TW201520223A

TW201520223A - 生體組織分散用組成物

Info

Publication number: TW201520223A
Application number: TW103136472A
Authority: TW
Inventors: Isao Miyagawa; Seiko Kawamura; Hisayuki Kobayashi
Original assignee: Kurashiki Boseki Kk
Priority date: 2013-11-12
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2015-06-01
Also published as: CN105705651A; US20160289662A1; CA2929682A1; JP2015092852A; HK1222211A1; WO2015072266A1

Abstract

本發明之目的在於以高效率從來自生體組織的試料取得增殖性高的細胞。本發明提供一種組成物，為用以使生體組織分散的組成物，藉由FALGPA分解活性測定的方法進行測定，在前述組成物之處方溶液中的膠原蛋白酶活性為0.30U/mL~10U/mL；藉由BAEE水解活性測定的方法進行測定，在前述組成物之處方濃度中的胰蛋白酶活性為0U/mL~30U/mL。

Description

生體組織分散用組成物

發明領域

本發明係關於用以使生體組織分散的組成物。此外，本發明係關於被包埋於滴塊狀凝膠之細胞培養結果的評價方法。再者，本發明係關於用以進行上述方法之套件。

發明背景

儘管抗癌劑亦作用於正常細胞而有表現較強副作用的情況，但抗癌劑的奏效率，除了一部分以外不滿50%，抗癌劑的有效程度係已知會因患者而有很大的不同。因此，希望在癌症患者接受投與抗癌劑的治療前，評價預定要投與的抗癌劑是否對該癌症患者有效，避免投與無效的抗癌劑，減少患者在肉體與經濟上的負擔，並避免失去治療機會。

作為如此之抗癌作用的評價方法，已知有在模擬生體之滴塊狀凝膠中，以3次元方式增殖癌細胞，使其與抗癌劑接觸，評價增殖結果的方法(專利文獻1~11)，希望在滴塊狀凝膠內取得與在生體內同樣方式增殖的細胞。

在專利文獻1~7中，作為在從自來自生體組織之試料取得細胞時使用的酵素，記載有膠原蛋白酶、玻尿酸酶、去氧核醣核酸酶、彈性蛋白酶、中性蛋白酶(dispase)等。此外，在專利文獻9~11中，記載有將生體組織，以包含選自於梭菌屬中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、及中性蛋白酶所構成之群中至少1種以上的蛋白酶；以及選自於膠原蛋白酶I、膠原蛋白酶II、及膠原蛋白酶IV所構成之群中至少1種以上的膠原蛋白酶之混合酵素進行處理。

此外，在非專利文獻1~21中，記載有可使生體細胞分散的酵素。在此等文獻中，記載有藉由I型膠原蛋白酶、II型膠原蛋白酶、III型膠原蛋白酶、IV型膠原蛋白酶、胰蛋白酶、玻尿酸酶、神經胺糖酸苷酶等處理來自生體組織之試料的內容。

先行技術文獻專利文獻

專利文獻1：日本專利2879978號公報

專利文獻2：日本特開平3-285696號公報

專利文獻3：日本特開平7-31470號公報

專利文獻4：日本特開平7-241190號公報

專利文獻5：日本特開平10-115612號公報

專利文獻6：日本特開2003-9853號公報

專利文獻7：日本特開2008-11797號公報

專利文獻8：日本特開2005-95058號公報

專利文獻9：日本特開2010-227088號公報

專利文獻10：日本特開2011-115106號公報

專利文獻11：國際公開第2011/090068號公報

非專利文獻

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發明概要

然而，藉由以往方法調製從來自生體組織之試料的細胞，即使欲使其增殖，亦偶爾會出現無法依期待進行增殖的情形。此外，由於還有只能自生體取得少量來自組織之試料的問題，因此希望來自試料之細胞取得率為高。因此，本發明之目的係在於以高效率從來自生體組織的試料取得增殖性高的細胞。

本發明人等經過努力檢討，發現包含在用於使來自生體組織之試料分散所使用的組成物中，被認為對組織之可溶化有所貢獻的胰蛋白酶有阻礙膠原蛋白酶與其他有用酵素之作用的事實。此外，發現在胰蛋白酶活性高的情況下，有細胞毒性高，使取得之細胞增殖性降低的事實。以以上發現為基礎進行進一步檢討的結果，本發明人等發現藉由使用與以往使用之組成物不同，且可抑制胰蛋白酶活性，並使膠原蛋白酶確保在高活性的組成物來使來自生體組織之試料分散的方式，能夠以高效率取得增殖度高的細胞。在來自生體組織之試料的分散不充分的情況下，有細胞之取得效率較低的傾向，在以往，一直使用表示高胰蛋白酶活性之組成物進行細胞分散。反過來說，本發明發現藉由使胰蛋白酶活性降低，可提高增殖度高之細胞的取得效率，為劃期性的發明。

亦即，於第1態樣，本發明為提供一種組成物者，其為用以使生體組織分散之組成物，且藉由FALGPA分解活性測定的方法進行測定，在前述組成物之處方溶液中的膠原蛋白酶活性為0.30U/mL~10U/mL；藉由BAEE水解活性測定的方法進行測定，在前述組成物之處方濃度中的胰蛋白酶活性為0U/mL~30U/mL。

此外，於第2態樣，本發明為提供記載於第1態樣之組成物者，其係用於藥劑評價。

再者，於第3態樣，本發明為提供記載於第1態樣或第2態樣之組成物者，其中生體組織為癌組織。

再者，於第4態樣，本發明為提供一種方法者，其為來自生體組織之細胞的取得方法，且包含以第1態樣~第3態樣中任1者所記載之組成物處理來自生體組織之試料。

再者，於第5態樣，本發明為提供一種方法者，其為細胞之培養結果的評價方法，且培養之細胞為經第1態樣~第3態樣中任1者所記載之組成物處理過的細胞。

此外，於第6態樣，本發明為提供第5態樣所記載之方法者，其中，細胞的培養結果為2次元的培養結果。

此外，於第7態樣，本發明為提供第5態樣所記載之方法者，其中，細胞的培養結果為3次元的培養結果。

此外，於第8態樣，本發明為提供第7態樣所記載之方法者，其中，3次元的培養在滴塊狀凝膠內進行。

再者，於第9態樣，本發明為提供一種套件者，其為用以進行第4態樣或第5態樣所記載之方法的套件，且包含第1態樣~第3態樣中任1者所記載的組成物。

若使用本發明之組成物處理來自生體組織之試料，則可有效分散試料，並可以高效率取得附著於周圍之組織量少，且酵素毒性造成之傷害少，以與生體內同樣方式增殖的細胞。尤其，若使用本發明之組成物，可自硬癌等高硬度組織以高效率取得增殖度高的細胞。若將使用本發明之組成物取得之細胞以立體方式增殖，或以形成凝集塊之3次元培養法進行培養，則由於細胞以與在生體內同樣的方式進行增殖，因此可進行抗癌劑等藥劑評價，或基因、蛋白質、糖鍵(sugar chain)等功能性高分子等之生體物質的解析等各種解析。再者，若將使用本發明之組成物取得的細胞包埋至滴塊狀凝膠進行培養，則可自更少量的細胞進行各種解析。

圖1為對照擬似基質組織之消化效率的照片。

圖2為對照組成物對HCT-116細胞及PC-14細胞之組成物毒性的圖。

圖3為對照使用含酵素組成物進行調製之細胞增殖性的照片。

圖4為對照藉由含酵素組成物進行處理後之細胞增殖性的圖。

圖5-1為對照藉由含酵素組成物進行處理後之細胞對於各種藥劑之感受性的圖。

圖5-2為對照藉由含酵素組成物進行處理後之細胞對於各種藥劑之感受性的圖。

圖6為關於實施例1之組成物與比較例1之組成物之T/C(%)值的1對1圖表。

圖7為對照將對含酵素組成物進行處理所獲得之細胞在滴塊狀凝膠培養後進行之中性紅染色結果的照片。

用以實施發明之形態

本發明係提供一種用以使生體組織分散的組成物。本發明之組成物的處方濃度下之膠原蛋白酶活性，係藉由FALGPA分解活性測定之方法進行測定，為0.30U/mL~10U/mL，宜為0.30U/mL~5U/mL，較宜為0.30U/mg~1U/mg。在此，FALPGA分解活性測定的方法，在後述之試驗例2中，將使用FALGPA分解活性測定之方法所示的規程測定出來的值(U/mL)，作為膠原蛋白酶活性。FALGPA為N-(3-[2-呋喃基]丙烯醯基)-Leu-Gly-Pro-Ala。此外，本發明之組成物在處方濃度下之胰蛋白酶活性，係藉由BAEE水解活性測定之方法進行測定，為0U/mL~30U/mL，宜為0U/mL~20U/mL，較宜為0U/mL~10U/mL。BAEE水解活性測定的方法，在後述之試驗例2中，將使用BAEE水解活性測定之方法所示的規程測定出來的值(U/mL)，作為胰蛋白酶活性。BAEE為Nα-苯甲醯基-L-精胺酸乙酯鹽酸鹽。處方濃度為在使用本發明之組成物使生體組織分散時的本發明之組成物濃度。

本發明之組成物係藉由FALGPA分解活性測定方法，及BAEE水解活性測定方法，分別測定將市售膠原蛋白酶、中性蛋白酶、玻尿酸酶混合之混合膠原蛋白酶活性，及胰蛋白酶活性，並藉由將膠原蛋白酶活性及胰蛋白酶活性調整至期望的範圍而可進行製作。作為膠原蛋白酶，使用來自梭菌屬、來自放線菌之任一者皆可。此外，膠原蛋白酶之精製度使用任一者皆可，但期望含有部分精製之膠原蛋白酶。此外，本發明之組成物，亦可含有玻尿酸酶、去氧核醣核酸酶、彈性蛋白酶、中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等各種分解酵素。較宜為含有中性蛋白酶。由於中性蛋白酶可分解在生體內作為細胞之結構支撐的IV型膠原蛋白或纖網蛋白，因此可更有效率取得細胞。此外，本發明之組成物為了控制胰蛋白酶活性，亦可含有胰蛋白酶活性之抑制劑。作為胰蛋白酶之抑制劑，可舉出血清等。藉由使用血清，可降低本發明之組成物中的細胞毒性。

本發明之組成物，係可用以處理來自生體組織之試料，使該試料分散而取得細胞。作為生體，除了人以外可舉出小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔、狗、貓、綿羊、豬、山羊、牛、猴等非人哺乳動物等。作為生體組織，例如可舉出癌組織、正常組織等。作為癌，例如可舉出消化器癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、癌性胸‧腹膜炎、子宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌等。本發明之組成物，係尤其適用於硬癌之消除及分散。來自生體組織之試料，例如可舉出手術材料的全部或一部分、生檢試料的全部或一部分。手術材料，例如可使用以治療為目的之外科切除手術時摘出的組織。此外，可使用以病理診斷或疾病治療及病後復原期之判定等為目的，藉由低侵襲性採取法以試驗切除.試驗穿刺所採取的組織。作為藉由低侵襲性採取法採取的組織，可舉出各種生檢試料、胸腔鏡下或者腹腔鏡下材料、自腹水及胸水等獲得之試料等。試料亦可為自生體採取後，接受使用剪刀、鑷子、及剃刀等進行之細切處理等機械性分離處理者。此外，試料亦可為使用含有培養基成分或抗生素之洗淨液洗淨者。此外，試料亦可為藉由在自癌患者採取後之擂潰處理成為糊狀態者。

來自生體組織之試料的分散，係例如可將本發明之組成物與來自生體組織之試料進行混合，藉由以25~40℃，處理3分鐘~72小時的方式進行。來自生體組織之試料的分散，較宜為藉由處理5分鐘~24小時的方式進行。混合時之來自生體組織之試料的含有量，例如為0.1~5g/10mL。混合時之膠原蛋白酶活性，藉由FALGPA分解活性測定之方法進行測定，為0.30U/mL~10U/mL，宜為0.30U/mL~5U/mL，較宜為0.30U/mL~1U/mL。FALGPA分解活性測定之方法如前述。混合時之胰蛋白酶活性，藉由BAEE水解活性測定之方法進行測定，為0U/mL~30U/mL，宜為0U/mL~20U/mL，較宜為0U/mL~10U/mL。FALGPA分解活性測定之方法如前述。

分散後，可使用任意的方法，自本發明之組成物與來自生體組織之試料的混合物取得細胞。為了降低本發明組成物所含之酵素造成的細胞毒性，並提升取得細胞的增殖性，以使用血清處理將包含來自生體組織之試料分散後的混合物為佳。此外，為了降低酵素作用亦可使用EDTA等金屬鉗合劑進行處理。再者，為了除去酵素，亦可藉由遠心分離除去酵素液。在取得細胞時，亦可使用尼龍網、細胞過濾器等過濾器進行過濾。此外，亦可將分散有來自生體組織之試料的溶液，接種至培養基上進行培養，選擇性取得增殖的細胞。培養亦可以支撐體進行。接種來自生體組織之試料的支撐體，亦可以層狀塗布細胞黏著分子。作為細胞黏著分子，適宜舉出各種類型之膠原蛋白、纖網蛋白、層連結蛋白、纖維連結蛋白(vitronectin)、鈣黏蛋白、明膠、胜肽、整聯蛋白(integrin)等細胞外基質，此等即使使用1種或者2種以上並用亦可，但從進一步提升細胞接著性與細胞伸展性的觀點，以使用各種膠原蛋白為較佳，在各種膠原蛋白中，以使用I型膠原蛋白與IV型膠原蛋白為尤佳。塗布於支撐體表面之細胞黏著分子，亦可與滴塊狀凝膠之凝膠化劑相同。接著於支撐體之細胞的取得，例如可藉由在除去含有血球、不需要之細胞成分等培養液後，添加細胞之剝離劑，將接著於支撐體的細胞剝離下來的方式進行。作為細胞的剝離劑，例如可舉出EDTA-胰蛋白酶等。接著於支撐體之細胞的剝離，在支撐體有塗布物的情況下，亦可藉由添加塗布物之剝離劑的方式進行。在支撐體之塗布物為膠原蛋白的情況下，塗布物之剝離劑，例如為膠原蛋白酶。在藉由添加膠原蛋白酶進行細胞剝離的情況下，在對活細胞進行作用之前，會先對活細胞接著的膠原蛋白‧凝膠層本身進行酵素分解，對活細胞的損傷較少。

藉由將使用本發明之組成物取得的細胞，以2次元方式培養，或以立體方式增殖，或者以形成凝集塊之3次元培養法培養，並評價培養結果，可評價與在生體內之條件相同的培養結果。藉由評價將以本發明之組成物處理的細胞，進行3次元培養所得之培養結果，可更進一步獲得與生體內之條件類似的培養結果。3次元培養方法，例如有包埋至膠原蛋白或基質膠(matrigel)等細胞外基質的方法、於培養面為低接著性之培養器進行培養的方法、於培養面為U底之培養器進行培養之方法、於培養面上有構成微小圖案之培養器進行培養之方法、於培養液滴中進行培養的方法等，但並非被限定為此等。若將使用本發明組成物取得之細胞包埋至滴塊狀凝膠進行培養，則可自更少量的細胞進行各種解析。作為滴塊狀凝膠，例如可舉出在平面基材上表示凸表面形狀者。滴塊狀凝膠之容積的一例，為3~300μL、3~150μL、5~100μL、15~50μL等。滴塊狀凝膠的高度，例如為2mm以下。作為滴塊狀凝膠，例如可舉出表示對400nm的光為透過率1~95%之透明度者。滴塊狀凝膠的黏度，從兼顧容易操作與維持滴塊狀凝膠之形狀的觀點來看，例如為50~2000厘泊或100~1000厘泊等。滴塊狀凝膠亦可含有凝膠化劑。作為凝膠化劑，可舉出酸可溶性I型膠原蛋白等膠原蛋白；基質膠等細胞外基質、軟洋菜膠等。滴塊狀凝膠之膠原蛋白的含有量，從兼顧維持滴塊狀凝膠之形狀的觀點來看，例如為0.1~2.0重量%。再者，滴塊狀凝膠，亦可含有多醣類與其他細胞外基質等高分子材料、血清培養基等培養基成分等。滴塊狀凝膠，例如亦可藉由緩衝液等，例如設定為pH6.2~7.6，或pH6.8~7.4等。滴塊狀凝膠之鹽強度或離子強度，例如為100~180mmol或140~160mmol等。

滴塊狀凝膠係可使用來包埋以本發明組成物處理來自生體組織之試料所獲得的細胞。被包埋至滴塊狀凝膠之細胞的濃度，例如為10²~10⁷細胞/mL，宜為10³~10⁶細胞/mL。包埋細胞之滴塊狀凝膠，例如可藉由將含凝膠化劑之溶液與細胞等成分進行混合，將獲得之混合液以冰塊冷卻，使用吸量管滴至基材上，並在30~45℃中靜置30分鐘~2小時的方式進行製作。基材為具備可固定滴塊狀凝膠之表面者。作為基材，例如可舉出培養皿、多孔盤等培養皿；燒瓶與其他一般的培養容器；將玻璃或塑膠成形為薄片狀之蓋玻片或細胞盤(cell disk)等培養盤；等。基材從容易評價細胞培養結果的觀點來看，宜為在光學上為透明。包埋至滴塊狀凝膠的培養，例如進行1~10日，宜為進行3~8日。

作為評價的培養結果，例如可舉出培養前後之生存細胞數的變化，培養前後之細胞內產物的變化等。作為細胞內產物，可舉出DNA、RNA等核酸、蛋白質等。再進行細胞培養時，亦可對滴塊狀凝膠添加藥劑。在該情況下，藉由對培養前之細胞與培養後之細胞進比較，或對添加藥劑進行培養之細胞與不添加藥劑進行培養之細胞進行比較的方式，可評價藥劑對細胞的影響。

作為藥劑評價，例如為評價藥劑對細胞之作用的方法，其係包含在使含有藥劑之溶液接觸包埋細胞之滴塊狀凝膠後，使包埋細胞之滴塊狀凝膠與培養基接觸，在包埋細胞之滴塊狀凝膠中培養細胞，評價培養結果的方法。

作為藥劑評價之藥劑，係可舉出對疾患之治療、預防、或改善劑。作為疾患可舉出癌等。作為對癌之治療、預防、或改善劑，除了直接作用於癌細胞之抗癌劑之外，可舉出雖不直接攻擊癌細胞，但藉由與生體內之免疫細胞或其他藥劑的協同作用，發揮抑制癌細胞之增殖、緩和癌細胞活動、或殺死癌細胞之功能的藥劑。作為抗癌劑，例如可舉出5-FU等代謝拮抗劑；SN-38等抗癌妥(irinotecan)類抗癌劑；歐洲紫杉醇(docetaxel)等微管解聚合抑制藥；順鉑、l-奧沙利鉑(l-oxaliplatin)等白金製劑；等。其他可舉出與細胞增殖有關之增殖因子及其受體，以及選擇性修飾與細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡及其信號傳達有關之分子或酵素等，欲獲得抗癌效果之分子標的藥。例如，有曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、或吉非替尼(gefitinib)等作用於增殖因子受容體者；伊馬替尼(imatinib)或克唑替尼(crizotinib)等作用於融合基因之信號傳達者；貝伐單抗(bevacizumab)等抑制癌組織之血管新生者等。作為其他藥劑，可舉出抗癌劑之前體藥物、調整與抗癌劑或其前體藥物代謝相關之細胞內代謝酵素活性的藥劑、免疫療法劑等。

作為在藥劑評價中被評價的作用，係例如可舉出在對於該所取得細胞之生體投與該藥劑的情況下，與該生體之治療、預防、或改善可得到之可能性有關的作用。作為治療、預防、或改善的效果，例如可舉出疾患細胞之增殖的減少、細胞的傷害、組織的縮小等。

在藥劑評價方法中，滴塊狀凝膠與含有藥劑之溶液的接觸，係例如為了不讓滴塊狀凝膠乾燥而成為平坦之乾燥物，對位於基材上的滴塊狀凝膠，藉由將含有藥劑之溶液以多層式，覆蓋整個滴塊狀凝膠的方式進行為佳。所接觸之含有藥劑的溶液，除了藥劑以外，亦可含有血清培養基等培養基。溶液中之藥劑的濃度，宜為在對所取得細胞之生體投與藥劑時之該細胞附近的藥劑濃度。

與含有藥劑之溶液接觸後之細胞的培養，係使包埋細胞之滴塊狀凝膠與培養基接觸來進行，接觸之培養基，宜為液體培養基。作為接觸之培養基，從抑制纖維母細胞之增殖的觀點來看，或者從維持、表現纖維母細胞之功能的觀點來看，以無血清培養基為佳。與液體培養基的接觸，為了不讓滴塊狀凝膠乾燥而成為平坦之乾燥物，藉由以液體培養基覆蓋整個滴塊狀凝膠的方式進行為佳。進行培養的時間，例如為1~10日，宜為3~8日。接觸液體培養基的滴塊狀凝膠，亦可為在與含有藥劑之溶液接觸後，藉由洗淨將藥劑洗淨除去者。

藥劑評價係亦可包含使包埋細胞之滴塊狀凝膠與培養基接觸，進行培養，對培養結果進行評價。此培養結果的評價，例如藉由以下方式進行，對培養前後之生存細胞的數量進行比較，或對添加藥劑進行培養時之生存細胞的數量與不添加藥劑進行培養時之生存細胞的數量進行比較。生存細胞之數量的計測，可藉由透過顯微鏡進行目視觀察的方式進行。此外，生存細胞之數量的計測，亦可藉由進行對活細胞選擇性染色的染色法，測定因染色造成之顯色的方式進行。作為對活細胞選擇性染色的染色法，可舉出中性紅染色法等利用細胞之吞噬作用的染色法、乳膠粒子染色法、二乙酸螢光素染色法等利用細胞內酵素活性的染色法、使用其他螢光試劑的染色法等。染色後的細胞，亦可藉由福馬林固定等方式進行固定。藉此，可暫時性防止染色劑之溶出，進行更高感度之染色。染色後的滴塊狀凝膠，亦可使其乾燥。藉此，可防止變質或劣化。滴塊狀凝膠的乾燥，例如可藉由風乾，或以10~50℃左右的加熱進行強制乾燥等方式進行。因染色造成之顯色的測定，亦可藉由拍攝染色後的滴塊狀凝膠，將拍攝之圖像數值化進行評價的方式進行。數值化後的評價，亦可包含根據被染色細胞之圖像形狀的數值修正。癌細胞有形成塊狀且深色圖像的傾向，纖維母細胞有形成細纖維狀且淺色圖像的傾向，藉由選擇塊狀之染色圖的數值進行修正，可更正確且簡單地檢測出來。

此培養結果之其他的評價方法，係例如可藉由對細胞在培養前後或藥劑接觸之有無下的基因表現變動進行比較的方式進行。基因表現變動係關於培養後之細胞內mRNA表現，可藉由以即時RT-PCR法或使用DNA晶片的方法等公知方法進行解析的方式進行。作為被當成對象的基因，可比較所有的基因，亦可將與成為藥劑標的之分子或其功能有關者、與藥劑之代謝有關者、與細胞周期或細胞之生與死有關者等進行分別或組合比較。亦可在培養中將解析基因所必須之藥劑添加至滴塊狀凝膠。

此外，其他方法係例如藉由對細胞在培養前後或藥劑接觸之有無下表現之細胞表面抗原、受體蛋白質、或藥劑代謝酵素等蛋白質進行比較的方式進行。在蛋白質的檢測，可使用免疫染色法、ELISA法、或酵素活性測定法等公知技術。此外，亦可在將培養後之滴塊狀凝膠回收進行固定、包埋後，製作病理標本，並藉由免疫組織染色法進行比較。亦可將解析蛋白質所必須之藥劑添加至培養中的滴塊狀凝膠等培養基。

此外，其他方法係例如藉由對細胞在培養前後或藥劑接觸之有無下所具有之突變基因的方式進行。突變基因的檢測，可使用PCR或DNA定序等公知的基因解析方法，或原位雜交法等公知技術。亦可將解析突變基因所必須之藥劑添加至培養中的滴塊狀凝膠。

經使用本發明組成物之細胞的取得方法，及細胞培養結果的評價方法，係亦可使用含有本發明組成物的套件。套件除了本發明組成物之外，亦可含有膠原蛋白溶液，及液體培養基。套件可含有之膠原蛋白溶液，可用以與從來自生體組織之試料取得的細胞混合，製作滴塊狀凝膠。作為膠原蛋白溶液所含之膠原蛋白，例如可舉出酸可溶性之I型膠原蛋白或IV型膠原蛋白，或者胃蛋白酶可溶性之I型膠原蛋白或III型膠原蛋白等。套件可含有之液體培養基，為用以在滴塊狀凝膠培養細胞者。液體培養基亦可為濃縮培養基。作為濃縮培養基，例如可舉出McCoy's 5A、RPMI-1640、D-MEM、MEM、MCDB-131、Ham's F-12、D-MEM/F-12、Medium-199等哺乳類細胞培養基本培養基。

再者，套件係亦可含有重組緩衝液。重組緩衝液會中和酸可溶性膠原蛋白溶液，並將滴塊狀凝膠固化。作為重組緩衝液，例如可舉出調整為pH7~10之氫氧化鈉水溶液等。此外，套件亦可含有接種來自生體組織之試料進行培養的支撐體。作為支撐體的例，可舉出膠原蛋白‧凝膠‧燒瓶、培養支撐體用管等。作為培養支撐體用管，可舉出平底管容器等，其係將管容器的一部分裁切為對容器中心軸有平緩角度之形狀，將表面積為0.01~25.0cm²之該平坦裁切面作為支撐體，其中該支撐體之表面為接著細胞進行培養之部分。套件除了用以在滴塊狀凝膠培養細胞的液體培養基之外，亦可含有用以在支撐體上之培養的培養基。作為用以在支撐體上之培養的培養基，可舉出在對來自生體組織之動物細胞具有增殖作用及生理活性維持作用的同時對細菌具有致死作用及/或增殖抑制作用的培養液。具體而言，例如可舉出Ham's F-12或D-MEM，或者於D-MEM/F-12混合液以成為5~20%的方式添加牛血清血蛋白(FBS)者，或進一步添加各種成長增殖因子者等。此等培養基亦可含有抗生物質。

此外，套件係亦可含有用以評價細胞之培養結果的細胞染色劑。作為細胞染色劑，例如可舉出中性紅等利用細胞吞噬作用的染色劑。中性紅在與利用對溶體之吞噬作用之細胞習性相關性高的觀點上為佳。套件除了上述構成物品以外，亦可含有其他構成物品。

實施例

以下，藉由實施例說明本發明，但本發明非受此等所限定者。

試驗例1抗癌劑感受性試驗：

以下的試驗例中，在沒有特別記述的情況下，抗癌劑感受性試驗係遵照以下的順序進行。

1.檢體洗淨：

從癌患者之胃癌、大腸癌、胰臟癌等消化器癌；乳癌；肺癌；頭頸部癌；癌性胸‧腹膜癌；子宮頸癌；子宮體癌或卵巢癌等固形癌組織摘出檢體。藉由以下方法，去除附著於檢體表面的雜菌。首先，準備3張10cm大的面紙，各加入20mL添加抗生劑之培養基溶液(檢體洗淨液)。將檢體於第1張面紙的檢體洗淨液中，充分清洗檢體表面。將檢體移至第2張、及第3張面紙進行洗淨作業。所使用之檢體洗淨液，為於DF培養液(DF：杜爾貝科改進之伊格爾(DME)培養液(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)與Ham's F-12培養液1：1的混合培養液)以最終濃度相對於基礎培養液為1mg/mL的方式添加Pentcillin(富山化學公司製，Pentcillin注射用)，以最終濃度相對於基礎培養液為0.5mg/mL的方式添加康黴素(明治製菓製，硫酸康黴素注射液)，以最終濃度相對於基礎培養液為2.5μg/mL的方式添加雙性殺黴素B(和光純藥公司製)者。

2.組織之細切處理：

將進行過洗淨的檢體移至新的面紙，在面紙上使用剪刀或鑷子，將作為檢體之腫瘤組織迅速切成3~5mm見方的大小。

3.組織之擂潰處理：

將進行過細切處理的檢體，在面紙上使用夾在把針器的剃刀，進行擂潰直到經過細切的腫瘤組織成為糊狀為止。加入20mL的DF培養液至經擂潰的腫瘤組織，將組織與DF培養液一起回收至50mL離心管。再加入10mL的DF培養液，充分回收附著於培養皿上的組織。於桌上型離心機以400×g離心3分鐘。

4.組織分散：

離心後，藉由抽吸除去上清液。添加DF培養液9mL至離心後之沉澱物，搖晃離心管讓組織片盡量分開。因應酵素組成物亦可添加10%FBS(FBS為牛血清血蛋白)。添加1mL調整為處方濃度之10倍濃度的細胞分散用酵素組成物，調整處方濃度之細胞分散溶液。在37℃恆溫器內進行攪拌振盪1~2小時左右。

5.回收

加入10mL的DF培養液成為20mL，以400×g離心3分鐘，除去上清液。將上清液除去後，輕輕搖晃離心管讓細胞集塊分開，在添加10mL的培養基後，進行移液(pipetting)，進一步解開細胞集塊。使用孔徑尺寸300μm之尼龍網，過濾含有細胞的懸濁液。加入10mL的DF培養液，將離心管與尼龍網進行充分的預洗。

6.預備培養

將回收處理所得之細胞進行離心回收，吸引除去上清液。使離心後的細胞沉澱物懸濁於Primaster套件(倉敷紡積股份有限公司製)之5mL的預備培養培養基(PCM-1)。將懸濁有細胞的PCM-1接種至膠原蛋白‧凝膠‧燒瓶內。靜置於CO₂恆溫箱，培養一夜。在培養一夜後，吸引除去包含血球與不需要之細胞成分等的培養液。觀察到腫瘤細胞植入至膠原蛋白‧凝膠‧燒瓶。

7.細胞回收：

吸引除去膠原蛋白‧凝膠‧燒瓶內的培養液，加入5mL的DF培養液洗淨後，加入2mL的DF培養液。再添加0.2mL調整為處方濃度之10倍濃度的細胞分散用酵素組成物，調整處方濃度的酵素溶液。以37℃振盪15~30分鐘，使燒瓶內的膠原蛋白‧凝膠溶解。將從膠原蛋白‧凝膠‧燒瓶剝離的細胞回收至50mL離心管。另外，在確認有細胞接著至燒瓶的情況下，加入3mL的EDTA-胰蛋白酶振盪5分鐘。在確認細胞的剝離後，加入5mL的10%血清培養基仔細預洗燒瓶內部，並回收至50mL離心管。在加入10mL的DF培養液後，離心回收細胞。

8.包埋：

除去上清液，對離心後之沉澱物加入2mL的EDTA-移蛋白酶溶液處理3~7分鐘後，加入10mL的10%血清培養基進行移液，以孔徑尺寸100μm的尼龍網過濾細胞懸濁液。加入10mL的DF培養液，充分預洗離心管與尼龍網。將過濾液離心後，吸引除去上清液，回收細胞。將膠原蛋白溶液混入至回收的細胞。將混有細胞的膠原蛋白溶液以冰塊冷卻，使用微吸管，以30μL/滴於盤上每1孔各滴下3滴。靜置於37℃的CO₂恆溫箱1小時，使膠原蛋白‧滴凝膠化。凝膠化後，將含有10%FBS之DF培養基以每3mL/孔的方式進行重疊。無血清培養基(PCM-2)亦可。在將培養基重疊後，於CO₂恆溫箱培養一夜。

9.藥劑接觸：

在經過一夜的培養後，以成為預定濃度的方式將濃縮藥劑液添加混合至培養基。在CO₂恆溫箱進行對應各藥劑之規定時間的接觸培養。

10.藥劑除去及培養：

在藥劑接觸結束後吸引除去培養液，於各孔以每4mL重疊Primaster套件(倉敷紡積股份有限公司製)之無血清培養基(PCM-2)，於接下來5天進行無血清培養。

11.評價：

無血清培養後，於各孔各添加40μL的中性紅(NR)溶液。於CO₂恆溫箱培養2小時，進行細胞染色。中性紅染色後，吸引除去含有染色液的培養液。除去培養液後，各添加4mL的10%中性福馬林溶液，在室溫下進行約1小時的細胞固定。細胞固定後，除去中性福馬林溶液。將培養盤浸漬於自來水中，水洗20分鐘。水洗後，仔細瀝乾盤上的水分，進行送風乾燥。進行經中性紅固定之細胞的圖像解析處理。圖像解析處理係使用日本特開平10-115612(癌細胞定量測定方法)揭示的圖像解析處理方法。

試驗例2

混合市售之膠原蛋白酶、中性蛋白酶、玻尿酸酶、及去氧核醣核酸酶，調製胰蛋白酶活性及膠原蛋白酶活性為如以下表1所示之實施例1及比較例1的組成物。將調製之組成物，使用於試驗例1的4.組織分散。

實施例1及比較例1之組成物的膠原蛋白酶活性，係藉由以下之FALGPA分解活性測定的方法進行測定。

1. FALGPA分解活性測定之方法：

以下方法係刊載在Sigma-Aldrich公司的網站(http：//www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-collagenase-using-n-3-2furylacryloyl-leu-gly-pro-ala.html)。

(1)略語：

(2)原理：

測定FALGPA在膠原蛋白酶之作用下分解為FAL與Gly-Pro-Ala時來自FALGPA之345nm吸光度(A345nm)的減少變量算出活性。

(3)方法： a.試藥：

(a)試藥B 50mM兩性離子緩衝劑(tricine)、10mM氯化鈣、400mM氯化鈉、pH7.5(25℃)緩衝液：

將兩性離子緩衝液(Sigma-Aldrich，T0377)0.896g、氯化鈉(Sigma-Aldrich，S9888)2.34g、氯化鈣(二水)(Sigma-Aldrich，C3881)0.147g溶於80mL的蒸餾水，用1M氫氧化鈉溶液(Sigma-Aldrich，S2567)，或1M氯化氫溶液(Sigma-Aldrich，H3162)調整為pH7.5(25℃)後，加入蒸餾水至100mL。

(b)試藥C 1.0mM N-(3-[2-呋喃基]丙烯醯基)-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA)：

將9.6mg的FALGPA(Sigma-Aldrich，F5135)添加至A之溶液20mL，攪拌30分鐘以上使其完全溶解。

(c)試藥D 蒸餾水：

(d)試藥E 酵素溶液：

將酵素以使用時之5~10倍濃度溶解於蒸餾水。

b.條件：

反應液pH=7.5，反應溫度=25℃，吸光度=A345nm，光徑長度=1cm

c.反應液之試藥組成及操作：

將2.9mL的試藥B放入1cm光徑長度的光析管(cell)，加溫至25℃。若A345nm穩定則添加0.1mL的試藥C(空白試驗)或試藥D(正式試驗)，立刻混合並於25℃記錄5分鐘之A345nm的降低。

(4)活性單位之定義與計算方法

在前述之條件下，並且在pH7.5、25℃、鈣離子的存在下，於1分鐘水解1.0μ莫耳FALGPA的酵素量定義為1FALGPA單位。FALGPA單位係由以下公式求得。

FALGPA單位/mL={(E1-E2)×3/(F×0.1)}/0.53

上述公式中之符號或數值係表示如下。

實施例1及比較例1之組成物的胰蛋白酶活性，係藉由以下之BAEE水解活性測定之方法進行測定。

2. BAEE水解活性測定之方法：

以下方法係刊載在Sigma-Aldrich公司的網站(http：//www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-trypsin.html)。

(1)略語：

BAEE=Nα-苯甲醯基-L-精胺酸乙酯鹽酸鹽

(2)原理：

測定BAEE在胰蛋白酶之作用下水解為Nα-苯甲醯基-L-精胺酸與乙醇時之253nm吸光度(A253nm)的增加變量算出活性。

(3)方法： a.試藥：

(a)試藥A 67mM磷酸鈉緩衝劑、pH7.5(25℃)緩衝液：

將磷酸鈉緩衝液(Sigma-Aldrich，S0751)0.804g溶於80mL的蒸餾水，並用1M氫氧化鈉溶液(Sigma-Aldrich，S2567)調整為pH7.6(25℃)後，加入蒸餾水至100mL。

(b)試藥B 0.25mM Nα-苯甲醯基-L-精胺酸乙酯鹽酸鹽：

將4.3mg的Nα-苯甲醯基-L-精胺酸乙酯鹽酸鹽(Sigma-Aldrich，B4500)添加並溶解至A之溶液50mL。

(c)試藥C 蒸餾水：

(d)試藥D 酵素溶液：

將酵素以使用時之5~10倍濃度溶解於蒸餾水。

b.條件：

反應液pH=7.6，反應溫度=25℃，吸光度=A253nm，光徑長度=1cm

c.反應液之試藥組成及操作：

將3.0mL的試藥B放入1cm光徑長度的光析管，加溫至25℃。若A253nm穩定則添加0.1mL的試藥C(空白試驗)或試藥D(正式試驗)，立刻混合並於25℃記錄5分鐘之A253nm的降低。

d.活性單位之定義與計算方法

前述之條件下，在pH7.6、25℃、反應液量3.2mL、光徑長度1cm下，將於1分鐘使A253nm上升0.001的酵素量定義為1BAEE單位。BAEE單位係由以下公式求得。

BAEE單位/mL=(E1-E2)/{0.001×(F×0.1)}

上述公式中之符號或數值係表示如下。

試驗例3 酵素消化能之比較：

使用用以評價消化能的豬皮，比較關於實施例1之組成物與比較例1之組成物，豬皮的消化效率。具體而言，於切碎的豬皮混入實施例1或比較例1之組成物0.1mL與加有10%FBS之DF培養基0.9mL，以37℃進行振盪，觀察豬皮的大小。將0小時與2小時後的狀態表示於圖1。

如圖1所示，在實施例1之組成物，可獲得較比較例1之組成物更好的消化結果。

試驗例4

使用實施例1之組成物或比較例1之組成物，進行胃癌10檢體、及大腸癌10檢體之癌組織的消化反應，以目視確認未分解殘渣量進行比較評價。將結果表示於以下表7。在以下表7中，實施例1係表示實施例1之未分解殘渣量較比較例1之未分解殘渣量少的檢體數量；比較例1係表示比較例1之未分解殘渣量較實施例1之未分解殘渣量少的檢體數量。相同程度表示兩者之未分解殘渣量無太大差別的檢體數量。

如表7所示，實施例1之組成物係與比較例1之組成物進行比較，對胃癌組織及大腸癌組織表示非常優良的消化性。如此，實施例1之組成物係不分癌組織的種類，表示高消化性。

試驗例5 對已建立之細胞株之細胞毒性的比較

使用來自結腸癌之HCT-116細胞與來自肺癌之PC-14細胞，比較實施例1或比較例1之組成物造成的細胞毒性。具體而言，於實施例1或比較例1之組成物，混入約50萬個/mL的HCT-116或PC-14細胞的懸濁液(加入10%FBS的DF培養基)，以37℃進行培養，每隔2小時確認細胞數。

將結果表示於圖2。圖2為以0小時之細胞數為100%之細胞數%為縱軸而製作成圖表者。如圖2所示，關於HCT-116細胞，不論是在實施例1之組成物的情況抑或是在比較例1之組成物之情況下，亦與沒有酵素一樣，幾乎沒有出現細胞的增減。在PC-14細胞，細胞在沒有酵素時會增加，而不論是在實施例1之組成物的情況或是在比較例1之組成物之情況下，細胞皆有些微增加，沒有確認到比初期細胞數少的情形。如此，實施例1之組成物及比較例1之組成物，在細胞毒性上沒有太大差別，實施例1之組成物在細胞毒性與比較例1之組成物幾乎一樣低。

試驗例6

使用實施例1之組成物及比較例1之組成物，藉由記載於試驗例1之2~7的方法從癌組織回收癌細胞，並藉由記載於試驗例1之8及10的方法將所獲得之癌細胞包埋培養至膠原蛋白‧凝膠‧滴7天。將培養第二天及培養7天後之細胞的中性紅(NR)染色圖表示於圖3。

如圖3所示，在使用比較例1之組成物的情況下，經過7天培養的增殖率為3.5倍。在使用實施例1之組成物的情況下，增殖率為4.5倍。如此，在使用實施例1之組成物的情況，較在使用比較例1之組成物的情況，可獲得適合在膠原蛋白‧凝膠‧滴中培養的細胞。

試驗例7 細胞回收量：

將大腸癌、胃癌、肺癌組織藉由記載於試驗例1之2、3的方法製成糊狀後分割為2群，分別使用實施例1之組成物或比較例1之組成物，藉由記載於試驗例1之4、5的方法回收癌細胞，並以記載於試驗例1之6的方法預備培養一夜後，以記載於試驗例1之7的方法回收細胞，並以錐蟲藍(trypan blue)染色法進行測定。將測定之細胞數表示於以下表8-1~表8-3。表8-1~表8-3中，組織的重量表示為了回收細胞所使用之癌組織每1群的重量。回收細胞數比較表示同一檢體實施例1之細胞數除以比較例1之細胞數的值。與經回收之糊狀組織片中的細胞數不同，藉由測定剛進行預備培養後之細胞數，可更正確測定沒受到損傷的細胞數。

若將回收細胞數之相對性差異未達25%視為同等程度，25%以上視為其中一方較他方多，則如表8所示，在使用實施例1之組成物的情況，較使用比較例1之組成物的情況可從癌組織回收同等程度或較多數的細胞。

試驗8

使用實施例1之組成物或比較例1之組成物，藉由記載於試驗例1之1~5的方法，從10被檢體之胃癌組織、10被檢體之大腸癌組織、6被檢體之肺癌組織、2被檢體之乳癌組織及2被檢體之胰臟癌組織回收癌細胞。使用膠原蛋白‧凝膠‧燒瓶(倉敷紡積股份有限公司製)，藉由記載於試驗例1之6的方法預備培養回收到的癌細胞。在預備培養後，藉由記載於試驗例1之7的方法，從膠原蛋白‧凝膠‧燒瓶回收細胞。測定回收到的細胞數量，並比較實施例1的情況與比較例1的情況。將結果表示於以下的表9。表9中，實施例1表示在實施例1之情況的回收細胞數較比較例1多出25%以上的被檢體數。比較例1表示在比較例1之情況的回收細胞數較實施例1多出25%以上的被檢體數。相同程度表示實施例1與比較例1之回收細胞數的相對差異未達25%的被檢體數。

如表9所示，在使用實施例1之組成物的情況下，關於全部4種癌細胞，可確保與在比較例1之組成物的情況同等以上的細胞數。此外，在使用實施例1之組成物進行回收的情況，於從膠原蛋白‧凝膠‧燒瓶回收細胞時附著殘留於燒瓶的細胞較使用比較例1之組成物的情況少，可有效率進行回收作業。

在回收來自乳癌組織的癌細胞的情況，使用比較例1之組成物的情況下，酵素反應後之未分解殘渣量較使用實施例1之組成物的情況少。然而，來自膠原蛋白‧凝膠‧燒瓶的細胞回收量，在實施例1之組成物的情況下較多。根據此事實，被認為即使實施例1之組成物沒有完全消化掉乳癌組織，亦可使癌細胞自乳癌組織露出，而可自乳癌組織有效率地回收癌細胞。

在如此使用實施例1之組成物的情況下，可較使用比較例1之組成物的情況，不分癌的種類更有效率地回收癌細胞。

試驗例9

作為培養細胞株，使用來自結腸癌的HCT-116與來自肺癌的PC-14等2種，查證關於實施例1之組成物及比較例1之組成物對培養細胞株之增殖性的影響。具體而言，在將細胞株培養於含有比較例1或實施例1之組成物的酵素液中2小時後，藉由試驗例1之8及10的步驟，實施膠原蛋白‧滴包埋培養，並查證24、48、120小時後的細胞增殖性。

將結果表示於圖4。如圖4所示，在酵素未處理的情況、比較例1的情況、實施例1的情況，無法確認細胞增殖性有不同。如此，藉由使用實施例1的組成物，可以取得在滴塊狀凝膠表示適合之增殖性的細胞。

試驗例10 使用培養細胞之抗癌劑感受性試驗

設想組織消化，在使來自結腸癌的HCT-116細胞與來自肺癌的PC-14細胞，接觸實施例1或比較例1之酵素組成物2小時後，藉由試驗例1的方法進行抗癌劑感受性試驗(CD-DST法)，求得圖像解析值，比較各種藥劑感受性。

將結果表示於圖5。圖5中之T/C率(%)，係將各藥劑濃度下120小時後的圖像解析值，除以無藥劑之圖像解析值得值。未處理表示在使用不進行酵素液處理之細胞的情況下的實驗結果。如圖5所示，HCT-116及PC-14任一者的細胞，在使用實施例1之組成物的情況下，對於5-FU、順鉑(CDDP)、及SN-38的藥劑感受性，與在比較例1之組成物的情況為相同程度。此外，關於歐洲紫杉醇及奧沙利鉑，同樣在調查藥劑感受性時，在實施例1之組成物的情況、比較例1之組成物的情況、及未處理的情況下，藥劑感受性為相同程度。如此，藉由使用實施例1之組成物，可獲得對5-FU、CDDP、SN-38、歐洲紫杉醇及奧利沙鉑等各種抗癌劑表示同等之藥劑感受性的細胞。

試驗例11

關於大腸癌細胞，藉由與試驗例10相同的方法求得在使用實施例1或比較例1的情況之T/C(%)值進行1對1製圖。將結果表示於圖6。

如圖6所示，從圖表資料可獲得斜率1確認有高關聯性之回歸線。根據此事實，可認為實施例1之組成物與比較例1之組成物在大腸癌有相同的藥劑感受性評價。

試驗例12 抗癌劑感受性試驗(CD-DST法)之成功率：

使用實施例1之組成物或比較例1之組成物，藉由試驗例1的方法，實施抗癌劑感受性試驗(CD-DST法)。CD-DST法的實施，係分別對複數的被檢體進行。

其結果，在部分被檢體的情況下，無法完成CD-DST法。無法完成的原因，在於無法確認群落狀的癌細胞增殖，無法藉由圖像解析獲得有效之數值資料。將沒有這樣的問題，成功進行感受性試驗之解析的被檢體數，定為成功數。將成功數相對於經實施之被檢體數的實施數的比率，定為成功率(%)。將成功率等數值結果表示於以下的表10。

如表10所示，在使用實施例1之組成物的情況下，即使在任一種癌之種類，使用CD-DST法皆可獲得很高的成功率。根據此事實，可得知實施例1之組成物，在用以回收適合感受性試驗之態樣的癌細胞為有益。

試驗例13 胃癌症例之膠原蛋白‧凝膠‧滴培養細胞染色圖的比較：

試驗例12中，在胃癌的情況下，培養的結果，關於確認到癌細胞增殖的3個被檢體，將增殖後細胞之中性紅染色圖表示於圖7。

如圖7所示，關於檢體1，實施例1方之深染色的癌細胞增殖為良好。另一方面，比較例1無法藉由圖像解析獲得有效的數值資料，沒有進行CD-DST法。在實施例1的情況，被認為可以回收到較多細胞這點亦為主要因素之一。

至於檢體2、3，雖然接種相同程度的細胞數，但在培養144小時後之深染色的癌細胞增殖性，實施例1這一方為良好。在檢體2之比較例1的情況，無法藉由圖像解析獲得有效的數值資料，沒有進行CD-DST法，但在檢體2之實施例1可獲得有效的數值資料，有完成CD-DST法。

如以上所述，在使用實施例1之組成物的情況，可從胃癌、大腸癌、乳癌等各種癌組織，獲得以適合抗癌劑感受性試驗之態樣增殖的合適細胞。

Claims

一種組成物，為用以使生體組織分散的組成物，藉由FALGPA分解活性測定的方法進行測定，在前述組成物之處方溶液中的膠原蛋白酶活性為0.30U/mL~10U/mL；藉由BAEE水解活性測定的方法進行測定，在前述組成物之處方濃度中的胰蛋白酶活性為0U/mL~30U/mL。
如請求項1之組成物，其係用於藥劑評價。
如請求項1或2之組成物，其中生體組織為癌組織。
一種方法，為源自生體組織之細胞的取得方法，且包含以如請求項1~3中任1項的組成物處理來自生體組織之試料。
一種方法，為細胞之培養結果的評價方法，且培養之細胞為經如請求項1~3中任1項的組成物處理過的細胞。
如請求項5之方法，其中，細胞的培養結果為2次元的培養結果。
如請求項5之方法，其中，細胞的培養結果為3次元的培養結果。
如請求項7之方法，其中，3次元的培養係在滴塊狀凝膠內進行。
一種套件，為用以進行如請求項4~8中任1項之方法的套件，且包含如請求項1~3中任1項的組成物。