KR100936216B1

KR100936216B1 - 코엔자임 ｑ10 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를이용한 코엔자임 ｑ10의 제조방법

Info

Publication number: KR100936216B1
Application number: KR1020080000643A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 최형석; 최솔
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2008-01-03
Filing date: 2008-01-03
Publication date: 2010-01-11
Also published as: KR20090074926A

Abstract

코엔자임 Q10의 생합성에 관여하는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans ) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase; DPS)를 코딩하는 유전자(ddsA)가 도입된 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 코엔자임 Q10의 제조방법이 개시된다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 부산물인 코엔자임 Q9의 생성을 제한함으로써, 코엔자임 Q10의 생성능을 향상시킬 수 있어 코엔자임 Q10의 제조에 유용하다.

데카프레닐 디포스페이트 합성효소, 코엔자임 Q10, 재조합 미생물

Description

코엔자임 Ｑ10 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 코엔자임 Ｑ10의 제조방법{Recombinant Microorganisms Having Producibility of Coenzyme Ｑ10 and Method for Preparing Coenzyme Ｑ10 Using the Same}

본 발명은 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 코엔자임 Q10의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 코엔자임 Q10의 생합성에 관여하는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase, DPS)를 코딩하는 유전자(ddsA)가 도입되어 있는 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 코엔자임 Q10의 제조방법에 관한 것이다.

코엔자임 Q는 거의 모든 생물체에 존재하는 지용성 퀴논(quinone) 상태의 천연물질로 환원성이 있는 벤조퀴논(benzoquinone) 구조에 이소프레노이드(isoprenoid) 사슬이 결합되어 있는 형태이며, 이소프레노이드 단량체가 10개일 때, 코엔자임(coenzyme) Q10이라고 지칭한다.

하기 화학식 1로 표시되는 코엔자임(coenzyme) Q10은 1957년 크랜(Crane) 등에 의해 소의 심근에서 최초로 분리되었고, 1958년에 폴커스(Folkers) 등에 의해서 그 화학 구조가 밝혀졌으며, 코큐텐, 비타민 큐텐, 유비퀴논(ubiquinone) 및 유비데카퀴논(ubidecaquinone) 등의 여러 가지 이름으로 지칭된다.

[화학식 1]

코엔자임 Q10의 가장 기본적인 기능은 미토콘드리아 내막의 전자전달계의 구성원으로서 콤플렉스 Ⅰ(또는 Ⅱ)에서 콤플렉스 Ⅲ로 전자를 전달하는 역할을 하여 세포내 에너지 대사에 관여하는 것에 있다. 또한, 미토콘드리아를 제외한 세포내 다양한 기관에서 세포막에서 지속적으로 일어나는 불포화지질의 산화적 손상을 방지하고, 반응성 산소종을 제거하는 등 DNA, 지질, 단백질 등에 의한 산화적 손상을 막는 항산화 기능을 한다. 이외에도 치주질환, 고혈압, 뇌졸중, 울혈성 심장질환, 협심증, 심근증, 루게릭병, 당뇨, 신장 질환, 파킨슨병 또는 후천성 면역결핍증(AIDS)과 같은 면역계 질환 또는 암의 예방과 치료 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 피부 노화 억제, 미백 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 다양한 생물체에서 TCA 회로의 발현 조절, 이황화물(disulfide) 결합 형성 조절, 열 생성(thermogenesis) 조절 등에 관여한다는 것이 밝혀지고 있다.

코엔자임 Q10은 활동을 많이 하는 기관인 심장, 폐, 간, 잇몸 등에 많이 분포되어 있지만, 체내 합성의 경우, 20대까지는 왕성하게 만들어지다가 40대부터 노화가 시작되면서 점점 체내 합성량이 적어지게 되므로 이러한 코엔자임 Q10을 산업적으로 대량 생산하여 각종 의약품, 건강보조식품, 화장료 등에 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재 코엔자임 Q10은 세계적으로 연간 350~400톤 정도 생산되고 있으며, 앞으로 그 생산규모는 더욱 증가될 것으로 보인다. 이와 같이, 코엔자임 Q10 관련 상품은 웰빙시대를 맞아 국내의 수요 창출이 급증할 것으로 보이는, 향후 높은 부가 가치를 창출할 수 있는 아이템이라고 할 수 있다.

그러나, 아직까지 국내에서 코엔자임 Q10 고함량 단일제제는 없는 실정이고,노령화가 서서히 진행되고 있는 상황에서 코엔자임 Q10의 요구량은 증가될 것으로 예측되므로, 향후 국내 수요의 증가를 대비하여 생산 비용을 낮출 수 있는 새로운 균주의 개발, 고함량 대량 생산 기법 등의 기술적 해결방법이 절실하다.

코엔자임 Q10의 생산 방법에는 동식물 조직으로부터 추출하는 방법, 다단계의 유기 화학합성 방법 및 미생물 배양을 통한 발효법이 있다. 동식물 조직으로부터 대용량으로 추출, 생산하는 방법은 많은 비용이 들고, 농도가 지극히 낮기 때문에 비효율적이다. 유기 / 반유기 합성법, 예를 들어 담배로부터 솔라네솔(solanesol, C₄₅H₇₄O)을 추출하고, 이로부터 다단계의 유기 화학합성을 하는 방법은 현재 코엔자임 Q10의 대량생산에 주로 사용되는 방법이다. 하지만 이 방법은 고 가의 전구체가 요구되고, 시스(cis) 형태와 트랜스(trans) 형태의 코엔자임 Q10이 동시에 생산된다는 단점을 가지고 있으며, 비친환경적이고, 수율이 낮기 때문에 비효율적이다 (JP2002-007145, US6506915, JP2002-013766). 마지막으로, 미생물 세포로부터의 직접 추출법은 미생물 세포 및 코엔자임 Q10의 수율에 따라 경제적으로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 유기 화학합성 방법의 단점을 극복할 수 있는 방안이므로 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

미생물의 코엔자임 Q10의 생합성 경로는 매우 복잡한 다단계 반응과정으로 구성되어 있는데, 크게 퀴논환 부분인 4-hydrobenzoate가 형성되는 단계, 곁사슬 부분인 데카프레닐 디포스페이트(decaprenyl diphosphate)가 합성되는 단계, 이들 두 개의 화합물이 결합되고, 각 치환기에 메틸레이션(methylation)이 순차적으로 이루어져 코엔자임 Q10이 생성되는 단계로 구분할 수 있다.

곁사슬 형성에 있어서, 옥타프레닐 디포스페이트 합성효소(octaprenyl diphosphate syntetase; ispB) 유전자에 의해 자연상태에서 옥타프레닐 디포스페이트(octaprenyl diphosphate)만을 합성하는 미생물, 예를 들어 대장균은 코엔자임 Q8만을 생산하게 된다. 따라서 대장균을 이용하여 코엔자임 Q10을 생산하기 위해서는 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS)를 대장균에 도입시켜야 한다.

현재까지 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS)는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 글루코노박터 서브옥시단스 (Gluconobacter suboxydans), 어그로박테이움 튜머페이시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 파라 코커스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans), 롭도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 등의 미생물에서 분리되고, 또한 대장균에 도입된 예가 있지만, 이들 재조합 균주를 배양할 경우 코엔자임 Q10 뿐만 아니라, 코엔자임 Q9이 부산물로써 동시에 생산되어 코엔자임 Q10의 생산성이 낮아지는 문제점이 있었다 (KR2004-018464, KR2002-007661, KR0761943, EP2004-007025, Eur. J. Biochem., 255:52-59, 1998; Appl . Microbiol . Biotechnol ., 67:192~196, 2005).

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans ) 621H로부터 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase, DPS)를 코딩하는 유전자(ddsA)를 분리하고, 상기 분리된 유전자를 미생물에 도입시켜 제작한 재조합 미생물을 배양할 경우, 부산물인 코엔자임 Q9는 생성되지 않고, 코엔자임 Q10이 높은 수율로 생성되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 부산물인 코엔자임 Q9의 생성을 제한함으로써, 코엔자임 Q10의 생성능이 향상된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 코엔자임 Q10의 생성능이 향상된 재조합 미생물을 이용한 코엔자임 Q10의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는, 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase, DPS)를 코딩하는 유전자(ddsA)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양한 다음, 배양된 미생물로부터 코엔자임 Q10을 회수하는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는, 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(modified decaprenyl diphosphate synthetase, mDPS), 상기 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(mDPS)를 코딩하는 유전자(mddsA) 및 상기 유전자(mddsA)를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자(mddsA) 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양한 다음, 배양된 미생물로부터 코엔자임 Q10을 회수하는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 미생물은 부산물인 코엔자임 Q9의 생성을 제한함으로써, 코엔자임 Q10의 생성능을 향상시킬 수 있어 코엔자임 Q10의 제조에 유용하다.

본 발명에서는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물이 코엔자임 Q9의 부산물 생산을 제한함으로써, 코엔자임 Q10의 생성능을 향상시킬 수 있는지 확인하고자 하였다.

글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxidans)의 ddsA 유전자를 이용하여 코엔자임 Q10을 생산할 경우, 코엔자임 Q8과 Q9의 부산물이 같이 나오는 것으로 알려져 있다 (Eur. J. Biochem., 255:52-59, 1998; Appl. Microbiol. Biotechnol., 67:192~196, 2005).

본 발명에서는, 코엔자임 Q10 생산시, 부산물을 감소시키기 위하여 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxidans) 이외의 미생물들로부터 디포스페이트 합성효소(DPS)를 코딩하는 ddsA 유전자를 분리하고, 이를 이용하여 코엔자임 Q10을 생산하는 실험을 수행하였다. 그 결과 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase)를 코딩하는 유전자를 이용하면, 코엔자임 Q9의 부산물 발생 없이, 목적하는 코엔자임 Q10을 생산할 수 있음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans ) 621H로부터 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase)를 코딩하는 유전자를 분리하고, 이를 도입시킨 재조합 대장균을 제조한 후, 이를 배양한 결과, 부산물인 코엔자임 Q9의 생성없이, 코엔자임 Q10이 생성 되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1로 표시되는, 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase, DPS)를 코딩하는 유전자(ddsA)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양한 다음, 배양된 재조합 미생물로부터 코엔자임 Q10을 회수하는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase, DPS)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 유전자(ddsA)는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 621H 유래인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 Agrobacterium 속, Aspergillus 속, Acetobacter 속, Aminobacter 속, Agromonas 속, Acidphilium 속, Bulleromyces 속, Bullera 속, Brevundimonas 속, Cryptococcus 속, Chionosphaera 속, Candida 속, Cerinosterus 속, Escherichia 속, Exisophiala 속, Exobasidium 속, Fellomyces 속, Filobasidium 속, Geotrichum 속, Graphiola 속, Gluconobacter 속, Kockovaella 속, Curtzmanomyces 속, Lalaria 속, Leucospoidium 속, Legionella 속, Psedozyma 속, Paracoccus 속, Petromyc 속, Rhodotorula 속, Rhodosporidium 속, Rhizomonas 속, Rhodobium 속, Rhodoplanes 속, Rhodopseudomonas 속, Rhodobacter 속, Sporobolomyces 속, Spridobolus 속, Saitoella 속, Schizosaccharomyces 속, Sphingomonas 속, Sporotrichum 속, Sympodiomycopsis 속, Sterigmatosporidium 속, Tapharina 속, Tremella 속, Trichosporon 속, Tilletiaria 속, Tilletia 속, Tolyposporium 속, Tilletiposis 속, Ustilago 속, Udenlomyce 속, Xanthophilomyces 속, Xanthobacter 속, Paecilomyces 속, Acremonium 속, Hyhomonus 속, Rhizobium 속 등을 예시할 수 있으며, Escherichia coli(대장균)인 것이 바람직하다.

상기 재조합 미생물로부터 코엔자임 Q10의 회수는 통상적인 방법을 이용할 수 있는데, 예를 들면 재조합 미생물(세포)를 파괴하여 세포 추출물을 획득한 후, 세포 추출물에 유기용매를 첨가하여 분획시키는 방법이다. 일반적으로 사용되는 세포 파괴 방법으로는 초음파 처리 또는 기계적인 압력 (French Pressure Cell, 볼 분쇄기)에 의한 세포용해, 화학적 용해, 효소에 의한 용해, 삼투압 충격 및 세정제나 와해제(Chaotropic agent)를 사용한 처리 등이 있다. 또한 상기 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 헥산 및 이들의 혼합물을 예시할 수 있으며, 헥산과 프로판올의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxidans) 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS) 유전자를 이용하여 코엔자임 Q10의 제조시, DPS 단백질의 70번째 아미노산인 알라닌을 글라이신으로 교체할 때 수율이 보다 향상된다는 보고(Eur . J. Biochem ., 255:52-59, 1998)를 바탕으로, 상기 글루코노박터 옥 시단스(Gluconobacter oxidans ) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS)를 코딩하는 유전자에 부위특이 돌연변이를 유발시킬 경우, 코엔자임 Q10의 수율이 더욱 증가될 것으로 예측하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS)를 코딩하는 유전자에 부위특이 돌연변이를 유발시키고, 이를 도입시킨 재조합 대장균을 제조한 후, 이를 배양한 결과, 부산물인 코엔자임 Q9는 생성되지 않으면서, 코엔자임 Q10이 더욱 많이 생성되었음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는, 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(modified decaprenyl diphosphate synthetase, mDPS), 상기 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(mDPS)를 코딩하는 유전자(mddsA) 및 상기 유전자(mddsA)를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상기 유전자(mddsA) 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양한 다음, 배양된 미생물로부터 코엔자임 Q10을 회수하는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자(mddsA)는 서열번호 3의 염기서열로 표시되며, 상기 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans ) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase, DPS)를 코딩하는 서열번호 1로 표시되는 유전자에 부위특이 돌연변이가 유발된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 부위특이 돌연변이는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자에서 209번째의 C가 G로 치환된 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter Oxidans) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase)의 70번째 아미노산인 알라닌(alanine)이 글라이신(glycine)으로 교체된다.

본 발명에 따른 상기 재조합 미생물은 통상의 방법에 따라 상기 유전자(mddsA)를 미생물의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터(pTL-Gmdds)를 미생물의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et. al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et. al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

상기 재조합 미생물로부터 코엔자임 Q10의 회수는 앞서 설명한 바와 동일한 방법으로 회수 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

시험예 1: G. oxydans 621H와 G. suboxydans 로부터 유래된 ddsA 유전자의 비교분석

homology 비교를 위하여, 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS)를 코딩하는 유전자와 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxidans) 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS)를 코딩하는 유전자의 염기서열 및 데카프레닐 디포스페이트 합성효소의 아미노산 서열을 비교하였다.

그 결과, 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, G. oxydans 621H와 G. suboxydans로부터 유래된 ddsA 유전자의 염기서열의 경우, 81% (775bp/948bp)의 유사성이 있는 것으로 나타났고, 또한 이들 유전자가 코딩하고 있는 합성효소의 아미노산 서열 의 경우, 89% (283aa/315aa)의 유사성이 있음을 확인하였다.

실시예 1: G. oxydans 621H 유래 ddsA 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용한 코엔자임 Q10 의 생산

1-1: G. oxydans 621H 유래 ddsA 유전자를 도입한 재조합 벡터(pTL-Gdds)의 제작

G. oxydans 621H(ATCC 621H)의 DPS 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터(pTL-Gdds)를 다음과 같이 제작하였다: 먼저, G. oxydans 621H의 염색체를 주형으로 하고, Dpsup: 5'-GTCGTCCATTCAGCAATGTG-3'(서열번호 5)과 Dpsdown: 5' -GCAGCCGTAAGTCG TTTAGG-3'(서열번호 6)를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 이때, 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 5분간 1회 수행하였고, 이후 두 번째 변성은 95℃에서 30초간, 교잡(annealing)은 50℃에서 30초간, 연장(extention)은 72℃에서 1분간 수행하였으며, 이를 30회 반복하고, 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 이로부터 확보된 중합효소연쇄반응의 결과물을 전기영동하여 약 900~1000 bp 크기의 DNA band를 gel로부터 얻어내었다.

이어서 확보된 DNA를 주형으로 하고, Dps1up: 5'-TGGAATTCAT GCAGGCCTGCAACCGCGCCA-3'(서열번호 7)과 Dps1down: 5'-GTGGTACCTTAGCGG GCGCGATCGACGGTA-3' (서열번호 8)을 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 이때, 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 5분간 1회 수행하였고, 이후 두 번째 변성은 95℃에서 30초간, 교잡(annealing)은 50℃에서 30초간, 연 장(extention)은 72℃에서 1분간 수행하였으며, 이를 30회 반복하고, 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행하였다.

이로부터 확보된 ddsA 유전자(서열번호 1)를 EcoRI과 KpnI으로 절단하고, 이를 trc 프로모터를 가진 벡터(pTrc99A)의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 pT-Gdds 벡터를 제작하였다. 이어서, trc 프로모터가 상시 작동되어, 해당 벡터에 클로닝한 유전자(ddsA)가 연속적으로 발현될 수 있도록 염색체 상의 lacI 유전자를 결실시켰다. 즉, pT-Gdds를 제한효소 NarI과 NdeI으로 절단하고 잘리부위를 klenow polymerase로 blunt end를 만든 후, ligation 함으로써 lacI^q가 제거된 pTL-Gdds 벡터를 제작하였다.

1-2: G. oxydans 621H 유래 ddsA 유전자가 도입된 재조합 미생물 제작 및 코엔자임 Q10의 생산

상기 실시예 1-1에서 제작된 pTL-Gdds를 대장균 W3110 (ATCC 27325)로부터 lacI 유전자가 결손된 대장균 WL3110에 도입하여, G. oxydans 621H 유래 ddsA 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제작하였다. 다음으로 제작된 재조합 미생물을 2YT(Bacto Trypton (Difco) 1.6%, Yeast extract (Difco) 0.5%, NaCl (Junsei) 0.5%) 배지(50ug/ml 암피실린)에서 30℃, 220rpm 조건으로 12~18시간 배양하였다.

배양액을 13000rpm으로 2min동안 원심분리를 실시한 후, 배양액을 버리고 세포를 획득하였다. 획득된 세포를 0.85% NaCl 용액으로 2회 washing 한 후, 450ul의 Cell Lytic B (시그마 알드리치)용액과 50ul의 lysozyme 용액 (10 mg/ml)을 넣어주고, 이를 37℃ 조건에서 30분간 교반하여 세포 추출물(cell extract)을 획득하였다. 이후 코엔자임 Q10을 추출하기 위해 900ul의 hexane:n-propanol (5:3) 혼합용액을 넣어주고 교반하였다. 30초간 원심분리하여 두 개층으로 분리된 용액중 위쪽의 유기용매 층을 새로운 튜브로 옮겨주었다. 계속해서 500ul의 hexane을 넣어주고 한번 더 교반 후, 원심분리하여 위쪽의 유기용매 층을 추가적으로 옮겨주었다. 이렇게 얻어진 유기용매 층을 speed-vac을 이용하여 유기용매을 모두 증발시킨 후 얻어진 추출물을 100% 에탄올로 녹여낸 후, 이를 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석을 위하여 Discovery^® C18 column (15cm x 4.6mm, 5um, Supelco)을 이용하였으며, 에탄올:메탄올=7:3의 혼합액을 이동상으로 하여 1 ml/min 조건에서 275nm의 파장으로 분석하였다. 그 결과, 코엔자임 Q8(retention time: 약 3분 50초) 및 코엔자임 Q10(retention time: 약 5분 10초)의 피크를 확인할 수 있었으나, 코엔자임 Q9의 피크는 나타나지 않았다.

실시예 2: G. oxydans 621H의 변이 mddsA 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용한 코엔자임 Q10 의 생산

2-1: G. oxydans 621H 유래 dds 유전자의 돌연변이 유발

실시예 1-1에서 제작된 재조합 벡터(pTL-Gdds)의 ddsA 유전자(서열번호 1)를 특정부위 돌연변이유발 중합효소연쇄반응을 이용하여 변이시켰다. 즉, pTL-Gdds를 주형으로 하고, Dps1up: 5'-TGGAATTCAT GCAGGCCTGCAACCGCGCCA-3' (서열번호 7), Dps1down: 5'-GTGGTACCTTAGCGG GCGCGATCGACGGTA-3' (서열번호 8), pTL-Gddsup: 5'-ATCCATACCGGTACGCTGCTT-3' (서열번호 9) 및 pTL-Gddsdown: 5'-AAGCAGCGTACCGGTATGGAT-3' (서열번호 10)을 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 서열번호 1의 유전자(ddsA)에서 209번째의 C가 G로 치환된 서열번호 3으로 표시되는 재조합 유전자(mddsA)를 제작하였다. 상기 재조합 유전자(mddsA)는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS)의 70번째 아미노산인 알라닌(alanine)이 글라이신(glycine)으로 치환된 것이다.

2-2: G. oxydans 621H의 mddsA 유전자를 도입한 재조합 벡터(pTL-mGdds)의 제작

실시예 2-1에서 제작된 재조합 유전자(mddsA)를 EcoRI과 KpnI으로 절단하고, 이를 lacI^q가 제거된 pTL99A의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 pTL-Gmdds를 제작하였다(도 3).

2-3: G. oxydans 621H 유래 mddsA 유전자가 도입된 재조합 미생물 제작 및 코엔자임 Q10의 생산

상기 실시예 2-2에서 제작된 pTL-Gmdds를 대장균 W3110 (ATCC 27325)로부터 lacI 유전자가 결손된 대장균 WL3110에 도입하여, G. oxydans 621H 유래 mddsA 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제작하였다. 다음으로 제작된 재조합 미생물을 2YT(Bacto Trypton (Difco) 1.6%, Yeast extract (Difco) 0.5%, NaCl (Junsei) 0.5%)배지(50ug/ml 암피실린)에서 30℃, 220rpm 조건으로 12~18시간 배양하였다.

배양액으로부터 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 세포 추출물을 획득하고, 세포 추출물을 유기용매로 분획한 후, HPLC를 이용하여 코엔자임 Q10을 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 코엔자임 Q8(retention time: 약 3분50초) 및 코엔자임 Q10(retention time: 약 5분 10초)의 피크를 확인할 수 있었으나, 코엔자임 Q9의 피크는 나타나지 않았다. 따라서, 코엔자임 Q9의 부산물이 발생되지 않은 만큼 상대적으로 코엔자임 Q10의 수율이 증가된 것으로 추정된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 예로서, G. oxydans 621H의 DPS 단백질을 과다발현시킬 수 있는 방법으로, ddsA 유전자를 기타 발현벡터 내에 도입하거나 숙주세포의 염색체에 융합하는 것 동일한 효과를 가져올 수 있음은 당업계 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 글루코노박터 옥시단스 621H와 글루코노박터 서브옥시단스의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS) 유전자 염기서열을 비교한 것이다.

도 2는 글루코노박터 옥시단스 621H와 글루코노박터 서브옥시단스의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(DPS) 단백질 아미노산 서열을 비교한 것이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter Oxidans) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase)를 코딩하는 유전자에 부위특이 돌연변이가 유발된 재조합 유전자(mddsA)가 삽입된 재조합 발현 벡터(pTL-Gmdds)의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 재조합 미생물의 세포추출물을 HPLC로 분석한 결과이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Microorganisms Having Producibility of Coenzyme Q10 and Method for Preparing Coenzyme Q10 Using the Same <130> p07-b271 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 948 <212> DNA <213> Gluconobacter oxydans <400> 1 atgcaggcct gcaaccgcgc catcatcgcg cggatggaga gcccggtccc gctcattcca 60 cagcttggcg cccatcttgt cgcggctggc ggcaagcgtc tgcgacccct gctgacactc 120 gcctcctccc gtctgtgcgg ctacaagtcg actcctgaaa accagcgtca tgtcggcctc 180 gccgcctgtg tggagttcat ccataccgct acgctgcttc acgatgacgt ggtcgatgag 240 agcaacctgc gccgtggtct ggcatctgcc aacgccgtgt ttggcaacaa ggcctccgtc 300 ctggtcggcg acttcctgtt tgcgcggtcg ttccagctga tgacggcgga cgggtcgctc 360 aaggtcatgg cgatcctgtc cgatgcgtcg gcaaccattg ccgaaggcga agtcctgcag 420 atggtgacgc agaacgacct gtctacgccg gtcgaccgct atctcgaagt cattcacggc 480 aagacggccg ccctgtttgc ggcggcctgc cgcgtgggcg cagtggtcgc ggatcgtccg 540 gaagcggaag agcttgcgct ggaccgtttc ggaaccaatc tgggtatggc gttccagctt 600 gtcgatgatg ctctggatta cgcagccgac cagcagatcc tcggcaagac ggtcggtgac 660 gacatgcgcg aaggcaagat cacgctgccg gttctggccg cctatgaagc cggatctgcg 720 gaagaccggg cattctggga gcgtgtgatc gagaagggtg agcagacgga agccgatctg 780 ccccacgctc tggccctgat cgagaagacc ggcgccattg caacgacgat cgcccgcgcg 840 caggcctatg ccgccgaggc tgtggatgcg ctgtcgattt tcccggatag tgaactgcgt 900 cgccttatga cggagacggt ccagtatacc gtcgatcgcg cccgctaa 948 <210> 2 <211> 315 <212> PRT <213> Gluconobacter oxydans <400> 2 Met Gln Ala Cys Asn Arg Ala Ile Ile Ala Arg Met Glu Ser Pro Val 1 5 10 15 Pro Leu Ile Pro Gln Leu Gly Ala His Leu Val Ala Ala Gly Gly Lys 20 25 30 Arg Leu Arg Pro Leu Leu Thr Leu Ala Ser Ser Arg Leu Cys Gly Tyr 35 40 45 Lys Ser Thr Pro Glu Asn Gln Arg His Val Gly Leu Ala Ala Cys Val 50 55 60 Glu Phe Ile His Thr Ala Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val Asp Glu 65 70 75 80 Ser Asn Leu Arg Arg Gly Leu Ala Ser Ala Asn Ala Val Phe Gly Asn 85 90 95 Lys Ala Ser Val Leu Val Gly Asp Phe Leu Phe Ala Arg Ser Phe Gln 100 105 110 Leu Met Thr Ala Asp Gly Ser Leu Lys Val Met Ala Ile Leu Ser Asp 115 120 125 Ala Ser Ala Thr Ile Ala Glu Gly Glu Val Leu Gln Met Val Thr Gln 130 135 140 Asn Asp Leu Ser Thr Pro Val Asp Arg Tyr Leu Glu Val Ile His Gly 145 150 155 160 Lys Thr Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ala Cys Arg Val Gly Ala Val Val 165 170 175 Ala Asp Arg Pro Glu Ala Glu Glu Leu Ala Leu Asp Arg Phe Gly Thr 180 185 190 Asn Leu Gly Met Ala Phe Gln Leu Val Asp Asp Ala Leu Asp Tyr Ala 195 200 205 Ala Asp Gln Gln Ile Leu Gly Lys Thr Val Gly Asp Asp Met Arg Glu 210 215 220 Gly Lys Ile Thr Leu Pro Val Leu Ala Ala Tyr Glu Ala Gly Ser Ala 225 230 235 240 Glu Asp Arg Ala Phe Trp Glu Arg Val Ile Glu Lys Gly Glu Gln Thr 245 250 255 Glu Ala Asp Leu Pro His Ala Leu Ala Leu Ile Glu Lys Thr Gly Ala 260 265 270 Ile Ala Thr Thr Ile Ala Arg Ala Gln Ala Tyr Ala Ala Glu Ala Val 275 280 285 Asp Ala Leu Ser Ile Phe Pro Asp Ser Glu Leu Arg Arg Leu Met Thr 290 295 300 Glu Thr Val Gln Tyr Thr Val Asp Arg Ala Arg 305 310 315 <210> 3 <211> 948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mddsA <400> 3 atgcaggcct gcaaccgcgc catcatcgcg cggatggaga gcccggtccc gctcattcca 60 cagcttggcg cccatcttgt cgcggctggc ggcaagcgtc tgcgacccct gctgacactc 120 gcctcctccc gtctgtgcgg ctacaagtcg actcctgaaa accagcgtca tgtcggcctc 180 gccgcctgtg tggagttcat ccataccggt acgctgcttc acgatgacgt ggtcgatgag 240 agcaacctgc gccgtggtct ggcatctgcc aacgccgtgt ttggcaacaa ggcctccgtc 300 ctggtcggcg acttcctgtt tgcgcggtcg ttccagctga tgacggcgga cgggtcgctc 360 aaggtcatgg cgatcctgtc cgatgcgtcg gcaaccattg ccgaaggcga agtcctgcag 420 atggtgacgc agaacgacct gtctacgccg gtcgaccgct atctcgaagt cattcacggc 480 aagacggccg ccctgtttgc ggcggcctgc cgcgtgggcg cagtggtcgc ggatcgtccg 540 gaagcggaag agcttgcgct ggaccgtttc ggaaccaatc tgggtatggc gttccagctt 600 gtcgatgatg ctctggatta cgcagccgac cagcagatcc tcggcaagac ggtcggtgac 660 gatatgcgcg aaggcaagat cacgctgccg gttctggccg cctatgaagc cggatctgcg 720 gaagaccggg cattctggga gcgtgtgatt gagaagggtg agcagacgga agccgatctg 780 ccccacgctc tggccctgat cgagaagacc ggcgccattg caacgacgat 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Ala Ala Cys Arg Val Gly Ala Val Val 165 170 175 Ala Asp Arg Pro Glu Ala Glu Glu Leu Ala Leu Asp Arg Phe Gly Thr 180 185 190 Asn Leu Gly Met Ala Phe Gln Leu Val Asp Asp Ala Leu Asp Tyr Ala 195 200 205 Ala Asp Gln Gln Ile Leu Gly Lys Thr Val Gly Asp Asp Met Arg Glu 210 215 220 Gly Lys Ile Thr Leu Pro Val Leu Ala Ala Tyr Glu Ala Gly Ser Ala 225 230 235 240 Glu Asp Arg Ala Phe Trp Glu Arg Val Ile Glu Lys Gly Glu Gln Thr 245 250 255 Glu Ala Asp Leu Pro His Ala Leu Ala Leu Ile Glu Lys Thr Gly Ala 260 265 270 Ile Ala Thr Thr Ile Ala Arg Ala Gln Ala Tyr Ala Ala Glu Ala Val 275 280 285 Asp Ala Leu Ser Ile Phe Pro Asp Ser Glu Leu Arg Arg Leu Met Thr 290 295 300 Glu Thr Val Gln Tyr Thr Val Asp Arg Ala Arg 305 310 315 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpsup primer <400> 5 gtcgtccatt cagcaatgtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpsdown primer <400> 6 gcagccgtaa gtcgtttagg 20 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dps1up primer <400> 7 tggaattcat gcaggcctgc aaccgcgcca 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dps1down primer <400> 8 gtggtacctt agcgggcgcg atcgacggta 30 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTL-Gddsup primer <400> 9 atccataccg gtacgctgct t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTL-Gddsdown primer <400> 10 aagcagcgta ccggtatgga t 21

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는, 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase, DPS)를 코딩하는 유전자(ddsA)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase, DPS)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 유전자(ddsA)는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 621H 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제1항의 재조합 미생물을 배양한 다음, 배양된 미생물로부터 코엔자임 Q10을 회수하는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10의 제조방법.
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글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxidans) 621H 유래의 데카프레닐 디포스페이트 합성효소(decaprenyl diphosphate synthetase, DPS)를 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자에서 209번째의 C가 G로 치환된 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 유전자(mddsA) 또는 상기 유전자(mddsA)를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제13항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제13항의 재조합 미생물을 배양한 다음, 배양된 미생물로부터 코엔자임 Q10을 회수하는 것을 특징으로 하는 코엔자임 Q10의 제조방법.