce carotenoids. Any medium containing such additives may be used, but a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and, if necessary, vitamins is preferably used.
  • Examples of the carbon source include sugars such as glucose, sucrose, lactose, fructose, trehalose, mannose, mannitol and maltose, and organic acids such as acetic acid, fumaric acid, citric acid, propionic acid, malic acid, malonic acid and pyruvic acid. , Alcohols such as ethanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, isobutanol and glycenol, and fats and oils such as soybean oil, nuka oil, olive oil, corn oil, sesame oil and linseed oil, among which glucose or Sucrose is used. Among these carbon sources, one type or two or more types can be used.
  • the amount added to the medium before culture varies depending on the type of carbon source and may be adjusted as appropriate, but is usually 1 to 100 g, preferably 2 to 50 g, per liter of the medium.
  • the carbon source is preferably added not only to the starting medium, but also to be added sequentially or continuously during the culture.
  • the nitrogen source one or more of inorganic salts such as ammonium salts such as ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, nitrates such as potassium nitrate, ammonia and urea are used.
  • the addition amount varies depending on the type of nitrogen source and may be adjusted as appropriate, but is usually 0.1 to 20 g, preferably 0.2 to 10 g, with respect to 1 L of the medium.
  • organic nitrogen sources include corn steep liquor (including filtered products), pharma media, soybean meal, soybean flour, peanut meal, soy peptone, distillers solver, dry yeast, yeast extract, casamino acid, and glutamic acid.
  • aspartic acid are used.
  • the addition concentration varies depending on the type of nitrogen source and may be adjusted as appropriate, but it is usually 0 to 80 g / L, preferably 1 to 30 g / L.
  • the inorganic nitrogen source and the organic nitrogen source are usually added to the starting medium, but it is also preferable to add them sequentially or continuously.
  • inorganic salts include phosphates such as potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and disodium hydrogen phosphate, magnesium salts such as magnesium sulfate and magnesium chloride, iron salts such as iron sulfate and iron chloride, Calcium salts such as calcium chloride and calcium carbonate, sodium salts such as sodium carbonate and sodium chloride, manganese salts such as manganese sulfate, copper salts such as copper sulfate, zinc salts such as zinc sulfate, molybdenum salts such as sodium molybdate, sulfuric acid 1 or 2 of nickel salts such as nickel, selenium salts such as sodium selenate, tungsten salts such as sodium tungstate, aluminum salts such as aluminum chloride, chromium salts such as chromium chloride, boric acid and potassium
  • the amount added varies depending on the type of inorganic salt and may be adjusted as appropriate, but is usually 0.0001 to 15 g with respect to 1 L of the medium.
  • the preferred concentration is 0.1 to 15 mg / L.
  • Inorganic salts are usually added to the starting medium, but may be additionally supplied sequentially or continuously.
  • vitamins for example, cyanocobalamin, riboflavin, pantothenic acid, pyridoxine, thiamine, ascorbic acid, folic acid, niacin, p-aminobenzoic acid, biotin, inositol, choline and the like can be used.
  • the addition ratio varies depending on the type of vitamins and may be adjusted as appropriate, but is usually 0.001 to 1000 mg, preferably 0.01 to 100 mg per 1 L of the medium. Vitamins are usually added to the starting medium, but may be added sequentially or continuously.
  • an antifoaming agent is preferably used to suppress foaming of the culture solution.
  • Any type of antifoaming agent may be used as long as it suppresses the generation of bubbles or eliminates the generated bubbles and has a small inhibitory effect on produced bacteria.
  • examples thereof include alcohol-based antifoaming agents, polyether-based antifoaming agents, ester-based antifoaming agents, fatty acid-based antifoaming agents, silicon-based antifoaming agents, and sulfonic acid-based antifoaming agents.
  • the amount added varies depending on the type of antifoaming agent and may be adjusted as appropriate, but is usually 0.01 to 10 g per 1 L of the medium.
  • Defoamer is usually added to the starting medium before sterilization. Further, it may be added continuously or intermittently during the culture.
  • a method of adding an antifoaming agent during the culture a method of automatically adding bubbles by sensing with a sensor, a method of adding at a fixed time with a program timer, a carbon source for feed, a nitrogen source in conjunction with the growth rate Or the method of mixing and adding with a pH adjuster etc. can be illustrated.
  • the antifoaming agent added to the initial culture medium and the antifoaming agent added to the culture medium during the culture may be the same, but different types may be used according to the action.
  • the initial pH of the medium is adjusted to 2 to 12, preferably 6 to 9, and more preferably 6.5 to 8.0. It is preferable to maintain the pH in the above range during the culture.
  • the pH adjuster include an aqueous sodium hydroxide solution, an aqueous potassium hydroxide solution, an aqueous sodium carbonate solution, ammonia water, ammonia gas, an aqueous sulfuric acid solution, or a mixture thereof.
  • the medium is sterilized and then used for bacterial culture. Sterilization can be appropriately performed by those skilled in the art.
  • the medium in a suitable container may be heat sterilized with an autoclave. Or what is necessary is just to sterilize by filtration with a sterilization filter.
  • the mutant carotenoid-producing bacterium or transformant of the present invention is inoculated into the medium prepared as described above and cultured under predetermined conditions. Inoculation is performed by appropriately increasing the number of strains by seed culture using a test tube, flask, or fermenter, and adding the obtained culture solution to the carotenoid production medium.
  • the medium used for seed culture is not particularly limited as long as the carotenoid-producing bacteria grow well.
  • Culture is performed in a suitable culture vessel.
  • the culture vessel can be appropriately selected depending on the culture volume, and examples thereof include a test tube, a flask, and a fermenter.
  • the culture temperature is 15 to 40 ° C., preferably 20 to 35 ° C., more preferably 25 to 32 ° C., usually 1 to 18 days, preferably 2 to 12 days, more preferably 3 to 8 days, aerobic. Cultivate under conditions. Examples of aerobic conditions include shaking culture or aeration and agitation culture, and it is preferable to control the dissolved oxygen concentration within a certain range.
  • the dissolved oxygen concentration can be controlled, for example, by changing the number of rotations of stirring, the amount of ventilation, the internal pressure, and the like.
  • the dissolved oxygen concentration is preferably controlled to 0.3 to 10 ppm, more preferably 0.5 to 7 ppm, and still more preferably 1 to 5 ppm.
  • the number of cells or the number of transformants of the carotenoid-producing bacterium after culturing the mutant carotenoid-producing bacterium or transformant of the present invention can be measured by OD.
  • quantification of carotenoids in a culture obtained by culturing carotenoid-producing bacteria or transformants, or carotenoids collected from the culture can be performed by high performance liquid chromatography. After carotenoid-producing bacteria or transformants are cultured as described above, carotenoids can be collected from the resulting culture. Examples of the culture include a culture solution, a culture supernatant, a cell concentrate, a wet cell, a dry cell, and a cell lysate.
  • the culture supernatant may be prepared by removing the cells from the culture solution by subjecting the culture solution to centrifugation or filtration.
  • the bacterial cell concentrate can be obtained by centrifugation or membrane filtration concentration of the culture solution.
  • the wet cells can be obtained by centrifuging or filtering the culture solution.
  • a dry microbial cell can be obtained by drying a wet microbial cell or a microbial cell concentrate by a general drying method.
  • the carotenoid-containing dry cells thus obtained can be used as they are as feed additives.
  • the yield during fermentation culture is at least 150 mg / L, and includes, for example, 150 mg / L, 400 mg / L, 2000 mg / L, and 4000 mg / L carotenoids.
  • the amount of carotenoid contained in the culture solution varies depending on the microbial cells used, it contains, for example, 400 mg / L to 4000 mg / L, more preferably 500 mg / L to 3500 mg / L carotenoid.
  • the bacterium of the present invention produces at least 5 times, preferably 10 times or more the amount of carotenoid produced by a carotenoid producing bacterium that does not have a gene encoding a protein containing a DXS and / or DPS mutant amino acid sequence. Have the ability.
  • the method for collecting carotenoids from the culture is not particularly limited, and any method in which carotenoids are stably and efficiently recovered may be used. Those skilled in the art can perform these methods by appropriately selecting from known extraction and purification techniques.
  • the culture can also be used as a carotenoid-containing composition. Prior to extraction, the culture is chemically treated with alkaline reagents or surfactants, biochemically treated with lytic enzymes, lipolytic enzymes, proteolytic enzymes, etc., or physically such as ultrasound or grinding. Among the processes, one or more processes may be performed.
  • the solvent used for extraction and washing is not particularly limited, but lower alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, acetone, tetrahydrofuran, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, dichloromethane, chloroform, dimethylformamide And dimethyl sulfoxide.
  • the treatment may be performed in an inert gas atmosphere such as nitrogen gas.
  • you may select the antioxidant currently used by the pharmaceutical and foodstuff, and may add to an extraction solvent. Alternatively, these processes may be combined. Further, in order to prevent the decomposition of carotenoids by light as much as possible, it may be performed under conditions where no light is applied.
  • the extract thus obtained can be used as it is as a carotenoid, and can also be used after further purification.
  • a method for separating bacteria remaining in the extract after the extraction operation is not particularly limited, and membrane filtration, centrifugation, decantation, and the like are used.
  • As a method for obtaining a carotenoid precipitate from the extract generally heating and / or vacuum concentration and crystallization are exemplified.
  • the carotenoid pigment may be separated without being concentrated by precipitation of the carotenoid pigment at a low temperature or by precipitation with an acid / alkali agent or various salts. In industrial use, it is desirable to crystallize.
  • the obtained carotenoid precipitate may be suspended and stirred using a small amount of a solvent such as a lower alcohol as necessary for washing.
  • a solvent such as a lower alcohol
  • the method of washing is not particularly limited, for example, a method of filtering after suspension and stirring, a method of passing liquid from above the precipitate, and the like are practically preferable methods.
  • the cultures, extracts or purified products obtained as described above can be used alone as carotenoids, or these can be mixed and used in an arbitrary ratio.
  • Enzyme A was presumed to be 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS).
  • DXS 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase
  • the identified amino acid mutation G225D is in the disordered region located near the active site. From the three-dimensional structure model, it is inferred that the mutation G225D of enzyme A causes a structural change similar to the mutation of the known disordered region, which is known to improve the activity of DXS, to the enzyme G225D. It was predicted that the enzyme activity was improved. Considering that DXS is controlled by feedback inhibition of IPP, it is suggested that the mutant G225D enzyme loses feedback inhibition and increases the production amount of IPP. An increase in the supply amount of IPP, which is a raw material for astaxanthin, due to the mutation G225D of enzyme A is considered to be a factor that increases the production amount of astaxanthin.
  • Enzyme C was assumed to be decaprenyl diphosphate synthase. From the three-dimensional structure model, it was inferred that the identified mutation A305V caused steric hindrance with surrounding amino acid residues and destabilized the three-dimensional structure of enzyme C.
  • FPP and IPP which are substrates for enzyme C and raw materials for decaprenyl diphosphate, are also raw materials for astaxanthin synthesis. It is suggested that the amount of FPP and IPP consumed by the enzyme C is reduced by reducing the activity of the enzyme C due to destabilization. As a result, it is considered that the amount of FPP and IPP that can be used for astaxanthin synthesis increases and the production amount of astaxanthin increases.
  • Mutation treatment of Paracoccus genus bacteria and genome analysis Mutation treatment method
  • the parent strain uses UV, NTG (nitrosoguanidine), etc. as a mutation source, and screens several times using various selection pressures. Carried out. Screening was performed using astaxanthin yield as an index.
  • Genome analysis method Genome analysis is performed by reading a genome sequence using a sequencer of PacBio RS II (manufactured by Pacific Biosciences) or MiSeq (Illumina), and then SMART Cell 8 Pac V3 (manufactured by Pacific Biosciences) or MiSeq ControlSwitter. Analysis software such as (MCS) v2.4.1.3, Real Time Analysis (RTA) v1.18.54, bc12fastq v 1.8.4 (Illumina) was used.
  • results of genome analysis (identification of mutation sites)
  • the identification of the mutation site is highly homologous between the amino acid sequence of the region considered to be a protein having the mutation point of these genome analysis results and the enzyme gene amino acid sequence listed in Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
  • KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
  • those contained in the genus Paracoccus are identified, and furthermore, by analyzing the three-dimensional structure of the enzyme from these information and searching for a template having a matching sequence, the final amino acid sequence of the protein having the mutation site is determined.
  • the enzyme name was determined.
  • test tube media for production were prepared in which 7.2 ml of the medium having the following composition was placed in a test tube with a cotton plug having an inner diameter of 18 mm.
  • the raw material of the test tube medium for production was a lot that has been confirmed to have insufficient growth of bacterial cells.
  • Three-dimensional structure data and method Three-dimensional structure models of enzymes A and C were constructed by homology modeling.
  • the software Swiss-Pdb viewer and SWISS-MODEL were used [1,2].
  • the mutant model was created with Swiss-Pdb viewer.
  • a mutate command was used, for calculation of intramolecular energy, a compute energy command was used, and for energy minimization calculation, an energy minimization command was used.
  • Production of a complex model with a substrate, detection of residues near the substrate, measurement of interatomic distances, and display of the three-dimensional structure were performed using software Waals (Altif Labs. Inc.).
  • a three-dimensional model of the low molecular weight compound was prepared by Marvin Sketch (ChemAxon Ltd.).
  • the coordinate data of the three-dimensional structure of the template structure was obtained from Protein Data Base (PDB) (http://www.rcsb.org/pdb/), which is a protein three-dimensional structure database.
  • PDB Protein Data Base
  • the template structure the data having the highest amino acid coincidence with enzyme A and enzyme C among the data registered in PDB was used.
  • the three-dimensional structure data used as a template for homology modeling is shown in Table 1.
  • the mutation G225D identified by genome analysis is in the disordered region near the active site, where multiple cases of DXS enzyme activity improving when mutation occurs have been reported. It was. From the analysis results of the mutant model, it is inferred that the mutation G225D of enzyme A causes the same structural change as the known mutation that improves the activity of DXS, and the enzyme activity of DXS is the same as that of the known mutation. Is expected to improve. As the activity of DXS increases, the amount of astaxanthin produced increases as the supply amount of IPP, the raw material for astaxanthin, increases.
  • 3D structure model of enzyme A Construction of 3D structure model of enzyme A by homology modeling 3D structure model of enzyme A is determined by X-ray crystallographic analysis of 3D structure of complex with coenzyme TPP. Based on the three-dimensional structure (PDB ID: 2O1X) [3] of 1-deoxy-D-xyrose-5-phosphate synthase (DXS, template) derived from Deinococcus radiodurans (D. radiodurans) (Fig. 2), constructed by homology modeling did.
  • PDB ID: 2O1X 1-deoxy-D-xyrose-5-phosphate synthase
  • DXS 1-deoxy-D-xyrose-5-phosphate synthase
  • FIG. 4 shows the template structure and the constructed model structure.
  • Enzyme A like the template structure, forms a homodimer and has a TPP binding site and a substrate binding site in each subunit.
  • the monomer of enzyme A is composed of three domains, domain I (1 to 319 residues), domain II (320 to 495 residues), and domain III (496 to 629 residues).
  • FIG. 5 shows the model structure of enzyme A and the substrate complex.
  • TPP Binding site of coenzyme TPP
  • TPP is located between domain I and domain II, as in the template structure, and the pyrimidine ring of TPP is linked to domain II.
  • the acid group is bound to domain I.
  • TPP is composed of an aminopyrimidine ring, a thiazoline ring, and pyrophosphate (FIG. 6).
  • the aminopyrimidine ring is bound so that it fits snugly inside the binding pocket of enzyme A.
  • the side chains of Phe396 and Ile369 are linked by a hydrophobic interaction so that the aminopyrimidine ring is sandwiched from both sides.
  • the cyclic phenyl group which is the side chain of Phe396 and the aminopyrimidine ring are presumed to be strongly bonded by ⁇ stacking.
  • the main chain oxygen of Gly120 and the side chain oxygen of Glu371 form a hydrogen bond with the nitrogen atom at the 1-position of the aminopyrimidine ring.
  • Mg is required for binding of the coenzyme TPP. It was speculated that Mg is coordinated between two phosphate groups of TPP, and the side chain of Asp151 and Asn180 and the main chain of Met182 are bonded to Mg. Regarding DXS, it is known that the sequence of GDGX25-30N is conserved as a TPP-binding motif [3]. The sequence of the amino acid sequence Gly150-Asp151-Gly152-Asn180 containing Asp151 and Asn180 in which Mg binding was estimated by enzyme A matches this motif.
  • FIG. 7 shows inferred amino acid residues involved in binding with TPP.
  • FIGS. 6, 10 and 11 respectively show the binding mode between enzyme A and coenzyme TPP, the binding mode between enzyme A and pyruvate, and the binding mode between enzyme A and glyceraldehyde triphosphate.
  • Enzyme A is a template of D.I. Since it retains an active site that binds the coenzyme TTP, the substrate pyruvate and GAP, which has been clarified in radiodurans-derived DXS, it is presumed to have DXS enzyme activity. These amino acid residues are D.I. radiodurans-derived DXS, DXS such as E. coli and S. It is known that cerevisiae-derived TK also has high conservation [3].
  • E. coli DXS has been shown to be inactivated when amino acid residues corresponding to Glu370, Arg399, and Arg479 of enzyme A are substituted with Ala [3].
  • Reference [8] shows that the enzyme activity is almost inactivated in experiments in which amino acid residues corresponding to His48, Glu371, Asp428 of enzyme A of E. coli DXS were mutated. Also in enzyme A, these amino acid residues are presumed to be important for DXS activity.
  • the enzyme G mutation G225D is present in the disordered region (196 to 238 residues) in which the three-dimensional structure could not be specified. In order to infer the influence of this mutation on the three-dimensional structure of enzyme A, the relationship between the position of the disordered region on the three-dimensional structure and the active site was examined.
  • inventions relating to mutations of K284N and R306C in Muscat and K213N and K234C in Escherichia coli are known (Special Tables 2014-500710, US20130276166).
  • the present invention relates to a method for increasing the production amount of terpene by improving the activity of DXS. In all four cases, the production amount of terpene is increased by mutation of one residue each.
  • FIG. 12 shows the positions of the mutations in which the enzyme activity increased in DXS of enzyme A, E. coli and Muscat. Muscat K284N and R306C and Escherichia coli K213N and K234C are all present in the disordered region (blue).
  • the mutation G225D of enzyme A is also present in the disordered region as well. From the amino acid sequence alignment, the active site (green) of DXS is conserved, and it is presumed that enzyme A also has the same reaction pattern as these DXS. An active site exists on the N-terminal side (agenta) of the disordered region.
  • FIG. 13 shows the position of the disordered region (residues 196 to 238) where the enzyme G mutation G225D exists.
  • This region is located near the binding site of coenzyme TPP, which is essential for DXS activity.
  • the side chain of Asn180 and the main chain of Met182 bind Mg.
  • the side chain of Ile184 is hydrophobically bound to TPP. In order for TPP and Mg essential for DXS activity to bind, it seems important that this loop has an appropriate structure.
  • FIG. 14 shows the result of mapping the electrostatic potential to the surface shape of the produced three-dimensional structure model. Blue indicates a positive (positive charge) region, and red indicates a negative (negative charge) region.
  • the mutant G225D enzyme has a weak positive charge and a strong negative charge.
  • side chains of Arg227, Arg228, Lys230, and K234 having a positive charge are gathered to form a strong positively charged region. It is considered that the positive charge in the vicinity of Asp225 was weakened by replacing Gly225 having no charge present in this region with Asp having a negative charge.
  • This result shows the same tendency as the change in the electrostatic potential of the Muscat mutation K284N shown in the literature [9], that is, the change in the electrostatic potential from the positive charge to the negative charge on the surface of the disordered region.
  • the structural change of the disordered region by G225D of enzyme A is predicted to have the same effect as the Muscat mutation on the active site including the TPP binding site, and as a result, enzyme G mutant G225D is also a Muscat mutant K284N. It is suggested that the enzyme activity increases as well.
  • enzyme A mutation G225D occurs in the disordered region of enzyme A, and this region exists in the vicinity of the TPP binding site essential for activity. Was confirmed.
  • a plurality of mutations that improve the enzyme activity of DXS have been found so far in this region, and the mutation of G225D was predicted to cause the same structural change as a known mutation that improves the activity of DXS.
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • the amount of IPP supplied is controlled by DXS, so simply increasing the enzyme activity Kcat / Km of DXS does not increase the amount of IPP supplied, and the terpene increases significantly. I can't do it.
  • the amount of terpene synthesis is increased due to mutation of the disordered region, and it is predicted that the supply amount of IPP is increased due to this mutation, that is, feedback inhibition by DXP IPP is not effective. It is suggested.
  • IPP In vitro, IPP has been shown to compete with TPP, bind to DXS and inhibit DXS [10].
  • the mutation in the disordered region causes a structural change in the TPP binding region, which not only makes the structure more suitable for TPP binding, but also affects the binding of IPP, so that the inhibition of feedback by IPP may not be effective. It is suggested.
  • the mutation G225D of enzyme A is presumed that the production amount of IPP is increased by causing a structural change in the TPP binding region and the feedback inhibition by IPP becoming ineffective. As a result, it is considered that the amount of astaxanthin synthesized is increased by increasing the supply amount of IPP as a raw material for astaxanthin synthesis (FIG. 15).
  • Construction of a three-dimensional structure model of enzyme C and analysis of mutant enzyme C is a kind of polyprenyl diphosphate synthase based on amino acid sequence homology and three-dimensional structure comparison analysis, and farnesyl diphosphate (FPP) and seven Decaprenyl diphosphate synthase: Decaprenyl diphosphate synthase that synthesizes decaprenyl diphosphate from isopentenyl diphosphate (IPP).
  • FPP farnesyl diphosphate
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • Decaprenyl diphosphate synthase has the activity to condense FPP and IPP, and repeats condensation with IPP to synthesize decaprenyl diphosphate (DPP) from FPP and seven IPPs. It is an enzyme. The enzyme reaction of decaprenyl diphosphate synthase is shown below.
  • 3D structure model of enzyme C (1) Construction of 3D structure model of enzyme C by homology modeling In order to investigate the effect of the active site and mutation of enzyme C, the amino acid matching degree is highest in the 3D structure of PDB as a template structure. (Amino acid coincidence is 76.2%), using the three-dimensional structure (PDB ID: 3MZV) of decaprenyl diphosphate synthase derived from Rhodobacter capsulatus (R. capsulatus) whose three-dimensional structure is determined by X-ray crystal structure analysis Then, a three-dimensional structure model was constructed by homology modeling (FIG. 16) [4]. Homology modeling was performed based on the three-dimensional structure alignment of enzyme C and the template structure (FIG. 17).
  • Decaprenyl diphosphate synthase of comparative enzyme C based on its three-dimensional structure belongs to the family of polyprenyl diphosphate synthases (Pfam PF00348 Polyprenyl synthetase).
  • FIG. 19 shows the substrate binding state of enzyme C.
  • the polyprenyl diphosphate synthase condenses IPP from FPP in a head-to-tail direction (herein, the phosphate group side is called head and the isoprenyl group side is called tail according to the literature [4]).
  • Various polyprenyl diphosphates are synthesized.
  • the decaprenyl diphosphate synthase continues the condensation reaction of FPP and IPPG, so that the prenyl chain is extended toward the back of the substrate binding site (indicated by an arrow on the right of FIG. 19), and C50 decaprenyl diphosphate is Synthesize.
  • Enzyme C and template R.I. capsulatus-derived decaprenyl diphosphate synthase has a high amino acid identity of 76.3% and the active site is also conserved (FIG. 17).
  • the RMSD of the three-dimensional structure by the superposition of C ⁇ is 0.063 mm, the two enzymes are very similar, and when the amino acid residue matches are displayed in different colors, the regions with different types of amino acid residues are molecules
  • the region that binds to the active site and the substrate is limited to the surface, and is composed of all matching amino acid residues (FIG. 20).
  • FIG. 22 shows the binding site between FPP and IPP in the A chain (light red).
  • FPP is bound to the tunnel-like region of the A chain, and FPP and IPP are bound in a head-to-tail form in which the phosphate group of FPP is directed to the isopentenyl group of IPP.
  • the catalytic reaction takes place between the phosphate group of FPP and the isopentenyl group of IPP in the presence of Mg.
  • This catalytic reaction requires Mg.
  • Mg binding site two known polyprenyl diphosphate synthases have two DDXDD motifs [11].
  • the coordinates of Mg are not determined, but also in enzyme C, Asp93, Asp94, Asp97 and Asp220, Asp221, Asp224 corresponding to the DDXXD motif are present in the vicinity of the phosphate group as well as the known Mg binding site. And it is speculated that these amino acid residues bind Mg (FIG. 23 bottom).
  • the inferred active sites are shown in Tables 6 to 8 in the attached material. Moreover, the figure about the coupling
  • Each amino acid residue whose binding is inferred is R.I. It is consistent with decaprenyl diphosphate synthase from capsulatus (FIG. 17).
  • the FPP binding site, IPP binding site, and Mg binding site of enzyme C are the E. coli used for preparing the substrate complex model. Since the binding site of the E. coli-derived octaprenyl diphosphate synthase is retained, it is considered that enzyme C takes the same reaction pattern as octaprenyl diphosphate synthase.
  • Arg102, Lys179, Lys244 that bind the phosphate group of FPP, and Asp93, Asp94, Asp97, Asp220, Asp221, and Asp224 that bind Mg are important residues that are directly involved in the catalytic activity of transferring the phosphate group. It appears to be.
  • amino acid residues corresponding to the enzyme C phosphate binding sites Arg102 and Arg103 and the Mg binding sites Asp94, Asp97, Asp220, Asp221 and Asp224 It has been reported that these amino acid residues are highly conserved among polyprenyl diphosphate synthases [14, 15].
  • the side chains of Phe and Gln are found to be important for substrate binding by producing a mutant of the amino acid residue corresponding to Phe216, Gln217 of enzyme C [16]. Also in the complex model of enzyme C, Phe216 and Gln217 are in the active site region and are predicted to be important for activity.
  • FIG. 26 shows a three-dimensional structure model of the wild type and mutant A305V enzyme. Wild-type Ala305 is present in the ⁇ -helix, and the side chain is packed with the amino acid residue of the adjacent ⁇ -helix by hydrophobic interaction.
  • FIG. 27 shows the structure of amino acid residues adjacent to Ala305.
  • the carbon atom of the methyl group which is the side chain of Ala305 is in contact with the peripheral amino acid residues, Tyr208, Ala211, His301, and Ala302, and the distance between the carbon atoms is less than 4.0 mm.
  • the substitution of Ala 305 with Val increases the number of side chain methyl groups by two.
  • the interatomic distances between the methyl group carbon of Val and the carbons of Tyr208 and Ala211 were 2.42 mm and 2.47 mm.
  • the lower limit of the contact distance due to the non-covalent bond between carbons is 2.9 mm. Since the distance between carbon atoms measured with Val305 is less than this value, it is considered that these carbon atoms collide and steric hindrance with surrounding amino acid residues occurs. In the display by Space-filling, the distance between atoms is shorter than the van der Waals radius, and it can be confirmed that the atoms collide. Based on the above, it is predicted that the mutation of A305V causes steric hindrance of enzyme C due to atom collision, leading to destabilization of the steric structure.
  • the mutant A305V enzyme increases the intramolecular energy of -16,295 (KJ / mol) and mutant A305V by 9.02%, and the structure It was confirmed that it became unstable. This increase in intramolecular energy is particularly observed in each amino acid residue of Tyr208, Ala211 and Val305, and it is considered that these amino acid residues are caused to collide due to the increase in intramolecular energy.
  • FIG. 28 shows a comparison of the intramolecular energy of enzyme C wild type and mutant A305V.
  • the ⁇ helix adjacent to the mutation A305V has active sites (Phe216, Gln217, Asp220) that bind to substrates IPP and Mg. It is considered that the amino acid residue in the active site cannot take its original position due to the structural change in the main chain structure of the ⁇ helix that forms the basis of the active site, and as a result, substrate binding and activity itself may be affected (FIG. 29). right).
  • FIG. 29 shows the structure around Ala305 and Val305 of mutant A305V after calculation of wild type and energy minimization
  • FIGS. 30, 31, and 32 show the structural changes of mutant A305V.
  • Decaprenyl diphosphate synthase is one of the enzymes of the coenzyme C10 (CoQ10) synthesis pathway. It has been revealed that decaprenyl diphosphate synthase derived from Paracoccus zeaxanthinifaciens or Paracoccus denitrificans confirmed to have high homology with enzyme C is an enzyme necessary for the production of CoQ10 [Japanese Patent Laid-Open No. 2005]. 211020, Special Table 2006-517794].
  • FPP and IPP which are substrates of decaprenyl diphosphate synthase, are also substrates of CrtE of the geranyl-geranyl pyrophosphate (GGPP) synthase of the astaxanthin synthesis pathway. Therefore, in normal Paracoccus cells, it is considered that decaprenyl diphosphate synthase and CrtE use the substrates FPP and IPP together.
  • GGPP geranyl-geranyl pyrophosphate
  • enzyme C reduces the activity of enzyme C by destabilizing the three-dimensional structure of the molecule. If the activity of enzyme C decreases, the amount of FPP and IPP used as substrates also decreases, and as a result, the amount of FPP and IPP that can be used in the astaxanthin synthesis pathway increases.
  • CrtE synthesizes one molecule of GGPP from one molecule of FPP and one molecule of IPP.
  • enzyme C requires one molecule of FPP and seven molecules of IPP to synthesize one molecule of decaprenyl diphosphate.
  • enzyme C consumes 7 times as much IPP as CrtE in one reaction. For this reason, reducing the activity of enzyme C is considered to be extremely effective in increasing IPP supplied to the astaxanthin synthesis pathway.
  • SWISS-MODEL modeling protein tertiary and quadrature structure using evolutionary information. Biasini M, Bienert S, Waterhouse A, Arnold K, Studer G, Schmidt T, Kiefer F, Cassario TG, Bertoni M, Bordoli L, Schweded T. Nucleic Acids Res. 2014; 42: W252-8. 2. Automated comparative protein structure modeling with SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer: A historical perspective. Guex, N.M. Peitsch, M .; C. , Schwede, T .; Electrophoresis, (2009). 30 (S1), S162-S173. 3.
  • Yeast farnesyl-diphosphate synthase site-directed mutations of residues in high constrained predominant domains I and II.
  • Song L1 Polter CD. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 12; 91 (8): 3044-8. 16.

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Abstract

以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの遺伝子を含む、変異型カロテノイド産生細菌。　（ａ）カロテノイド産生細菌における１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子　（ｂ）カロテノイド産生細菌におけるデカプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子　（ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）の両方の遺伝子

Description

カロテノイドの製造方法
　本発明は、カロテノイド産生細菌の変異株を用いたカロテノイドの製造方法に関する。
　カロテノイドは、飼料添加物、食品添加物、医薬品等として使用される有用な天然色素である。カロテノイドには、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、アドニルビン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノン及び３−ヒドロキシエキネノンなどが含まれる。中でも、アスタキサンチンは養殖魚であるサケ、マス、マダイ等の体色改善剤、家禽類の卵黄色改善剤等の飼料添加物として有用である。また、天然のアスタキサンチンは安全な食品添加物や健康食品素材として産業上の価値が高い。アドニキサンチン及びアドニルビンは、アスタキサンチンと同様に飼料添加物、食品添加物、医薬品等としての用途が期待されている。
　さらに、β−カロテンは飼料添加物、食品添加物、医薬品等として使用され、カンタキサンチンは飼料添加物、食品添加物、化粧品等として使用され、ゼアキサンチンは食品添加物、飼料添加物等として使用されている。さらにリコペン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン等も飼料添加物、食品素材等としての使用が期待される。これらカロテノイドの製造方法としては、化学合成法、天然物からの抽出法、微生物の培養による産生方法などが知られている。
　アスタキサンチンの化学合成法としては、β−カロテンの変換による方法（Ｐｕｒｅ　Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，５７，７４１，１９８５（非特許文献１））及びＣ１５ホスホニウム塩から合成する方法（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，６４，２４３６，１９８１（非特許文献２））が知られている。天然物からの抽出法として、アスタキサンチンはサケ、マダイ等の魚類及びエビ、カニ、オキアミ等の甲殻類に存在するため、これらより抽出して採取することも可能である。
　微生物によるカロテノイドの生産方法としては、緑藻類Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓによる培養法（特開２００７−９７５８４号公報（特許文献１））、赤色酵母Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａによる発酵法（特開平１１−６９９６９号公報（特許文献２））、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌（以下、「Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属細菌」ともいう）による発酵法、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ属に属する細菌による発酵法（特開２００６−３４０６７６号公報（特許文献３））、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌による発酵法（特開２００８−２５９４４９号公報（特許文献４））が報告されている。カロテノイドを生産するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属細菌の例としては、Ｅ−３９６株及びＡ−５８１−１株が挙げられる（特開平７−７９７９６号公報（特許文献５））及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９９），４９，２７７−２８２（非特許文献３））。他のカロテノイド生産性のＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌としては、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｍａｒｃｕｓｉｉ　ＭＨ１株（特表２００１−５１２０３０号公報（特許文献６））、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｈａｅｕｎｄａｅｎｓｉｓ　ＢＣ７４１７１株（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００４），５４，１６９９−１７０２（非特許文献４））、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属細菌Ｎ−８１１０６株（特開２００７−２４４２０５号公報（特許文献７））、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００３），５３，２３１−２３８（非特許文献５））及びＰａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＰＣ−１株（ＷＯ２００５／１１８８１２号パンフレット（特許文献８））などが挙げられる。
　しかしながら、前述のカロテノイドの製造方法にはいくつかの解決課題があった。例えば、化学合成法で製造したカロテノイドは、安全であっても消費者に好ましくない印象を与える。天然物から抽出したカロテノイドは化学合成法に比べて製造コストが格段に高い。微生物による製造のうち、緑藻類や酵母の培養による産生は生産性が低いうえにこれらの微生物は強固な細胞壁を持ち、これにより培養物からのカロテノイドの抽出が困難である。
　一方、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌によるカロテノイドの製造では、当該菌体の増殖速度が速い、カロテノイドの生産性が高い、培養物からのカロテノイドの抽出が容易であるなどの利点を有し、いくつかの培養方法及び製造方法が報告されている。
　例えば、特開２００７−１４３４９２号公報（特許文献９）は培養中に鉄塩を添加する方法、ＷＯ２０１０／０４４４６９号パンフレット（特許文献１０）は培地にアミノ酸を添加する方法、特開２０１１−１８８７９５号公報（特許文献１１）は培地にビオチンを添加する方法、また、特開２０１２−１３９１６４号公報（特許文献１２）は培地に３．６ｍＭ以上となるようにカルシウム化合物を添加する方法を開示する。
　しかし、カロテノイドを産生する細菌において、どの遺伝子が生産効率の上昇に寄与すのかについて、その詳細は不明であった。
［先行技術文献］
［特許文献１］特開２００７−９７５８４号公報
［特許文献２］特開平１１−６９９６９号公報
［特許文献３］特開２００６−３４０６７６号公報
［特許文献４］特開２００８−２５９４４９号公報
［特許文献５］特開平７−７９７９６号公報
［特許文献６］特表２００１−５１２０３０号公報
［特許文献７］特開２００７−２４４２０５号公報
［特許文献８］ＷＯ２００５／１１８８１２号パンフレット
［特許文献９］特開２００７−１４３４９２号公報
［特許文献１０］ＷＯ２０１０／０４４４６９号パンフレット
［特許文献１１］特開２０１１−１８８７９５号公報
［特許文献１２］特開２０１２−１３９１６４号公報
［非特許文献］
［非特許文献１］Ｐｕｒｅ　Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，５７，７４１，１９８５
［非特許文献２］Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，６４，２４３６，１９８１
［非特許文献３］Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９９），４９，２７７−２８２
［非特許文献４］Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００４），５４，１６９９−１７０２
［非特許文献５］Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００３），５３，２３１−２３８
　本発明は、変異型カロテノイド産生細菌、及び当該細菌を用いたカロテノイドの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、変異処理された細菌のうちアスタキサンチンを高生産する細菌を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
（１）以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの遺伝子を含む、変異型カロテノイド産生細菌。
　（ａ）カロテノイド産生細菌における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子
　（ｂ）カロテノイド産生細菌におけるデカプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子
　（ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）の両方の遺伝子
（２）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素のアミノ酸配列が配列番号２に示されるものである（１）に記載の細菌。
（３）第２２５番目のアミノ酸残基が、グリシンからアスパラギン酸に置換された、（１）又は（２）に記載の細菌。
（４）デカプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列が配列番号４に示されるものである（１）~（３）のいずれか１項に記載の細菌。
（５）第３０５番目のアミノ酸残基が、アラニンからバリンに置換された、（１）~（４）のいずれか１項に記載の細菌。
（６）変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を有さないカロテノイド産生細菌のカロテノイド産生能よりも高い産生能を獲得した、（１）~（５）のいずれか１項に記載の細菌。
（７）変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を有さないカロテノイド産生細菌のカロテノイド産生量よりも少なくとも５倍以上の量の産生能を獲得した、（６）に記載の細菌。
（８）カロテノイド産生細菌がパラコッカス属に属するものである（１）~（７）のいずれか１項に記載の細菌。
（９）パラコッカス属に属する細菌がＥ−３９６株である（８）に記載の細菌。
（１０）カロテノイドがアスタキサンチンである（１）~（９）のいずれか１項に記載の細菌。
（１１）　（１）~（１０）のいずれか１項に記載の細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを特徴とするカロテノイドの製造方法。
（１２）カロテノイドの産生量が、変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を有さないカロテノイド産生細菌のカロテノイド産生量よりも少なくとも５倍以上の産生量である、（１１）に記載の方法。
（１３）カロテノイドがアスタキサンチンである（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１４）カロテノイド産生細菌に変異処理を施し、変異処理された細菌から以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの特徴を有する細菌を選択することを特徴とする、カロテノイド産生細菌のスクリーニング方法。
　（ａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素の活性が変異処理前の細菌における活性よりも上昇した特徴
　（ｂ）デカプレニル二リン酸合成酵素の活性が変異処理前の細菌における活性よりも低下した特徴
　（ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）の両方の特徴
（１５）　（１４）に記載の方法により選択された細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを特徴とするカロテノイドの製造方法。
（１６）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子。
（１７）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
　（ａ）配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡ
　（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（１８）デカプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子。
（１９）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
　（ａ）配列番号７で表される塩基配列を含むＤＮＡ
　（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性が低下したタンパク質をコードするＤＮＡ
（２０）以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
　（ａ）　（１６）又は（１７）に記載の遺伝子
　（ｂ）　（１８）又は（１９）に記載の遺伝子
　（ｃ）　上記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子
　（２１）　（２０）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（２２）　（２１）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを特徴とするカロテノイドの製造方法。
　本発明により、カロテノイドの高生産細菌が提供される。本発明の細菌を用いることにより、効率的にカロテノイドを製造することが可能となった。
Ｅ−３９６株及びＡＳＢ−５７株における総カロテノイド及びアスタキサンチンの比生産性を示す図である。 酵素Ａのテンプレート構造を示す図である。 酵素Ａとテンプレート構造（２０１Ｘ）とのアライメントを示す図である。推察された活性部位を緑で示す。ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域を青のバーで示す。 酵素Ａとテンプレート構造（２０１Ｘ）とのアライメントを示す図である。推察された活性部位を緑で示す。ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域を青のバーで示す。 テンプレート構造と酵素Ａと補酵素ＴＰＰ複合体のモデル構造を示す図である。テンプレートのＤ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素（ＤＸＳ）とＴＰＰ複合体の構造（２０１Ｘ）（左）と構築した酵素Ａのモデル構造（右）。ホモ二量体を形成し、各サブユニットがＴＰＰとＭｇを結合している。ＴＰＰ及ひＭｇをＳｐａｃｅ−ｆｉｌｌｉｎｇで示す。 酵素ＡとＴＰＰ中間体及び基質との複合体のモデル構造を示す図である。構築した酵素Ａに、補酵素ＴＰＰにピルビン酸が付加したヒドロキシエチル−ＴＰＰ中間体とグリセルアルデヒド３リン酸（ＧＡＰ）が結合した複合体モデルを示す。 酵素Ａと補酵素ＴＰＰとの相互作用を示す図である。 酵素ＡでＴＰＰとの相互作用が推測されるアミノ酸残基を示す図である。ＴＰＰとの相互作用が推測された残基をＳｔｉｃｋｓで示す。 酵素Ａとヒドロキシエチル−ＴＰＰ中間体のヒドロキシエチル基との相互作用が推測されるアミノ酸残基を示す図である。ヒドロキシエチル基との相互作用が推測された残基をＳｔｉｃｋｓで示す。 酵素Ａとグリセルアルデヒド３リン酸（ＧＡＰ）との相互作用が推測されるアミノ酸残基を示す図である。 酵素Ａと基質ピルビン酸との相互作用を示す図である。 酵素Ａと基質グリセルアルデヒド３リン酸との相互作用を示す図である。 酵素Ａと他種ＤＸＳとのアライメントを示す図である。ＥｎｚｙｍｅＡ：酵素Ａ，ＤＸＳ＿ＥＣＯＬＩ：ＤＸＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ），ＤＸＳ＿ＶＩＴＶＩ：ＤＸＳ（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ），ＤＸＳ＿ＤＥＩＲＡ：（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）。テンプレート構造（ＤＸＳ＿ＤＥＩＲＡ）のｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域を青のバーで示す。活性部位を緑ボックスで、ＤＸＳ＿ＥＣＯＬＩ及びＤＸＳ＿ＶＩＴＶＩで活性向上が見られた変異を▲で示す。 酵素Ａのｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域の位置を示す図である。ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域（青の点線）のＮ末端側のループのＡｓｎ１８０，Ｍｅｔ１８２はＭｇと結合し、Ｉｌｅ１８４はＴＰＰと結合する。 酵素Ａのｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域のモデル構造を示す図である。酵素Ａにおけるｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域（水色）のモデル構造（左）とｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域のモデル構造の静電ポテンシャルマップ（右）。 アスタキサンチン合成経路で推察される酵素Ａ変異体の効果を示す図である。 酵素Ｃのテンプレート構造を示す図である。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来デカプレニル二リン酸合成酵素（ＰＤＢ　ＩＤ：３ＭＺＶ）を示す。 酵素Ｃとテンプレート構造（３ＭＺＶ）とのアライメントを示す図である。推察された活性部位を緑で示す。 テンプレート構造、並びに酵素ＣとＩＰＰ及びＦＰＰとの複合体のモデル構造を示す図である。テンプレートのＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来デカプレニル二リン酸合成酵素（３ＭＺＶ）（左）と構築した酵素Ｃのモデル構造（右）。ＦＰＰ及びＩＰＰをＳｐａｃｅ−ｆｉｌｌｉｎｇで示す。 テンプレート構造、並びに酵素ＣとＩＰＰ及びＦＰＰとの複合体のモデル構造を示す図である。ＦＰＰとＩＰＰはｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌの向きで結合し、縮合反応はＩＰＰのイソペンテニル基とＦＰＰのリン酸基の間（左図、矢印）で起こる。長鎖プレニルニリン酸合成酵素では、反応生成物はさらにＩＰＰと結合し、基質結合部位の奥へ（右図、矢印）と伸長する。 テンプレート構造と酵素Ｃのモデル構造の比較を示す図である。テンプレートＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来デカプレニル二リン酸合成酵素（左）と酵素Ｃ（右）の基質複合体モデル。一致するアミノ酸残基の構造をｇｒｅｅｎで示す。基質結合領域とその周辺の構造は全て一致している。 酵素Ｃとデカプレニル二リン酸合成酵素（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）のアライメントを示す図である。 酵素ＣとＦＰＰ及びＩＰＰとの複合体モデルを示す図である。リボン表示（左）と表面形状（右）。Ａ鎖（ｌｉｇｈｔ　ｒｅｄ）、Ｂ鎖（ｌｉｇｈｔ　ｂｌｕｅ）で示す。ＦＰＰとＩＰＰをＳｐａｃｅ−ｆｉｌｌｉｎｇで示す。 酵素ＣでＦＰＰ（上）、ＩＰＰ（中）、Ｍｇ（下）との相互作用が推測されるアミノ酸残基を示す図である。 酵素Ａと基質ＦＰＰ及びＩＰＰとの相互作用を示す図である。 酵素ＡとＭｇとの相互作用を示す図である。 酵素Ｃの野生型と変異体Ａ３０５Ｖの立体構造モデルを示す図である。Ａｌａ３０５（ｇｒｅｅｎ）及びＶａ１３０５（ｍａｇｅｎｔａ）をｓｐａｃｅ−ｆｉｌｌｉｎｇで示す。 野生型のＡｌａ３０５（左）と変異体のＶａｌ３０５（右）の周辺の構造を示す図である。Ａｌａ３０５は、周辺のアミノ酸残基と接している。Ｖａｌ３０５への変異により、周辺の構造と立体障害を起こす。Ａｌａ３０５をｇｒｅｅｎで、Ｖａｌ３０５をｍａｇｅｎｔａで示す。 野生型（青）と変異体Ａ３０５Ｖ（赤）の分子内エネルギーの比較を示す図である。 野生型と変異体Ａ３０５Ｖの構造比較を示す図である。Ａ３０５Ｖの変異により、Ａｌａ３０５（緑）とＶａｌ３０５（マゼンタ）の周辺のアミノ酸残基の構造が変化する（左）。この構造変化は、隣接するαヘリックスにも影響する（右）。 酵素ＣにおけるＡ３０５Ｖの影響を示す図である。 酵素ＣにおけるＡ３０５Ｖの影響を示す図である。 酵素ＣにおけるＡ３０５Ｖの影響を示す図である。 アスタキサンチン合成経路で推察される酵素Ｃ変異体の効果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
　本発明は、カロテノイドを高生産する細菌に関するものであり、以下の（ａ）及び（ｂ）のいずれかの遺伝子、又はこれらの両遺伝子を含む細菌である。
　（ａ）カロテノイド産生細菌における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子
　（ｂ）カロテノイド産生細菌におけるデカプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子
　本発明者は、カロテノイドの生産能が高い細菌を開発するため、Ｅ−３９６株及びその変異処理後の株におけるカロテノイド産生能を検討するとともに、これらの株において、カロテノイド合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の変異を解析した。
　その結果、親株として使用したＥ−３９６株よりも高いカロテノイド産生能を有する株（「ＡＳＢ−５７株」という。）を取得した。ＡＳＢ−５７株のゲノム解析を行った結果、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素（ＤＸＳ）のアミノ酸配列、及びデカプレニル二リン酸合成酵素（ＤＰＳ）のアミノ酸配列に変異が生じていることが確認された。そこで、アミノ酸立体構造解析により予測される機能解析を行い、少なくとも、ＤＸＳの第２２５番目のアミノ酸残基及び／又はＤＰＳの第３０５番目のアミノ酸残基に変異が生じていることが、カロテノイドの高生産に寄与するものと考えられた。
　本発明は、上記知見に基づいて完成されたものである。
２．変異型カロテノイド産生細菌
　本発明のカロテノイド産生細菌は、親株を変異処理し、ＤＸＳの第２２５番目のアミノ酸残基及び／又はＤＰＳの第３０５番目のアミノ酸残基に変異が生じたことを指標として得られる変異型細菌であって、カロテノイドを高効率で産生することができる細菌である。本発明のカロテノイド産生細菌を、本明細書において「変異型カロテノイド産生細菌」という。
（１）親株
　本発明において、変異型カロテノイド産生細菌を得るための親株として用いる細菌としては、カロテノイドを産生する細菌であれば何ら限定されず、例えばＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ属、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌が挙げられる。
　好ましくはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ属に属する細菌又はＥｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌が用いられ、より好ましくはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌が用いられる。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属及びＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ属は、いずれもＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ鋼に分類され、細菌分類学上の共通性があるため、本発明においては、これらの属に属する細菌を使用することが可能である。
　Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌の中では、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｍａｒｃｕｓｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｈａｅｕｎｄａｅｎｓｉｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓが好ましく用いられ、特にＰａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓが好ましく用いられる。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌の具体的な菌株の例として、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ　Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４２８３）及びＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属細菌Ａ−５８１−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４６７１）が挙げられ、これらの変異株も本発明に好ましく用いられる。
　Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属するカロテノイド産生細菌としては、例えばＥｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ＪＰＣＣ　Ｍ種（特開２００８−２５９４５２）、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ＪＰＣＣ　Ｏ種（特開２００８−２５９４４９）などが挙げられる。
　Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ属に属するカロテノイド産生細菌としては、例えばＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ　ＳＤ２１２株（特開２００９−２７９９５）、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ　ＦＥＲＭ　Ｐ−２０５１５，２０５１６株（特開２００６−３４０６７６）、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ　ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ（Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．３７９，ｐ．１０１−１０８，１　Ｓｅｐ　２００６）などが挙げられる。
　また、カロテノイド産生細菌として、好ましくは１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号９に記載されるＥ−３９６株の塩基配列と高い相同性を有する細菌が用いられる。ここで言う塩基配列の相同性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列とは、１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列中のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置き換えた塩基配列を意味する。
　この１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列の相同性に基づいた微生物の分類法は、近年主流になっている。従来の微生物の分類法は、従来の運動性、栄養要求性、糖の資化性など菌学的性質に基づいているため、自然突然変異による形質の変化等が生じた場合に、微生物を誤って分類する場合があった。これに対し、１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列は極めて遺伝的に安定であるので、その相同性に基づく分類法は従来の分類法に比べて分類の信頼度が格段に向上する。
　Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ　Ｅ−３９６株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列と、他のカロテノイド産生細菌Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｍａｒｃｕｓｉｉ　ＤＳＭ　１１５７４株、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属細菌Ｎ−８１１０６株、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｈａｅｕｎｄａｅｎｓｉｓ　ＢＣ　７４１７１株、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属細菌　Ａ−５８１−１株、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ　ＡＴＣＣ　２１５８８株、及びＰａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＰＣ−１株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列との相同性は、それぞれ９９．７％、９９．７％、９９．６％、９９．４％、９５．７％、及び９５．４％であり、これらは分類学上極めて近縁な菌株であることが分かる。よって、これらの菌株はカロテノイドを産生する細菌として一つのグループを形成しているといえる。このため、これらの菌株は本発明に好ましく用いられ、カロテノイドを効率的に産生することができる。
　本発明において、カロテノイドの生産性が改良された公知の変異株も用いることができる。当該公知変異株の例としては、アスタキサンチン生産能の高い菌株（特開２００１−９５５００）、カンタキサンチンを選択的に多く産生する菌株（特開２００３−３０４８７５）、ゼアキサンチンとβ−クリプトキサンチンを選択的に多く産生する菌株（特開２００５−８７０９７）、リコペンを選択的に産生する菌株（特開２００５−８７１００）を挙げることができる。
　本発明に親株として使用するカロテノイド産生細菌の例として挙げられるＥ−３９６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に以下のとおり国際寄託されている。
　国際寄託当局：独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許生物寄託センター
　〒２９２−０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
　識別のための表示：Ｅ−３９６
　受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−４２８３
　原寄託日：平成５年（１９９３年）４月２７日
　また、本発明に親株として使用するカロテノイド産生細菌の他の例として挙げられるＡ−５８１−１株は、上記機関に以下のとおり国際寄託されている。
　識別のための表示：Ａ−５８１−１
　受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−４６７１
　原寄託日：平成６年（１９９４年）５月２０日
（２）変異処理及びスクリーニング
　本発明の変異型カロテノイド産生細菌は、前記親株に変異処理を施し、ＤＸＳの第２２５番目のアミノ酸残基及び／又はＤＰＳの第３０５番目のアミノ酸残基に変異が生じたことを指標として得ることができる。
　変異処理する方法は変異を誘発するものであれば特に限定されない。例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）及びエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）などの変異剤による化学的方法、紫外線照射及びＸ線照射などの物理的方法、遺伝子組換え及びトランスポゾンなどによる生物学的方法などを用いることができる。変異処理される細菌は特に限定されないが、カロテノイド産生細菌であることが好ましい。
　また、本発明においては、上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）に点突然変異を導入することができる。その変異導入方法として、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
　変異株のスクリーニング方法は特に限定されないが、公知のゲノム解析ツールＰａｃＢｉｏ　ＲＳ　ＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社社製）などを用いて遺伝子解析し、ＤＸＳの第２２５番目のアミノ酸残基及び／又はＤＰＳの第３０５番目のアミノ酸残基に対応する塩基配列の変異の有無を確認すればよい。
　さらに、上記ゲノム解析と並行して、例えば、寒天培地上のコロニーの色調で目的の変異株を選択する方法の他、試験管、フラスコ、発酵槽などで変異株を培養し、吸光度、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどを利用したカロテノイド色素分析により、カロテノイドの生産量を指標として選択することもできる。
　変異及びスクリーニングの工程は１回でもよいし、また、例えば突然変異処理とスクリーニングにより変異株を得て、これをさらに変異処理とスクリーニングにより生産性の改良された変異株を取得するというように、変異及びスクリーニング工程を２回以上繰り返してもよい。
　このようにしてスクリーニングされた変異型カロテノイド産生細菌は、ＤＸＳの第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸に変異し、及び／又はＤＰＳの第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する。
　ＤＸＳの第２２５番目のアミノ酸残基から他のアミノ酸への変異は、ＤＸＳの酵素活性の上昇に寄与する。これにより、ピルビン酸から１−デオキシ−Ｄキシルロース−５−リン酸への合成を促進し、ひいてはアスタキサンチン合成の基質となるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の生産が上昇する。
　ＤＰＳの第３０５番目のアミノ酸残基から他のアミノ酸残基への変異は、ＤＰＳの酵素活性の低下に寄与する。この変異はファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からデカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）への合成を抑制する。ＦＰＰからＤＰＰへの合成にはＩＰＰが使用されることから、上記変異により、ＤＰＰ合成に使用されるＩＰＰの量が減少し、当該ＩＰＰは前記のアスタキサンチン合成の基質として利用される。
　ここで、本発明においては、ＤＸＳの第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸に変異し、及び／又はＤＰＳの第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列であって、これらのＤＸＳ活性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又はＤＰＳ活性が低下（抑制）されたアミノ酸配列を含むタンパク質コードする遺伝子を有する限り、当該ＤＸＳ及び／又はＤＰＳのアミノ酸配列の他の領域のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基に置換、欠失又は付加等の変異が生じてもよい。
　従って、本願発明の変異型カロテノイド産生細菌は、以下の（ａ）の遺伝子、以下の（ｂ）の遺伝子、又は以下の（ａ）及び（ｂ）の遺伝子の両者を含むことができる。
　（ａ）カロテノイド産生細菌におけるＤＸＳのアミノ酸配列において、少なくとも第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子
　上記変異型ＤＸＳ遺伝子としては、例えば以下のものが挙げられる。
　（ｉ）ＤＸＳのアミノ酸配列（例えば配列番号２）のうち第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含み、かつＤＸＳ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
　このような変異型アミノ酸配列として、配列番号６に示すものが挙げられ、上記遺伝子として、配列番号５に示されるものが挙げられる。本発明においては、配列番号２に示すアミノ酸配列において、第２２５番目のアミノ酸残基であるグリシンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列であることが好ましい。
　（ｉｉ）ＤＸＳのアミノ酸配列（例えば配列番号２）のうち第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されるとともに、当該第２２５番目のアミノ酸残基以外の１若しくは複数（例えば１~数個）のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加された変異型アミノ酸配列を含み、かつＤＸＳ活性を有するタンパク質
　（ｉｉｉ）配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡからなる遺伝子
　（ｉｖ）配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＸＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
　上記配列番号５で表される塩基配列は、カロテノイド産生細菌におけるＤＸＳのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号１）において、第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである。
　（ｂ）カロテノイド産生細菌におけるＤＰＳのアミノ酸配列において、少なくとも第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子
　このような遺伝子としては、例えば以下のものが挙げられる。
　（ｉ）ＤＰＳのアミノ酸配列（例えば配列番号４）のうち第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含み、かつＤＰＳ活性が低下したタンパク質をコードする遺伝子
　このような変異型アミノ酸配列として、配列番号８に示すものが挙げられ、上記遺伝子として、配列番号７に示されるものが挙げられる。本発明においては、配列番号４に示すアミノ酸配列において、第３０５番目のアミノ酸残基であるアラニンがバリンに置換されたアミノ酸配列であることが好ましい。
　（ｉｉ）ＤＰＳのアミノ酸配列（例えば配列番号４）のうち第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されるとともに、当該第３０５番目のアミノ酸残基以外の１若しくは複数（例えば１~数個）のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加された変異型アミノ酸配列を含み、かつＤＰＳ活性が低下したタンパク質
　（ｉｉｉ）配列番号７で表される塩基配列を含むＤＮＡからなる遺伝子
　（ｉｖ）配列番号７で表される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＰＳ活性が低下したタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
　上記配列番号７で表される塩基配列は、カロテノイド産生細菌におけるＤＰＳのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号３）において、第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである。
　ここで、ハイブリダイゼーションは、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））に従って行うことができる。高ストリンジェントな条件は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が１０ｍＭ~３００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ~１００ｍＭであり、温度が２５℃~７０℃、好ましくは４２℃~５５℃での条件をいう。
　このような変異型カロテノイド産生細菌として、例えばＡＳＢ−５７株、ＡＳＫ−８株、ＡＳＨ−６６株などが挙げられる。
　ＡＳＢ−５７株は、ＤＸＳの第２２５番目のアミノ酸残基であるグリシンがアスパラギン酸に変異し、ＤＰＳの第３０５番目のアミノ酸残基であるアラニンがバリンに変異したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を有する。ＡＳＢ−５７株においてＤＸＳのアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号６、５に示す。また、ＡＳＢ−５７株においてＤＰＳのアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号８、７に示す。
（４）遺伝子組み換え体の作製
　本発明においては、上記変異型ＤＸＳをコードする遺伝子、及び／又は上記変異型ＤＰＳをコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換を行うことにより、遺伝子組換え型の変異型カロテノイド産生細菌を得ることができる。
　変異型ＤＸＳ遺伝子及び／又は変異型ＤＰＳ遺伝子をベクターに導入して得られる組換えベクター、並びに当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体は、任意の公知方法を採用すればよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に従って行うことができる。
　上記ＤＸＳ遺伝子及びＤＰＳ遺伝子を遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該酵素ををコードするＤＮＡを設計し合成する。ＤＮＡの設計及び合成は、例えば、全長の遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。
　ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（枯草菌、パラコッカス属細菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、植物細胞、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
　また、遺伝子への変異の導入方法は、前記と同様である。
（３）カロテノイドの生産
　本発明において、上記のカロテノイド産生細菌又は形質転換体を所定の培地で培養することにより、高濃度のカロテノイドを安定的に生産させることができる。
　産生されるカロテノイドは特に限定されないが、例えば、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、アドニルビン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノン又は３−ヒドロキシエキネノンであり、好ましくは、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン又はβ−クリプトキサンチンであり、より好ましくは、アスタキサンチン又はゼアキサンチンである。本発明より製造されるカロテノイドは一種でもよいし、複数種が組み合わされていてもよい。
　本発明の変異型カロテノイド産生細菌又は形質転換体を培養する方法を以下に説明する。
　本発明の培養に用いるカロテノイド生産用培地は、カロテノイド産生細菌又は形質転換体が生育し、カロテノイドを生産するものであるならば任意の成分を添加することができる。そのような添加物を含有する培地は何れでもよいが、炭素源、窒素源、無機塩類及び必要に応じてビタミン類などを含有する培地が好ましく用いられる。
　炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール及びマルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸及びピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール及びグリセノール等のアルコール類、大豆油、ヌカ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油及びアマニ油等の油脂類などが挙げられ、中でも好ましくはグルコース又はシュークロースが用いられる。これらの炭素源の中、１種又は２種以上を用いることができる。培養前の培地（始発培地）に添加する量は炭素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌ当たり１~１００ｇ、好ましくは２~５０ｇである。また、炭素源は始発培地に添加するだけでなく、培養途中に逐次的又は連続的に追加供給することも好ましく行われる。
　窒素源としては、無機塩として、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類、硝酸カリウムなどの硝酸塩類、アンモニア及び尿素等の中、１種又は２種以上が用いられる。添加量は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．１ｇ~２０ｇ、好ましくは０．２~１０ｇである。
　また、有機窒素源としては、例えば、コーンスティープリカー（ろ過処理物を含む）、ファーマメディア、大豆粕、大豆粉、ピーナッツミール、ソイペプトン、ディスティラーズソルブル、乾燥酵母、酵母エキス、カザミノ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸などの中、１種又は２種以上が用いられる。添加濃度は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、０~８０ｇ／Ｌ、好ましくは１~３０ｇ／Ｌである。
　無機窒素源及び有機窒素源は、通常始発培地に添加するが、逐次的又は連続的に追加供給することも好ましく行われる。
　無機塩類としては、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムなどのリン酸塩類、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩類、硫酸鉄、塩化鉄などの鉄塩類、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどのカルシウム塩類、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどのナトリウム塩類、硫酸マンガンなどのマンガン塩類、硫酸銅などの銅塩類、硫酸亜鉛などの亜鉛塩類、モリブデン酸ナトリウムなどのモリブデン塩類、硫酸ニッケルなどのニッケル塩類、セレン酸ナトリウムなどのセレン塩類、タングステン酸ナトリウムなどのタングステン塩類、塩化アルミニウムなどのアルミニウム塩類、塩化クロムなどのクロム塩類、ホウ酸及びヨウ化カリウム等の中、１種又は２種以上が用いられる。添加量は無機塩の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．０００１~１５ｇである。リン酸塩類、マグネシウム塩類、カルシウム塩類、ナトリウム塩類及び鉄塩類では、０．０２~１５ｇ／Ｌが好ましく、マンガン塩類、銅塩類、亜鉛塩類、モリブデン塩類、ニッケル塩類、セレン塩類、タングステン塩類、アルミニウム塩類、クロム塩類、ホウ酸、ヨウ化カリウムなどを加える場合には、０．１~１５ｍｇ／Ｌが好ましい濃度である。無機塩類は通常始発培地に添加するが、逐次的又は連続的に追加供給してもよい。
　ビタミン類としては、例えば、シアノコバラミン、リボフラビン、パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、アスコルビン酸、葉酸、ナイアシン、ｐ−アミノ安息香酸、ビオチン、イノシトール、コリンなどを用いることができる。添加割合はビタミン類の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．００１~１０００ｍｇであり、好ましくは０．０１~１００ｍｇである。ビタミン類は通常始発培地に添加するが、逐次的又は連続的に追加供給してもよい。
　本発明において、培養液の発泡を抑えるために消泡剤が好ましく用いられる。消泡剤の種類は泡の発生を抑制し又は発生した泡を消す作用があり、かつ産生細菌に対する阻害作用の少ないものであれば何れでもよい。たとえば、アルコール系消泡剤、ポリエーテル系消泡剤、エステル系消泡剤、脂肪酸系消泡剤、シリコン系消泡剤、スルフォン酸系消泡剤などを例示することができる。添加量は消泡剤の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．０１ｇ~１０ｇである。
　消泡剤は通常殺菌前の始発培地に添加する。さらに、培養途中に連続的又は間欠的に追加添加してもよい。培養途中に消泡剤を添加する方法としては、センサーで泡を感知して自動添加する方法、プログラムタイマーで一定時間ごとに添加する方法、生育速度に連動するようにフィード用炭素源、窒素源又はｐＨ調整剤などと混合して添加する方法などを例示できる。始発培地に添加する消泡剤と培養途中に培養液に添加する消泡剤とは同種でもよいが、作用に合わせて異なる種類を用いることもできる。
　本発明において、培地の初期ｐＨは２~１２、好ましくは６~９、より好ましくは６．５~８．０に調整する。培養中も上記範囲のｐＨを維持することが好ましい。ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、アンモニア水、アンモニアガス、硫酸水溶液又はこれらの混合物が例示される。
　本発明において、培地は滅菌処理した後、細菌の培養に用いられる。滅菌処理は、当業者であれば、適宜行うことができる。例えば、適切な容器中の培地をオートクレーブで加熱滅菌すればよい。あるいは、滅菌フィルターによりろ過滅菌すればよい。
　本発明の変異型カロテノイド産生細菌又は形質転換体は、上記のように調製された培地に植菌され、所定の条件で培養される。植菌は、試験管、フラスコあるいは発酵槽などを用いたシード培養により菌株を適宜増やし、得られた培養液をカロテノイド生産用培地に加えることで行う。シード培養に用いる培地は、カロテノイド産生細菌が良好に増殖する培地であれば特に限定されない。
　培養は、適切な培養容器において行われる。培養容器は培養容量により適宜選択することができ、例えば、試験管、フラスコ、発酵槽などをあげることができる。
　培養温度は１５~４０℃、好ましくは２０~３５℃、より好ましくは２５℃~３２℃であり、通常１日~１８日間、好ましくは２~１２日間、より好ましくは３~８日間、好気条件で培養を行う。好気条件としては、例えば、振とう培養又は通気撹拌培養等が挙げられ、溶存酸素濃度を一定の範囲に制御するのが好ましい。溶存酸素濃度の制御は、例えば、攪拌回転数、通気量、内圧などを変化させることにより行うことができる。溶存酸素濃度は好ましくは０．３~１０ｐｐｍ、より好ましくは０．５~７ｐｐｍ、さらに好ましくは１~５ｐｐｍに制御する。
　本発明の変異型カロテノイド産生細菌又は形質転換体を培養した後のカロテノイド産生細菌の菌体数又は形質転換体数はＯＤにより測定することができる。また、カロテノイド産生細菌又は形質転換体を培養して得られる培養物中のカロテノイド、又は培養物から採取されたカロテノイドの定量は、高速液体クロマトグラフィーにより行うことができる。上記のようにカロテノイド産生細菌又は形質転換体を培養した後、得られる培養物からカロテノイド採取することができる。
　培養物は、例えば、培養液、培養上清、菌体濃縮液、湿菌体、乾燥菌体、菌体溶解物などが挙げられる。培養上清は、培養液を遠心処理又はろ過処理することで、培養液から菌体を除いて調製すればよい。菌体濃縮液は、培養液を遠心分離又は膜ろ過濃縮することにより得ることができる。湿菌体は、培養液を遠心又はろ過することにより得ることができる。乾燥菌体は、湿菌体又は菌体濃縮液を一般的な乾燥方法によって乾燥させることにより得ることができる。このようにして得られたカロテノイド含有乾燥菌体はそのまま飼料添加物として用いることができる。
　発酵培養時の収量は、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌであり、例えば１５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、２０００ｍｇ／Ｌ、４０００ｍｇ／Ｌのカロテノイドが含まれる。使用する菌体により培養液中に含まれるカロテノイドの量は変動するが、例えば４００ｍｇ／Ｌ~４０００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは、５００ｍｇ／Ｌ~３５００ｍｇ／Ｌのカロテノイドを含む。
　本発明の細菌は、ＤＸＳ及び／又はＤＰＳの変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を有さないカロテノイド産生細菌のカロテノイド産生量よりも、少なくとも５倍、好ましくは１０倍以上の量の産生能を有する。
　本発明においてカロテノイドを上記培養物から採取する方法は特に限定されず、カロテノイドが安定に効率よく回収されるいずれの方法でもよい。これらの方法は、当業者であれば公知の抽出、精製技術から適宜選択して行うことができる。また、本発明においては、上記培養物をカロテノイド含有組成物として用いることもできる。
　抽出を行う前に、培養物をアルカリ試薬や界面活性剤などを用いた化学的処理、溶菌酵素、脂質分解酵素及びタンパク分解酵素などを用いた生化学処理、又は超音波若しくは粉砕などの物理的処理の中、１つ又は２つ以上の処理を行ってもよい。
　例えば、カロテノイドを培養物から抽出する場合、抽出及び洗浄に用いる溶媒は特に限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール類、アセトン、テトラヒドロフラン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
　抽出操作中のカロテノイドの酸化を極力防止したい場合には、窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気で処理すればよい。また、医薬品や食品で用いられている酸化防止剤を選択して抽出溶媒に加えてもよい。あるいは、これらの処理を組み合わせてもよい。また、光によるカロテノイドの分解を極力防止するために、光を当てない条件下で行ってもよい。
　このように得られた抽出物をカロテノイドとしてそのまま用いることが可能であり、さらに精製して使用することもできる。
　抽出操作後の抽出物に残存する細菌等を分離する方法は特に限定されないが、膜濾過、遠心分離、デカンテーションなどが用いられる。
　抽出液からカロテノイド沈殿物を得る方法としては、一般的には加熱及び／又は減圧濃縮や晶析が挙げられる。この他、低温におけるカロテノイド色素の析出、酸・アルカリ薬剤や各種塩類による析出によってカロテノイド色素を濃縮せずに分離してもよい。工業的に用いる場合には、晶析することが望ましい。
　得られたカロテノイド沈殿物は、洗浄のため必要に応じて少量の低級アルコール類などの溶媒を用いて懸濁攪拌させてもよい。洗浄の手法は特に限定されないが、例えば、懸濁攪拌後に濾取する方法又は沈殿物の上から通液する方法等が実用的に好ましい方法として挙げられる。
　上記のように得られる培養物、抽出物又は精製物は、カロテノイドとしてそれぞれ単独で用いることもできるし、これらを任意の割合で混合して用いることもできる。
２．　アスタキサンチン合成経路に関与する酵素の立体構造解析
　前記ＤＸＳの第２２５番目のアミノ酸残基、及びＤＰＳの第３０５番目のアミノ酸残基の変異がカロテノイド合成に重要な役割を果たすことを示すため、これらの酵素の立体構造解析を行うことができる。
　本発明においては、アスタキサンチン合成経路上での酵素２種（酵素Ａ、酵素Ｃという）について点変異が同定された。アスタキサンチンの産生の増加は、これらの酵素に起こった変異が原因と考えられることから、変異が同定された酵素２種について立体構造モデルを構築し、変異によるアミノ酸置換の影響を推察する。
　酵素Ａは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素（ＤＸＳ）と推察された。同定されたアミノ酸の変異Ｇ２２５Ｄは、活性部位の近傍に位置するｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域にある。立体構造モデルからは、酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄが、ＤＸＳの活性を向上させることの知られている既知のｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域の変異と同様の構造変化を酵素Ａに引き起こすことが推察され、変異Ｇ２２５Ｄ酵素の酵素活性が向上していることが予測された。ＤＸＳがＩＰＰのフィードバック阻害による制御を受けることを考慮すると、変異Ｇ２２５Ｄ酵素では、フィードバック阻害が効かなくなり、ＩＰＰの産生量が増加することが示唆される。酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄにより、アスタキサンチンの原料であるＩＰＰの供給量が増加することが、アスタキサンチン産生量の増加する要因と考えられる。
　酵素Ｃは、デカプレニル二リン酸合成酵素であると推察された。立体構造モデルからは、同定された変異Ａ３０５Ｖが、周辺のアミノ酸残基と立体障害を引き起こし、酵素Ｃの立体構造を不安定化することが推察された。酵素Ｃの基質でデカプレニル二リン酸の原料であるＦＰＰとＩＰＰは、アスタキサンチン合成の原料でもある。不安定化により酵素Ｃの活性が低下することで、酵素Ｃにより消費されるＦＰＰとＩＰＰの量が減少することが示唆される。その結果、アスタキサンチン合成に使用できるＦＰＰ，ＩＰＰの量が増加し、アスタキサンチンの産生量が増加することが考えられる。
　以上のように、今回同定された変異がアスタキサンチン合成経路に及ぼす効果として、酵素Ａの活性向上によるＩＰＰ産生量の増加と、酵素Ｃの活性減少によるアスタキサンチン合成経路へのＩＰＰ供給量の増加の２つが推察された。これらの効果が、アスタキサンチン産生量が増加する要因と考えられる。
　実施例
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
（１）Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属細菌の変異処理及びゲノム解析
変異処理方法
　親株（Ｅ−３９６株）に変異源にＵＶやＮＴＧ（ニトロソグアニジン）などを使用し、種々選択圧を使用して数度のスクリーニングを実施した。スクリーニングは、アスタキサンチンの収量を指標として行った。
ゲノム解析法
　ゲノム解析は、ＰａｃＢｉｏ　ＲＳ　ＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）やＭｉＳｅｑ（イルミナ社）のシーケンサーを用いてゲノム配列を読んだ後、ＳＭＡＲＴ　Ｃｅｌｌ　８　Ｐａｃ　Ｖ３（Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）や、ＭｉＳｅｑ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＭＣＳ）ｖ２．４．１．３、Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＴＡ）ｖ１．１８．５４，ｂｃ１２ｆａｓｔｑ　ｖ　１．８．４（イルミナ社）などの解析ソフトを使用して行った。
　ゲノム解析結果（変異部位の同定）
　変異部位の同定は、これらのゲノム解析結果の変異点を持つタンパクと考えられる領域のアミノ酸配列とＫｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）に収載されている酵素遺伝子アミノ酸配列の間で相同性の高いもののうち、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に含まれるものを洗い出し、さらに、これらの情報から酵素の立体構造解析を行って、配列の一致するテンプレートを探しだすことにより、変異部位を持つタンパク質のアミノ酸配列の最終的な酵素名を決定した。
（２）アスタキサンチンの収量
（ｉ）培養条件
　試験管ストローク‐３３０ｒｐｍ、２８℃、ｐＨ７．２、培地量８ｍｌ／本
　培養時間‐７２時間。
　培地‐
　以下の組成の培地８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、シード用試験管培地を調製した。シード用試験管培地の原料は、十分に菌体の生育することが確認されているロットのものを使用した。
　シュークロース　　３０ｇ／Ｌ
　コーンスティープリカー　　３０ｇ／Ｌ
　リン酸二水素カリウム　　１．５ｇ／Ｌ
　リン酸水素二ナトリウム１２水和物　　３．８ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　５．０ｇ／Ｌ
　硫酸マグネシウム７水和物　　０．７ｇ／Ｌ
　硫酸鉄７水和物　　１．０ｇ／Ｌ
　ｐＨ７．２
　次に以下の組成の培地７．２ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れた生産用試験管培地を５本準備した。生産用試験管培地の原料は、菌体の生育が不十分であることが確認されているロットのものを使用した。
　グルコース　　３０ｇ／Ｌ
　コーンスティープリカーろ過処理物　　３０ｇ／Ｌ
　硫酸アンモニウム　　１．５ｇ／Ｌ
　リン酸二水素カリウム　　１．５ｇ／Ｌ
　リン酸水素二ナトリウム１２水和物　　３．８ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　５．０ｇ／Ｌ
　硫酸マグネシウム７水和物　　０．７ｇ／Ｌ
　硫酸鉄７水和物　　１．０ｇ／Ｌ
　シリコン系消泡剤　　０．２ｇ／Ｌ
（ｉｉ）結果
　各株における比生産性を図１に示す。
　本実施例により、Ｅ−３９６株と比較して１０倍以上のカロテノイド産生能を有するＡＳＢ−５７株を取得した。
［実施例２］
　アスタキサンチン合成経路に関与する酵素の立体構造解析
１．立体構造データ及び手法
酵素Ａ、酵素Ｃの立体構造モデルはホモロジーモデリングにより構築した。モデリングには、ソフトウェアＳｗｉｓｓ−Ｐｄｂ　ｖｉｅｗｅｒ及びＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬを使用した［１，２］。変異体モデルはＳｗｉｓｓ−Ｐｄｂ　ｖｉｅｗｅｒで作製した。アミノ酸残基の置換はｍｕｔａｔｅコマンドを、分子内エネルギーの算出はｃｏｍｐｕｔｅ　ｅｎｅｒｇｙコマンドを、また、エネルギー最小化計算はｅｎｅｒｇｙ　ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎコマンドを使用した。基質等との複合体モデルの作製、基質近傍残基の検出、原子間距離の測定、立体構造の表示はソフトウェアＷａａｌｓ（Ａｌｔｉｆ　Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）を使用して行った。低分子化合物の立体構造モデルはＭａｒｖｉｎＳｋｅｔｃｈ（ＣｈｅｍＡｘｏｎ　Ｌｔｄ．）により作製した。
テンプレート構造の立体構造の座標データは、タンパク質立体構造データベースであるＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｓｅ（ＰＤＢ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）から取得した。テンプレート構造は、ＰＤＢに登録されているデータの中で、酵素Ａ、酵素Ｃそれぞれと最もアミノ酸一致度が高いものを使用した。ホモロジーモデリングのテンプレートとして使用した立体構造データを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．酵素Ａの立体構造モデルの構築と変異体の解析
　酵素Ａは、アスタキサンチン合成の原料となるイソプレニル二リン酸（ＩＰＰ）を生合成するイソプレノイド生合成経路の１つであるデオキシキシルロース経路において、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド三リン酸から、１−デオキシ−Ｄキシルロース５リン酸を合成する１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素：１−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｘｙｌｕｒｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＤＸＳ）である。
　構築した酵素Ａの立体構造モデルから、ゲノム解析で同定された変異Ｇ２２５Ｄは、変異が生じるとＤＸＳの酵素活性が向上する例が複数報告されている、活性部位近傍のｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域にあることがわかった。変異体モデルの解析結果より、酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄは、ＤＸＳの活性を向上させる既知の変異と同様の構造変化を引き起こすことが推察され、変異Ｇ２２５Ｄ酵素も既知の変異と同様にＤＸＳの酵素活性が向上していることが予測される。ＤＸＳの活性向上により、アスタキサンチンの原料であるＩＰＰの供給量が増加することに伴い、アスタキサンチンの産生量が増加すると考えられる。
２．１．１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素の酵素反応
酵素Ａ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素：１−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｘｙｌｕｒｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＤＸＳ）は、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド三リン酸から、マグネシウムイオン（Ｍｇ）存在下で、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸を合成する。触媒反応には、補酵素としてチアミンピロリン酸（Ｔｈｉａｍｉｎｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＴＰＰ）を必要とし、まず、補酵素ＴＰＰが基質のピルビン酸に付加し、ヒドロキシエチル−ＴＰＰ中間体を生じる。この中間体とグリセルアルデヒド三リン酸が反応することにより１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸が生成する。以下に酵素Ａの酵素反応を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
２．２．酵素Ａの立体構造モデルの構築
（１）ホモロジーモデリングによる酵素Ａの立体構造モデルの構築
　酵素Ａの立体構造モデルは、補酵素ＴＰＰとの複合体の立体構造がＸ線結晶構造解析により決定されているＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）由来の１−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｘｙｌｕｒｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＤＸＳ、テンプレート）の立体構造（ＰＤＢ　ＩＤ：２Ｏ１Ｘ）［３］に基づき（図２）、ホモロジーモデリングにより構築した。
ホモロジーモデリングは、酵素Ａとテンプレート構造の立体構造アライメントに基づいて行った（図３Ａ，３Ｂ）。
　酵素ＡとＤ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ由来ＤＸＳのアミノ酸一致度は４４．１％である。テンプレートのＤＸＳの立体構造では、アミノ酸番号１９９~２４２残基の領域（４４残基）がｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄであり、Ｘ線結晶構造解析により原子の位置が特定できていない。そのため、酵素Ａのｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域に相当する１９６~２３８残基（４３残基）を除く、アミノ酸残基番号７~６３０残基の立体構造モデルを構築した。次に、酵素Ａの立体構造モデルとテンプレート構造を重ね合わせることにより、ＴＰＰ及びＭｇをはめ込み、酵素ＡとＴＰＰの複合体モデルを作製した。図４にテンプレート構造と構築したモデル構造を示す。
　酵素Ａは、テンプレート構造と同様、ホモ二量体を形成しており、それぞれのサブユニットにＴＰＰ結合部位及び基質結合部位を持つ。酵素Ａの単量体は、ドメインＩ（１~３１９残基）、ドメインＩＩ（３２０~４９５残基）、ドメインＩＩＩ（４９６~６２９残基）の３つのドメインで構成される。
（２）酵素Ａの基質複合体モデルの作製
酵素Ａの基質との結合に関与するアミノ酸残基を推察するため、酵素Ａに基質が結合した複合体モデルを構築した。テンプレート構造の２０１Ｘでは、基質であるピルビン酸及びグリセルアルデヒド３リン酸の座標は確定できていないため、先ず、ピルビン酸結合部位を検出するために、補酵素ＴＰＰにピルビン酸が付加したヒドロキシエチル−ＴＰＰ中間体との複合体モデルを、類縁のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のトランスケトラーゼＴｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ（ＴＫ）とヒドロキシエチル−ＴＰＰ中間体が結合した立体構造（ＰＤＢ　ＩＤ：１ＧＰＵ）［６］に基づき、重ね合わせにより、ヒドロキシエチル−ＴＰＰ中間体をはめ込み、複合体モデルを作製した。同様にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴＫとエリトロース−４−リン酸との立体構造（ＰＤＢ　ＩＤ：１ＮＧＳ）［７］に基づき、エリトロース−４−リン酸をはめ込み、さらにエリトロース−４−リン酸からグリセルアルデヒド３リン酸モデルを作製することにより、酵素Ａとグリセルアルデヒド三リン酸との複合体モデルを作製した。
　図５に酵素Ａと基質複合体のモデル構造を示す。
２．３．酵素Ａの活性部位の推察
補酵素及び基質を結合するアミノ酸残基を推定するため、酵素Ａと補酵素の複合体モデルにおいて、ＴＰＰ中間体、ＧＡＰ及びＭｇとの相互作用について調べた。
（１）補酵素ＴＰＰの結合部位
　酵素ＡとＴＰＰとの複合体モデルでは、テンプレート構造と同様、ＴＰＰはドメインＩとドメインＩＩの間に位置しており、ＴＰＰのピリミジン環はドメインＩＩに、リン酸基はドメインＩに結合している。
　ＴＰＰは、アミノピリミジン環、チアゾリン環、ピロリン酸で構成される（図６）。アミノピリミジン環は酵素Ａの結合ポケットの内部にぴったりと収まるように結合している。Ｐｈｅ３９６とＩｌｅ３６９の側鎖は、アミノピリミジン環を両側から挟むように疎水性相互作用で結合している。特にＰｈｅ３９６の側鎖である環状のフェニル基とアミノピリミジン環はπスタッキングによる強い結合が推察される。Ｇｌｙ１２０の主鎖の酸素と、Ｇｌｕ３７１の側鎖の酸素はアミノピリミジン環の１位の窒素原子と水素結合を形成する。ＴＰＰのピリミジン環の１位の窒素原子とＧｌｕ残基との水素結合は、ＴＰＰを介した触媒反応に重要であり、ＴＰＰを補酵素として使用する酵素で保存されていることが知られている。Ａｒｇ３９９の側鎖は、疎水性結合だけでなく、周辺のアミノ酸残基Ｇｌｕ３７１、Ｓｅｒ１２２の側鎖との水素結合により、結合ポケットを形成していると推測される。チアゾリン環との相互作用としては、Ｉｌｅ１８４，Ｉｌｅ３６９との疎水性結合が見られた。ピロリン酸との相互作用としては、Ｇｌｙ１５２の主鎖、Ｌｙｓ２８５の側鎖及びＨｉｓ７９の側鎖と間に水素結合が推察された。
　補酵素ＴＰＰの結合にはＭｇを必要とする。ＭｇはＴＰＰの２つのリン酸基の間に配位しており、Ａｓｐ１５１とＡｓｎ１８０の側鎖及びＭｅｔ１８２の主鎖がＭｇと結合していることが推察された。ＤＸＳについてはＴＰＰ結合モチーフとして、ＧＤＧＸ２５−３０Ｎの配列が保存されていることが知られている［３］。酵素ＡでＭｇ結合が推察されたＡｓｐ１５１とＡｓｎ１８０を含むアミノ酸配列Ｇｌｙ１５０−Ａｓｐ１５１−Ｇｌｙ１５２−Ａｓｎ１８０の配列は、このモチーフと合致する。
以上のように、ＴＰＰのアミノピリミジン環とチアゾリン環の炭素は、酵素Ａの疎水性残基Ｉｌｅ１８４，Ｉｌｅ３６９，Ｐｈｅ３９６，Ａｒｇ３９９との間に疎水性相互作用が推察された。また、アミノピリミジン環の２つの窒素原子はＧｌｙ１２０，Ｇｌｕ３７１と水素結合を形成することが推察された。ピロリン酸との間にはＨｉｓ７９，Ｇｌｙ１５２，Ｌｙｓ２８５との水素結合の他、Ａｓｐ１５１，Ａｓｎ１８０，Ｍｅｔ１８２によるＭｇを介した水素結合が推察される。図７に、推察されたＴＰＰとの結合に関与するアミノ酸残基を示す。
（２）ピルビン酸との相互作用
基質であるピルビン酸はＴＰＰと反応し、ヒドロキシエチル−ＴＰＰ中間体となる。酵素Ａとヒドロキシエチル−ＴＰＰ中間体の複合体モデルからは、ピルビン酸由来のヒドロキシエチル基との相互作用として、Ｖａｌ７７との疎水性相互作用及びＨｉｓ４３２との水素結合が推察された。これらのアミノ酸残基がピルビン酸との結合に関与していると考えられる。図８に、ヒドロキシエチル基との相互作用が推測されるアミノ酸残基を示す。
（３）グリセルアルデヒド３リン酸との相互作用
基質であるグリセルアルデヒド３リン酸（ＧＡＰ）と相互作用するアミノ酸残基として、Ｈｉｓ４８，Ｔｙｒ３９３，Ａｒｇ４２１，Ａｓｐ４２８，Ａｒｇ４７９との水素結合が推察された（図９）。
　Ｈｉｓ４８とＡｓｐ４２８はＧＡＰのアルデヒド基と水素結合を形成する。Ｔｙｒ３９３，Ａｒｇ４２１，Ａｒｇ４７９はＧＡＰのリン酸基との水素結合を形成することが推察された。
以上、推察された活性部位について表２~４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　また、酵素Ａと補酵素ＴＰＰとの結合様式、酵素Ａとピルビン酸との結合様式、酵素Ａとグリセルアルデヒド３リン酸との結合様式の図をそれぞれ、図６、１０、１１に示す。
　酵素Ａは、テンプレートのＤ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ由来ＤＸＳで明らかになっている補酵素のＴＴＰ、基質のピルビン酸及びＧＡＰを結合する活性部位を保持していることから、ＤＸＳの酵素活性を持つと推測される。これらのアミノ酸残基は、Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ由来ＤＸＳの他、大腸菌等のＤＸＳやＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＴＫにおいても保存性が高いことが知られている［３］。
大腸菌ＤＸＳでは、酵素ＡのＧｌｕ３７０，Ａｒｇ３９９，Ａｒｇ４７９に相当するアミノ酸残基をＡｌａへ置換すると、失活することが明らかになっている［３］。また、文献［８］では、大腸菌ＤＸＳの酵素ＡのＨｉｓ４８，Ｇｌｕ３７１，Ａｓｐ４２８に相当するアミノ酸残基を変異させた実験で、いずれも酵素活性がほぼ失活することが示されている。酵素Ａにおいてもこれらのアミノ酸残基はＤＸＳの活性に重要であると推測される。
２．４．酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄによる影響
酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄは立体構造が特定できなかったｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域（１９６~２３８残基）に存在する。この変異が酵素Ａの立体構造に与える影響を推察するため、これまでの知見や立体構造上でのｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域の位置と活性部位との関連について調べた。
（１）既知のｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域での変異について
これまでに、マスカットと大腸菌のＤＸＳについて、ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域で起こった変異、それぞれ２箇所、計４種がいずれも酵素活性を増加させることが報告されている。
　マスカット（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来ＤＸＳでは、Ｋ２８４Ｎの変異が野生型に比べＶｍａｘ及びＫｃａｔ／Ｋｍで約２倍の活性の増大をもたらすこと、過剰発現によりモノテルペンの産生量が大幅に増加することが報告されている［９］。
　また、マスカットにおいてＫ２８４ＮとＲ３０６Ｃの変異が、大腸菌においてＫ２１３ＮとＫ２３４Ｃの変異に関する発明が知られている（特表２０１４−５００７１０、ＵＳ２０１３０２７６１６６）。この発明は、ＤＸＳの活性向上によりテルペンの産生量を増加させる方法に関するもので、４例のいずれも、それぞれの一残基の変異によりテルペンの産生量が増加する。
図１２に、酵素Ａと大腸菌とマスカットのＤＸＳにおける酵素活性が増加した変異の位置を示す。
　マスカットのＫ２８４ＮとＲ３０６Ｃ、大腸菌のＫ２１３ＮとＫ２３４Ｃは、いずれもｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域（青）に存在する。酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄもこれらと同じくｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域に存在する。アミノ酸配列アライメントから、ＤＸＳの活性部位（ｇｒｅｅｎ）が保存されており、酵素ＡもこれらのＤＸＳと同様の反応様式を持つと推測される。なお、ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域のＮ末端側（ｍａｇｅｎｔａ）には、活性部位が存在する。
以上のように、ＤＸＳのｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域にはＤＸＳの酵素活性を上げる変異が複数存在しており、本領域への変異導入が、ＤＸＳの活性に何らかの影響を及ぼすことが推測される。
（２）酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄ（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域）の立体構造での位置
図１３に、酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄが存在するｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域（１９６~２３８残基）位置を青の点線で示す。
本領域は、ＤＸＳの活性に必須である補酵素ＴＰＰの結合部位近傍に位置する。本領域のＮ末端側のループ（ｍａｇｅｎｔａ）には活性部位であるＡｓｎ１８０，Ｍｅｔ１８２及びＩｌｅ１８４が存在する。Ａｓｎ１８０の側鎖とＭｅｔ１８２の主鎖はＭｇを結合する。Ｉｌｅ１８４の側鎖はＴＰＰと疎水性結合している。ＤＸＳの活性に必須なＴＰＰとＭｇが結合するには、このループが適切な構造をとることが重要であると思われる。文献［９］では、生理的役割は不明ではあるが、本領域は活性部位の近くに存在し、本領域内の変異が合理的に酵素の活性に影響するではないか、と考察されている。図１２、１３に示すように、本領域は、アミノ酸配列上でも立体構造上でも、ＴＰＰ結合部位の近傍に存在するため、本領域への変異がこれらの活性部位に影響を与えることは、十分起こりうると考えられる。
（３）酵素Ａのｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域のモデル及び変異Ｇ２２５Ｄ酵素の作製
次に、酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄがｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域の立体構造に与える影響を調べるため、酵素Ａの１９６~２３８残基（４３残基）のｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域についてモデル構造を作製した。マスカットの変異Ｋ２８４Ｎについて報告された文献［９］では、マスカットＤＸＳのｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域について、モデルを作製し、変異による静電ポテンシャルの変化を見ている。参考のため、酵素Ａについても同様の解析を行った。ホモロジーモデリングにより、酵素Ａのｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域と相同性の高いアミノ酸配列のフラグメント構造を基に立体構造モデルを作製した。テンプレート構造として、ＰＤＢに登録された立体構造の中で最も高いアミノ酸一致度（３４％）を持つ１ＡＬ７のフラグメントを使用した。ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域はゆらいだ構造をとっていると推測されるが、本領域が形成しやすいフォールディングとしては参考になると思われる。作製したモデルを図１４（左）に示す。
さらに、変異箇所のＧｌｙ２２５をＡｓｐに置換することにより変異Ｇ２２５Ｄ酵素の立体構造モデルを作製した。Ｇｌｙ２２５は表面に位置しており、Ａｓｐへの置換によりＡｓｐの側鎖が表面に露出する。作製した立体構造モデルの表面形状に静電ポテンシャルをマップした結果を図１４（右）に示す。青がｐｏｓｉｔｉｖｅ（正電荷）領域を、赤がｎｅｇａｔｉｖｅ（負電荷）な領域を示す。
野生型では、強い正電荷の領域が存在するが、変異Ｇ２２５Ｄ酵素では正電荷が弱まり、負電荷が強くなっていることが確認できる。野生型では、正電荷を持つＡｒｇ２２７，Ａｒｇ２２８，Ｌｙｓ２３０，Ｋ２３４の側鎖が集まり、強い正電荷の領域を形成している。この領域に存在する電荷を持たないＧｌｙ２２５が負電荷を持つＡｓｐに置換されることにより、Ａｓｐ２２５の近傍の正電荷が弱まったためと考えられる。この結果は、文献［９］で示されているマスカットの変異Ｋ２８４Ｎの静電ポテンシャルの変化、すなわちｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域の表面に正電荷から負電荷への静電ポテンシャルの変化と同じ傾向を示している。酵素ＡのＧ２２５Ｄによるｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域の構造変化は、ＴＰＰ結合部位を含む活性部位にマスカットの変異と同様の影響を及ぼすことが予測さ、その影響により、酵素Ａの変異体Ｇ２２５Ｄもマスカットの変異体Ｋ２８４Ｎと同様に酵素活性が増加していることが示唆される。
２．５．アスタキサンチン合成経路における酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄの影響
以上のように、酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄは酵素Ａのｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域で起きていること、本領域は、活性に必須なＴＰＰ結合部位の近傍に存在することが確認された。また、本領域にはこれまで複数のＤＸＳの酵素活性を向上させる変異が見つかっており、Ｇ２２５Ｄの変異は、ＤＸＳの活性を向上させる既知の変異と同様の構造変化を起こすことが予測された。
立体構造モデルで確認されたｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域の位置からは、少なくとも文献で述べられているように、ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域への変異がＴＰＰ結合領域に何らかの影響を及ぼすことにより、酵素活性が向上していると考えられる。マスカットの例では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの酵素学的実験により変異体のＫｃａｔ／Ｋｍが野生型の約２倍になっていることが示されており、ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域での変異がＴＰＰの結合により適した構造変化をもたらすことが予測される。
細胞内で各種のモノテルペンの大幅な増加がもたらされるためには、モノテルペンの原料となるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の増加が必要である。ＤＸＳは、デオキシキシルロース経路の産生物であるＩＰＰによりフィードバック阻害がかかること、ＩＰＰはＴＰＰと競争阻害することが報告されている［１０］。また、ＩＰＰの量が一定量以上になると、デオキシキシルロース経路の最初の酵素であるＤＸＳに阻害がかかり、それ以上のＩＰＰを増やさないように制御されることが知られている。
このフィードバック阻害により、供給されるＩＰＰの量は、ＤＸＳによって一定に制御されているため、単にＤＸＳの酵素活性Ｋｃａｔ／Ｋｍが増加しただけでは、ＩＰＰの供給量は増えず、テルペンが大幅に増加することはできない。既知の例では、ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域の変異によりテルペンの合成量が増加しており、この変異によりＩＰＰの供給量が増加していることが予測され、すなわち、ＤＸＳのＩＰＰによるフィードバック阻害が効かなくなっていることが示唆される。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、ＩＰＰは、ＴＰＰと競合してＤＸＳに結合し、ＤＸＳを阻害することが明らかになっている［１０］。ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ領域への変異により、ＴＰＰ結合領域に構造変化が起こり、ＴＰＰ結合により適した構造になるだけでなく、ＩＰＰの結合に影響を及ぼすことで、ＩＰＰによるフィードバック阻害が効かなくなっている可能性が示唆される。
酵素Ａの変異Ｇ２２５Ｄも同様、ＴＰＰ結合領域に構造変化を及ぼし、ＩＰＰによるフィードバック阻害が効かなくなることで、ＩＰＰの産生量が増加していると推察される。その結果、アスタキサンチン合成の原料となるＩＰＰの供給量が増えることで、アスタキサンチンの合成量が増加していると考えられる（図１５）。
３．酵素Ｃの立体構造モデルの構築と変異体の解析
酵素Ｃは、アミノ酸配列の相同性および立体構造比較解析から、ポリプレニル二リン酸合成酵素の一種であり、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）と７個のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からデカプレニル二リン酸を合成するデカプレニル二リン酸合成酵素：Ｄｅｃａｐｒｅｎｙｌ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅである。
　構築した酵素Ｃの立体構造モデルから、ゲノム解析で同定された変異Ａ３０５Ｖは、周辺のアミノ酸残基との原子の衝突による立体障害を引き起こし、酵素Ｃの立体構造を不安定化することが推察された。立体構造の不安定化により酵素Ｃの活性が減少することにより、酵素Ｃにより消費されるＦＰＰとＩＰＰの量が減少する。その結果、アスタキサンチン合成に使用できるＦＰＰ，ＩＰＰの量が増加することにより、アスタキサンチンの産生量が増加することが考えられる。
３．１．デカプレニル二リン酸合成酵素の酵素反応
デカプレニル二リン酸合成酵素は、ＦＰＰとＩＰＰを縮合する活性を持ち、ＩＰＰとの縮合を繰り返し、ＦＰＰと７個のＩＰＰからデカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）を合成する酵素である。デカプレニル二リン酸合成酵素の酵素反応を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
３．２．酵素Ｃの立体構造モデルの構築
（１）ホモロジーモデリングによる酵素Ｃの立体構造モデルの構築
酵素Ｃの活性部位及び変異による影響を調べるため、テンプレート構造として、ＰＤＢの立体構造でアミノ酸一致度が最も高く（アミノ酸一致度は７６．２％）、立体構造がＸ線結晶構造解析により決定されているＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）由来のデカプレニル二リン酸合成酵素の立体構造（ＰＤＢ　ＩＤ：３ＭＺＶ）を使用し、ホモロジーモデリングにより立体構造モデルを構築した（図１６）［４］。
ホモロジーモデリングは、酵素Ｃとテンプレート構造の立体構造アライメントに基づいて行った（図１７）。
（２）酵素Ｃの基質複合体モデルの作製
テンプレート構造の３ＭＺＶは基質が結合していないため、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のｏｃｔａｐｒｅｎｙｌ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（オクタプレニル二リン酸合成酵素）（ＰＤＢ　ＩＤ：３ＷＪＮ，３ＷＪＯ）の立体構造データ［１１］を使用して、酵素Ｃの立体構造モデルに３ＷＪＮを重ね合わせ、基質であるＦＰＰを酵素Ｃの立体構造モデルにはめ込むことにより、酵素ＣとＦＰＰの複合体モデルを作製した。次に、同様に、３ＷＪＯを重ね合わせて、ＩＰＰをはめ込み、酵素ＣとＦＰＰ，ＩＰＰ複合体モデルを作製した。
図１８に、テンプレート構造と構築したモデル構造を示す。酵素Ｃはテンプレート構造と同様にホモ二量体を形成している。
３．３．酵素Ｃについて
（１）立体構造による比較
酵素Ｃのデカプレニル二リン酸合成酵素は、ポリプレニル二リン酸合成酵素のファミリー（Ｐｆａｍ　ＰＦ００３４８　Ｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）に属する。図１９に酵素Ｃの基質結合の様子を示す。
ポリプレニル二リン酸合成酵素は、ＦＰＰからＩＰＰをｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ（ここでは文献［４］に従い、リン酸基側をｈｅａｄ、イソプレニル基側をｔａｉｌと呼ぶ。）の向きで縮合することにより、各種のポリプレニル二リン酸を合成する。デカプレニル二リン酸合成酵素は、ＦＰＰとＩＰＰＧの縮合反応を続けることにより、基質結合部位の奥の方へと（図１９右に矢印で示す）プレニル鎖が伸長され、Ｃ５０のデカプレニル二リン酸を合成する。
酵素ＣとテンプレートのＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来デカプレニル二リン酸合成酵素はアミノ酸一致度が７６．３％と高く、活性部位も保存されている（図１７）。立体構造の、Ｃαの重ね合わせによるＲＭＳＤは０．０６３Åであり、２つの酵素は非常に類似しており、アミノ酸残基の一致を色分けで表示すると、アミノ酸残基の種類が異なる領域は、分子表面に限られ、活性部位や基質を結合する領域は、全て一致するアミノ酸残基で構成されている（図２０）。
（２）アミノ酸配列による比較
次に、酵素Ｃのアミノ酸配列について、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ由来のデカプレニル二リン酸合成酵素との比較を行った。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ由来のデカプレニル二リン酸合成酵素として、既に明らかになっているアミノ酸配列として、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）に、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｚｅａｘｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ（Ｑ８Ｌ１Ｉ６）とＰａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ａ１Ｂ３Ｍ９）由来のアミノ酸配列が登録されている。これらと酵素Ｃのアミノ酸配列を比較したところ、アミノ酸一致度は７５．１％（類似度８９．２％）であり、高い相同性を示した（表５）。
　アミノ酸配列からも酵素Ｃはデカプレニル二リン酸合成酵素であると推測される。図２１にアライメントを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
３．４．酵素Ｃの活性部位の推察
酵素Ｃと基質の複合体モデルにおいて、基質であるＦＰＰ結合部位とＩＰＰ結合部位、触媒に必要なＭｇ結合部位を推察した。これらの結果から推察された活性部位と他のポリプレニル二リン酸合成酵素の活性中心や基質結合部位の保存性は高く、酵素Ｃはポリプレニル二リン酸合成酵素と同様の反応様式を持つと推察される。
酵素Ｃと基質との複合体モデルを図２２に示す。
酵素Ｃは、テンプレート構造のデカプレニルニリン酸合成酵素と同様、ホモ二量体を形成すると推測される。図２２に、Ａ鎖（ｌｉｇｈｔ　ｒｅｄ）のＦＰＰとＩＰＰとの結合部位を示す。ＦＰＰは、Ａ鎖のトンネル状の領域に結合し、ＦＰＰとＩＰＰは、ＩＰＰのイソペンテニル基にＦＰＰのリン酸基を向けたｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌの形で結合している。触媒反応は、Ｍｇ存在下において、ＦＰＰのリン酸基とＩＰＰのイソペンテニル基の間で起こる。
酵素Ｃの活性部位を推察するため、酵素Ｃと基質複合体モデルにおいて、ＦＰＰ、ＩＰＰの近傍に存在するアミノ酸残基を検出し、基質とアミノ酸残基の相互作用を推察した。ＦＰＰについては、リン酸基とＡｒｇ１０２，Ｌｙｓ１７９，Ｌｙｓ２４４との間に水素結合が、ポリプレニル基とＡｌａ８８，Ｔｈｒ８９，Ｈｉｓ９２，Ｐｈｅ１２５との間に疎水性相互作用が推察された（図２３上）。
ＩＰＰについては、リン酸基とＬｙｓ５４，Ａｒｇ５７，Ｈｉｓ８６，Ａｒｇ１０３との間に水素結合が、イソペンテニル基とＰｈｅ２１６との間に疎水性相互作用が推察された（図２３中央）。
本触媒反応には、Ｍｇが必要である。Ｍｇ結合部位として、既知のポリプレニル二リン酸合成酵素では、２箇所のＤＤＸＸＤモチーフが知られている［１１］。テンプレート構造ではＭｇの座標は決定されていないが、酵素Ｃにおいても、ＤＤＸＸＤモチーフ相当するＡｓｐ９３，Ａｓｐ９４，Ａｓｐ９７及びＡｓｐ２２０，Ａｓｐ２２１，Ａｓｐ２２４が、既知のＭｇ結合部位と同様にリン酸基の近くに存在し、これらのアミノ酸残基がＭｇを結合すると推察される（図２３下）。
以上、推察された活性部位について添付資料の表６~８に示す。また、酵素ＣとＦＰＰ及びＩＰＰとの結合様式、並びに酵素ＣとＭｇとの結合様式についての図をそれぞれ図２４、２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
結合が推察された各アミノ酸残基は、テンプレート構造であるＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来のデカプレニル二リン酸合成酵素と一致する（図１７）。また、酵素ＣのＦＰＰ結合部位、ＩＰＰ結合部位、Ｍｇ結合部位は、基質複合体モデルの作成に使用したＥ．ｃｏｌｉ由来のオクタプレニル二リン酸合成酵素の結合部位を保持していることから、酵素Ｃは、オクタプレニル二リン酸合成酵素と同様の反応様式をとると考えられる。
特に、ＦＰＰのリン酸基を結合するＡｒｇ１０２，Ｌｙｓ１７９，Ｌｙｓ２４４、Ｍｇを結合するＡｓｐ９３，Ａｓｐ９４，Ａｓｐ９７，Ａｓｐ２２０，Ａｓｐ２２１，Ａｓｐ２２４は、リン酸基を転移する触媒活性に直接関与する重要な残基であると思われる。ラットや酵母のＦＰＰ合成酵素の変異体作製による実験では、酵素Ｃのリン酸結合部位であるＡｒｇ１０２，Ａｒｇ１０３及びＭｇ結合部位であるＡｓｐ９４，Ａｓｐ９７，Ａｓｐ２２０，Ａｓｐ２２１，Ａｓｐ２２４及びに相当するアミノ酸残基が、酵素活性に重要であること、ポリプレニル二リン酸合成酵素の間でこれらのアミノ酸残基が高く保存されていることが報告されている［１４，１５］。
また、ＦＰＰ合成酵素では、酵素ＣのＰｈｅ２１６，Ｇｌｎ２１７に相当するアミノ酸残基の変異体作製により、ＰｈｅとＧｌｎの側鎖が基質結合に重要であることが明らかにされている［１６］。酵素Ｃの複合体モデルにおいても、Ｐｈｅ２１６，Ｇｌｎ２１７が活性部位の領域にあり、活性に重要であると予測される。
３．５．酵素Ｃの変異Ａ３０５Ｖによる影響
酵素Ｃで同定されたＡｌａ３０５からＶａｌへの変異が立体構造に及ぼす影響を推察するため、酵素Ｃの変異Ａ３０５Ｖ酵素の立体構造モデルを作製した。
（１）Ａ３０５Ｖの一残基置換による変異モデルの作製
ＡｌａからＶａｌへの置換による影響を見るため、まず、他のアミノ酸残基の立体構造を固定して、（ｒｉｇｉｄ　ｂｏｄｙと仮定して）、Ａｌａ３０５をＶａｌに一残基置換したモデルを作製し、野生型と比較した。
図２６に、野生型と変異Ａ３０５Ｖ酵素の立体構造モデルを示す。野生型のＡｌａ３０５は、αヘリックス（ｐｉｎｋ）に存在し、側鎖は隣接するαヘリックス（ｃｙａｎ）のアミノ酸残基と疎水性相互作用によりパッキングしている。
図２７に、Ａｌａ３０５と隣接するアミノ酸残基の構造を示す。
Ａｌａ３０５の側鎖であるメチル基の炭素原子は周辺のアミノ酸残基、Ｔｙｒ２０８，Ａｌａ２１１，Ｈｉｓ３０１，Ａｌａ３０２と接しており、炭素の原子間の距離はいずれも４．０Å未満である。Ａｌａ３０５からＶａｌへの置換により側鎖のメチル基が２つ分増えることになる。Ａｌａ３０５をＶａｌに置換した立体構造モデルでは、Ｖａｌの側鎖のメチル基の炭素とＴｙｒ２０８及びＡｌａ２１１の炭素との原子間距離は２．４２Å，２．４７Åであった。
炭素間の非共有結合による接触距離の極限下限値は２．９Åである。Ｖａｌ３０５で測定された炭素の原子間の距離はこの値を下回るため、これらの炭素原子は衝突し、周辺のアミノ酸残基との立体障害が起きると考えられる。Ｓｐｅｃｅ−ｆｉｌｌｉｎｇによる表示では、原子間の距離がファンデルワールス半径より短く、原子間で衝突していることが確認できる。以上より、Ａ３０５Ｖの変異は、原子の衝突により酵素Ｃの立体障害を引き起こし、立体構造の不安定化を招くと予測される。
（２）Ａ３０５Ｖの変異による分子内エネルギーの変化
Ａ３０５Ｖによる構造の不安定化を評価するため、酵素Ｃの野生型と変異体Ａ３０５Ｖの分子内エネルギーを原子間の結合の長さ、結合角、ねじれ、結合エネルギー等の合計により、単位キロジュール／ｍｏｌ（ＫＪ／ｍｏｌ）で算出した。。
その結果、野生型の−１７，９１２（ＫＪ／ｍｏｌ）に対し、変異Ａ３０５Ｖ酵素では−１６，２９５（ＫＪ／ｍｏｌ）と、変異Ａ３０５Ｖの分子内エネルギーが９．０２％も増加し、構造が不安定化することが確認された。この分子内エネルギーの増加は、特にＴｙｒ２０８，Ａｌａ２１１，Ｖａｌ３０５の各アミノ酸残基に認められ、これらのアミノ酸残基が衝突を起こしていることが分子内エネルギーの増加に起因すると考えられる。図２８に、酵素Ｃの野生型と変異体Ａ３０５Ｖの分子内エネルギーの比較を示す。
（３）変異Ａ３０５Ｖによる構造変化
次に、変異体モデルに対しエネルギー最小化計算を行い、周辺のアミノ酸残基の立体構造を動かすことにより、Ａ３０５Ｖによる衝突を回避できるかどうかを調べた。その結果、Ｖａｌ３０５の側鎖の衝突を回避して、側鎖を許容するためには、Ｖａｌ３０５が存在するαヘリックスと隣接するαヘリックスのアミノ酸残基の立体構造を動かさなければならないことがわかった。すなわち、その構造変化は側鎖のみならず、主鎖にも及ぶものであり、変異Ａ３０５Ｖ酵素では、αヘリックス間の本来のパッキングができなくなり、２本のヘリックス周辺の構造が不安定化することが予想される。また、変異Ａ３０５Ｖに隣接するαヘリックスには基質であるＩＰＰやＭｇを結合する活性部位（Ｐｈｅ２１６，Ｇｌｎ２１７，Ａｓｐ２２０）が存在する。活性部位の土台となるαヘリックスの主鎖構造の構造変化により、活性部位のアミノ酸残基が本来の位置をとれなくなり、その結果、基質結合や活性そのものに影響がでることが考えられる（図２９右）。
図２９に、野生型とエネルギー最小化計算後の変異体Ａ３０５ＶのＡｌａ３０５とＶａｌ３０５周辺の構造を、図３０、３１、３２に変異体Ａ３０５Ｖの構造変化を示す。
（４）構造の不安定化による酵素Ｃの活性の減少
以上のように、Ａ３０５Ｖの立体構造モデルからは、周辺のアミノ酸残基との立体障害、分子内エネルギーの増加および隣接する２本のαヘリックスの構造変化が起きていると推察され、Ａ３０５Ｖの変異が酵素Ｃの立体構造を不安定化することが示唆された。点変異による立体構造の不安定化については、遺伝病等でも数多く報告されている。たとえば、不安定化を引き起こす変異を持ったタンパク質が、溶媒中で本来の立体構造を維持することができずに、通常よりも短かい時間で失活する、また、細胞内では、本来のパッキングができない変異体タンパク質が細胞自身の機能により排除されると考えられている。そのため、本来の活性を有さない、不安定な構造である変異Ａ３０５Ｖ酵素は、細菌内で排除されている可能性があり、結果的に、細菌内での酵素Ｃの活性が減少するものと推察される。
３．６．アスタキサンチン合成経路における酵素Ｃの変異Ａ３０５Ｖの効果
デカプレニル二リン酸合成酵素は、コエンザイムＣ１０（ＣｏＱ１０）合成経路の酵素の１つである。今回、酵素Ｃと高い相同性を持つことが確認されたＰａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓあるいはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来のデカプレニル二リン酸合成酵素は、ＣｏＱ１０の産生に必要な酵素であることが明らかにされている［特開２００５−２１１０２０、特表２００６−５１７７９４］。デカプレニル二リン酸合成酵素の基質であるＦＰＰとＩＰＰは、アスタキサンチン合成経路のゲラニルゲラニル二リン酸（Ｇｅｒａｎｙｌ−ｇｅｒａｎｙｌ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＧＧＰＰ）合成酵素のＣｒｔＥの基質でもある。したがって、通常のＰａｒａｃｏｃｃｕｓの細胞内では、デカプレニル二リン酸合成酵素とＣｒｔＥが、基質であるＦＰＰとＩＰＰを取り合って使用していると考えられる。
酵素Ｃで同定された変異Ａ３０５Ｖは、分子の立体構造を不安定化させることにより、酵素Ｃの活性を減少させると推察された。酵素Ｃの活性が減少すれば、使用する基質のＦＰＰ及びＩＰＰの量も減少し、その結果、アスタキサンチン合成経路で使用可能なＦＰＰ、ＩＰＰの量は増加すると考えられる。
ＣｒｔＥは、１分子のＦＰＰと１分子のＩＰＰから１分子のＧＧＰＰを合成する。一方、酵素Ｃが１分子のデカプレニル二リン酸を合成するには、１分子のＦＰＰと７分子のＩＰＰを必要とする。ＩＰＰで見ると、酵素Ｃは、１つの反応でＣｒｔＥの７倍のＩＰＰを消費する。このため、酵素Ｃの活性減少は、アスタキサンチン合成経路に供給されるＩＰＰを増加させるのに極めて効果的であると考えられる。
その結果、アスタキサンチンの合成量が顕著に増加すると推察される（図３３）。
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Claims (22)

  1. 以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの遺伝子を含む、変異型カロテノイド産生細菌。
    （ａ）カロテノイド産生細菌における１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子
    （ｂ）カロテノイド産生細菌におけるデカプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子
    （ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）の両方の遺伝子
  2. １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素のアミノ酸配列が配列番号２に示されるものである請求項１に記載の細菌。
  3. 第２２５番目のアミノ酸残基が、グリシンからアスパラギン酸に置換された、請求項１又は２に記載の細菌。
  4. デカプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列が配列番号４に示されるものである請求項１~３のいずれか１項に記載の細菌。
  5. 第３０５番目のアミノ酸残基が、アラニンからバリンに置換された、請求項１~４のいずれか１項に記載の細菌。
  6. 変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を有さないカロテノイド産生細菌のカロテノイド産生能よりも高い産生能を獲得した、請求項１~５のいずれか１項に記載の細菌。
  7. 変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を有さないカロテノイド産生細菌のカロテノイド産生量よりも少なくとも５倍以上の量の産生能を獲得した、請求項６に記載の細菌。
  8. カロテノイド産生細菌がパラコッカス属に属するものである請求項１~７のいずれか１項に記載の細菌。
  9. パラコッカス属に属する細菌がＥ−３９６株である請求項８に記載の細菌。
  10. カロテノイドがアスタキサンチンである請求項１~９のいずれか１項に記載の細菌。
  11. 請求項１~１０のいずれか１項に記載の細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを特徴とするカロテノイドの製造方法。
  12. カロテノイドの産生量が、変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を有さないカロテノイド産生細菌のカロテノイド産生量よりも少なくとも５倍以上の産生量である、請求項１１に記載の方法。
  13. カロテノイドがアスタキサンチンである請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. カロテノイド産生細菌に変異処理を施し、変異処理された細菌から以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの特徴を有する細菌を選択することを特徴とする、カロテノイド産生細菌のスクリーニング方法
    （ａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素の活性が変異処理前の細菌における活性よりも上昇した特徴
    （ｂ）デカプレニル二リン酸合成酵素の活性が変異処理前の細菌における活性よりも低下した特徴
    （ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）の両方の特徴
  15. 請求項１４に記載の方法により選択された細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを特徴とするカロテノイドの製造方法。
  16. １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第２２５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子。
  17. 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
    （ａ）配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡ
    （ｂ）上記（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
  18. デカプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列において、少なくとも第３０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子。
  19. 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
    （ａ）配列番号７で表される塩基配列を含むＤＮＡ
    （ｂ）上記（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル二リン酸合成酵素活性が低下したタンパク質をコードするＤＮＡ
  20. 以下の（ａ）~（ｃ）のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
    （ａ）請求項１６又は１７に記載の遺伝子
    （ｂ）請求項１８又は１９に記載の遺伝子
    （ｃ）上記　（ａ）及び（ｂ）の遺伝子
  21. 請求項２０に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
  22. 請求項２１に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを特徴とするカロテノイドの製造方法。
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