TW201634060A - 生理活性物質結合嵌段共聚物 - Google Patents

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Chisato Tomiyama
Yasushi Yoneta
Yuichi Akatsu
Keiichirou Yamamoto
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Abstract

本發明之課題在於提供一種較公知之生理活性物質結合嵌段共聚物可提高向疾病靶組織之浸透性及/或提高排泄性從而抑制生理活性物質對疾病靶組織以外之正常組織致敏，藉此提高有效性及/或安全性之生理活性物質結合嵌段共聚物。本發明之嵌段共聚物係聚乙二醇鏈段與結合有生理活性物質之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成者，其分子量為2kDa以上且15kDa以下，該生理活性物質結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之利用雷射光散射光度計所測得之光散射強度為甲苯之光散射強度之至少2倍以上。

Description

生理活性物質結合嵌段共聚物
本發明係關於一種生理活性物質之高分子化衍生物及其用途。
業界開發有如下藥物遞送系統(DDS)，其係控制醫藥品中作為有效成分之生理活性物質之藥物動態，並將該生理活性物質以所需之藥物濃度-作用時間遞送至活體內之特異性作用部位。非專利文獻1中記載有以聚乙二醇鏈段與聚胺基酸鏈段連結而成之嵌段共聚物作為藥劑遞送載體之DDS化製劑。記載有該嵌段共聚物表現出聚集性，形成具有聚乙二醇之外殼與疏水性內核之粒徑為20~100nm之高分子微胞形狀，且藉由化學鍵結或物理納入而將各種藥劑穩定地包含於內核中。已知該高分子微胞型DDS製劑係以若投予至活體內則排泄受到抑制而體內滯留性提高為特徵，且該製劑會被動性地向腫瘤等組織移行並聚集。因此，可藉由使生理活性物質長時間滯留於活體內而提高有效成分之利用率，利用該等系統之藥劑與搭載藥相比，能夠發揮出更強力之生理活性效果。
關於上述高分子微胞型DDS製劑，已知有藉由化學鍵結而使藥劑包含於該高分子微胞內核中而成之製劑。例如專利文獻1中記載有喜樹鹼衍生物之製劑例。又，專利文獻2中記載有具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物之製劑例，專利文獻3中記載有紫杉烷衍生物之製劑例，專利文獻4中記載有類固醇衍生物之製劑例，揭示有可應用於各種藥劑之各種生理活性物質結合嵌段共聚物。
先前之生理活性物質結合嵌段共聚物可使結合藥劑之血中滯留性提高。因此，不僅使藥劑長時間作用於疾病組織，亦會使藥劑長時間作用於正常組織。例如專利文獻1所記載之結合有作為抗腫瘤劑之喜樹鹼衍生物之嵌段共聚物於活體內會緩釋性地解離喜樹鹼衍生物。其結果為，不僅使游離之喜樹鹼衍生物持續長期對腫瘤組織發揮作用，亦會使游離之喜樹鹼衍生物持續長期對骨髄等正常組織發揮作用。因此，先前之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物發揮出強力之抗腫瘤效果，同時不可避免地表現出嗜中性球減少等骨髄抑制，此情況成為用量制限毒性(DLT：dose limiting toxity)(非專利文獻2)。因此，業界謀求開發出維持抗腫瘤效果，並且進一步減輕骨髄抑制之喜樹鹼衍生物。如上所述，先前之生理活性物質結合嵌段共聚物雖然可發揮出強力之藥理活性效果，但對於正常組織亦表現出副作用。
因此，關於上述高分子微胞型DDS製劑，謀求開發出維持作為其特徵之生理活性機能之增強效果，並且抑制對正常組織之藥理活性機能表現而減輕副作用之生理活性物質結合嵌段共聚物。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開WO2004/039869號
[專利文獻2]國際公開WO2008/041610號
[專利文獻3]國際公開WO2007/111211號
[專利文獻4]國際公開WO2009/041570號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Advanced Drug Delivery Reviews、2008年、60卷、899~914頁
[非專利文獻2]Clinical Cancer Research、2010年、16卷、5058~5066頁
本發明之課題在於提供一種較公知之生理活性物質結合嵌段共聚物，有效性及/或安全性得到提高之生理活性物質結合嵌段共聚物。具體而言，本發明之課題在於：與公知之生理活性物質結合嵌段共聚物相比，提高向疾病靶組織之浸透性而使藥理活性物質之作用提高，藉此有效率地發揮藥理活性效果。及/或本發明之課題在於：藉由使該嵌段共聚物於腎臟等中之排泄性提高而控制血中滯留性，而抑制生理活性物質對疾病靶組織以外之正常組織致敏，藉此避免正常組織之損傷表現。
本發明者等人為解決上述課題而進行銳意研究，結果發現，如下嵌段共聚物可提高有效性及/或安全性，從而完成本發明，上述嵌段共聚物係聚乙二醇鏈段與結合有生理活性物質之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成者，且其分子量為2kDa以上且15kDa以下，該生理活性物質結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之利用雷射光散射光度計所測得之光散射強度為於與上述相同之測定條件下的甲苯之光散射強度之至少2倍以上。又，就另一觀點而言，如下嵌段共聚物可提高有效性及/或安全性，從而完成本發明，上述嵌段共聚物係聚乙二醇鏈段與結合有生理活性物質之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成者，該嵌段共聚物基於聚集性而形成奈米粒子，且上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下。
即，本發明係關於下述之[1]~[17]。
[1]一種嵌段共聚物，其係聚乙二醇鏈段、與包含於側鏈羧基鍵結有具有羥基及/或胺基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或麩胺酸衍生物之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成者，且 上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下，且於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm之測定條件下利用雷射光散射光度計所測得之上述嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之光散射強度為上述測定條件下之甲苯之光散射強度之至少2倍以上。
[2]一種嵌段共聚物，其係聚乙二醇鏈段、與包含於側鏈羧基鍵結有具有羥基及/或胺基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或麩胺酸衍生物之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成的具有奈米粒子形成能力者，且上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下。
[3]如上述[1]或[2]記載之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物中之上述聚乙二醇鏈段之質量含有率為10質量%以上且80質量%以下。
[4]如上述[3]記載之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物中之上述聚乙二醇鏈段之質量含有率為30質量%以上且65質量%以下。
[5]如上述[1]至[4]中任一項記載之嵌段共聚物，其中上述聚乙二醇鏈段之分子量為1kDa~10kDa。
[6]如上述[1]至[5]中任一項記載之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物中之上述具有羥基及/或胺基之生理活性物質之質量含有率為10質量%以上且60質量%以下。
[7]如上述[1]至[6]中任一項記載之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物以通式(1)表示，[化1]
[式中，R1表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，t表示20~270之整數，A表示可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，R2表示選自由氫原子、碳數(C1~C6)醯基及碳數(C1~C6)烷氧羰基所組成之群中之取代基，R3表示具有羥基及/或胺基之生理活性物質之鍵結殘基，R4表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基、螢光物質之鍵結殘基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基，B表示鍵結基，n表示1或2，x1、x2、y1、y2及z分別獨立地表示0~25之整數，(x1+x2)表示1~25之整數，(x1+x2+y1+y2+z)表示3~25之整數，鍵結有上述R3及R4之各構成單元以及支鏈羰基進行分子內環化之構成單元分別獨立為無規排列之結構]。
[8]如上述[1]至[7]中任一項記載之嵌段共聚物，其中具有羥基及/或胺基之生理活性物質為選自由喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、蒽環黴素衍生物、雷帕黴素衍生物、胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑、葉酸代謝拮抗劑、嘌呤系代謝拮抗劑、氟化嘧啶系代謝拮抗劑、鉑衍生物、絲裂黴素衍生物、博萊黴素衍生物、長春花生物鹼衍生物、鬼臼毒素衍生物、軟海綿素衍生物、星孢菌素衍生物、沙利竇 邁衍生物、維生素A衍生物、康普瑞汀(Complestatin)衍生物、抗雄性素劑、抗雌性素劑、激素劑、他克莫司衍生物、類固醇衍生物、雷帕黴素衍生物、多烯系抗生物質、唑系衍生物、Candin系衍生物、嘧啶衍生物所組成之群中之1種以上之生理活性物質。
[9]如上述[8]記載之嵌段共聚物，其中具有羥基及/或胺基之生理活性物質為選自由喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、蒽環黴素衍生物、雷帕黴素衍生物、胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑、葉酸代謝拮抗劑、嘌呤系代謝拮抗劑、氟化嘧啶系代謝拮抗劑、鉑衍生物、絲裂黴素衍生物、博萊黴素衍生物、長春花生物鹼衍生物、鬼臼毒素衍生物、軟海綿素衍生物、星孢菌素衍生物、沙利竇邁衍生物、維生素A衍生物、康普瑞汀(Complestatin)衍生物、抗雄性素劑、抗雌性素劑、激素劑所組成之群中之1種以上之抗腫瘤劑。
[10]如上述[7]記載之嵌段共聚物，其中R3為通式(2)所表示之喜樹鹼衍生物之鍵結殘基，
[式中，R5表示選自由氫原子、可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基及可具有取代基之矽烷基所組成之群中之1種，R6表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基]。
[11]如上述[7]記載之嵌段共聚物，其中R3為通式(3)所表示之間苯二酚衍生物之鍵結殘基，
[式中，R7表示選自由巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔基、碳環或雜環芳基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、碳數(C1~C8)之醯基、羧基、碳數(C1~C8)之烷氧羰基、胺甲醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種，R8表示選自由可具有取代基之碳環或雜環芳基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔基、碳數(C1~C20)之烷基胺基及碳數(C1~C20)之醯基胺基所組成之群中之1種，環H為選自由通式(3-1)、(3-2)及(3-3)所組成之群中之雜環芳基，[化4]
[式中，R9表示選自由巰基、羥基、氫原子、鹵素原子、胺甲醯基、碳數(C1~C20)之烷氧羰基、氰基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)之烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)之烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、碳數(C1~C8)之醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種]。
[12]如上述[7]記載之嵌段共聚物，其中R3為太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇或卡巴他賽(Cabazitaxel)之鍵結殘基。
[13]一種嵌段共聚物，其係藉由使用縮合劑，使聚乙二醇鏈段與含有天冬胺酸及/或麩胺酸之聚胺基酸鏈段連結而成之嵌段共聚物、具有羥基及/或胺基之生理活性物質、以及任意之具有羥基及/或胺基之疏水性取代基進行反應而獲得者，且上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下，且於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm之測定條件下利用雷射光散射光度計所測得之上述嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之光散射強度為上述測定條件下之甲苯之光散射強度之至少2倍以上。
[14]一種奈米粒子，其係由如上述[1]至[13]中任一項記載之嵌段共聚物所形成。
[15]如上述[14]記載之奈米粒子，其中上述奈米粒子之體積平均粒徑未達20奈米。
[16]一種醫藥品，其以如上述[1]至[13]中任一項記載之嵌段共聚物或如上述[14]或[15]記載之奈米粒子作為有效成分。
[17]一種抗腫瘤劑，其以如上述[1]至[13]中任一項記載之嵌段共聚物或如上述[14]或[15]記載之奈米粒子作為有效成分。
本發明之嵌段共聚物之特徵在於：其係聚乙二醇鏈段與結合有生理活性物質之聚胺基酸鏈段連結而成者，且該嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下，該嵌段共聚物水溶液之利用雷射光散射光度計所測得之光散射強度為甲苯之光散射強度之至少2倍以上。
又，就另一觀點而言，本發明之嵌段共聚物係如下嵌段共聚物，其係聚乙二醇鏈段與結合有生理活性物質之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成之具有奈米粒子形成能力者，且上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下。
由本案發明之嵌段共聚物形成之奈米粒子具有較公知之高分子微胞型DDS製劑小之體積平均粒徑，而於投予至活體內後，向靶組織滲透及/或於腎臟等中之排泄性提高。因此本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物與公知之嵌段共聚物相比，具有向靶組織之較高浸透性，因此可使生理活性物質對靶組織之廣範圍致敏，故而可有效率地發揮藥理活性效果。以及/或者，由於該嵌段共聚物於腎臟等中之排泄性提高，故而可藉由控制血中滯留性而抑制生理活性物質對靶組織以外之正常組織致敏而避免正常組織之損傷表現。
尤其是於使用抗腫瘤劑作為生理活性物質之情形時，可藉由提高該嵌段共聚物向腫瘤組織之浸透性、及/或提高腎排泄性，而達成抗腫瘤效果之增強及/或骨髄抑制等正常組織損傷之背離。
圖1係表示人類胰腺癌BxPC3腫瘤切片中之實施例A-4及比較例A-4之組織內分佈之圖像。
圖2係表示腎臟切片中之實施例A-4及比較例A-4之組織內分佈之圖像。
圖3係表示人類胰腺癌BxPC3腫瘤切片及腎臟切片中之實施例B-2及比較例B-2之組織內分佈之圖像。
圖4係表示對人類結腸癌Col-5-JCK之實施例B-1、比較例B-1及Ganetesipib之抗腫瘤效果之結果。
圖5係表示對人類結腸癌Co-3-KIST之實施例B-1、比較例B-1及Ganetesipib之抗腫瘤效果之結果。
圖6係表示對人類乳腺癌MC-19-JCK之實施例B-1、比較例B-1及Ganetesipib之抗腫瘤效果之結果。
圖7係表示人類胰腺癌BxPC3腫瘤切片及腎臟切片中之實施例C-3、比較例C-2及比較例C-3之組織內分佈之圖像。
本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物係聚乙二醇鏈段與含有天冬胺酸衍生物及/或麩胺酸衍生物之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成者，並且上述聚胺基酸衍生物鏈段包含於側鏈羧基鍵結有具有羥基及/或胺基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或麩胺酸衍生物，上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下，於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm之測定條件下利用雷射光散射光度計所測得之上述嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之光散射強度為上述測定條件下之甲苯之光散射強度之至少2倍以上。
又，就另一觀點而言，本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物係聚乙二醇鏈段與含有天冬胺酸衍生物及/或麩胺酸衍生物之聚胺基 酸衍生物鏈段連結而成之具有奈米粒子形成能力者，並且上述聚胺基酸衍生物鏈段包含於側鏈羧基鍵結有具有羥基及/或胺基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或麩胺酸衍生物，上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下。
即，該嵌段型共聚物係使用有如下嵌段共聚物之DDS化製劑，該嵌段共聚物係以聚乙二醇鏈段與聚胺基酸衍生物鏈段藉由適當之鍵結基連結而成之嵌段型共聚物為主鏈，並使其與生理活性物質結合而成。以下，對其詳細內容進行說明。
本發明之嵌段共聚物中之聚乙二醇鏈段係具有伸乙基氧基：(CH2CH2O)單元之重複結構之鏈段。較佳為包含伸乙基氧基單元聚合度為10~300單元、更佳為聚合度為20~270單元之聚乙二醇鏈之鏈段結構。
即，所謂該聚乙二醇鏈段，較佳為以相當於聚乙二醇之分子量計為0.4kDa~13kDa之鏈段部，更佳為以分子量計為0.8kDa~12kDa之結構部分，尤佳為以分子量計為1kDa~10kDa。特別較佳為分子量為1kDa~5kDa之聚乙二醇鏈段。
再者，本發明中所使用之所謂聚乙二醇鏈段之分子量，係採用如下平均分子量，該平均分子量係根據於製備本發明之嵌段共聚物時所使用之聚乙二醇鏈段結構化合物之藉由以聚乙二醇標準品為基準之GPC法所測得之峰頂分子量而求出。
該聚乙二醇鏈段之一末端基係用以與下述之聚胺基酸衍生物鏈段鍵結之連結基。並且，另一末端基並無特別限定，可列舉：氫原子、羥基、可具有取代基之碳數(C1~C6)之烷氧基、可具有取代基之碳數(C7~C20)之芳烷氧基等。作為該烷氧基、芳烷氧基中之取代基，可列舉：羥基、胺基、甲醯基、羧基等。又，亦可經由上述取代基而具備靶向性分子。作為靶向性分子，可列舉：蛋白質或肽或者葉 酸等。
作為該末端基中之可具有取代基之碳數(C1~C6)之烷氧基，可列舉：直鏈、支鏈或環狀之碳數(C1~C6)之烷氧基。例如可列舉：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、2-甲基丁氧基、新戊氧基、1-乙基丙氧基、正己氧基、4-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、1-甲基戊氧基、3,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基、1,3-二甲基丁氧基、2,3-二甲基丁氧基、2-乙基丁氧基、環丙氧基、環戊氧基或環己氧基等。較佳為碳數(C1~C4)之烷氧基，例如為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第二丁氧基或第三丁氧基等，尤佳為甲氧基、乙氧基、正丙氧基或異丙氧基。
作為該末端基中之可具有取代基之碳數(C7~C20)之芳烷氧基，係任一處之氫原子被取代為芳基之直鏈或支鏈烷基。例如可列舉：苄氧基、2-苯基乙氧基、4-苯基丁氧基、3-苯基丁氧基、5-苯基戊氧基、6-苯基己氧基、8-苯基辛氧基等。較佳為苄氧基、4-苯基丁氧基、8-苯基辛氧基。
該聚乙二醇鏈段之末端基較佳為羥基或可具有取代基之碳數(C1~C6)之烷氧基。
本發明中之聚胺基酸衍生物鏈段係包含於側鏈羧基鍵結有具有羥基及/或胺基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或聚麩胺酸衍生物之聚胺基酸鏈段。即，至少1單元以上之包含結合有上述生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或麩胺酸衍生物之聚胺基酸鏈段。該聚胺基酸鏈段可為直鏈狀聚胺基酸鏈段，亦可為經由支鏈之支鏈型結構之鏈段。該聚胺基酸鏈段較佳為胺基酸以2~30單元聚合而成之鏈段結構。更佳為3~25單元之聚合物，特別較佳為5~20單元之聚合物。
構成該聚胺基酸鏈段之胺基酸並無特別限定，可使用天然型胺基酸、合成胺基酸及其側鏈修飾體中之任一種。又，亦可使用L體、D體及外消旋體中之任一種。例如可列舉：甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、鳥胺酸、半胱胺酸等。又，作為側鏈經修飾之胺基酸，可列舉：天冬胺酸或麩胺酸之烷基酯、天冬胺酸或麩胺酸之芳烷基酯、天冬胺酸或麩胺酸之烷基醯胺、天冬胺酸或麩胺酸之芳烷基醯胺、Boc賴胺酸等烷氧基羰基賴胺酸等。該聚胺基酸鏈段可為該等胺基酸中之任意1種，亦可混合存在複數種而構建鏈段。
關於該聚胺基酸鏈段，就包含於側鏈羧基鍵結有具有羥基及/或胺基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或聚麩胺酸衍生物之方面而言，較佳為由天冬胺酸及/或麩胺酸構建而成之聚胺基酸鏈段。更佳為僅由天冬胺酸構建而成之聚天冬胺酸鏈段、或者僅由麩胺酸構建而成之聚麩胺酸鏈段。即，於包含於側鏈羧基鍵結有具有羥基及/或胺基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物之情形時，較佳為採用聚天冬胺酸鏈段，於包含於側鏈羧基鍵結有具有羥基及/或胺基之生理活性物質之麩胺酸衍生物之情形時，較佳為採用聚麩胺酸鏈段。聚天冬胺酸或聚麩胺酸之聚合方式係肽結合，可為α結合體，亦可為β結合體或γ結合體，亦可為該等之混合物。
該聚胺基酸鏈段之一末端基係用以與上述聚乙二醇鏈段鍵結之連結基。並且，另一末端基可為N末端基及C末端基，亦可為無保護之游離胺基及游離羧酸、以及該等之鹽，亦可為N末端基及C末端基之適當修飾體。
作為N末端基之修飾體，可列舉：醯基醯胺型修飾體、烷氧基羰基醯胺型修飾體(胺基甲酸酯型修飾體)、烷基胺基羰基醯胺型修飾體(脲型修飾體)等。另一方面，作為該C末端基之修飾體，可列舉：酯 型修飾體、醯胺型修飾體、硫酯型修飾體。
該N末端基及該C末端基之修飾基可為任意之修飾基，較佳為經由與N末端基及C末端基鍵結之適當鍵結基，可列舉可具有取代基之碳數(C1~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基、可具有取代基之碳數(C6~C18)之芳香族基、可具有取代基之碳數(C7~C20)之芳烷基等。
即，N末端基較佳為適當之醯基醯胺型修飾體或烷氧基羰基醯胺型修飾體(胺基甲酸酯型修飾體)，較佳為經由羰基或羰氧基之上述可具有取代基之碳數(C1~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基、可具有取代基之碳數(C6~C18)之芳香族基、可具有取代基之碳數(C7~C20)之芳烷基。
另一方面，作為C末端基，較佳為適當之醯胺型取代基或酯型取代基，較佳為經由醯胺基或酯基之上述可具有取代基之碳數(C1~C8)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基、可具有取代基之碳數(C6~C18)之芳香族基、可具有取代基之碳數(C7~C20)之芳烷基。
作為該末端基中之可具有取代基之碳數(C1~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第三丁基、環己基等。
作為該末端基中之可具有取代基之碳數(C6~C18)芳香族基，可列舉：苯基、吡啶基、萘基等。
作為該末端基中之可具有取代基之碳數(C7~C20)之芳烷基，係任一處之氫原子被取代為芳基之直鏈或支鏈烷基。例如可列舉：苄基、2-苯基乙基、4-苯基丁基、8-苯基辛基等。
該聚胺基酸鏈段之該末端基較佳為N末端基及C末端基之修飾體。
本發明係連結有包含於側鏈羧基鍵結有具有羥基及/或胺基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或聚麩胺酸衍生物之聚胺基酸衍生 物鏈段的嵌段共聚物。該所謂具有羥基及/或胺基之生理活性物質，只要為具有羥基及/或胺基作為利用酯鍵或醯胺鍵之鍵結性官能基之生理活性物質，則可無特別限定地應用。又，只要為包含生理活性物質之物質即可，且可藉由將該生理活性物質進行衍生物化或前驅藥化而導入羥基及/或胺基，從而用作該具有羥基及/或胺基之生理活性物質。
本發明係使用嵌段共聚物作為生理活性物質載體之技術，尤其是在不影響所使用之生理活性物質之藥理活性機能或化學結構及物性之情況下可應用於所有物質之通用性較高之技術。因此，本發明並不限於該等應用於疾病治療之生理活性物質，且只要為具有鍵結性之羥基及/或胺基之生理活性物質，則可應用任何物質。
本發明之嵌段共聚物之特徵在於：其組織浸透性提高，因此較佳為用於局部之組織疾病之治療。作為此種疾病，可列舉：惡性腫瘤疾病、炎症性疾病、感染症疾病等。因此，關於本發明中之該生理活性物質，較佳為應用該等疾病之治療所使用之醫藥品之有效成分或醫藥有效成分候補化合物，或者應用將該等衍生物化或前驅藥化而成之有效成分。於以下列舉可應用於本發明之生理活性物質之例，但並不限定於該等。
作為可用於惡性腫瘤疾病之生理活性物質，可列舉：7-乙基-10-羥基喜樹鹼、伊立替康、拓撲替康、9-胺基喜樹鹼等喜樹鹼衍生物；太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇、卡巴他賽(Cabazitaxel)等紫杉烷衍生物；Ganetespib、Luminespib等具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物；多柔比星、表柔比星、氨柔比星、道諾黴素、艾達黴素、吡柔比星等蒽環黴素衍生物；西羅莫司、依維莫司、坦羅莫司(Temsirolimus)等雷帕黴素衍生物；吉西他濱、胞嘧啶阿拉伯糖、依諾他濱、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽、乙炔基胞嘧啶核苷、氮雜胞嘧啶 核苷、地西他濱等胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑；甲胺喋呤、培美曲塞、左亞葉酸鹽(levofolinate)、甲醯四氫葉酸(folinate)等葉酸代謝拮抗劑；氟達拉濱、奈拉濱、噴司他丁(Pentostatin)、克拉屈濱等嘌呤系代謝拮抗劑；去氧氟尿苷、卡培他濱、替加氟(Tegafur)、氟尿嘧啶、卡莫氟等氟化嘧啶系代謝拮抗劑；順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、奈達帕汀(Nedaplatin)等含鉑化合物；絲裂黴素C等絲裂黴素衍生物；博萊黴素、Libromycin等博萊黴素衍生物；長春新鹼、長春花鹼、長春地辛、長春瑞濱等長春花生物鹼衍生物；依託泊苷、替尼泊苷等鬼臼毒素衍生物；埃立布林等軟海綿素衍生物；蝴蝶黴素、UCN-01等星孢菌素衍生物；雷利度胺(Lenalidomide)、泊馬度胺(Pomalidomide)等沙利竇邁衍生物；維生素A酸、他米巴羅汀等維生素A衍生物；硼替佐米、Carfilzomib、Ixazomib等蛋白酶體抑制劑；康普瑞汀(Complestatin)A4等康普瑞汀(Complestatin)衍生物；Binimetinib、Cobimetinib、曲美替尼(Trametinib)等MEK抑制劑；Dinaciclib、Flavopirido、Palbociclib等CDK抑制劑；達拉菲尼(Dabrafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、維羅非尼(Vemurafenib)等Raf激酶抑制劑；伏立諾他(Vorinostat)、Belinostat、帕比司他(Panobinostat)、羅米地辛(Romidepsin)等HDAC抑制劑；細胞遲緩素(Cytochalasin)、拉春庫林(Latrunculin)、鬼筆環肽(Phalloidin)等肌動蛋白聚合抑制劑；維利帕尼(Veliparib)、Rucaparib、奧拉帕尼(Olaparib)等PARP抑制劑；克唑替尼(Crizotinib)、伊馬替尼(Imatinib)、吉米沙星(gefitinib)、埃羅替尼(Erlotinib)、阿法替尼(Afatinib)、達沙替尼(Dasatinib)、伯舒替尼(Bosutinib)、凡德他尼(Vandetanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、阿西替尼(Axitinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、樂伐替尼(Lenvatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、尼達尼布(Nintedanib)、尼洛替尼(Nilotinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、阿雷替尼(Alectinib)、魯索利替尼(Ruxolitinib)、克唑替 尼(Crizotinib)、依魯替尼(Imbruvica)等酪胺酸激酶抑制劑；苯達莫司汀(bendamustine)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、異環磷醯胺(Ifosfamide)、硫酸布他卡因(Busulfan)、美法侖(Merphalan)等氮芥(Nitrogen mustard)系烷化劑；尼莫司汀(Nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、洛莫司汀(Lomustine)等亞硝基脲系烷化劑；達卡巴嗪(Dacarbazine)、替莫唑胺(Temozolomide)、甲基苄肼(Procarbazine)、噻替派等烷化劑；阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、法倔唑等芳香酶抑制劑；羥基氟他胺、氟他胺、比卡魯胺、恩紮魯胺(Enzalutamide)等抗雄性素劑；阿比特龍(Abiraterone)等CYP17(解離酶)抑制劑；他莫昔芬、托瑞米芬等抗雌性素劑；雌莫司汀(Estramustine)、助孕酮(Progesterone)、米托坦(Mitotane)、甲羥助孕酮(Medroxy Progesterone)等激素劑。
作為用於炎症性疾病之生理活性物質，可列舉：他克莫司等他克莫司衍生物；地塞米松、潑尼松龍等類固醇衍生物；西羅莫司、依維莫司、坦羅莫司(Temsirolimus)等雷帕黴素衍生物；環孢靈、芬戈莫德(Fingolimod)、硫唑嘌呤、咪唑立賓、黴酚酸嗎啉乙酯、胍立莫司(Gusperimus)等免疫抑制劑；二氟尼柳、噻拉米特等NSAIDs等。
作為可用於感染症疾病之生理活性物質，可列舉：雙性黴素B、製黴素等多烯系抗生物質；氟康唑、伏立康唑等唑系衍生物、米卡芬淨(Micafungin)等Candin系衍生物、氟胞嘧啶(Flucytosine)等嘧啶衍生物等抗真菌劑；阿昔洛韋(Aciclovir)、萬乃洛韋(valaciclovir)、更昔洛韋(Ganciclovir)等抗病毒劑；紮那米韋(Zanamivir)、奧司他韋(Oseltamivir)、拉尼娜米韋(Laninamivir)等抗病毒劑等。
本發明係使用嵌段共聚物作為生理活性物質載體之技術，尤其是為所使用之生理活性物質之藥理活性機能或化學結構及物性不受影響，可應用於所有物質之通用性較高之技術。因此，本發明並不限定 於該等應用於疾病治療之生理活性物質，且只要為具有鍵結性之羥基及/或胺基之生理活性物質，則可應用任何物質。
作為本發明之具有羥基及/或胺基之生理活性物質，更佳為不進行衍生物化或前驅藥化而直接使用具有羥基及/或胺基之公知之醫藥有效成分或醫藥有效成分候補化合物。可列舉以下之化合物作為此種生理活性物質。
作為可用於惡性腫瘤疾病之生理活性物質，可列舉：7-乙基-10-羥基喜樹鹼、伊立替康、拓撲替康、9-胺基喜樹鹼等喜樹鹼衍生物；太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇、卡巴他賽(Cabazitaxel)等紫杉烷衍生物；Ganetespib、Luminespib等具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物；多柔比星、表柔比星、氨柔比星、道諾黴素、艾達黴素、吡柔比星等蒽環黴素衍生物；西羅莫司、依維莫司、坦羅莫司(Temsirolimus)等雷帕黴素衍生物；吉西他濱、胞嘧啶阿拉伯糖、依諾他濱、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽、乙炔基胞嘧啶核苷、氮雜胞嘧啶核苷、地西他濱等胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑；甲胺喋呤、培美曲塞、左亞葉酸鹽(levofolinate)、甲醯四氫葉酸(folinate)等葉酸代謝拮抗劑；氟達拉濱、奈拉濱、噴司他丁(Pentostatin)、克拉屈濱等嘌呤系代謝拮抗劑；去氧氟尿苷、卡培他濱、等氟化嘧啶系代謝拮抗劑；順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、奈達帕汀(Nedaplatin)等含鉑化合物；絲裂黴素C等絲裂黴素衍生物；博萊黴素、Libromycin等博萊黴素衍生物；長春新鹼、長春花鹼、長春地辛、長春瑞濱等長春花生物鹼衍生物；依託泊苷、替尼泊苷等鬼臼毒素衍生物；埃立布林等軟海綿素衍生物；蝴蝶黴素、UCN-01等星孢菌素衍生物；雷利度胺(Lenalidomide)、泊馬度胺(Pomalidomide)等沙利竇邁衍生物；維生素A酸、等維生素A衍生物；硼替佐米、Ixazomib等蛋白酶體抑制劑；康普瑞汀(Complestatin)A4等康普瑞汀(Complestatin)衍生物； Binimetinib、Cobimetinib等MEK抑制劑；Dinaciclib、Flavopirido等CDK抑制劑；達拉菲尼(Dabrafenib)等Raf激酶抑制劑；伏立諾他(Vorinostat)、Belinostat、帕比司他(Panobinostat)等HDAC抑制劑；細胞遲緩素(cytochalasin)、拉春庫林(Latrunculin)、鬼筆環肽(Phalloidin)等肌動蛋白聚合抑制劑；伯舒替尼(Bosutinib)、克唑替尼(Crizotinib)、依魯替尼(Imbruvica)等酪胺酸激酶抑制劑；美法侖(Merphalan)等氮芥(Nitrogen mustard)系烷化劑；尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、等亞硝基脲系烷化劑；達卡巴嗪(Dacarbazine)、甲基苄肼(Procarbazine)等烷化劑；羥基氟他胺、比卡魯胺等抗雄性素劑等CYP17(解離酶)抑制劑；他莫昔芬等抗雌性素劑；雌莫司汀(Estramustine)等激素劑。
作為用於炎症性疾病之生理活性物質，可列舉：他克莫司等他克莫司衍生物；地塞米松、潑尼松龍等類固醇衍生物；西羅莫司、依維莫司、坦羅莫司(Temsirolimus)等雷帕黴素衍生物；環孢靈、芬戈莫德(Fingolimod)、咪唑立賓、黴酚酸嗎啉乙酯、胍立莫司(Gusperimus)等免疫抑制劑；二氟尼柳、噻拉米特等NSAIDs等。
作為可用於感染症疾病之生理活性物質，可列舉：雙性黴素B、製黴素等多烯系抗生物質；氟康唑、伏立康唑等唑系衍生物、米卡芬淨(Micafungin)等Candin系衍生物、氟胞嘧啶(Flucytosine)等嘧啶衍生物等抗真菌劑；阿昔洛韋(Aciclovir)、萬乃洛韋(valaciclovir)、更昔洛韋(Ganciclovir)等抗病毒劑；紮那米韋(zanamivir)、奧司他韋(Oseltamivir)、拉尼娜米韋(Laninamivir)等抗病毒劑等。
本發明具備如下性能：向疾病靶組織之移行性及浸透性提高，並且自腎臟等之排泄性提高。因此，發揮如下效果：抑制生理活性物質對疾病靶組織以外之正常組織致敏而減少副作用。因此，較佳為應用可用於有減少對正常組織之副作用之課題之疾病的生理活性物質， 較佳為使用針對惡性腫瘤疾病之抗腫瘤劑、或針對炎症性疾病之藥劑。由於應用有抗腫瘤劑或炎症性疾病藥劑作為生理活性物質之該嵌段共聚物向腫瘤或炎症部位等組織之移行性及向組織內部之浸透性得到提高，故而揮發增強抗腫瘤效果或抗炎症作用之效果。又，由於上述嵌段共聚物亦具備自腎臟等之排出性，故而可控制高分子化DDS製劑之體內滯留性，而抑制向正常組織之不需要之移行，從而達成副作用之減少。
作為可用於惡性腫瘤疾病之生理活性物質，較佳為上述之喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、蒽環黴素衍生物、雷帕黴素衍生物、胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑、葉酸代謝拮抗劑、嘌呤系代謝拮抗劑、氟化嘧啶系代謝拮抗劑、含鉑化合物、絲裂黴素衍生物、博萊黴素衍生物、長春花生物鹼衍生物、鬼臼毒素衍生物、軟海綿素衍生物、星孢菌素衍生物、沙利竇邁衍生物、維生素A衍生物、蛋白酶體抑制劑、康普瑞汀(Complestatin)衍生物、MEK抑制劑、CDK抑制劑、Raf激酶抑制劑、HDAC抑制劑、肌動蛋白聚合抑制劑、PARP抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、氮芥(Nitrogen mustard)系烷化劑、亞硝基脲系烷化劑、烷化劑、芳香酶抑制劑、抗雄性素劑、CYP17(解離酶)抑制劑、抗雌性素劑、激素劑。更佳為喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、蒽環黴素衍生物、雷帕黴素衍生物、胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑、葉酸代謝拮抗劑等。尤佳為喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、雷帕黴素衍生物。
作為可用於炎症性疾病之生理活性物質，較佳為他克莫司衍生物、類固醇衍生物、雷帕黴素衍生物、免疫抑制劑、NSAIDs等。尤佳為他克莫司衍生物、類固醇衍生物、雷帕黴素衍生物。
上述生理活性物質係經由任意之鍵結基而結合於天冬胺酸或麩胺酸之側鏈羧基。生理活性物質係藉由羥基及/或胺基並經由酯鍵或 醯胺鍵而進行結合，且必須具備如下結合物性：上述鍵於將該嵌段共聚物投予至活體內後，慢慢地以水解方式斷鍵從而游離該生理活性物質。
該生理活性物質由於具有羥基及/或胺基，故而可列舉：藉由酯鍵或醯胺鍵而將該生理活性物質與作為鍵結性官能基之該側鏈羧基進行結合之態樣。於該情形時，係不經由上述任意之鍵結基之鍵結方式。較佳為如下態樣：較佳為使用具有羥基之生理活性物質，與側鏈羧基進行酯鍵結。作為具有胺基鍵之生理活性物質，較佳為使用胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑等具有芳香族胺基之生理活性物質，較佳為該芳香族胺基與側鏈羧基進行醯胺鍵結之態樣。
作為使上述生理活性物質、與天冬胺酸或麩胺酸之側鏈羧基進行結合之任意之鍵結基，就較佳為可使該生理活性物質之羥基及/或胺基作為鍵結性官能基發揮功能而以酯鍵或醯胺鍵進行鍵結之方面而言，只要為一末端基為羧基，另一末端基具備可與上述天冬胺酸或麩胺酸之側鏈羧基進行鍵結之羥基、胺基、巰基之適當的連結基，則可無特別限定地使用。作為該連結基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)伸烷基、可具有取代基之碳數(C6~C12)之芳香族基等。
於上述鍵結基為將可具有取代基之亞甲基設為該連結基之上述鍵結基之情形時，亦可稱為胺基酸衍生物或乙醇酸衍生物。
於使用胺基酸衍生物作為該鍵結基之情形時，可使用天然型胺基酸或合成胺基酸及其側鏈修飾體中之任一種。又，亦可使用L體、D體及外消旋體中之任一種。例如可列舉：甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、鳥胺酸、半胱胺酸等。又，作為側鏈經修飾之胺基酸，可列舉：天冬胺酸或麩胺酸之烷基酯、天冬胺酸或 麩胺酸之芳烷基酯、天冬胺酸或麩胺酸之烷基醯胺、天冬胺酸或麩胺酸之芳烷基醯胺、Boc賴胺酸等烷氧基羰基賴胺酸等。
於使用乙醇酸衍生物作為該鍵結基之情形時，例如可列舉：乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等。於使用多元羧酸之情形時，較佳為上述生理活性物質結合於一羧基，而另一羧基為酯衍生物或醯胺衍生物。
上述鍵結基可為單一種類之鍵結基，亦可複數種類之鍵結基混合存在。
本發明中之聚胺基酸衍生物鏈段亦可包含於側鏈羧基未鍵結有上述生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或聚麩胺酸衍生物單元。於該情形時，該側鏈羧基可為游離酸之態樣，亦可為作為醫藥品所容許之羧酸鹽之態樣。作為上述羧酸鹽，可列舉：鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽等。
又，該聚胺基酸衍生物鏈段中之該天冬胺酸衍生物及/或聚麩胺酸衍生物單元亦可為具有適當取代基之酯衍生物及/或醯胺衍生物。該等取代基可以控制本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物之物性為目的而任意地導入。例如藉由導入疏水性基，可提高該生理活性物質結合嵌段共聚物之聚胺基酸衍生物鏈段之疏水性。另一方面，藉由導入具備胺基或羧基、羥基等可形成鹽之離子性官能基之親水性取代基，可提高該生理活性物質結合嵌段共聚物之聚胺基酸鏈段之親水性。
該所謂天冬胺酸衍生物及/或聚麩胺酸衍生物單元之酯衍生物及/或醯胺衍生物，例如較佳為選自由可具有取代基之碳數(C1~C30)烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C30)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C30)烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基所組成之群中之1種以上之取代基。
作為可具有取代基之碳數(C1~C30)烷氧基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C30)烷氧基。即，側鏈羧基成為酯型衍生物者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為該碳數(C1~C30)烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、第三丁氧基、環己氧基、苄氧基、4-苯基丁氧基、辛氧基、癸氧基、十二烷氧基、十四烷氧基、十六烷氧基、十八烷氧基、二十烷氧基、二十二烷氧基、二十四烷氧基、二十六烷氧基、二十八烷氧基、三十烷氧基等。
作為可具有取代基之碳數(C1~C30)烷基胺基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C30)烷基胺基。即，側鏈羧基成為烷基醯胺型衍生物者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為該碳數(C1~C30)烷基胺基，例如可列舉：甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、異丙基胺基、丁基胺基、第三丁基胺基、環己基胺基、苄基胺基、4-苯基丁基胺基、辛基胺基、癸基胺基、十二烷基胺基、十四烷基胺基、十六烷基胺基、十八烷基胺基、二十烷基胺基、二十二烷基胺基、二十四烷基胺基、二十六烷基胺基、二十八烷基胺基、三十烷基胺基等。
該烷基胺基亦包含羧基得到保護之胺基酸或具有胺基之螢光物質之鍵結殘基。作為該羧基得到保護之胺基酸，例如亦可使用甘胺酸甲酯、甘胺酸苄酯、β-丙胺酸甲酯、β-丙胺酸苄酯、丙胺酸甲酯、白胺酸甲酯、苯丙胺酸甲酯等。
作為該具有胺基之螢光物質，例如亦包含：2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮、BODIPY(註冊商標)TR Cadaverine、BODIPY(註冊商標)FL Ethylene diamine、Alexa Fluor(註 冊商標)594 Cadaverine、Texas Red(註冊商標)Cadaverine、ATTO 594 amine等，且包含該等之醯胺鍵結殘基。
作為可具有取代基之二(C1~C30)烷基胺基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二(C1~C30)烷基胺基。即，側鏈羧基成為二烷基醯胺型衍生物者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為該二(C1~C30)烷基胺基，例如可列舉：二甲基胺基、二乙基胺基、二丙基胺基、二異丙基胺基、二丁基胺基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基胺基、N-苄基-N-甲基胺基、二辛基胺基、二壬基胺基、二癸基胺基、二-十二烷基胺基、二-十四烷基胺基、二-十六烷基胺基、二-十八烷基胺基、二-二十烷基胺基等。
作為可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基，係可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之(C1~C8)烷基經取代之脲型衍生物。該烷基可為相同種類，亦可為不同種類。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。於具有取代基之情形時，較佳為二烷基胺基。作為可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基，例如為甲基胺基羰基甲基胺基、乙基胺基羰基乙基胺基、異丙基胺基羰基異丙基胺基、環己基胺基羰基環己基胺基、乙基胺基羰基(3-二甲基胺基丙基)胺基、(3-二甲基胺基丙基)胺基羰基乙基胺基等。
該天冬胺酸衍生物及/或聚麩胺酸衍生物單元之酯衍生物及/或醯胺衍生物可為相同種類之衍生物，亦可為不同種類之衍生物混合存在之態樣。又，亦可側鏈羧基為游離酸或其鹽之態樣混合存在。
本發明之嵌段共聚物係聚乙二醇鏈段與聚胺基酸衍生物鏈段連結在一起。作為該連結方式，只要為藉由化學鍵結而將2個聚合物鏈段進行連結之基，則無特別限定，只要為具備可與聚乙二醇末端基及 聚胺基酸衍生物之末端基分別鍵結之官能基之連結基即可。較佳為於末端基具有鍵結性官能基之(C1~6)伸烷基。與聚乙二醇鏈段之鍵結方式較佳為基於聚氧乙烯基；(CH2CH2O)之末端氧原子之醚鍵結，與聚胺基酸衍生物鏈段之鍵結方式較佳為醯胺鍵結或酯鍵結。即，作為連結基，較佳為-(CH2)s-NH-基(s為1~6之整數)或-(CH2)s-CO-基(s為1~6之整數)。
本發明之嵌段共聚物之特徵在於：其分子量為2kDa以上且15kDa以下。該嵌段共聚物之分子量係採用對其構成部分之各構成分子量進行累加而獲得之計算值作為該嵌段共聚物之分子量。即，將對(1)聚乙二醇鏈段之分子量、(2)聚胺基酸衍生物鏈段之主鏈部分之分子量、(3)生理活性物質之鍵結殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之生理活性物質之總分子量、以及(4)生理活性物質以外之鍵結基殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之該鍵結基之總分子量進行累加而獲得之計算值設為該嵌段共聚物之分子量。因此，關於該嵌段共聚物之兩末端基或構建嵌段共聚物之連結基，只要沒有特別理由，則於該嵌段共聚物之分子量算出中不考慮。
再者，該嵌段共聚物之分子量可為kDa單位之精度之分子量界定。因此，上述各構成部分之分析方法只要為於該聚胺基酸衍生物之kDa單位之分子量測定中精度充分之分析方法，則無特別限定，可適當選擇各種分析方法。於以下列舉各構成部分之較佳之分析方法。
上述(1)聚乙二醇鏈段之分子量係構建聚乙二醇鏈段之聚乙二醇化合物之分子量測定值，且採用根據藉由以聚乙二醇標準品為基準之GPC法所測得之峰頂分子量而求出之平均分子量。
上述(2)聚胺基酸衍生物鏈段之主鏈部分之分子量係該鏈段之聚合單體單元之平均分子量乘以其平均聚合數而獲得之計算值。該聚合數可使用藉由中和滴定對聚胺基酸之側鏈羧基進行定量之方法而求 出；或者可使用自1H-NMR之積分值算出之聚合數。較佳為使用中和滴定法。
上述(3)生理活性物質之總分子量係該生理活性物質之分子量乘以其鍵結數而獲得之計算值。該鍵結數可藉由自利用HPLC之反應液中之未反應該生理活性物質之計量算出之方法；或者對由該生理活性物質結合嵌段共聚物裂解該生理活性物質從而游離之生理活性物質或源自其之鏈段分子進行定量分析之方法而求出。
上述(4)生理活性物質以外之鍵結基之總分子量係該鍵結基殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之計算值。該鍵結基之鍵結數可藉由自利用HPLC之反應液中之未反應該鍵結殘基之計量算出之方法；或者自聚胺基酸之水解後之定量分析而求出。又，亦可自1H-NMR之積分值算出。
本發明之嵌段共聚物係分子量為2kDa以上且15kDa以下。於上述分子量小於2kDa之情形時，該生理活性物質結合嵌段共聚物表現出不具有充分之奈米粒子形成能力之情況，而無法獲得向靶組織之充分浸透性。因此，變得無法有效率地發揮生理活性物質之藥理作用效果。另一方面，於上述分子量大於15kDa之情形時，伴隨著該嵌段共聚物之腎排泄性受到抑制，其體內滯留性變高。因此，可導致生理活性物質對疾病靶組織以外之正常組織致敏，故而有正常組織之損傷表現之顧慮。例如於使用有細胞毒性之生理活性物質之情形時，可想到伴隨著骨髓抑制之血液毒性之延遲化。因此，必須將上述分子量控制為15kDa以下。該嵌段共聚物之分子量較佳為3kDa以上且12kDa以下，進而較佳為3kDa以上且10kDa以下。
本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物係於水溶液中表現出自我聚集性之物性。即，係如下物性：若對該生理活性物質結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液進行利用使用雷射光之動態光散射法之粒 度分佈測定，則計測為以體積平均粒徑計約數奈米~約20奈米之奈米粒子。本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物較佳為如下物性，即該嵌段共聚物於1mg/mL水溶液中為最大亦未達20奈米之奈米粒子。於該情形時，係於利用純水之水溶液中進行粒度分佈測定。較佳為如下物性，該物性之特徵在於：藉由利用使用雷射光之動態光散射法之粒度分佈測定法，以計測出體積平均粒徑未達20奈米，且更佳為計測為3~15奈米之奈米粒子。
本發明中之所謂體積平均粒徑，係例如利用Particle Sizing System公司製造之ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(解析方法：NICOMP法)或者Malvern公司製造之粒徑-ζ電位測定裝置Zetasizer Nano ZS(解析方法：NNLS法)進行測定而獲得之體積分佈中存在之比例最多的峰值粒徑。
本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物係親水性之聚乙二醇鏈段、與藉由生理活性物質或其他疏水性側鏈而表現出疏水性之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成之嵌段共聚物，因此可認為於水溶液中複數個該嵌段共聚物彼此之聚胺基酸衍生物鏈段基於疏水性相互作用而進行聚集。結果形成以聚胺基酸衍生物鏈段為內核(核心部)，且親水性之聚乙二醇鏈段覆蓋上述內核周圍而形成外殼層(外殼部)之核心-外殼結構之微胞狀聚集體，推測其為以上述之奈米粒子之形式所觀測到者。
本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物係於水溶液中形成奈米粒子之物性，該情況對生理活性物質之藥理作用效果之增強及/或副作用之減少而言為必需。
有效的是使用利用雷射光之光散射強度作為本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物之奈米粒子形成性之指標。即，可確認該生理活性物質結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性係以雷射光散射強度為指標。由此，有效的是以甲苯為光散射強度標準試樣，以 相對於甲苯之相對強度為指標，對該生理活性物質結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性進行確認之方法。
本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之雷射光散射強度以相對於甲苯之光散射強度之相對強度計為至少2倍以上。
於上述光散射相對強度小於2倍之情形時，該生理活性物質結合嵌段共聚物表現出不具有充分之奈米粒子形成性之情況，而無法獲得向靶組織之充分浸透性。因此，變得無法有效率地發揮生理活性物質之藥理作用效果。本發明中，光散射相對強度之數值係具有奈米粒子形成能力之指標，只要相對於甲苯為2倍以上之光散射強度即可，其上限並無限制。即，即便於上述光散射相對強度大於100倍之情形時，亦可謂該嵌段共聚物具有充分之奈米粒子形成能力。然而，於光散射強度大於100倍之情形時，可認為有該嵌段共聚物不具有所需之排泄性之可能性。於該情形時，該嵌段共聚物之體內滯留性變高，因此可導致生理活性物質對疾病靶組織以外之正常組織致敏，故而有正常組織之損傷表現之顧慮。因此，妥當的是將上述光散射相對強度控制為100倍以下。
本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物之水溶液中之光散射強度較佳為以相對於甲苯之光散射強度的相對強度計為2倍以上且50倍以下，更佳為2倍以上且30倍以下。
本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物之奈米粒子形成性分析中的使用雷射光之光散射強度之測定方法適當為如下方法：以該生理活性物質結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液為測定試樣，於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm下利用雷射光散射光度計進行測定。作為測定機器，例如可列舉：大塚電子公司製造之動態光散射光度計DLS-8000DL(測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm、 ND過濾器2.5%、PH1：OPEN、PH2：SLIT)。
關於光散射強度測定，係將由不包含微粒子之純水製備之水溶液設為分析試樣而獲得分析值。該水溶液亦可於溶液製備中任意地藉由超音波照射而進行溶解。所製備之水溶液較佳為為了進而去除次微米級之微粒子而實施了過濾處理之水溶液。
再者，用作光散射強度測定之標準物質之甲苯只要為試劑級之純度，則可無特別限定地使用。較佳為使用進行過於光散射分析之試樣製備中通常進行之預處理過濾之甲苯。
本發明之嵌段共聚物較佳為聚乙二醇鏈段之質量含有率為10質量%以上且80質量%以下。即，較佳為該嵌段共聚物之分子量中之相當於聚乙二醇鏈段之分子量所占的比例為10質量%~80質量%。於聚乙二醇鏈段之質量含有率少於10質量%之情形時，有水溶性明顯降低而於水溶液中無法利用自我聚集而形成奈米粒子之顧慮。另一方面，於聚乙二醇鏈段之質量含有率多於80質量%之情形時，有承擔自我聚集性之聚胺基酸衍生物鏈段之構成變少，因此基於疏水性相互作用之奈米粒子形成性降低之顧慮。為了達成充分之藥效與副作用之減少，較佳為設定聚乙二醇鏈段之質量含有率。
上述聚乙二醇鏈段之質量分子量率更佳為20質量%以上且70質量%以下。特別較佳為30質量%以上且65質量%以下。
本發明之嵌段共聚物較佳為具有羥基及/或胺基之生理活性物質之質量含有率為10質量%以上且60質量%以下。於該生理活性物質含有率低於10質量%之情形時，有用以顯現藥理活性之有效成分變少，因此藥效降低之顧慮。另一方面，於該生理活性物質之含有率多於60質量%之情形時，有該嵌段共聚物之自我聚集性之平衡性明顯降低，而未取得所需之奈米粒子形成性之顧慮。
該藥理活性物質之質量含有率較佳為10質量%以上且50質量%以 下。進而較佳為10質量%以上且40質量%以下。
本發明之嵌段共聚物較佳為通式(1)所示之嵌段共聚物，
[式中，R1表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，t表示20~270之整數，A表示可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，R2表示選自由氫原子、碳數(C1~C6)醯基及碳數(C1~C6)烷氧羰基所組成之群中之取代基，R3表示具有羥基及/或胺基之生理活性物質之鍵結殘基，R4表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基、疏水性螢光物質之鍵結殘基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基，B表示鍵結基，n表示1或2，x1、x2、y1、y2及z分別獨立，表示0~25之整數，(x1+x2)表示1~25之整數，(x1+x2+y1+y2+z)表示3~25之整數，鍵結有上述R3及R4之各構成單元以及支鏈羰基進行分子內環化之構成單元分別獨立為無規排列之結構]。
作為上述R1中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，可列舉：可 具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷基等。例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、環戊基、正己基、環己基等。
作為上述可具有之取代基，可列舉：鹵素原子、硝基、氰基、羥基、巰基、碳環或雜環芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、取代或未經取代之胺基、醯基胺基、烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、醯基、羧基、烷氧羰基、胺甲醯基或矽烷基等。芳香環上之取代位置可為鄰位，亦可為間位，亦可為對位。
作為該R1，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、苄基、2,2-二甲氧基乙基、2,2-二乙氧基乙基、2-甲醯基乙基。尤其是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基等更佳。
通式(1)之t表示聚乙二醇鏈段中之伸乙基氧基之聚合數。該t為20~270之整數。即，作為該聚乙二醇鏈段之分子量，為0.8kDa~12kDa。
若該t小於20，則有所獲得之結合有生理活性物質之嵌段共聚物不具備充分之水溶性，又未發揮所需之體內動態之虞。另一方面，於該t大於270之情形時，有承擔疏水性之聚胺基酸衍生物鏈段之含量相對變低，因此未獲得所需之自我聚集性物性，而無法發揮伴隨著其之體內動態之顧慮。該t較佳為22~230之整數，更佳為30~180之整數。即，作為該聚乙二醇鏈段之分子量，較佳為1kDa~10kDa，更佳為1.3kDa~8kDa。
作為上述A中之可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，可列舉：亞甲基、伸乙基、正伸丙基、正伸丁基等。作為可具有之取代基，亦 可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。
作為該A，尤其是伸乙基、正伸丙基更佳。
作為上述R2中之可具有取代基之碳數(C1~C6)醯基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)醯基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R2之該碳數(C1~C6)醯基，例如可列舉：甲醯基、乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、丙醯基、三甲基乙醯基、苄基羰基、苯乙基羰基等。更佳為可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C4)醯基，更佳為乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基。
作為上述R2中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷氧羰基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷氧羰基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R2之該碳數(C1~C6)烷氧羰基，例如可列舉：甲氧基羰基、乙氧基羰基、第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基等。
上述R3係具有羥基及/或胺基之生理活性物質之鍵結殘基。即，該羥基及/或胺基係鍵結性官能基，且表示自此處去除了氫原子之殘基。該具有羥基及/或胺基之生理活性物質可無特別限定地使用。然而，本發明為了用作醫藥品，較佳為使用醫藥品之有效成分，且較佳為使用具有羥基及/或胺基之公知之醫藥有效成分或醫藥有效成分候補化合物。又，只要為包含公知之醫藥有效成分或醫藥有效成分候補化合物作為該具有羥基及/或胺基之生理活性物質的物質，則可無特別限定地應用。即，藉由將該醫藥有效成分或其候補化合物進行衍生物化或前驅藥化而導入羥基及/或胺基，而可作為該具有羥基及/或胺基之生理活性物質進行應用。
本發明之嵌段共聚物之特徵在於：其組織浸透性提高，因此較佳為用於局部之組織疾病之治療。作為此種疾病，可列舉：惡性腫瘤疾病、炎症性疾病、感染症疾病等。因此，本發明中之所謂該生理活性物質，較佳為應用該等疾病之治療所使用之醫藥品之有效成分。
作為可用於惡性腫瘤疾病之生理活性物質，可列舉：7-乙基-10-羥基喜樹鹼、伊立替康、拓撲替康、9-胺基喜樹鹼等喜樹鹼衍生物；太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇、卡巴他賽(Cabazitaxel)等紫杉烷衍生物；多柔比星、表柔比星、氨柔比星、道諾黴素、艾達黴素、吡柔比星等蒽環黴素衍生物；西羅莫司、依維莫司、坦羅莫司(Temsirolimus)等雷帕黴素衍生物；吉西他濱、胞嘧啶阿拉伯糖、依諾他濱、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽、乙炔基胞嘧啶核苷、氮雜胞嘧啶核苷、地西他濱等胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑；甲胺喋呤、培美曲塞、左亞葉酸鹽(levofolinate)、甲醯四氫葉酸(folinate)等葉酸代謝拮抗劑；氟達拉濱、奈拉濱、噴司他丁(Pentostatin)、克拉屈濱等嘌呤系代謝拮抗劑；去氧氟尿苷、卡培他濱、替加氟(Tegafur)、氟尿嘧啶、卡莫氟等氟化嘧啶系代謝拮抗劑；順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、奈達帕汀(Nedaplatin)等含鉑化合物；Ganetespib、Luminespib等具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物；絲裂黴素C等絲裂黴素衍生物；博萊黴素、Libromycin等博萊黴素衍生物；長春新鹼、長春花鹼、長春地辛、長春瑞濱等長春花生物鹼衍生物；依託泊苷、替尼泊苷等鬼臼毒素衍生物；埃立布林等軟海綿素衍生物；蝴蝶黴素、UCN-01等星孢菌素衍生物；雷利度胺(Lenalidomide)、泊馬度胺(Pomalidomide)等沙利竇邁衍生物；維生素A酸、他米巴羅汀等維生素A衍生物；硼替佐米、carfilzomib、Ixazomib等蛋白酶體抑制劑；康普瑞汀(Complestatin)A4等康普瑞汀(Complestatin)衍生物；Binimetinib、Cobimetinib、曲美替尼(Trametinib)等MEK抑制劑；Dinaciclib、 Flavopirido、Palbociclib等CDK抑制劑；達拉菲尼(Dabrafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、維羅非尼(Vemurafenib)等Raf激酶抑制劑；伏立諾他(Vorinostat)、Belinostat、帕比司他(Panobinostat)、羅米地辛(Romidepsin)等HDAC抑制劑；細胞遲緩素(cytochalasin)、拉春庫林(Latrunculin)、鬼筆環肽(Phalloidin)等肌動蛋白聚合抑制劑；維利帕尼(Veliparib)、Rucaparib、奧拉帕尼(Olaparib)等PARP抑制劑；克唑替尼(Crizotinib)、伊馬替尼(imatinib)、吉米沙星(gefitinib)、埃羅替尼(Erlotinib)、阿法替尼(Afatinib)、達沙替尼(Dasatinib)、伯舒替尼(Bosutinib)、凡德他尼(vandetanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、阿西替尼(Axitinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、樂伐替尼(Lenvatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、尼達尼布(Nintedanib)、尼洛替尼(Nilotinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、阿雷替尼(Alectinib)、魯索利替尼(Ruxolitinib)、克唑替尼(Crizotinib)、依魯替尼(Imbruvica)等酪胺酸激酶抑制劑；苯達莫司汀(bendamustine)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、異環磷醯胺(Ifosfamide)、硫酸布他卡因(Busulfan)、美法侖(Merphalan)等氮芥(Nitrogen mustard)系烷化劑；尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、洛莫司汀(Lomustine)等亞硝基脲系烷化劑；達卡巴嗪(Dacarbazine)、替莫唑胺(Temozolomide)、甲基苄肼(Procarbazine)、噻替派等烷化劑；阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、法倔唑等芳香酶抑制劑；羥基氟他胺、氟他胺、比卡魯胺、恩紮魯胺(Enzalutamide)等抗雄性素劑；阿比特龍(Abiraterone)等CYP17(解離酶)抑制劑；他莫昔芬、托瑞米芬等抗雌性素劑；雌莫司汀(Estramustine)、助孕酮(Progesterone)、米托坦(Mitotane)、甲羥助孕酮(Medroxy Progesterone)等激素劑。
作為用於炎症性疾病之生理活性物質，可列舉：他克莫司等他克莫司衍生物；地塞米松、潑尼松龍等類固醇衍生物；西羅莫司、依 維莫司、坦羅莫司(Temsirolimus)等雷帕黴素衍生物；環孢靈、芬戈莫德(Fingolimod)、硫唑嘌呤、咪唑立賓、黴酚酸嗎啉乙酯、胍立莫司(Gusperimus)等免疫抑制劑；二氟尼柳、噻拉米特等NSAIDs等。
作為可用於感染症疾病之生理活性物質，可列舉：雙性黴素B、製黴素等多烯系抗生物質；氟康唑、伏立康唑等唑系衍生物、米卡芬淨(Micafungin)等Candin系衍生物、氟胞嘧啶(Flucytosine)等嘧啶衍生物等抗真菌劑；阿昔洛韋(Aciclovir)、萬乃洛韋(valaciclovir)、更昔洛韋(Ganciclovir)等抗病毒劑；紮那米韋(zanamivir)、奧司他韋(Oseltamivir)、拉尼娜米韋(Laninamivir)等抗病毒劑等。
本發明係使用嵌段共聚物作為生理活性物質載體之技術，尤其是為所使用之生理活性物質之藥理活性機能或化學結構及物性不受影響，可應用於所有物質之通用性較高之技術。因此，本發明並不限於該等應用於疾病治療之生理活性物質，只要為具有鍵結性之羥基及/或胺基之生理活性物質，則可應用任何物質。
作為本發明之具有羥基及/或胺基之生理活性物質，更佳為不進行衍生物化或前驅藥化而具有羥基及/或胺基之公知之醫藥有效成分或醫藥有效成分候補化合物。
作為可用於惡性腫瘤疾病之生理活性物質，可列舉：7-乙基-10-羥基喜樹鹼、伊立替康、拓撲替康、9-胺基喜樹鹼等喜樹鹼衍生物；太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇、卡巴他賽(Cabazitaxel)等紫杉烷衍生物；多柔比星、表柔比星、氨柔比星、道諾黴素、艾達黴素、吡柔比星等蒽環黴素衍生物；西羅莫司、依維莫司、坦羅莫司(Temsirolimus)等雷帕黴素衍生物；吉西他濱、胞嘧啶阿拉伯糖、依諾他濱、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽、乙炔基胞嘧啶核苷、氮雜胞嘧啶核苷、地西他濱等胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑；甲胺喋呤、培美曲塞、左亞葉酸鹽(levofolinate)、甲醯四氫葉酸(folinate)等葉酸代謝拮抗 劑；氟達拉濱、奈拉濱、噴司他丁(Pentostatin)、克拉屈濱等嘌呤系代謝拮抗劑；去氧氟尿苷、卡培他濱等氟化嘧啶系代謝拮抗劑；順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、奈達帕汀(Nedaplatin)等含鉑化合物；Ganetespib、Luminespib等具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物；絲裂黴素C等絲裂黴素衍生物；博萊黴素、Libromycin等博萊黴素衍生物；長春新鹼、長春花鹼、長春地辛、長春瑞濱等長春花生物鹼衍生物；依託泊苷、替尼泊苷等鬼臼毒素衍生物；埃立布林等軟海綿素衍生物；蝴蝶黴素、UCN-01等星孢菌素衍生物；雷利度胺(Lenalidomide)、泊馬度胺(Pomalidomide)等沙利竇邁衍生物；維生素A酸、等維生素A衍生物；硼替佐米、Ixazomib等蛋白酶體抑制劑；康普瑞汀(Complestatin)A4等康普瑞汀(Complestatin)衍生物；Binimetinib、Cobimetinib等MEK抑制劑；Dinaciclib、Flavopirido等CDK抑制劑；達拉菲尼(Dabrafenib)等Raf激酶抑制劑；伏立諾他(Vorinostat)、Belinostat、帕比司他(Panobinostat)等HDAC抑制劑；細胞遲緩素(cytochalasin)、拉春庫林(Latrunculin)、鬼筆環肽(Phalloidin)等肌動蛋白聚合抑制劑；伯舒替尼(Bosutinib)、克唑替尼(Crizotinib)、依魯替尼(Imbruvica)等酪胺酸激酶抑制劑；美法侖(Merphalan)等氮芥(Nitrogen mustard)系烷化劑；尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、等亞硝基脲系烷化劑；達卡巴嗪(Dacarbazine)、甲基苄肼(Procarbazine)等烷化劑；羥基氟他胺、比卡魯胺等抗雄性素劑等CYP17(解離酶)抑制劑；他莫昔芬等抗雌性素劑；雌莫司汀(Estramustine)等激素劑。
作為用於炎症性疾病之生理活性物質，可列舉：他克莫司等他克莫司衍生物；地塞米松、潑尼松龍等類固醇衍生物；西羅莫司、依維莫司、坦羅莫司(Temsirolimus)等雷帕黴素衍生物；環孢靈、芬戈莫德(Fingolimod)、咪唑立賓、黴酚酸嗎啉乙酯、胍立莫司 (Gusperimus)等免疫抑制劑；二氟尼柳、噻拉米特等NSAIDs等。
作為可用於感染症之生理活性物質，可列舉：雙性黴素B、製黴素等多烯系抗生物質；氟康唑、伏立康唑等唑系衍生物、米卡芬淨(Micafungin)等Candin系衍生物、氟胞嘧啶(Flucytosine)等嘧啶衍生物等抗真菌劑；阿昔洛韋(Aciclovir)、萬乃洛韋(valaciclovir)、更昔洛韋(Ganciclovir)等抗病毒劑；紮那米韋(zanamivir)、奧司他韋(Oseltamivir)、拉尼娜米韋(Laninamivir)等抗病毒劑等。
本發明具備如下性能：向疾病靶組織之移行性及浸透性提高，並且自腎臟等之排泄性提高。因此，發揮如下效果：抑制生理活性物質對疾病靶組織以外之正常組織致敏而減少副作用。因此，較佳為應用可用於有減少對正常組織之副作用之課題之疾病的生理活性物質。可列舉惡性腫瘤疾病或炎症性疾病作為上述疾病。因此，作為本發明所使用之生理活性物質，較佳為使用針對惡性腫瘤疾病之抗腫瘤劑。又，較佳為使用針對炎症性疾病之生理活性物質。
作為可用於惡性腫瘤疾病之生理活性物質，可列舉：上述之喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、蒽環黴素衍生物、雷帕黴素衍生物、胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑、葉酸代謝拮抗劑、嘌呤系代謝拮抗劑、氟化嘧啶系代謝拮抗劑、含鉑化合物、絲裂黴素衍生物、博萊黴素衍生物、長春花生物鹼衍生物、鬼臼毒素衍生物、軟海綿素衍生物、星孢菌素衍生物、沙利竇邁衍生物、維生素A衍生物、蛋白酶體抑制劑、康普瑞汀(Complestatin)衍生物、MEK抑制劑、CDK抑制劑、Raf激酶抑制劑、HDAC抑制劑、肌動蛋白聚合抑制劑、PARP抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、氮芥(Nitrogen mustard)衍生物、亞硝基脲系烷化劑、烷化劑、芳香酶抑制劑之衍生物、抗雄性素劑、CYP17(解離酶)抑制劑、抗雌性素劑、激素劑。
更佳為喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、蒽環 黴素衍生物、雷帕黴素衍生物、胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑、葉酸代謝拮抗劑等。尤佳為喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、雷帕黴素衍生物等。
又，作為可用於炎症性疾病之生理活性物質，較佳為上述之他克莫司衍生物、類固醇衍生物、雷帕黴素衍生物、免疫抑制劑、NSAIDs等，尤佳為他克莫司衍生物、類固醇衍生物、雷帕黴素衍生物。
R3之生理活性物質於該結合有生理活性物質之嵌段共聚物之同一分子中可為相同化合物，亦可複數種類之化合物混合存在。該R3較佳為相同化合物。
於通式(1)中，n表示1或2。n為1時，構成聚胺基酸衍生物鏈段之胺基酸為天冬胺酸。另一方面，n為2時，構成聚胺基酸衍生物鏈段之胺基酸為麩胺酸。因此，通式(1)中之聚胺基酸衍生物鏈段係聚天冬胺酸鏈段、聚麩胺酸鏈段或聚(天冬胺酸-麩胺酸混合存在)鏈段。
通式(1)中之B係上述R3之具有羥基及/或胺基之生理活性物質之鍵結殘基、與天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元之側鏈羧基之鍵結基。
作為該B之鍵結基，係與上述生理活性物質之羥基及/或胺基進行酯鍵結及/或醯胺鍵結，且與上述天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元之側鏈羧基進行酯鍵結、醯胺鍵結或硫酯鍵結之鍵結基。例如，-CO-(CH2)x-O-(x表示1~8之整數)、-CO-(CH2)x-NH-(x表示1~8之整數)、-CO-(CH2)x-S-(x表示1~8之整數)。
又，亦可使用胺基酸衍生物作為該B之鍵結基。作為將胺基酸衍生物設為鍵結基之情形時之鍵結基之使用態樣，係胺基酸衍生物之N末胺基與上述側鏈羧基進行醯胺鍵結，C末羧基與該生理活性物質之羥基及/或胺基進行酯鍵結或醯胺鍵結之態樣。
於使用胺基酸衍生物作為該B之鍵結基之情形時，可使用天然型 胺基酸或合成胺基酸及其側鏈修飾體中之任一種。又，亦可使用L體、D體及外消旋體中之任一種。例如可列舉：甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、鳥胺酸、半胱胺酸等。又，作為側鏈經修飾之胺基酸，可列舉：天冬胺酸或麩胺酸之烷基酯、天冬胺酸或麩胺酸之芳烷基酯、天冬胺酸或麩胺酸之烷基醯胺、天冬胺酸或麩胺酸之芳烷基醯胺、Boc賴胺酸等烷氧基羰基賴胺酸等。
又，亦可使用經由亞甲基而配置羥基與羧基之乙醇酸衍生物作為該鍵結基。作為將乙醇酸衍生物設為鍵結基之情形時之鍵結基之使用態樣，係乙醇酸衍生物之羥基與上述側鏈羧基進行酯鍵結，羧基與該生理活性物質之羥基及/或胺基進行酯鍵結或醯胺鍵結之態樣。
作為乙醇酸衍生物，例如可列舉：乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等。於使用多元羧酸之情形時，較佳為上述生理活性物質鍵結於一羧基，而另一羧基為酯衍生物或醯胺衍生物。
上述鍵結基可為單一種類之鍵結基，亦可複數種類之鍵結基混合存在。
又，該B可為「鍵」。所謂「鍵」，係指如下態樣：尤其是不經由鍵結基，上述生理活性物質之羥基及/或胺基與上述天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元之側鏈羧基直接酯鍵結或醯胺鍵結。
通式(1)中之R4表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基、疏水性螢光物質之鍵結殘基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基。
該R4可以控制本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物之物性為目 的而任意地導入。例如，藉由導入疏水性基為該R4，可提高該生理活性物質結合嵌段共聚物之聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之疏水性。另一方面，藉由導入具備胺基或羧基、羥基等可形成鹽之離子性官能基之親水性取代基作為該R4，可提高該生理活性物質結合嵌段共聚物之聚麩胺酸鏈段之親水性。又，於該R4為羥基之情形時，有上述聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之側鏈羧基為游離羧酸之情形。
該R4可為單一種類之取代基，亦可為複數種類之取代基。
上述R4中之可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷氧基係於上述聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之側鏈羧基鍵結有酯型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4中之該碳數(C1~C30)烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第三丁氧基、環己氧基、苄氧基、4-苯基丁基氧基、正辛氧基、癸氧基、十二烷氧基、十四烷氧基、十六烷氧基、十八烷氧基、二十烷氧基、二十二烷氧基、二十四烷氧基、二十六烷氧基、二十八烷氧基、三十烷氧基等。
上述R4中之可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基胺基係於上述聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之側鏈羧基鍵結有烷基醯胺型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4中之該碳數(C1~C30)烷基胺基，例如可列舉：甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、異丙基胺基、丁基胺基、第三丁基胺基、環己基胺基、苄基胺基、4-苯基丁基胺基、辛基胺基、癸基胺基、十二烷基胺基、十四烷基胺基、十六烷基胺基、十八烷基胺基、二十烷基胺基、二十二烷基胺基、二十四烷基胺基、二十六烷基胺基、二十八烷基胺基、三十烷基胺基等。
又，該可具有取代基之碳數(C1~C30)烷基胺基亦包含羧基得到保護之胺基酸。作為該羧基得到保護之胺基酸，例如亦可使用甘胺酸甲酯、甘胺酸苄酯、β-丙胺酸甲酯、β-丙胺酸苄酯、丙胺酸甲酯、白胺酸甲酯、苯丙胺酸甲酯等。
上述R4中之可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二烷基胺基係於上述聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之側鏈羧基鍵結有二烷基醯胺型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4中之該二(C1~C30)烷基胺基，例如可列舉：二甲基胺基、二乙基胺基、二丙基胺基、二異丙基胺基、二丁基胺基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基胺基、N-苄基-N-甲基胺基、二辛基胺基、二壬基胺基、二癸基胺基、二-十二烷基胺基、二-十四烷基胺基、二-十六烷基胺基、二-十八烷基胺基、二-二十烷基胺基等。
上述R4中之可具有取代基之碳數(C1~8)烷基胺基羰基(C1~8)烷基胺基係於上述聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之側鏈羧基鍵結有脲型修飾基者。該烷基可為相同種類，亦可為不同種類。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。於具有取代基之情形時，較佳為二烷基胺基。作為可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基，例如為甲基胺基羰基甲基胺基、乙基胺基羰基乙基胺基、異丙基胺基羰基異丙基胺基、環己基胺基羰基環己基胺基、乙基胺基羰基(3-二甲基胺基丙基)胺基、(3-二甲基胺基丙基)胺基羰基乙基胺基等。
上述R4可為螢光物質之鍵結殘基。該螢光物質較佳為使用具有用以與天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元之側鏈羧基鍵結之羥基及/或胺基之螢光物質。因此，於該R4為螢光物質之鍵結殘基之情形時，係指自上述羥基及/或胺基去除了氫原子之螢光物質之鍵結殘基。
作為該螢光物質，較佳為具有胺基之螢光物質，例如可列舉：2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮、BODIPY(註冊商標)TR Cadaverine、BODIPY(註冊商標)FL Ethylene diamine、Alexa Fluor(註冊商標)594 Cadaverine、Texas Red(註冊商標)Cadaverine、ATTO 594 amine等。因此，該R4之螢光物質之鍵結殘基包含該等之醯胺鍵結殘基。
通式(1)中之R4亦可為羥基。即，聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之側鏈羧酸為游離羧酸。於該情形時，側鏈羧酸可為游離酸之態樣，又，亦可為作為醫藥品所容許之任意之羧酸鹽之形態。作為上述羧酸鹽，可列舉：鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽等，且包含於本發明中。
通式(1)中，x1、x2、y1、y2及z分別表示該嵌段共聚物之聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段中之天冬胺酸衍生物單元及/或麩胺酸衍生物單元之構成單元之含量，且分別為0~25之整數。又，(x1+x2+y1+y2+z)表示該聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之聚合數，為3~25之整數。即，聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段表示以平均聚合數計為3~25之聚合物。若該(x1+x2+y1+y2+z)小於3，則有所獲得之嵌段共聚物不具備自我聚集性，而雷射光散射強度不符合最佳範圍之虞。另一方面，於聚合數大於25之情形時，有所獲得之生理活性物質結合嵌段共聚物之分子量超過15kDa之可能性，而有未取得所需之藥物動態之顧慮。即，若作為聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之聚合數之(x1+x2+y1+y2+z)偏離3~25之範圍，則有無法獲得生理活性物質之藥理作用效果之增強作用及副作用之減少效果之顧慮。聚胺基酸衍生物之聚合數較佳為考慮該結合有生理活性物質之嵌段共聚物之分子量而適當設定。該(x1+x2+y1+y2+z)較佳為5~20之整數。
作為該聚胺基酸衍生物之聚合數之(x1+x2+y1+y2+z)可藉由基 於1H-NMR之測定、或者對鍵結R3及R4前之聚乙二醇-聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)嵌段共聚物進行中和滴定而求出。
通式(1)中，(x1+x2)表示結合有R3之生理活性物質之天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元之總數。該結合有生理活性物質之單元係必須之構成，該(x1+x2)為1~25之整數。該(x1+x2)較佳為2~20之整數，更佳為3~15之整數。(x1+x2)相對於作為聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)衍生物鏈段之聚合數之上述(x1+x2+y1+y2+z)的比例為4~100%。較佳為10~90%，更佳為20~80%。
該(x1+x2)之結合有生理活性物質之天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元之含有數係自生理活性物質之結合量與聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之聚合數而算出。該生理活性物質之結合量可藉由如下方法求出，即對由該結合有生理活性物質之嵌段共聚物裂解該生理活性物質裂解從而游離之生理活性物質進行定量分析。又，亦可使用自製造該結合有生理活性物質之嵌段共聚物時之生理活性物質之反應率算出之方法。
通式(1)中，(y1+y2)表示鍵結有R4之天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元之總數。又，z表示側鏈羧基經分子內環化之結構之天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元之總數。該等係任意之構成，(y1+y2)及z分別為0~24之整數。該(y1+y2)及z較佳為分別為1~20之整數。(y1+y2+z)相對於作為聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)衍生物鏈段之聚合數之上述(x1+x2+y1+y2+z)的比例為0~96%，較佳為4~90%。
該(y1+y2)之鍵結有R4之天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元之含有數係自該R4之取代基之鍵結量與聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段之聚合數而算出。該R4之取代基之鍵結量可藉由如下方法求出：對由該嵌段共聚物裂解該R4之取代基從而游離之生理活性物質進行定量分析。又，亦可使用自製造該嵌段共聚物時之R4之取代基之反應率算出之方法。 又，亦可自1H-NMR之積分值算出。
於本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物中，上述聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)鏈段係於側鏈羧基具備R3之天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元、具備R4之天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元、以及側鏈羧基經分子內環化之結構之天冬胺酸單元及/或麩胺酸單元混合存在的聚合物鏈段。各構成單元係以1單元以上存在，且其排列不受特別控制，係不規則排列之無規排列之鏈段結構。
通式(1)所示之結合有生理活性物質之嵌段共聚物較佳為上述R3所示之生理活性物質之質量含有率為10質量%以上且60質量%以下。於該生理活性物質含量低於10質量%之情形時，有生理活性物質含量較少而無法充分發揮藥理活性效果之顧慮。另一方面，於生理活性物質之含量多於60質量%之情形時，有該結合有生理活性物質之嵌段共聚物之親水性-疏水性之平衡性大幅變化而不具備適當之自我聚集性，從而未發揮所需之藥物動態之顧慮。該生理活性物質之質量含有率較佳為10質量%以上且50質量%以下。進而較佳為10質量%以上且40質量%以下。
通式(1)所示之嵌段共聚物之特徵在於：其分子量為2kDa以上且15kDa以下。該嵌段共聚物之分子量係採用對其構成部分之各構成分子量進行累加而獲得之計算值作為該嵌段共聚物之分子量。即，將對(1)聚乙二醇鏈段之分子量、(2)聚胺基酸衍生物鏈段之主鏈部分之分子量、(3)生理活性物質之鍵結殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之生理活性物質之總分子量、以及(4)生理活性物質以外之鍵結基殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之該鍵結基之總分子量進行累加而獲得之計算值設為該嵌段共聚物之分子量。
再者，關於該嵌段共聚物之分子量，可為kDa單位之精度之分子量界定。因此，上述各構成部分之分析方法只要為於該聚胺基酸衍生 物之kDa單位之分子量測定中精度充分之分析方法，則無特別限定，可適當選擇各種分析方法。於以下列舉各構成部分之較佳之分析方法。
上述(1)聚乙二醇鏈段之分子量係構建聚乙二醇鏈段之聚乙二醇化合物之分子量測定值，採用根據藉由以聚乙二醇標準品為基準之GPC法所測得之峰頂分子量而求出之平均分子量。
上述(2)聚胺基酸衍生物鏈段之主鏈部分之分子量係該鏈段之聚合單體單元之分子量乘以其平均聚合數而獲得之計算值。該聚合數可使用藉由中和滴定對聚胺基酸之側鏈羧基進行定量之方法而求出；或者可使用自1H-NMR之積分值算出之聚合數。較佳為使用中和滴定法。
上述(3)生理活性物質之總分子量係該生理活性物質之分子量乘以其鍵結數而獲得之計算值。該鍵結數可藉由自利用HPLC之反應液中之未反應該生理活性物質之計量算出之方法；或者對由該生理活性物質結合嵌段共聚物裂解該生理活性物質從而游離之生理活性物質或源自其之鏈段分子進行定量分析之方法而求出。
上述(4)生理活性物質以外之鍵結基之總分子量係該鍵結基殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之計算值。該鍵結基之鍵結數可藉由自利用HPLC之反應液中之未反應該鍵結殘基之計量算出之方法；或者自聚胺基酸之水解後之定量分析而求出。又，亦可自1H-NMR之積分值算出。
本發明之嵌段共聚物係分子量為2kDa以上且15kDa以下。於上述分子量小於2kDa之情形時，該生理活性物質結合嵌段共聚物表現出不具有充分之奈米粒子形成能力之情況，而無法獲得向靶組織之充分浸透性。因此，變得無法有效率地發揮生理活性物質之藥理作用效果。另一方面，於上述分子量大於15kDa之情形時，伴隨著該嵌段共 聚物之腎排泄性受到抑制，其體內滯留性變高。因此，可導致生理活性物質對疾病靶組織以外之正常組織致敏，故而有正常組織之損傷表現之顧慮。例如於使用有細胞毒性之生理活性物質之情形時，可想到伴隨著骨髄抑制之血液毒性之延遲化。因此，必須將上述分子量控制為15kDa以下。該嵌段共聚物之分子量較佳為3kDa以上且12kDa以下，進而較佳為3kDa以上且10kDa以下。
通式(1)所示之結合有生理活性物質之嵌段共聚物係於水溶液中表現出自我聚集性之物性。即，係如下物性：若對該生理活性物質結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液進行利用使用雷射光之動態光散射法之粒度分佈測定，則計測為體積平均粒徑計約數奈米~約20奈米之奈米粒子。本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物較佳為如下物性，即該嵌段共聚物於1mg/mL水溶液中為體積平均粒徑最大亦未達20奈米之奈米粒子。於該情形時，係於利用純水之水溶液中進行粒度分佈測定。較佳為如下物性，該物性之特徵在於：藉由利用使用雷射光之動態光散射法之粒度分佈測定法，以計測出體積平均粒徑未達20奈米，且更佳為計測為3~15奈米之奈米粒子。
本發明中之所謂體積平均粒徑，係例如利用Particle Sizing System公司製造之ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(解析方法：NICOMP法)或者Malvern公司製造之粒徑-ζ電位測定裝置Zetasizer Nano ZS(解析方法：NNLS法)進行測定而獲得之體積分佈中存在之比例最多的峰值粒徑。
通式(1)所示之生理活性物質結合嵌段共聚物係親水性之聚乙二醇鏈段、與藉由生理活性物質或其他疏水性側鏈而表現出疏水性之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成之嵌段共聚物，因此可認為於水溶液中複數個該嵌段共聚物彼此之聚胺基酸衍生物鏈段基於疏水性相互作用而進行聚集。結果形成以聚胺基酸衍生物鏈段為內核(核心部)，且親水 性之聚乙二醇鏈段覆蓋上述內核周圍而形成外殼層(外殼部)之核心-外殼結構之微胞狀聚集體，推測其為以上述之奈米粒子之形式所觀測到者。
通式(1)所示之生理活性物質結合嵌段共聚物係於水溶液中形成奈米粒子之物性，該情況對生理活性物質之藥理作用效果之增強及/或副作用之減少而言為必需。
有效的是使用利用雷射光之光散射強度作為該結合有生理活性物質之嵌段共聚物之奈米粒子形成性之指標。即，可確認該生理活性物質結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性係以雷射光散射強度為指標。由此，有效的是以甲苯為光散射強度標準試樣，以相對於甲苯之相對強度為指標，對該生理活性物質結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性進行確認之方法。
本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之雷射光散射強度以相對於甲苯之光散射強度之相對強度計為至少2倍以上。
於上述光散射相對強度小於2倍之情形時，該生理活性物質結合嵌段共聚物表現出不具有充分之奈米粒子形成性之情況，而無法獲得向靶組織之充分浸透性。因此，變得無法有效率地發揮生理活性物質之藥理作用效果。本發明中，光散射相對強度之數值係具有奈米粒子形成能力之指標，只要相對於甲苯為2倍以上之光散射強度即可，其上限並無限制。即，即便於上述光散射相對強度大於100倍之情形時，亦可謂該嵌段共聚物具有充分之奈米粒子形成能力。然而，於光散射強度大於100倍之情形時，可認為有該嵌段共聚物不具有所需之排泄性之可能性。於該情形時，該嵌段共聚物之體內滯留性變高，因此可導致生理活性物質對疾病靶組織以外之正常組織致敏，故而有正常組織之損傷表現之顧慮。因此，妥當的是將上述光散射相對強度控 制為100倍以下。
本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物之水溶液中之光散射強度較佳為以相對於甲苯之光散射強度的相對強度計為2倍以上且50倍以下，更佳為2倍以上且30倍以下。
本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物之奈米粒子形成性分析中之使用雷射光之光散射強度的測定方法適當為如下方法：以該生理活性物質結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液為測定試樣，於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm下利用雷射光散射光度計進行測定。作為測定機器，例如可列舉：大塚電子公司製造之動態光散射光度計DLS-8000DL(測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm、ND過濾器2.5%、PH1：OPEN、PH2：SLIT)。
關於光散射強度測定，係將由不包含微粒子之純水製備之水溶液設為分析試樣而獲得分析值。該水溶液亦可於溶液製備中任意地藉由超音波照射而進行溶解。所製備之水溶液較佳為為了進而去除次微米級之微粒子而實施了過濾處理之水溶液。
再者，用作光散射強度測定之標準物質之甲苯只要為試劑級之純度，則可無特別限定地使用。較佳為使用進行過於光散射分析之試樣製備中通常進行之預處理過濾之甲苯。
繼而，對本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物之製造方法進行說明。可列舉：製備本嵌段共聚物之聚乙二醇鏈段與包含天冬胺酸及/或麩胺酸之聚胺基酸鏈段連結而成之AB嵌段共聚物，藉由使其與生理活性物質進行縮合反應而製造之方法；或者使包含聚乙二醇鏈段之聚合物成分與結合有生理活性物質之聚胺基酸衍生物進行結合之方法等。較佳為預先製備上述之聚乙二醇鏈段與聚胺基酸鏈段連結而成之AB嵌段共聚物，藉由使其與生理活性物質進行縮合反應而製造之方法。
作為該聚乙二醇鏈段與聚胺基酸鏈段連結而成之AB嵌段共聚物之製造方法，可列舉：藉由使用胺基酸-N-羧酸酐，使之與包含聚乙二醇鏈段之化合物逐次聚合而構建聚胺基酸鏈段之方法；或者使聚乙二醇鏈段與聚胺基酸鏈段進行結合之方法等。就嵌段共聚物反應性較高，容易控制聚胺基酸聚合數之原因而言，較佳為使用前者之方法。
對預先製備聚乙二醇鏈段與聚胺基酸衍生物鏈段連結而成之AB嵌段共聚物，使其與具有羥基及/或胺基之生理活性物質進行結合而獲得本發明之嵌段共聚物的製造方法之一態樣進行說明。
首先，使胺基酸之側鏈官能基得到適當保護之N-羰基胺基酸酐依序與一末端為胺基之聚乙二醇衍生物(例如，甲氧基聚乙二醇-1-丙基胺)進行反應，藉由逐次聚合而構建聚乙二醇鏈段與聚胺基酸鏈段連結而成之AB嵌段型共聚物骨架。於該情形時，藉由包含側鏈羧基得到適當保護之N-羰基天冬胺酸酐及/或N-羰基麩胺酸酐作為該N-羰基胺基酸酐，而可於聚胺基酸鏈段中包含天冬胺酸及/或麩胺酸。其後，實施適當之脫保護反應，可製備包含側鏈羧基已脫保護之天冬胺酸及/或麩胺酸之該AB嵌段共聚物。作為脫保護反應，於側鏈羧基為β-苄酯之情形時，可藉由鹼條件下之水解、或氫解反應而進行脫保護基反應。
只要使具有胺基及/或羥基之生理活性物質於適當之反應溶劑中且於縮合反應條件下與該聚乙二醇-聚胺基酸AB嵌段共聚物進行反應即可。
於該聚乙二醇-聚胺基酸AB嵌段共聚物與生理活性物質之縮合反應中可使用之溶劑只要為兩化合物溶解之溶劑，則可無特別限定地使用。例如可列舉：N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMI)等水溶性有機溶劑。該等溶劑可單獨使用，亦可以該等之混合溶劑之形式使用。又，亦可為基於上 述溶劑與其他有機溶劑之混合溶劑。
又，所使用之縮合劑只要為藉由脫水縮合反應而使羧酸與羥基進行酯反應及/或藉由脫水縮合反應而使羧酸與胺基進行醯胺反應之一般的脫水縮合劑，則可無特別問題地使用。作為該縮合劑，例如可使用二環己基碳二醯亞胺(DCC)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSC)等碳二醯亞胺系縮合劑；4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽n-水合物(DMT-MM)等三系縮合劑；1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)、二碳酸二-第三丁酯(Boc2O)等。於該縮合反應時，亦可使用N,N-二甲基胺基吡啶(DMAP)、或1-羥基苯并三吡咯環(HOBt)、N-羥基丁二醯亞胺(HOSu)等反應助劑。若使用碳二醯亞胺系縮合劑，則可將通式(1)之R4中，可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基與生理活性物質同時導入。
關於反應溫度，於通常0~180℃、較佳為5~100℃之溫度下進行即可。
又，為了調整本發明之結合有生理活性物質之共聚物之自我聚集性，亦可向聚胺基酸鏈段導入上述碳數(C1~C30)烷氧基、上述碳數(C1~C30)烷基胺基或上述二(C1~C30)烷基胺基等其他疏水性取代基。作為其方法，可列舉：藉由添加縮合劑而使聚乙二醇-聚胺基酸共聚物之羧基活化後，使相當於欲導入之疏水性取代基之醇化合物或胺基化合物以所需之當量進行反應之方法；或者使該醇化合物或該胺基化合物活化後，使之與該共聚物之聚胺基酸鏈段進行反應之方法等。
於該情形時，可於藉由該醇化合物或該胺基化合物而導入疏水性取代基後，導入生理活性物質，反之亦可，且亦可同時導入該生理活性物質與該疏水性取代基。
該疏水性取代基可為單一種類之取代基，亦可為複數種類之取代基。於導入複數種類之取代基之情形時，若使另外之醇化合物或胺基化合物反覆進行反應，則可合成各種疏水性取代基之混合體。
向聚乙二醇-聚胺基酸AB嵌段共聚物導入生理活性物質及任意之疏水性取代基後，任意地進行通常之分離操作或精製操作，藉此可製造本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物。
本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物係投予至活體內後，慢慢地裂解生理活性物質從而游離之物性。所游離之生理活性物質可發揮藥理效果。因此，本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物可用作以該生理活性物質為有效成分之醫藥品。
於使用本發明之結合有生理活性物質之嵌段共聚物作為醫藥品之情形時，可以經口、非經口中之任一種投予路徑使用。較佳為藉由利用非經口之注射之投予路徑而進行配方。利用注射之投予可藉由靜脈內投予、動脈內投予、皮下投予、肌內投予、腫瘤部內投予等而進行。
於本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物之製劑化時，可使用通常所使用之藥學上所容許之載體、例如結合劑、潤滑劑、崩解劑、溶劑、賦形劑、助溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、保存劑、鎮靜劑、色素、香料等。
於注射液劑之情形時，通常使用溶劑。作為溶劑，例如可列舉：水、生理鹽水、5%葡萄糖或甘露醇液、水溶性有機溶劑、例如甘油、乙醇、二甲基亞碸、N-甲基吡咯啶酮、聚乙二醇、發色基等、及該等之混合液、以及水與該水溶性有機溶劑之混合液等。較佳為使用該等製劑用添加劑，而用於製備可投予之醫藥製劑。
本發明之生理活性物質結合嵌段共聚物之投予量當然可根據所結合之生理活性物質之種類、患者之性別、年齡、生理狀態、病狀等 而變更，但較佳為以非經口之方式並以通常成人每天投予活性成分0.01~500mg/m2、較佳為0.1~250mg/m2之方式進行投予。
本發明可列舉生理活性物質使用有作為抗腫瘤劑之喜樹鹼衍生物之該嵌段共聚物作為較佳態樣。於以下對使用有喜樹鹼衍生物作為生理活性物質之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物進行說明。
喜樹鹼衍生物例如為7-乙基-10-羥基喜樹鹼、伊立替康、拓撲替康等喜樹鹼衍生物。該等喜樹鹼衍生物係於喜樹鹼骨架之20位具有羥基。進而7-乙基-10-羥基喜樹鹼及拓撲替康係於10位具有羥基。因此，係如下態樣，即該10位及/或20位羥基直接或經由適當之鍵結基而與天冬胺酸及/或麩胺酸之側鏈羧基酯鍵結。
喜樹鹼衍生物較佳為使用通式(2)所表示之喜樹鹼衍生物，
[式中，R5表示選自由氫原子、可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基及可具有取代基之矽烷基所組成之群中之1種取代基，R6表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基]。
作為鍵結殘基之態樣，係基於該喜樹鹼衍生物之羥基與聚胺基酸鏈段之天冬胺酸及/或麩胺酸之側鏈羧基之酯鍵之鍵結殘基。作為酯鍵，可為該喜樹鹼衍生物之10位羥基及20位羥基中之任一者，亦可為該等之混合物。較佳為基於利用10位羥基之酯鍵之鍵結殘基。更佳 為不包含該喜樹鹼衍生物之20位羥基酯鍵結殘基之態樣。
作為通式(2)之上述R5中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R5中之該碳數(C1~C6)烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、苄基等。更佳為可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C4)烷基，尤其是乙基更佳。
作為上述R5中之可具有取代基之矽烷基，可列舉：三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、第三丁基二甲基矽烷基、三異丙基矽烷基、第三丁基二苯基矽烷基等。較佳為第三丁基二甲基矽烷基。
作為上述R5，較佳為氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基。尤佳為氫原子或乙基。
作為通式(2)之上述R6中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R6中之該碳數(C1~C6)烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、苄基、二甲基胺基甲基等。作為該R6，尤佳為氫原子或二甲基胺基甲基。
作為通式(1)之R3之喜樹鹼衍生物，較佳為7-乙基-10-羥基喜樹鹼及/或拓撲替康(9-二甲基胺基甲基-10-羥基喜樹鹼)。即，較佳為通式(2)中，上述R5為乙基，上述R6為氫原子之7-乙基-10-羥基喜樹鹼。或者，較佳為通式(2)中，上述R5為氫原子，上述R6為二甲基胺基甲基之拓撲替康(9-二甲基胺基甲基-10-羥基喜樹鹼)。
於本發明中，作為使用上述喜樹鹼衍生物作為藥理活性物質之 態樣，較佳為通式(1)中之R3為喜樹鹼衍生物之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物。於以下進行說明。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物係如下喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物，其係通式(1)所示之聚乙二醇鏈段與聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)衍生物鏈段連結而成之嵌段共聚物，且R3為喜樹鹼衍生物之鍵結殘基。即，係通式(1)所示之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物。
[式中，R1表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，t表示20~270之整數，A表示可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，R2表示選自由氫原子、碳數(C1~C6)醯基及碳數(C1~C6)烷氧羰基所組成之群中之取代基，R3表示喜樹鹼衍生物之鍵結殘基，R4表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基、疏水性螢光物質之鍵結殘基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基，B表示鍵結基，n表示1或2，x1、x2、y1、y2及z分別獨立地表示 0~25之整數，(x1+x2)表示1~25之整數，(x1+x2+y1+y2+z)表示3~25之整數，鍵結有上述R3及R4之各構成單元以及支鏈羰基進行分子內環化之構成單元分別獨立為無規排列之結構]。
此處，通式R1、R2、R4、A、B、t、x1、x2、y1、y2、z係與上述含義相同。
於通式(1)之R3為喜樹鹼衍生物之鍵結殘基之情形時，所謂該喜樹鹼衍生物，可列舉：7-乙基-10-羥基喜樹鹼、伊立替康、拓撲替康等。該等喜樹鹼衍生物係於喜樹鹼骨架之20位具有羥基。進而7-乙基-10-羥基喜樹鹼及拓撲替康係於10位具有羥基。因此，係如下態樣，即該10位及/或20位羥基與天冬胺酸及/或麩胺酸之側鏈羧基酯鍵結。
上述R3之喜樹鹼衍生物之鍵結殘基中之喜樹鹼衍生物較佳為使用通式(2)所示之喜樹鹼衍生物，
[式中，R5表示選自由氫原子、可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基及可具有取代基之矽烷基所組成之群中之1種取代基，R6表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基]。此處，通式(2)中之R5及R6係與上述含義相同。
作為鍵結殘基之態樣，係基於該喜樹鹼衍生物之羥基與聚胺基酸鏈段之天冬胺酸及/或麩胺酸之側鏈羧基之酯鍵之鍵結殘基。作為酯鍵，可為該喜樹鹼衍生物之10位羥基及20位羥基中之任一者，亦可 為該等之混合物。較佳為基於利用10位羥基之酯鍵之鍵結殘基。更佳為不包含該喜樹鹼衍生物之20位羥基酯鍵結殘基之態樣。
作為通式(1)之R3之喜樹鹼衍生物，較佳為7-乙基-10-羥基喜樹鹼及/或拓撲替康(9-二甲基胺基甲基-10-羥基喜樹鹼)。即，較佳為通式(2)中，上述R5為乙基，上述R6為氫原子之7-乙基-10-羥基喜樹鹼。或者，較佳為通式(2)中，上述R5為氫原子，上述R6為二甲基胺基甲基之拓撲替康(9-二甲基胺基甲基-10-羥基喜樹鹼)。
通式(1)之R3之喜樹鹼衍生物於該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之同一分子中可為相同化合物，亦可複數種類之化合物混合存在。該R3較佳為相同化合物。
作為本發明之生理活性物質為喜樹鹼衍生物之情形時之較佳態樣，可列舉如下喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物，該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物係聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸衍生物鏈段連結而成之嵌段共聚物，且於麩胺酸單元之側鏈羧基鍵結有喜樹鹼衍生物。即，較佳為使用聚麩胺酸鏈段作為嵌段共聚物之聚胺基酸鏈段。總之，較佳為上述通式(1)中，n為2。
關於作為喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之更佳態樣，係通式(4)所示之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物，
[式中，R1a表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，ta表示20~270之整數，Aa表示可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，xa及ya分別為整數，(xa+ya)表示3~20之整數，xa相對於該(xa+ya)之比例為1~100%及ya相對於該(xa+ya)之比例為0~99%，R2a表示選自由氫原子、可具有取代基之碳數(C1~C6)醯基及可具有取代基之碳數(C1~C6)烷氧羰基所組成之群中之1種，R3a表示喜樹鹼衍生物之鍵結殘基，R4a可相同亦可不同，表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基，鍵結有上述R3a之麩胺酸單元、鍵結有上述R4a之麩胺酸單元分別獨立並以無規之排列進行聚合]。
作為上述R1a中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷基等。例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、環戊基、正己基、環己基等。
作為上述可具有之取代基，可列舉：鹵素原子、硝基、氰基、羥基、巰基、碳環或雜環芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、取代或未經取代之胺基、醯基胺基、烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、醯基、羧基、烷氧羰基、胺甲醯基或矽烷基等。芳香環上之取代位置可為鄰位，亦可為間位，亦可為對位。
作為該R1a，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、苄基、2,2-二甲氧基乙基、2,2-二乙氧基乙基、2-甲醯基乙基。更佳為可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀 之碳數(C1~C4)烷基。尤其是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基等更佳。
作為上述Aa中之可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，可列舉：亞甲基、伸乙基、正伸丙基、正伸丁基等。作為可具有之取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。
作為該Aa，尤其是伸乙基、正伸丙基更佳。
通式(4)之ta表示聚乙二醇鏈段中之伸乙基氧基之聚合數。該ta係20~270之整數。即，作為該聚乙二醇鏈段之分子量，係0.8kDa~12kDa。若作為聚乙二醇鏈段之聚合度之該ta小於20，則有所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物不具備充分之水溶性，又未發揮所需之體內動態之虞。另一方面，於該ta大於270之情形時，有所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之總分子量變大，而無法發揮所需之體內動態，從而使肝細胞毒性等無法預期之組織損傷出現病症之顧慮。該ta較佳為22~230之整數，更佳為30~180之整數。即，作為該聚乙二醇鏈段之分子量，較佳為1kDa~10kDa，更佳為1.3kDa~8kDa。
通式(4)之嵌段共聚物具有聚麩胺酸衍生物鏈段，(xa+ya)表示該聚麩胺酸衍生物之聚合數。該聚麩胺酸衍生物之聚合數為3~20，即(xa+ya)為3~20之整數。若該(xa+ya)小於3，則有所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之下述之雷射光散射強度不符合最佳範圍之虞。另一方面，於該(xa+ya)大於20之情形時，有所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之總分子量變大，並且下述之雷射光散射強度不符合最佳範圍之虞。即，若該(xa+ya)偏離3~20之範圍，則有無法獲得抗腫瘤效果之增強作用及/或副作用之減少效果之顧慮。聚麩胺酸衍生物之聚合數較佳為考慮所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之總分子量而適當設定。該(xa+ya)較佳為5~15之整數。
作為該聚麩胺酸衍生物之聚合數之(xa+ya)可藉由利用1H-NMR之測定、或對鍵結下述之R3a及R4a前之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物進行中和滴定而求出。
作為上述R2a中之可具有取代基之碳數(C1~C6)醯基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)醯基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R2a之該碳數(C1~C6)醯基，例如可列舉：甲醯基、乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、丙醯基、三甲基乙醯基、苄基羰基、苯乙基羰基等。更佳為可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C4)醯基，更佳為乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基。
作為上述R2a中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷氧羰基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷氧羰基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R2a之該碳數(C1~C6)烷氧羰基，例如可列舉：甲氧基羰基、乙氧基羰基、第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基等。
通式(4)中之R3a係通式(2)所示之喜樹鹼衍生物之鍵結殘基，
[式中，R5表示選自由氫原子、可具有取代基之碳數(C1~C6)烷 基及可具有取代基之矽烷基所組成之群中之1種取代基，R6表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基]。
再者，通式(2)中之R5及R6係與上述含義相同。
作為鍵結殘基之態樣，較佳為基於該喜樹鹼衍生物之羥基與上述聚麩胺酸衍生物鏈段之側鏈羧基之酯鍵之鍵結殘基。作為酯鍵，可為該喜樹鹼衍生物之10位羥基及20位羥基中之任一者，亦可為該等之混合物。較佳為基於利用10位羥基之酯鍵之鍵結殘基。更佳為不包含該喜樹鹼衍生物之20位羥基酯鍵結殘基之態樣。
作為通式(4)之R3a之喜樹鹼衍生物，較佳為7-乙基-10-羥基喜樹鹼及/或拓撲替康(9-二甲基胺基甲基-10-羥基喜樹鹼)。即，較佳為通式(2)中，上述R5為乙基，上述R6為氫原子之7-乙基-10-羥基喜樹鹼。或者，較佳為通式(2)中，上述R5為氫原子，上述R6為二甲基胺基甲基之拓撲替康(9-二甲基胺基甲基-10-羥基喜樹鹼)。
通式(4)之R3a之喜樹鹼衍生物於該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之同一分子中可為相同化合物，亦可複數種類之化合物混合存在。該R3a較佳為相同化合物。
通式(4)中，xa表示結合有上述R3a之喜樹鹼衍生物之麩胺酸單元之總數。該結合有喜樹鹼衍生物之麩胺酸單元係必須之構成，該xa係1以上之整數。該xa較佳為2~18之整數，更佳為3~16之整數。
xa相對於作為聚麩胺酸衍生物之聚合數之上述(xa+ya)之比例為1~100%。xa相對於上述(xa+ya)之比例較佳為10~90%，更佳為20~80%。
關於該xa之喜樹鹼類之鍵結數，可藉由利用HPLC對使所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物水解而游離之喜樹鹼衍生物或源自其之鏈段分子進行定量而算出喜樹鹼衍生物含量，自其數值而算出。
通式(4)中之R4a係選自由可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基、 可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基。
該R4a可以控制本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之物性為目的而任意地導入。例如藉由導入疏水性基為該R4a，可提高該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之聚麩胺酸鏈段之疏水性。另一方面，藉由導入具備胺基或羧基、羥基等可形成鹽之離子性官能基之親水性取代基作為該R4a，可提高該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之聚麩胺酸鏈段之親水性。又，於該R4a為羥基之情形時，有上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基為游離羧酸之情形。
該R4a可為單一種類之取代基，亦可為複數種類之取代基。
作為上述R4a中之可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷氧基。即，係於上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有酯型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4a中之該碳數(C1~C8)烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、第三丁氧基、環己氧基、苄氧基等。
作為上述R4a中之可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基胺基。即，係於上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有烷基醯胺型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4a中之該碳數(C1~C8)烷基胺基，例如可列舉：甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、異丙基胺基、丁基胺基、第三丁基胺基、環己基胺基、苄基胺基等。
又，該可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基亦包含羧基得到 保護之胺基酸。作為該羧基得到保護之胺基酸，例如亦可使用甘胺酸甲酯、甘胺酸苄酯、β-丙胺酸甲酯、β-丙胺酸苄酯、丙胺酸甲酯、白胺酸甲酯、苯丙胺酸甲酯等。
作為上述R4a中之可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二(C1~C8)烷基胺基。即，係於上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有二烷基醯胺型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4a中之該二(C1~C8)烷基胺基，例如可列舉：二甲基胺基、二乙基胺基、二丙基胺基、二異丙基胺基、二丁基胺基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基胺基、N-苄基-N-甲基胺基等。
上述R4a亦可為可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基。其係於上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有脲型修飾基者，即於側鏈羧基鍵結有-N(R4ax)CONH(R4ay)者[該R4ax及該R4ay可相同亦可不同，表示可經三級胺基取代之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基]。
作為該R4ax及R4ay中之可經三級胺基取代之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、環己基、2-二甲基胺基乙基、3-二甲基胺基丙基等。
作為上述R4a中之可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基，例如為甲基胺基羰基甲基胺基、乙基胺基羰基乙基胺基、異丙基胺基羰基異丙基胺基、環己基胺基羰基環己基胺基、乙基胺基羰基(3-二甲基胺基丙基)胺基、(3-二甲基胺基丙基)胺基羰基乙基胺基等。
通式(4)中之R4a亦可為羥基。即，麩胺酸之側鏈羧酸為游離羧酸。於該情形時，側鏈羧酸可為游離酸之態樣，又，亦可為作為醫藥 品所容許之任意之羧酸鹽之形態。作為上述羧酸鹽，可列舉：鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽等，且包含於本發明中。
通式(4)中之R4a較佳為碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及/或羥基。即，該R4a較佳為碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及羥基混合存在之態樣；或者該R4a較佳為僅羥基之態樣。
通式(4)中，ya表示鍵結有上述R4a之麩胺酸單元之總數。該鍵結有R4a之麩胺酸單元係任意之構成，該ya係0~19之整數。該ya較佳為2~18之整數，更佳為4~17。
ya相對於作為聚麩胺酸衍生物之聚合數之上述(xa+ya)之比例為0~99%。ya相對於上述(xa+ya)之比例較佳為10~90%，更佳為20~80%。
作為該R4a之鍵結數之ya可於鹼性條件下對所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物測定1H-NMR，自訊號強度比而算出。
於本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物中，上述聚麩胺酸衍生物鏈段係於側鏈羧基具備上述R3a之麩胺酸衍生物單元、與具備上述R4a之麩胺酸衍生物單元混合存在之聚合物鏈段。上述聚麩胺酸衍生物鏈段可為該具備R3a之麩胺酸衍生物單元、與該具備R4a之麩胺酸衍生物單元極化存在之嵌段聚合型，亦可為上述單元不規則存在之無規聚合型。較佳為具備上述R3a之麩胺酸衍生物單元、與具備上述R4a之麩胺酸衍生物單元不規則存在之無規聚合型聚麩胺酸衍生物鏈段。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物係分子量為2kDa以上且15kDa以下。於分子量小於2kDa之情形時，有未發揮基於高分子化之藥物動態特性，而未獲得抗腫瘤效果之增強作用等所需之藥理作用之虞。另一方面，於分子量超過15kDa之情形時，有抗腫瘤效果與副作用之背離變困難而明顯表現出副作用之顧慮。尤其是喜樹鹼衍生物 有強烈表現出骨髄抑制之血液毒性之延遲化之特徵。於分子量超過15kDa之情形時，強烈表現出血液毒性。因此，本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之分子量之控制非常重要。本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之分子量較佳為3kDa以上且12kDa以下，進而較佳為3kDa以上且10kDa以下。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之分子量係採用對其構成部分之各構成分子量進行累加而獲得之計算值作為上述「喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之分子量」。即，將對(1)聚乙二醇鏈段之分子量、(2)聚麩胺酸主鏈之分子量、(3)喜樹鹼衍生物之鍵結殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之喜樹鹼衍生物之總分子量、以及(4)喜樹鹼衍生物以外之鍵結基殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之該鍵結基之總分子量進行累加而獲得之計算值設為上述「喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之分子量」。
關於該「喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之分子量」，可為kDa單位之精度之分子量界定。因此，上述各構成部分之分析方法只要為於該聚胺基酸衍生物之kDa單位之分子量測定中精度充分之分析方法，則無特別限定，可適當選擇各種分析方法。於以下列舉各構成部分之較佳之分析方法。
上述(1)聚乙二醇鏈段之分子量係構建聚乙二醇鏈段之聚乙二醇化合物之分子量測定值，採用根據藉由以聚乙二醇標準品為基準之GPC法所測得之峰頂分子量而求出之平均分子量。
上述(2)聚麩胺酸主鏈之分子量係該主鏈之聚合單體單元之分子量乘以其聚合數而獲得之計算值。關於該聚合數，可使用藉由中和滴定對聚麩胺酸之側鏈羧基進行定量之方法而求出；或者可使用自1H-NMR之積分值算出之聚合數。較佳為使用中和滴定法。
上述(3)喜樹鹼衍生物之總分子量係該喜樹鹼衍生物之分子量乘 以其鍵結數而獲得之計算值。該鍵結數可藉由如下方式求出，即對由該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物裂解喜樹鹼衍生物從而游離之喜樹鹼衍生物或源自其之鏈段分子進行定量分析。
上述(4)喜樹鹼衍生物以外之鍵結基之總分子量係該鍵結基殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之計算值。該鍵結基之鍵結數可藉由自聚麩胺酸之水解後之定量分析而求出。又，亦可自1H-NMR之積分值算出。於該喜樹鹼衍生物以外之鍵結基為酯型修飾基之情形時，較佳為對藉由水解而酯裂解之對應醇化合物進行定量分析之方法。另一方面，於該喜樹鹼衍生物以外之鍵結基為醯胺型修飾基及脲型修飾基之情形時，較佳為藉由1H-NMR法而算出鍵結數。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物係於水溶液中表現出自我聚集性之物性。即，係如下物性：若對該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液進行利用雷射光散射法之粒度分佈測定，則計測為以體積平均粒徑計約數奈米~約20奈米之奈米粒子。本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物較佳為如下物性，即該衍生物於1mg/mL水溶液中為體積平均粒徑最大亦未達20奈米之奈米粒子。於該情形時，係於利用純水之水溶液中進行粒度分佈測定。較佳為如下物性，該物性之特徵在於：藉由利用使用雷射光之動態光散射法之粒度分佈測定法，以計測出體積平均粒徑未達20奈米，且更佳為計測為3~15奈米之奈米粒子。
本發明中之所謂體積平均粒徑，係利用Particle Sizing System公司製造之ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(解析方法：NICOMP法)或者Malvern公司製造之粒徑-ζ電位測定裝置Zetasizer Nano ZS(解析方法：NNLS法)進行測定而獲得之體積分佈中存在之比例最多的峰值粒徑。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物係親水性之聚乙二醇鏈 段、與利用酯鍵結而具備疏水性之喜樹鹼衍生物之聚麩胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物，因此可認為於水溶液中複數個該嵌段共聚物彼此之聚麩胺酸鏈段基於疏水性相互作用而進行聚集。結果形成以聚麩胺酸鏈段為內核(核心部)，且親水性之聚乙二醇鏈段覆蓋上述內核周圍而形成外殼層(外殼部)之核心-外殼結構之微胞狀聚集體，推測其為以上述之奈米粒子之形式所觀測到者。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物係於水溶液中形成奈米粒子之物性，該情況對減少副作用而言為必需。尤其是對於肝細胞毒性之表現抑制而言，重要的是具有奈米粒子形成性。
有效的是使用利用雷射光之光散射強度作為本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之奈米粒子形成性之指標。即，可確認該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性係以雷射光散射強度為指標。由此，有效的是以甲苯為光散射強度標準試樣，以相對於甲苯之相對強度為指標，對該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性進行確認之方法。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之雷射光散射強度以相對於甲苯之光散射強度的相對強度計為2倍以上且10倍以下。於上述光散射相對強度小於2倍之情形時，該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物表現出不具有充分之奈米粒子形成性之情況，而有表現出肝細胞毒性等副作用之虞。於本發明中，光散射相對強度之數值係具有奈米粒子形成能力之指標，只要相對於甲苯為2倍以上之光散射強度即可，其上限並無限制。即，即便於上述光散射相對強度大於10倍之情形時，亦判明該高分子衍生物具有充分之奈米粒子形成能力。然而，於該情形時，雖無肝細胞毒性之高頻率表現之顧慮，但有血液毒性之延遲化之顧慮，因此妥當的是將上述光散射相對強度控制為10倍以下。
再者，關於該水溶液，係將由不包含微粒子之純水製備之水溶液設為分析試樣而獲得分析值。該水溶液亦可於溶液製備中任意地藉由超音波照射而進行溶解。所製備之水溶液較佳為為了進而去除次微米級之微粒子而實施了過濾處理之水溶液。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之水溶液中之光散射強度較佳為以相對於甲苯之光散射強度的相對強度計為2倍以上且8倍以下，更佳為2倍以上且6倍以下。
作為本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之奈米粒子形成性分析之使用雷射光之光散射強度的測定方法適當為如下方法：以該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液為測定試樣，於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm下利用雷射光散射光度計進行測定。作為測定機器，例如可列舉：大塚電子公司製造之動態光散射光度計DLS-8000DL(測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm、ND過濾器2.5%、PH1：OPEN、PH2：SLIT)。
再者，用作光散射強度測定之標準物質之甲苯只要為試劑級之純度，則可無特別限定地使用。較佳為使用進行過於光散射分析之試樣製備中通常進行之預處理過濾之甲苯。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物較佳為通式(2)所示之喜樹鹼衍生物之質量含有率較佳為10質量%以上且60質量%以下。於該喜樹鹼衍生物含量低於10質量%之情形時，由於疏水性之喜樹鹼衍生物較少，故而基於疏水性相互作用之奈米粒子形成性降低。另一方面，於喜樹鹼衍生物之含量多於60質量%之情形時，有該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之水溶性明顯降低之顧慮。該喜樹鹼衍生物之質量含有率較佳為15質量%以上且50質量%以下。進而較佳為15質量%以上且40質量%以下。
於通式(4)中，R4a為可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基、可具 有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基或可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基之情形時，該R4a之鍵結基係任意之取代基，因此該取代基含有率為30質量%以下。較佳為1質量%以上且20質量%以下。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物中之聚乙二醇鏈段之質量含有率較佳為10質量%以上且80質量%以下，於聚乙二醇鏈段之質量含有率低於10質量%之情形時，有該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物不具備充分之水溶性，故而無法確保水溶液中之奈米粒子形成性之虞。另一方面，於聚乙二醇鏈段之質量含有率多於80質量%之情形時，有具備喜樹鹼衍生物之聚麩胺酸鏈段之質量含有率相對變低，故而無法確保水溶液中之奈米粒子形成性之顧慮。該聚乙二醇鏈段之質量含有率較佳為20質量%以上且70質量%以下。進而較佳為30質量%以上且65質量%以下。
作為本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之製造方法，可列舉：藉由聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物、與10位具有羥基之喜樹鹼衍生物之縮合反應而製造之方法；或者使包含聚乙二醇鏈段之聚合物成分與喜樹鹼結合聚麩胺酸衍生物進行結合之方法等。較佳為如下方法：預先製備聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物，藉由使其與10位具有羥基之喜樹鹼衍生物進行縮合反應而製造。
作為該聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物之製造方法，可列舉：藉由使用麩胺酸-N-羧酸酐，使之與包含聚乙二醇鏈段之化合物逐次聚合而構建聚麩胺酸鏈段之方法；或者使聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸鏈段進行結合之方法等。就用以使聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸鏈段鍵結之反應性較高，容易控制聚麩胺酸聚合數之原因而言，較佳為使用前者之方法。
即，藉由使用麩胺酸-N-羧酸酐，使之與包含聚乙二醇鏈段之化合物逐次聚合而構建聚麩胺酸鏈段，製備聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物，使用縮合劑，使喜樹鹼衍生物與所獲得之嵌段共聚物進行反應，藉此可製造本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物較佳為依據上述之專利文獻1所記載之方法而進行製造。即，使具有末端胺基之聚乙二醇化合物、與側鏈羧基得到保護之N-羰基麩胺酸酐以適當之當量進行反應，而構建所需之麩胺酸聚合數之聚麩胺酸鏈段，其後，對側鏈羧基進行脫保護，而製備側鏈羧基含有游離羧酸基之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物。使用縮合劑，使所製備之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物、與通式(2)所示之10位具有羥基之喜樹鹼衍生物於適當之溶劑中進行反應，藉此可製造本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物。
於該聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物與喜樹鹼衍生物之縮合反應中使用之溶劑只要為兩化合物溶解之溶劑，則可無特別限定地使用。例如可列舉：N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMI)等水溶性有機溶劑。該等溶劑可單獨使用，亦可以該等之混合溶劑之形式使用。又，亦可為基於上述溶劑與其他有機溶劑之混合溶劑。關於反應溫度，只要於通常0~180℃、較佳為5~50℃之溫度下進行即可。
又，所使用之縮合劑只要為藉由脫水縮合反應而使羧酸與羥基進行酯反應之通常的脫水縮合劑，則可無特別問題地使用。作為該縮合劑，例如可使用二環己基碳二醯亞胺(DCC)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSC)等碳二醯亞胺系縮合劑；4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽n-水合物(DMT-MM)等三系縮合劑；1-乙氧基羰基-2-乙氧基- 1,2-二氫喹啉(EEDQ)、二碳酸二-第三丁酯(Boc2O)等。
若使用上述碳二醯亞胺系縮合劑，則可將通式(1)之R4及通式(4)之R4a中，可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基；-N(R4ax)CONH(R4ay)[該R4ax及該R4ay可相同亦可不同，表示可經三級胺基取代之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基]與喜樹鹼衍生物同時導入。於該縮合反應時，亦可使用N,N-二甲基-4-胺基吡啶(DMAP)等反應助劑。
又，藉由調整反應條件等，可調整該高分子衍生物中之聚麩胺酸鏈段中之該R4a之取代基的組成。例如，根據使用EEDQ或Boc2O等作為縮合劑之活性酯化法或使用磷醯氯等之醯氯形成法，上述通式(4)中，R3a之喜樹鹼衍生物與R4a可製成包含羥基之聚麩胺酸鏈段。於導入烷基胺基羰基烷基胺基為該R4a之情形時，只要如上述般採用利用碳二醯亞胺系縮合劑之反應即可。
又，通式(4)中，為了調整聚麩胺酸鏈段之疏水性，亦可導入上述碳數(C1~C8)烷氧基、上述碳數(C1~C8)烷基胺基或上述二(C1~C8)烷基胺基作為R4a。作為該情形時之方法，可列舉：藉由添加縮合劑而使聚乙二醇-聚麩胺酸共聚物之羧基活化後，使相當於欲導入之R4a之取代基之醇化合物或胺基化合物以所需之當量進行反應之方法；或者使該醇化合物或該胺基化合物活化後，使之與該共聚物之聚麩胺酸鏈段進行反應之方法等。於該情形時，可於藉由該醇化合物或該胺基化合物而導入該R4a後，導入R3a之喜樹鹼衍生物，反之亦可，且亦可同時導入該R3a與該R4a。
該相當於R4a之基可為單一種類之官能基，亦可為複數種類之官能基。於導入複數種類之官能基之情形時，若使另外之醇化合物或胺基化合物反覆進行反應，則亦可合成R4a為各種取代基之混合體。
藉由上述縮合反應而導入R3a之喜樹鹼衍生物、及任意之R4a之取 代基後，任意地進行通常之分離操作或精製操作，藉此可取得本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物於投予至活體內後，藉由慢慢地裂解喜樹鹼衍生物並使之游離而可發揮藥理效果。因此，本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物可用作惡性腫瘤之治療所使用之抗腫瘤劑。
於使用本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物作為抗腫瘤劑之情形時，其投予量當然可根據患者之性別、年齡、生理狀態、病狀等而變更，但可以非經口之方式並以通常成人每天投予活性成分0.01~500mg/m2(體表面積)、較佳為0.1~250mg/m2之方式進行投予而使用。作為投予路徑，較佳為以非經口投予而使用。利用注射之投予係藉由靜脈內投予、動脈內投予、皮下投予、肌內投予、腫瘤部內投予等而進行。
本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物較佳為用作注射劑、片劑、散劑等通常所使用之醫藥製劑。製劑化時，可使用通常所使用之藥學上所容許之載體、例如結合劑、潤滑劑、崩解劑、溶劑、賦形劑、助溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、保存劑、鎮靜劑、色素、香料等。於注射液劑之情形時，通常使用溶劑。作為溶劑，例如可列舉：水、生理鹽水、5%葡萄糖或甘露醇液、水溶性有機溶劑、例如甘油、乙醇、二甲基亞碸、N-甲基吡咯啶酮、聚乙二醇、發色基等、及該等之混合液、以及水與該水溶性有機溶劑之混合液等。較佳為使用該等製劑用添加劑，而用於製備可投予之醫藥製劑。
關於本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之作為抗腫瘤劑之用途，可用於惡性腫瘤疾病之治療。作為可治療之惡性腫瘤，並無特別限定，可應用於對乳癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、直腸結腸癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝細胞癌、胃 癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、類癌瘤、頭部及頸部之癌、黑色素瘤、卵巢癌、膽管癌、間皮瘤、及多發性骨髓瘤等惡性腫瘤之治療。尤其是適合可將喜樹鹼衍生物用於治療之非小細胞肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌(無法手術或復發)、結腸‧直腸癌(無法手術或復發)、乳癌(無法手術或復發)、鱗狀細胞癌、惡性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)之治療。
本發明可列舉使用具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物作為生理活性物質之該嵌段共聚物作為較佳態樣。以下對使用間苯二酚衍生物作為生理活性物質之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物進行說明。
關於間苯二酚衍生物，已知其與HSP90(熱休克蛋白90)家族蛋白質結合並藉由抑制HSP90家族之蛋白質之機能而表現出抗腫瘤活性等(Hsp90 inhibitors as novel cancerchemotherapeutic agents.Trends Mol Med.2002；8(4 Suppl.)：p.S55-61.)。作為具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物，已知有具有三吡咯環骨架(參照國際公開WO05/000300號、國際公開WO06/055760號、國際公開WO05/018674號等)、異噁唑骨架(參照國際公開WO04/072051號)、吡唑骨架(參照國際公開WO03/055860號等)之化合物等。該等化合物由於包含具有羥基之間苯二酚結構，故而可藉由將該羥基設為鍵結基而應用於本發明之嵌段共聚物。即，係如下態樣：間苯二酚基之羥基直接或經由適當之鍵結基而與天冬胺酸及/或麩胺酸之側鏈羧基酯鍵結。
具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物較佳為間苯二酚衍生物之鍵結殘基由通式(3)表示之間苯二酚衍生物，[化11]
[式中，R7表示選自由巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔基、碳環或雜環芳基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、碳數(C1~C8)之醯基、羧基、碳數(C1~C8)之烷氧羰基、胺甲醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種，R8表示選自由可具有取代基之碳環或雜環芳基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔基、碳數(C1~C20)之烷基胺基及碳數(C1~C20)之醯基胺基所組成之群中之1種，環H為選自由通式(3-1)、(3-2)及(3-3)所組成之群中之雜環芳基，
[式中，R9表示選自由巰基、羥基、氫原子、鹵素原子、胺甲醯基、碳數(C1~C8)之烷氧羰基、氰基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)之烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)之烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、碳數(C1~C8)之醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種]。
R7及R9中之所謂鹵素原子，表示氟原子、氯原子、溴原子、或碘原子。
R7及R8中之所謂烷基，表示碳數(C1~C20)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基。作為直鏈狀烷基，例如可列舉：甲基、乙基、丙基、正丁基、正戊基、正己基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基等。作為支鏈狀烷基，例如可列舉：異丙基、第三丁基、2,2-二甲基丙基、2,3-二甲基戊基、2,3-二甲基辛基、3-甲基-4-乙基癸基、3,4-二乙基十一烷基等。作為環狀烷基，例如可列舉：環丙基、環丁基、環戊基、環己基、金剛烷基、環十二烷基、環十六烷基、環十八烷基、環二十烷基等。較佳為碳數(C1~C8)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基。
R7及R8中之所謂烯基，表示於任意一處以上具有碳-碳雙鍵之碳數(C2~C20)之直鏈狀、支鏈狀、或環狀烯基。作為直鏈狀烯基，例如可列舉：乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、1-辛烯基、1-十六烯基、1-十八烯基等1-烯基；2-丁烯基、2-戊烯基、2-辛烯基、2-十六烯基、2-十八烯基等2-烯基等。作為支鏈狀烯基，例如可列舉：異丙烯基、3-甲基-1-丁烯基或香葉基、6-乙基-3-甲基-1辛烯基、5,6-二甲基- 1-十八烯基等。較佳為碳數(C2~C8)之直鏈狀、支鏈狀、或環狀烯基。
R7及R8中之所謂炔基，表示於任意一處以上具有碳-碳三鍵之碳數(C2~C20)之炔基。例如可列舉：乙炔基、1-丙炔基、3,3-二甲基-1-丁炔基、1-辛炔基、1-十六炔基、1-十八炔基等1-炔基；2-丙炔基、2-丁炔基、3-苯基-2-丙炔基、4,4-二甲基-2-戊炔基、3-三甲基矽烷基-2-丙炔基、2-己炔基、2-辛炔基、2-十二炔基、2-十六炔基、2-十八炔基等2-炔基等。較佳為碳數(C2~C8)之炔基。
作為R7及R8中之碳環芳基，例如可列舉：苯基、萘基等。又，作為雜環芳基，例如可列舉：吡啶基、嘧啶基、喹啉基、喹唑啉基、萘啶基、呋喃基、吡咯基、吲哚基、咪唑基、吡唑基、唑基、異噁唑基、三唑基等。
作為R8中之可具有之取代基，例如可列舉：氫原子、巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、烷基、烯基、炔基、碳環或雜環芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、醯基胺基、烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、醯基、羧基、烷氧羰基、胺甲醯基、或矽烷基等。芳香環上之取代位置可為鄰位，亦可為間位，亦可為對位。
作為R7及R9中之烷硫基，表示碳數(C1~C8)之烷硫基，例如可列舉：甲硫基、異丙硫基、苄硫基等。作為芳硫基，例如可列舉：苯硫基、萘硫基、吡啶硫基等。
作為烷基亞磺醯基，表示碳數(C1~C8)之烷基亞磺醯基，例如可列舉：甲基亞磺醯基、異丙基亞磺醯基、苄基亞磺醯基等。作為芳基亞磺醯基，例如可列舉：苯基亞磺醯基、萘基亞磺醯基、吡啶基亞磺醯基等。
作為烷基磺醯基，表示碳數(C1~C8)之烷基磺醯基，例如可列舉：甲基磺醯基、異丙基磺醯基、苄基磺醯基等。作為芳基磺醯基，例如可列舉：苯基磺醯基、萘基磺醯基、吡啶基磺醯基等。
作為胺磺醯基，例如可列舉：二甲基胺磺醯基、苯基胺磺醯基等。
作為R7及R9中之烷氧基，表示碳數(C1~C8)之烷氧基，例如可列舉：甲氧基、異丙氧基、苄氧基等。作為芳氧基，例如可列舉：苯氧基、萘氧基、吡啶氧基等。
作為醯氧基，表示碳數(C1~C8)之醯氧基，例如可列舉：乙醯氧基、苯甲醯氧基等。
作為烷氧基羰氧基，表示碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基，例如可列舉：甲氧基羰氧基、三氟甲氧基羰基等。
作為胺甲醯氧基，例如可列舉：二甲基胺甲醯氧基、苯基胺甲醯氧基等。
作為R7及R9中之胺基，例如可列舉：未經取代之胺基、二甲基胺基、嗎啉基、哌啶基、4-甲基哌-1-基、苯基胺基等。
作為醯基胺基，例如可列舉：乙醯基胺基、苯甲醯基胺基等。
作為烷氧基羰基胺基，例如可列舉：甲氧基羰基胺基、乙氧基羰基胺基、苄氧基羰基胺基等。
作為脲基，例如可列舉：三甲基脲基、1-甲基-3-苯基-脲基等。
作為磺醯基胺基，例如可列舉：甲烷磺醯基胺基、苯磺醯基胺基等。
作為胺磺醯基胺基，例如可列舉：二甲基胺磺醯基胺基等。
作為R7及R9中之醯基，例如可列舉：乙醯基、三甲基乙醯基、苯甲醯基、吡啶羰基等。
作為烷氧羰基，例如可列舉：甲氧基羰基、苄氧基羰基等。
作為烷基矽烷基，例如可列舉：三甲基矽烷基、三異丙基矽烷基、第三丁基-二苯基矽烷基等。
作為R7中之胺甲醯基，例如可列舉：二甲基胺甲醯基、苯基胺甲醯基等。
R8中之所謂可具有取代基之烷基胺基，表示具有胺基或烷基胺基作為取代基之碳數(C1~C8)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基，例如可列舉：胺基亞甲基、嗎啉基亞甲基、嗎啉基-3-伸丙基、哌嗪基-3-伸丙基等。
作為可具有取代基之醯基胺基，例如可列舉：乙醯基胺基、苯甲醯基胺基等。
作為R8中之可具有之取代基，係與上述含義相同。
本發明中，較佳為通式(1)中之R3為具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物之鍵結殘基之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物。於以下進行說明。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物係如下間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物，其係通式(1)所示之聚乙二醇鏈段與聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)衍生物鏈段連結而成之嵌段共聚物，且R3為間苯二酚衍生物之鍵結殘基。即，係通式(1)所示之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物，[化13]
[式中，R1表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，t表示20~270之整數，A表示可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，R2表示選自由氫原子、碳數(C1~C6)醯基及碳數(C1~C6)烷氧羰基所組成之群中之取代基，R3表示間苯二酚衍生物之鍵結殘基，R4表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基、疏水性螢光物質之鍵結殘基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基，B表示鍵結基，n表示1或2，z1、x2、y1、y2及z分別獨立地表示0~25之整數，(x1+x2)表示1~25之整數，(x1+x2+y1+y2+z)表示3~25之整數，鍵結有上述R3及R4之各構成單元以及支鏈羰基進行分子內環化之構成單元分別獨立為無規排列之結構]。
此處，通式R1、R2、R4、A、B、t、x1、x2、y1、y2、z係與上述含義相同。
於通式(1)之R3為間苯二酚衍生物之鍵結殘基之情形時，關於該間苯二酚衍生物，已知有具有上述之三吡咯環骨架、異噁唑骨架、吡唑骨架之具有HSP90抑制活性之化合物等。該等由於具備具有羥基之 間苯二酚結構，故而可用作本發明之生理活性物質。較佳為具有三吡咯環骨架之間苯二酚衍生物，較佳為國際公開WO05/000300號、國際公開WO06/055760號、國際公開WO05/018674號所記載之具有HSP90抑制活性之化合物。
上述R3之具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物之鍵結殘基中之間苯二酚衍生物較佳為間苯二酚衍生物之鍵結殘基由通式(3)表示之間苯二酚衍生物，
[式中，R7表示選自由巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔基、碳環或雜環芳基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、碳數(C1~C8)之醯基、羧基、碳數(C1~C8)之烷氧羰基、胺甲醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種，R8表示選自由可具有取代基之碳環或雜環芳基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔基、碳數(C1~ C20)之烷基胺基及碳數(C1~C20)之醯基胺基所組成之群中之1種，環H為選自由通式(3-1)、(3-2)及(3-3)所組成之群中之雜環芳基，
[式中，R9表示選自由巰基、羥基、氫原子、鹵素原子、胺甲醯基、碳數(C1~C20)之烷氧羰基、氰基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)之烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)之烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、碳數(C1~C8)之醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種]。
再者，通式(3)中之R7~R9及環H係與上述含義相同。
該R3之間苯二酚衍生物之鍵結殘基中之間苯二酚衍生物較佳為通式(3)中之R7~R9及環H為選自以下之群中之組合之化合物。
作為R7，較佳為鹵素原子、可具有取代基之碳數(C1~C8)之直鏈狀或支鏈狀之烷基、可具有取代基之碳數(C1~C8)之直鏈狀或支鏈狀之炔基、胺甲醯基、胺磺醯基，尤佳為氯原子、溴原子、乙基、異丙基、2-丙炔基。
作為R8，較佳為可具有取代基之碳數(C1~C8)之直鏈狀或支鏈狀 之烷基、可具有取代基之苯基、萘基、吡咯基、吲哚基。作為通式(3)中之R8之取代基，較佳為羥基、碳數(C1~C8)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基、碳數(C1~C8)之烷氧基、可具有取代基之胺基，尤佳為羥基、甲氧基、嗎啉基、4-甲基哌-1-基。
作為R9，較佳為巰基、羥基、烷基磺醯基、胺甲醯基、烷氧羰基，尤佳為巰基、羥基。
作為環H，較佳為三唑基、異噁唑基。
再者，於上述R9為巰基或羥基，環H為三唑基之情形時，可能具有互變異構性，亦可為各自之互變異構體。
作為本發明中之間苯二酚衍生物之具體例，可列舉：以下之化合物(3a)~(3k)之11種化合物。
作為R3之間苯二酚衍生物，較佳為結構式(3a)之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3- 二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(非專有名：Ganetespib)。
通式(1)之R3之間苯二酚衍生物於該間苯二酚類結合嵌段共聚物之同一分子中可為相同化合物，亦可複數種類之化合物混合存在。該R3較佳為相同化合物。
作為本發明之生理活性物質為具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物之情形時的較佳態樣，可列舉如下間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物，其係聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸衍生物鏈段連結而成之嵌段共聚物，且於麩胺酸單元之側鏈羧基鍵結有間苯二酚衍生物。即，較佳為使用聚麩胺酸鏈段作為嵌段共聚物之聚胺基酸鏈段。總之，較佳為上述通式(1)中，n為2。
關於作為間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之更佳態樣，係通式(5)所表示之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物，
[式中，R1b表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，tb表示20~270之整數，Ab表示可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，xb及yb分別為整數，(xb+yb)表示3~20之整數，xb相對於該(xb+yb)之比例為1~100%及yb相對於該(xb+yb)之比例為0~99%，R2b表示選自 由氫原子、可具有取代基之碳數(C1~C6)醯基及可具有取代基之碳數(C1~C6)烷氧羰基所組成之群中之1種，R3b表示具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物之鍵結殘基，R4b可相同亦可不同，表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基，鍵結有上述R3b之麩胺酸單元、鍵結有上述R4b之麩胺酸單元分別獨立並以無規之排列進行聚合]。
作為上述R1b中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷基等。例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、環戊基、正己基、環己基等。
作為上述可具有之取代基，可列舉：鹵素原子、硝基、氰基、羥基、巰基、碳環或雜環芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、取代或未經取代之胺基、醯基胺基、烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、醯基、羧基、烷氧羰基、胺甲醯基或矽烷基等。芳香環上之取代位置可為鄰位，亦可為間位，亦可為對位。
作為該R1b，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、苄基、2,2-二甲氧基乙基、2,2-二乙氧基乙基、2-甲醯基乙基。更佳為可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C4)烷基。尤其是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基等更佳。
作為上述Ab中之可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，可列舉：亞甲基、伸乙基、正伸丙基、正伸丁基等。作為可具有之取代 基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。
作為該Ab，尤其是伸乙基、正伸丙基更佳。
通式(5)之tb表示聚乙二醇鏈段中之伸乙基氧基之聚合數。該tb係20~270之整數。即，作為該聚乙二醇鏈段之分子量，係0.8kDa~12kDa。若作為聚乙二醇鏈段之聚合度之該tb小於20，則有所獲得之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物不具備充分之水溶性，又未發揮所需之體內動態之虞。另一方面，於該tb大於270之情形時，有所獲得之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之總分子量變大，而無法發揮所需之體內動態，從而使血液毒性等無法預期之組織損傷出現症狀之顧慮。該tb較佳為22~230之整數，更佳為30~180之整數。即，作為該聚乙二醇鏈段之分子量，較佳為1kDa~10kDa，更佳為1.3kDa~8kDa。
通式(5)之嵌段共聚物具有聚麩胺酸衍生物鏈段，(xb+yb)表示該聚麩胺酸衍生物之聚合數。該聚麩胺酸衍生物之聚合數為3~20，即(xb+yb)為3~20之整數。若該(xb+yb)小於3，則有所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之下述之雷射光散射強度不符合最佳範圍之虞。另一方面，於該(xb+yb)大於20之情形時，有所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之總分子量變大，並且下述之雷射光散射強度不符合最佳範圍之虞。即，若該(xb+yb)偏離3~20之範圍，則有無法獲得抗腫瘤效果之增強作用及/或副作用之減少效果之顧慮。聚麩胺酸衍生物之聚合數較佳為考慮所獲得之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之總分子量而適當設定。該(xb+yb)較佳為5~15之整數。
作為該聚麩胺酸衍生物之聚合數之(xb+yb)可藉由利用1H-NMR之測定、或者對鍵結下述之R3b及R4b前之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物進行中和滴定而求出。
作為上述R2b中之可具有取代基之碳數(C1~C6)醯基，可列舉： 可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)醯基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R2b之該碳數(C1~C6)醯基，例如可列舉：甲醯基、乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、丙醯基、三甲基乙醯基、苄基羰基、苯乙基羰基等。更佳為可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C4)醯基，更佳為乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基。
作為上述R2b中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷氧羰基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷氧羰基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R2b之該碳數(C1~C6)烷氧羰基，例如可列舉：甲氧基羰基、乙氧基羰基、第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基等。
通式(5)中之R3b中之具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物之鍵結殘基中之間苯二酚衍生物較佳為間苯二酚衍生物之鍵結殘基由通式(3)表示之間苯二酚衍生物，
[式中，R7表示選自由巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔 基、碳環或雜環芳基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、碳數(C1~C8)之醯基、羧基、碳數(C1~C8)之烷氧羰基、胺甲醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種，R8表示選自由可具有取代基之碳環或雜環芳基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔基、碳數(C1~C20)之烷基胺基及碳數(C1~C20)之醯基胺基所組成之群中之1種，環H為選自由通式(3-1)、(3-2)及(3-3)所組成之群中之雜環芳基，
[式中，R9表示選自由巰基、羥基、氫原子、鹵素原子、胺甲醯基、碳數(C1~C20)之烷氧羰基、氰基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)之烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)之烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰 基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、碳數(C1~C8)之醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種]。
再者，上述R3b中之通式(3)中之R5~R9及環H係與上述含義相同。
作為間苯二酚衍生物之鍵結殘基之態樣，較佳為基於該間苯二酚衍生物之羥基與上述聚麩胺酸衍生物鏈段之側鏈羧基之酯鍵之鍵結殘基。作為酯鍵，可為該間苯二酚衍生物之間苯二酚取代基之羥基中之任一者，亦可為其混合物。
作為通式(5)之R3b之間苯二酚衍生物，較佳為4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(非專有名：Ganetespib)。
通式(5)之R3b之間苯二酚衍生物於該間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之同一分子中可為相同化合物，亦可複數種類之化合物混合存在。該R3b較佳為相同化合物。
通式(5)中，xb表示結合有上述R3b之間苯二酚衍生物之麩胺酸單元之總數。該結合有間苯二酚衍生物之麩胺酸單元係必須之構成，該xb為1以上之整數。該xb較佳為2~18之整數，更佳為3~16之整數。
xb相對於作為聚麩胺酸衍生物之聚合數之上述(xb+yb)之比例為1~100%。xb相對於上述(xb+yb)之比例較佳為10~90%，更佳為20~80%。
關於該xb之間苯二酚衍生物之鍵結數，可藉由利用HPLC對使所獲得之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物水解從而游離之間苯二酚衍生物或源自其之鏈段分子進行定量而算出間苯二酚衍生物含量，並根據該數值而算出。
通式(5)中之R4b係選自由可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基、 可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基。
該R4b可以控制本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之物性為目的而任意地導入。例如，藉由導入疏水性基為該R4b，可提高該間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之聚麩胺酸鏈段之疏水性。另一方面，藉由導入具備胺基或羧基、羥基等可形成鹽之離子性官能基之親水性取代基作為該R4b，可提高該間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之聚麩胺酸鏈段之親水性。又，於該R4b為羥基之情形時，有上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基為游離羧酸之情形。
該R4b可為單一種類之取代基，亦可為複數種類之取代基。
作為上述R4b中之可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷氧基。即，係於上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有酯型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4b中之該碳數(C1~C8)烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、第三丁氧基、環己氧基、苄氧基等。
作為上述R4b中之可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基胺基。即，係於上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有烷基醯胺型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4b中之該碳數(C1~C8)烷基胺基，例如可列舉：甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、異丙基胺基、丁基胺基、第三丁基胺基、環己基胺基、苄基胺基等。
又，該可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基亦包含羧基得到 保護之胺基酸。作為該羧基得到保護之胺基酸，例如亦可使用甘胺酸甲酯、甘胺酸苄酯、β-丙胺酸甲酯、β-丙胺酸苄酯、丙胺酸甲酯、白胺酸甲酯、苯丙胺酸甲酯等。
作為上述R4b中之可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二(C1~C8)烷基胺基。即，係於上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有二烷基醯胺型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4b中之該二(C1~C8)烷基胺基，例如可列舉：二甲基胺基、二乙基胺基、二丙基胺基、二異丙基胺基、二丁基胺基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基胺基、N-苄基-N-甲基胺基等。
上述R4b亦可為可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基。其係於上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有脲型修飾基者，即係於側鏈羧基鍵結有-N(R4bx)CONH(R4by)者[該R4bx及該R4by可相同亦可不同，表示可經三級胺基取代之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基]。
作為該R4bx及R4by中之可經三級胺基取代之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、環己基、2-二甲基胺基乙基、3-二甲基胺基丙基等。
作為上述R4b中之可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基，例如為甲基胺基羰基甲基胺基、乙基胺基羰基乙基胺基、異丙基胺基羰基異丙基胺基、環己基胺基羰基環己基胺基、乙基胺基羰基(3-二甲基胺基丙基)胺基、(3-二甲基胺基丙基)胺基羰基乙基胺基等。
通式(5)中之R4b亦可為羥基。即，麩胺酸之側鏈羧酸為游離羧酸。於該情形時，側鏈羧酸可為游離酸之態樣，又，亦可為作為醫藥 品所容許之任意之羧酸鹽之形態。作為上述羧酸鹽，可列舉：鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽等，且包含於本發明中。
通式(4)中之R4b較佳為碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及/或羥基。即，該R4b較佳為碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及羥基混合存在之態樣；或者該R4b較佳為僅羥基之態樣。
通式(4)中，yb表示鍵結有上述R4b之麩胺酸單元之總數。該鍵結有R4b之麩胺酸單元係任意之構成，該yb係0~19之整數。該yb較佳為2~18之整數，更佳為4~17。
yb相對於作為聚麩胺酸衍生物之聚合數之上述(xb+yb)之比例為0~99%。yb相對於上述(xb+yb)之比例較佳為10~90%，更佳為20~80%。
作為該R4b之鍵結數之yb可於鹼性條件下對所獲得之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物測定1H-NMR，自訊號強度比而算出。
於本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物中，上述聚麩胺酸衍生物鏈段係於側鏈羧基具備上述R3b之麩胺酸衍生物單元、與具備上述R4b之麩胺酸衍生物單元混合存在之聚合物鏈段。該具備R3b之麩胺酸衍生物單元、與該具備R4b之麩胺酸衍生物單元可為極化存在之嵌段聚合型，亦可為不規則存在之無規聚合型。較佳為具備上述R3b之麩胺酸衍生物單元、與具備上述R4b之麩胺酸衍生物單元不規則存在之無規聚合型聚麩胺酸衍生物鏈段。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物係分子量為2kDa以上且15kDa以下。於分子量小於2kDa之情形時，有未發揮基於高分子化之藥物動態特性，而無法獲得抗腫瘤效果之增強作用等所需之藥理作用之虞。另一方面，於分子量超過15kDa之情形時，有抗腫瘤效果與副作用之背離變得困難而強烈表現出副作用之顧慮。尤其是間苯二 酚衍生物有強烈表現出骨髄抑制之血液毒性之延遲化之特徵。於分子量超過15kDa之情形時，強烈表現出血液毒性之延遲化。因此，本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之分子量之控制非常重要。本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之分子量較佳為3kDa以上且12kDa以下，進而較佳為3kDa以上且10kDa以下。
本發明中之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之分子量係採用對其構成部分之各構成分子量進行累加而獲得之計算值作為該「間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之分子量」。即，將對(1)聚乙二醇鏈段之分子量、(2)聚麩胺酸主鏈之分子量、(3)間苯二酚衍生物之鍵結殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之間苯二酚衍生物之總分子量、以及(4)間苯二酚衍生物以外之鍵結基殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之該鍵結基之總分子量進行累加而獲得之計算值設為上述「間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之分子量」。
該「間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之分子量」可為kDa單位之精度之分子量界定。因此，關於上述各構成部分之分析方法，只要為於該聚胺基酸衍生物之kDa單位之分子量測定中精度充分之分析方法，則無特別限定，可適當選擇各種分析方法。於以下列舉各構成部分之較佳之分析方法。
各構成部分之各構成分子量之算出方法可基於依據上述之記載之方法而算出。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物係於水溶液中表現出自我聚集性之物性。即，係如下物性：若對該間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液進行利用雷射光散射法之粒度分佈測定，則計測為以體積平均粒徑計約數奈米~約20奈米之奈米粒子。本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物較佳為如下物性，即該衍生物於1mg/mL水溶液中為體積平均粒徑最大亦未達20奈米之奈米粒子。於該 情形時，係於利用純水之水溶液中進行粒度分佈測定。較佳為如下物性，該物性之特徵在於：藉由利用使用雷射光之動態光散射法之粒度分佈測定法，計測出體積平均粒徑未達20奈米，且更佳為計測為3~15奈米之奈米粒子。
本發明中之所謂體積平均粒徑，係利用Particle Sizing System公司製造之ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(解析方法：NICOMP法)或者Malvern公司製造之粒徑-ζ電位測定裝置Zetasizer Nano ZS(解析方法：NNLS法)進行測定而獲得之體積分佈中存在之比例最多的峰值粒徑。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物係親水性之聚乙二醇鏈段、與利用酯鍵結而具備疏水性之間苯二酚衍生物之聚麩胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物，因此可認為於水溶液中複數個該嵌段共聚物彼此之聚麩胺酸鏈段基於疏水性相互作用而進行聚集。結果形成以聚麩胺酸鏈段為內核(核心部)，且親水性之聚乙二醇鏈段覆蓋上述內核周圍而形成外殼層(外殼部)之核心-外殼結構之微胞狀聚集體，推測其為以上述之奈米粒子之形式所觀測到者。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物係於水溶液中形成奈米粒子之物性，該情況對抗腫瘤效果之增強作用與血液毒性之延遲化抑制而言重要。
有效的是使用利用雷射光之光散射強度作為本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之奈米粒子形成性之指標。即，可確認該間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性係以雷射光散射強度為指標。由此，有效的是以甲苯為光散射強度標準試樣，以相對於甲苯之相對強度為指標，對該喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性進行確認之方法。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之雷 射光散射強度以相對於甲苯之光散射強度的相對強度計為2倍以上且50倍以下。於上述光散射相對強度小於2倍之情形時，該間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物表現出不具有充分之奈米粒子形成性之情況，而無法充分獲得向腫瘤等疾病靶組織之藥劑移行性及向組織內部之浸透性，因此有藥效表現並不充分之虞。於本發明中，光散射相對強度之數值係具有奈米粒子形成能力之指標，只要相對於甲苯為2倍以上之光散射強度即可，其上限並無限制。即，即便於上述光散射相對強度大於50倍之情形時，亦判明該高分子衍生物具有充分之奈米粒子形成能力。然而，於該情形時，該嵌段共聚物之體內滯留性變高，而導致藥劑向疾病靶組織以外傳遞，故而有血液毒性之延遲化等無法預期之副作用表現之顧慮，因此需要將上述光散射相對強度控制為50倍以下。較佳為40倍以下。
再者，關於該水溶液，係將由不包含微粒子之純水製備之水溶液設為分析試樣而獲得分析值。該水溶液亦可於溶液製備中任意地藉由超音波照射而進行溶解。所製備之水溶液較佳為為了進而去除次微米級之微粒子而實施了過濾處理之水溶液。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之水溶液中之光散射強度較佳為以相對於甲苯之光散射強度的相對強度計為2倍以上且40倍以下，更佳為2倍以上且30倍以下。
作為本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之奈米粒子形成性分析之使用雷射光之光散射強度之測定方法適當為如下方法，即，以該間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液為測定試樣，於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm下利用雷射光散射光度計進行測定。作為測定機器，例如可列舉：大塚電子公司製造之動態光散射光度計DLS-8000DL(測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm、ND過濾器2.5%、PH1：OPEN、PH2：SLIT)。
再者，用作光散射強度測定之標準物質之甲苯只要為試劑級之純度，則可無特別限定地使用。較佳為使用進行過於光散射分析之試樣製備中通常進行之預處理過濾之甲苯。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物較佳為通式(2)所示之間苯二酚衍生物之質量含有率為10質量%以上且60質量%以下。於該喜樹鹼衍生物含量低於10質量%之情形時，由於疏水性之間苯二酚衍生物較少，故而基於疏水性相互作用之奈米粒子形成性降低。另一方面，於間苯二酚衍生物之含量多於60質量%之情形時，有該間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之水溶性明顯降低之顧慮。該間苯二酚衍生物之質量含有率較佳為15質量%以上且50質量%以下。進而較佳為15質量%以上且40質量%以下。
於通式(5)中，R4b為可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基或可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基之情形時，該R4b之鍵結基係任意之取代基，因此該取代基含有率為30質量%以下。較佳為1質量%以上且20質量%以下。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物中之聚乙二醇鏈段之質量含有率較佳為10質量%以上且80質量%以下，於聚乙二醇鏈段之質量含有率低於10質量%之情形時，由於該間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物不具備充分之水溶性，故而有無法確保水溶液中之奈米粒子形成性之虞。另一方面，於聚乙二醇鏈段之質量含有率多於80質量%之情形時，由於具備間苯二酚衍生物之聚麩胺酸鏈段之質量含有率相對變低，故而有無法確保水溶液中之奈米粒子形成性之顧慮。該聚乙二醇鏈段之質量含有率較佳為20質量%以上且70質量%以下。進而較佳為30質量%以上且65質量%以下。
作為本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之製造方法，可 列舉：藉由聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物、與間苯二酚衍生物之縮合反應而進行製造之方法；或使包含聚乙二醇鏈段之聚合物成分與間苯二酚衍生物結合聚麩胺酸衍生物進行結合之方法等。較佳為如下方法：預先製備聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物，藉由使該嵌段共聚物與間苯二酚衍生物進行縮合反應而製造。
聚乙二醇鏈段與聚麩胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物之製備方法、以及使該嵌段共聚物與間苯二酚衍生物進行縮合反應而製造之方法可依據上述喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物中之製備方法而製造。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物於投予至活體內後，藉由慢慢地裂解具有HSP90抑制活性之間苯二酚衍生物並使之游離而可發揮藥理效果。因此，本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物可用作惡性腫瘤疾病或原因在於細胞之異常增生之疾病之治療所使用的治療用醫藥品。
於使用本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物作為醫藥品之情形時，其投予量當然可根據患者之性別、年齡、生理狀態、病狀等而變更，但可以非經口之方式並以通常成人每天投予活性成分0.01~500mg/m2(體表面積)、較佳為0.1~250mg/m2之方式進行投予而使用。作為投予路徑，較佳為以非經口投予而使用。利用注射之投予係藉由靜脈內投予、動脈內投予、皮下投予、肌內投予、腫瘤部內投予等而進行。
本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物較佳為用作注射劑、片劑、散劑等通常所使用之醫藥製劑。製劑化時，可使用通常所使用之藥學上所容許之載體、例如結合劑、潤滑劑、崩解劑、溶劑、賦形劑、助溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、保存劑、鎮靜劑、色素、香料等。於注射液劑之情形時，通常使用溶劑。作為溶劑，例如可列 舉：水、生理鹽水、5%葡萄糖或甘露醇液、水溶性有機溶劑、例如甘油、乙醇、二甲基亞碸、N-甲基吡咯啶酮、聚乙二醇、發色基等、及該等之混合液、以及水與該水溶性有機溶劑之混合液等。較佳為使用該等製劑用添加劑，而用於製備可投予之醫藥製劑。
關於本發明之間苯二酚衍生物結合嵌段共聚物之作為抗腫瘤劑之用途，可用於惡性腫瘤疾病之治療。作為可治療之惡性腫瘤疾病，並無特別限定，可應用於對乳癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、直腸結腸癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、類癌瘤、頭部及頸部之癌、黑色素瘤、卵巢癌、膽管癌、間皮瘤、及多發性骨髓瘤等惡性腫瘤疾病之治療。尤其是適合可將間苯二酚衍生物用於治療之非小細胞肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌(無法手術或復發)、結腸‧直腸癌(無法手術或復發)、乳癌(無法手術或復發)、鱗狀細胞癌、惡性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)之治療。
本發明可列舉使用可用作抗腫瘤劑之紫杉烷衍生物作為生理活性物質之該嵌段共聚物作為較佳態樣。於以下對使用紫杉烷衍生物作為生理活性物質之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物進行說明。
紫杉烷衍生物係結合於細胞內之微小管而具有基於脫聚合抑制作用之細胞增生抑制活性之化合物，且可用作抗腫瘤劑。作為可用作抗腫瘤劑之紫杉烷衍生物，已知有太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇、卡巴他賽(Cabazitaxel)等。該等化合物由於在紫杉烷環骨架內或側鏈具有羥基，故而可藉由將該羥基設為鍵結基而應用於本發明之嵌段共聚物。即，係如下態樣：紫杉烷衍生物之羥基直接或經由適當之鍵結基而與天冬胺酸及/或麩胺酸之側鏈羧基酯鍵結。
本發明中，較佳為通式(1)中之R3為紫杉烷衍生物之鍵結殘基之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物。於以下進行說明。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物係如下紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物，其係通式(1)所示之聚乙二醇鏈段與聚(天冬胺酸及/或麩胺酸)衍生物鏈段連結而成之嵌段共聚物，且R3為紫杉烷衍生物之鍵結殘基。即，係通式(1)所示之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物，
[式中，R1表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，t表示20~270之整數，A表示可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，R2表示選自由氫原子、碳數(C1~C6)醯基及碳數(C1~C20)烷氧羰基所組成之群中之取代基，R3表示紫杉烷衍生物之鍵結殘基，R4表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基、疏水性螢光物質之鍵結殘基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基，B表示鍵結基，n表示1或2，x1、x2、y1、y2及z分別獨立地表示0~25之整數，(x1+x2)表示1~25之整數，(x1+x2+y1+y2+z)表示3~25之整數，鍵結有上述R3及R4之各構成單元以及支鏈羰基進行分子內環化之構成單元分別獨立為無規排列之結構]。
此處，通式R1、R2、R4、A、B、t、x1、x2、y1、y2、z係與上述含義相同。
於通式(1)之R3為紫杉烷衍生物之鍵結殘基之情形時，關於該紫杉烷衍生物，已知有太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇、卡巴他賽(Cabazitaxel)等。該等由於在紫杉烷環及側鏈具有羥基，故而可用作本發明之生理活性物質。
作為本發明之生理活性物質為紫杉烷衍生物之情形時之較佳態樣，可列舉如下紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物，其係聚乙二醇鏈段與聚天冬胺酸衍生物鏈段連結而成之嵌段共聚物，且於天冬胺酸單元之側鏈羧基鍵結有紫杉烷衍生物。即，較佳為使用聚天冬胺酸鏈段作為嵌段共聚物之聚胺基酸鏈段。再者，該聚天冬胺酸鏈段可為α型聚合聚天冬胺酸鏈段，亦可為β型聚合聚天冬胺酸鏈段，亦可為α-β混合型聚合聚天冬胺酸鏈段。總之，較佳為通式(1)中之n為1。
關於作為該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之更佳態樣，係通式(6)所示之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物，
[式中，R1c表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，tc表示20~270之整數，Ac表示可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基， x1c、x2c、y1c、y2c及zc分別為整數，(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)表示3~25之整數，(x1c+x2c)相對於該(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)之比例為1~100%及(y1c+y2c+zc)相對於該(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)之比例為0~99%，R2c表示選自由氫原子、可具有取代基之碳數(C1~C6)醯基及可具有取代基之碳數(C1~C6)烷氧羰基所組成之群中之1種，R3c表示紫杉烷衍生物之鍵結殘基，R4c可相同亦可不同，表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基，鍵結有上述R3c之天冬胺酸單元、鍵結有上述R4c之天冬胺酸單元及支鏈羰基進行分子內環化之結構單元分別獨立並以無規排列進行聚合]。
作為上述R1c中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷基等。例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、環戊基、正己基、環己基等。
作為上述可具有之取代基，可列舉：鹵素原子、硝基、氰基、羥基、巰基、碳環或雜環芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、取代或未經取代之胺基、醯基胺基、烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、醯基、羧基、烷氧羰基、胺甲醯基或矽烷基等。芳香環上之取代位置可為鄰位，亦可為間位，亦可為對位。
作為該R1c，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、苄基、2,2-二甲氧基乙基、2,2-二乙氧基乙基、2-甲醯基乙基。更佳為可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀 之碳數(C1~C4)烷基。尤其是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基等更佳。
作為上述Ac中之可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，可列舉：亞甲基、伸乙基、正伸丙基、正伸丁基等。作為可具有之取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為該Ac，尤其是伸乙基、正伸丙基更佳。
上述tc表示聚乙二醇鏈段中之伸乙基氧基之聚合數。該tc係20~270之整數。即，作為該聚乙二醇鏈段之分子量，係0.8kDa~12kDa。若作為聚乙二醇鏈段之聚合度之該tc小於20，則有所獲得之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物不具備充分之水溶性，又未發揮所需之體內動態之虞。另一方面，於該tc大於270之情形時，有所獲得之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之總分子量變大，而無法發揮所需之體內動態，從而使無法預期之組織損傷出現症狀之顧慮。該tc較佳為22~230之整數，更佳為30~180之整數。即，作為該聚乙二醇鏈段之分子量，較佳為1kDa~10kDa，更佳為1.3kDa~8kDa。
通式(6)之嵌段共聚物具有聚天冬胺酸衍生物鏈段，(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)表示該聚天冬胺酸衍生物之聚合數。該聚天冬胺酸衍生物之聚合數為3~25，即(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)係3~25之整數。若該(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)小於3，則有所獲得之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之下述之雷射光散射強度不符合最佳範圍之虞。另一方面，於該(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)大於25之情形時，有所獲得之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之總分子量變大，並且下述之雷射光散射強度不符合最佳範圍之虞。即，若該(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)偏離3~25之範圍，則有無法獲得抗腫瘤效果之增強作用及/或副作用之減少效果之顧慮。聚天冬胺酸衍生物之聚合數較佳為考慮所獲得之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之總分子量而適當設定。該(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)較佳 為5~20之整數。
作為該聚天冬胺酸衍生物之聚合數之(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)可藉由利用1H-NMR之測定、或者對鍵結下述之R3c及R4c前之聚乙二醇-聚天冬胺酸嵌段共聚物進行中和滴定而求出。
作為上述R2c中之可具有取代基之碳數(C1~C6)醯基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)醯基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R2c之該碳數(C1~C6)醯基，例如可列舉：甲醯基、乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、丙醯基、三甲基乙醯基、苄基羰基、苯乙基羰基等。更佳為可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C4)醯基，更佳為乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基。
作為上述R2c中之可具有取代基之碳數(C1~C6)烷氧羰基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C6)烷氧羰基。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R2c之該碳數(C1~C6)烷氧羰基，例如可列舉：甲氧基羰基、乙氧基羰基、第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基等。
上述R3c之紫杉烷衍生物之鍵結殘基中之紫杉烷衍生物較佳為選自由太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇及卡巴他賽(Cabazitaxel)所組成之群中之1種以上。上述紫杉烷衍生物係於紫杉烷環骨架內及側鏈分別具有羥基。該R3c之紫杉烷衍生物之鍵結方式並無特別限定，只要任一者之羥基與聚天冬胺酸之側鏈羧基酯鍵結即可。
R3c之紫杉烷衍生物於該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之同一分子中可為相同化合物，亦可複數種類之化合物混合存在。該R3c較佳為相同化合物。
通式(6)中，(x1c+x2c)表示結合有上述R3c之紫杉烷衍生物之天冬胺酸單元之總數。該結合有紫杉烷衍生物之胺基酸單元係必須之構成，該(x1c+x2c)係1以上之整數。該(x1c+x2c)較佳為2~20之整數，更佳為2~15之整數。
(x1c+x2c)相對於作為聚胺基酸衍生物之聚合數之上述(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)之比例為1~100%。(x1c+x2c)相對於上述(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)之比例較佳為5~80%，更佳為5~60%。
關於該(x1c+x2c)之紫杉烷衍生物之鍵結數，可藉由利用HPLC對使該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物水解從而游離之紫杉烷衍生物或源自其之鏈段分子進行定量而算出紫杉烷衍生物含量，並根據其數值而算出。又，亦可自製備該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物時之紫杉烷衍生物之反應率算出該紫杉烷衍生物之含量，並自其數值而算出。
R4c係選自由可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基。
該R4c可以控制本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之物性為目的而任意地導入。例如藉由導入疏水性基為該R4c，可提高該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之聚胺基酸鏈段之疏水性。另一方面，藉由導入具備胺基或羧基、羥基等可形成鹽之離子性官能基之親水性取代基作為該R4c，可提高該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之聚胺基酸鏈段之親水性。又，於該R4c為羥基之情形時，有上述聚天冬胺酸鏈段之側鏈羧基為游離羧酸之情形。
該R4c可為單一種類之取代基，亦可為複數種類之取代基。
作為上述R4c中之可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷氧基。 即，係於上述聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有酯型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4中之該碳數(C1~C8)烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、第三丁氧基、環己氧基、苄氧基等。
作為上述R4c中之可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基胺基。即，係於上述聚天冬胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有烷基醯胺型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4c中之該碳數(C1~C8)烷基胺基，例如可列舉：甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、異丙基胺基、丁基胺基、第三丁基胺基、環己基胺基、苄基胺基等。
又，該可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基亦包含羧基得到保護之胺基酸。作為該羧基得到保護之胺基酸，例如亦可使用甘胺酸甲酯、甘胺酸苄酯、β-丙胺酸甲酯、β-丙胺酸苄酯、丙胺酸甲酯、白胺酸甲酯、苯丙胺酸甲酯等。
作為上述R4c中之可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二(C1~C8)烷基胺基。即，係於上述聚天冬胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有二烷基醯胺型修飾基者。作為取代基，亦可具備羥基、鹵素原子、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、烷氧基、芳基等。作為上述R4中之該二(C1~C8)烷基胺基，例如可列舉：二甲基胺基、二乙基胺基、二丙基胺基、二異丙基胺基、二丁基胺基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基胺基、N-苄基-N-甲基胺基等。
上述R4c亦可為可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基。其係於上述聚天冬胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有脲型修 飾基者，即於側鏈羧基鍵結有-N(R4cx)CONH(R4cy)者[該R4cx及該R4cy可相同亦可不同，表示可經三級胺基取代之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基]。
作為該R4cx及R4cy中之可經三級胺基取代之直鏈狀、支鏈狀或環狀之碳數(C1~C8)烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、環己基、2-二甲基胺基乙基、3-二甲基胺基丙基等。
作為上述R4c中之可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基，例如為甲基胺基羰基甲基胺基、乙基胺基羰基乙基胺基、異丙基胺基羰基異丙基胺基、環己基胺基羰基環己基胺基、乙基胺基羰基(3-二甲基胺基丙基)胺基、(3-二甲基胺基丙基)胺基羰基乙基胺基等。
通式(6)中之R4c亦可為羥基。即，胺基酸之側鏈羧酸為游離羧酸。於該情形時，側鏈羧酸可為游離酸之態樣，又，亦可為作為醫藥品所容許之任意之羧酸鹽之形態。作為上述羧酸鹽，可列舉：鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽等，且包含於本發明中。
通式(6)中之R4c較佳為碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及/或羥基。即，該R4較佳為碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基及羥基混合存在之態樣；或者該R4c較佳為僅羥基之態樣。
通式(6)中，(y1c+y2c)表示鍵結有上述R4c之天冬胺酸單元之總數。該鍵結有R4c之天冬胺酸單元係任意之構成，該(y1c+y2c)係0~24之整數。該(y1c+y2c)較佳為5~24之整數，更佳為10~24。
(y1c+y2c)相對於作為聚天冬胺酸衍生物之聚合數之上述(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)之比例為0~99%。(y1c+y2c)相對於上述(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)之比例較佳為10~95%，更佳為30~95%。
又，zc係支鏈羰基進行分子內環化之天冬胺酸構成單元之總數， 且係任意之構成。該z係自聚天冬胺酸衍生物之聚合數去除了鍵結有上述R3c及R4c之天冬胺酸構成單元的剩餘部分。
因此，鍵結有具備紫杉烷衍生物之鍵結殘基之R4c之天冬胺酸單元以外之天冬胺酸構成單元之總數，即(y1c+y2c+zc)相對於聚天冬胺酸衍生物鏈段之總聚合數之比例為0~99%。較佳為20~95%，更佳為40~95%。
於通式(6)所示之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物中，上述聚天冬胺酸衍生物鏈段係於側鏈羧基具備上述R3c之天冬胺酸衍生物單元、具備上述R4c之天冬胺酸衍生物單元、以及支鏈羰基進行分子內環化之天冬胺酸單元混合存在之聚合物鏈段。該具備R3c之天冬胺酸衍生物單元、該具備R4c之天冬胺酸衍生物單元、以及支鏈羰基進行分子內環化之天冬胺酸單元可極化存在，亦可為上述單元不規則存在之無規聚合型。較佳為具備上述R3c之胺基酸衍生物單元、具備上述R4c之胺基酸衍生物單元、以及支鏈羰基進行分子內環化之天冬胺酸單元不規則存在之無規聚合型聚天冬胺酸衍生物鏈段。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物係分子量為2kDa以上且15kDa以下。於分子量小於2kDa之情形時，有未發揮基於高分子化之藥物動態特性，而無法獲得抗腫瘤效果之增強作用等所需之藥理作用之虞。另一方面，於分子量超過15kDa之情形時，有抗腫瘤效果與副作用之背離變困難而強烈表現出副作用之顧慮。尤其是紫杉烷衍生物有強烈表現出骨髄抑制之血液毒性之延遲化之特徵。於分子量超過15kDa之情形時，強烈表現出血液毒性之延遲化。因此，本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之分子量之控制非常重要。本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之分子量較佳為3kDa以上且15kDa以下，進而較佳為3kDa以上且12kDa以下。
本發明中之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之分子量係採用對其 構成部分之各構成分子量進行累加而獲得之計算值作為該「紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之分子量」。即，將對(1)聚乙二醇鏈段之分子量、(2)聚天冬胺酸主鏈之分子量、(3)紫杉烷衍生物之鍵結殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之紫杉烷衍生物之總分子量、以及(4)紫杉烷衍生物以外之鍵結基殘基分子量乘以其鍵結數而獲得之該鍵結基之總分子量進行累加而獲得之計算值設為上述「紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之分子量」。
該「紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之分子量」可為kDa單元之精度之分子量界定。因此，上述各構成部分之分析方法只要為於該聚胺基酸衍生物之kDa單位之分子量測定中精度充分之分析方法，則無特別限定，可適當選擇各種分析方法。於以下列舉各構成部分之較佳之分析方法。
各構成部分之各構成分子量之算出方法可基於依據上述之記載之方法而算出。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物係於水溶液中表現出自我聚集性之物性。即，係如下物性：若對該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液進行利用雷射光散射法之粒度分佈測定，則計測為以體積平均粒徑計約數奈米~約20奈米之奈米粒子。本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物較佳為如下物性，即該衍生物於1mg/mL水溶液中為體積平均粒徑最大亦未達20奈米之奈米粒子。於該情形時，係於利用純水之水溶液中進行粒度分佈測定。較佳為如下物性，該物性之特徵在於：藉由利用使用雷射光之動態光散射法之粒度分佈測定法，以計測出體積平均粒徑未達20奈米，且更佳為計測為3~15奈米之奈米粒子。
本發明中之所謂體積平均粒徑，係利用Particle Sizing System公司製造之ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(解析方法：NICOMP法)或者Malvern公司製造之粒徑-ζ電位測定裝置Zetasizer Nano ZS(解析方法：NNLS法)進行測定而獲得之體積分佈中存在之比例最多的峰值粒徑。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物係親水性之聚乙二醇鏈段、與利用酯鍵結而具備疏水性之紫杉烷衍生物之聚天冬胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物，因此可認為於水溶液中複數個該嵌段共聚物彼此之聚天冬胺酸鏈段基於疏水性相互作用而進行聚集。結果形成以聚天冬胺酸鏈段為內核(核心部)，且親水性之聚乙二醇鏈段覆蓋上述內核周圍而形成外殼層(外殼部)之核心-外殼結構之微胞狀聚集體，推測其為以上述之奈米粒子之形式所觀測到者。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物係於水溶液中形成奈米粒子之物性，該情況對紫杉烷衍生物之藥效增強及/或副作用之減少而言為必需。
有效的是使用利用雷射光之光散射強度作為本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之奈米粒子形成性之指標。即，可確認該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性係以雷射光散射強度為指標。由此，有效的是以甲苯為光散射強度標準試樣，以相對於甲苯之相對強度為指標，對該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物於水溶液中之奈米粒子形成性進行確認之方法。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之雷射光散射強度以相對於甲苯之光散射強度的相對強度計為至少2倍以上。於上述光散射相對強度小於2倍之情形時，該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物表現出不具有充分之奈米粒子形成性之情況，而有未獲得向靶組織之充分浸透性，而導致副作用表現之虞。於本發明中，光散射相對強度之數值係具有奈米粒子形成能力之指標，只要相對於甲苯為2倍以上之光散射強度即可，其上限並無限制。即，即便於上述光散射相對強度大於100倍之情形時，亦判明該高分子衍生物具有充分 之奈米粒子形成能力。
本發明之紫杉烷類結合嵌段共聚物之水溶液中之光散射強度較佳為以相對於甲苯之光散射強度的相對強度計為2倍以上且70倍以下，更佳為2倍以上且50倍以下。
再者，關於該水溶液，係將由不包含微粒子之純水製備之水溶液設為分析試樣而獲得分析值。該水溶液亦可於溶液製備中任意地藉由超音波照射而進行溶解。所製備之水溶液較佳為為了進而去除次微米級之微粒子而實施了過濾處理之水溶液。
作為本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之奈米粒子形成性分析之使用雷射光之光散射強度的測定方法適當為如下方法：以該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之1mg/mL水溶液為測定試樣，於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm下利用雷射光散射光度計進行測定。作為測定機器，例如可列舉：大塚電子公司製造之動態光散射光度計DLS-8000DL(測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm、ND過濾器2.5%、PH1：OPEN、PH2：SLIT)。
再者，用作光散射強度測定之標準物質之甲苯只要為試劑級之純度，則可無特別限定地使用。較佳為使用進行過於光散射分析之試樣製備中通常進行之預處理過濾之甲苯。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物較佳為通式(1)中之R3c所示之紫杉烷衍生物之質量含有率為10質量%以上且60質量%以下。於該紫杉烷衍生物含量低於10質量%之情形時，由於疏水性紫杉烷衍生物較少，故而基於疏水性相互作用之奈米粒子形成性降低。另一方面，於紫杉烷衍生物之含量多於60質量%之情形時，有該紫杉烷類結合嵌段共聚物之水溶性明顯降低之顧慮。該紫杉烷衍生物之質量含有率較佳為10質量%以上且50質量%以下。進而較佳為10質量%以上且40質量%以下。
關於本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物，於通式(6)中，R4c為可具有取代基之碳數(C1~C8)烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基、可具有取代基之二(C1~C8)烷基胺基或可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基之情形時，該R4c之鍵結基係任意之取代基，因此該取代基含有率為30質量%以下。較佳為1質量%以上且20質量%以下。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物中之聚乙二醇鏈段之質量含有率較佳為10質量%以上且80質量%以下，於聚乙二醇鏈段之質量含有率低於10質量%之情形時，有由於該紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物不具備充分之水溶性，故而無法確保水溶液中之奈米粒子形成性之虞。另一方面，於聚乙二醇鏈段之質量含有率多於80質量%之情形時，有由於具備紫杉烷衍生物之聚天冬胺酸鏈段之質量含有率相對變低，故而無法確保水溶液中之奈米粒子形成性之顧慮。該聚乙二醇鏈段之質量含有率較佳為20質量%以上且70質量%以下。進而較佳為30質量%以上且65質量%以下。
作為本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之製造方法，可列舉：藉由聚乙二醇鏈段與聚天冬胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物、與紫杉烷衍生物之縮合反應而製造之方法；或者使包含聚乙二醇鏈段之聚合物成分與紫杉烷衍生物結合聚天冬胺酸衍生物進行結合之方法等。較佳為預先製備聚乙二醇鏈段與聚天冬胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物，藉由使所獲得之嵌段共聚物與紫杉烷衍生物進行縮合反應而製造之方法。
聚乙二醇鏈段與聚天冬胺酸鏈段連結而成之嵌段共聚物之製備方法、以及藉由使該嵌段共聚物與紫杉烷衍生物進行縮合反應而製造之方法可依據上述喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物中之製備方法而進行製造。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物於投予至活體內後，藉由慢慢地裂解紫杉烷衍生物並使之游離而可發揮藥理效果。因此，本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物可用作惡性腫瘤疾病之治療所使用之抗腫瘤劑。
於使用本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物作為抗腫瘤劑之情形時，其投予量當然可根據患者之性別、年齡、生理狀態、病狀等而變更，但可以非經口之方式並以通常成人每天投予活性成分0.01~500mg/m2(體表面積)、較佳為0.1~250mg/m2之方式進行投予而使用。作為投予路徑，較佳為以非經口投予而使用。利用注射之投予係藉由靜脈內投予、動脈內投予、皮下投予、肌內投予、腫瘤部內投予等而進行。
本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物較佳為用作注射劑、片劑、散劑等通常所使用之醫藥製劑。製劑化時，可使用通常所使用之藥學上所容許之載體、例如結合劑、潤滑劑、崩解劑、溶劑、賦形劑、助溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、保存劑、鎮靜劑、色素、香料等。於注射液劑之情形時，通常使用溶劑。作為溶劑，例如可列舉：水、生理鹽水、5%葡萄糖或甘露醇液、水溶性有機溶劑、例如甘油、乙醇、二甲基亞碸、N-甲基吡咯啶酮、聚乙二醇、發色基等、及該等之混合液、以及水與該水溶性有機溶劑之混合液等。較佳為使用該等製劑用添加劑，而用於製備可投予之醫藥製劑。
關於本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之作為抗腫瘤劑之用途，可用於惡性腫瘤疾病之治療。作為可治療之惡性腫瘤疾病，並無特別限定，可應用於對乳癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、直腸結腸癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、類癌瘤、頭部及頸部之癌、黑色素瘤、卵巢癌、膽管癌、間皮瘤、及多發性骨髓瘤等惡性腫 瘤疾病之治療。尤其是適合可將紫杉烷衍生物用於治療之非小細胞肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌(無法手術或復發)、結腸‧直腸癌(無法手術或復發)、乳癌(無法手術或復發)、鱗狀細胞癌、惡性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)之治療。
[實施例]
以下，藉由實施例對本發明進一步進行說明。但本發明並不限定於該等實施例。
實施例及比較例之生理活性物質結合嵌段共聚物之散射強度測定係利用大塚電子公司製造之動態光散射光度計DLS-8000DL(測定溫度25℃、散射角度：90°、波長：632.8nm、ND過濾器：5%、PH1：OPEN、PH2：SLIT)而進行。散射強度測定之測定樣品係使用如下溶液，該溶液係以生理活性物質結合嵌段共聚物濃度計成為1mg/mL之方式添加超純水，於冰浴冷卻下照射超音波10分鐘使之溶解後，利用0.2μm薄膜過濾器進行過濾而獲得。
光散射強度之測定所使用之甲苯(純正化學公司製造，特級)係利用0.2μm薄膜過濾器過濾3次後而使用。
又，實施例及比較例之生理活性物質結合嵌段共聚物之體積平均粒徑之測定係利用Particle Sizing System公司製造之ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(機器A：Temperture：25℃)或Malvern公司製造之粒徑‧ζ電位測定裝置Zetasizer Nano ZS(機器B：測定溫度：25℃，分析模式：通用(normal resolution)、Material RI：1.59)而進行。體積平均粒徑測定樣品係使用如下溶液，該溶液係以生理活性物質結合嵌段共聚物濃度計成為1mg/mL或5mg/mL之方式添加超純水，於冰浴冷卻下照射超音波10分鐘使之溶解後，利用0.2μm薄膜過濾器進行過濾而獲得。
[合成例1]聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2kDa、聚 麩胺酸聚合數8；共聚物1)之合成。
使一末端為甲氧基、另一末端為3-胺基丙基之聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-20H，日油公司製造，平均分子量2kDa、7.00g)溶解於DMSO(140mL)中後，添加γ-苄基-L-麩胺酸酯-N-羧酸酐(7.35g)，於30℃下攪拌24小時。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(2,520mL)及乙醇(280mL)混合液中，於室溫下攪拌一晚。其後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥而獲得聚合物(12.77g)。
使所獲得之聚合物溶解於DMF(168mL)中，添加乙酸酐(2.6mL)，於20℃下攪拌21小時。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(1,350mL)及乙酸乙酯(150mL)混合液中，於室溫下攪拌一晚。其後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得乙醯化聚合物(11.66g)。
使所獲得之乙醯化聚合物溶解於DMF(291mL)中，添加5%鈀-碳(1.17g)。其後，對反應氛圍進行氫氣置換，於室溫、1氣壓下進行24小時氫解。將5%鈀-碳觸媒進行過濾分離後，歷時1小時將濾液滴加於庚烷(1,654mL)及乙酸乙酯(827mL)混合液中，於室溫下攪拌一晚。其後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥。使該析出物再次溶解於水中，進行冷凍乾燥，藉此獲得聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(共聚物1 9.66g)。
關於共聚物1，藉由使用0.1N氫氧化鉀之滴定法，而算出麩胺酸之聚合數為7.59。
[合成例2]聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2kDa、聚麩胺酸聚合數10；共聚物2)之合成。
使一末端為甲氧基、另一末端為3-胺基丙基之聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-20H，日油公司製造，平均分子量2kDa，5.00g)溶解於DMSO(100mL)中後，添加γ-苄基-L-麩胺酸酯-N-羧酸酐(7.50 g)，於30℃下攪拌17小時。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(1,800mL)及乙醇(200mL)混合液中，於室溫下攪拌一晚後濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得聚合物(10.64g)。
使所獲得之聚合物溶解於DMF(176mL)中，添加乙酸酐(2.1mL)，於20℃下攪拌23小時。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(1,584mL)及乙酸乙酯(176mL)混合液中，於室溫下攪拌一晚後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得乙醯化聚合物(9.91g)。
使所獲得之乙醯化聚合物溶解於DMF(198mL)中，添加5%鈀-碳(0.99g)後進行氫氣置換，於室溫、1氣壓下進行85小時氫解。將5%鈀-碳觸媒過濾分離後，歷時1小時將濾液滴加於庚烷(1,125mL)及乙酸乙酯(563mL)混合液中，於室溫下攪拌一晚後，濾取析出物。使該析出物溶解於5%鹽水(570mL)中，利用2N氫氧化鈉水溶液將溶解液之pH值調整至約10後，使用分配吸附樹脂管柱層析法進行精製，繼而使用離子交換樹脂管柱層析法進行精製。將所溶出之溶液進行減壓濃縮後，進行冷凍乾燥，藉此獲得聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(共聚物2 5.66g)。
關於共聚物2，基於使用0.1N氫氧化鉀而獲得之滴定值，麩胺酸之聚合數為10.01。
[合成例3]聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量5kDa、聚麩胺酸聚合數10；共聚物3)之合成。
使用一末端為甲氧基、另一末端為3-胺基丙基之聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-50H，日油公司製造，平均分子量5kDa，10.00g)與γ-苄基-L-麩胺酸酯-N-羧酸酐(6.02g)，依據合成例2所記載之方法，而獲得標題之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(共聚物3)。
關於共聚物3，基於使用0.1N氫氧化鉀而獲得之滴定值，麩胺酸之聚合數為10.02。
[合成例4]聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量12kDa、聚麩胺酸聚合數25；共聚物4)之合成。
依據專利文獻1(國際公開WO2004/039869號)之參考例1所記載之方法，而獲得標題之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(共聚物4)。
關於共聚物4，基於使用0.1N氫氧化鉀而獲得之滴定值，麩胺酸之聚合數為24.54。
[合成例5]聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量3kDa、聚麩胺酸聚合數7；共聚物5)之合成。
使用一末端2-(第三丁氧基羰基胺基)乙基、另一末端2-胺基乙基之聚乙二醇(H2N-PEG-NH-Boc，RAPP POLYMERE公司製造，平均分子量3kDa，5.00g)與γ-苄基-L-麩胺酸酯-N-羧酸酐(6.02g)，依據合成例1所記載之方法，而獲得標題之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(共聚物5)。
關於共聚物5，基於使用0.1N氫氧化鉀而獲得之滴定值，麩胺酸之聚合數為6.55。
[合成例6]聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量12kDa，聚麩胺酸聚合數7；共聚物6)之合成。
依據專利文獻1(國際公開WO2004/039869號)之參考例2所記載之方法，而獲得標題之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(共聚物6)。
關於共聚物6，基於使用0.1N氫氧化鉀而獲得之滴定值，麩胺酸之聚合數為7.50。
[實施例A-1]聚乙二醇(2kDa)-聚麩胺酸(7.6聚合物)嵌段共聚物之7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC)結合體之合成。
使合成例1中所獲得之共聚物1(221mg)及7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC SCINOPHARM公司製造，120mg)溶解於DMF(17mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 10mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 174 μL)，於25℃下攪拌24小時。其後，追加DIPCI(174μL)，進而攪拌3小時。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(230mL)及乙酸乙酯(26mL)混合液中，於室溫下攪拌一晚後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得產物(250mg)。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(98/2(v/v)，7mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌7小時。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物(實施例A-1)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例A-1進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之EHC進行定量而求出EHC含量。其結果為，實施例A-1中之EHC含量為29.0%(w/w)。
使實施例A-1於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與EHC之鍵結殘基之比為0.46。
自該等值算出實施例A-1之總分子量為4,519。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為44.3%。
又，實施例A-1之1mg/mL水溶液之光散射強度為17,070cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為5,535cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為3.1倍。體積平均粒徑為6nm(機器A，1mg/mL)。
[實施例A-2]聚乙二醇(2kDa)-聚麩胺酸(10.0聚合物)嵌段共聚物之7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC)結合體之合成。
使用合成例2中所獲得之共聚物2(324mg)及7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC SCINOPHARM公司製造，210mg)，依據實施例A-1所記載之方法而獲得標題之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物(實施例A-2)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例A-2進行水解處理，利用高效 液相層析法(HPLC)對所游離之EHC進行定量而求出EHC含量。其結果為，實施例A-2中之EHC含量為33.1%(w/w)。
使實施例A-2於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與EHC之鍵結殘基之比為0.47。
自該等值算出實施例A-2之總分子量為5,255。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為38.1%。
又，實施例A-2之1mg/mL水溶液之光散射強度為27,149cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為5,535cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為4.9倍。體積平均粒徑係10nm(機器A，1mg/mL)。
[實施例A-3]聚乙二醇(5kDa)-聚麩胺酸(10.0聚合物)嵌段共聚物之7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC)結合體之合成。
使用合成例3中所獲得之共聚物3(3.00g)及7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC SCINOPHARM公司製造，1.02g)，依據實施例A-1所記載之方法而獲得標題之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物(實施例A-3)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例A-3進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之EHC進行定量而求出EHC含量。其結果為，實施例A-3中之EHC含量為21.0%(w/w)。
使實施例A-3於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與EHC之鍵結殘基之比為0.44。
自該等值算出實施例A-3之總分子量為8,225。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為60.8%。
又，實施例A-3之1mg/mL水溶液之光散射強度為16,750cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為5,535cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為3.0倍。體積平均粒徑為8nm(機器A，1mg/mL)。
[實施例A-4]聚乙二醇(2kDa)-聚麩胺酸(7.6聚合物)嵌段共聚物之7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC)及2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合體之合成。
使合成例1中所獲得之共聚物1(981mg)及2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮(藤本分子化學公司製造，42.2mg)溶解於DMF(50mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 45mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 35μL)，於25℃下攪拌3小時，追加DIPCI(35μL)後，進而攪拌1小時。其後，添加7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC SCINOPHARM公司製造，532mg)及DIPCI(771μL)，攪拌24小時。添加DIPCI(771μL)，進而攪拌4小時後，歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(675mL)及乙酸乙酯(75mL)混合液中，於室溫下攪拌一晚後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得產物。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(98/2(v/v)，30mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌7小時。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物(實施例A-4)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例A-4進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之EHC進行定量而求出EHC含量。其結果為，實施例A-4中之EHC含量為24.2%(w/w)。
關於實施例A-4之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之消 耗率為1分子。因此，算出實施例A-4之總2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮分子量為377。
自該等值算出實施例A-4之總分子量為4,617。
由此，實施例A-4中之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之含量為8.2質量%，聚乙二醇鏈段之含量為43.3質量%。
實施例A-4係作為實施例A-1之螢光標記物而用於下述之分佈試驗。
[比較例A-1]聚乙二醇(12kDa)-聚麩胺酸(25聚合物)嵌段共聚物之7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC)結合體之合成。
依據專利文獻1(國際公開WO2004/039869號)之實施例1所記載之方法，使用合成例4中所獲得之共聚物4而獲得標題之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物(比較例A-1)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對比較例A-1進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之EHC進行定量而求出EHC含量。其結果為，比較例A-1中之EHC含量為22.5%(w/w)。
使比較例A-1於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與EHC之鍵結殘基之比為0.26。
自該等值算出比較例A-1之總分子量為19,245。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為62.4%。
又，比較例A-1之1mg/mL水溶液之光散射強度為41,321cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為5,535cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為7.5倍。體積平均粒徑為20nm(機器A，1mg/mL)。
[比較例A-2]聚乙二醇(3kDa)-聚麩胺酸(6.6聚合物)嵌段共聚物之7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC)結合體之合成。
使用合成例5中所獲得之共聚物5(250mg)及7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC SCINOPHARM公司製造，91mg)，依據實施例A-1所記載之方法而獲得標題之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物(比較例A-2)。
利用高效液相層析法(HPLC)對藉由使用1N-氫氧化鈉水溶液對比較例A-2進行水解處理而游離之EHC進行定量而求出EHC含量。其結果為，比較例2中之EHC含量為20.1%(w/w)。
使比較例A-2於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與EHC之鍵結殘基之比為0.37。
自該等值算出比較例A-2之總分子量為5,031。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為59.6%。
又，比較例A-2之1mg/mL水溶液之光散射強度為9,964cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為5,535cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為1.80倍。比較例A-2之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物係非聚集性。
[比較例A-3]聚乙二醇(12kDa)-聚麩胺酸(7.5聚合物)嵌段共聚物之7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC)結合體之合成。
依據專利文獻1所記載之方法，使用合成例6中所獲得之共聚物6而獲得標題之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物(比較例A-3)。
利用高效液相層析法(HPLC)對藉由使用1N-氫氧化鈉水溶液對比較例A-3進行水解處理而游離之EHC進行定量而求出EHC含量。其結果為，比較例A-3中之EHC含量為7.8%(w/w)。
使比較例A-3於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與EHC之鍵結殘基之比為0.28。
自該等值算出比較例A-3之總分子量為14,094。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為85.1%。
又，比較例A-3之1mg/mL水溶液之光散射強度為5,625cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為5,535cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為1.0倍。比較例A-3之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物係非聚集性。
[比較例A-4]聚乙二醇(12kDa)-聚麩胺酸(25聚合物)嵌段共聚物之7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC)及2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合體之合成。
使合成例4中所獲得之共聚物4(6g)及2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮(藤本分子化學公司製造，162.3mg)溶解於DMF(160mL)中，添加4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽n-水合物(DMT-MM，145mg)，於25℃下攪拌29小時，歷時20分鐘將反應液滴加於二異丙醚(1460mL)及乙醇(360mL)混合液中，於室溫下攪拌40分鐘後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得產物。使所獲得之產物及7-乙基-10-羥基喜樹鹼(EHC SCINOPHARM公司製造，1778mg)溶解於DMF(250mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 151mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 2583μL)，於25℃下攪拌22小時。其後，追加DIPCI(646μL)，進而攪拌2小時。歷時30分鐘將反應液滴加於二異丙醚(3000mL)及乙醇(1000mL)混合液中，於室溫下攪拌1小時後，濾取析出物，於減壓下進行 乾燥，藉此獲得產物(7.3g)。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(98/2(v/v)，7mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌3小時。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物(比較例A-4)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對比較例A-4進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之EHC進行定量而求出EHC含量。其結果為，比較例A-4中之EHC含量為19.1%(w/w)。
關於比較例A-4之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之消耗率為1分子。因此，算出比較例A-4之總2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮分子量為377。
自該等值算出比較例A-4之總分子量為19,007。
由此，比較例A-4中之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之含量為1.9質量%，聚乙二醇鏈段之含量為63.1質量%。
比較例A-4係作為比較例A-1之螢光標記物而用於下述之分佈試驗。
[試驗例A-1]腫瘤內分佈試驗
將BALB/c裸小鼠之以皮下移植繼代之人類胰腺癌BxPC3之腫瘤塊製成約3mm見方之塊體，使用套管針移植至裸小鼠之背側部皮下。使實施例A-4及比較例A-4分別於5%葡萄糖注射液中溶解，並以7-乙基-10-羥基喜樹鹼換算量50mg/kg分別單次投予至靜脈內。投予30分鐘後將小鼠於異氟醚麻醉下進行除血，而製作取出之腫瘤之冷凍包埋切片，觀察螢光。將結果示於圖1。
試驗例A-1之結果為，關於實施例A-4，係於腫瘤切片之廣泛區 域內觀察到螢光之訊號。根據上述情況，表示實施例A-4之嵌段共聚物可滲透至腫瘤組織之深部。相對於此，關於比較例A-4，有嵌段共聚物僅偏集存在於腫瘤之外緣部之傾向，而表示作為嵌段共聚物無法滲透至腫瘤組織之深部。因此，暗示如下情況，即實施例A-4滲透至腫瘤組織全部區域，而可使作為結合藥劑之喜樹鹼衍生物作用於腫瘤組織整體。
[試驗例A-2]腎臟內分佈試驗
使實施例A-4及比較例A-4分別於5%葡萄糖注射液中溶解，並將7-乙基-10-羥基喜樹鹼換算量50mg/kg單次投予至C.B-17SCID小鼠靜脈內。投予30分鐘後，將小鼠於異氟醚麻醉下進行除血，而製作取出之腎臟之冷凍包埋切片，觀察螢光。將結果示於圖2。
試驗例A-2之結果為，關於實施例A-4，係於腎臟之血管內及腎小管觀察到螢光。因此，表示實施例A-4之嵌段共聚物雖為高分子體，但係腎排泄之物性。另一方面，關於比較例A-4，於腎臟之血管內以外未見螢光，而表示未遭受腎排泄。
[試驗例A-3]對非患癌小鼠之肝細胞毒性試驗 [藥劑投予]
使實施例A-1及實施例A-2、以及比較例A-2及比較例A-3溶解於5%葡萄糖注射液中，基於投予當日之測定體重，將各化合物之最大耐用量附近之7-乙基-10-羥基喜樹鹼換算50mg/kg或100mg/kg之用量單次投予至雄6週齡之Crl：CD1(ICR)(ICR(IGS))小鼠之尾靜脈內。作為對照群，將5%葡萄糖注射液進行尾靜脈內單次投予。
[血液化學檢查]
於各化合物投予3天後，使用安裝有27G注射針之1mL一次性注射筒於異氟醚麻醉下自腹部主動脈採血。預先向注射筒添加肝素鈉溶液約10μL，將其與所採取之血液充分混合。將進行離心分離(4℃， 1600×g，10分鐘)而獲得之血漿設為測定試樣，使用7180形生化自動分析裝置(日立高新技術股份有限公司)而進行血液化學檢查。將血漿中ALT(alanine aminotransferase)之測定結果示於表1。
於血液化學檢查中，關於比較例A-2，發現ALT之明顯增加，而可見肝細胞毒性之表現。關於比較例A-3，儘管投予量較低，但ALT增加，而明確肝細胞毒性之表現。相對於此，關於實施例A-1及A-2之化合物，未確認到ALT之大幅增加，而表示肝細胞毒性輕微。
比較例A-2及比較例A-3之化合物均為非聚集性，係水溶液中之光散射強度為甲苯之光散射強度之2倍以下的化合物。根據以上之結果，表示喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之水溶液中之光散射強度所示之分析值係與肝細胞毒性表現相關。因此，以甲苯為雷射光散射強度測定之標準物質，且將該水溶液之光散射強度設為甲苯相對強度，藉此可製備肝細胞毒性表現較低之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物。
[試驗例A-4]對非患癌大鼠之血液毒性試驗 [藥劑投予]
使實施例A-1及實施例A-3、以及比較例A-1及比較例A-2之化合物溶解於5%葡萄糖注射液中，基於投予當日之測定體重，將7-乙基-10-羥基喜樹鹼換算40mg/kg之用量單次投予至雄7週齡之Sprague- Dawley大鼠(Crl：CD；IGS、Charles River Laboratories Japan股份有限公司)之尾靜脈內。作為對照群，將5%葡萄糖注射液進行尾靜脈內單次投予。
[血液學檢查]
各化合物投予3、5、7、11、14天後，使用安裝有26G注射針之1mL一次性注射筒於無麻醉下自鎖骨下靜脈採血。預先向注射筒添加EDTA-2K溶液約3μL，將其與所採取之血液充分混合而製成分析試樣。使用血球分析裝置XT-2000iV(Sysmex股份有限公司)對血液試樣進行血球分析。將投予7天後之網狀紅血球計數示於表2。
血液學檢查之結果為，關於比較例A-1，於投予7天後，網狀紅血球計數降低，而可見血液毒性之延遲化。相對於此，關於本發明之實施例A-1及A-3之化合物，於投予後7天之時點，網狀紅血球計數未減少，而未見血液毒性之延遲化。因此，認為實施例A-1及A-3之化合物未使血液毒性延遲化。
比較例A-1係分子量為19kDa之化合物。另一方面，實施例A-1、A-3及比較例A-2之分子量較小。根據以上之結果，認為喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物之血液毒性之延遲化係與分子量相關。因此，藉由設為分子量為15kDa以下之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物，可製備 避免血液毒性之延遲化之抗腫瘤劑。
[試驗例A-5]對人類胃癌移植裸小鼠之抗腫瘤效果試驗
將於裸小鼠皮下繼代之人類胃癌SC-4-JCK之腫瘤塊製成約3mm見方之塊體，使用套管針移植至裸小鼠之背側部皮下。於腫瘤移植後平均腫瘤體積成為約150mm3以上之時點，使實施例A-1、實施例A-2及實施例A-3、以及比較例A-1及比較例A-2溶解於5%葡萄糖注射液中，將7-乙基-10-羥基喜樹鹼換算12mg/kg單次投予至靜脈內。
自投予日及投予後第14天之腫瘤體積求出相對腫瘤體積，而設為抗腫瘤效果之指標。再者，腫瘤體積係計測腫瘤之長徑(L：mm)及短徑(W：mm)，並以(L×W2)/2之計算式而算出。將結果示於表3。
實施例A-1~A-3以及比較例A-1及A-2與藥劑非投予群相比，腫瘤體積較小而表現出腫瘤增生抑制作用。其中，實施例A-3與比較例相比，表現出更強之抗腫瘤效果。
關於喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物，已知有原因在於高分子載體之特異性藥物動態、及可藉由喜樹鹼衍生物之緩釋而增強抗腫瘤效果。然而，喜樹鹼衍生物不僅對腫瘤組織發揮藥理作用，亦對正常組織發揮藥理作用，因此副作用之表現不可避免。
然而，根據試驗例A-1~A-4之結果可明確，本發明之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物一方面發揮與先前之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物同等以上之抗腫瘤效果，另一方面不使血液毒性延遲化，進而亦抑制肝細胞毒性之表現。因此，明確藉由設為分子量及水溶液之光散射強度得到控制之喜樹鹼衍生物結合嵌段共聚物，可提供可將腫瘤增生抑制作用與正常組織損傷作用背離，而達成了效果增強與副作用減少之抗腫瘤劑。
[合成例7]聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2kDa、聚麩胺酸聚合數8；共聚物7)之合成。
使用一末端為甲氧基、另一末端為3-胺基丙基之聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-50H，日油公司製造，平均分子量5kDa，14.00g)與γ-苄基-L-麩胺酸酯-N-羧酸酐(16.80g)，依據合成例2所記載之方法而獲得標題之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(共聚物7)。
關於共聚物7，基於使用0.1N氫氧化鉀而獲得之滴定值，麩胺酸之聚合數為7.90。
[合成例8]聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2kDa、聚麩胺酸聚合數6；共聚物8)之合成。
使用一末端為甲氧基、另一末端為3-胺基丙基之聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-50H，日油公司製造，平均分子量2kDa，14.00g)與γ-苄基-L-麩胺酸酯-N-羧酸酐(12.60g)，依據合成例2所記載之方法而獲得標題之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(共聚物8)。
關於共聚物8，基於使用0.1N氫氧化鉀而獲得之滴定值，麩胺酸之聚合數為6.46。
[合成例9]聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2kDa、聚麩胺酸聚合數14；共聚物9)之合成。
使用一末端為甲氧基、另一末端為3-胺基丙基之聚乙二醇 (SUNBRIGHT MEPA-50H，日油公司製造，平均分子量2kDa，10.15g)與γ-苄基-L-麩胺酸酯-N-羧酸酐(18.28g)，依據合成例2所記載之方法而獲得標題之聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物(共聚物9)。
關於共聚物9，基於使用0.1N氫氧化鉀而獲得之滴定值，麩胺酸之聚合數為13.69。
[實施例B-1]聚乙二醇(2kDa)-聚麩胺酸(7.9聚合物)嵌段共聚物之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)結合體之合成。
使合成例7中所獲得之共聚物7(1300mg)及4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(Shanghai Haoyuan Chemexpress公司製造，550mg)溶解於DMF(46mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 64mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 1050μL)，於25℃下攪拌24小時。其後，追加DIPCI(525μL)，進而攪拌2小時。歷時15分鐘將反應液滴加於二異丙醚(250mL)及乙酸乙酯(500mL)混合液中，於室溫下攪拌45分鐘後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得產物(1558mg)。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(1/1(v/v)，100mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌3小時。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)結合嵌段共聚物(實施例B-1)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例B-1進行水解處理，利用高效 液相層析法(HPLC)對所游離之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)進行定量而求出其含量。其結果為，實施例B-1中之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)含量係21.8%(w/w)。
使實施例B-1於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)之鍵結殘基之比為0.27。
自該等值算出實施例B-1之總分子量為3,963。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為50.5%。
又，實施例B-1之1mg/mL水溶液之光散射強度為83,228cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為7,195cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為11.6倍。體積平均粒徑為11nm(機器A，5mg/mL)。
[實施例B-2]聚乙二醇(2kDa)-聚麩胺酸(7.9聚合物)嵌段共聚物之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H- indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)及BODIPY-FL結合體之合成。
使合成例7中所獲得之共聚物7(40mg)及4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(Shanghai Haoyuan Chemexpress公司製造，17mg)、BODIPY-FL EDA‧HCl(Life Technology公司製造，5mg)、二異丙基乙基胺(4μL)溶解於DMF(1mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 2mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 33μL)，於25℃下攪拌24小時。其後，追加DIPCI(16μL)，進而攪拌3小時。歷時20分鐘將反應液滴加於二異丙醚(7mL)及乙酸乙酯(14mL)混合液中，於室溫下攪拌20分鐘後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得產物。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(1/1(v/v)，10mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌45分鐘。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)結合嵌段共聚物(實施例B-2)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例B-2進行水解處理，求出所游離之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)含量。其結果為，利用高效液相層析法(HPLC)對實施例B-2中之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3- 基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)進行定量，其含量為23.1%(w/w)。
使實施例B-2於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)之鍵結殘基之比為0.27。
關於實施例B-2之BODIPY-FL結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之BODIPY-FL之消耗率為1.0分子。因此，算出實施例B-2之總BODIPY-FL分子量為334。
自該等值算出實施例B-2之總分子量為4,451。
由此，實施例-2中之BODIPY-FL之含量為7.5質量%，聚乙二醇鏈段之含量為44.9質量%。
實施例B-2係作為實施例B-1之螢光標記物而用於下述之分佈試驗。
[實施例B-3]聚乙二醇(2kDa)-聚麩胺酸(6聚合物)嵌段共聚物之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)結合體之合成。
使用合成例8中所獲得之共聚物8(1100mg)及4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(Shanghai Haoyuan Chemexpress 公司製造，450mg)，依據實施例B-1所記載之方法而獲得標題之間苯二酚類結合嵌段共聚物(實施例B-3)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例B-3進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)進行定量而求出含量。其結果為，實施例B-3中之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)含量為18.8%(w/w)。
使實施例B-3於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)之鍵結殘基之比為0.11。
自該等值算出實施例B-3之總分子量為3.539。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為56.5%。
又，實施例B-3之1mg/mL水溶液之光散射強度為37,270cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為7,195cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為5.0倍。體積平均粒徑為8nm(機器A，5mg/mL)。
[實施例B-4]聚乙二醇(2kDa)-聚麩胺酸(10聚合物)嵌段共聚物之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene- 4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)結合體之合成。
使用合成例2中所獲得之共聚物2(966mg)及4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(Shanghai Haoyuan Chemexpress公司製造，317mg)，依據實施例B-1所記載之方法而獲得標題之間苯二酚類結合嵌段共聚物(實施例B-4)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例B-4進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)進行定量而求出其含量。其結果為，實施例B-4中之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)含量為17.0%(w/w)。
使實施例B-4於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)之鍵結殘基之比為0.09。
自該等值算出實施例B-3之總分子量為4,001。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為50.0%。
又，實施例B-3之1mg/mL水溶液之光散射強度為125,125cps， 此時之甲苯標準液之光散射強度為7,195cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為16.9倍。體積平均粒徑為11nm(機器A，5mg/mL)。
[實施例B-5]聚乙二醇(2kDa)-聚麩胺酸(12聚合物)嵌段共聚物之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)結合體之合成。
使用合成例9中所獲得之共聚物9(1500mg)及4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(Shanghai Haoyuan Chemexpress公司製造，393mg)，依據實施例B-1所記載之方法而獲得標題之間苯二酚類結合嵌段共聚物(實施例B-5)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例B-5進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)進行定量而求出其含量。其結果為，實施例B-5中之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)含量為12.7%(w/w)。
使實施例B-5於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H- 吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)之鍵結殘基之比為0.34。
自該等值算出實施例B-5之總分子量為4,409。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為45.4%。
又，實施例B-5之1mg/mL水溶液之光散射強度為50,425cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為7,195cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為6.8倍。體積平均粒徑為14nm(機器B，5mg/mL)。
[實施例B-6]聚乙二醇(5kDa)-聚麩胺酸(10聚合物)嵌段共聚物之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)結合體之合成。
使用合成例3中所獲得之共聚物3(953mg)及4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(Shanghai Haoyuan Chemexpress公司製造，250mg)，依據實施例B-1所記載之方法而獲得標題之間苯二酚類結合嵌段共聚物(實施例B-6)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對實施例B-6進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)進行定量而求出其含量。其結果為，實施例B-6中之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)含量為 17.3%(w/w)。
使實施例B-6於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)之鍵結殘基之比為0.23。
自該等值算出實施例B-6之總分子量為7,724。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為64.7%。
又，實施例B-6之1mg/mL水溶液之光散射強度為88,115cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為7,195cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為11.9倍。體積平均粒徑為12nm(機器A，5mg/mL)。
[比較例B-1]聚乙二醇(12kDa)-聚麩胺酸(25聚合物)嵌段共聚物之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)結合體之合成。
使用合成例4中所獲得之共聚物4(2300mg)及4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(Shanghai Haoyuan Chemexpress公司製造，557mg)，依據實施例B-1所記載之方法而獲得標題之Ganetespib結合嵌段共聚物(比較例B-1)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對比較例B-1進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4- (1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)進行定量而求出其含量。其結果為，實施例B-1中之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)含量為14.1%(w/w)。
使比較例B-1於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)之鍵結殘基之比為0.13。
自該等值算出比較例B-1之總分子量為17,311。
由此，聚乙二醇鏈段之質量含有率為69.3%。
又，比較例B-1之1mg/mL水溶液之光散射強度為294,722cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為7,195cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為41.0倍。體積平均粒徑為25nm(機器A，1mg/mL)。
[比較例B-2]聚乙二醇(12kDa)-聚麩胺酸(25聚合物)嵌段共聚物之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)及BODIPY-TR結合體之合成。
使用合成例4中所獲得之共聚物4(170mg)、4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚 (4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(Shanghai Haoyuan Chemexpress公司製造，41mg)及BODIPY-TR Cadaverine‧HCl(Life Technology公司製造，6mg)，依據實施例B-2所記載之方法而獲得標題之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)結合嵌段共聚物(比較例B-2)。
使用1N-氫氧化鈉水溶液對比較例B-2進行水解處理，利用高效液相層析法(HPLC)對所游離之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)進行定量而求出其含量。其結果為，實施例1中之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)含量為14.2%(w/w)。
使比較例B-2於包含氘氧化鈉之重水-氘代乙腈溶液中進行水解，對所獲得之溶液之1H-NMR圖譜進行解析，藉此確認到於聚麩胺酸鏈段之側鏈羧基鍵結有異丙基胺基羰基異丙基胺基。根據1H-NMR圖譜之積分比，異丙基胺基羰基異丙基胺基與4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)之鍵結殘基之比為0.39。
關於比較例B-2之BODIPY-TR結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之BODIPY-TR之消耗率為1.0分子。因 此，算出比較例B-2之總BODIPY-TR分子量為334。
自該等值算出比較例B-2之總分子量為18,171。
由此，比較例-2中之BODIPY-FL之含量為2.8質量%，聚乙二醇鏈段之含量為66.0質量%。
比較例B-2係作為比較例B-1之螢光標記物而用於下述之分佈試驗。
[試驗例B-1]腫瘤及腎臟內分佈試驗
將BALB/c裸小鼠之以皮下移植繼代之人類胰腺癌BxPC3之腫瘤塊製成約3mm見方之塊體，使用套管針移植至裸小鼠之背側部皮下。使實施例B-2及比較例B-2分別以BODIPY換算量5mg/kg之濃度溶解於5%葡萄糖注射液中，將等量之各溶解液進行混合，並單次投予至靜脈內。投予1小時後將裸小鼠於異氟醚麻醉下進行除血，而製作取出之腫瘤組織及腎臟之冷凍包埋切片，觀察螢光。將結果示於圖3。
試驗例B-1之結果為，關於實施例B-2之投予例，於腫瘤切片之觀察中於組織切片之廣泛區域內觀察到螢光之訊號。根據上述情況，確認到實施例B-2之嵌段共聚物係於腫瘤組織聚集，且滲透至腫瘤組織內部。相對於此，比較例B-2雖然於腫瘤外殼部觀察到螢光，但於組織中心部分未見螢光訊號，而表示嵌段共聚物未使藥劑到達腫瘤組織整體。
又，於腎臟中，實施例B-2於血管內及腎小管觀察到螢光。另一方面，比較例B-2於血管內以外未見螢光。
根據以上情況，表示實施例B-2之嵌段共聚物具有包括腫瘤組織深部在內之腫瘤組織聚集性，並且係可腎排泄之物性，而控制長期之體內滯留性。
[試驗例B-2]對非患癌小鼠之血液毒性試驗 [藥劑投予]
使實施例B-1及比較例B-1溶解於5%葡萄糖注射液中，基於投予當日之測定體重，將4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)換算75mg/kg之用量單次投予至雄5週齡之ICR小鼠(Crl：CD1(ICR)、Charles River Laboratories Japan股份有限公司)之尾靜脈內。作為對照群，將5%葡萄糖注射液進行尾靜脈內單次投予。
[血液學檢查]
於各化合物投予3天及14天後，使用安裝有26G注射針之1mL一次性注射筒於無麻醉下自鎖骨下靜脈採血。預先向注射筒添加EDTA-2K溶液約3μL，將其與所採取之血液充分混合而製成分析試樣。使用血球分析裝置XT-2000iV(Sysmex股份有限公司)，對血液試樣進行血球分析。將投予3天後之血小板數示於表4。
血液學檢查之結果為，比較例B-1於投予3天後血小板數降低，而可見血液毒性之延遲化。相對於此，本發明之實施例B-2之化合物於投予後3天之時點，血小板數降低之現象較比較例B-1得到抑制，血液毒性之延遲化為輕度。
比較例B-1係分子量為18kDa之化合物。另一方面，實施例B-1之 分子量較小為4kDa。根據以上之結果，認為間苯二酚衍生物結合高分子衍生物之血液毒性之延遲化係與分子量相關。因此，藉由設為分子量為15kDa以下之間苯二酚類結合高分子衍生物，可提供避免血液毒性之延遲化之抗腫瘤劑。
[試驗例B-3]對人類結腸癌及人類乳腺癌移植小鼠之抗腫瘤效果
將BALB/c裸小鼠之以皮下移植繼代之人類結腸癌Col-5-JCK及Co-3-KIST、及SCID小鼠之以皮下移植繼代之人類乳腺癌MC-19-JCK之腫瘤塊製成約3mm見方之塊體，使用套管針分別移植至裸小鼠或SCID小鼠之背側部皮下。於腫瘤移植後平均腫瘤體積成為約150mm3以上之時點進行分群。
使實施例B-1及比較例B-1溶解於5%葡萄糖注射液中，將4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)換算75、50mg/kg單次投予至尾靜脈內。
又，使作為對照藥之4-異丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亞甲基-4,5-二氫-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二酚(4-Isopropyl-6-(4-(1-methyl-1H-indol-5-yl)-5-methylene-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-3-yl)benzene-1,3-diol)(Ganetespib)溶解於DMSO中之後，利用Cremophor RH40：5%葡萄糖液(1：4)之混合液稀釋至10倍，將其以150mg/kg單次投予至尾靜脈內。
由投予開始日腫瘤體積求出相對腫瘤體積，設為抗腫瘤效果之指標。再者，腫瘤體積係計測腫瘤之長徑(L：mm)及短徑(W：mm)，並根據(L×W2)/2之計算式而算出。將結果示於圖4、圖5、圖6。
關於實施例B-1，與比較例B-1相比，其以相同投予量於任一種腫瘤皮下模型中均顯示更優異之效果。根據試驗例B-1之結果可知， 實施例B-1具有腫瘤組織移行性且腫瘤深部浸透性。因此，認為該等於腫瘤組織中之藥物動態之差異為原因在於抗腫瘤效果之增強作用者。
[合成例10]聚乙二醇-α,β-聚天冬胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2kDa、聚天冬胺酸聚合數12.5；共聚物10)之合成。
使一末端為甲氧基、另一末端為3-胺基丙基之聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-20H，日油公司製造，平均分子量2kDa，20.0g)溶解於DMSO(400mL)中後，添加γ-苄基-L-天冬胺酸-N-羧酸酐(29.8g，12當量)，於32.5℃下攪拌20小時。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(3,200mL)及乙醇(800mL)混合液中，於室溫下攪拌3小時。其後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，而獲得聚合物(31.2g)。
使所獲得之聚合物(30.0g)溶解於DMF(300mL)中，添加乙酸酐(7.3mL)，於35℃下攪拌3小時。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(2,700mL)及乙醇(300mL)混合液中，於室溫下攪拌1小時。其後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得乙醯化聚合物(26.6g)。
使所獲得之乙醯化聚合物(25.0g)溶解於MeCN(500mL)中後，添加0.2N之氫氧化鈉(500mL)，於23℃下進行3小時水解。向反應液添加2N之鹽酸進行中和後，利用減壓濃縮將乙腈去除後，使用乙酸乙酯(500mL)將濃縮液清洗3次。將水層減壓濃縮後，利用1N之氫氧化鈉水溶液將溶解液之pH值調整至11.0，添加食鹽(50g)後，使用分配吸附樹脂管柱層析法進行精製，繼而使用離子交換樹脂管柱層析法進行精製，將所溶出之溶液進行減壓濃縮後，進行冷凍乾燥，而獲得聚乙二醇-聚天冬胺酸嵌段共聚物(共聚物10 13.0g)。
關於共聚物10，藉由使用0.1N氫氧化鉀之滴定法而算出天冬胺酸之聚合數為12.5。
又，合成例10之1mg/mL水溶液之光散射強度為2,179cps，此時 之甲苯標準液之光散射強度為7,305cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為0.3倍。
[合成例11]聚乙二醇-α-聚天冬胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量5kDa、聚天冬胺酸聚合數20.0；共聚物11)之合成。
使用一末端為甲氧基、另一末端為3-胺基丙基之聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-50H，日油公司製造，平均分子量5kDa)與γ-苄基-L-天冬胺酸-N-羧酸酐，依據合成例2所記載之方法，而獲得標題之聚乙二醇-α-聚天冬胺酸嵌段共聚物(共聚物11)。
關於共聚物11，藉由使用0.1N氫氧化鉀之滴定法而算出天冬胺酸之聚合數為20.0。
[合成例12]聚乙二醇-α,β-聚天冬胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量12kDa、聚天冬胺酸聚合數23.8；共聚物12)之合成。
使一末端為甲氧基、另一末端為3-胺基丙基之聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-12K，日油公司製造，平均分子量12kDa，75.0g)溶解於DMSO(1430mL)後，添加γ-苄基-L-天冬胺酸-N-羧酸酐(45.0g，29當量)，於32.0℃下攪拌一夜。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(12L)及乙醇(3L)混合液中，於室溫下攪拌1小時。其後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，而獲得聚合物(106.0g)。
使所獲得之聚合物(105.0g)溶解於DMF(1050mL)中，添加乙酸酐(3.3mL)，於35℃下攪拌3小時。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(2,9450mL)及乙醇(1050mL)混合液中，於室溫下攪拌1小時。其後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得乙醯化聚合物(103.0g)。
使所獲得之乙醯化聚合物(100.0g)溶解於乙腈(2L)中後，添加0.2N之氫氧化鈉(2L)，於23℃下進行3小時水解。向反應液添加2N之鹽酸而進行中和後，利用減壓濃縮將乙腈去除後，使用乙酸乙酯(2 L)而將濃縮液清洗3次。將水層減壓濃縮後，利用1N之氫氧化鈉水溶液將溶解液之pH值調整至11.0，添加食鹽(100g)後，使用分配吸附樹脂管柱層析法進行精製，繼而使用離子交換樹脂管柱層析法進行精製，將所溶出之溶液減壓濃縮後，進行冷凍乾燥，而獲得聚乙二醇-聚天冬胺酸嵌段共聚物(共聚物12 75.4g)。
關於共聚物12，藉由使用0.1N氫氧化鉀之滴定法而算出天冬胺酸之聚合數為23.8。
[實施例C-1]聚乙二醇(2kDa)-α,β-聚天冬胺酸(12.5聚合物)嵌段共聚物之卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ)及正丁胺結合體之合成。
使合成例10中所獲得之共聚物10(707.6mg)及卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ 572.2mg)溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP 19.5mL)中，添加正丁胺(125μL)、二甲基胺基吡啶(DMAP 154.9mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 911μL)，於25℃下攪拌19小時。其後，追加DIPCI(228μL)，進而攪拌6小時。向反應液添加乙酸乙酯(20mL)後，歷時1小時滴加於二異丙醚(1560mL)中，於室溫下攪拌1小時後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得產物(950mg)。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(50/50(v/v)，140mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌30分鐘。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之紫杉烷類結合高分子衍生物(實施例C-1 930mg)。
關於實施例C-1之CBZ結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之CBZ之消耗率為1.3分子。因此，算出實施例C-1之總CBZ分子量為1,087。
關於實施例C-1之正丁胺結合量，若假定正丁胺之添加量全部進行反應，則為6.2分子。因此，算出實施例C-1之總正丁胺分子量為453。
自該等值算出實施例C-1之總分子量為5,516。
由此，實施例C-1中之CBZ之含量為19.7質量%，正丁胺之含量為8.2質量%，聚乙二醇鏈段之含量為36.3質量%。
又，實施例C-1之1mg/mL水溶液之光散射強度為13,018cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為4,368cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為3.0倍。體積平均粒徑為6.3nm(機器A，1mg/mL)。
[實施例C-2]聚乙二醇(5kDa)-α-聚天冬胺酸(20.0聚合物)嵌段共聚物之卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ)結合體之合成。
使合成例11中所獲得之共聚物11(1.50g)及卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ 342mg)溶解於NMP(31mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 250mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 1468μL)，於20℃下攪拌21小時。其後，追加DIPCI(367μL)，進而攪拌5小時。向反應液添加乙酸乙酯(31mL)後，歷時1小時滴加於二異丙醚(1260mL)中，於室溫下攪拌1小時後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得產物(1.71g)。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(50/50(v/v)，80mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌30分鐘。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之紫杉烷類結合高分子衍生物(實施例C-2 1.58g)。
關於實施例C-2之CBZ結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之CBZ之消耗率為1.6分子。因此，算出實施例C-2之總CBZ分子量為1,337。
自該等值算出實施例C-2之總分子量為10,970。
由此，實施例C-2中之CBZ之含量為12.2質量%，聚乙二醇鏈段之含量為45.6質量%。
又，實施例C-2之1mg/mL水溶液之光散射強度為10,382cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為4,187cps。因此，與甲苯之光散射強 度之相對比率為2.5倍。體積平均粒徑為10nm(機器B，1mg/mL)。
[實施例C-3]聚乙二醇(2kDa)-α,β-聚天冬胺酸(12.5聚合物)嵌段共聚物之卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ)及正丁胺及2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合體之合成。
使合成例10中所獲得之共聚物10(205.6mg)及卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ 166.3mg)及2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮(5.1mg)溶解於NMP(5.7mL)中，添加正丁胺(36μL)、二甲基胺基吡啶(DMAP 45.0mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 265μL)，於20℃下攪拌17.5小時。其後，追加DIPCI(66μL)，進而攪拌4.5小時。向反應液添加乙酸乙酯(5.5mL)後，歷時10分鐘滴加於二異丙醚(440mL)中，於室溫下攪拌1小時後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得產物(300mg)。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(50/50(v/v)，20mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌30分鐘。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之紫杉烷類結合高分子衍生物(實施例C-3 270.9mg)。
關於實施例C-3之CBZ結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之CBZ之消耗率為1.7分子。因此，算出實施例C-3之總CBZ分子量為1,421。
關於實施例C-3之正丁胺結合量，若假定正丁胺之添加量全部反應，則為6.2分子。因此，算出實施例C-3之總正丁胺分子量為453。
關於實施例C-3之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之消耗率為0.23分子。因此，算出實施例C-3之總2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮分子量為87。
自該等值算出實施例C-3之總分子量為5,846。
由此，實施例C-3中之CBZ之含量為24.3質量%，正丁胺之含量為7.8質量%，2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之含量為1.5質量%，聚乙二醇鏈段之含量為34.2質量%。
實施例C-3係作為實施例C-1之螢光標記物而用於下述之分佈試驗。
[實施例C-4]聚乙二醇(2kDa)-α,β-聚天冬胺酸(12.5聚合物)嵌段共聚物之卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ)結合體之合成。
使合成例10中所獲得之共聚物10(51.5mg)及卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ 30.9mg)溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP 1.42mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 11.3mg)及二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 66μL)，於25℃下攪拌13小時。其後，追加DIPCI(17μL)，進而攪拌5小時。向反應液添加乙酸乙酯(1.42mL)後，歷時1小時滴加於二異丙醚(114mL)中，於室溫下攪拌1小時後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得標題之紫杉烷類結合高分子衍生物(實施例C-4)。
關於實施例C-4之CBZ結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之CBZ之消耗率為1.8分子。因此，算出實施例C-4之總CBZ分子量為1,505。
自該等值算出實施例C-4之總分子量為6,301。
由此，實施例C-4中之CBZ之含量為23.9質量%，聚乙二醇鏈段之含量為31.7質量%。
又，實施例C-4之1mg/mL水溶液之光散射強度為176,886cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為7,156cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為24.7倍。體積平均粒徑為12nm(機器A，1mg/mL)。
[實施例C-5]聚乙二醇(2kDa)-α,β-聚天冬胺酸(12.5聚合物)嵌段共聚物之歐洲紫杉醇(DTX)及4-苯基丁胺結合體之合成。
使合成例10中所獲得之共聚物10(33.4mg)及歐洲紫杉醇(DTX 26.1mg)溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP 0.92mL)中，添加4-苯基丁胺(6μL)、二甲基胺基吡啶(DMAP 7.3mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 43μL)，於25℃下攪拌22小時。其後，追加DIPCI(11μL)，進而攪拌6小時。將反應液移至MWCO2,000之透析膜，於水中進行透析後，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之紫杉烷類結合高分子衍生物(實施例C-5 59.6mg)。
關於實施例C-5之DTX結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之DTX之消耗率為1.2分子。因此，算出實施例C-5之總DTX分子量為969。
關於實施例C-5之4-苯基丁胺結合量，若假定4-苯基丁胺之添加量全部反應，則為3.7分子。因此，算出實施例C-5之總4-苯基丁胺分子量為552。
自該等值算出實施例C-5之總分子量為5,872。
由此，實施例C-5中之DTX之含量為16.5質量%，4-苯基丁胺之含量為9.4質量%，聚乙二醇鏈段之含量為34.1質量%。
又，實施例C-5之1mg/mL水溶液之光散射強度為162,126cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為7,152cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為22.7倍。
[比較例C-1]聚乙二醇(12kDa)-α,β-聚天冬胺酸(23.8聚合物)嵌段共聚物之卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ)結合體之合成。
使合成例12中所獲得之共聚物12(1.60g)及卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ 797.9mg)溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP 20.2mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 35.2mg)、二異丙基碳二醯亞胺 (DIPCI 942μL)，於15℃下攪拌21小時。其後，追加DIPCI(236μL)，進而攪拌7小時。歷時1小時將反應液滴加於二異丙醚(360mL)及乙醇(90mL)混合液中，於室溫下攪拌1小時後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉此獲得產物(1.98g)。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(50/50(v/v)，80mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌30分鐘。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之紫杉烷類結合高分子衍生物(比較例C-1 1.93g)。
關於比較例C-1之CBZ結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之CBZ之消耗率為5.2分子。因此，算出比較例C-1之總CBZ分子量為4,347。
自該等值算出比較例C-1之總分子量為21,377。
由此，比較例C-1中之CBZ之含量為20.3質量%，聚乙二醇鏈段之含量為56.1質量%。
又，比較例C-1之1mg/mL水溶液之光散射強度為24,804cps，此時之甲苯標準液之光散射強度為4,368cps。因此，與甲苯之光散射強度之相對比率為5.7倍。體積平均粒徑為22nm(機器A，1mg/mL)。
[比較例C-2]聚乙二醇(12kDa)-α,β-聚天冬胺酸(23.8聚合物)嵌段共聚物之卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ)及2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合體之合成。
使合成例12中所獲得之共聚物12(200mg)及卡巴他賽(Cabazitaxel)(CBZ 99.7mg)及2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮(5.2mg)溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP 2.5mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 4.4mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 118μL)，於20℃下攪拌21小時。其後，追加DIPCI(29μL)，進而攪拌5小時。歷時10分鐘將反應液滴加於二異丙醚(18mL)及乙醇(4.5mL)混合液中，於室溫下攪拌1小時後，濾取析出物，於減壓下進行乾燥，藉 此獲得產物(235.0mg)。使所獲得之產物溶解於乙腈/水(50/50(v/v)，10mL)中後，添加離子交換樹脂，於5℃下攪拌30分鐘。將離子交換樹脂過濾分離後，將乙腈減壓蒸餾去除，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之紫杉烷類結合高分子衍生物(比較例C-2 205.6mg)。
關於比較例C-2之CBZ結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之CBZ之消耗率為4.3分子。因此，算出比較例C-2之總CBZ分子量為3,594。
關於比較例C-2之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之消耗率為1.0分子。因此，算出比較例C-2之總2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮分子量為377。
自該等值算出比較例C-2之總分子量為20,988。
由此，比較例C-2中之CBZ之含量為17.1質量%，2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之含量為1.8質量%，聚乙二醇鏈段之含量為57.2質量%。
比較例C-2係作為比較例C-1之螢光標記物而用於下述之分佈試驗。
[比較例C-3]聚乙二醇(2kDa)-α,β-聚天冬胺酸(12.5聚合物)嵌段共聚物之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合體之合成。
使合成例10中所獲得之共聚物10(205.7mg)及2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮(5.1mg)溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP 5.7mL)中，添加二甲基胺基吡啶(DMAP 45.0mg)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI 265μL)，於20℃下攪拌18.5小時。其後，追加DIPCI(66μL)，進而攪拌2.5小時。將反應液移至MWCO 10,000之透 析膜，於水中進行透析後，進行冷凍乾燥，藉此獲得標題之紫杉烷類結合高分子衍生物(比較例C-3 247.7mg)。
關於比較例C-3之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮結合量，根據藉由高效液相層析法(HPLC)所測得之反應溶液中之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之消耗率為0.3分子。因此，算出比較例C-3之總2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮分子量為113。
自該等值算出比較例C-3之總分子量為5,126。
由此，比較例C-3中之2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮之含量為2.2質量%，聚乙二醇鏈段之含量為39.0質量%。
比較例C-3係非聚集性，並作為共聚物12之螢光標記物而用於下述之分佈試驗。
[試驗例C-1]腫瘤內及腎臟內分佈試驗
將BALB/c裸小鼠之以皮下移植繼代之人類胰腺癌BxPC3之腫瘤塊製成約3mm見方之塊體，使用套管針移植至裸小鼠之背側部皮下。使實施例C-3、比較例C-2及比較例C-3分別於5%葡萄糖注射液中溶解，並以2-(2-胺基乙氧基)-9-(二乙基胺基)-5H-苯并[a]啡-5-酮換算量5mg/kg分別單次投予至靜脈內。於投予1小時後將小鼠於異氟醚麻醉下進行除血，而製作取出之腫瘤及腎臟之冷凍包埋切片，觀察螢光。將結果示於圖7。
試驗例C-1之結果為，關於實施例C-3，於腫瘤切片之廣泛區域內觀察到螢光之訊號。根據上述情況，表示實施例C-3之嵌段共聚物可一面向腫瘤組織移行並聚集，一面滲透至腫瘤組織之深部。相對於此，比較例C-2及C-3係如下結果：雖於腫瘤外緣部觀察到螢光訊號，但亦未確認到腫瘤組織浸透性，而腫瘤組織移行性及聚集性較低。
又，於腎臟中，關於實施例C-3及比較例C-3，於腎小管觀察到螢光。另一方面，關於比較例C-2，於血管內以外未見螢光。根據上述情況，表示實施例C-3與比較例C-2相比，係可迅速遭受腎排泄之物性。
水溶液中之光散射強度所示之分析值未達2倍且分子量未達15kDa之非聚集性之比較例C-3的嵌段共聚物係如下結果：雖迅速遭受腎排泄，但向腫瘤之聚集性較低。水溶液中之光散射強度所示之分析值為2倍以上且分子量大於15kDa之比較例C-2的紫杉烷類結合嵌段共聚物係如下結果：雖未遭受腎排泄，但向腫瘤之聚集性低於實施例C-3。明確藉由將水溶液中之光散射強度所示之分析值設為2倍以上且將分子量設為15kDa以下，可製備迅速遭受腎排泄且表現出腫瘤聚集性之紫杉烷類結合嵌段共聚物。
[試驗例C-2]對非患癌小鼠之血液毒性試驗 [藥劑投予]
使實施例C-1及比較例C-1溶解於5%葡萄糖注射液中，基於投予當日之測定體重，將各化合物之最大耐用量附近之卡巴他賽(Cabazitaxel)換算60mg/kg之用量單次投予至雄5週齡之ICR小鼠(Crl：CD1(ICR)，Charles River Laboratories Japan股份有限公司)之尾靜脈內。作為對照群，將5%葡萄糖注射液進行尾靜脈內單次投予。
將實施例C-1及比較例C-1之化合物之以成為特定之卡巴他賽(Cabazitaxel)濃度之方式利用各化合物之卡巴他賽(Cabazitaxel)含量進行修正而算出的必需量稱取至聚丙烯製離心管中，添加5%葡萄糖注射液，一面於冰水中照射超音波一面使之溶解。
又，將作為對象藥之卡巴他賽(Cabazitaxel)之以成為特定濃度之20倍濃度之方式算出的必需量稱取至聚丙烯製離心管中，添加無水乙醇而使之溶解。添加與無水乙醇量等量之聚山梨糖醇酯80，將充分混 合而成者設為製備原液，於即將投予前利用5%葡萄糖注射液將製備原液進行10倍稀釋，將作為最大非致死量之30mg/kg單次投予至尾靜脈內。
[血液學檢查]
於各化合物投予3、5、7、11、14天後，使用安裝有26G注射針之1mL一次性注射筒於無麻醉下自鎖骨下靜脈採血。預先向注射筒添加EDTA-2K溶液約3μL，將其與所採取之血液充分混合而製成分析試樣。使用血球分析裝置XT-2000iV(Sysmex股份有限公司)對血液試樣進行血球分析。將投予5天後之網狀紅血球計數示於表5。
血液學檢查之結果為，關於比較例C-1，於投予5天後，網狀紅血球計數降低，而可見血液毒性之延遲化。相對於此，關於實施例C-1之化合物及卡巴他賽(Cabazitaxel)，於投予後5天之時點，網狀紅血球計數未減少，而未見血液毒性之延遲化。因此，認為實施例C-1及卡巴他賽(Cabazitaxel)之化合物未使血液毒性延遲化。
比較例C-1係分子量為21kDa之化合物。另一方面，實施例C-1之分子量較小為5.5kDa。根據以上之結果，認為紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物之血液毒性之延遲化係與分子量相關。因此，藉由設為分子量為15kDa以下之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物，可製備避免血液毒性之延遲化之抗腫瘤劑。
[試驗例C-3]對人類胰腺癌移植裸小鼠之抗腫瘤效果試驗
將於裸小鼠皮下繼代之人類胰腺癌BxPC3之腫瘤塊製成約3mm見方之塊體，使用套管針移植至裸小鼠之背側部皮下。於腫瘤移植後平均腫瘤體積成為約200mm3以上之時點，使實施例C-1、實施例C-2及比較例C-1溶解於5%葡萄糖注射液中，基於投予當日之測定體重，將各化合物之最大耐用量附近之卡巴他賽(Cabazitaxel)換算60mg/kg之用量單次投予至尾靜脈內。
又，將卡巴他賽(Cabazitaxel)於聚山梨糖醇酯80中溶解後利用等量之無水乙醇進行稀釋而成者設為製備原液，於即將投予前利用5%葡萄糖注射液將製備原液進行10倍稀釋，將作為最大非致死量之30mg/kg單次投予至尾靜脈內。
自投予日及投予後第8天之腫瘤體積求出相對腫瘤體積，而設為抗腫瘤效果之指標。再者，腫瘤體積係計測腫瘤之長徑(L：mm)及短徑(W：mm)並利用(L×W2)/2之計算式而算出。將結果示於表6。
試驗例C-3之結果為，實施例C-1、實施例C-2及比較例C-1與卡巴他賽(Cabazitaxel)相比，腫瘤體積較小，表現出更強之腫瘤增生抑制作用。
[試驗例C-4]對人類肺癌移植裸小鼠之抗腫瘤效果試驗
將於裸小鼠皮下繼代之人類肺癌H460之腫瘤塊製成約3mm見方之塊體，使用套管針移植至裸小鼠之背側部皮下。於腫瘤移植後平均腫瘤體積成為約200mm3以上之時點，使實施例C-1、實施例C-2及比較例C-1溶解於5%葡萄糖注射液中，基於投予當日之測定體重，將各化合物之最大耐用量附近之卡巴他賽(Cabazitaxel)換算60mg/kg之用量單次投予至尾靜脈內。
又，將卡巴他賽(Cabazitaxel)於無水乙醇中溶解後利用等量之聚山梨糖醇酯80進行稀釋而成者設為製備原液，於即將投予前利用5%葡萄糖注射液將製備原液進行10倍稀釋，將作為最大非致死量之30mg/kg單次投予至尾靜脈內。
自投予日及投予後第15天之腫瘤體積求出相對腫瘤體積，而設為抗腫瘤效果之指標。再者，腫瘤體積係計測腫瘤之長徑(L：mm)及短徑(W：mm)並利用(L×W2)/2之計算式而算出。將結果示於表7。
試驗例C-4之結果為，實施例C-1、實施例C-2及比較例C-1與卡巴他賽(Cabazitaxel)相比，腫瘤體積較小，表現出更強之腫瘤增生抑制作用。
自試驗例C-1~C-4之結果明確，本發明之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物一面發揮與對照藥同等以上之抗腫瘤效果，一面亦抑制血液毒性之延遲化。因此，藉由設為分子量及水溶液之光散射強度得到控制之紫杉烷衍生物結合嵌段共聚物，可提供可將腫瘤增生抑制作用與正常組織損傷作用背離，而達成了效果增強與副作用減少之抗腫瘤劑。
自以上之結果明確，藉由於以聚乙二醇鏈段與聚胺基酸鏈段連結而成之嵌段共聚物為藥劑輸送載體之DDS化製劑中，將該嵌段共聚物之分子量控制為2kDa以上且15kDa以下，並設為於利用雷射光散射光度法之水溶液中物性解析中於水溶液中形成自我聚集性粒子之物性，可製備體積平均粒徑較先前小之奈米粒子DDS製劑，藉此，發揮先前之嵌段共聚物所沒有之藥物動態特性。
即，明確本發明之嵌段共聚物不僅具有向腫瘤等疾病靶組織之組織移行性，亦具有向組織內部之較高浸透性，而發揮較高之靶組織移行性及聚集性。又，已知使用有高分子載體之DDS化製劑之腎排泄性受到抑制，但明確本發明之嵌段共聚物具備腎排泄性。本發明之嵌段共聚物係如下物性，即該等之特異之藥物動態特性原因在於該嵌段共聚物之分子量及自我聚集性，且係不論所結合之生理活性物質之種類或化學結構，均具有通用性之DDS化製劑技術。此種藥物動態特性係可使生理活性物質傳遞至疾病靶組織之深部並使之致敏，因此可有效率地發揮藥理活性效果。又，由於具備腎排泄性，故而未分佈、聚集於疾病靶組織中之該嵌段共聚物迅速地排泄，因此抑制不需要之體內滯留性，避免向疾病靶組織以外之組織之分佈、聚集，藉此可減少副作用之表現。
根據以上情況，本發明之嵌段共聚物係可導入新穎之高分子化DDS製劑之概念的技術，且可藉由應用於可用於各種疾病之治療之醫 藥而提供有用之醫藥品。尤其是較佳為用於局部之組織疾病之治療，可應用針對惡性腫瘤疾病、炎症性疾病、感染症疾病之治療用醫藥品。

Claims (19)

  1. 一種嵌段共聚物，其係聚乙二醇鏈段、與包含於側鏈羧基上酯鍵結有具有羥基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或麩胺酸衍生物的聚胺基酸衍生物鏈段連結而成者，並且上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下，於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm之測定條件下利用雷射光散射光度計所測得之上述嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之光散射強度為上述測定條件下之甲苯之光散射強度之至少2倍以上。
  2. 一種嵌段共聚物，其係聚乙二醇鏈段、與包含於側鏈羧基上酯鍵結有具有羥基之生理活性物質的天冬胺酸衍生物及/或麩胺酸衍生物之聚胺基酸衍生物鏈段連結而成之具有奈米粒子形成能力者，並且上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下。
  3. 如請求項1之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物中之上述聚乙二醇鏈段之質量含有率為10質量%以上且80質量%以下。
  4. 如請求項2之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物中之上述聚乙二醇鏈段之質量含有率為10質量%以上且80質量%以下。
  5. 如請求項3之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物中之上述聚乙二醇鏈段之質量含有率為30質量%以上且65質量%以下。
  6. 如請求項4之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物中之上述聚乙二醇鏈段之質量含有率為30質量%以上且65質量%以下。
  7. 如請求項1至6中任一項之嵌段共聚物，其中上述聚乙二醇鏈段之分子量為1kDa~10kDa。
  8. 如請求項1至6中任一項之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物中 之上述具有羥基之生理活性物質之質量含有率為10質量%以上且60質量%以下。
  9. 如請求項1至6中任一項之嵌段共聚物，其中上述嵌段共聚物以通式(1)表示， [式中，R1表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基，t表示20~270之整數，A表示可具有取代基之碳數(C1~C6)伸烷基，R2表示選自由氫原子、碳數(C1~C6)醯基及碳數(C1~C6)烷氧羰基所組成之群中之取代基，R3表示具有羥基之生理活性物質之酯鍵結殘基，R4表示選自由可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷氧基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C30)之直鏈狀、支鏈狀或環狀之二烷基胺基、可具有取代基之碳數(C1~C8)烷基胺基羰基(C1~C8)烷基胺基、螢光物質之鍵結殘基及羥基所組成之群中之1種以上之取代基，B表示鍵結基，n表示1或2，x1、x2、y1、y2及z分別獨立地表示0~25之整數，(x1+x2)表示1~25之整數，(x1+x2+y1+y2+z)表示3~25 之整數，鍵結有上述R3及R4之各構成單元以及支鏈羰基進行分子內環化而成之構成單元分別獨立為無規排列之結構]。
  10. 如請求項1至6中任一項之嵌段共聚物，其中具有羥基之生理活性物質為選自由喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、蒽環黴素衍生物、雷帕黴素衍生物、胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑、葉酸代謝拮抗劑、嘌呤系代謝拮抗劑、氟化嘧啶系代謝拮抗劑、鉑衍生物、絲裂黴素衍生物、博萊黴素衍生物、長春花生物鹼衍生物、鬼臼毒素衍生物、軟海綿素衍生物、星孢菌素衍生物、沙利竇邁衍生物、維生素A衍生物、康普瑞汀衍生物、抗雄性素劑、抗雌性素劑、激素劑、他克莫司衍生物、類固醇衍生物、雷帕黴素衍生物、多烯系抗生物質、唑系衍生物、Candin系衍生物、嘧啶衍生物所組成之群中之1種以上之生理活性物質。
  11. 如請求項10之嵌段共聚物，其中具有羥基之生理活性物質為選自由喜樹鹼衍生物、紫杉烷衍生物、間苯二酚衍生物、蒽環黴素衍生物、雷帕黴素衍生物、胞嘧啶核苷系代謝拮抗劑、葉酸代謝拮抗劑、嘌呤系代謝拮抗劑、氟化嘧啶系代謝拮抗劑、鉑衍生物、絲裂黴素衍生物、博萊黴素衍生物、長春花生物鹼衍生物、鬼臼毒素衍生物、軟海綿素衍生物、星孢菌素衍生物、沙利竇邁衍生物、維生素A衍生物、康普瑞汀衍生物、抗雄性素劑、抗雌性素劑、激素劑所組成之群中之1種以上之抗腫瘤劑。
  12. 如請求項9之嵌段共聚物，其中R3為通式(2)所表示之喜樹鹼衍生物之酯鍵結殘基，[化2] [式中，R5表示選自由氫原子、可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基及可具有取代基之矽烷基所組成之群中之1種，R6表示氫原子或可具有取代基之碳數(C1~C6)烷基]。
  13. 如請求項9之嵌段共聚物，其中R3為通式(3)所表示之間苯二酚衍生物之酯鍵結殘基， [式中，R7表示選自由巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔基、碳環或雜環芳基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲 醯基、碳數(C1~C8)之醯基、羧基、碳數(C1~C8)之烷氧羰基、胺甲醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種，R8表示選自由可具有取代基之碳環或雜環芳基、碳數(C1~C20)之烷基、碳數(C2~C20)之烯基、碳數(C2~C20)之炔基、碳數(C1~C20)之烷基胺基及碳數(C1~C20)之醯基胺基所組成之群中之1種，環H為選自由通式(3-1)、(3-2)及(3-3)所組成之群中之雜環芳基， [式中，R9表示選自由巰基、羥基、氫原子、鹵素原子、胺甲醯基、碳數(C1~C20)之烷氧羰基、氰基、碳數(C1~C8)之烷硫基、芳硫基、碳數(C1~C8)之烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、碳數(C1~C8)之烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、碳數(C1~C8)之烷氧基、芳氧基、碳數(C1~C8)之醯氧基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰氧基、胺甲醯氧基、胺基、碳數(C1~C8)之醯基胺基、碳數(C1~C8)之烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、碳數(C1~C8)之醯基及碳數(C1~C8)之烷基矽烷基所組成之群中之1種]]。
  14. 如請求項9之嵌段共聚物，其中R3為太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇 或卡巴他賽之酯鍵結殘基。
  15. 一種嵌段共聚物，其係藉由使用縮合劑，使聚乙二醇鏈段與含有天冬胺酸及/或麩胺酸之聚胺基酸鏈段連結而成之嵌段共聚物、與具有羥基之生理活性物質、以及任意之具有羥基及/或胺基之疏水性取代基進行反應而獲得者，並且上述嵌段共聚物之分子量為2kDa以上且15kDa以下，於測定溫度25℃、散射角度90°、波長632.8nm之測定條件下利用雷射光散射光度計所測得之上述嵌段共聚物之1mg/mL水溶液之光散射強度為上述測定條件下之甲苯之光散射強度之至少2倍以上。
  16. 一種奈米粒子，其係由如請求項1至15中任一項之嵌段共聚物所形成。
  17. 如請求項16之奈米粒子，其中上述奈米粒子之體積平均粒徑未達20奈米。
  18. 一種醫藥品，其以如請求項1至15中任一項之嵌段共聚物或如請求項16或17之奈米粒子作為有效成分。
  19. 一種抗腫瘤劑，其以如請求項1至15中任一項之嵌段共聚物或如請求項16或17之奈米粒子作為有效成分。
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