CN107249589A - 生理活性物质结合嵌段共聚物 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种生理活性物质结合嵌段共聚物，与公知的生理活性物质结合嵌段共聚物相比，其提高在病变靶组织中的渗透性和/或提高排泄性，抑制生理活性物质对病变靶组织以外的正常组织的致敏，由此提高了有效性和/或安全性。一种嵌段共聚物，其为聚乙二醇链段与结合有生理活性物质的聚氨基酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，其分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下，利用激光散射光度计测定的该生理活性物质结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液的光散射强度为甲苯的光散射强度的至少2倍以上。

Description

生理活性物质结合嵌段共聚物
技术领域
本发明涉及生理活性物质的高分子化衍生物及其用途。
背景技术
关于药品，已经开发了对作为有效成分的生理活性物质的药代动力学进行控制、以所期望的药物浓度-作用时间送达至生物体内的特异性作用部位的药物递送系统(DDS)。非专利文献1中记载了一种DDS化制剂，其将聚乙二醇链段与聚氨基酸链段连结而成的嵌段共聚物作为药物递送载体。并记载了下述内容：该嵌段共聚物显示出缔合性，形成具有聚乙二醇的外壳和疏水性内核的粒径为20～100nm的高分子胶束形状，通过化学键合或物理性摄入将各种种类的药物稳定地包含于内核中。该高分子胶束型DDS制剂的特征在于，当给药至生物体内时，排泄受到抑制，体内滞留性提高，并且已知该高分子胶束型DDS制剂会被动地迁移并集聚于肿瘤等组织中。因此，通过使生理活性物质长时间停留于生物体内，能够提高有效成分的利用率，利用了这些系统的药物与搭载药相比能够发挥更强的生理活性效果。
关于上述高分子胶束型DDS制剂，已知通过化学键合使药物包含于该高分子胶束内核中的制剂。例如，专利文献1中记载了一种喜树碱衍生物的制剂例。另外，专利文献2中记载了一种具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物的制剂例；专利文献3中记载了一种紫杉烷衍生物的制剂例；专利文献4中记载了一种类固醇衍生物的制剂例，示出了能够应用于各种药物的各种生理活性物质结合嵌段共聚物。
现有的生理活性物质结合嵌段共聚物能够提高结合药物的血中滞留性。因此，使药物不仅作用于病变组织，也长时间作用于正常组织。例如，专利文献1中记载的结合有作为抗肿瘤剂的喜树碱衍生物的嵌段共聚物在生物体内以缓释的方式解离出喜树碱衍生物。其结果，使游离的喜树碱衍生物不仅作用于肿瘤组织，也长时间作用于骨髓等正常组织。因此，现有的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物在发挥出强力的抗肿瘤效果的同时，不可避免地表现出嗜中性粒细胞减少等骨髓抑制，这引起了剂量限制性毒性(DLT；dose limitingtoxicity)(非专利文献2)。因此，要求开发出在维持抗肿瘤效果的同时、进一步减轻骨髓抑制的喜树碱衍生物。如此，现有的生理活性物质结合嵌段共聚物虽然能够发挥出强力的药理活性效果，但在正常组织中有时会表现出副作用。
因此，关于上述高分子胶束型DDS制剂，要求开发出在维持其特征、即生理活性功能的增强效果的同时，抑制对于正常组织的药理活性功能表现，减轻了副作用的生理活性物质结合嵌段共聚物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2004/039869号
专利文献2：国际公开WO2008/041610号
专利文献3：国际公开WO2007/111211号
专利文献4：国际公开WO2009/041570号
非专利文献
非专利文献1：Advanced Drug Delivery Reviews、2008年、60卷、899～914页
非专利文献2：Clinical Cancer Research、2010年、16卷、5058～5066页
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供一种与公知的生理活性物质结合嵌段共聚物相比有效性和/或安全性提高的生理活性物质结合嵌段共聚物。具体而言，其课题在于：通过与公知的生理活性物质结合嵌段共聚物相比提高在病变靶组织中的渗透性、提高药理活性物质的作用而有效地发挥出药理活性效果。并且/或者，其课题在于：通过提高该嵌段共聚物在肾脏等中的排泄性而控制血中滞留性，通过抑制生理活性物质对病变靶组织以外的正常组织的致敏而避免正常组织的损伤表现。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现下述嵌段共聚物能够提高有效性和/或安全性，从而完成了本发明，该嵌段共聚物为聚乙二醇链段与结合有生理活性物质的聚氨基酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下，利用激光散射光度计测定的该生理活性物质结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液的光散射强度为上述相同测定条件下的甲苯的光散射强度的至少2倍以上。另外，从另一方面出发，发现下述嵌段共聚物能够提高有效性和/或安全性，从而完成了本发明，该嵌段共聚物为聚乙二醇链段与结合有生理活性物质的聚氨基酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，该嵌段共聚物基于缔合性形成纳米颗粒，上述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。
即，本发明涉及下述[1]～[17]。
[1]一种嵌段共聚物，其为聚乙二醇链段与聚氨基酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，该聚氨基酸衍生物链段包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或谷氨酸衍生物，
上述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下，
在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的测定条件下，利用激光散射光度计测定的上述嵌段共聚物的1mg/mL水溶液的光散射强度为上述测定条件下的甲苯的光散射强度的至少2倍以上。
[2]一种嵌段共聚物，其为聚乙二醇链段与聚氨基酸衍生物链段连结而成的具有纳米颗粒形成能力的嵌段共聚物，该聚氨基酸衍生物链段包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或谷氨酸衍生物，
上述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。
[3]如上述[1]或[2]所述的嵌段共聚物，其中，上述嵌段共聚物中的上述聚乙二醇链段的质量含量为10质量％以上80质量％以下。
[4]如上述[3]所述的嵌段共聚物，其中，上述嵌段共聚物中的上述聚乙二醇链段的质量含量为30质量％以上65质量％以下。
[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的嵌段共聚物，其中，上述聚乙二醇链段的分子量为1千道尔顿～10千道尔顿。
[6]如上述[1]～[5]中任一项所述的嵌段共聚物，其中，上述嵌段共聚物中的上述具有羟基和/或氨基的生理活性物质的质量含量为10质量％以上60质量％以下。
[7]如上述[1]～[6]中任一项所述的嵌段共聚物，其中，上述嵌段共聚物由通式(1)所表示。
[化1]
[式中，R1表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，t表示20～270的整数，A表示具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，R2表示选自由氢原子、碳原子数(C1～C6)酰基和碳原子数(C1～C6)烷氧羰基组成的组中的取代基，R3表示具有羟基和/或氨基的生理活性物质的结合残基，R4表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的二烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基、荧光物质的结合残基和羟基组成的组中的1种以上的取代基，B表示结合基团，n表示1或2，x1、x2、y1、y2和z各自独立地表示0～25的整数，(x1+x2)表示1～25的整数，(x1+x2+y1+y2+z)表示3～25的整数，结合了上述R3和R4的各构成单元以及侧链羰基发生了分子内环化的构成单元是各自独立地无规排列的结构。]
[8]如上述[1]～[7]中任一项所述的嵌段共聚物，其中，具有羟基和/或氨基的生理活性物质为选自由喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、蒽环类衍生物、雷帕霉素衍生物、胞苷系代谢拮抗剂、叶酸代谢拮抗剂、嘌呤系代谢拮抗剂、氟化嘧啶系代谢拮抗剂、铂衍生物、丝裂霉素衍生物、博来霉素衍生物、长春花生物碱衍生物、鬼臼毒素衍生物、软海绵素衍生物、星形孢菌素衍生物、沙利度胺衍生物、维生素A衍生物、康普瑞汀衍生物、抗雄激素剂、抗雌激素剂、激素剂、他克莫司衍生物、类固醇衍生物、雷帕霉素衍生物、多烯系抗生素、唑系衍生物、棘白菌素系衍生物、嘧啶衍生物组成的组中的1种以上的生理活性物质。
[9]如上述[8]所述的嵌段共聚物，其中，具有羟基和/或氨基的生理活性物质为选自由喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、蒽环类衍生物、雷帕霉素衍生物、胞苷系代谢拮抗剂、叶酸代谢拮抗剂、嘌呤系代谢拮抗剂、氟化嘧啶系代谢拮抗剂、铂衍生物、丝裂霉素衍生物、博来霉素衍生物、长春花生物碱衍生物、鬼臼毒素衍生物、软海绵素衍生物、星形孢菌素衍生物、沙利度胺衍生物、维生素A衍生物、康普瑞汀衍生物、抗雄激素剂、抗雌激素剂、激素剂组成的组中的1种以上的抗肿瘤剂。
[10]如上述[7]所述的嵌段共聚物，其中，R3为通式(2)所表示的喜树碱衍生物的结合残基。
[化2]
[式中，R5表示选自由氢原子、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基和具有或不具有取代基的甲硅烷基组成的组中的1种，R6表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基。]。
[11]如上述[7]所述的嵌段共聚物，其中，R3为通式(3)所表示的间苯二酚衍生物的结合残基。
[化3]
[式中，R7表示选自由巯基、羟基、卤原子、硝基、氰基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基、羧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基、氨基甲酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种，
R8表示选自由具有或不具有取代基的碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳原子数(C1～C20)的烷基氨基和碳原子数(C1～C20)的酰基氨基组成的组中的1种，环H为选自由通式(3-1)、(3-2)和(3-3)组成的组中的杂环芳基。
[化4]
[式中，R9表示选自由巯基、羟基、氢原子、卤原子、氨基甲酰基、碳原子数(C1～C20)的烷氧羰基、氰基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)的烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种。]
[12]如上述[7]所述的嵌段共聚物，其中，R3为紫杉醇、多西他赛或卡巴他赛的结合残基。
[13]一种嵌段共聚物，其为通过使聚乙二醇链段与含有天冬氨酸和/或谷氨酸的聚氨基酸链段连结而成的嵌段共聚物与具有羟基和/或氨基的生理活性物质、以及任选的具有羟基和/或氨基的疏水性取代基利用缩合剂进行反应而得到的嵌段共聚物，
上述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下，
在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的测定条件下，利用激光散射光度计测定的上述嵌段共聚物的1mg/mL水溶液的光散射强度为上述测定条件下的甲苯的光散射强度的至少2倍以上。
[14]一种纳米颗粒，其由上述[1]～[13]中任一项所述的嵌段共聚物形成。
[15]如上述[14]所述的纳米颗粒，其中，上述纳米颗粒的体积平均粒径小于20纳米。
[16]一种药品，其以上述[1]～[13]所述的嵌段共聚物或者上述[14]或[15]所述的纳米颗粒作为有效成分。
[17]一种抗肿瘤剂，其以上述[1]～[13]所述的嵌段共聚物或者上述[14]或[15]所述的纳米颗粒作为有效成分。
发明的效果
本发明的嵌段共聚物为聚乙二醇链段与结合有生理活性物质的聚氨基酸链段连结而成的嵌段共聚物，其特征在于，该嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下，该嵌段共聚物水溶液的利用激光散射光度计测定的光散射强度为甲苯的光散射强度的至少2倍以上。
另外，从另一方面出发，本发明的嵌段共聚物为聚乙二醇链段与结合有生理活性物质的聚氨基酸衍生物链段连结而成的具有纳米颗粒形成能力的嵌段共聚物，上述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。
由本申请发明的嵌段共聚物形成的纳米颗粒具有小于公知的高分子胶束型DDS制剂的体积平均粒径，在给药至生物体内后，渗透至靶组织中，并且/或者在肾脏等中的排泄性提高。因此，本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物与公知的嵌段共聚物相比，在靶组织中具有高渗透性，因而能够使生理活性物质在广范围的靶组织中致敏，因而能够高效地发挥药理活性效果。并且/或者，由于该嵌段共聚物在肾脏等中的排泄性提高，因而血中滞留性得到控制，抑制生理活性物质对靶组织以外的正常组织的致敏，由此能够避免正常组织的损伤表现。
特别是在使用抗肿瘤剂作为生理活性物质的情况下，通过该嵌段共聚物在肿瘤组织中的渗透性的提高和/或肾排泄性的提高，能够实现抗肿瘤效果的增强和/或骨髓抑制等正常组织损伤的背离。
附图说明
图1是示出人胰腺癌BxPC3肿瘤切片中的实施例A-4和比较例A-4的组织内分布的图像。
图2是示出肾脏切片中的实施例A-4和比较例A-4的组织内分布的图像。
图3是示出人胰腺癌BxPC3肿瘤切片和肾脏切片中的实施例B-2和比较例B-2的组织内分布的图像。
图4是示出实施例B-1、比较例B-1和Ganetespib对于人结肠癌Col-5-JCK的抗肿瘤效果的结果。
图5是示出实施例B-1、比较例B-1和Ganetespib对于人结肠癌Co-3-KIST的抗肿瘤效果的结果。
图6是示出实施例B-1、比较例B-1和Ganetespib对于人乳腺癌MC-19-JCK的抗肿瘤效果的结果。
图7是示出人胰腺癌BxPC3肿瘤切片和肾脏切片中的实施例C-3、比较例C-2和比较例C-3的组织内分布的图像。
具体实施方式
本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物为聚乙二醇链段与含有天冬氨酸衍生物和/或谷氨酸衍生物的聚氨基酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，上述聚氨基酸衍生物链段包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或谷氨酸衍生物，上述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下，在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的测定条件下，利用激光散射光度计测定的上述嵌段共聚物的1mg/mL水溶液的光散射强度为上述测定条件下的甲苯的光散射强度的至少2倍以上。
另外，从另一方面出发，本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物为聚乙二醇链段与含有天冬氨酸衍生物和/或谷氨酸衍生物的聚氨基酸衍生物链段连结而成的、具有纳米颗粒形成能力的嵌段共聚物，上述聚氨基酸衍生物链段包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或谷氨酸衍生物，上述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。
即，该嵌段型共聚物是使用了下述嵌段共聚物的DDS化制剂，该嵌段共聚物以聚乙二醇链段与聚氨基酸衍生物链段通过适当的结合基团连结而成的嵌段型共聚物作为主链，并在其上结合有生理活性物质。下面，对其详细情况进行说明。
本发明的嵌段共聚物中的聚乙二醇链段是具有亚乙基氧基(CH2CH2O)单元的重复结构的链段。优选为包含亚乙基氧基单元聚合度为10～300单元、更优选聚合度为20～270单元的聚乙二醇链的链段结构。
即，该聚乙二醇链段以相当于聚乙二醇的分子量计优选为0.4千道尔顿～13千道尔顿的链段部，更优选以分子量计为0.8千道尔顿～12千道尔顿的结构部分，特别优选以分子量计为1千道尔顿～10千道尔顿。尤其优选分子量为1千道尔顿～5千道尔顿的聚乙二醇链段。
需要说明的是，本发明中所用的聚乙二醇链段的分子量采用由在制备本发明的嵌段共聚物时通过以聚乙二醇标准品为基准的GPC法测定的所使用的聚乙二醇链段结构化合物的峰值分子量求出的平均分子量。
该聚乙二醇链段的一个末端基团是用于与后述的聚氨基酸衍生物链段结合的连结基团。并且，另一个末端基团没有特别限定，可以举出氢原子、羟基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)的烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C7～C20)的芳烷基氧基等。作为该烷氧基、芳烷基氧基中的取代基，可以举出羟基、氨基、甲酰基、羧基等。另外，也可以藉由上述取代基而具备靶向分子。作为靶向分子，可以举出蛋白质、肽或叶酸等。
作为该末端基团中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)的烷氧基，可以举出直链、支链或环状的碳原子数(C1～C6)的烷氧基。可以举出例如：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、2-甲基丁氧基、新戊基氧基、1-乙基丙氧基、正己氧基、4-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、1-甲基戊氧基、3,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基、1,3-二甲基丁氧基、2,3-二甲基丁氧基、2-乙基丁氧基、环丙氧基、环戊氧基或环己氧基等。优选为碳原子数(C1～C4)的烷氧基，例如为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基等，特别优选为甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基。
作为该末端基团中的具有或不具有取代基的碳原子数(C7～C20)的芳烷基氧基，为任意1处的氢原子被芳基所取代的直链或支链烷基。可以举出例如：苄氧基、2-苯基乙氧基、4-苯基丁氧基、3-苯基丁氧基、5-苯基戊氧基、6-苯基己氧基、8-苯基辛氧基等。优选为苄氧基、4-苯基丁氧基、8-苯基辛氧基。
该聚乙二醇链段的末端基团优选为羟基或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)的烷氧基。
本发明中的聚氨基酸衍生物链段是包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或聚谷氨酸衍生物的聚氨基酸链段。即，是包含至少1单元以上的结合有上述生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或谷氨酸衍生物的聚氨基酸链段。该聚氨基酸链段可以为直链状聚氨基酸链段，也可以为藉由侧链而成的支链型结构的链段。该聚氨基酸链段优选为氨基酸以2～30单元聚合而成的链段结构。更优选为3～25单元的聚合物，尤其优选为5～20单元的聚合物。
构成该聚氨基酸链段的氨基酸没有特别限定，可以使用天然型氨基酸、合成氨基酸及其侧链修饰体中的任一种。另外，也可以使用L体、D体和外消旋体中的任一种。可以举出例如：甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸等。另外，作为侧链经修饰的氨基酸，可以举出天冬氨酸或谷氨酸的烷基酯、天冬氨酸或谷氨酸的芳烷基酯、天冬氨酸或谷氨酸的烷基酰胺、天冬氨酸或谷氨酸的芳烷基酰胺、Boc赖氨酸等烷氧羰基赖氨酸等。该聚氨基酸链段可以为这些氨基酸中的任一种，也可以多种混杂而构建链段。
由该聚氨基酸链段包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或聚谷氨酸衍生物，因而优选为由天冬氨酸和/或谷氨酸构建的聚氨基酸链段。更优选为仅由天冬氨酸构建的聚天冬氨酸链段、或者仅由谷氨酸构建的聚谷氨酸链段。即，在包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物的情况下，优选采用聚天冬氨酸链段，在包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的谷氨酸衍生物的情况下，优选采用聚谷氨酸链段。聚天冬氨酸或聚谷氨酸的聚合方式为肽键，可以为α结合体，也可以为β结合体或γ结合体，还可以为其混合物。
该聚氨基酸链段的一个末端基团为用于与上述聚乙二醇链段结合的连结基团。并且，另一个末端基团可以为N末端基团和C末端基，也可以为无保护的游离氨基和游离羧酸、以及它们的盐，还可以为N末端基团和C末端基团的适当修饰体。
作为N末端基团的修饰体，可以举出酰基酰胺型修饰体、烷氧羰基酰胺型修饰体(氨基甲酸酯型修饰体)、烷基氨基羰基酰胺型修饰体(脲型修饰体)等。另一方面，作为该C末端基团的修饰体，可以举出酯型修饰体、酰胺型修饰体、硫酯型修饰体。
该N末端基团和该C末端基团的修饰基团可以为任意的修饰基团，优选举出：藉由与N末端基团和C末端基团结合的适当的结合基团而结合的、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)的直链状、支链状或环状的烷基、具有或不具有取代基的碳原子数(C6～C18)的芳香族基团、具有或不具有取代基的碳原子数(C7～C20)的芳烷基等末端修饰基团。
即，N末端基团优选为适当的酰基酰胺型修饰体或烷氧羰基酰胺型修饰体(氨基甲酸酯型修饰体)，优选为藉由羰基或羰氧基而结合的、上述具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)的直链状、支链状或环状的烷基、具有或不具有取代基的碳原子数(C6～C18)的芳香族基团、具有或不具有取代基的碳原子数(C7～C20)的芳烷基。
另一方面，作为C末端基团，优选为适当的酰胺型取代基或酯型取代基，优选为藉由酰胺基或酯基而结合的、上述具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)的直链状、支链状或环状的烷基、具有或不具有取代基的碳原子数(C6～C18)的芳香族基团、具有或不具有取代基的碳原子数(C7～C20)的芳烷基。
作为该末端基团中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)的直链状、支链状或环状的烷基，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、环己基等。
作为该末端基团中的具有或不具有取代基的碳原子数(C6～C18)芳香族基团，可以举出苯基、吡啶基、萘基等。
作为该末端基团中的具有或不具有取代基的碳原子数(C7～C20)的芳烷基，为任意一处的氢原子被芳基所取代的直链或支链烷基。可以举出例如苄基、2-苯基乙基、4-苯基丁基、8-苯基辛基等。
该聚氨基酸链段的该末端基团优选为基于N末端基团和C末端基团的修饰体。
本发明为聚氨基酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，该聚氨基酸衍生物链段包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或聚谷氨酸衍生物。该具有羟基和/或氨基的生理活性物质只要是具有羟基和/或氨基作为藉由酯键或酰胺键进行结合的结合性官能团的生理活性物质，就可以没有特别限定地应用。另外，只要是包含生理活性物质的物质即可，可以通过将该生理活性物质进行衍生物化或前药化而引入羟基和/或氨基，从而作为该具有羟基和/或氨基的生理活性物质应用。
本发明是使用嵌段共聚物作为生理活性物质载体的技术，是能够应用于所有物质而不会因所使用的生理活性物质的药理活性功能、化学结构和物性而受到特别影响的通用性高的技术。因此，本发明不限于应用于这些疾病治疗的生理活性物质，只要是具有结合性的羟基和/或氨基的生理活性物质，则可以应用于任何物质。
本发明的嵌段共聚物的特征在于组织渗透性提高，因而优选用于局部性组织疾病的治疗。作为这样的疾病，可以举出恶性肿瘤疾病、炎性疾病、传染病等。因此，本发明中的该生理活性物质优选应用用于治疗这些疾病的药品的有效成分或药物有效成分候选化合物，或者优选应用将它们衍生物化或前药化而得到的有效成分。下面，举出可应用于本发明的生理活性物质的例子，但不限定于这些。
作为用于恶性肿瘤疾病的生理活性物质，可以举出：7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、9-氨基喜树碱等喜树碱衍生物；紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛等紫杉烷衍生物；ganetespib、luminespib等具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物；多柔比星、表柔比星、氨柔比星、道诺霉素、伊达比星、吡柔比星等蒽环类衍生物；西罗莫司、依维莫司、替西罗莫司等雷帕霉素衍生物；吉西他滨、阿糖胞苷、依诺他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、乙炔基胞苷、氮杂胞苷、地西他滨等胞苷系代谢拮抗剂；甲氨蝶呤、培美曲塞、左亚叶酸盐、亚叶酸盐等叶酸代谢拮抗剂；氟达拉滨、奈拉滨、喷司他丁、克拉屈滨等嘌呤系代谢拮抗剂；去氧氟尿苷、卡培他滨、替加氟、氟尿嘧啶、卡莫氟等氟化嘧啶系代谢拮抗剂；顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂等含铂化合物；丝裂霉素C等丝裂霉素衍生物；博来霉素、Libromycin等博来霉素衍生物；长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨等长春花生物碱衍生物；依托泊苷、替尼泊苷等鬼臼毒素衍生物；艾日布林等软海绵素衍生物；蝴蝶霉素、UCN-01等星形孢菌素衍生物；来那度胺、泊马度胺等沙利度胺衍生物；维甲酸、他米巴罗汀等维生素A衍生物；硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米等蛋白酶体抑制剂；康普瑞汀A4等康普瑞汀衍生物；比尼替尼(binimetinib)、考比替尼、曲美替尼等MEK抑制剂；dinaciclib、夫拉平度、帕博西尼等CDK抑制剂；达拉非尼、索拉非尼、维罗非尼等Raf激酶抑制剂；伏立诺他、贝利司他、帕比司他、罗米地辛等HDAC抑制剂；细胞松弛素、拉春库林、鬼笔环肽等肌动蛋白聚合抑制剂；维利帕尼、鲁卡帕尼、奥拉帕尼等PARP抑制剂；克唑替尼、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达沙替尼、博舒替尼、凡德他尼、舒尼替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、乐伐替尼、拉帕替尼、尼达尼布、尼罗替尼、色瑞替尼、艾乐替尼、鲁索利替尼、克唑替尼、依鲁替尼等酪氨酸激酶抑制剂；苯达莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、白消安、美法仑等氮芥系烷基化剂；尼莫司汀、雷莫司汀、洛莫司汀等亚硝基脲系烷基化剂；达卡巴嗪、替莫唑胺、丙卡巴肼、噻替哌等烷基化剂；阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、法倔唑等芳香化酶抑制剂；羟基氟他胺、氟他胺、比卡鲁胺、恩杂鲁胺等抗雄激素剂；阿比特龙等CYP17(裂解酶)抑制剂；他莫昔芬、托瑞米芬等抗雌激素剂；雌莫司汀、黄体酮、米托坦、甲羟孕酮等激素剂。
作为用于炎性疾病的生理活性物质，可以举出：他克莫司等他克莫司衍生物；地塞米松、泼尼松龙等类固醇衍生物；西罗莫司、依维莫司、替西罗莫司等雷帕霉素衍生物；环孢菌素、芬戈莫德、硫唑嘌呤、咪唑立宾、霉酚酸酯、胍立莫司等免疫抑制剂；二氟尼柳、噻拉米特等NSAIDs等。
作为用于传染病的生理活性物质，可以举出：两性霉素B、制霉菌素等多烯系抗生素；氟康唑、伏立康唑等唑系衍生物；米卡芬净等棘白菌素系衍生物；氟胞嘧啶等嘧啶衍生物等抗真菌剂；阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦等抗病毒剂；扎那米韦、奥司他韦、拉尼娜米韦等抗病毒剂等。
本发明是使用嵌段共聚物作为生理活性物质载体的技术，是能够应用于所有物质而不会因所使用的生理活性物质的药理活性功能、化学结构和物性而受到特别影响的通用性高的技术。因此，本发明不限于应用于这些疾病治疗的生理活性物质，只要是具有结合性的羟基和/或氨基的生理活性物质，则可以应用于任何物质。
作为本发明所涉及的具有羟基和/或氨基的生理活性物质，更优选不进行衍生物化或前药化而直接使用具有羟基和/或氨基的公知的药物有效成分或药物有效成分候选化合物。作为这样的生理活性物质，可以举出下述化合物。
作为用于恶性肿瘤疾病的生理活性物质，可以举出：7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、9-氨基喜树碱等喜树碱衍生物；紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛等紫杉烷衍生物；ganetespib、luminespib等具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物；多柔比星、表柔比星、氨柔比星、道诺霉素、伊达比星、吡柔比星等蒽环类衍生物；西罗莫司、依维莫司、替西罗莫司等雷帕霉素衍生物；吉西他滨、阿糖胞苷、依诺他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、乙炔基胞苷、氮杂胞苷、地西他滨等胞苷系代谢拮抗剂；甲氨蝶呤、培美曲塞、左亚叶酸盐、亚叶酸盐等叶酸代谢拮抗剂；氟达拉滨、奈拉滨、喷司他丁、克拉屈滨等嘌呤系代谢拮抗剂；去氧氟尿苷、卡培他滨等氟化嘧啶系代谢拮抗剂；顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂等含铂化合物；丝裂霉素C等丝裂霉素衍生物；博来霉素、Libromycin等博来霉素衍生物；长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨等长春花生物碱衍生物；依托泊苷、替尼泊苷等鬼臼毒素衍生物；艾日布林等软海绵素衍生物；蝴蝶霉素、UCN-01等星形孢菌素衍生物；来那度胺、泊马度胺等沙利度胺衍生物；维甲酸等维生素A衍生物；硼替佐米、伊沙佐米等蛋白酶体抑制剂；康普瑞汀A4等康普瑞汀衍生物；比尼替尼(binimetinib)、考比替尼等MEK抑制剂；dinaciclib、夫拉平度等CDK抑制剂；达拉非尼等Raf激酶抑制剂；伏立诺他、贝利司他、帕比司他等HDAC抑制剂；细胞松弛素、拉春库林、鬼笔环肽等肌动蛋白聚合抑制剂；博舒替尼、克唑替尼、依鲁替尼等酪氨酸激酶抑制剂；美法仑等氮芥系烷基化剂；尼莫司汀、雷莫司汀等亚硝基脲系烷基化剂；达卡巴嗪、丙卡巴肼等烷基化剂；羟基氟他胺、比卡鲁胺等抗雄激素剂等CYP17(裂解酶)抑制剂；他莫昔芬等抗雌激素剂；雌莫司汀等激素剂。
作为用于炎性疾病的生理活性物质，可以举出：他克莫司等他克莫司衍生物；地塞米松、泼尼松龙等类固醇衍生物；西罗莫司、依维莫司、替西罗莫司等雷帕霉素衍生物；环孢菌素、芬戈莫德、咪唑立宾、霉酚酸酯、胍立莫司等免疫抑制剂；二氟尼柳、噻拉米特等NSAIDs等。
作为用于传染病的生理活性物质，可以举出：两性霉素B、制霉菌素等多烯系抗生素；氟康唑、伏立康唑等唑系衍生物；米卡芬净等棘白菌素系衍生物；氟胞嘧啶等嘧啶衍生物等抗真菌剂；阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦等抗病毒剂；扎那米韦、奥司他韦、拉尼娜米韦等抗病毒剂等。
本发明具有下述性能：对于病变靶组织的迁移性和渗透性提高，同时由肾脏等的排泄性提高。因此，抑制生理活性物质对病变靶组织以外的正常组织的致敏，起到减轻副作用的效果。因此，优选应用被用于存在减轻对正常组织的副作用的课题的疾病的生理活性物质，优选使用针对恶性肿瘤疾病的抗肿瘤剂、针对炎性疾病的药物。应用了抗肿瘤剂、炎性疾病药物作为生理活性物质的该嵌段共聚物向肿瘤、炎症部位等组织的迁移性和向组织内部的渗透性提高，因而起到抗肿瘤效果或抗炎症作用增强的效果。另外，由于还具备从肾脏等的排出性，因而在高分子化DDS制剂中观察到的体内滞留性得到控制，能够抑制所不希望的向正常组织的迁移，能够实现副作用的减轻。
作为用于恶性肿瘤疾病的生理活性物质，优选上述的喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、蒽环类衍生物、雷帕霉素衍生物、胞苷系代谢拮抗剂、叶酸代谢拮抗剂、嘌呤系代谢拮抗剂、氟化嘧啶系代谢拮抗剂、含铂化合物、丝裂霉素衍生物、博来霉素衍生物、长春花生物碱衍生物、鬼臼毒素衍生物、软海绵素衍生物、星形孢菌素衍生物、沙利度胺衍生物、维生素A衍生物、蛋白酶体抑制剂、康普瑞汀衍生物、MEK抑制剂、CDK抑制剂、Raf激酶抑制剂、HDAC抑制剂、肌动蛋白聚合抑制剂、PARP抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、氮芥系烷基化剂、亚硝基脲系烷基化剂、烷基化剂、芳香化酶抑制剂、抗雄激素剂、CYP17(裂解酶)抑制剂、抗雌激素剂、激素剂。更优选喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、蒽环类衍生物、雷帕霉素衍生物、胞苷系代谢拮抗剂、叶酸代谢拮抗剂等。特别优选为喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、雷帕霉素衍生物。
作为用于炎性疾病的生理活性物质，优选他克莫司衍生物、类固醇衍生物、雷帕霉素衍生物、免疫抑制剂、NSAIDs等。特别优选他克莫司衍生物、类固醇衍生物、雷帕霉素衍生物。
上述生理活性物质藉由任意的结合基团与天冬氨酸或谷氨酸的侧链羧基结合。生理活性物质利用羟基和/或氨基藉由酯键或酰胺键进行结合，该结合需要具有下述结合物性：该嵌段共聚物被给药至生物体内后，慢慢地以水解方式断裂，使该生理活性物质游离。
由于该生理活性物质具有羟基和/或氨基，因而可以举出将其作为结合性官能团，利用酯键或酰胺键与该侧链羧基进行结合的方式。这种情况下，为不藉由上述任意的结合基团的结合方式。优选的是，使用具有羟基的生理活性物质，与侧链羧基形成酯键的方式。作为具有氨基键的生理活性物质，优选使用胞苷系代谢拮抗剂等具有芳香族氨基的生理活性物质，优选该芳香族氨基与侧链羧基形成了酰胺键的方式。
作为使上述生理活性物质与天冬氨酸或谷氨酸的侧链羧基结合的任意的结合基团，优选将该生理活性物质的羟基和/或氨基作为结合性官能团发挥功能而能够利用酯键或酰胺键进行结合，因此，只要是一个末端基团为羧基、另一个末端基团具备能够与上述天冬氨酸或谷氨酸的侧链羧基结合的羟基、氨基、巯基的适当的连结基团，就可以没有特别限定地使用。作为该连结基团，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链或环状的碳原子数(C1～C8)亚烷基、具有或不具有取代基的碳原子数(C6～C12)的芳香族基团等。
在上述结合基团是以具有或不具有取代基的亚甲基作为该连结基团的上述结合基团的情况下，也可以称为氨基酸衍生物或乙醇酸衍生物。
在使用氨基酸衍生物作为该结合基团的情况下，可以为天然型氨基酸或合成氨基酸及其侧链修饰体中的任一种。另外，可以使用L体、D体和外消旋体中的任一种。可以举出例如甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸等。另外，作为侧链经修饰的氨基酸，可以举出天冬氨酸或谷氨酸的烷基酯、天冬氨酸或谷氨酸的芳烷基酯、天冬氨酸或谷氨酸的烷基酰胺、天冬氨酸或谷氨酸的芳烷基酰胺、Boc赖氨酸等烷氧羰基赖氨酸等。
在使用乙醇酸衍生物作为该结合基团的情况下，可以举出例如乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等。在使用多元羧酸的情况下，优选在一个羧基上结合上述生理活性物质，另一个羧基为酯衍生物或酰胺衍生物。
上述结合基团可以为单一种类的结合基团，也可以两种以上的结合基团混杂。
本发明中的聚氨基酸衍生物链段也可以包含在侧链羧基上未结合有上述生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或聚谷氨酸衍生物单元。该情况下，该侧链羧基可以是游离酸的形式，也可以是作为药品所允许的羧酸盐的形式。作为上述羧酸盐，可以举出锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐等。
另外，该聚氨基酸衍生物链段中的该天冬氨酸衍生物和/或聚谷氨酸衍生物单元也可以为具有适当的取代基的酯衍生物和/或酰胺衍生物。这些取代基可以出于控制本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物的物性的目的而任意地引入。例如，通过引入疏水性基团，能够提高该生理活性物质结合嵌段共聚物的聚氨基酸衍生物链段的疏水性。另一方面，通过引入具备氨基、羧基、羟基等可形成盐的离子性官能团的亲水性的取代基，能够提高该生理活性物质结合嵌段共聚物的聚氨基酸链段的亲水性。
该天冬氨酸衍生物和/或聚谷氨酸衍生物单元的酯衍生物和/或酰胺衍生物优选为例如选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C30)烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基组成的组中的1种以上的取代基。
作为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)烷氧基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C30)烷氧基。即，侧链羧基形成了酯型衍生物。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为该碳原子数(C1～C30)烷氧基，可以举出例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、环己氧基、苄氧基、4-苯基丁氧基、辛氧基、癸氧基、十二烷基氧基、十四烷基氧基、十六烷基氧基、十八烷基氧基、二十烷基氧基、二十二烷基氧基、二十四烷基氧基、二十六烷基氧基、二十八烷基氧基、三十烷基氧基等。
作为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)烷基氨基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C30)烷基氨基。即，侧链羧基形成了烷基酰胺型衍生物。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为该碳原子数(C1～C30)烷基氨基，可以举出例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨基、叔丁基氨基、环己基氨基、苄基氨基、4-苯基丁基氨基、辛基氨基、癸基氨基、十二烷基氨基、十四烷基氨基、十六烷基氨基、十八烷基氨基、二十烷基氨基、二十二烷基氨基、二十四烷基氨基、二十六烷基氨基、二十八烷基氨基、三十烷基氨基等。
该烷基氨基还包含对羧基进行了保护的氨基酸或具有氨基的荧光物质的结合残基。作为该对羧基进行了保护的氨基酸，可以使用例如甘氨酸甲酯、甘氨酸苄酯、β-丙氨酸甲酯、β-丙氨酸苄酯、丙氨酸甲酯、亮氨酸甲酯、苯丙氨酸甲酯等。
作为该具有氨基的荧光物质，还包含例如2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮、BODIPY(注册商标)TR尸胺、BODIPY(注册商标)FL乙二胺、AlexaFluor(注册商标)594尸胺、Texas Red(注册商标)尸胺、ATTO 594胺等，包含它们的酰胺键残基。
作为具有或不具有取代基的二(C1～C30)烷基氨基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的二(C1～C30)烷基氨基。即，侧链羧基形成了二烷基酰胺型衍生物。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为该二(C1～C30)烷基氨基，可以举出例如二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基氨基、N-苄基-N-甲基氨基、二辛基氨基、二壬基氨基、二癸基氨基、二(十二烷基)氨基、二(十四烷基)氨基、二(十六烷基)氨基、二(十八烷基)氨基、二(二十烷基)氨基等。
作为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基，为具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的(C1～C8)烷基进行了取代的脲型衍生物。该烷基可以为相同种类，也可以为不同种类。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。在具有取代基的情况下，优选二烷基氨基。作为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基，例如为甲基氨基羰基甲基氨基、乙基氨基羰基乙基氨基、异丙基氨基羰基异丙基氨基、环己基氨基羰基环己基氨基、乙基氨基羰基(3-二甲基氨基丙基)氨基、(3-二甲基氨基丙基)氨基羰基乙基氨基等。
该天冬氨酸衍生物和/或聚谷氨酸衍生物单元的酯衍生物和/或酰胺衍生物可以为相同种类的衍生物，也可以为不同种类的衍生物混杂的方式。另外，侧链羧基可以为游离酸或以其盐的方式混杂。
本发明的嵌段共聚物中，聚乙二醇链段与聚氨基酸衍生物链段进行了连结。作为该连结方式，只要是通过化学键合将2个聚合物链段连结的基团就没有特别限定，只要是具备能够与聚乙二醇末端基团和聚氨基酸衍生物的末端基团分别结合的官能团的连结基团即可。优选为末端基团具有结合官能团的(C1～6)亚烷基。与聚乙二醇链段的结合方式优选为利用聚亚乙基氧基：(CH2CH2O)的末端氧原子而成的醚键，与聚氨基酸衍生物链段的结合方式优选为酰胺键或酯键。即，作为连结基团，优选-(CH2)s-NH-基(s为1～6的整数)或-(CH2)s-CO-基(s为1～6的整数)。
本发明的嵌段共聚物的特征在于，分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。关于该嵌段共聚物的分子量，采用将其构成部分的各构成分子量相加得到的计算值作为该嵌段共聚物的分子量。即，将下述分子量相加得到的计算值作为该分子量：(1)聚乙二醇链段的分子量；(2)聚氨基酸衍生物链段的主链部分的分子量；(3)将生理活性物质的结合残基分子量乘以其结合数而得到的生理活性物质的总分子量；以及(4)将生理活性物质以外的结合基团残基分子量乘以其结合数而得到的该结合基团的总分子量。因此，只要没有特别的理由，在该嵌段共聚物的分子量计算中不考虑该嵌段共聚物的两末端基团或构建嵌段共聚物的连结基团。
需要说明的是，该嵌段共聚物的分子量可以是以千道尔顿单位的精度规定的分子量。因此，上述各构成部分的分析方法只要是在该聚氨基酸衍生物的以千道尔顿单位计的分子量测定中具有充分精度的分析方法就没有特别限定，可以适当选择各种分析方法。下面，举出各构成部分中的优选分析方法。
上述(1)聚乙二醇链段的分子量是构建聚乙二醇链段的聚乙二醇化合物的分子量测定值，采用由通过以聚乙二醇标准品为基准的GPC法测定的峰值分子量求出的平均分子量。
上述(2)聚氨基酸衍生物链段的主链部分的分子量是将该链段的聚合单体单元的平均分子量乘以其平均聚合数而得到的计算值。该聚合数可以使用由通过中和滴定对聚氨基酸的侧链羧基进行定量的方法计算出的聚合数、或由1H-NMR的积分值计算出的聚合数。优选使用中和滴定法。
上述(3)生理活性物质的总分子量是将该生理活性物质的分子量乘以其结合数而得到的计算值。该结合数可以通过下述方法求出：利用HPLC计量反应液中的未反应的该生理活性物质而算出的方法；使该生理活性物质从该生理活性物质结合嵌段共聚物上断裂，对游离的生理活性物质或来自其的片段分子进行定量分析的方法。
上述(4)的生理活性物质以外的结合基团的总分子量是将该结合基团残基分子量乘以其结合数而得到的计算值。该结合基团的结合数可以通过下述方法求出：利用HPLC计量反应液中的未反应的该结合残基而算出的方法；在由聚氨基酸水解后进行定量分析。另外，也可以由1H-NMR的积分值算出。
本发明的嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。在上述分子量小于2千道尔顿的情况下，表明该生理活性物质结合嵌段共聚物不具有充分的纳米颗粒形成能力，无法得到对靶组织的充分的渗透性。因此，无法有效地发挥出生理活性物质的药理作用效果。另一方面，在上述分子量大于15千道尔顿的情况下，该嵌段共聚物的肾脏排泄性受到抑制，与之相伴体内滞留性提高。因此，可能发生生理活性物质对病变靶组织以外的正常组织的致敏，因此正常组织可能表现出损伤。例如，在使用细胞毒性的生理活性物质的情况下，考虑有与脊髓损伤相伴的血液毒性的持久化。因此，上述分子量需要控制为15千道尔顿以下。该嵌段共聚物的分子量优选为3千道尔顿以上12千道尔顿以下、进一步优选为3千道尔顿以上10千道尔顿以下。
本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物具有在水溶液中显示出自缔合性的物性。即，为下述物性：通过使用激光的动态光散射法对该生理活性物质结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液进行粒度分布测定时，该生理活性物质结合嵌段共聚物作为以体积平均粒径计为约几纳米～约20纳米的纳米颗粒被计测。本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物优选具有在1mg/mL水溶液中最大为小于20纳米的纳米颗粒的物性。这种情况下，是在基于纯水的水溶液中的粒度分布测定。优选特征在于，通过基于使用激光的动态光散射法的粒度分布测定法，以体积平均粒径小于20纳米被计测，更优选具有作为3～15纳米的纳米颗粒被计测的物性。
本发明中的体积平均粒径是指在利用例如Particle Sizing System公司制造的ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(分析方法：NICOMP法)或者Malvern公司制造的粒径·ζ电位测定装置Zetasizer Nano ZS(分析方法：NNLS法)测定得到的体积分布内存在的比例最多的峰的粒径。
本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物是亲水性的聚乙二醇链段与通过生理活性物质或其他疏水性侧链而显示出疏水性的聚氨基酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，因而认为，在水溶液中，多个该嵌段共聚物彼此的聚氨基酸衍生物链段基于疏水性相互作用而发生缔合。结果，推测形成核-壳结构的胶束状缔合体，其以聚氨基酸衍生物链段为内核(核部)，亲水性的聚乙二醇链段覆盖内核的周围而形成了外壳层(壳部)，从而作为上述纳米颗粒被观测到。
为了增强生理活性物质的药理作用效果和/或减轻副作用，本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物需要具有在水溶液中形成纳米颗粒的物性。
作为本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物的纳米颗粒形成性的指标，使用利用激光得到的光散射强度是有效的。即，可以将激光散射强度作为指标来确认该生理活性物质结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。此时，下述方法是有效的：将甲苯作为光散射强度标准试样，以相对于甲苯的相对强度作为指标，确认该生理活性物质结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。
关于本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物，其1mg/mL水溶液的激光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计至少为2倍以上。
在上述相对光散射强度小于2倍的情况下，表明该生理活性物质结合嵌段共聚物不具有充分的纳米颗粒形成性，无法得到对靶组织的充分的渗透性。因此，无法有效地发挥出生理活性物质的药理作用效果。本发明中，相对光散射强度的数值是具有纳米颗粒形成能力的指标，只要光散射强度相对于甲苯为2倍以上即可，对其上限没有限制。即，即使在上述相对光散射强度大于100倍的情况下，也可以说该嵌段共聚物具有充分的纳米颗粒形成能力。但是，在光散射强度大于100倍的情况下，认为该嵌段共聚物可能不具有所期望的排泄性。该情况下，由于该嵌段共聚物的体内滞留性升高，因而可能发生生理活性物质对病变靶组织以外的正常组织的致敏，因此正常组织可能表现出损伤。因此，将上述相对光散射强度控制为100倍以下是妥当的。
关于本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物，该水溶液的光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计优选为2倍以上50倍以下，更优选为2倍以上30倍以下。
关于本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物的纳米颗粒形成性分析中的利用激光的光散射强度的测定方法，将该生理活性物质结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液作为测定试样，在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的条件下利用激光散射光度计进行测定的方法是适当的。作为测定设备，可以举出例如大塚电子公司制造的动态光散射光度计DLS-8000DL(测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm、ND滤光片2.5％、PH1：开启(OPEN)、PH2：狭缝(SLIT))。
关于光散射强度测定，是将利用不含微粒的纯水制备的水溶液作为分析试样而得到的分析值。该水溶液可以在溶液制备中任选地通过超声波照射而进行溶解。所制备的水溶液优选为为了进一步去除亚微米级的微粒而实施了过滤处理的水溶液。
需要说明的是，作为光散射强度测定的标准物质使用的甲苯只要是试剂级的纯度，就可以没有特别限定地使用。优选使用进行了在光散射分析的试样制备中通常进行的预处理过滤的甲苯。
本发明的嵌段共聚物优选聚乙二醇链段的质量含量为10质量％以上80质量％以下。即，该嵌段共聚物的分子量中的与聚乙二醇链段相当的分子量所占的比例优选为10质量％～80质量％。在聚乙二醇链段的质量含量少于10质量％的情况下，水溶性显著降低，有可能无法在水溶液中通过自缔合而形成纳米颗粒。另一方面，在聚乙二醇链段的质量含量多于80质量％的情况下，担负自缔合性的聚氨基酸衍生物链段的构成减少，因此基于疏水性相互作用的纳米颗粒形成性可能降低。为了实现充分的药效和副作用的减轻，优选对聚乙二醇链段的质量含量进行设定。
上述聚乙二醇链段的质量含量更优选为20质量％以上70质量％以下。尤其优选为30质量％以上65质量％以下。
本发明的嵌段共聚物优选具有羟基和/或氨基的生理活性物质的质量含量为10质量％以上60质量％以下。在该生理活性物质含量低于10质量％的情况下，用于显示药理活性的有效成分减少，因而药效可能会降低。另一方面，在该生理活性物质的含量多于60质量％的情况下，该嵌段共聚物的自缔合性的平衡显著降低，有可能无法发挥出所期望的纳米颗粒形成性。
该药理活性物质的质量含量优选为10质量％以上50质量％以下、进一步优选为10质量％以上40质量％以下。
本发明的嵌段共聚物优选为通式(1)所表示的嵌段共聚物。
[化5]
[式中，R1表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，t表示20～270的整数，A表示具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，R2表示选自由氢原子、碳原子数(C1～C6)酰基和碳原子数(C1～C6)烷氧羰基组成的组中的取代基，R3表示具有羟基和/或氨基的生理活性物质的结合残基，R4表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的二烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基、疏水性荧光物质的结合残基和羟基组成的组中的1种以上的取代基，B表示结合基团，n表示1或2，x1、x2、y1、y2和z各自独立地表示0～25的整数，(x1+x2)表示1～25的整数，(x1+x2+y1+y2+z)表示3～25的整数，结合了上述R3和R4的各构成单元以及侧链羰基发生了分子内环化的构成单元是各自独立地无规排列的结构。]
上述R1中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷基等。可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、环戊基、正己基、环己基等。
上述具有或不具有的取代基可以举出卤原子、硝基、氰基、羟基、巯基、碳环芳基或杂环芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、烷氧基、芳氧基、酰基氧基、烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、取代或无取代氨基、酰基氨基、烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、酰基、羧基、烷氧羰基、氨基甲酰基或甲硅烷基等。芳香环上的取代位置可以为邻位、间位或对位。
作为该R1，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、苄基、2,2-二甲氧基乙基、2,2-二乙氧基乙基、2-甲酰基乙基。特别是更优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。
通式(1)的t表示聚乙二醇链段中的亚乙基氧基的聚合数。该t为20～270的整数。即，作为该聚乙二醇链段的分子量，为0.8千道尔顿～12千道尔顿。
若该t小于20，则所得到的结合有生理活性物质的嵌段共聚物不具备充分的水溶性，并且有可能无法发挥所期望的体内动力学。另一方面，在该t大于270的情况下，担负相对疏水性的聚氨基酸衍生物链段的含量降低，因而有可能无法得到所期望的自缔合性物性，无法发挥与之相伴的体内动力学。该t优选为22～230的整数、更优选为30～180的整数。即，作为该聚乙二醇链段的分子量，优选为1千道尔顿～10千道尔顿、更优选为1.3千道尔顿～8千道尔顿。
作为上述A中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，可以举出亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚正丁基等。具有或不具有的取代基可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。
作为该A，特别是更优选亚乙基、亚正丙基。
作为上述R2中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)酰基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)酰基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R2的该碳原子数(C1～C6)酰基，可以举出例如甲酰基、乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、丙酰基、新戊酰基、苄基羰基、苯乙基羰基等。更优选具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C4)酰基，更优选乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基。
作为上述R2中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R2的该碳原子数(C1～C6)烷氧羰基，可以举出例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基等。
上述R3为具有羟基和/或氨基的生理活性物质的结合残基。即，该羟基和/或氨基为结合性官能团，残基表示从其中除去了氢原子后的残基。该具有羟基和/或氨基的生理活性物质可以没有特别限定地使用。但是，由于本发明的目的是作为药品使用，因而优选使用药品的有效成分，优选使用具有羟基和/或氨基的公知的药物有效成分或者药物有效成分候选化合物。另外，作为该具有羟基和/或氨基的生理活性物质，只要是包含公知的药物有效成分或药物有效成分候选化合物的物质就可以没有特别限定地应用。即，可以通过将该药物有效成分或其候选化合物进行衍生物化或前药化而引入羟基和/或氨基，从而作为该具有羟基和/或氨基的生理活性物质应用。
本发明的嵌段共聚物的特征在于组织渗透性提高，因而优选用于局部性组织疾病的治疗。作为这样的疾病，可以举出恶性肿瘤疾病、炎性疾病、传染病等。因此，本发明中的该生理活性物质优选应用用于治疗这些疾病的药品的有效成分。
作为用于恶性肿瘤疾病的生理活性物质，可以举出：7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、9-氨基喜树碱等喜树碱衍生物；紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛等紫杉烷衍生物；多柔比星、表柔比星、氨柔比星、道诺霉素、伊达比星、吡柔比星等蒽环类衍生物；西罗莫司、依维莫司、替西罗莫司等雷帕霉素衍生物；吉西他滨、阿糖胞苷、依诺他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、乙炔基胞苷、氮杂胞苷、地西他滨等胞苷系代谢拮抗剂；甲氨蝶呤、培美曲塞、左亚叶酸盐、亚叶酸盐等叶酸代谢拮抗剂；氟达拉滨、奈拉滨、喷司他丁、克拉屈滨等嘌呤系代谢拮抗剂；去氧氟尿苷、卡培他滨、替加氟、氟尿嘧啶、卡莫氟等氟化嘧啶系代谢拮抗剂；顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂等含铂化合物；ganetespib、luminespib等具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物；丝裂霉素C等丝裂霉素衍生物；博来霉素、Libromycin等博来霉素衍生物；长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨等长春花生物碱衍生物；依托泊苷、替尼泊苷等鬼臼毒素衍生物；艾日布林等软海绵素衍生物；蝴蝶霉素、UCN-01等星形孢菌素衍生物；来那度胺、泊马度胺等沙利度胺衍生物；维甲酸、他米巴罗汀等维生素A衍生物；硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米等蛋白酶体抑制剂；康普瑞汀A4等康普瑞汀衍生物；比尼替尼(binimetinib)、考比替尼、曲美替尼等MEK抑制剂；dinaciclib、夫拉平度、帕博西尼等CDK抑制剂；达拉非尼、索拉非尼、维罗非尼等Raf激酶抑制剂；伏立诺他、贝利司他、帕比司他、罗米地辛等HDAC抑制剂；细胞松弛素、拉春库林、鬼笔环肽等肌动蛋白聚合抑制剂；维利帕尼、鲁卡帕尼、奥拉帕尼等PARP抑制剂；克唑替尼、伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达沙替尼、博舒替尼、凡德他尼、舒尼替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、乐伐替尼、拉帕替尼、尼达尼布、尼罗替尼、色瑞替尼、艾乐替尼、鲁索利替尼、克唑替尼、依鲁替尼等酪氨酸激酶抑制剂；苯达莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、白消安、美法仑等氮芥系烷基化剂；尼莫司汀、雷莫司汀、洛莫司汀等亚硝基脲系烷基化剂；达卡巴嗪、替莫唑胺、丙卡巴肼、噻替哌等烷基化剂；阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、法倔唑等芳香化酶抑制剂；羟基氟他胺、氟他胺、比卡鲁胺、恩杂鲁胺等抗雄激素剂；阿比特龙等CYP17(裂解酶)抑制剂；他莫昔芬、托瑞米芬等抗雌激素剂；雌莫司汀、黄体酮、米托坦、甲羟孕酮等激素剂。
作为用于炎性疾病的生理活性物质，可以举出：他克莫司等他克莫司衍生物；地塞米松、泼尼松龙等类固醇衍生物；西罗莫司、依维莫司、替西罗莫司等雷帕霉素衍生物；环孢菌素、芬戈莫德、硫唑嘌呤、咪唑立宾、霉酚酸酯、胍立莫司等免疫抑制剂；二氟尼柳、噻拉米特等NSAIDs等。
作为用于传染病的生理活性物质，可以举出：两性霉素B、制霉菌素等多烯系抗生素；氟康唑、伏立康唑等唑系衍生物；米卡芬净等棘白菌素系衍生物；氟胞嘧啶等嘧啶衍生物等抗真菌剂；阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦等抗病毒剂；扎那米韦、奥司他韦、拉尼娜米韦等抗病毒剂等。
本发明是使用嵌段共聚物作为生理活性物质载体的技术，是能够应用于所有物质而不会因所使用的生理活性物质的药理活性功能、化学结构和物性而受到特别影响的通用性高的技术。因此，本发明不限于应用于这些疾病治疗的生理活性物质，只要是具有结合性的羟基和/或氨基的生理活性物质，则可以应用于任何物质。
作为本发明所涉及的具有羟基和/或氨基的生理活性物质，更优选为不进行衍生物化或前药化而具有羟基和/或氨基的公知的药物有效成分或者药物有效成分候选化合物。
作为用于恶性肿瘤疾病的生理活性物质，可以举出：7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、9-氨基喜树碱等喜树碱衍生物；紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛等紫杉烷衍生物；多柔比星、表柔比星、氨柔比星、道诺霉素、伊达比星、吡柔比星等蒽环类衍生物；西罗莫司、依维莫司、替西罗莫司等雷帕霉素衍生物；吉西他滨、阿糖胞苷、依诺他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、乙炔基胞苷、氮杂胞苷、地西他滨等胞苷系代谢拮抗剂；甲氨蝶呤、培美曲塞、左亚叶酸盐、亚叶酸盐等叶酸代谢拮抗剂；氟达拉滨、奈拉滨、喷司他丁、克拉屈滨等嘌呤系代谢拮抗剂；去氧氟尿苷、卡培他滨等氟化嘧啶系代谢拮抗剂；顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂等含铂化合物；ganetespib、luminespib等具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物；丝裂霉素C等丝裂霉素衍生物；博来霉素、Libromycin等博来霉素衍生物；长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨等长春花生物碱衍生物；依托泊苷、替尼泊苷等鬼臼毒素衍生物；艾日布林等软海绵素衍生物；蝴蝶霉素、UCN-01等星形孢菌素衍生物；来那度胺、泊马度胺等沙利度胺衍生物；维甲酸等维生素A衍生物；硼替佐米、伊沙佐米等蛋白酶体抑制剂；康普瑞汀A4等康普瑞汀衍生物；比尼替尼(binimetinib)、考比替尼等MEK抑制剂；dinaciclib、夫拉平度等CDK抑制剂；达拉非尼等Raf激酶抑制剂；伏立诺他、贝利司他、帕比司他等HDAC抑制剂；细胞松弛素、拉春库林、鬼笔环肽等肌动蛋白聚合抑制剂；博舒替尼、克唑替尼、依鲁替尼等酪氨酸激酶抑制剂；美法仑等氮芥系烷基化剂；尼莫司汀、雷莫司汀等亚硝基脲系烷基化剂；达卡巴嗪、丙卡巴肼等烷基化剂；羟基氟他胺、比卡鲁胺等抗雄激素剂等CYP17(裂解酶)抑制剂；他莫昔芬等抗雌激素剂；雌莫司汀等激素剂。
作为用于炎性疾病的生理活性物质，可以举出：他克莫司等他克莫司衍生物；地塞米松、泼尼松龙等类固醇衍生物；西罗莫司、依维莫司、替西罗莫司等雷帕霉素衍生物；环孢菌素、芬戈莫德、咪唑立宾、霉酚酸酯、胍立莫司等免疫抑制剂；二氟尼柳、噻拉米特等NSAIDs等。
作为用于传染病的生理活性物质，可以举出：两性霉素B、制霉菌素等多烯系抗生素；氟康唑、伏立康唑等唑系衍生物；米卡芬净等棘白菌素系衍生物；氟胞嘧啶等嘧啶衍生物等抗真菌剂；阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦等抗病毒剂；扎那米韦、奥司他韦、拉尼娜米韦等抗病毒剂等。
本发明具有下述性能：对于病变靶组织的迁移性和渗透性提高，同时由肾脏等的排泄性提高。因此，抑制生理活性物质对病变靶组织以外的正常组织的致敏，起到减轻副作用的效果。因此，优选应用被用于存在减轻对正常组织的副作用的课题的疾病的生理活性物质。作为这样的疾病，可以举出恶性肿瘤疾病、炎性疾病。因此，作为本发明中所用的生理活性物质，优选使用针对恶性肿瘤疾病的抗肿瘤剂。另外，优选使用针对炎性疾病的生理活性物质。
作为用于恶性肿瘤疾病的生理活性物质，优选上述的喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、蒽环类衍生物、雷帕霉素衍生物、胞苷系代谢拮抗剂、叶酸代谢拮抗剂、嘌呤系代谢拮抗剂、氟化嘧啶系代谢拮抗剂、含铂化合物、丝裂霉素衍生物、博来霉素衍生物、长春花生物碱衍生物、鬼臼毒素衍生物、软海绵素衍生物、星形孢菌素衍生物、沙利度胺衍生物、维生素A衍生物、蛋白酶体抑制剂、康普瑞汀衍生物、MEK抑制剂、CDK抑制剂、Raf激酶抑制剂、HDAC抑制剂、肌动蛋白聚合抑制剂、PARP抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、氮芥衍生物、亚硝基脲系烷基化剂、烷基化剂、芳香化酶抑制剂的衍生物、抗雄激素剂、CYP17(裂解酶)抑制剂、抗雌激素剂、激素剂。
更优选喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、蒽环类衍生物、雷帕霉素衍生物、胞苷系代谢拮抗剂、叶酸代谢拮抗剂等。特别优选喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、雷帕霉素衍生物等。
另外，作为用于炎性疾病的生理活性物质，优选上述的他克莫司衍生物、类固醇衍生物、雷帕霉素衍生物、免疫抑制剂、NSAIDs等，特别优选他克莫司衍生物、类固醇衍生物、雷帕霉素衍生物。
关于R3的生理活性物质，在该结合有生理活性物质的嵌段共聚物的同一分子中可以为同一化合物，也可以两种以上的化合物混杂。该R3优选为同一化合物。
通式(1)中，n表示1或2。n为1时，构成聚氨基酸衍生物链段的氨基酸为天冬氨酸。另一方面，n为2时，构成聚氨基酸衍生物链段的氨基酸为谷氨酸。因此，通式(1)中的聚氨基酸衍生物链段为聚天冬氨酸链段、聚谷氨酸链段或聚(天冬氨酸-谷氨酸的混杂)链段。
通式(1)中的B是上述R3的具有羟基和/或氨基的生理活性物质的结合残基与天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元的侧链羧基的结合基团。
作为该B的结合基团，是与上述生理活性物质的羟基和/或氨基形成酯键和/或酰胺键、与上述天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元的侧链羧基形成酯键、酰胺键或硫酯键的结合基团。例如为-CO-(CH2)x-O-(x表示1～8的整数)、-CO-(CH2)x-NH-(x表示1～8的整数)、-CO-(CH2)x-S-(x表示1～8的整数)。
另外，也可以使用氨基酸衍生物作为该B的结合基团。作为将氨基酸衍生物作为结合基团时的结合基团的使用方式，为氨基酸衍生物的N末端氨基与上述侧链羧基形成酰胺键、C末端羧基与该生理活性物质的羟基和/或氨基形成酯键或酰胺键的方式。
在使用氨基酸衍生物作为该B的结合基团的情况下，可以使用天然型氨基酸或合成氨基酸及其侧链修饰体中的任一种。另外，可以使用L体、D体和外消旋体中的任一种。可以举出例如甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸等。另外，作为侧链经修饰的氨基酸，可以举出天冬氨酸或谷氨酸的烷基酯、天冬氨酸或谷氨酸的芳烷基酯、天冬氨酸或谷氨酸的烷基酰胺、天冬氨酸或谷氨酸的芳烷基酰胺、Boc赖氨酸等烷氧羰基赖氨酸等。
另外，作为该结合基团，也可以使用藉由亚甲基而配置羟基和羧基的乙醇酸衍生物。作为将乙醇酸衍生物作为结合基团时的结合基团的使用方式，为乙醇酸衍生物的羟基与上述侧链羧基形成酯键、羧基与该生理活性物质的羟基和/或氨基形成酯键或酰胺键的方式。
作为乙醇酸衍生物，可以举出例如乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等。在使用多元羧酸的情况下，优选在一个羧基上结合上述生理活性物质，另一个羧基为酯衍生物或酰胺衍生物。
上述结合基团可以为单一种类的结合基团，也可以两种以上的结合基团混杂。
另外，该B也可以为“键”。“键”是指不特别藉由结合基团，而是上述天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元的侧链羧基与上述生理活性物质的羟基和/或氨基直接形成酯键或酰胺键的方式。
通式(1)中的R4表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的二烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基、疏水性荧光物质的结合残基和羟基组成的组中的1种以上的取代基。
该R4可以出于控制本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物的物性的目的而任意地引入。例如，通过在该R4中引入疏水性基团，能够提高该生理活性物质结合嵌段共聚物的聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的疏水性。另一方面，作为该R4，通过引入具备氨基、羧基、羟基等可形成盐的离子性官能团的亲水性的取代基，能够提高该生理活性物质结合嵌段共聚物的聚谷氨酸链段的亲水性。另外，在该R4为羟基的情况下，是上述聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的侧链羧基为游离羧酸的情况。
该R4可以为单一种类，也可以为两种以上的取代基。
上述R4中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷氧基是在上述聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的侧链羧基上结合有酯型修饰基的烷氧基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4中的该碳原子数(C1～C30)烷氧基，可以举出例如：甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、环己氧基、苄氧基、4-苯基丁氧基、正辛氧基、癸氧基、十二烷基氧基、十四烷基氧基、十六烷基氧基、十八烷基氧基、二十烷基氧基、二十二烷基氧基、二十四烷基氧基、二十六烷基氧基、二十八烷基氧基、三十烷基氧基等。
上述R4中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷基氨基是上述聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的侧链羧基结合有烷基酰胺型修饰基的烷基氨基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4中的该碳原子数(C1～C30)烷基氨基，可以举出例如：甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨基、叔丁基氨基、环己基氨基、苄基氨基、4-苯基丁基氨基、辛基氨基、癸基氨基、十二烷基氨基、十四烷基氨基、十六烷基氨基、十八烷基氨基、二十烷基氨基、二十二烷基氨基、二十四烷基氨基、二十六烷基氨基、二十八烷基氨基、三十烷基氨基等。
另外，对羧基进行了保护的氨基酸也包含在该具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)烷基氨基中。作为该对羧基进行了保护的氨基酸，可以使用例如甘氨酸甲酯、甘氨酸苄酯、β-丙氨酸甲酯、β-丙氨酸苄酯、丙氨酸甲酯、亮氨酸甲酯、苯丙氨酸甲酯等。
上述R4中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的二烷基氨基是上述聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的侧链羧基结合有二烷基酰胺型修饰基的二烷基氨基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4中的该二(C1～C30)烷基氨基，可以举出例如：二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基氨基、N-苄基-N-甲基氨基、二辛基氨基、二壬基氨基、二癸基氨基、二(十二烷基)氨基、二(十四烷基)氨基、二(十六烷基)氨基、二(十八烷基)氨基、二(二十烷基)氨基等。
上述R4中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～8)烷基氨基羰基(C1～8)烷基氨基是上述聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的侧链羧基结合有脲型修饰基的基团。该烷基可以为相同种类，也可以为不同种类。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。在具有取代基的情况下，优选二烷基氨基。作为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基，例如为甲基氨基羰基甲基氨基、乙基氨基羰基乙基氨基、异丙基氨基羰基异丙基氨基、环己基氨基羰基环己基氨基、乙基氨基羰基(3-二甲基氨基丙基)氨基、(3-二甲基氨基丙基)氨基羰基乙基氨基等。
上述R4也可以为荧光物质的结合残基。该荧光物质优选使用具有用于与天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元的侧链羧基结合的羟基和/或氨基的荧光物质。因此，在该R4为荧光物质的结合残基的情况下，是指从上述羟基和/或氨基中去除氢原子后的荧光物质的结合残基。
作为该荧光物质，优选具有氨基的荧光物质，可以举出例如：2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮、BODIPY(注册商标)TR尸胺、BODIPY(注册商标)FL乙二胺、Alexa Fluor(注册商标)594尸胺、Texas Red(注册商标)尸胺、ATTO594胺等。因此，该R4的荧光物质的结合残基包含它们的酰胺键残基。
通式(1)中的R4也可以为羟基。即，聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的侧链羧酸为游离羧酸。这种情况下，侧链羧酸可以是游离酸的形式，另外也可以是作为药品所允许的任意的羧酸盐的形式。作为上述羧酸盐，可以举出锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐等，包含在本发明中。
通式(1)中，x1、x2、y1、y2和z分别表示该嵌段共聚物的聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段中的天冬氨酸衍生物单元和/或谷氨酸衍生物单元的结构单元的含量，分别为0～25的整数。另外，(x1+x2+y1+y2+z)表示该聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的聚合数，为3～25的整数。即，表明聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段是以平均聚合数计为3～25的聚合物。若该(x1+x2+y1+y2+z)小于3，则所得到的嵌段共聚物不具备自缔合性，激光散射强度有可能不符合最佳范围。另一方面，在聚合数大于25的情况下，所得到的生理活性物质结合嵌段共聚物的分子量有可能超过15千道尔顿，有可能无法发挥出所期望的药代动力学。即，若聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的聚合数(x1+x2+y1+y2+z)不在3～25的范围，则有可能无法得到生理活性物质的药理作用效果的增强作用和副作用的降低效果。聚氨基酸衍生物的聚合数优选考虑该结合有生理活性物质的嵌段共聚物的分子量而适当设定。该(x1+x2+y1+y2+z)优选为5～20的整数。
该聚氨基酸衍生物的聚合数(x1+x2+y1+y2+z)可以通过利用1H-NMR的测定、或在结合R3和R4前对聚乙二醇-聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)嵌段共聚物进行中和滴定来求出。
通式(1)中，(x1+x2)表示结合有R3的生理活性物质的天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元的总数。该结合有生理活性物质的单元是必要的构成，该(x1+x2)为1～25的整数。该(x1+x2)优选为2～20的整数、更优选为3～15的整数。相对于作为聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)衍生物链段的聚合数的上述(x1+x2+y1+y2+z)，(x1+x2)的比例为4～100％。优选为10～90％、更优选为20～80％。
结合有该(x1+x2)的生理活性物质的天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元的含有数由生理活性物质的结合量和聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的聚合数算出。该生理活性物质的结合量可以通过使该生理活性物质从该结合有生理活性物质的嵌段共聚物上断裂，对游离的生理活性物质进行定量分析的方法求出。另外，也可以使用由制造该结合有生理活性物质的嵌段共聚物时的生理活性物质的反应率进行计算的方法。
通式(1)中，(y1+y2)表示结合有R4的天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元的总数。另外，z表示侧链羧基发生了分子内环化的结构的天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元的总数。这些为任选的构成，(y1+y2)和z分别为0～24的整数。该(y1+y2)和z优选分别为1～20的整数。相对于作为聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)衍生物链段的聚合数的上述(x1+x2+y1+y2+z)，(y1+y2+z)的比例为0～96％、优选为4～90％。
结合有该(y1+y2)的R4的天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元的含有数由该R4的取代基的结合量和聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段的聚合数算出。该R4的取代基的结合量可以通过使该R4的取代基从该嵌段共聚物上断裂，对游离的生理活性物质进行定量分析的方法求出。另外，也可以使用由制造该嵌段共聚物时的R4的取代基的反应率进行计算的方法。另外，还可以由1H-NMR的积分值算出。
在本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物中，上述聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)链段是在侧链羧基上具备R3的天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元、具备R4的天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元、以及侧链羧基发生了分子内环化的结构的天冬氨酸单元和/或谷氨酸单元混杂的聚合物链段。各构成单元存在1单元以上，其排列没有特别控制，是不规则排列的、无规排列的链段结构。
通式(1)所表示的结合有生理活性物质的嵌段共聚物的上述R3所表示的生理活性物质的质量含量优选为10质量％以上60质量％以下。在该生理活性物质含量低于10质量％的情况下，生理活性物质含量少，有可能无法充分发挥出药理活性效果。另一方面，在生理活性物质的含量多于60质量％的情况下，该结合有生理活性物质的嵌段共聚物的亲水性-疏水性的平衡大幅变化，不具备适当的自缔合性，有可能无法发挥出所期望的药代动力学。该生理活性物质的质量含量优选为10质量％以上50质量％以下、进一步优选为10质量％以上40质量％以下。
通式(1)所表示的嵌段共聚物的特征在于，分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。关于该嵌段共聚物的分子量，采用将其构成部分的各构成分子量相加得到的计算值作为该嵌段共聚物的分子量。即，将下述分子量相加得到的计算值作为该分子量：(1)聚乙二醇链段的分子量；(2)聚氨基酸衍生物链段的主链部分的分子量；(3)将生理活性物质的结合残基分子量乘以其结合数而得到的生理活性物质的总分子量；以及(4)将生理活性物质以外的结合基团残基分子量乘以其结合数而得到的该结合基团的总分子量。
需要说明的是，该嵌段共聚物的分子量可以是以千道尔顿单位的精度规定的分子量。因此，上述各构成部分的分析方法只要是在该聚氨基酸衍生物的以千道尔顿单位计的分子量测定中具有充分精度的分析方法就没有特别限定，可以适当选择各种分析方法。下面，举出各构成部分中的优选分析方法。
上述(1)聚乙二醇链段的分子量是构建聚乙二醇链段的聚乙二醇化合物的分子量测定值，采用由通过以聚乙二醇标准品为基准的GPC法测定的峰值分子量求出的平均分子量。
上述(2)聚氨基酸衍生物链段的主链部分的分子量是将该链段的聚合单体单元的平均分子量乘以其平均聚合数而得到的计算值。该聚合数可以使用由通过中和滴定对聚氨基酸的侧链羧基进行定量的方法计算出的聚合数、或由1H-NMR的积分值计算出的聚合数。优选使用中和滴定法。
上述(3)生理活性物质的总分子量是将该生理活性物质的分子量乘以其结合数而得到的计算值。该结合数可以通过下述方法求出：利用HPLC计量反应液中的未反应的该生理活性物质而算出的方法；使该生理活性物质从该生理活性物质结合嵌段共聚物上断裂，对游离的生理活性物质或来自其的片段分子进行定量分析的方法。
上述(4)的生理活性物质以外的结合基团的总分子量是将该结合基团残基分子量乘以其结合数而得到的计算值。该结合基团的结合数可以通过下述方法求出：利用HPLC计量反应液中的未反应的该结合残基而算出的方法；在由聚氨基酸水解后进行定量分析。另外，也可以由1H-NMR的积分值算出。
本发明的嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。在上述分子量小于2千道尔顿的情况下，表明该生理活性物质结合嵌段共聚物不具有充分的纳米颗粒形成能力，无法得到对靶组织的充分的渗透性。因此，无法有效地发挥出生理活性物质的药理作用效果。另一方面，在上述分子量大于15千道尔顿的情况下，该嵌段共聚物的肾脏排泄性受到抑制，与之相伴体内滞留性提高。因此，可能发生生理活性物质对病变靶组织以外的正常组织的致敏，因此正常组织可能表现出损伤。例如，在使用细胞毒性的生理活性物质的情况下，考虑有与脊髓病相伴的血液毒性的持久化。因此，上述分子量需要控制为15千道尔顿以下。该嵌段共聚物的分子量优选为3千道尔顿以上12千道尔顿以下、进一步优选为3千道尔顿以上10千道尔顿以下。
通式(1)所表示的结合有生理活性物质的嵌段共聚物具有在水溶液中显示出自缔合性的物性。即，为下述物性：通过使用激光的动态光散射法对该生理活性物质结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液进行粒度分布测定时，该生理活性物质结合嵌段共聚物作为以体积平均粒径计为约几纳米～约20纳米的纳米颗粒被计测。本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物优选具有在1mg/mL水溶液中最大为体积平均粒径小于20纳米的纳米颗粒的物性。这种情况下，是在基于纯水的水溶液中的粒度分布测定。优选特征在于，通过基于使用激光的动态光散射法的粒度分布测定法，以体积平均粒径小于20纳米被计测，更优选具有作为3～15纳米的纳米颗粒被计测的物性。
本发明中的体积平均粒径是指在利用例如Particle Sizing System公司制造的ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(分析方法：NICOMP法)或者Malvern公司制造的粒径·ζ电位测定装置Zetasizer Nano ZS(分析方法：NNLS法)测定得到的体积分布内存在的比例最多的峰的粒径。
通式(1)所表示的生理活性物质结合嵌段共聚物是亲水性的聚乙二醇链段与通过生理活性物质或其他疏水性侧链而显示出疏水性的聚氨基酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，因而认为，在水溶液中，多个该嵌段共聚物彼此的聚氨基酸衍生物链段基于疏水性相互作用而发生缔合。结果，推测形成核-壳结构的胶束状缔合体，其以聚氨基酸衍生物链段为内核(核部)，亲水性的聚乙二醇链段覆盖内核的周围而形成了外壳层(壳部)，从而其作为上述纳米颗粒被观测到。
为了增强生理活性物质的药理作用效果和/或减轻副作用，通式(1)所表示的生理活性物质结合嵌段共聚物需要具有在水溶液中形成纳米颗粒的物性。
作为该结合有生理活性物质的嵌段共聚物的纳米颗粒形成性的指标，使用利用激光得到的光散射强度是有效的。即，可以将激光散射强度作为指标来确认该生理活性物质结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。此时，下述方法是有效的：将甲苯作为光散射强度标准试样，以相对于甲苯的相对强度作为指标，确认该生理活性物质结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。
关于本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物，其1mg/mL水溶液的激光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计至少为2倍以上。
在上述相对光散射强度小于2倍的情况下，表明该生理活性物质结合嵌段共聚物不具有充分的纳米颗粒形成性，无法得到对靶组织的充分的渗透性。因此，无法有效地发挥出生理活性物质的药理作用效果。本发明中，相对光散射强度的数值是具有纳米颗粒形成能力的指标，只要光散射强度相对于甲苯为2倍以上即可，对其上限没有限制。即，即使在上述相对光散射强度大于100倍的情况下，也可以说该嵌段共聚物具有充分的纳米颗粒形成能力。但是，在光散射强度大于100倍的情况下，认为该嵌段共聚物可能不具有所期望的排泄性。该情况下，由于该嵌段共聚物的体内滞留性升高，因而可能发生生理活性物质对病变靶组织以外的正常组织的致敏，因此正常组织可能表现出损伤。因此，将上述相对光散射强度控制为100倍以下是妥当的。
关于本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物，该水溶液的光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计优选为2倍以上50倍以下，更优选为2倍以上30倍以下。
关于本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物的纳米颗粒形成性分析中的利用激光的光散射强度的测定方法，将该生理活性物质结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液作为测定试样，在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的条件下利用激光散射光度计进行测定的方法是适当的。作为测定设备，可以举出例如大塚电子公司制造的动态光散射光度计DLS-8000DL(测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm、ND滤光片2.5％、PH1：开启(OPEN)、PH2：狭缝(SLIT))。
关于光散射强度测定，是将利用不含微粒的纯水制备的水溶液作为分析试样而得到的分析值。该水溶液可以在溶液制备中任选地通过超声波照射而进行溶解。所制备的水溶液优选为为了进一步去除亚微米级的微粒而实施了过滤处理的水溶液。
需要说明的是，作为光散射强度测定的标准物质使用的甲苯只要是试剂级的纯度，就可以没有特别限定地使用。优选使用进行了在光散射分析的试样制备中通常进行的预处理过滤的甲苯。
接着，对本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物的制造方法进行说明。可以举出下述方法：制备本嵌段共聚物的聚乙二醇链段与包含天冬氨酸和/或谷氨酸的聚氨基酸链段连结而成的AB嵌段共聚物，将其与生理活性物质进行缩合反应来制造的方法；使包含聚乙二醇链段的聚合物成分与结合有生理活性物质的聚氨基酸衍生物结合的方法；等等。优选前者的方法，即，预先制备聚乙二醇链段与聚氨基酸链段连结而成的AB嵌段共聚物，使其与生理活性物质进行缩合反应来制造。
作为该聚乙二醇链段与聚氨基酸链段连结而成的AB嵌段共聚物的制造方法，可以举出下述方法：利用所使用的氨基酸-N-羧酸酐对包含聚乙二醇链段的化合物进行序贯聚合，由此构建聚氨基酸链段的方法；使聚乙二醇链段与聚氨基酸链段结合的方法；等等。出于嵌段共聚物反应性高、容易控制聚氨基酸聚合数的原因，优选使用前者的方法。
对于预先制备聚乙二醇链段与聚氨基酸衍生物链段连结而成的AB嵌段共聚物，使其与具有羟基和/或氨基的生理活性物质结合而得到本发明的嵌段共聚物的制造方法的一个方式进行说明。
首先，使氨基酸的侧链官能团进行了适当保护的N-羰基氨基酸酐与一个末端为氨基的聚乙二醇衍生物(例如，甲氧基聚乙二醇-1-丙胺)依次进行反应，通过序贯聚合构建聚乙二醇链段与聚氨基酸链段连结而成的AB嵌段型共聚物骨架。这种情况下，通过包含侧链羧基进行了适当保护的N-羰基天冬氨酸酐和/或N-羰基谷氨酸酐作为该N-羰基氨基酸酐，能够在聚氨基酸链段中包含天冬氨酸和/或谷氨酸。之后，实施适当的脱保护反应，能够制备包含侧链羧基进行了脱保护的天冬氨酸和/或谷氨酸的该AB嵌段共聚物。作为脱保护反应，在侧链羧基为β-苄基酯的情况下，可以通过碱性条件下的水解或氢解反应来进行脱保护基反应。
使具有氨基和/或羟基的生理活性物质在适当的反应溶剂中、在缩合反应条件下对该聚乙二醇-聚氨基酸AB嵌段共聚物进行反应即可。
在该聚乙二醇-聚氨基酸AB嵌段共聚物与生理活性物质的缩合反应中，可使用的溶剂只要是溶解两化合物的溶剂就可以没有特别限定地使用。可以举出例如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)等水溶性有机溶剂。这些溶剂可以单独使用，也可以作为它们的混合溶剂使用。另外，还可以为上述溶剂与其他有机溶剂的混合溶剂。
另外，所使用的缩合剂只要是使羧酸与羟基通过脱水缩合反应进行酯反应、和/或使羧酸与氨基通过脱水缩合反应进行酰胺反应的通常的脱水缩合剂，就可以没有特别问题地使用。作为该缩合剂，可以使用例如：二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSC)等碳二亚胺系的缩合剂；4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物n水合物(DMT-MM)等三嗪系缩合剂；1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、二碳酸二叔丁酯(Boc2O)等。在该缩合反应时，也可以使用N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)等反应助剂。若使用碳二亚胺系缩合剂，则能够与生理活性物质同时地在通式(1)的R4中引入具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基。
关于反应温度，通常在0～180℃、优选在5～100℃的温度进行即可。
另外，出于调整本发明的结合有生理活性物质的共聚物的自缔合性的目的，也可以在聚氨基酸链段中引入上述碳原子数(C1～C30)烷氧基、上述碳原子数(C1～C30)烷基氨基或上述二(C1～C30)烷基氨基之类的其他疏水性取代基。作为其方法，可以举出下述方法：在通过添加缩合剂使聚乙二醇-聚氨基酸共聚物的羧基活化后，使与希望引入的疏水性取代基相当的醇化合物或氨基化合物以所期望的当量进行反应的方法；或者，在使该醇化合物或该氨基化合物活化后，与该共聚物的聚氨基酸链段进行反应的方法；等等。
该情况下，可以在通过该醇化合物或该氨基化合物引入疏水性取代基后再引入生理活性物质；也可以相反；还可以同时引入该生理活性物质和该疏水性取代基。
该疏水性取代基可以为单一种类的取代基，也可以为两种以上的取代基。在引入两种以上取代基的情况下，若使不同的醇化合物或氨基化合物反复进行反应，则能够合成各种疏水性取代基的混合物。
在聚乙二醇-聚氨基酸AB嵌段共聚物中引入生理活性物质和任选的疏水性取代基后，任选地进行通常的分离操作、纯化操作，由此能够制造本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物。
本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物具有在给药至生物体内后使生理活性物质慢慢地断裂而游离的物性。游离的生理活性物质能够发挥出药理效果。因此，本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物能够用作以该生理活性物质为有效成分的药品。
在将本发明的结合有生理活性物质的嵌段共聚物用作药品的情况下，可以以经口、非经口的任一种给药途径使用。优选通过基于非经口注射的给药途径进行处方给药。基于注射的给药通过静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、肌肉内给药、肿瘤部内给药等进行。
在本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物的制剂化时，可以使用通常所用的药学上允许的载体，例如粘结剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、防腐剂、舒缓剂、色素、香料等。
在注射液剂的情况下，通常使用溶剂。作为溶剂，可以举出例如：水；生理盐水；5％葡萄糖或甘露醇溶液；水溶性有机溶剂，例如甘油、乙醇、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、聚乙二醇、发色团等和它们的混合液；以及水与该水溶性有机溶剂的混合液等。优选利用这些制剂用添加剂制备成可给药的药物制剂后使用。
本发明的生理活性物质结合嵌段共聚物的给药量当然可根据所结合的生理活性物质的种类、患者的性别、年龄、生理状态、病情等而变更，优选以活性成分计通常成人每天以非经口方式给药0.01～500mg/m2、优选0.1～250mg/m2。
本发明可以举出生理活性物质使用了作为抗肿瘤剂的喜树碱衍生物的该嵌段共聚物作为优选方式。下面，对使用了喜树碱衍生物作为生理活性物质的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物进行说明。
喜树碱衍生物例如为7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康等喜树碱衍生物。这些喜树碱衍生物在喜树碱骨架的20位具有羟基。进而，7-乙基-10-羟基喜树碱和拓扑替康在10位具有羟基。因此，是该10位和/或20位羟基直接或藉由适当的结合基团与天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链羧基形成了酯键的方式。
喜树碱衍生物优选使用通式(2)所表示的喜树碱衍生物。
[化6]
[式中，R5表示选自由氢原子、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基和具有或不具有取代基的甲硅烷基组成的组中的1种取代基，R6表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基。]。
作为结合残基的方式，为该喜树碱衍生物的羟基与聚氨基酸链段的天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链羧基形成酯键而成的结合残基。作为酯键，可以为该喜树碱衍生物的10位羟基和20位羟基中的任一个，也可以为其混合物。优选为由10位羟基形成酯键而成的结合残基。更优选不包含该喜树碱衍生物的20位羟基酯键残基的方式。
作为通式(2)的上述R5中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R5中的该碳原子数(C1～C6)烷基，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、苄基等。更优选具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C4)烷基，特别是更优选乙基。
作为上述R5中的具有或不具有取代基的甲硅烷基，可以举出三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基等。优选叔丁基二甲基甲硅烷基。
作为上述R5，优选氢原子或具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基。特别优选氢原子或乙基。
作为通式(2)的上述R6中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R6中的该碳原子数(C1～C6)烷基，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、苄基、二甲基氨基甲基等。作为该R6，特别优选氢原子或二甲基氨基甲基。
作为通式(1)的R3的喜树碱衍生物，优选为7-乙基-10-羟基喜树碱和/或拓扑替康(9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱)。即，优选通式(2)中上述R5为乙基、上述R6为氢原子的7-乙基-10-羟基喜树碱。或者优选通式(2)中上述R5为氢原子、上述R6为二甲基氨基甲基的拓扑替康(9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱)。
本发明中，作为使用上述喜树碱衍生物作为药理活性物质的方式，优选为通式(1)中的R3为喜树碱衍生物的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物。下面进行说明。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物是通式(1)所表示的聚乙二醇链段与聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，是R3为喜树碱衍生物的结合残基的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物。即，为通式(1)所表示的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物。
[化7]
[式中，R1表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，t表示20～270的整数，A表示具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，R2表示选自由氢原子、碳原子数(C1～C6)酰基和碳原子数(C1～C6)烷氧羰基组成的组中的取代基，R3表示喜树碱衍生物的结合残基，R4表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的二烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基、疏水性荧光物质的结合残基和羟基组成的组中的1种以上取代基，B表示结合基团，n表示1或2，x1、x2、y1、y2和z各自独立地表示0～25的整数，(x1+x2)表示1～25的整数，(x1+x2+y1+y2+z)表示3～25的整数，上述结合了R3和R4的各构成单元以及侧链羰基发生了分子内环化的构成单元是各自独立地无规排列的结构。]
此处，通式中的R1、R2、R4、A、B、t、x1、x2、y1、y2、z与上述含义相同。
通式(1)的R3为喜树碱衍生物的结合残基时，该喜树碱衍生物可以举出7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康等。这些喜树碱衍生物在喜树碱骨架的20位具有羟基。进而，7-乙基-10-羟基喜树碱和拓扑替康在10位具有羟基。因此，是该10位和/或20位羟基与天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链羧基形成了酯键的方式。
上述R3的喜树碱衍生物的结合残基中的喜树碱衍生物优选使用通式(2)所表示的喜树碱衍生物。
[化8]
[式中，R5表示选自由氢原子、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基和具有或不具有取代基的甲硅烷基组成的组中的1种取代基，R6表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基。]
此处，通式(2)中的R5和R6与上述含义相同。
作为结合残基的方式，为该喜树碱衍生物的羟基与聚氨基酸链段的天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链羧基形成酯键而成的结合残基。作为酯键，可以为该喜树碱衍生物的10位羟基和20位羟基中的任一个，也可以为其混合物。优选为10位羟基形成酯键而成的结合残基。更优选不包含该喜树碱衍生物的20位羟基酯键残基的方式。
作为通式(1)的R3的喜树碱衍生物，优选为7-乙基-10-羟基喜树碱和/或拓扑替康(9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱)。即，优选通式(2)中上述R5为乙基、上述R6为氢原子的7-乙基-10-羟基喜树碱。或者优选通式(2)中上述R5为氢原子、上述R6为二甲基氨基甲基的拓扑替康(9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱)。
关于通式(1)的R3的喜树碱衍生物，在该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的同一分子中可以为同一化合物，也可以两种以上化合物混杂。该R3优选为同一化合物。
作为本发明的生理活性物质为喜树碱衍生物时的优选方式，可以举出下述喜树碱衍生物结合嵌段共聚物，其为聚乙二醇链段与聚谷氨酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，在谷氨酸单元的侧链羧基上结合有喜树碱衍生物。即，作为嵌段共聚物的聚氨基酸链段，优选使用聚谷氨酸链段。即，上述通式(1)中，n优选为2。
作为喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的更优选的方式，为通式(4)所表示的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物。
[化9]
[式中，R1a表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，ta表示20～270的整数，Aa表示具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，xa和ya分别为整数，(xa+ya)表示3～20的整数，相对于该(xa+ya)，xa的比例为1～100％且ya的比例为0～99％，R2a表示选自由氢原子、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)酰基和具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基组成的组中的1种，R3a表示喜树碱衍生物的结合残基，R4a可以相同也可以不同，表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和羟基组成的组中的1种以上的取代基，结合了上述R3a的谷氨酸单元、结合了上述R4a的谷氨酸单元各自独立地以无规的排列进行了聚合。]
上述R1a中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷基等。可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、环戊基、正己基、环己基等。
上述具有或不具有的取代基可以举出卤原子、硝基、氰基、羟基、巯基、碳环芳基或杂环芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、烷氧基、芳氧基、酰基氧基、烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、取代或无取代氨基、酰基氨基、烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、酰基、羧基、烷氧羰基、氨基甲酰基或甲硅烷基等。芳香环上的取代位置可以为邻位、间位或对位。
作为该R1a，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、苄基、2,2-二甲氧基乙基、2,2-二乙氧基乙基、2-甲酰基乙基。更优选具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C4)烷基。特别是更优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。
作为上述Aa中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，可以举出亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚正丁基等。具有或不具有的取代基可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。
作为该Aa，特别是更优选亚乙基、亚正丙基。
通式(4)的ta表示聚乙二醇链段中的亚乙基氧基的聚合数。该ta为20～270的整数。即，作为该聚乙二醇链段的分子量，为0.8千道尔顿～12千道尔顿。若作为聚乙二醇链段的聚合度的该ta小于20，则所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物不具备充分的水溶性，并且有可能无法发挥所期望的体内动力学。另一方面，在该ta大于270的情况下，所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的总分子量变大，有可能无法发挥出所期望的体内动力学，引发肝毒性等意料外的组织障碍。该ta优选为22～230的整数、更优选为30～180的整数。即，作为该聚乙二醇链段的分子量，优选为1千道尔顿～10千道尔顿、更优选为1.3千道尔顿～8千道尔顿。
通式(4)的嵌段共聚物具有聚谷氨酸衍生物链段，(xa+ya)表示该聚谷氨酸衍生物的聚合数。该聚谷氨酸衍生物的聚合数为3～20，即(xa+ya)为3～20的整数。若该(xa+ya)小于3，则在所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物中后述的激光散射强度有可能不符合最佳范围。另一方面，在该(xa+ya)大于20的情况下，随着所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的总分子量变大，后述的激光散射强度有可能不符合最佳范围。即，若该(xa+ya)不在3～20的范围，则有可能无法得到抗肿瘤效果的增强作用和/或副作用的降低效果。聚谷氨酸衍生物的聚合数优选考虑所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的总分子量而适当设定。该(xa+ya)优选为5～15的整数。
该聚谷氨酸衍生物的聚合数(xa+ya)可以通过利用1H-NMR的测定、或在结合后述的R3a和R4a前对聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物进行中和滴定来求出。
作为上述R2a中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)酰基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)酰基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R2a的该碳原子数(C1～C6)酰基，可以举出例如甲酰基、乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、丙酰基、新戊酰基、苄基羰基、苯乙基羰基等。更优选具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C4)酰基，更优选乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基。
作为上述R2a中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R2a的该碳原子数(C1～C6)烷氧羰基，可以举出例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基等。
通式(4)中的R3a为通式(2)所表示的喜树碱衍生物的结合残基。
[化10]
[式中，R5表示选自由氢原子、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基和具有或不具有取代基的甲硅烷基组成的组中的1种取代基，R6表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基。]。
需要说明的是，通式(2)中的R5和R6与上述含义相同。
作为结合残基的方式，为该喜树碱衍生物的羟基与上述聚谷氨酸衍生物链段的侧链羧基形成酯键而成的结合残基。作为酯键，可以为该喜树碱衍生物的10位羟基和20位羟基中的任一个，也可以为其混合物。优选为10位羟基形成酯键而成的结合残基。更优选不包含该喜树碱衍生物的20位羟基酯键残基的方式。
作为通式(4)的R3a的喜树碱衍生物，优选为7-乙基-10-羟基喜树碱和/或拓扑替康(9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱)。即，优选通式(2)中上述R5为乙基、上述R6为氢原子的7-乙基-10-羟基喜树碱。或者优选通式(2)中上述R5为氢原子、上述R6为二甲基氨基甲基的拓扑替康(9-二甲基氨基甲基-10-羟基喜树碱)。
关于通式(4)的R3a的喜树碱衍生物，在该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的同一分子中可以为同一化合物，也可以两种以上化合物混杂。该R3a优选为同一化合物。
通式(4)中，xa表示结合有上述R3a的喜树碱衍生物的谷氨酸单元的总数。该结合有该喜树碱衍生物的谷氨酸单元是必要的构成，该xa为1以上的整数。该xa优选为2～18的整数、更优选为3～16的整数。
相对于作为聚谷氨酸衍生物的聚合数的上述(xa+ya)，xa的比例为1～100％。相对于上述(xa+ya)，xa的比例优选为10～90％、更优选为20～80％。
该xa的喜树碱类的结合数可以如下算出：将所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物水解，利用HPLC对游离的喜树碱衍生物或来自其的片段分子进行定量，由此计算出喜树碱衍生物含量，由该数值计算出上述结合数。
通式(4)中的R4a为选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和羟基组成的组中的1种以上的取代基。
该R4a可以出于控制本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的物性的目的而任意地引入。例如，通过在该R4a中引入疏水性基团，能够提高该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的聚谷氨酸链段的疏水性。另一方面，作为该R4a，通过引入具备氨基、羧基、羟基等可形成盐的离子性官能团的亲水性的取代基，能够提高该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的聚谷氨酸链段的亲水性。另外，在该R4a为羟基的情况下，是上述聚谷氨酸链段的侧链羧基为游离羧酸的情况。
该R4a可以为单一种类，也可以为两种以上的取代基。
作为上述R4a中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷氧基。即，是上述聚谷氨酸链段的侧链羧基结合有酯型修饰基的烷氧基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4a中的该碳原子数(C1～C8)烷氧基，可以举出例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、环己氧基、苄氧基等。
作为上述R4a中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基氨基。即，是上述聚谷氨酸链段的侧链羧基结合有烷基酰胺型修饰基的烷基氨基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4a中的该碳原子数(C1～C8)烷基氨基，可以举出例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨基、叔丁基氨基、环己基氨基、苄基氨基等。
另外，对羧基进行了保护的氨基酸也包含在该具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基中。作为该对羧基进行了保护的氨基酸，可以使用例如甘氨酸甲酯、甘氨酸苄酯、β-丙氨酸甲酯、β-丙氨酸苄酯、丙氨酸甲酯、亮氨酸甲酯、苯丙氨酸甲酯等。
作为上述R4a中的具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的二(C1～C8)烷基氨基。即，是上述聚谷氨酸链段的侧链羧基结合有二烷基酰胺型修饰基的二烷基氨基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4a中的该二(C1～C8)烷基氨基，可以举出例如二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基氨基、N-苄基-N-甲基氨基等。
上述R4a也可以为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基。其为上述聚谷氨酸链段的侧链羧基结合有脲型修饰基的基团，并具有-N(R4ax)CONH(R4ay)[该R4ax和该R4ay可以相同也可以不同，表示可以被叔氨基取代的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基]作为侧链羧基。
该R4ax和R4ay中的可以被叔氨基取代的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环己基、2-二甲基氨基乙基、3-二甲基氨基丙基等。
作为上述R4a中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基，例如为甲基氨基羰基甲基氨基、乙基氨基羰基乙基氨基、异丙基氨基羰基异丙基氨基、环己基氨基羰基环己基氨基、乙基氨基羰基(3-二甲氨基丙基)氨基、(3-二甲氨基丙基)氨基羰基乙基氨基等。
通式(4)中的R4a也可以为羟基。即，谷氨酸的侧链羧酸为游离羧酸。这种情况下，侧链羧酸可以为游离酸的形式，另外也可以为作为药品所允许的任意的羧酸盐的形式。作为上述羧酸盐，可以举出锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐等，包含在本发明中。
通式(4)中的R4a优选为碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和/或羟基。即，优选该R4a为碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和羟基混杂的方式、或该R4a仅为羟基的方式。
通式(4)中，ya表示结合有上述R4a的谷氨酸单元的总数。结合有该R4a的谷氨酸单元为任选的构成，该ya为0～19的整数。该ya优选为2～18的整数、更优选为4～17。
相对于作为聚谷氨酸衍生物的聚合数的上述(xa+ya)，ya的比例为0～99％。相对于上述(xa+ya)，ya的比例优选为10～90％、更优选为20～80％。
该R4a的结合数ya可以通过在碱性条件下对所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物进行1H-NMR测定，由信号强度比算出。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物中，上述聚谷氨酸衍生物链段是在侧链羧基上具备上述R3a的谷氨酸衍生物单元与具备上述R4a的谷氨酸衍生物单元混杂的聚合物链段。具备该R3a的谷氨酸衍生物单元和具备该R4a的谷氨酸衍生物单元可以为以极化方式存在的嵌段聚合型，也可以为不规则地存在的无规聚合型。优选为具备上述R3a的谷氨酸衍生物单元与具备上述R4a的谷氨酸衍生物单元不规则地存在的无规聚合型的聚谷氨酸衍生物链段。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。在分子量小于2千道尔顿的情况下，基于高分子化的药代动力学特性无法得到发挥，有可能无法得到抗肿瘤效果的增强作用等所期望的药理作用。另一方面，在分子量超过15千道尔顿的情况下，抗肿瘤效果与副作用的背离变难，有可能强烈地表现出副作用。特别是，喜树碱衍生物具有强烈表现出骨髓抑制等血液毒性的持久化的特征。在分子量超过15千道尔顿的情况下，强烈表现出血液毒性。因此，对于本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物来说，分子量的控制非常重要。本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的分子量优选为3千道尔顿以上12千道尔顿以下、进一步优选为3千道尔顿以上10千道尔顿以下。
关于本发明中的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的分子量，采用将其构成部分的各构成分子量相加得到的计算值作为该“喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的分子量”。即，将下述分子量相加得到的计算值作为该分子量：(1)聚乙二醇链段的分子量；(2)聚谷氨酸主链的分子量；(3)将喜树碱衍生物的结合残基分子量乘以其结合数而得到的喜树碱衍生物的总分子量；以及(4)将喜树碱衍生物以外的结合基团残基分子量乘以其结合数而得到的该结合基团的总分子量。
该“喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的分子量”可以是以千道尔顿单位的精度规定的分子量。因此，上述各构成部分的分析方法只要是在该聚氨基酸衍生物的以千道尔顿单位计的分子量测定中具有充分精度的分析方法就没有特别限定，可以适当选择各种分析方法。下面，举出各构成部分中的优选分析方法。
上述(1)聚乙二醇链段的分子量是构建聚乙二醇链段的聚乙二醇化合物的分子量测定值，采用由通过以聚乙二醇标准品为基准的GPC法测定的峰值分子量求出的平均分子量。
上述(2)聚谷氨酸主链的分子量是将该主链的聚合单体单元的分子量乘以其聚合数而得到的计算值。该聚合数可以使用由通过中和滴定对聚谷氨酸的侧链羧基进行定量的方法计算出的聚合数、或由1H-NMR的积分值计算出的聚合数。优选使用中和滴定法。
上述(3)喜树碱衍生物的总分子量是将该喜树碱衍生物的分子量乘以其结合数而得到的计算值。该结合数通过使喜树碱衍生物从该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物上断裂，对游离的喜树碱衍生物或来自其的片段分子进行定量分析而求出。
上述(4)的喜树碱衍生物以外的结合基团的总分子量是将该结合基团残基分子量乘以其结合数而得到的计算值。该结合基团的结合数可以在由聚谷氨酸水解后通过定量分析求出。另外，也可以由1H-NMR的积分值算出。在该喜树碱衍生物以外的结合基团为酯型修饰基的情况下，优选对通过水解使酯断裂而得到的对应醇化合物进行定量分析的方法。另一方面，在该喜树碱衍生物以外的结合基团为酰胺型修饰基和脲型修饰基的情况下，优选利用1H-NMR法计算出结合数。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物具有在水溶液中显示出自缔合性的物性。即，为下述物性：通过激光散射法对该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液进行粒度分布测定时，该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物作为以体积平均粒径计为约几纳米～约20纳米的纳米颗粒被计测。本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物优选具有该衍生物在1mg/mL的水溶液中为体积平均粒径最大为小于20纳米的纳米颗粒的物性。这种情况下，是在基于纯水的水溶液中的粒度分布测定。优选特征在于，通过基于使用激光的动态光散射法的粒度分布测定法，以体积平均粒径小于20纳米被计测，更优选具有作为3～15纳米的纳米颗粒被计测的物性。
本发明中的体积平均粒径是指在利用例如Particle Sizing System公司制造的ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(分析方法：NICOMP法)或者Malvern公司制造的粒径·ζ电位测定装置Zetasizer Nano ZS(分析方法：NNLS法)测定得到的体积分布内存在的比例最多的峰的粒径。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物是亲水性的聚乙二醇链段与通过酯键而具备疏水性的喜树碱衍生物的聚谷氨酸链段连结而成的嵌段共聚物，因而认为，在水溶液中，多个该嵌段共聚物彼此的聚谷氨酸链段基于疏水性相互作用而发生缔合。结果，推测形成核-壳结构的胶束状缔合体，其以聚谷氨酸链段为内核(核部)，亲水性的聚乙二醇链段覆盖内核的周围而形成了外壳层(壳部)，从而作为上述纳米颗粒被观测到。
为了降低副作用，本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物需要具有在水溶液中形成纳米颗粒的物性。特别是在抑制肝毒性表现的方面，具有纳米颗粒形成性很重要。
作为本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的纳米颗粒形成性的指标，使用利用激光而得到的光散射强度是有效的。即，可以将激光散射强度作为指标来确认该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。此时，下述方法是有效的：将甲苯作为光散射强度标准试样，以相对于甲苯的相对强度作为指标，确认该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。
关于本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物，其1mg/mL水溶液的激光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计为2倍以上10倍以下。在上述相对光散射强度小于2倍的情况下，表明该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物不具有充分的纳米颗粒形成性，有可能引起肝毒性等副作用的表现。本发明中，相对光散射强度的数值是具有纳米颗粒形成能力的指标，只要光散射强度相对于甲苯为2倍以上即可，对其上限没有限制。即，可知：即使在上述相对光散射强度大于10倍的情况下，该高分子衍生物也具有充分的纳米颗粒形成能力。但是，该情况下，虽然没有高频率表现肝毒性的风险，但存在血液毒性持久化的风险，因而控制为10倍以下是妥当的。
需要说明的是，关于该水溶液，是将利用不含微粒的纯水制备的水溶液作为分析试样而得到的分析值。该水溶液可以在溶液制备中任选地通过超声波照射而进行溶解。所制备的水溶液优选为为了进一步去除亚微米级的微粒而实施了过滤处理的水溶液。
关于本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物，该水溶液的光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计优选为2倍以上8倍以下，更优选为2倍以上6倍以下。
关于本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的纳米颗粒形成性分析中的利用激光的光散射强度的测定方法，将该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液作为测定试样，在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的条件下利用激光散射光度计进行测定的方法是适当的。作为测定设备，可以举出例如大塚电子公司制造的动态光散射光度计DLS-8000DL(测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm、ND滤光片2.5％、PH1：开启(OPEN)、PH2：狭缝(SLIT))。
需要说明的是，作为光散射强度测定的标准物质使用的甲苯只要是试剂级的纯度，就可以没有特别限定地使用。优选使用进行了在光散射分析的试样制备中通常进行的预处理过滤的甲苯。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物中，通式(2)所表示的喜树碱衍生物的质量含量优选为10质量％以上60质量％以下。在该喜树碱衍生物含量低于10质量％的情况下，疏水性的喜树碱衍生物少，因而基于疏水性相互作用的纳米颗粒形成性降低。另一方面，在喜树碱衍生物的含量多于60质量％的情况下，该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的水溶性有可能显著降低。该喜树碱衍生物的质量含量优选为15质量％以上50质量％以下、进一步优选为15质量％以上40质量％以下。
通式(4)中，在R4a为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基的情况下，由于该R4a的结合基团为任选的取代基，因而其取代基含量为30质量％以下。优选为1质量％以上20质量％以下。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物中的聚乙二醇链段的质量含量优选为10质量％以上80质量％以下。在聚乙二醇链段的质量含量低于10质量％的情况下，该喜树碱衍生物结合嵌段共聚物不具备充分的水溶性，因而有可能无法确保水溶液中的纳米颗粒形成性。另一方面，在多于80质量％的情况下，具备喜树碱衍生物的聚谷氨酸链段的质量含量相对降低，因而有可能无法确保水溶液中的纳米颗粒形成性。该聚乙二醇链段的质量含量优选为20质量％以上70质量％以下、进一步优选为30质量％以上65质量％以下。
作为本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的制造方法，可以举出下述方法：通过聚乙二醇链段和聚谷氨酸链段连结而成的嵌段共聚物与在10位具有羟基的喜树碱衍生物的缩合反应进行制造的方法；使包含聚乙二醇链段的聚合物成分与喜树碱结合聚谷氨酸衍生物结合的方法；等等。优选通过预先制备聚乙二醇链段与聚谷氨酸链段连结而成的嵌段共聚物，使其与在10位具有羟基的喜树碱衍生物进行缩合反应来制造的方法。
作为该聚乙二醇链段与聚谷氨酸链段连结而成的嵌段共聚物的制造方法，可以举出下述方法：使用谷氨酸-N-羧酸酐对包含聚乙二醇链段的化合物进行序贯聚合，由此构建聚谷氨酸链段的方法；使聚乙二醇链段与聚谷氨酸链段结合的方法；等等。出于用于使聚乙二醇链段与聚谷氨酸链段结合的反应性高、容易控制聚谷氨酸聚合数的原因，优选使用前者的方法。
即，使用谷氨酸-N-羧酸酐对包含聚乙二醇链段的化合物进行序贯聚合，由此构建聚谷氨酸链段，制备聚乙二醇链段与聚谷氨酸链段连结而成的嵌段共聚物，利用缩合剂使其与喜树碱衍生物反应，由此能够制造本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物优选根据上述专利文献1中记载的方法进行制造。即，使具有末端氨基的聚乙二醇化合物和对侧链羧基进行了保护的N-羰基谷氨酸酐以适当的当量进行反应，构建所期望的谷氨酸聚合数的聚谷氨酸链段，之后将侧链羧基脱保护，制备侧链羧基含有游离羧酸基的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物。在适当的溶剂中，利用缩合剂使所制备的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物与通式(2)所表示的在10位具有羟基的喜树碱衍生物进行反应，由此能够制造本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物。
在该聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物与喜树碱衍生物的缩合反应中，所使用的溶剂只要是溶解两化合物的溶剂就可以没有特别限定地使用。可以举出例如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)等水溶性有机溶剂。这些溶剂可以单独使用，也可以作为它们的混合溶剂使用。另外，还可以为上述溶剂与其他有机溶剂的混合溶剂。关于反应温度，通常在0～180℃、优选在5～50℃的温度进行即可。
另外，所使用的缩合剂只要是使羧酸和羟基通过脱水缩合反应进行酯反应的通常的脱水缩合剂，就可以没有特别问题地使用。作为该缩合剂，可以使用例如：二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSC)等碳二亚胺系的缩合剂；4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物n水合物(DMT-MM)等三嗪系缩合剂；1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、二碳酸二叔丁酯(Boc2O)等。
使用上述碳二亚胺系缩合剂时，能够与喜树碱衍生物同时地在通式(1)的R4和通式(4)的R4a中引入具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基：-N(R4ax)CONH(R4ay)[该R4ax和该R4ay可以相同也可以不同，表示可以被叔氨基取代的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基]。在该缩合反应时，可以使用N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)等反应助剂。
另外，可以通过调整反应条件等来调整该高分子衍生物中的聚谷氨酸链段中的该R4a的取代基的组成。例如，根据使用EEDQ或Boc2O等作为缩合剂的活性酯化法、或使用磷酰氯等的酰氯形成法，在上述通式(4)中，能够形成由R3a的喜树碱衍生物和R4a的羟基构成的聚谷氨酸链段。在该R4a中引入烷基氨基羰基烷基氨基的情况下，如上所述采用利用碳二亚胺系缩合剂的反应即可。
另外，通式(4)中，出于调整聚谷氨酸链段的疏水性的目的，也可以引入上述碳原子数(C1～C8)烷氧基、上述碳原子数(C1～C8)烷基氨基或上述二(C1～C8)烷基氨基作为R4a。作为该情况下的方法，可以举出下述方法：在通过添加缩合剂使聚乙二醇-聚谷氨酸共聚物的羧基活化后，使与希望引入的R4a的取代基相当的醇化合物或氨基化合物以所期望的当量进行反应的方法；或者，在使该醇化合物或该氨基化合物活化后，与该共聚物的聚谷氨酸链段进行反应的方法；等等。这种情况下，可以在通过该醇化合物或该氨基化合物引入该R4a后再引入R3a的喜树碱衍生物；也可以相反；还可以同时引入该R3a和该R4a。
与该R4a相当的基团可以为单一种类的官能团，也可以为两种以上的官能团。在引入两种以上的官能团的情况下，若使不同的醇化合物或氨基化合物反复进行反应，则也能够合成R4a为各种取代基的混合物。
通过上述缩合反应，引入R3a的喜树碱衍生物以及任选的R4a的取代基后，任选进行通常的分离操作、纯化操作，由此能够获得本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物在给药至生物体内后，通过使喜树碱衍生物慢慢地断裂而游离，能够发挥出药理效果。因此，本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物能够用作用于恶性肿瘤治疗的抗肿瘤剂。
在将本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物用作抗肿瘤剂的情况下，给药量当然可根据患者的性别、年龄、生理状态、病情等而变更，以活性成分计通常成人每天以非经口方式给药0.01～500mg/m2(体表面积)、优选0.1～250mg/m2来使用。作为给药途径，优选以非经口给药方式使用。基于注射的给药通过静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、肌肉内给药、肿瘤部内给药等进行。
本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物优选作为注射剂、片剂、散剂等通常使用的药物制剂来使用。在制剂化时，可以使用通常所使用的药学上允许的载体，例如粘结剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、防腐剂、舒缓剂、色素、香料等。在注射液剂的情况下，通常使用溶剂。作为溶剂，可以举出例如：水；生理盐水；5％葡萄糖或甘露醇溶液；水溶性有机溶剂，例如甘油、乙醇、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、聚乙二醇、发色团等和它们的混合液；以及水与该水溶性有机溶剂的混合液等。优选利用这些制剂用添加剂制备成可给药的药物制剂后使用。
关于本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的作为抗肿瘤剂的用途，被用于恶性肿瘤疾病的治疗。作为可治疗的恶性肿瘤，没有特别限定，可以应用于对于乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、直肠结肠癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、软组织肉瘤、恶性皮肤癌、类癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、胆管癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤的治疗。特别适合于喜树碱衍生物被用于治疗的非小细胞肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌(不能手术或复发)、结肠/直肠癌(不能手术或复发)、乳腺癌(不能手术或复发)、鳞状细胞癌、恶性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)的治疗。
本发明可以举出使用具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物作为生理活性物质的该嵌段共聚物作为优选方式。下面，对使用间苯二酚衍生物作为生理活性物质的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物进行说明。
已知间苯二酚衍生物通过与HSP90(热休克蛋白90)家族蛋白结合、抑制HSP90家族蛋白的功能而表现出抗肿瘤活性等(Hsp90inhibitors as novelcancerchemotherapeutic agents.Trends Mol Med.2002；8(4Suppl.):p.S55-61.)。作为具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物，已知具有三唑骨架(参照国际公开WO05/000300号、国际公开WO06/055760号、国际公开WO05/018674号等)、异噁唑骨架(参照国际公开WO04/072051号)、吡唑骨架(参照国际公开WO03/055860号等)的化合物等。这些化合物含有具有羟基的间苯二酚结构，因而通过将该羟基作为结合基团，能够应用于本发明的嵌段共聚物。即，为间苯二酚基的羟基直接或藉由适当的结合基团与天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链羧基形成了酯键的方式。
具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物优选为通式(3)所表示的作为间苯二酚衍生物的结合残基的间苯二酚衍生物。
[化11]
[式中，R7表示选自由巯基、羟基、卤原子、硝基、氰基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基、羧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基、氨基甲酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种，
R8表示选自由具有或不具有取代基的碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳原子数(C1～C20)的烷基氨基和碳原子数(C1～C20)的酰基氨基组成的组中的1种，环H为选自由通式(3-1)、(3-2)和(3-3)组成的组中的杂环芳基。
[化12]
[式中，R9表示选自由巯基、羟基、氢原子、卤原子、氨基甲酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基、氰基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)的烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种。]。
R7和R9中的卤原子表示氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
R7和R8中的烷基表示碳原子数(C1～C20)的直链状、支链状或环状烷基。作为直链状烷基，可以举出例如甲基、乙基、丙基、正丁基、正戊基、正己基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基等。作为支链状烷基，可以举出例如异丙基、叔丁基、2,2-二甲基丙基、2,3-二甲基戊基、2,3-二甲基辛基、3-甲基-4-乙基癸基、3,4-二乙基十一烷基等。作为环状烷基，可以举出例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、金刚烷基、环十二烷基、环十六烷基、环十八烷基、环二十烷基等。优选为碳原子数(C1～C8)的直链状、支链状或环状烷基。
R7和R8中的烯基表示在任意1处以上具有碳-碳双键的碳原子数(C2～C20)的直链状、支链状或环状烯基。作为直链状烯基，可以举出例如：乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、1-辛烯基、1-十六碳烯基、1-十八碳烯基等1-烯基；2-丁烯基、2-戊烯基、2-辛烯基、2-十六碳烯基、2-十八碳烯基等2-烯基等。作为支链状烯基，可以举出例如异丙烯基、3-甲基-1-丁烯基或香叶基、6-乙基-3-甲基-1-辛烯基、5,6-二甲基-1-十八碳烯基等。优选碳原子数(C2～C8)的直链状、支链状或环状烯基。
R7和R8中的炔基表示在任意1处以上具有碳-碳三键的碳原子数(C2～C20)的炔基。可以举出例如：乙炔基、1-丙炔基、3,3-二甲基-1-丁炔基、1-辛炔基、1-十六炔基、1-十八炔基等1-炔基；2-丙炔基、2-丁炔基、3-苯基-2-丙炔基、4,4-二甲基-2-戊炔基、3-三甲基甲硅烷基-2-丙炔基、2-己炔基、2-辛炔基、2-十二炔基、2-十六炔基、2-十八炔基等2-炔基等。优选碳原子数(C2～C8)的炔基。
作为R7和R8中的碳环芳基，可以举出例如苯基、萘基等。另外，作为杂环芳基，可以举出例如吡啶基、嘧啶基、喹啉基、喹唑啉基、萘啶基、呋喃基、吡咯基、吲哚基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基等。
作为R8中的具有或不具有的取代基，可以举出例如氢原子、巯基、羟基、卤原子、硝基、氰基、烷基、烯基、炔基、碳环芳基或杂环芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、烷氧基、芳氧基、酰基氧基、烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、酰基氨基、烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、酰基、羧基、烷氧羰基、氨基甲酰基或甲硅烷基等。芳香环上的取代位置可以为邻位、间位或对位。
作为R7和R9中的烷硫基，表示碳原子数(C1～C8)的烷硫基，可以举出例如甲硫基、异丙硫基、苄硫基等。作为芳硫基，可以举出例如苯硫基、萘硫基、吡啶硫基等。
作为烷基亚磺酰基，表示碳原子数(C1～C8)的烷基亚磺酰基，可以举出例如甲基亚磺酰基、异丙基亚磺酰基、苄基亚磺酰基等。作为芳基亚磺酰基，可以举出例如苯基亚磺酰基、萘基亚磺酰基、吡啶基亚磺酰基等。
作为烷基磺酰基，表示碳原子数(C1～C8)的烷基磺酰基，可以举出例如甲基磺酰基、异丙基磺酰基、苄基磺酰基等。作为芳基磺酰基，可以举出例如苯基磺酰基、萘基磺酰基、吡啶基磺酰基等。
作为氨磺酰基，可以举出例如二甲基氨磺酰基、苯基氨磺酰基等。
作为R7和R9中的烷氧基，表示碳原子数(C1～C8)的烷氧基，可以举出例如甲氧基、异丙氧基、苄氧基等。作为芳氧基，可以举出例如苯氧基、萘氧基、吡啶氧基等。
作为酰基氧基，表示碳原子数(C1～C8)的酰基氧基，可以举出例如乙酰氧基、苯甲酰基氧基等。
作为烷氧羰基氧基，表示碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基，可以举出例如甲氧基羰基氧基、三氟甲氧基羰基等。
作为氨基甲酰基氧基，可以举出例如二甲基氨基甲酰基氧基、苯基氨基甲酰基氧基等。
作为R7和R9中的氨基，可以举出例如无取代氨基、二甲基氨基、吗啉基、呱啶基、4-甲基哌嗪-1-基、苯基氨基等。
作为酰基氨基，可以举出例如乙酰基氨基、苯甲酰基氨基等。
作为烷氧羰基氨基，可以举出例如甲氧基羰基氨基、乙氧基羰基氨基、苄氧基羰基氨基等。
作为脲基，可以举出例如三甲基脲基、1-甲基-3-苯基-脲基等。
作为磺酰基氨基，可以举出例如甲磺酰基氨基、苯磺酰基氨基等。
作为氨磺酰基氨基，可以举出例如二甲基氨磺酰基氨基等。
作为R7和R9中的酰基，可以举出例如乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、吡啶羰基等。
作为烷氧羰基，可以举出例如甲氧基羰基、苄氧基羰基等。
作为烷基甲硅烷基，可以举出例如三甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基等。
作为R7中的氨基甲酰基，可以举出例如二甲基氨基甲酰基、苯基氨基甲酰基等。
R8中的具有或不具有取代基的烷基氨基表示具有氨基或烷基氨基作为取代基的碳原子数(C1～C8)的直链状、支链状或环状的烷基，可以举出例如氨基亚甲基、吗啉基亚甲基、吗啉基-3-亚丙基、哌嗪基-3-亚丙基等。
作为具有或不具有取代基的酰基氨基，可以举出例如乙酰基氨基、苯甲酰基氨基等。
作为R8中的具有或不具有的取代基，与上述含义相同。
本发明中，优选为通式(1)中的R3为具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物的结合残基的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物。下面进行说明。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物是通式(1)所表示的聚乙二醇链段与聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，是R3为间苯二酚衍生物的结合残基的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物。即，为通式(1)所表示的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物。
[化13]
[式中，R1表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，t表示20～270的整数，A表示具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，R2表示选自由氢原子、碳原子数(C1～C6)酰基和碳原子数(C1～C6)烷氧羰基组成的组中的取代基，R3表示间苯二酚衍生物的结合残基，R4表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的二烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基、疏水性荧光物质的结合残基和羟基组成的组中的1种以上的取代基，B表示结合基团，n表示1或2，x1、x2、y1、y2和z各自独立地表示0～25的整数，(x1+x2)表示1～25的整数，(x1+x2+y1+y2+z)表示3～25的整数，结合了上述R3和R4的各构成单元以及侧链羰基发生了分子内环化的构成单元是各自独立地无规排列的结构。]
此处，通式中的R1、R2、R4、A、B、t、x1、x2、y1、y2、z与上述含义相同。
通式(1)的R3为间苯二酚衍生物的结合残基时，该间苯二酚衍生物已知有上述的具有三唑骨架、异噁唑骨架、吡唑骨架的、具有HSP90抑制活性的化合物等。这些化合物由于具备具有羟基的间苯二酚结构，因而可以用作本发明的生理活性物质。优选为具有三唑骨架的间苯二酚衍生物，优选国际公开WO05/000300号、国际公开WO06/055760号、国际公开WO05/018674号中记载的具有HSP90抑制活性的化合物。
上述R3的具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物的结合残基中的间苯二酚衍生物优选为通式(3)所表示的作为间苯二酚衍生物的结合残基的间苯二酚衍生物。
[化14]
[式中，R7表示选自由巯基、羟基、卤原子、硝基、氰基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基、羧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基、氨基甲酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种，
R8表示选自由具有或不具有取代基的碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳原子数(C1～C20)的烷基氨基和碳原子数(C1～C20)的酰基氨基组成的组中的1种，环H为选自由通式(3-1)、(3-2)和(3-3)组成的组中的杂环芳基。
[化15]
[式中，R9表示选自由巯基、羟基、氢原子、卤原子、氨基甲酰基、碳原子数(C1～C20)的烷氧羰基、氰基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)的烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种。]
需要说明的是，通式(3)中的R7～R9和环H与上述含义相同。
该R3的间苯二酚衍生物的结合残基中的间苯二酚衍生物优选通式(3)中的R7～R9和环H为选自下述组中的组合的化合物。
作为R7，优选卤原子、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)的直链状或支链状的烷基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)的直链状或支链状的炔基、氨基甲酰基、氨磺酰基，特别优选氯原子、溴原子、乙基、异丙基、2-丙炔基。
作为R8，优选具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)的直链状或支链状的烷基、具有或不具有取代基的苯基、萘基、吡咯基、吲哚基。作为通式(3)中的R8的取代基，优选羟基、碳原子数(C1～C8)的直链状、支链状或环状烷基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、具有或不具有取代基的氨基，特别优选羟基、甲氧基、吗啉基、4-甲基哌嗪-1-基。
作为R9，优选巯基、羟基、烷基磺酰基、氨基甲酰基、烷氧羰基，特别优选巯基、羟基。
作为环H，优选三唑基、异噁唑基。
需要说明的是，在上述R9为巯基或羟基、环H为三唑基的情况下，可具有互变异构性，可以为各自的互变异构体。
作为本发明中的间苯二酚衍生物的具体例，可以举出下述化合物(3a)～(3k)这11种化合物。
[化16]
作为R3的间苯二酚衍生物，优选结构式(3a)的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(通用名：Ganetespib)。
关于通式(1)的R3的间苯二酚衍生物，在该间苯二酚类结合嵌段共聚物的同一分子中可以为同一化合物，也可以两种以上化合物混杂。该R3优选为同一化合物。
作为本发明的生理活性物质为具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物时的优选方式，可以举出下述间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物，其为聚乙二醇链段与聚谷氨酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，在谷氨酸单元的侧链羧基上结合有间苯二酚衍生物。即，作为嵌段共聚物的聚氨基酸链段，优选使用聚谷氨酸链段。即，上述通式(1)中，n优选为2。
作为间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的更优选的方式，为通式(5)所表示的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物。
[化17]
[式中，R1b表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，tb表示20～270的整数，Ab表示具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，xb和yb分别为整数，(xb+yb)表示3～20的整数，相对于该(xb+yb)，xb的比例为1～100％且yb的比例为0～99％，R2b表示选自由氢原子、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)酰基和具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基组成的组中的1种，R3b表示具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物的结合残基，R4a可以相同也可以不同，表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和羟基组成的组中的1种以上的取代基，结合了上述R3b的谷氨酸单元、结合了上述R4b的谷氨酸单元各自独立地以无规的排列进行了聚合。]
上述R1b中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷基等。可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、环戊基、正己基、环己基等。
上述具有或不具有的取代基可以举出卤原子、硝基、氰基、羟基、巯基、碳环芳基或杂环芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、烷氧基、芳氧基、酰基氧基、烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、取代或无取代氨基、酰基氨基、烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、酰基、羧基、烷氧羰基、氨基甲酰基或甲硅烷基等。芳香环上的取代位置可以为邻位、间位或对位。
作为该R1b，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、苄基、2,2-二甲氧基乙基、2,2-二乙氧基乙基、2-甲酰基乙基。更优选具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C4)烷基。特别是更优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。
作为上述Ab中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，可以举出亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚正丁基等。具有或不具有的取代基可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。
作为该Ab，特别是更优选亚乙基、亚正丙基。
通式(5)的tb表示聚乙二醇链段中的亚乙基氧基的聚合数。该tb为20～270的整数。即，作为该聚乙二醇链段的分子量，为0.8千道尔顿～12千道尔顿。若作为聚乙二醇链段的聚合度的该tb小于20，则所得到的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物不具备充分的水溶性，并且有可能发挥不出所期望的体内动力学。另一方面，在该tb大于270的情况下，所得到的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的总分子量变大，有可能无法发挥出所期望的体内动力学，引发血液毒性等意料外的组织障碍。该tb优选为22～230的整数、更优选为30～180的整数。即，作为该聚乙二醇链段的分子量，优选为1千道尔顿～10千道尔顿、更优选为1.3千道尔顿～8千道尔顿。
通式(5)的嵌段共聚物具有聚谷氨酸衍生物链段，(xb+yb)表示该聚谷氨酸衍生物的聚合数。该聚谷氨酸衍生物的聚合数为3～20，即(xb+yb)为3～20的整数。若该(xb+yb)小于3，则在所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物中后述的激光散射强度有可能不符合最佳范围。另一方面，在该(xb+yb)大于20的情况下，随着所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的总分子量变大，后述的激光散射强度有可能不符合最佳范围。即，若该(xb+yb)不在3～20的范围，则有可能无法得到抗肿瘤效果的增强作用和/或副作用的降低效果。聚谷氨酸衍生物的聚合数优选考虑所得到的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的总分子量而适当设定。该(xb+yb)优选为5～15的整数。
该聚谷氨酸衍生物的聚合数(xb+yb)可以通过利用1H-NMR的测定、或在结合后述的R3b和R4b前对聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物进行中和滴定来求出。
作为上述R2b中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)酰基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)酰基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R2b的该碳原子数(C1～C6)酰基，可以举出例如甲酰基、乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、丙酰基、新戊酰基、苄基羰基、苯乙基羰基等。更优选具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C4)酰基，更优选乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基。
作为上述R2b中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R2b的该碳原子数(C1～C6)烷氧羰基，可以举出例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基等。
通式(5)中的R3b中的具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物的结合残基中的间苯二酚衍生物优选为通式(3)所表示的作为间苯二酚衍生物的结合残基的间苯二酚衍生物。
[化18]
[式中，R7表示选自由巯基、羟基、卤原子、硝基、氰基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基、羧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基、氨基甲酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种，
R8表示选自由具有或不具有取代基的碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳原子数(C1～C20)的烷基氨基和碳原子数(C1～C20)的酰基氨基组成的组中的1种，环H为选自由通式(3-1)、(3-2)和(3-3)组成的组中的杂环芳基。
[化19]
[式中，R9表示选自由巯基、羟基、氢原子、卤原子、氨基甲酰基、碳原子数(C1～C20)的烷氧羰基、氰基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)的烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种。]
需要说明的是，上述R3b中的通式(3)中的R5～R9及环H与上述含义相同。
作为间苯二酚衍生物的结合残基的方式，优选为该间苯二酚衍生物的羟基与上述聚谷氨酸衍生物链段的侧链羧基形成酯键而成的结合残基。作为酯键，可以为该间苯二酚衍生物的间苯二酚取代基的羟基中的任意一个，也可以为其混合物。
作为通式(5)的R3b的间苯二酚衍生物，优选4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(通用名：Ganetespib)。
关于通式(5)的R3b的间苯二酚衍生物，在该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的同一分子中可以为同一化合物，也可以两种以上化合物混杂。该R3b优选为同一化合物。
通式(5)中，xb表示结合有上述R3b的间苯二酚衍生物的谷氨酸单元的总数。该结合有间苯二酚衍生物的谷氨酸单元是必要的构成，该xb为1以上的整数。该xb优选为2～18的整数、更优选为3～16的整数。
相对于作为聚谷氨酸衍生物的聚合数的上述(xb+yb)，xb的比例为1～100％。相对于上述(xb+yb)，xb的比例优选为10～90％、更优选为20～80％。
该xb的间苯二酚衍生物的结合数可以如下算出：将所得到的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物水解，利用HPLC对游离的间苯二酚衍生物或来自其的片段分子进行定量，由此计算出间苯二酚衍生物含量，由该数值计算出上述结合数。
通式(5)中的R4b为选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和羟基组成的组中的1种以上的取代基。
该R4b可以出于控制本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的物性的目的而任意地引入。例如，通过在该R4b中引入疏水性基团，能够提高该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的聚谷氨酸链段的疏水性。另一方面，作为该R4b，通过引入具备氨基、羧基、羟基等可形成盐的离子性官能团的亲水性的取代基，能够提高该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的聚谷氨酸链段的亲水性。另外，在该R4b为羟基的情况下，是上述聚谷氨酸链段的侧链羧基为游离羧酸的情况。
该R4b可以为单一种类，也可以为两种以上的取代基。
作为上述R4b中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷氧基。即，是上述聚谷氨酸链段的侧链羧基结合有酯型修饰基的烷氧基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4b中的该碳原子数(C1～C8)烷氧基，可以举出例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、环己氧基、苄氧基等。
作为上述R4b中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基氨基。即，是上述聚谷氨酸链段的侧链羧基结合有烷基酰胺型修饰基的烷基氨基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4b中的该碳原子数(C1～C8)烷基氨基，可以举出例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨基、叔丁基氨基、环己基氨基、苄基氨基等。
另外，对羧基进行了保护的氨基酸也包含在该具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基中。作为该对羧基进行了保护的氨基酸，可以使用例如甘氨酸甲酯、甘氨酸苄酯、β-丙氨酸甲酯、β-丙氨酸苄酯、丙氨酸甲酯、亮氨酸甲酯、苯丙氨酸甲酯等。
作为上述R4b中的具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的二(C1～C8)烷基氨基。即，是上述聚谷氨酸链段的侧链羧基结合有二烷基酰胺型修饰基的二烷基氨基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4b中的该二(C1～C8)烷基氨基，可以举出例如二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基氨基、N-苄基-N-甲基氨基等。
上述R4b也可以为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基。其是上述聚谷氨酸链段的侧链羧基结合有脲型修饰基的基团，并具有-N(R4bx)CONH(R4by)[该R4bx和该R4by可以相同也可以不同，表示可以被叔氨基取代的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基]作为侧链羧基。
该R4bx和R4by中的可以被叔氨基取代的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环己基、2-二甲基氨基乙基、3-二甲基氨基丙基等。
作为上述R4b中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基，例如为甲基氨基羰基甲基氨基、乙基氨基羰基乙基氨基、异丙基氨基羰基异丙基氨基、环己基氨基羰基环己基氨基、乙基氨基羰基(3-二甲氨基丙基)氨基、(3-二甲氨基丙基)氨基羰基乙基氨基等。
通式(5)中的R4b也可以为羟基。即，谷氨酸的侧链羧酸为游离羧酸。这种情况下，侧链羧酸可以为游离酸的形式，另外也可以为作为药品所允许的任意的羧酸盐的形式。作为上述羧酸盐，可以举出锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐等，包含在本发明中。
通式(4)中的R4b优选为碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和/或羟基。即，优选该R4b为碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和羟基混杂的方式、或该R4b仅为羟基的方式。
通式(4)中，yb表示结合有上述R4b的谷氨酸单元的总数。结合有该R4b的谷氨酸单元为任选的构成，该yb为0～19的整数。该yb优选为2～18的整数、更优选为4～17。
相对于作为聚谷氨酸衍生物的聚合数的上述(xb+yb)，yb的比例为0～99％。相对于上述(xb+yb)，yb的比例优选为10～90％、更优选为20～80％。
该R4b的结合数yb可以通过在碱性条件下对所得到的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物进行1H-NMR测定，由信号强度比算出。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物中，上述聚谷氨酸衍生物链段是在侧链羧基上具备上述R3b的谷氨酸衍生物单元与具备上述R4b的谷氨酸衍生物单元混杂的聚合物链段。具备该R3b的谷氨酸衍生物单元和具备该R4b的谷氨酸衍生物单元可以为以极化方式存在的嵌段聚合型，也可以为不规则地存在的无规聚合型。优选为具备上述R3b的谷氨酸衍生物单元与具备上述R4b的谷氨酸衍生物单元不规则地存在的无规聚合型的聚谷氨酸衍生物链段。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。在分子量小于2千道尔顿的情况下，基于高分子化的药代动力学特性无法得到发挥，有可能无法得到抗肿瘤效果的增强作用等所期望的药理作用。另一方面，在分子量超过15千道尔顿的情况下，抗肿瘤效果与副作用的背离变难，有可能强烈地表现出副作用。特别是，间苯二酚衍生物具有强烈表现出骨髓抑制等血液毒性的持久化的特征。在分子量超过15千道尔顿的情况下，强烈表现出血液毒性的持久化。因此，对于本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物来说，分子量的控制非常重要。本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的分子量优选为3千道尔顿以上12千道尔顿以下、进一步优选为3千道尔顿以上10千道尔顿以下。
关于本发明中的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的分子量，采用将其构成部分的各构成分子量相加得到的计算值作为该“间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的分子量”。即，将下述分子量相加得到的计算值作为该分子量：(1)聚乙二醇链段的分子量；(2)聚谷氨酸主链的分子量；(3)将间苯二酚衍生物的结合残基分子量乘以其结合数而得到的间苯二酚衍生物的总分子量；以及(4)将间苯二酚衍生物以外的结合基团残基分子量乘以其结合数而得到的该结合基团的总分子量。
该“间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的分子量”可以是以千道尔顿单位的精度规定的分子量。因此，上述各构成部分的分析方法只要是在该聚氨基酸衍生物的以千道尔顿单位计的分子量测定中具有充分精度的分析方法就没有特别限定，可以适当选择各种分析方法。下面，举出各构成部分中的优选分析方法。
各构成部分的各构成分子量的计算方法可以基于依据上述记载的方法来算出。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物具有在水溶液中显示出自缔合性的物性。即，为下述物性：通过激光散射法对该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液进行粒度分布测定时，该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物作为以体积平均粒径计为约几纳米～约20纳米的纳米颗粒被计测。本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物优选具有该衍生物在1mg/mL的水溶液中为体积平均粒径最大为小于20纳米的纳米颗粒的物性。这种情况下，是在基于纯水的水溶液中的粒度分布测定。优选特征在于，通过基于使用激光的动态光散射法的粒度分布测定法，以体积平均粒径小于20纳米被计测，更优选具有作为3～15纳米的纳米颗粒被计测的物性。
本发明中的体积平均粒径是指在利用Particle Sizing System公司制造的ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(分析方法：NICOMP法)或者Malvern公司制造的粒径·ζ电位测定装置Zetasizer Nano ZS(分析方法：NNLS法)测定得到的体积分布内存在的比例最多的峰的粒径。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物是亲水性的聚乙二醇链段与通过酯键而具备疏水性的间苯二酚衍生物的聚谷氨酸链段连结而成的嵌段共聚物，因而认为，在水溶液中，多个该嵌段共聚物彼此的聚谷氨酸链段基于疏水性相互作用而发生缔合。结果，推测形成核-壳结构的胶束状缔合体，其以聚谷氨酸链段为内核(核部)，亲水性的聚乙二醇链段覆盖内核的周围而形成了外壳层(壳部)，从而作为上述纳米颗粒被观测到。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物具有在水溶液中形成纳米颗粒的物性这一点对于抗肿瘤效果的增强作用和血液毒性的持久化抑制而言很重要。
作为本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的纳米颗粒形成性的指标，使用利用激光得到的光散射强度是有效的。即，可以将激光散射强度作为指标来确认该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。此时，下述方法是有效的：将甲苯作为光散射强度标准试样，以相对于甲苯的相对强度作为指标，确认该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。
关于本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物，其1mg/mL水溶液的激光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计为2倍以上50倍以下。在上述相对光散射强度小于2倍的情况下，表明该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物不具有充分的纳米颗粒形成性，无法充分获得向肿瘤等病变靶组织的药物迁移性和向组织内部的渗透性，因而药效表现有可能不充分。本发明中，相对光散射强度的数值是具有纳米颗粒形成能力的指标，只要光散射强度相对于甲苯为2倍以上即可，对其上限没有限制。即，可知：即使在上述相对光散射强度大于50倍的情况下，该高分子衍生物也具有充分的纳米颗粒形成能力。但是，该情况下，该嵌段共聚物的体内滞留性升高，会向病变靶组织以外进行药物递送，因而存在表现出血液毒性持久化等意料外的副作用的风险，因而需要控制为50倍以下。优选为40倍以下。
需要说明的是，关于该水溶液，是将利用不含微粒的纯水制备的水溶液作为分析试样而得到的分析值。该水溶液可以在溶液制备中任选地通过超声波照射而进行溶解。所制备的水溶液优选为为了进一步去除亚微米级的微粒而实施了过滤处理的水溶液。
关于本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物，该水溶液的光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计优选为2倍以上40倍以下，更优选为2倍以上30倍以下。
关于本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的纳米颗粒形成性分析中的利用激光的光散射强度的测定方法，将该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液作为测定试样，在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的条件下利用激光散射光度计进行测定的方法是适当的。作为测定设备，可以举出例如大塚电子公司制造的动态光散射光度计DLS-8000DL(测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm、ND滤光片2.5％、PH1：开启(OPEN)、PH2：狭缝(SLIT))。
需要说明的是，作为光散射强度测定的标准物质使用的甲苯只要是试剂级的纯度，就可以没有特别限定地使用。优选使用进行了在光散射分析的试样制备中通常进行的预处理过滤的甲苯。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物优选通式(2)所表示的间苯二酚衍生物的质量含量为10质量％以上60质量％以下。在该间苯二酚衍生物含量低于10质量％的情况下，疏水性的间苯二酚衍生物少，因而基于疏水性相互作用的纳米颗粒形成性降低。另一方面，在间苯二酚衍生物的含量多于60质量％的情况下，该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的水溶性有可能显著降低。该间苯二酚衍生物的质量含量优选为15质量％以上50质量％以下、进一步优选为15质量％以上40质量％以下。
通式(5)中，在R4b为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基的情况下，由于该R4b的结合基团为任选的取代基，因而其取代基含量为30质量％以下。优选为1质量％以上20质量％以下。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物中的聚乙二醇链段的质量含量优选为10质量％以上80质量％以下。在聚乙二醇链段的质量含量低于10质量％的情况下，该间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物不具备充分的水溶性，因而有可能无法确保水溶液中的纳米颗粒形成性。另一方面，在多于80质量％的情况下，具备间苯二酚衍生物的聚谷氨酸链段的质量含量相对降低，因而有可能无法确保水溶液中的纳米颗粒形成性。该聚乙二醇链段的质量含量优选为20质量％以上70质量％以下。进一步优选为30质量％以上65质量％以下。
作为本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的制造方法，可以举出下述方法：通过聚乙二醇链段和聚谷氨酸链段连结而成的嵌段共聚物与间苯二酚衍生物的缩合反应而进行制造的方法；使包含聚乙二醇链段的聚合物成分与间苯二酚衍生物结合聚谷氨酸衍生物结合的方法；等等。优选通过预先制备聚乙二醇链段与聚谷氨酸链段连结而成的嵌段共聚物，使其与间苯二酚衍生物进行缩合反应来制造的方法。
关于聚乙二醇链段与聚谷氨酸链段连结而成的嵌段共聚物的制备方法、以及通过使该嵌段共聚物与间苯二酚衍生物进行缩合反应来制造的方法，可以根据上述喜树碱衍生物结合嵌段共聚物中的制备方法来进行制造。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物在给药至生物体内后，通过使具有HSP90抑制活性的间苯二酚衍生物慢慢地断裂而游离，能够发挥出药理效果。因此，本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物能够用作用于治疗恶性肿瘤疾病或起因于细胞异常增殖的疾病的治疗用药品。
在将本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物用作药品的情况下，给药量当然可根据患者的性别、年龄、生理状态、病情等而变更，以活性成分计通常成人每天以非经口方式给药0.01～500mg/m2(体表面积)、优选0.1～250mg/m2来使用。作为给药途径，优选以非经口给药方式使用。基于注射的给药通过静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、肌肉内给药、肿瘤部内给药等进行。
本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物优选作为注射剂、片剂、散剂等通常使用的药物制剂来使用。在制剂化时，可以使用通常所使用的药学上允许的载体，例如粘结剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、防腐剂、舒缓剂、色素、香料等。在注射液剂的情况下，通常使用溶剂。作为溶剂，可以举出例如：水；生理盐水；5％葡萄糖或甘露醇溶液；水溶性有机溶剂，例如甘油、乙醇、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、聚乙二醇、发色团等和它们的混合液；以及水与该水溶性有机溶剂的混合液等。优选利用这些制剂用添加剂制备成可给药的药物制剂后使用。
关于本发明的间苯二酚衍生物结合嵌段共聚物的作为抗肿瘤剂的用途，被用于恶性肿瘤疾病的治疗。作为可治疗的恶性肿瘤疾病，没有特别限定，可以应用于对于乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、直肠结肠癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、软组织肉瘤、恶性皮肤癌、类癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、胆管癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤疾病的治疗。特别适合于间苯二酚衍生物被用于治疗的非小细胞肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌(不能手术或复发)、结肠/直肠癌(不能手术或复发)、乳腺癌(不能手术或复发)、鳞状细胞癌、恶性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)的治疗。
本发明可以举出使用被用作抗肿瘤剂的紫杉烷衍生物作为生理活性物质的该嵌段共聚物作为优选方式。下面，对使用紫杉烷衍生物作为生理活性物质的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物进行说明。
紫杉烷衍生物是与细胞内微管结合，基于解聚抑制作用而具有细胞增殖抑制活性的化合物，其被用作抗肿瘤剂。作为被用作抗肿瘤剂的紫杉烷衍生物，已知紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛等。这些化合物在紫杉烷环骨架内或侧链上具有羟基，因而通过将该羟基作为结合基团，能够应用于本发明的嵌段共聚物。即，为紫杉烷衍生物的羟基直接或藉由适当的结合基团与天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链羧基形成了酯键的方式。
本发明中，优选为通式(1)中的R3为紫杉烷衍生物的结合残基的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物。下面进行说明。
本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物是通式(1)所表示的聚乙二醇链段与聚(天冬氨酸和/或谷氨酸)衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，是R3为紫杉烷衍生物的结合残基的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物。即，为通式(1)所表示的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物。
[化20]
[式中，R1表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，t表示20～270的整数，A表示具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，R2表示选自由氢原子、碳原子数(C1～C6)酰基和碳原子数(C1～C20)烷氧羰基组成的组中的取代基，R3表示紫杉烷衍生物的结合残基，R4表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的二烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基、疏水性荧光物质的结合残基和羟基组成的组中的1种以上的取代基，B表示结合基团，n表示1或2，x1、x2、y1、y2和z各自独立地表示0～25的整数，(x1+x2)表示1～25的整数，(x1+x2+y1+y2+z)表示3～25的整数，结合了上述R3和R4的各构成单元以及侧链羰基发生了分子内环化的构成单元是各自独立地无规排列的结构。]
此处，通式中的R1、R2、R4、A、B、t、x1、x2、y1、y2、z与上述含义相同。
通式(1)的R3为紫杉烷衍生物的结合残基时，该紫杉烷衍生物已知有紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛等。它们在紫杉烷环和侧链上具有羟基，因而能够用作本发明的生理活性物质。
作为本发明的生理活性物质为紫杉烷衍生物时的优选方式，可以举出下述紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物，其为聚乙二醇链段与聚天冬氨酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，在天冬氨酸单元的侧链羧基上结合有紫杉烷衍生物。即，作为嵌段共聚物的聚氨基酸链段，优选使用聚天冬氨酸链段。需要说明的是，该聚天冬氨酸链段可以为α型聚合聚天冬氨酸链段，也可以为β型聚合聚天冬氨酸链段，还可以为α-β混合型聚合聚天冬氨酸链段。即，通式(1)中的n优选为1。
作为该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的更优选的方式，为通式(6)所表示的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物。
[化21]
[式中，R1c表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，tc表示20～270的整数，Ac表示具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，x1c、x2c、y1c、y2c和zc分别为整数，(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)表示3～25的整数，相对于该(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)，(x1c+x2c)的比例为1～100％且(y1c+y2c+zc)的比例为0～99％，R2c表示选自由氢原子、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)酰基和具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基组成的组中的1种，R3c表示紫杉烷衍生物的结合残基，R4c可以相同也可以不同，表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和羟基组成的组中的1种以上的取代基，结合了上述R3c的天冬氨酸单元、结合了上述R4c的天冬氨酸单元和侧链羰基发生了分子内环化的结构单元各自独立地以无规的排列进行了聚合。]
上述R1c中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷基等。可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、环戊基、正己基、环己基等。
上述具有或不具有的取代基可以举出卤原子、硝基、氰基、羟基、巯基、碳环芳基或杂环芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、烷氧基、芳氧基、酰基氧基、烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、取代或无取代氨基、酰基氨基、烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、酰基、羧基、烷氧羰基、氨基甲酰基或甲硅烷基等。芳香环上的取代位置可以为邻位、间位或对位。
作为该R1c，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、苄基、2,2-二甲氧基乙基、2,2-二乙氧基乙基、2-甲酰基乙基。更优选具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C4)烷基。特别是更优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。
作为上述Ac中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，可以举出亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚正丁基等。具有或不具有的取代基可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为该Ac，特别是更优选亚乙基、亚正丙基。
上述tc表示聚乙二醇链段中的亚乙基氧基的聚合数。该tc为20～270的整数。即，作为该聚乙二醇链段的分子量，为0.8千道尔顿～12千道尔顿。若作为聚乙二醇链段的聚合度的该tc小于20，则所得到的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物不具备充分的水溶性，并且有可能无法发挥所期望的体内动力学。另一方面，在该tc大于270的情况下，所得到的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的总分子量变大，有可能无法发挥出所期望的体内动力学，引发意料外的组织障碍。该tc优选为22～230的整数、更优选为30～180的整数。即，作为该聚乙二醇链段的分子量，优选为1千道尔顿～10千道尔顿、更优选为1.3千道尔顿～8千道尔顿。
通式(6)的嵌段共聚物具有聚天冬氨酸衍生物链段，(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)表示该聚天冬氨酸衍生物的聚合数。该聚天冬氨酸衍生物的聚合数为3～25，即(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)为3～25的整数。若该(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)小于3，在所得到的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物中后述的激光散射强度有可能不符合最佳范围。另一方面，在该(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)大于25时，随着所得到的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的总分子量变大，后述的激光散射强度有可能不符合最佳范围。即，若该(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)不在3～25的范围，则有可能无法得到抗肿瘤效果的增强作用和/或副作用的降低效果。聚天冬氨酸衍生物的聚合数优选考虑所得到的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的总分子量而适当设定。该(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)优选为5～20的整数。
该聚天冬氨酸衍生物的聚合数(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)可以通过利用1H-NMR的测定、或在结合后述的R3c和R4c前对聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物进行中和滴定来求出。
作为上述R2c中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)酰基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)酰基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R2c的该碳原子数(C1～C6)酰基，可以举出例如甲酰基、乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、丙酰基、新戊酰基、苄基羰基、苯乙基羰基等。更优选具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C4)酰基，更优选乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基。
作为上述R2c中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C6)烷氧羰基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R2c的该碳原子数(C1～C6)烷氧羰基，可以举出例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基等。
上述R3c的紫杉烷衍生物的结合残基中的紫杉烷衍生物优选为选自由紫杉醇、多西他赛和卡巴他赛组成的组中的1种以上。上述紫杉烷衍生物在紫杉烷环骨架内和侧链上分别具有羟基。该R3c的紫杉烷衍生物的结合方式没有特别限定，只要该任意一个羟基与聚天冬氨酸的侧链羧基形成酯键即可。
关于R3c的紫杉烷衍生物，在该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的同一分子中可以为同一化合物，也可以两种以上的化合物混杂。该R3c优选为同一化合物。
通式(6)中，(x1c+x2c)表示结合有上述R3c的紫杉烷衍生物的天冬氨酸单元的总数。该结合有紫杉烷衍生物的氨基酸单元是必要的构成，该(x1c+x2c)为1以上的整数。该(x1c+x2c)优选为2～20的整数、更优选为2～15的整数。
相对于作为聚氨基酸衍生物的聚合数的上述(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)，(x1c+x2c)的比例为1～100％。相对于上述(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)，(x1c+x2c)的比例优选为5～80％，更优选为5～60％。
该(x1c+x2c)的紫杉烷衍生物的结合数可以如下算出：将该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物水解，利用HPLC对游离的紫杉烷衍生物或来自其的片段分子进行定量，由此计算出紫杉烷衍生物含量，由该数值计算出上述结合数。另外，也可以由制备该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物时的紫杉烷衍生物的反应率计算出该紫杉烷衍生物的含量，由该数值计算出上述结合数。
R4c为选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和羟基组成的组中的1种以上的取代基。
该R4c可以出于控制本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的物性的目的而任意地引入。例如，通过在该R4c中引入疏水性基团，能够提高该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的聚氨基酸链段的疏水性。另一方面，作为该R4c，通过引入具备氨基、羧基、羟基等可形成盐的离子性官能团的亲水性的取代基，能够提高该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的聚氨基酸链段的亲水性。另外，在该R4c为羟基的情况下，是上述聚天冬氨酸链段的侧链羧基为游离羧酸的情况。
该R4c可以为单一种类，也可以为两种以上的取代基。
作为上述R4c中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷氧基。即，是上述聚天冬氨酸链段的侧链羧基结合有酯型修饰基的烷氧基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4中的该碳原子数(C1～C8)烷氧基，可以举出例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、环己氧基、苄氧基等。
作为上述R4c中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基氨基。即，是上述聚天冬氨酸链段的侧链羧基结合有烷基酰胺型修饰基的烷基氨基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4c中的该碳原子数(C1～C8)烷基氨基，可以举出例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨基、叔丁基氨基、环己基氨基、苄基氨基等。
另外，对羧基进行了保护的氨基酸也包含在该具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基中。作为该对羧基进行了保护的氨基酸，可以使用例如甘氨酸甲酯、甘氨酸苄酯、β-丙氨酸甲酯、β-丙氨酸苄酯、丙氨酸甲酯、亮氨酸甲酯、苯丙氨酸甲酯等。
作为上述R4c中的具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基，可以举出具有或不具有取代基的直链状、支链状或环状的二(C1～C8)烷基氨基。即，是上述聚天冬氨酸链段的侧链羧基结合有二烷基酰胺型修饰基的二烷基氨基。作为取代基，可以具备羟基、卤原子、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、芳基等。作为上述R4中的该二(C1～C8)烷基氨基，可以举出例如二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、吡咯烷基、哌啶基、二苄基氨基、N-苄基-N-甲基氨基等。
上述R4c也可以为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基。其是上述聚天冬氨酸链段的侧链羧基结合有脲型修饰基的基团，并具有-N(R4cx)CONH(R4cy)[该R4cx和该R4cy可以相同也可以不同，表示可以被叔氨基取代的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基]作为侧链羧基。
该R4cx和R4cy中的可以被叔氨基取代的直链状、支链状或环状的碳原子数(C1～C8)烷基可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环己基、2-二甲基氨基乙基、3-二甲基氨基丙基等。
作为上述R4c中的具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基，例如为甲基氨基羰基甲基氨基、乙基氨基羰基乙基氨基、异丙基氨基羰基异丙基氨基、环己基氨基羰基环己基氨基、乙基氨基羰基(3-二甲氨基丙基)氨基、(3-二甲氨基丙基)氨基羰基乙基氨基等。
通式(6)中的R4c也可以为羟基。即，氨基酸的侧链羧酸为游离羧酸。这种情况下，侧链羧酸可以为游离酸的形式，另外也可以为作为药品所允许的任意的羧酸盐的形式。作为上述羧酸盐，可以举出锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐等，包含在本发明中。
通式(6)中的R4c优选为碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和/或羟基。即，优选该R4为碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基和羟基混杂的方式、或该R4c仅为羟基的方式。
通式(6)中，(y1c+y2c)表示结合有上述R4c的天冬氨酸单元的总数。结合有该R4c的天冬氨酸单元为任选的构成，该(y1c+y2c)为0～24的整数。该(y1c+y2c)优选为5～24的整数、更优选为10～24。
相对于作为聚天冬氨酸衍生物的聚合数的上述(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)，(y1c+y2c)的比例为0～99％。相对于上述(x1c+x2c+y1c+y2c+zc)，(y1c+y2c)的比例优选为10～95％，更优选为30～95％。
另外，zc是侧链羰基发生了分子内环化的天冬氨酸结构单元的总数，为任选的构成。该z是从聚天冬氨酸衍生物的聚合数中除去结合有上述R3c和R4c的天冬氨酸结构单元后的剩余部分。
因此，结合有具备紫杉烷衍生物的结合残基的R4c的天冬氨酸单元以外的天冬氨酸结构单元的总数(y1c+y2c+zc)相对于聚天冬氨酸衍生物链段的总聚合数的比例为0～99％。优选为20～95％、更优选为40～95％。
在通式(6)所表示的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物中，上述聚天冬氨酸衍生物链段是在侧链羧基上具备上述R3c的天冬氨酸衍生物单元、具备上述R4c的天冬氨酸衍生物单元、以及侧链羰基发生了分子内环化的天冬氨酸单元混杂的聚合物链段。具备该R3c的天冬氨酸衍生物单元、具备该R4c的天冬氨酸衍生物单元、以及侧链羰基发生了分子内环化的天冬氨酸单元可以以极化方式存在，也可以为不规则地存在的无规聚合型。优选为具备上述R3c的氨基酸衍生物单元、具备上述R4c的氨基酸衍生物单元、以及侧链羰基发生了分子内环化的天冬氨酸单元不规则地存在的无规聚合型的聚天冬氨酸衍生物链段。
本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。在分子量小于2千道尔顿的情况下，基于高分子化的药代动力学特性无法得到发挥，有可能无法得到抗肿瘤效果的增强作用等所期望的药理作用。另一方面，在分子量超过15千道尔顿的情况下，抗肿瘤效果与副作用的背离变难，有可能强烈地表现出副作用。特别是，紫杉烷衍生物具有强烈表现出骨髓抑制等血液毒性的持久化的特征。在分子量超过15千道尔顿的情况下，强烈表现出血液毒性的持久化。因此，对于本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物来说，分子量的控制非常重要。本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的分子量优选为3千道尔顿以上15千道尔顿以下、进一步优选为3千道尔顿以上12千道尔顿以下。
关于本发明中的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的分子量，采用将其构成部分的各构成分子量相加得到的计算值作为该“紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的分子量”。即，将下述分子量相加得到的计算值作为该分子量：(1)聚乙二醇链段的分子量；(2)聚天冬氨酸主链的分子量；(3)将紫杉烷衍生物的结合残基分子量乘以其结合数而得到的紫杉烷衍生物的总分子量；以及(4)将紫杉烷衍生物以外的结合基团残基分子量乘以其结合数而得到的该结合基团的总分子量。
该“紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的分子量”可以是以千道尔顿单位的精度规定的分子量。因此，上述各构成部分的分析方法只要是在该聚氨基酸衍生物的以千道尔顿单位计的分子量测定中具有充分精度的分析方法就没有特别限定，可以适当选择各种分析方法。下面，举出各构成部分中的优选分析方法。
各构成部分的各构成分子量的计算方法可以基于依据上述记载的方法来算出。
本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物具有在水溶液中显示出自缔合性的物性。即，为下述物性：通过激光散射法对该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液进行粒度分布测定时，该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物作为以体积平均粒径计为约几纳米～约20纳米的纳米颗粒被计测。本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物优选具有该衍生物在1mg/mL的水溶液中为体积平均粒径最大为小于20纳米的纳米颗粒的物性。这种情况下，是在基于纯水的水溶液中的粒度分布测定。优选特征在于，通过基于使用激光的动态光散射法的粒度分布测定法，以体积平均粒径小于20纳米被计测，更优选具有作为3～15纳米的纳米颗粒被计测的物性。
本发明中的体积平均粒径是指在利用Particle Sizing System公司制造的ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(分析方法：NICOMP法)或者Malvern公司制造的粒径·ζ电位测定装置Zetasizer Nano ZS(分析方法：NNLS法)测定得到的体积分布内存在的比例最多的峰的粒径。
本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物是亲水性的聚乙二醇链段与通过酯键而具备疏水性的紫杉烷衍生物的聚天冬氨酸链段连结而成的嵌段共聚物，因而认为，在水溶液中，多个该嵌段共聚物彼此的聚天冬氨酸链段基于疏水性相互作用而发生缔合。结果，推测形成核-壳结构的胶束状缔合体，其以聚天冬氨酸链段为内核(核部)，亲水性的聚乙二醇链段覆盖内核的周围而形成了外壳层(壳部)，从而作为上述纳米颗粒被观测到。
为了增强紫杉烷衍生物的药效和/或降低副作用，本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物需要具有在水溶液中形成纳米颗粒的物性。
作为本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的纳米颗粒形成性的指标，使用利用激光得到的光散射强度是有效的。即，可以将激光散射强度作为指标来确认该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。此时，下述方法是有效的：将甲苯作为光散射强度标准试样，以相对于甲苯的相对强度作为指标，确认该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物在水溶液中的纳米颗粒形成性。
关于本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物，其1mg/mL水溶液的激光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计至少为2倍以上。在上述相对光散射强度小于2倍的情况下，表明该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物不具有充分的纳米颗粒形成性，无法获得向靶组织的充分的渗透性，有可能引起副作用的表现。本发明中，相对光散射强度的数值是具有纳米颗粒形成能力的指标，只要光散射强度相对于甲苯为2倍以上即可，对其上限没有限制。即，可知：即使在上述相对光散射强度大于100倍的情况下，该高分子衍生物也具有充分的纳米颗粒形成能力。
关于本发明的紫杉烷类结合嵌段共聚物，该水溶液的光散射强度以相对于甲苯的光散射强度的相对强度计优选为2倍以上70倍以下，更优选为2倍以上50倍以下。
需要说明的是，关于该水溶液，是将利用不含微粒的纯水制备的水溶液作为分析试样而得到的分析值。该水溶液可以在溶液制备中任选地通过超声波照射而进行溶解。所制备的水溶液优选为为了进一步去除亚微米级的微粒而实施了过滤处理的水溶液。
关于本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的纳米颗粒形成性分析中的利用激光的光散射强度的测定方法，将该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的1mg/mL水溶液作为测定试样，在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的条件下利用激光散射光度计进行测定的方法是适当的。作为测定设备，可以举出例如大塚电子公司制造的动态光散射光度计DLS-8000DL(测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm、ND滤光片2.5％、PH1：开启(OPEN)、PH2：狭缝(SLIT))。
需要说明的是，作为光散射强度测定的标准物质使用的甲苯只要是试剂级的纯度，就可以没有特别限定地使用。优选使用进行了在光散射分析的试样制备中通常进行的预处理过滤的甲苯。
本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物优选通式(1)中的R3c所表示的紫杉烷衍生物的质量含量为10质量％以上60质量％以下。在该紫杉烷衍生物含量低于10质量％的情况下，疏水性紫杉烷衍生物少，因而基于疏水性相互作用的纳米颗粒形成性降低。另一方面，在紫杉烷衍生物的含量多于60质量％的情况下，该紫杉烷类结合嵌段共聚物的水溶性有可能显著降低。该紫杉烷衍生物的质量含量优选为10质量％以上50质量％以下、进一步优选为10质量％以上40质量％以下。
关于本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物，在通式(6)中R4c为具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基、具有或不具有取代基的二(C1～C8)烷基氨基或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基的情况下，由于该R4c的结合基团为任选的取代基，因而其取代基含量为30质量％以下。优选为1质量％以上20质量％以下。
本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物中的聚乙二醇链段的质量含量优选为10质量％以上80质量％以下。在聚乙二醇链段的质量含量低于10质量％的情况下，该紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物不具备充分的水溶性，因而有可能无法确保水溶液中的纳米颗粒形成性。另一方面，在多于80质量％的情况下，具备紫杉烷衍生物的聚天冬氨酸链段的质量含量相对降低，因而有可能无法确保水溶液中的纳米颗粒形成性。该聚乙二醇链段的质量含量优选为20质量％以上70质量％以下、进一步优选为30质量％以上65质量％以下。
作为本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的制造方法，可以举出下述方法：通过聚乙二醇链段和聚天冬氨酸链段连结而成的嵌段共聚物与紫杉烷衍生物的缩合反应来制造的方法；使包含聚乙二醇链段的聚合物成分与紫杉烷衍生物结合聚天冬氨酸衍生物结合的方法；等等。优选通过预先制备聚乙二醇链段与聚天冬氨酸链段连结而成的嵌段共聚物，使其与紫杉烷衍生物进行缩合反应来制造的方法。
关于聚乙二醇链段与聚天冬氨酸链段连结而成的嵌段共聚物的制备方法、以及通过使该嵌段共聚物与紫杉烷衍生物进行缩合反应来制造的方法，可以根据上述喜树碱衍生物结合嵌段共聚物中的制备方法来进行制造。
本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物在给药至生物体内后，通过使紫杉烷衍生物慢慢地断裂而游离，能够发挥出药理效果。因此，本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物能够用作用于治疗恶性肿瘤疾病的抗肿瘤剂。
在将本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物用作抗肿瘤剂的情况下，给药量当然可根据患者的性别、年龄、生理状态、病情等而变更，以活性成分计通常成人每天以非经口方式给药0.01～500mg/m2(体表面积)、优选0.1～250mg/m2来使用。作为给药途径，优选以非经口给药方式使用。基于注射的给药通过静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、肌肉内给药、肿瘤部内给药等进行。
本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物优选作为注射剂、片剂、散剂等通常使用的药物制剂来使用。在制剂化时，可以使用通常所使用的药学上允许的载体，例如粘结剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、防腐剂、舒缓剂、色素、香料等。在注射液剂的情况下，通常使用溶剂。作为溶剂，可以举出例如：水；生理盐水；5％葡萄糖或甘露醇溶液；水溶性有机溶剂，例如甘油、乙醇、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、聚乙二醇、发色团等和它们的混合液；以及水与该水溶性有机溶剂的混合液等。优选利用这些制剂用添加剂制备成可给药的药物制剂后使用。
关于本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的作为抗肿瘤剂的用途，被用于恶性肿瘤疾病的治疗。作为可治疗的恶性肿瘤疾病，没有特别限定，可以应用于对于乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、直肠结肠癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、软组织肉瘤、恶性皮肤癌、类癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、胆管癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤疾病的治疗。特别适合于紫杉烷衍生物被用于治疗的非小细胞肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌(不能手术或复发)、结肠/直肠癌(不能手术或复发)、乳腺癌(不能手术或复发)、鳞状细胞癌、恶性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)的治疗。
实施例
下面，通过实施例来进一步说明本发明。但是本发明并不受这些实施例的限定。
实施例和比较例的生理活性物质结合嵌段共聚物的散射强度测定利用大塚电子公司制造的动态光散射光度计DLS-8000DL(测定温度25℃、散射角度：90°、波长：632.8nm、ND滤光片：5％、PH1：开启(OPEN)、PH2：狭缝(SLIT))进行。散射强度测定的测定样品使用了下述溶液：以生理活性物质结合嵌段共聚物浓度达到1mg/mL的方式加入超纯水，在冰冷条件下照射10分钟超声波进行溶解，之后用0.2μm膜过滤器进行过滤。
光散射强度的测定中使用的甲苯(纯正化学公司制造、特级)在用0.2μm膜过滤器过滤3次后使用。
另外，实施例和比较例的生理活性物质结合嵌段共聚物的体积平均粒径的测定利用Particle Sizing System公司制造的ZetaPotential/Particlesizer NICOMP 380ZLS(设备A：温度：25℃)或者Malvern公司制造的粒径·ζ电位测定装置Zetasizer Nano ZS(设备B：测定温度：25℃、分析模式：一般用途(正常分辨率)、材料RI：1.59)进行。体积平均粒径测定样品使用了下述溶液：以生理活性物质结合嵌段共聚物浓度达到1mg/mL或5mg/mL的方式加入超纯水，在冰冷条件下照射10分钟超声波进行溶解，之后用0.2μm膜过滤器进行过滤。
[合成例1]聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2千道尔顿、聚谷氨酸聚合数8；共聚物1)的合成。
将单末端为甲氧基、单末端为3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-20H、日油公司制造、平均分子量2千道尔顿、7.00g)溶解于DMSO(140mL)中后，加入L-谷氨酸γ-苄酯N-羧酸酐(7.35g)，在30℃搅拌24小时。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(2520mL)和乙醇(280mL)混合液中，在室温下搅拌一晚。之后，滤取析出物，在减压下干燥，得到聚合物(12.77g)。
将所得到的聚合物溶解于DMF(168mL)中，加入乙酸酐(2.6mL)，在20℃搅拌21小时。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(1350mL)和乙酸乙酯(150mL)混合液中，在室温下搅拌一晚。之后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到乙酰化聚合物(11.66g)。
将所得到的乙酰化聚合物溶解于DMF(291mL)中，加入5％钯-碳(1.17g)。之后，对反应气氛进行氢气置换，在室温、1气压下进行24小时氢解。滤出5％钯-碳催化剂后，用1小时将滤液滴加至庚烷(1654mL)和乙酸乙酯(827mL)混合液中，在室温下搅拌一晚。之后，滤取析出物，在减压下干燥。将该析出物再溶解于水中，冷冻干燥，由此得到聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(共聚物1，9.66g)。
关于共聚物1，通过使用0.1N氢氧化钾的滴定法计算出谷氨酸的聚合数为7.59。
[合成例2]聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2千道尔顿、聚谷氨酸聚合数10；共聚物2)的合成。
将单末端为甲氧基、单末端为3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-20H、日油公司制造、平均分子量2千道尔顿、5.00g)溶解于DMSO(100mL)中后，加入L-谷氨酸γ-苄酯N-羧酸酐(7.50g)，在30℃搅拌17小时。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(1800mL)和乙醇(200mL)混合液中，在室温下搅拌一晚后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到聚合物(10.64g)。
将所得到的聚合物溶解于DMF(176mL)中，加入乙酸酐(2.1mL)，在20℃搅拌23小时。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(1584mL)和乙酸乙酯(176mL)混合液中，在室温下搅拌一晚后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到乙酰化聚合物(9.91g)。
将所得到的乙酰化聚合物溶解于DMF(198mL)中，加入5％钯-碳(0.99g)后进行氢气置换，在室温、1气压下进行85小时氢解。滤出5％钯-碳催化剂后，用1小时将滤液滴加至庚烷(1125mL)和乙酸乙酯(563mL)混合液中，在室温下搅拌一晚后，滤取析出物。将该析出物溶解于5％盐水(570mL)中，用2N氢氧化钠水溶液将溶解液的pH调整为约10后，利用分配吸附树脂柱层析、接着利用离子交换树脂柱层析进行纯化。将洗脱的溶液减压浓缩后，冷冻干燥，由此得到聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(共聚物2，5.66g)。
关于共聚物2，基于使用0.1N氢氧化钾得到的滴定值，谷氨酸的聚合数为10.01。
[合成例3]聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量5千道尔顿、聚谷氨酸聚合数10；共聚物3)的合成。
使用单末端为甲氧基、单末端为3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-50H、日油公司制造、平均分子量5千道尔顿、10.00g)和L-谷氨酸γ-苄酯N-羧酸酐(6.02g)，根据合成例2中记载的方法，得到标题的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(共聚物3)。
关于共聚物3，基于使用0.1N氢氧化钾得到的滴定值，谷氨酸的聚合数为10.02。
[合成例4]聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量12千道尔顿、聚谷氨酸聚合数25；共聚物4)的合成。
根据专利文献1(国际公开WO2004/039869号)的参考例1中记载的方法，得到标题的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(共聚物4)。
关于共聚物4，基于使用0.1N氢氧化钾得到的滴定值，谷氨酸的聚合数为24.54。
[合成例5]聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量3千道尔顿、聚谷氨酸聚合数7；共聚物5)的合成。
使用单末端为2-(叔丁氧基羰基氨基)乙基、单末端为2-氨基乙基的聚乙二醇(H2N-PEG-NH-Boc、RAPP POLYMERE公司制造、平均分子量3千道尔顿、5.00g)和L-谷氨酸γ-苄酯N-羧酸酐(6.02g)，根据合成例1中记载的方法，得到标题的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(共聚物5)。
关于共聚物5，基于使用0.1N氢氧化钾得到的滴定值，谷氨酸的聚合数为6.55。
[合成例6]聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量12千道尔顿、聚谷氨酸聚合数7；共聚物6)的合成。
根据专利文献1(国际公开WO2004/039869号)的参考例2中记载的方法，得到标题的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(共聚物6)。
关于共聚物6，基于使用0.1N氢氧化钾得到的滴定值，谷氨酸的聚合数为7.50。
[实施例A-1]聚乙二醇(2千道尔顿)-聚谷氨酸(7.6聚合物)嵌段共聚物的7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC)结合体的合成。
将合成例1中得到的共聚物1(221mg)和7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC SCINOPHARM公司制造、120mg)溶解于DMF(17mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP10mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI 174μL)，在25℃搅拌24小时。之后，追加DIPCI(174μL)，进一步搅拌3小时。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(230mL)和乙酸乙酯(26mL)混合液中，在室温下搅拌一晚后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物(250mg)。将所得到的产物溶解于乙腈/水(98/2(v/v)、7mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌7小时。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物(实施例A-1)。
将实施例A-1利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的EHC进行定量，求出EHC含量。其结果，实施例A-1中的EHC含量为29.0％(w/w)。
将实施例A-1在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与EHC的结合残基之比为0.46。
由这些值计算出实施例A-1的总分子量为4519。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为44.3％。
另外，实施例A-1的1mg/mL水溶液的光散射强度为17,070cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为5,535cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为3.1倍。体积平均粒径为6nm(设备A、1mg/mL)。
[实施例A-2]聚乙二醇(2千道尔顿)-聚谷氨酸(10.0聚合物)嵌段共聚物的7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC)结合体的合成。
使用合成例2中得到的共聚物2(324mg)和7-乙基-10-羟基喜树碱(EHCSCINOPHARM公司制造、210mg)，根据实施例A-1中记载的方法，得到标题的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物(实施例A-2)。
将实施例A-2利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的EHC进行定量，求出EHC含量。其结果，实施例A-2中的EHC含量为33.1％(w/w)。
将实施例A-2在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与EHC的结合残基之比为0.47。
由这些值计算出实施例A-2的总分子量为5,255。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为38.1％。
另外，实施例A-2的1mg/mL水溶液的光散射强度为27,149cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为5,535cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为4.9倍。体积平均粒径为10nm(设备A、1mg/mL)。
[实施例A-3]聚乙二醇(5千道尔顿)-聚谷氨酸(10.0聚合物)嵌段共聚物的7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC)结合体的合成。
使用合成例3中得到的共聚物3(3.00g)和7-乙基-10-羟基喜树碱(EHCSCINOPHARM公司制造、1.02g)，根据实施例A-1中记载的方法，得到标题的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物(实施例A-3)。
将实施例A-3利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的EHC进行定量，求出EHC含量。其结果，实施例A-3中的EHC含量为21.0％(w/w)。
将实施例A-3在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与EHC的结合残基之比为0.44。
由这些值计算出实施例A-3的总分子量为8,225。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为60.8％。
另外，实施例A-3的1mg/mL水溶液的光散射强度为16,750cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为5,535cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为3.0倍。体积平均粒径为8nm(设备A、1mg/mL)。
[实施例A-4]聚乙二醇(2千道尔顿)-聚谷氨酸(7.6聚合物)嵌段共聚物的7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC)和2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合体的合成。
将合成例1中得到的共聚物1(981mg)和2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮(藤本分子化学公司制造、42.2mg)溶解于DMF(50mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP 45mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI 35μL)，在25℃搅拌3小时，追加DIPCI(35μL)后进一步搅拌1小时。之后，加入7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC SCINOPHARM公司制造、532mg)和DIPCI(771μL)，搅拌24小时。加入DIPCI(771μL)并进一步搅拌4小时后，用1小时将反应液滴加至二异丙醚(675mL)和乙酸乙酯(75mL)混合液中，在室温下搅拌一晚后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物。将所得到的产物溶解于乙腈/水(98/2(v/v)、30mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌7小时。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物(实施例A-4)。
将实施例A-4利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的EHC进行定量，求出EHC含量。其结果，实施例A-4中的EHC含量为24.2％(w/w)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的消耗率，实施例A-4的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合量为1分子。因此，计算出实施例A-4的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮总分子量为377。
由这些值计算出实施例A-4的总分子量为4,617。
由此，实施例A-4中的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的含量为8.2质量％，聚乙二醇链段的含量为43.3质量％。
实施例A-4作为实施例A-1的荧光标记体用于后述的分布试验。
[比较例A-1]聚乙二醇(12千道尔顿)-聚谷氨酸(25聚合物)嵌段共聚物的7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC)结合体的合成。
根据专利文献1(国际公开WO2004/039869号)的实施例1中记载的方法，使用合成例4中得到的共聚物4，得到标题的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物(比较例A-1)。
将比较例A-1利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的EHC进行定量，求出EHC含量。其结果，比较例A-1中的EHC含量为22.5％(w/w)。
将比较例A-1在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与EHC的结合残基之比为0.26。
由这些值计算出比较例A-1的总分子量为19,245。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为62.4％。
另外，比较例A-1的1mg/mL水溶液的光散射强度为41,321cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为5,535cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为7.5倍。体积平均粒径为20nm(设备A、1mg/mL)。
[比较例A-2]聚乙二醇(3千道尔顿)-聚谷氨酸(6.6聚合物)嵌段共聚物的7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC)结合体的合成。
使用合成例5中得到的共聚物5(250mg)和7-乙基-10-羟基喜树碱(EHCSCINOPHARM公司制造、91mg)，根据实施例A-1中记载的方法，得到标题的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物(比较例A-2)。
将比较例A-2利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的EHC进行定量，求出EHC含量。其结果，比较例2中的EHC含量为20.1％(w/w)。
将比较例A-2在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与EHC的结合残基之比为0.37。
由这些值计算出比较例A-2的总分子量为5,031。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为59.6％。
另外，比较例A-2的1mg/mL水溶液的光散射强度为9,964cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为5,535cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为1.80倍。比较例A-2的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物为非缔合性。
[比较例A-3]聚乙二醇(12千道尔顿)-聚谷氨酸(7.5聚合物)嵌段共聚物的7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC)结合体的合成。
根据专利文献1记载的方法，使用合成例6中得到的共聚物6，得到标题的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物(比较例A-3)。
将比较例A-3利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的EHC进行定量，求出EHC含量。其结果，比较例A-3中的EHC含量为7.8％(w/w)。
将比较例A-3在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与EHC的结合残基之比为0.28。
由这些值计算出比较例A-3的总分子量为14,094。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为85.1％。
另外，比较例A-3的1mg/mL水溶液的光散射强度为5,625cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为5,535cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为1.0倍。比较例A-3的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物为非缔合性。
[比较例A-4]聚乙二醇(12千道尔顿)-聚谷氨酸(25聚合物)嵌段共聚物的7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC)和2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合体的合成。
将合成例4中得到的共聚物4(6g)和2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮(藤本分子化学公司制造、162.3mg)溶解于DMF(160mL)中，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物n水合物(DMT-MM、145mg)，在25℃搅拌29小时，用20分钟将反应液滴加至二异丙醚(1460mL)和乙醇(360mL)混合液中，在室温搅拌40分钟后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物。将所得到的产物和7-乙基-10-羟基喜树碱(EHC SCINOPHARM公司制造、1778mg)溶解于DMF(250mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP151mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI2583μL)，在25℃搅拌22小时。之后，追加DIPCI(646μL)，进一步搅拌2小时。用30分钟将反应液滴加至二异丙醚(3000mL)和乙醇(1000mL)混合液中，在室温搅拌1小时后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物(7.3g)。将所得到的产物溶解于乙腈/水(98/2(v/v)、7mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌3小时。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物(比较例A-4)。
将比较例A-4利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的EHC进行定量，求出EHC含量。其结果，比较例A-4中的EHC含量为19.1％(w/w)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的消耗率，比较例A-4的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合量为1分子。因此，计算出比较例A-4的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮总分子量为377。
由这些值计算出比较例A-4的总分子量为19,007。
由此，比较例A-4中的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的含量为1.9质量％，聚乙二醇链段的含量为63.1质量％。
比较例A-4作为比较例A-1的荧光标记体用于后述的分布试验。
[试验例A-1]肿瘤内分布试验
将通过BALB/c裸小鼠的皮下移植进行了传代培养的人胰腺癌BxPC3的肿瘤块切成约3mm见方的块，利用套管针移植至裸小鼠的背侧部皮下。分别用5％葡萄糖注射液溶解实施例A-4和比较例A-4，按照以7-乙基-10-羟基喜树碱换算量计为50mg/kg分别单次给药至静脉内。给药30分钟后，在异氟烷麻醉下从小鼠中除去血液，制作所取出的肿瘤的冷冻包埋切片，进行荧光观察。结果示于图1。
试验例A-1的结果，实施例A-4在肿瘤切片的广泛区域内观察到荧光信号。由此表明，实施例A-4的嵌段共聚物能够渗透至肿瘤组织的深部。与此相对，比较例A-4的情况下，荧光仅不均匀存在于肿瘤的外缘部，表明作为嵌段共聚物无法渗透至肿瘤组织的深部。因此暗示，实施例A-4能够渗透至肿瘤组织整个区域，能够使作为结合药物的喜树碱衍生物作用于肿瘤组织整体。
[试验例A-2]肾脏内分布试验
分别用5％葡萄糖注射液溶解实施例A-4和比较例A-4，按照以7-乙基-10-羟基喜树碱换算量计为50mg/kg向C.B-17SCID小鼠静脉内单次给药。给药30分钟后，在异氟烷麻醉下从小鼠中除去血液，制作所取出的肾脏的冷冻包埋切片，进行荧光观察。结果示于图2。
试验例A-2的结果，实施例A-4在肾脏的血管内和肾小管观察到荧光。因此表明，实施例A-4的嵌段共聚物虽然为高分子体，但具有通过肾排泄的物性。另一方面，在比较例A-4的情况下，除肾脏的血管内以外未确认到荧光，表明不通过肾排泄。
[试验例A-3]对于非荷瘤小鼠的肝毒性试验
[给药]
将实施例A-1和实施例A-2、以及比较例A-2和比较例A-3溶解于5％葡萄糖注射液中，基于给药当天的测定体重，按照作为各化合物的最大耐受剂量附近的、以7-乙基-10-羟基喜树碱换算为50mg/kg或100mg/kg的用量，对雄性6周龄Crl：CD1(ICR)(ICR(IGS))小鼠进行尾静脉内单次给药。作为对照组，尾静脉内单次给药5％葡萄糖注射液。
[血液化学检查]
给药各化合物3天后，在异氟烷麻醉下，利用安装有27G注射针的1mL一次性注射器从腹主动脉进行采血。预先在注射器中添加约10μL肝素钠溶液，与采集的血液充分混合。将离心分离(4℃、1600×g、10分钟)后得到的血浆作为测定试样，使用7180型自动生化分析装置(株式会社Hitachi High-Technologies)进行了血液化学检查。将血浆中ALT(alanineaminotransferase，丙氨酸转氨酶)的测定结果示于表1。
[表1]
[表1]血液化学检查(ALT)结果
在血液化学检查中，比较例A-2确认到ALT的显著增加，确认到肝毒性的表现。比较例A-3虽然给药量低，但ALT增加，肝毒性的表现明显。与此相对，实施例A-1和A-2的化合物未确认到ALT的大幅增加，表明肝毒性轻微。
比较例A-2和比较例A-3的化合物均为非缔合性，是水溶液中的光散射强度为甲苯的光散射强度的2倍以下的化合物。由以上结果表明，喜树碱衍生物结合嵌段共聚物在水溶液中的光散射强度所表示的分析值与肝毒性表现有关。因此，通过将甲苯作为激光散射强度测定的标准物质，并使该水溶液的光散射强度为甲苯相对强度，能够制备肝毒性表现低的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物。
[试验例A-4]对于非荷瘤大鼠的血液毒性试验
[给药]
将实施例A-1和实施例A-3、以及比较例A-1和比较例A-2的化合物溶解于5％葡萄糖注射液中，基于给药当天的测定体重，按照以7-乙基-10-羟基喜树碱换算为40mg/kg的用量，对雄性7周龄的Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD；IGS、Charles River LaboratoriesJapan,Inc.)进行尾静脉内单次给药。作为对照组，尾静脉内单次给药5％葡萄糖注射液。
[血液学检查]
给药各化合物3、5、7、11、14天后，在无麻醉下，利用安装有26G注射针的1mL一次性注射器从锁骨下静脉进行采血。预先在注射器中添加约3μL EDTA-2K溶液，与采集的血液充分混合，作为分析试样。使用血细胞分析装置XT-2000iV(Sysmex株式会社)对血液试样进行血细胞分析。将给药7天后的网织红细胞数示于表2。
[表2]
[表2]血液学检查(网织红细胞)结果
**给药后第7天的各处置组中的网织红细胞数(×104/μL)
血液学检查的结果，比较例A-1在给药7天后使网织红细胞数降低，确认到血液毒性的持久化。与此相对，本发明的实施例A-1和A-3的化合物在给药后7天的时刻网织红细胞数未减少，未确认到血液毒性的持久化。因此，推测实施例A-1和A-3的化合物不会使血液毒性持久化。
比较例A-1是分子量为19千道尔顿的化合物。另一方面，实施例A-1、A-3和比较例A-2的分子量小。由以上结果认为，喜树碱衍生物结合嵌段共聚物的血液毒性的持久化与分子量有关。因此，通过制成分子量为15千道尔顿以下的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物，能够制备避免了血液毒性的持久化的抗肿瘤剂。
[试验例A-5]对于人胃癌移植裸小鼠的抗肿瘤效果试验
将在裸小鼠皮下进行了传代培养的人胃癌SC-4-JCK的肿瘤块切成约3mm见方的块，利用套管针移植至裸小鼠的背侧部皮下。在肿瘤移植后平均肿瘤体积达到约150mm3以上的时刻，将实施例A-1、实施例A-2和实施例A-3、以及比较例A-1和比较例A-2溶解于5％葡萄糖注射液中，按照以7-乙基-10-羟基喜树碱换算为12mg/kg向静脉内单次给药。
由给药当天和给药后第14天的肿瘤体积求出相对肿瘤体积，作为抗肿瘤效果的指标。需要说明的是，关于肿瘤体积，计测肿瘤的长径(L：mm)和短径(W：mm)，由(L×W2)/2的计算式算出。结果示于表3。
[表3]
[表3]抗肿瘤效果试验结果
*将给药当天的肿瘤体积设为1.0时的给药后第14天的各处置组中的相对肿瘤体积(平均±SD)
实施例A-1～A-3以及比较例A-1和A-2与非给药组相比肿瘤体积小，显现出肿瘤增殖抑制作用。其中，实施例A-3与比较例相比显示出更强的抗肿瘤效果。
已知：喜树碱衍生物结合嵌段共聚物通过归因于高分子载体的特异性药代动力学和喜树碱衍生物的缓释，能够增强抗肿瘤效果。但是，由于不仅对于肿瘤组织而且对于正常组织也发挥出喜树碱衍生物的药理作用，因而副作用的表现是不可避免的。
但是，由试验例A-1～A-4的结果可知，本发明的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物发挥出与现有的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物同等或更高的抗肿瘤效果，另一方面，不使血液毒性持久化，进而还抑制肝毒性的表现。因此可知，通过制成分子量和水溶液的光散射强度得到控制的喜树碱衍生物结合嵌段共聚物，能够使肿瘤增殖抑制作用与正常组织损伤作用背离，能够提供实现了效果增强和副作用降低的抗肿瘤剂。
[合成例7]聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2千道尔顿、聚谷氨酸聚合数8；共聚物7)的合成。
使用单末端为甲氧基、单末端为3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-50H、日油公司制造、平均分子量5千道尔顿、14.00g)和L-谷氨酸γ-苄酯N-羧酸酐(16.80g)，根据合成例2中记载的方法，得到标题的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(共聚物7)。
关于共聚物7，基于使用0.1N氢氧化钾得到的滴定值，谷氨酸的聚合数为7.90。
[合成例8]聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2千道尔顿、聚谷氨酸聚合数6；共聚物8)的合成。
使用单末端为甲氧基、单末端为3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-50H、日油公司制造、平均分子量2千道尔顿、14.00g)和L-谷氨酸γ-苄酯N-羧酸酐(12.60g)，根据合成例2中记载的方法，得到标题的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(共聚物8)。
关于共聚物8，基于使用0.1N氢氧化钾得到的滴定值，谷氨酸的聚合数为6.46。
[合成例9]聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2千道尔顿、聚谷氨酸聚合数14；共聚物9)的合成。
使用单末端为甲氧基、单末端为3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-50H、日油公司制造、平均分子量2千道尔顿、10.15g)和L-谷氨酸γ-苄酯N-羧酸酐(18.28g)，根据合成例2中记载的方法，得到标题的聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物(共聚物9)。
关于共聚物9，基于使用0.1N氢氧化钾得到的滴定值，谷氨酸的聚合数为13.69。
[实施例B-1]聚乙二醇(2千道尔顿)-聚谷氨酸(7.9聚合物)嵌段共聚物的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇结合体的合成。
将合成例7中得到的共聚物7(1300mg)和4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(Shanghai HaoyuanChemexpress公司制造、550mg)溶解于DMF(46mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP 64mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI 1050μL)，在25℃搅拌24小时。之后，追加DIPCI(525μL)，进一步搅拌2小时。用15分钟将反应液滴加至二异丙醚(250mL)和乙酸乙酯(500mL)混合液中，在室温搅拌45分钟后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物(1558mg)。将所得到的产物溶解于乙腈/水(1/1(v/v)、100mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌3小时。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇结合嵌段共聚物(实施例B-1)。
将实施例B-1利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇进行定量，求出其含量。其结果，实施例B-1中的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇含量为21.8％(w/w)。
将实施例B-1在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇的结合残基之比为0.27。
由这些值计算出实施例B-1的总分子量为3,963。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为50.5％。
另外，实施例B-1的1mg/mL水溶液的光散射强度为83,228cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为7,195cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为11.6倍。体积平均粒径为11nm(设备A、5mg/mL)。
[实施例B-2]聚乙二醇(2千道尔顿)-聚谷氨酸(7.9聚合物)嵌段共聚物的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇和BODIPY-FL结合体的合成。
将合成例7中得到的共聚物7(40mg)和4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(Shanghai Haoyuan Chemexpress公司制造、17mg)、BODIPY-FL EDA·HCl(Life Technology公司制造、5mg)、二异丙基乙胺(4μL)溶解于DMF(1mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP 2mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI 33μL)，在25℃搅拌24小时。之后，追加DIPCI(16μL)，进一步搅拌3小时。用20分钟将反应液滴加至二异丙醚(7mL)和乙酸乙酯(14mL)混合液中，在室温搅拌20分钟后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物。将所得到的产物溶解于乙腈/水(1/1(v/v)、10mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌45分钟。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇结合嵌段共聚物(实施例B-2)。
将实施例B-2利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，求出游离的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇含量。其结果，利用高效液相色谱法(HPLC)对实施例B-2中的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇进行定量，其含量为23.1％(w/w)。
将实施例B-2在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇的结合残基之比为0.27。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的BODIPY-FL的消耗率，实施例B-2的BODIPY-FL结合量为1.0分子。因此，计算出实施例B-2的BODIPY-FL总分子量为334。
由这些值计算出实施例B-2的总分子量为4,451。
由此，实施例-2中的BODIPY-FL的含量为7.5质量％，聚乙二醇链段的含量为44.9质量％。
实施例B-2作为实施例B-1的荧光标记体用于后述的分布试验。
[实施例B-3]聚乙二醇(2千道尔顿)-聚谷氨酸(6聚合物)嵌段共聚物的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇结合体的合成。
使用合成例8中得到的共聚物8(1100mg)和4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(Shanghai HaoyuanChemexpress公司制造、450mg)，根据实施例B-1中记载的方法，得到标题的间苯二酚类结合嵌段共聚物(实施例B-3)。
将实施例B-3利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇进行定量，求出含量。其结果，实施例B-3中的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇含量为18.8％(w/w)。
将实施例B-3在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇的结合残基之比为0.11。
由这些值计算出实施例B-3的总分子量为3.539。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为56.5％。
另外，实施例B-3的1mg/mL水溶液的光散射强度为37,270cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为7,195cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为5.0倍。体积平均粒径为8nm(设备A、5mg/mL)。
[实施例B-4]聚乙二醇(2千道尔顿)-聚谷氨酸(10聚合物)嵌段共聚物的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇结合体的合成。
使用合成例2中得到的共聚物2(966mg)和4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(Shanghai HaoyuanChemexpress公司制造、317mg)，根据实施例B-1中记载的方法，得到标题的间苯二酚类结合嵌段共聚物(实施例B-4)。
将实施例B-4利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇进行定量，求出其含量。其结果，实施例B-4中的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇含量为17.0％(w/w)。
将实施例B-4在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇的结合残基之比为0.09。
由这些值计算出实施例B-3的总分子量为4,001。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为50.0％。
另外，实施例B-3的1mg/mL水溶液的光散射强度为125,125cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为7,195cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为16.9倍。体积平均粒径为11nm(设备A、5mg/mL)。
[实施例B-5]聚乙二醇(2千道尔顿)-聚谷氨酸(12聚合物)嵌段共聚物的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇结合体的合成。
使用合成例9中得到的共聚物9(1500mg)和4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(Shanghai HaoyuanChemexpress公司制造、393mg)，根据实施例B-1中记载的方法，得到标题的间苯二酚类结合嵌段共聚物(实施例B-5)。
将实施例B-5利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇进行定量，求出其含量。其结果，实施例B-5中的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇含量为12.7％(w/w)。
将实施例B-5在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇的结合残基之比为0.34。
由这些值计算出实施例B-5的总分子量为4,409。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为45.4％。
另外，实施例B-5的1mg/mL水溶液的光散射强度为50,425cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为7,195cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为6.8倍。体积平均粒径为14nm(设备B、5mg/mL)。
[实施例B-6]聚乙二醇(5千道尔顿)-聚谷氨酸(10聚合物)嵌段共聚物的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇结合体的合成。
使用合成例3中得到的共聚物3(953mg)和4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(Shanghai HaoyuanChemexpress公司制造、250mg)，根据实施例B-1中记载的方法，得到标题的间苯二酚类结合嵌段共聚物(实施例B-6)。
将实施例B-6利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇进行定量，求出其含量。其结果，实施例B-6中的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇含量为17.3％(w/w)。
将实施例B-6在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇的结合残基之比为0.23。
由这些值计算出实施例B-6的总分子量为7,724。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为64.7％。
另外，实施例B-6的1mg/mL水溶液的光散射强度为88,115cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为7,195cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为11.9倍。体积平均粒径为12nm(设备A、5mg/mL)。
[比较例B-1]聚乙二醇(12千道尔顿)-聚谷氨酸(25聚合物)嵌段共聚物的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇结合体的合成。
使用合成例4中得到的共聚物4(2300mg)和4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(Shanghai HaoyuanChemexpress公司制造、557mg)，根据实施例B-1中记载的方法，得到标题的Ganetespib结合嵌段共聚物(比较例B-1)。
将比较例B-1利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇进行定量，求出其含量。其结果，实施例B-1中的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇含量为14.1％(w/w)。
将比较例B-1在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇的结合残基之比为0.13。
由这些值计算出比较例B-1的总分子量为17,311。
由此，聚乙二醇链段的质量含量为69.3％。
另外，比较例B-1的1mg/mL水溶液的光散射强度为294,722cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为7,195cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为41.0倍。体积平均粒径为25nm(设备A、1mg/mL)。
[比较例B-2]聚乙二醇(12千道尔顿)-聚谷氨酸(25聚合物)嵌段共聚物的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇和BODIPY-TR结合体的合成。
使用合成例4中得到的共聚物4(170mg)、4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(Shanghai HaoyuanChemexpress公司制造、41mg)和BODIPY-TR尸胺·HCl(Life Technology公司制造、6mg)，根据实施例B-2中记载的方法，得到标题的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇结合嵌段共聚物(比较例B-2)。
将比较例B-2利用1N-氢氧化钠水溶液进行水解处理，利用高效液相色谱法(HPLC)对游离的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇进行定量，求出其含量。其结果，实施例1中的4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇含量为14.2％(w/w)。
将比较例B-2在包含氘代氢氧化钠的氘化水-氘代乙腈溶液中水解，对所得到的溶液的1H-NMR光谱进行分析，由此能够确认在聚谷氨酸链段的侧链羧基上结合有异丙基氨基羰基异丙基氨基。根据1H-NMR光谱的积分比，异丙基氨基羰基异丙基氨基与4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇的结合残基之比为0.39。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的BODIPY-TR的消耗率，比较例B-2的BODIPY-TR结合量为1.0分子。因此，计算出比较例B-2的BODIPY-TR总分子量为334。
由这些值计算出比较例B-2的总分子量为18,171。
由此，比较例-2中的BODIPY-FL的含量为2.8质量％，聚乙二醇链段的含量为66.0质量％。
比较例B-2作为比较例B-1的荧光标记体用于后述的分布试验。
[试验例B-1]肿瘤和肾脏内分布试验
将通过BALB/c裸小鼠的皮下移植进行了传代培养的人胰腺癌BxPC3的肿瘤块切成约3mm见方的块，利用套管针移植至裸小鼠的背侧部皮下。将实施例B-2和比较例B-2分别按照以BODIPY换算量计为5mg/kg的浓度用5％葡萄糖注射液溶解，将相同量的各溶解液混合，向静脉内单次给药。给药1小时后，在异氟烷麻醉下将裸小鼠除去血液，制作所取出的肿瘤组织和肾脏的冷冻包埋切片，进行荧光观察。结果示于图3。
试验例B-1的结果，实施例B-2的给药例在肿瘤切片的观察中在组织切片的广泛区域内观察到荧光信号。由此确认到，实施例B-2的嵌段共聚物集聚于肿瘤组织，并且渗透至肿瘤组织内部。与此相对，比较例B-2虽然肿瘤外壳部观察到荧光，但在组织中心部分未确认到荧光信号，表明嵌段共聚物无法将药物递送到整个肿瘤组织。
另外，在肾脏中，实施例B-2在血管内和肾小管观察到荧光。另一方面，比较例B-2在血管内以外未确认到荧光。
由以上结果表明，实施例B-2的嵌段共聚物在包括肿瘤组织深部的肿瘤组织中具有集聚性，同时具有能够通过肾排泄的物性，长期的体内滞留性得到控制。
[试验例B-2]对于非荷瘤小鼠的血液毒性试验
[给药]
将实施例B-1和比较例B-1溶解于5％葡萄糖注射液中，基于给药当天的测定体重，按照以4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇换算为75mg/kg的用量，对雄性5周龄的ICR小鼠(Crl：CD1(ICR)、CharlesRiver Laboratories Japan,Inc.)进行尾静脉内单次给药。作为对照组，尾静脉内单次给药5％葡萄糖注射液。
[血液学检查]
给药各化合物3天和14天后，在无麻醉下，利用安装有26G注射针的1mL一次性注射器从锁骨下静脉进行采血。预先在注射器中添加约3μL EDTA-2K溶液，与采集的血液充分混合，作为分析试样。使用血细胞分析装置XT-2000iV(Sysmex株式会社)对血液试样进行血细胞分析。将给药3天后的血小板数示于表4。
[表4]
[表4]血液学检查(血小板)结果
*给药后第3天的75 mg/kg处置组中的血小板数(×104/μL)
血液学检查的结果，比较例B-1在给药3天后使血小板数降低，确认到血液毒性的持久化。与此相对，本发明的实施例B-2的化合物在给药后3天的时刻血小板数的减少与比较例B-1相比受到抑制，血液毒性的持久化为轻度。
比较例B-1是分子量为18千道尔顿的化合物。另一方面，实施例B-1的分子量小，为4千道尔顿。由以上结果认为，间苯二酚衍生物结合高分子衍生物的血液毒性的持久化与分子量有关。因此表明，通过制成分子量为15千道尔顿以下的间苯二酚类结合高分子衍生物，能够提供避免了血液毒性的持久化的抗肿瘤剂。
[试验例B-3]对于人结肠癌和人乳腺癌移植小鼠的抗肿瘤效果
将通过BALB/c裸小鼠的皮下移植进行了传代培养的人结肠癌Col-5-JCK和Co-3-KIST、以及通过SCID小鼠的皮下移植进行了传代培养的人乳腺癌MC-19-JCK的肿瘤块切成约3mm见方的块，利用套管针分别移植至裸小鼠或SCID小鼠的背侧部皮下。在肿瘤移植后平均肿瘤体积达到约150mm3以上的时刻进行分组。
用5％葡萄糖注射液溶解实施例B-1和比较例B-1，按照以4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇换算为75mg/kg、50mg/kg向尾静脉内进行单次给药。
另外，作为对照药，将4-异丙基-6-(4-(1-甲基-1H-吲哚-5-基)-5-亚甲基-4,5-二氢-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯-1,3-二醇(Ganetespib)用DMSO溶解后，用Cremophor RH40：5％葡萄糖溶液(1：4)的混合液稀释10倍，以150mg/kg向尾静脉内进行单次给药。
由给药开始当天的肿瘤体积求出相对肿瘤体积，作为抗肿瘤效果的指标。需要说明的是，关于肿瘤体积，计测肿瘤的长径(L：mm)和短径(W：mm)，由(L×W2)/2的计算式算出。将结果示于图4、图5、图6。
与比较例B-1相比，实施例B-1在相同给药量下在任一肿瘤皮下模型中均显示出更优异的效果。由试验例B-1的结果可知，实施例B-1具有肿瘤组织迁移性及肿瘤深部渗透性。因此，推测这些肿瘤组织中的药代动力学的差异起因于抗肿瘤效果的增强作用。
[合成例10]聚乙二醇-α,β-聚天冬氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量2千道尔顿、聚天冬氨酸聚合数12.5；共聚物10)的合成。
将单末端为甲氧基、单末端为3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-20H、日油公司制造、平均分子量2千道尔顿、20.0g)溶解于DMSO(400mL)中后，加入L-天冬氨酸γ-苄酯N-羧酸酐(29.8g、12当量)，在32.5℃搅拌20小时。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(3200mL)和乙醇(800mL)混合液中，在室温搅拌3小时。之后，滤取析出物，在减压下干燥，得到聚合物(31.2g)。
将所得到的聚合物(30.0g)溶解于DMF(300mL)中，加入乙酸酐(7.3mL)，在35℃搅拌3小时。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(2700mL)和乙醇(300mL)混合液中，在室温搅拌1小时。之后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到乙酰化聚合物(26.6g)。
将所得到的乙酰化聚合物(25.0g)溶解于MeCN(500mL)中后，加入0.2当量的氢氧化钠(500mL)，在23℃进行3小时水解。向反应液中加入2当量的盐酸进行中和后，通过减压浓缩去除乙腈，之后用乙酸乙酯(500mL)对浓缩液进行3次清洗。将水层减压浓缩后，用1当量的氢氧化钠水溶液将溶解液的pH调整为11.0，添加食盐(50g)后，利用分配吸附树脂柱层析、接着利用离子交换树脂柱层析进行纯化，将洗脱的溶液减压浓缩后，冷冻干燥，得到聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(共聚物10，13.0g)。
关于共聚物10，通过使用0.1N氢氧化钾的滴定法计算出天冬氨酸的聚合数为12.5。
另外，合成例10的1mg/mL水溶液的光散射强度为2,179cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为7,305cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为0.3倍。
[合成例11]聚乙二醇-α-聚天冬氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量5千道尔顿、聚天冬氨酸聚合数20.0；共聚物11)的合成。
使用单末端为甲氧基、单末端为3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-50H、日油公司制造、平均分子量5千道尔顿)和L-天冬氨酸γ-苄酯N-羧酸酐，根据合成例2中记载的方法，得到标题的聚乙二醇-α-聚天冬氨酸嵌段共聚物(共聚物11)。
关于共聚物11，通过使用0.1N氢氧化钾的滴定法计算出天冬氨酸的聚合数为20.0。
[合成例12]聚乙二醇-α,β-聚天冬氨酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量12千道尔顿、聚天冬氨酸聚合数23.8；共聚物12)的合成。
将单末端为甲氧基、单末端为3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHT MEPA-12K、日油公司制造、平均分子量12千道尔顿75.0g)溶解于DMSO(1430mL)中后，加入L-天冬氨酸γ-苄酯N-羧酸酐(45.0g、29当量)，在32.0℃搅拌一晚。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(12L)和乙醇(3L)混合液中，在室温搅拌1小时。之后，滤取析出物，在减压下干燥，得到聚合物(106.0g)。
将所得到的聚合物(105.0g)溶解于DMF(1050mL)中，加入乙酸酐(3.3mL)，在35℃搅拌3小时。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(29450mL)和乙醇(1050mL)混合液中，在室温搅拌1小时。之后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到乙酰化聚合物(103.0g)。
将所得到的乙酰化聚合物(100.0g)溶解于乙腈(2L)中后，加入0.2当量的氢氧化钠(2L)，在23℃进行3小时水解。向反应液中加入2当量的盐酸进行中和后，通过减压浓缩将乙腈去除，之后用乙酸乙酯(2L)对浓缩液进行3次清洗。对水层进行减压浓缩后，用1当量的氢氧化钠水溶液将溶解液的pH调整为11.0，添加食盐(100g)后，利用分配吸附树脂柱层析、接着利用离子交换树脂柱层析进行纯化，将洗脱的溶液减压浓缩后，冷冻干燥，得到聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(共聚物12，75.4g)。
关于共聚物12，通过使用0.1N氢氧化钾的滴定法计算出天冬氨酸的聚合数为23.8。
[实施例C-1]聚乙二醇(2千道尔顿)-α,β-聚天冬氨酸(12.5聚合物)嵌段共聚物的卡巴他赛(CBZ)和正丁胺结合体的合成。
将合成例10中得到的共聚物10(707.6mg)和卡巴他赛(CBZ 572.2mg)溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP 19.5mL)中，加入正丁胺(125μL)、二甲基氨基吡啶(DMAP 154.9mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI 911μL)，在25℃搅拌19小时。之后，追加DIPCI(228μL)，进一步搅拌6小时。向反应液中加入乙酸乙酯(20mL)后，用1小时滴加至二异丙醚(1560mL)中，在室温搅拌1小时后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物(950mg)。将所得到的产物溶解于乙腈/水(50/50(v/v)、140mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌30分钟。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的紫杉烷类结合高分子衍生物(实施例C-1，930mg)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的CBZ的消耗率，实施例C-1的CBZ结合量为1.3分子。因此，计算出实施例C-1的CBZ总分子量为1,087。
若假定正丁胺的投料量全部发生了反应，则实施例C-1的正丁胺结合量为6.2分子。因此，计算出实施例C-1的正丁胺总分子量为453。
由这些值计算出实施例C-1的总分子量为5,516。
由此，实施例C-1中的CBZ的含量为19.7质量％，正丁胺的含量为8.2质量％，聚乙二醇链段的含量为36.3质量％。
另外，实施例C-1的1mg/mL水溶液的光散射强度为13,018cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为4,368cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为3.0倍。体积平均粒径为6.3nm(设备A、1mg/mL)。
[实施例C-2]聚乙二醇(5千道尔顿)-α-聚天冬氨酸(20.0聚合物)嵌段共聚物的卡巴他赛(CBZ)结合体的合成。
将合成例11中得到的共聚物11(1.50g)和卡巴他赛(CBZ 342mg)溶解于NMP(31mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP 250mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI1468μL)，在20℃搅拌21小时。之后，追加DIPCI(367μL)，进一步搅拌5小时。向反应液中加入乙酸乙酯(31mL)后，用1小时滴加至二异丙醚(1260mL)中，在室温搅拌1小时后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物(1.71g)。将所得到的产物溶解于乙腈/水(50/50(v/v)、80mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌30分钟。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的紫杉烷类结合高分子衍生物(实施例C-2，1.58g)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的CBZ的消耗率，实施例C-2的CBZ结合量为1.6分子。因此，计算出实施例C-2的CBZ总分子量为1,337。
由这些值计算出实施例C-2的总分子量为10,970。
由此，实施例C-2中的CBZ的含量为12.2质量％，聚乙二醇链段的含量为45.6质量％。
另外，实施例C-2的1mg/mL水溶液的光散射强度为10,382cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为4,187cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为2.5倍。体积平均粒径为10nm(设备B、1mg/mL)。
[实施例C-3]聚乙二醇(2千道尔顿)-α,β-聚天冬氨酸(12.5聚合物)嵌段共聚物的卡巴他赛(CBZ)、正丁胺和2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合体的合成。
将合成例10中得到的共聚物10(205.6mg)和卡巴他赛(CBZ 166.3mg)及2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮(5.1mg)溶解于NMP(5.7mL)中，加入正丁胺(36μL)、二甲基氨基吡啶(DMAP 45.0mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI 265μL)，在20℃搅拌17.5小时。之后，追加DIPCI(66μL)，进一步搅拌4.5小时。向反应液中加入乙酸乙酯(5.5mL)后，用10分钟滴加至二异丙醚(440mL)中，在室温搅拌1小时后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物(300mg)。将所得到的产物溶解于乙腈/水(50/50(v/v)、20mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌30分钟。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的紫杉烷类结合高分子衍生物(实施例C-3，270.9mg)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的CBZ的消耗率，实施例C-3的CBZ结合量为1.7分子。因此，计算出实施例C-3的CBZ总分子量为1,421。
若假定正丁胺的投料量全部发生了反应，则实施例C-3的正丁胺结合量为6.2分子。因此，计算出实施例C-3的正丁胺总分子量为453。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的消耗率，实施例C-3的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合量为0.23分子。因此，计算出实施例C-3的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮总分子量为87。
由这些值计算出实施例C-3的总分子量为5,846。
由此，实施例C-3中的CBZ的含量为24.3质量％，正丁胺的含量为7.8质量％，2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的含量为1.5质量％，聚乙二醇链段的含量为34.2质量％。
实施例C-3作为实施例C-1的荧光标记体用于后述的分布试验。
[实施例C-4]聚乙二醇(2千道尔顿)-α,β-聚天冬氨酸(12.5聚合物)嵌段共聚物的卡巴他赛(CBZ)结合体的合成。
将合成例10中得到的共聚物10(51.5mg)和卡巴他赛(CBZ 30.9mg)溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP 1.42mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP 11.3mg)和二异丙基碳二亚胺(DIPCI 66μL)，在25℃搅拌13小时。之后，追加DIPCI(17μL)，进一步搅拌5小时。向反应液中加入乙酸乙酯(1.42mL)后，用1小时滴加至二异丙醚(114mL)中，在室温搅拌1小时后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到标题的紫杉烷类结合高分子衍生物(实施例C-4)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的CBZ的消耗率，实施例C-4的CBZ结合量为1.8分子。因此，计算出实施例C-4的CBZ总分子量为1,505。
由这些值计算出实施例C-4的总分子量为6,301。
由此，实施例C-4中的CBZ的含量为23.9质量％，聚乙二醇链段的含量为31.7质量％。
另外，实施例C-4的1mg/mL水溶液的光散射强度为176,886cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为7,156cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为24.7倍。体积平均粒径为12nm(设备A、1mg/mL)。
[实施例C-5]聚乙二醇(2千道尔顿)-α,β-聚天冬氨酸(12.5聚合物)嵌段共聚物的多西他赛(DTX)和4-苯基丁胺结合体的合成。
将合成例10中得到的共聚物10(33.4mg)和多西他赛(DTX 26.1mg)溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP 0.92mL)中，加入4-苯基丁胺(6μL)、二甲基氨基吡啶(DMAP 7.3mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI 43μL)，在25℃搅拌22小时。之后，追加DIPCI(11μL)，进一步搅拌6小时。将反应液移至MWCO2,000的透析膜中，在水中透析后，进行冷冻干燥，由此得到标题的紫杉烷类结合高分子衍生物(实施例C-5，59.6mg)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的DTX的消耗率，实施例C-5的DTX结合量为1.2分子。因此，计算出实施例C-5的DTX总分子量为969。
若假定4-苯基丁胺的投料量全部发生了反应，则实施例C-5的4-苯基丁胺结合量为3.7分子。因此，计算出实施例C-5的4-苯基丁胺总分子量为552。
由这些值计算出实施例C-5的总分子量为5,872。
由此，实施例C-5中的DTX的含量为16.5质量％，4-苯基丁胺的含量为9.4质量％，聚乙二醇链段的含量为34.1质量％。
另外，实施例C-5的1mg/mL水溶液的光散射强度为162,126cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为7,152cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为22.7倍。
[比较例C-1]聚乙二醇(12千道尔顿)-α,β-聚天冬氨酸(23.8聚合物)嵌段共聚物的卡巴他赛(CBZ)结合体的合成。
将合成例12中得到的共聚物12(1.60g)和卡巴他赛(CBZ 797.9mg)溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP 20.2mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP 35.2mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI942μL)，在15℃搅拌21小时。之后，追加DIPCI(236μL)，进一步搅拌7小时。用1小时将反应液滴加至二异丙醚(360mL)和乙醇(90mL)混合液中，在室温搅拌1小时后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物(1.98g)。将所得到的产物溶解于乙腈/水(50/50(v/v)、80mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌30分钟。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的紫杉烷类结合高分子衍生物(比较例C-1 1.93g)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的CBZ的消耗率，比较例C-1的CBZ结合量为5.2分子。因此，计算出比较例C-1的CBZ总分子量为4,347。
由这些值计算出比较例C-1的总分子量为21,377。
由此，比较例C-1中的CBZ的含量为20.3质量％，聚乙二醇链段的含量为56.1质量％。
另外，比较例C-1的1mg/mL水溶液的光散射强度为24,804cps，此时的甲苯标准液的光散射强度为4,368cps。因此，与甲苯的光散射强度的相对比例为5.7倍。体积平均粒径为22nm(设备A、1mg/mL)。
[比较例C-2]聚乙二醇(12千道尔顿)-α,β-聚天冬氨酸(23.8聚合物)嵌段共聚物的卡巴他赛(CBZ)和2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合体的合成。
将合成例12中得到的共聚物12(200mg)和卡巴他赛(CBZ 99.7mg)及2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮(5.2mg)溶解至N-甲基吡咯烷酮(NMP2.5mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP 4.4mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI 118μL)，在20℃搅拌21小时。之后，追加DIPCI(29μL)，进一步搅拌5小时。用10分钟将反应液滴加至二异丙醚(18mL)和乙醇(4.5mL)混合液中，在室温搅拌1小时后，滤取析出物，在减压下干燥，由此得到产物(235.0mg)。将所得到的产物溶解于乙腈/水(50/50(v/v)、10mL)中后，加入离子交换树脂，在5℃搅拌30分钟。滤出离子交换树脂后，减压蒸馏除去乙腈，进行冷冻干燥，由此得到标题的紫杉烷类结合高分子衍生物(比较例C-2，205.6mg)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的CBZ的消耗率，比较例C-2的CBZ结合量为4.3分子。因此，计算出比较例C-2的总CBZ分子量为3,594。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的消耗率，比较例C-2的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合量为1.0分子。因此，计算出比较例C-2的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮总分子量为377。
由这些值计算出比较例C-2的总分子量为20,988。
由此，比较例C-2中的CBZ的含量为17.1质量％，2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的含量为1.8质量％，聚乙二醇链段的含量为57.2质量％。
比较例C-2作为比较例C-1的荧光标记体用于后述的分布试验。
[比较例C-3]聚乙二醇(2千道尔顿)-α,β-聚天冬氨酸(12.5聚合物)嵌段共聚物的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合体的合成。
将合成例10中得到的共聚物10(205.7mg)和2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮(5.1mg)溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP 5.7mL)中，加入二甲基氨基吡啶(DMAP 45.0mg)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI 265μL)，在20℃搅拌18.5小时。之后，追加DIPCI(66μL)，进一步搅拌2.5小时。将反应液移至MWCO10,000的透析膜中，在水中透析后，进行冷冻干燥，由此得到标题的紫杉烷类结合高分子衍生物(比较例C-3，247.7mg)。
根据利用高效液相色谱法(HPLC)测定的反应溶液中的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的消耗率，比较例C-3的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮结合量为0.3分子。因此，计算出比较例C-3的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮总分子量为113。
由这些值计算出比较例C-3的总分子量为5,126。
由此，比较例C-3中的2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮的含量为2.2质量％，聚乙二醇链段的含量为39.0质量％。
比较例C-3为非缔合性，作为共聚物12的荧光标记体用于后述的分布试验。
[试验例C-1]肿瘤内和肾脏内分布试验
将通过BALB/c裸小鼠的皮下移植进行了传代培养的人胰腺癌BxPC3的肿瘤块切成约3mm见方的块，利用套管针移植至裸小鼠的背侧部皮下。分别用5％葡萄糖注射液溶解实施例C-3、比较例C-2和比较例C-3，按照以2-(2-氨基乙氧基)-9-(二乙基氨基)-5H-苯并[a]吩噁嗪-5-酮换算量计为5mg/kg分别单次给药至静脉内。给药1小时后，在异氟烷麻醉下将小鼠除去血液，制作所取出的肿瘤和肾脏的冷冻包埋切片，进行荧光观察。结果示于图7。
试验例C-1的结果，实施例C-3在肿瘤切片的广泛区域内观察到荧光信号。由此表明，实施例C-3的嵌段共聚物向肿瘤组织迁移并集聚，同时能够渗透至肿瘤组织的深部。与此相对，比较例C-2和C-3虽然在肿瘤外缘部观察到荧光信号，但未确认到肿瘤组织渗透性，得到了肿瘤组织迁移性和集聚性低的结果。
另外，在肾脏中，实施例C-3和比较例C-3在肾小管观察到荧光。另一方面，比较例C-2除血管内以外未确认到荧光。由此表明，与比较例C-2相比，实施例C-3具有能够迅速通过肾排泄的物性。
以水溶液中的光散射强度表示的分析值小于2倍且分子量小于15千道尔顿的非缔合性的比较例C-3的嵌段共聚物得到了虽然迅速地通过肾排泄、但向肿瘤的集聚性低的结果。以水溶液中的光散射强度表示的分析值为2倍以上且分子量大于15千道尔顿的比较例C-2的紫杉烷类结合嵌段共聚物得到了虽然不能通过肾排泄、但向肿瘤的集聚性低于实施例C-3的结果。可知，通过使以水溶液中的光散射强度表示的分析值为2倍以上且分子量为15千道尔顿以下，能够制备迅速地通过肾排泄、并显示出肿瘤集聚性的紫杉烷类结合嵌段共聚物。
[试验例C-2]对于非荷瘤小鼠的血液毒性试验
[给药]
将实施例C-1和比较例C-1溶解于5％葡萄糖注射液中，基于给药当天的测定体重，按照作为各化合物的最大耐受剂量附近的、以卡巴他赛换算为60mg/kg的用量，对雄性5周龄的ICR小鼠(Crl：CD1(ICR)、Charles River Laboratories Japan,Inc.)进行尾静脉内单次给药。作为对照组，尾静脉内单次给药5％葡萄糖注射液。
对于实施例C-1和比较例C-1的化合物，在聚丙烯制离心管中称取按照达到规定的卡巴他赛浓度的方式用各化合物的卡巴他赛含量进行校正而算出的必要量的上述化合物，加入5％葡萄糖注射液，在冰水中照射超声波，使其溶解。
另外，在聚丙烯制离心管中称取以达到规定浓度的20倍浓度的方式算出的必要量的对象药卡巴他赛，加入无水乙醇进行溶解。加入与无水乙醇量相等的聚山梨醇酯80并充分混合，将混合物作为制备原液，在即将给药前，将制备原液用5％葡萄糖注射液稀释10倍，以最大非致死剂量30mg/kg向尾静脉内进行单次给药。
[血液学检查]
在给药各化合物3、5、7、11、14天后，在无麻醉下，利用安装有26G注射针的1mL一次性注射器从锁骨下静脉进行采血。预先在注射器中添加约3μL EDTA-2K溶液，与采集的血液充分混合，作为分析试样。使用血细胞分析装置XT-2000iV(Sysmex株式会社)对血液试样进行血细胞分析。将给药5天后的网织红细胞数示于表5。
[表5]
[表5]血液学检查(网织红细胞)结果
*给药后第5天的各处置组中的网织红细胞数(×104/μL)
血液学检查的结果，比较例C-1在给药5天后使网织红细胞数降低，确认到血液毒性的持久化。与此相对，实施例C-1的化合物和卡巴他赛在给药后5天的时刻网织红细胞数未减少，未确认到血液毒性的持久化。因此，推测实施例C-1和卡巴他赛的化合物不会使血液毒性持久化。
比较例C-1是分子量为21千道尔顿的化合物。另一方面，实施例C-1的分子量小，为5.5千道尔顿。由以上结果认为，紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物的血液毒性的持久化与分子量有关。因此，通过制成分子量为15千道尔顿以下的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物，能够制备避免了血液毒性的持久化的抗肿瘤剂。
[试验例C-3]对于人胰腺癌移植裸小鼠的抗肿瘤效果试验
将在裸小鼠皮下进行了传代培养的人胰腺癌BxPC3的肿瘤块切成约3mm见方的块，利用套管针移植至裸小鼠的背侧部皮下。在肿瘤移植后平均肿瘤体积达到约200mm3以上的时刻，将实施例C-1、实施例C-2和比较例C-1溶解于5％葡萄糖注射液中，基于给药当天的测定体重，按照作为各化合物的最大耐受剂量附近的、以卡巴他赛换算为60mg/kg的用量，单次给药至尾静脉内。
另外，关于卡巴他赛，用聚山梨醇酯80溶解后，用等量的无水乙醇稀释，将所得到的溶液作为制备原液，在即将给药前，将制备原液用5％葡萄糖注射液稀释10倍，以最大非致死剂量30mg/kg向尾静脉内进行单次给药。
由给药当天和给药后第8天的肿瘤体积求出相对肿瘤体积，作为抗肿瘤效果的指标。需要说明的是，关于肿瘤体积，计测肿瘤的长径(L：mm)和短径(W：mm)，由(L×W2)/2的计算式算出。结果示于表6。
[表6]
[表6]对于人胰腺癌BxPC3移植裸小鼠的抗肿瘤效果试验结果
*将给药日的肿瘤体积设为1.0时的给药后第8天的各处置组中的相对肿瘤体积(平均±SD)
试验例C-3的结果，与卡巴他赛相比，实施例C-1、实施例C-2和比较例C-1的肿瘤体积小，显示出更强的肿瘤增殖抑制作用。
[试验例C-4]对于人肺癌移植裸小鼠的抗肿瘤效果试验
将在裸小鼠皮下进行了传代培养的人肺癌H460的肿瘤块切成约3mm见方的块，利用套管针移植至裸小鼠的背侧部皮下。在肿瘤移植后平均肿瘤体积达到约200mm3以上的时刻，将实施例C-1、实施例C-2和比较例C-1溶解于5％葡萄糖注射液中，基于给药当天的测定体重，按照作为各化合物的最大耐受剂量附近的、以卡巴他赛换算为60mg/kg的用量，单次给药至尾静脉内。
另外，关于卡巴他赛，用无水乙醇溶解后，用等量的聚山梨醇酯80稀释，将所得到的溶液作为制备原液，在即将给药前，将制备原液用5％葡萄糖注射液稀释10倍，以最大非致死剂量30mg/kg向尾静脉内进行单次给药。
由给药当天和给药后第15天的肿瘤体积求出相对肿瘤体积，作为抗肿瘤效果的指标。需要说明的是，关于肿瘤体积，计测肿瘤的长径(L：mm)和短径(W：mm)，由(L×W2)/2的计算式算出。结果示于表7。
[表7]
[表7]对于人肺癌H460移植裸小鼠的抗肿瘤效果试验结果
*将给药日的肿瘤体积设为1.0时的给药后第15天的各处置组中的相对肿瘤体积(平均±SD)
试验例C-4的结果，与卡巴他赛相比，实施例C-1、实施例C-2和比较例C-1的肿瘤体积小，显示出更强的肿瘤增殖抑制作用。
由试验例C-1～C-4的结果可知，本发明的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物发挥出与对照药同等或更高的抗肿瘤效果，并且还抑制血液毒性的持久化。因此可知，通过制成分子量和水溶液的光散射强度受到控制的紫杉烷衍生物结合嵌段共聚物，能够使肿瘤增殖抑制作用与正常组织损伤作用背离，能够提供实现了效果增强和副作用降低的抗肿瘤剂。
由以上结果可知，在将聚乙二醇链段与聚氨基酸链段连结而成的嵌段共聚物作为药物递送载体的DDS化制剂中，通过将该嵌段共聚物的分子量控制为2千道尔顿以上15千道尔顿以下，并在利用激光散射光度法的水溶液中物性分析中具有在水溶液中形成自缔合性颗粒的物性，能够制备体积平均粒径比以往更小的纳米颗粒DDS制剂，由此，发挥出现有的嵌段共聚物所不具有的药代动力学特性。
即，可知，本发明的嵌段共聚物不仅具有向肿瘤等病变靶组织的组织迁移性，还具有向组织内部的高渗透性，发挥出高的靶组织迁移性和集聚性。另外，已知使用了高分子载体的DDS化制剂的肾排泄性受到抑制，但可知本发明的嵌段共聚物具备肾排泄性。这些特异性的药代动力学特性是归因于该嵌段共聚物的分子量和自缔合性的物性，表明其是具有通用性的DDS化制剂技术而与所结合的生理活性物质的种类及化学结构无关。这样的药代动力学特性能够使生理活性物质递送至病变靶组织的深部而致敏，因此能够有效地发挥出药理活性效果。另外，由于具备肾排泄性，因而未分布/集聚在病变靶组织的该嵌段共聚物迅速地排泄，因此可抑制不必要的体内滞留性，避免在病变靶组织以外的组织的分布/集聚，由此能够减轻副作用的表现。
由此，本发明的嵌段共聚物是能够引入新的高分子化DDS制剂的概念的技术，通过应用于供各种疾病的治疗的药物，能够提供有用的药品。特别是，优选用于局部性组织疾病的治疗，能够应用针对恶性肿瘤疾病、炎性疾病、传染病的治疗用药品。

Claims (17)

1.一种嵌段共聚物，其为聚乙二醇链段与聚氨基酸衍生物链段连结而成的嵌段共聚物，该聚氨基酸衍生物链段包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或谷氨酸衍生物，
所述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下，
在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的测定条件下，利用激光散射光度计测定的所述嵌段共聚物的1mg/mL水溶液的光散射强度为所述测定条件下的甲苯的光散射强度的至少2倍以上。
2.一种嵌段共聚物，其为聚乙二醇链段与聚氨基酸衍生物链段连结而成的具有纳米颗粒形成能力的嵌段共聚物，该聚氨基酸衍生物链段包含在侧链羧基上结合有具有羟基和/或氨基的生理活性物质的天冬氨酸衍生物和/或谷氨酸衍生物，
所述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下。
3.如权利要求1或2所述的嵌段共聚物，其中，所述嵌段共聚物中的所述聚乙二醇链段的质量含量为10质量％以上80质量％以下。
4.如权利要求3所述的嵌段共聚物，其中，所述嵌段共聚物中的所述聚乙二醇链段的质量含量为30质量％以上65质量％以下。
5.如权利要求1～4中任一项所述的嵌段共聚物，其中，所述聚乙二醇链段的分子量为1千道尔顿～10千道尔顿。
6.如权利要求1～5中任一项所述的嵌段共聚物，其中，所述嵌段共聚物中的所述具有羟基和/或氨基的生理活性物质的质量含量为10质量％以上60质量％以下。
7.如权利要求1～6中任一项所述的嵌段共聚物，其中，所述嵌段共聚物由通式(1)所表示，
[化1]
式中，R1表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基，t表示20～270的整数，A表示具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)亚烷基，R2表示选自由氢原子、碳原子数(C1～C6)酰基和碳原子数(C1～C6)烷氧羰基组成的组中的取代基，R3表示具有羟基和/或氨基的生理活性物质的结合残基，R4表示选自由具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷氧基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C30)的直链状、支链状或环状的二烷基氨基、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C8)烷基氨基羰基(C1～C8)烷基氨基、荧光物质的结合残基和羟基组成的组中的1种以上的取代基，B表示结合基团，n表示1或2，x1、x2、y1、y2和z各自独立地表示0～25的整数，(x1+x2)表示1～25的整数，(x1+x2+y1+y2+z)表示3～25的整数，结合了所述R3和R4的各构成单元以及侧链羰基发生了分子内环化的构成单元是各自独立地无规排列的结构。
8.如权利要求1～7中任一项所述的嵌段共聚物，其中，具有羟基和/或氨基的生理活性物质为选自由喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、蒽环类衍生物、雷帕霉素衍生物、胞苷系代谢拮抗剂、叶酸代谢拮抗剂、嘌呤系代谢拮抗剂、氟化嘧啶系代谢拮抗剂、铂衍生物、丝裂霉素衍生物、博来霉素衍生物、长春花生物碱衍生物、鬼臼毒素衍生物、软海绵素衍生物、星形孢菌素衍生物、沙利度胺衍生物、维生素A衍生物、康普瑞汀衍生物、抗雄激素剂、抗雌激素剂、激素剂、他克莫司衍生物、类固醇衍生物、雷帕霉素衍生物、多烯系抗生素、唑系衍生物、棘白菌素系衍生物、嘧啶衍生物组成的组中的1种以上的生理活性物质。
9.如权利要求8所述的嵌段共聚物，其中，具有羟基和/或氨基的生理活性物质为选自由喜树碱衍生物、紫杉烷衍生物、间苯二酚衍生物、蒽环类衍生物、雷帕霉素衍生物、胞苷系代谢拮抗剂、叶酸代谢拮抗剂、嘌呤系代谢拮抗剂、氟化嘧啶系代谢拮抗剂、铂衍生物、丝裂霉素衍生物、博来霉素衍生物、长春花生物碱衍生物、鬼臼毒素衍生物、软海绵素衍生物、星形孢菌素衍生物、沙利度胺衍生物、维生素A衍生物、康普瑞汀衍生物、抗雄激素剂、抗雌激素剂、激素剂组成的组中的1种以上的抗肿瘤剂。
10.如权利要求7所述的嵌段共聚物，其中，R3为通式(2)所表示的喜树碱衍生物的结合残基，
[化2]
式中，R5表示选自由氢原子、具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基和具有或不具有取代基的甲硅烷基组成的组中的1种，R6表示氢原子或者具有或不具有取代基的碳原子数(C1～C6)烷基。
11.如权利要求7所述的嵌段共聚物，其中，R3为通式(3)所表示的间苯二酚衍生物的结合残基，
[化3]
式中，R7表示选自由巯基、羟基、卤原子、硝基、氰基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基、羧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基、氨基甲酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种，
R8表示选自由具有或不具有取代基的碳环芳基或杂环芳基、碳原子数(C1～C20)的烷基、碳原子数(C2～C20)的烯基、碳原子数(C2～C20)的炔基、碳原子数(C1～C20)的烷基氨基和碳原子数(C1～C20)的酰基氨基组成的组中的1种，环H为选自由通式(3-1)、(3-2)和(3-3)组成的组中的杂环芳基，
[化4]
式中，R9表示选自由巯基、羟基、氢原子、卤原子、氨基甲酰基、碳原子数(C1～C20)的烷氧羰基、氰基、碳原子数(C1～C8)的烷硫基、芳硫基、碳原子数(C1～C8)的烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨磺酰基、碳原子数(C1～C8)的烷氧基、芳氧基、碳原子数(C1～C8)的酰基氧基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氧基、氨基甲酰基氧基、氨基、碳原子数(C1～C8)的酰基氨基、碳原子数(C1～C8)的烷氧羰基氨基、脲基、磺酰基氨基、氨磺酰基氨基、甲酰基、碳原子数(C1～C8)的酰基和碳原子数(C1～C8)的烷基甲硅烷基组成的组中的1种。
12.如权利要求7所述的嵌段共聚物，其中，R3为紫杉醇、多西他赛或卡巴他赛的结合残基。
13.一种嵌段共聚物，其为通过使聚乙二醇链段与含有天冬氨酸和/或谷氨酸的聚氨基酸链段连结而成的嵌段共聚物与具有羟基和/或氨基的生理活性物质、以及任选的具有羟基和/或氨基的疏水性取代基利用缩合剂进行反应而得到的嵌段共聚物，
所述嵌段共聚物的分子量为2千道尔顿以上15千道尔顿以下，
在测定温度25℃、散射角度90°、波长632.8nm的测定条件下，利用激光散射光度计测定的所述嵌段共聚物的1mg/mL水溶液的光散射强度为所述测定条件下的甲苯的光散射强度的至少2倍以上。
14.一种纳米颗粒，其由权利要求1～13中任一项所述的嵌段共聚物形成。
15.如权利要求14所述的纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒的体积平均粒径小于20纳米。
16.一种药品，其以权利要求1～13所述的嵌段共聚物或者权利要求14或15所述的纳米颗粒作为有效成分。
17.一种抗肿瘤剂，其以权利要求1～13所述的嵌段共聚物或者权利要求14或15所述的纳米颗粒作为有效成分。
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