CN105705651A - 生物组织分散用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是,以高效率从来自生物组织的样品获得增殖性高的细胞。本发明提供用于使生物组织分散的组合物,所述组合物的处方溶液中的胶原酶活性通过FALGPA分解活性测定的方法测定为0.30U/mL-10U/mL,所述组合物的处方浓度中的胰蛋白酶活性通过BAEE水解活性测定的方法测定为0U/mL-30U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及用于使生物组织分散的组合物。另外,本发明涉及滴块状凝胶中包埋的细胞的培养结果的评价方法。进一步地,本发明涉及来自生物组织的细胞的获得方法。另外,本发明涉及用于进行上述方法的试剂盒。
背景技术
尽管抗癌剂也作用于正常细胞而存在表现强副作用的情况,但抗癌剂的奏效率,除了一部分以外不满50%,抗癌剂的有效程度已知随患者而大大不同。因此,希望在癌症患者接受抗癌剂的施用的治疗前,评价预定施用的抗癌剂对该癌症患者是否有效,避免无效抗癌剂的不需要的施用,减少患者的身体上、经济上的负担,避免治疗机会的失去。
作为如此的抗癌作用的评价方法,已知在模拟生物的滴块状凝胶中,以3维增殖癌细胞,使其与抗癌剂接触,评价增殖结果的方法(专利文献1-11),希望在滴块状凝胶中获得与生物内同样地增殖的细胞。
专利文献1-7中,作为在从来自生物组织的样品获得细胞时应用的酶,记载了应用胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、弹性蛋白酶、分散酶等。另外,专利文献9-11中记载了,将生物组织以包含选自梭菌属中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(サーモライシン)、以及分散酶的1种以上蛋白酶,以及选自胶原酶I、胶原酶II、以及胶原酶IV的1种以上胶原酶的混合酶进行处理。
另外,非专利文献1-21中记载了使生物细胞分散的酶。在这些文献中记载了,通过I型胶原酶、II型胶原酶、III型胶原酶、IV型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶、神经氨酸酶等处理来自生物组织的样品。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利2879978号公报
专利文献2:日本特开平3-285696号公报
专利文献3:日本特开平7-31470号公报
专利文献4:日本特开平7-241190号公报
专利文献5:日本特开平10-115612号公报
专利文献6:日本特开2003-9853号公报
专利文献7:日本特开2008-11797号公报
专利文献8:日本特开2005-95058号公报
专利文献9:日本特开2010-227088号公报
专利文献10:日本特开2011-115106号公报
专利文献11:国际公开第2011/090068号。
非专利文献
非专利文献1:Zhou,J,Belov,L.,Solomon,M.,Chan,C.,Clarke,S.andChristopherson,R.:ColorectalCancerCellSurfaceProteinProfilingUsinganAntibodyMicroarrayandFluorescenceMultiplexing.,JVisExp55,e3322,2011
非专利文献2:Quintana,E.,Shackleton,M.,Foster,H.,Fullen,D.,Sabel,M.,Johnson,T.andMorrison,S.:PhenotypicHeterogeneityAmongTumorigenicMelanomaCellsfromPatientsthatisReversibleandNotHierarchicallyOrganized.,CancerCellVol.18,,,510,2010
非专利文献3:Kim,M.,Evans,D.,Wang,H.,Abbruzzese,J.,Fleming,J.andGallick,G.:GenerationofOrthotopicandHeterotopicHumanPancreaticCancerXenograftsinImmunodeficientMice.,NatProtoc4,1670,2009
非专利文献4:Sauvageot,C.,Weatherbee,J.,Kesari,S.,Winters,S.,Barnes,J.,Dellagatta,J.,Ramakrishna,N.,Stiles,C.,Kung,A.,Kieran,M.andWen,P.:EfficacyoftheHSP90Inhibitor17-AAGinHumanGliomaCellLinesandTumorigenicGliomaStemCells.,NeuroOncolVol.11,,,109,2009
非专利文献5:Liu,R.,Wang,X.,Chen,G.,Dalerba,P.,Gurney,A.,Hoey,T.,Sherlock,G.,Lewicki,J.,Shedden,K.andClarke,M.:ThePrognosticRoleofaGeneSignaturefromTumorigenicBreast-CancerCells.,NEnglJMed356,217,2007
非专利文献6:NakashiroKoh-Ichi,HaraShingo,ShinoharaYuji,OyasuMiho,KawamataHitoshi,ShintaniSatoru,HamakawaHiroyuki,OyasuRyoichi:Phenotypicswitchfromparacrinetoautocrineroleofhepatocytegrowthfactorinanandrogen-independenthumanprostaticcarcinomacellline,CWR22R,AmJPathol165,533-40,2004
非专利文献7:NishioJun,IwasakiHiroshi,IshiguroMasko,OhjimiYuko,FujitaChikako,IsayamaTeruto,NaitoMasatoshi,OdaYoshinao,KanekoYasuhiko,KikuchiMasahiro:Establishmentofanewhumansynovialsarcomacellline,FU-SY-1,thatexpressesc-Metreceptoranditsligandhepatocytegrowthfactor,IntJOncol21,17-23,2002
非专利文献8:EmenakerN,CalafG,CoxD,BassonMandQureshiN:Shortchainfattyacidsdifferentiallymodulatecellularphenotypeandc-mycproteinlevelsinprimaryhumannonmalignantandmalignantcolonocytes,JNutr46,96-105,2001
非专利文献9:MacLeod,R:RapidMonolayerPrimaryCellCulturefromTissueBiopsy,Cell&TissueCulture:LaboratoryProceduresVol.1,Doyle,A.,Griffiths,J.,andNewell,D.,JohnWileyandSonsLtd,3E:2.1,1995
非专利文献10:Hague,AandParaskeva,C:ColonAdenocarcinomaCells,Cell&TissueCulture:LaboratoryProceduresVol.1,Doyle,A.,Griffiths,J.,andNewell,D.,JohnWileyandSons,Ltd.,12C:1.1,1995
非专利文献11:Beaupain,R.,Mainquene,C.,Brouty-Boye,D.,Planchon,P.,andMagniew,V.:"Normal"BreastCellsAdjacenttoaTumorGrowninLong-termThreeDimensionalCulture,InVitroCellDevBiol29,100,1993
非专利文献12:Kruse,C.,Mitchell,D.,Kleinschmidt-DeMasteis,B.,Franklin,W.,Morse,H.,Spector,E.,andLillehei,K.:CharacterizationofaContinuousHumanGliomaCellLineDBTRG-OSMG:GrowthKinetics,Karyotype,ReceptorExpressionandTumorSuppressorGeneAnalyses,InVitroCellDevBiol28,609,1992
非专利文献13:Emerman,J.andWilkinson,D.:RoutineCulturingofNormal,DysplasticandMalignantHumanMammaryEpithelialCellsfromSmallTissueSamples,InVitroCellDevBiol26,1186,1990
非专利文献14:Boyd,J.,RinehartJr.,C.,Walton,L.,Siegal,G.andKaufman,D.:UltrastructuralCharacterizationofTwoNewHumanEndometrialCarcinomaCellLinesandNormalHumanEndometrialEpithelialCellsCulturedonExtracellularMatrix,InVitroCellDevBiol26,701,1990
非专利文献15:SheelaS,RiccardiVM,RatnerN:AngiogenicandinvasivepropertiesofneurofibromaSchwanncells,JCellBiol111,645-53,1990
非专利文献16:Sacks,P.,Parnes,S.,Gallick,G.,Mansouri,Z.,Lichtner,R.,Satya-Prakash,K.,Pathak,S,andParsons,D.:EstablishmentandCharacterizationofTwoNewSquamousCellCarcinomaCellLinesDerivedfromTumorsoftheHeadandNeck,CancerRes48,2858,1988
非专利文献17:Brattain,M.,Marks,M.,McCombs,J.,Finely,W.,andBrattain,D.:CharacterizationofHumanColonCarcinomaCellLinesIsolatedFromaSinglePrimaryTumour,BrJCancer47,373,1983
非专利文献18:Friedman,E.,Higgins,P.,Lipkin,M.,Shinya,H.,andGelb,A.:TissueCultureofHumanEpithelialCellsfromBenignColonicTumors,InVitro17,632,1981
非专利文献19:Leung,C.,andShiu,R.:MorphologicalandProliferativeCharacteristicsofHumanBreastTumorCellsCulturedonPlasticandinCollagenMatrix,InVitro18,476,1981
非专利文献20:Creasey,A.,Smith,H.,Hackett,A.,Fukuyama,K.,Epstein,W.,andMadin,S.:BiologicalPropertiesofHumanMelanomaCellsinCulture,InVitro15,342,1979
非专利文献21:Lasfargues,E.:TissueCultureMethods/Applications,Kruse,P.,andPatterson,M.,AcademicPress,45,1973。
发明内容
发明要解决的课题
但是,通过以往的方法从来自生物组织的样品配制的细胞,即使要使其增殖,也偶尔存在不按期待增殖的情况。另外,由于存在只能从生物获得少量来自组织的样品的情况,因此希望来自样品的细胞的获得效率高。因此,本发明的目的是,以高效率从来自生物组织的样品获得增殖性高的细胞。
用于解决课题的手段
本发明人等经过努力研究发现,在用于使来自生物组织的样品分散所使用的组合物中包含的、被认为促成组织的可溶化的胰蛋白酶妨碍胶原酶、其它有用酶的作用。另外发现,在胰蛋白酶活性高的情况下,细胞毒性高,使获得的细胞的增殖性降低。以以上的发现为基础进一步努力研究,本发明人等发现,通过使用与以往使用的组合物不同、抑制胰蛋白酶活性且确保胶原酶活性高的组合物使来自生物组织的样品分散,能够以高效率获得增殖度高的细胞。在来自生物组织的样品的分散不充分的情况下,存在细胞的获得效率低的倾向,以往,一直使用显示高胰蛋白酶活性的组合物,进行细胞分散。相反,本发明发现,通过使胰蛋白酶活性降低,能够提高增殖度高的细胞的获得效率,因此是突破性的发明。
也即,在第1实施方式中,本发明提供用于使生物组织分散的组合物,所述组合物的处方溶液中的胶原酶活性通过FALGPA分解活性测定的方法测定为0.30U/mL-10U/mL,所述组合物的处方溶液中的胰蛋白酶活性通过BAEE水解活性测定的方法测定为0U/mL-30U/mL。
另外,在第2实施方式中,本发明提供第1实施方式中记载的组合物,其用于药剂评价。
进一步地,在第3实施方式中,本发明提供第1实施方式或第2实施方式中记载的组合物,其中生物组织是癌组织。
进一步地,在第4实施方式中,本发明提供来自生物组织的细胞的获得方法,其包含将来自生物组织的样品以第1实施方式-第3实施方式中任一项记载的组合物处理。
进一步地,在第5实施方式中,本发明提供细胞的培养结果的评价方法,其中培养的细胞是以第1实施方式-第3实施方式中任一项记载的组合物处理的细胞。
另外,在第6实施方式中,本发明提供第5实施方式中记载的方法,其中细胞的培养结果是2维的培养结果。
另外,在第7实施方式中,本发明提供第5实施方式中记载的方法,其中细胞的培养结果是3维的培养结果。
另外,在第8实施方式中,本发明提供第7实施方式中记载的方法,其中3维的培养在滴块状凝胶内进行。
进一步地,在第9实施方式中,本发明提供用于实施第4实施方式或第5实施方式中记载的方法的试剂盒,其包含第1实施方式-第3实施方式中任一项记载的组合物。
发明的效果
如果使用本发明的组合物处理来自生物组织的样品,能够有效地分散样品,能够以高效率获得附着于周围的组织量少、且酶毒性造成的伤害少、与生物内同样地增殖的细胞。特别地,如果使用本发明的组合物,能够从硬癌等硬度高的组织以高效率获得增殖度高的细胞。如果将使用本发明的组合物获得的细胞立体地增殖,或以形成凝集块的3维培养法培养,则由于细胞与生物内同样地增殖,能够进行抗癌剂等药剂的评价,基因、蛋白质、糖链等功能性高分子等的生物物质的分析等各种分析。进一步地,如果将使用本发明的组合物获得的细胞在滴块状凝胶中包埋培养,则可从更少量的细胞进行各种分析。
附图说明
【图1】图1是对比疑似间质组织的消化效率的照片。
【图2】图2是对比组合物对HCT-116细胞以及PC-14细胞的毒性的图。
【图3】图3是对比使用包含酶的组合物配制的细胞的增殖性的照片。
【图4】图4是对比通过包含酶的组合物处理后的细胞的增殖性的图。
【图5-1】图5是对比通过包含酶的组合物处理后的细胞对各种药剂的感受性的图。
【图5-2】图5是对比通过包含酶的组合物处理后的细胞对各种药剂的感受性的图。
【图6】图6是关于实施例1的组合物与比较例1的组合物的T/C(%)值的1比1图。
【图7】图7是对比将包含酶的组合物处理得到的细胞在滴块状凝胶中培养后进行中性红染色的结果的照片。
具体实施方式
本发明提供用于使生物组织分散的组合物。本发明的组合物的处方浓度下的胶原酶活性通过FALGPA分解活性测定的方法测定为0.30U/mL-10U/mL,优选地为0.30U/mL-5U/mL,更优选地为0.30U/mg-1U/mg。此处,对于FALPGA分解活性测定的方法,在后述试验例2中,将使用示为FALGPA分解活性测定的方法的方案测定的值(U/mL)作为胶原酶活性。FALGPA是N-(3-[2-呋喃基]丙烯酰基)-Leu-Gly-Pro-Ala。另外,本发明的组合物的处方浓度下的胰蛋白酶活性通过BAEE水解活性测定的方法测定为0U/mL-30U/mL,优选地为0U/mL-20U/mL,更优选地为0U/mL-10U/mL。对于BAEE水解活性测定的方法,在后述试验例2中,将使用示为BAEE水解活性测定的方法的方案测定的值(U/mL)作为胰蛋白酶活性。BAEE是Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐。处方浓度是使用本发明的组合物使生物组织分散时的本发明的组合物的浓度。
本发明的组合物可如下制备:将市售的胶原酶、分散酶、透明质酸酶等混合,通过FALGPA分解活性测定的方法、以及BAEE水解活性测定的方法,分别测定混合物的胶原酶活性以及胰蛋白酶活性,并将混合物中胶原酶活性以及胰蛋白酶活性调整至期望的范围。作为胶原酶,可使用来自梭菌属、来自放线菌等的任一。另外,胶原酶的纯化度可使用任一,但期望含有粗纯化的胶原酶。另外,本发明的组合物中也可包含透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、弹性蛋白酶、分散酶、嗜热菌蛋白酶等各种分解酶。更优选地,包含分散酶。分散酶能够分解在生物中作为细胞的支架的IV型胶原蛋白、纤连蛋白,因此能够更有效地获得细胞。另外,为了控制胰蛋白酶活性,本发明的组合物也可包含胰蛋白酶活性的抑制剂。胰蛋白酶活性的抑制剂可列举血清等。通过应用血清,可使本发明的组合物中的细胞毒性降低。
本发明的组合物可用于处理来自生物组织的样品,使该样品分散,获得细胞。作为生物,除了人,可列举小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、犬、猫、绵羊、猪、山羊、牛、猴等非人哺乳动物等。作为生物组织,例如可列举,癌组织、正常组织等。作为癌症,例如可列举,消化器官癌、头颈癌、乳癌、肺癌、癌性胸?腹膜炎、宫颈癌、子宫体癌、卵巣癌等。本发明的组合物尤其适于硬癌的消化以及分散。来自生物组织的样品例如可列举,手术材料的全部或一部分、活组织检查样品的全部或一部分等。手术材料例如可使用以治疗为目的的外科切除术时摘出的组织。另外,可使用以病理诊断、疾病的治疗以及病程预后的判定等为目的由低侵袭性采集法以试验切除?试验穿刺方式采集的组织。作为由低侵袭性采集法采集的组织,可列举各种活组织检查样品、胸腔镜下或腹腔镜下材料、由腹水以及胸水等获得的样品等。样品也可从生物采集后接受用剪刀、镊子以及剃刀等的细切处理等机械分离处理。另外,样品也可使用含有培养基成分、抗生素的洗涤液洗涤。另外,样品也可通过从癌症患者采集后的切碎处理成为糊状。
来自生物组织的样品的分散可如下进行,例如,将本发明的组合物与来自生物组织的样品混合,在25-40℃处理3分钟-72小时。更优选地,来自生物组织的样品的分散可通过处理5分钟-24小时而进行。混合时来自生物组织的样品的含量例如为0.1-5g/10mL。混合时的胶原酶活性通过FALGPA分解活性测定的方法测定为0.30U/mL-10U/mL,优选地为0.30U/mL-5U/mL,更优选地为0.30U/mL-1U/mL。FALGPA分解活性测定的方法如前述。混合时的胰蛋白酶活性通过BAEE水解活性测定的方法测定为0U/mL-30U/mL,优选地为0U/mL-20U/mL,更优选地为0U/mL-10U/mL。FALGPA分解活性测定的方法如前述。
分散后,可使用任意方法,从本发明的组合物与来自生物组织的样品的混合物获得细胞。为了使本发明的组合物中包含的酶造成的细胞毒性降低,并使获得的细胞的增殖性提高,优选地,用血清处理包含来自生物组织的样品的分散后的混合物。另外,为了降低酶的作用,也可使用EDTA等金属嵌合剂处理。进一步地,为了除去酶,也可通过离心分离去除酶液。获得细胞时,也可使用尼龙网、细胞滤过器等滤器进行过滤。另外,也可将分散了来自生物组织的样品的溶液接种在培养基上进行培养,选择性获得增殖的细胞。培养也可用载体进行。接种来自生物组织的样品的载体也可以层状包被细胞粘附因子。作为细胞粘附因子,可优选地列举各种类型的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、钙粘着蛋白、明胶、肽以及整联蛋白等细胞外基质,这些可以使用仅1种,也可联用2种以上,但从进一步提高细胞粘附性、细胞伸展性的观点,使用各种胶原蛋白是更优选的,在各种胶原蛋白中,特别优选使用I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白。载体表面包被的细胞粘附因子也可与滴块状凝胶的凝胶化剂相同。粘附于载体的细胞的获得可如下进行,例如,在除去含有血细胞、不需要细胞成分等的培养液后,添加细胞的剥离剂,剥离粘附于载体的细胞。细胞的剥离剂例如可列举,EDTA-胰蛋白酶等。在载体存在包被物的情况下,粘附于载体的细胞的剥离也可通过添加包被物的剥离剂而进行。载体的包被物是胶原蛋白的情况下,包被物的剥离剂是例如胶原酶。通过胶原酶的添加进行细胞剥离的情况下,对活细胞作用之前,对活细胞粘附的胶原蛋白?凝胶层本身进行酶分解,对活细胞的损伤少。
通过将使用本发明的组合物获得的细胞以2维培养、或立体增殖、或以形成凝集块的3维培养法培养,并评价培养结果,能够评价与生物内的条件同样的培养结果。通过评价将以本发明的组合物处理的细胞3维培养得到的培养结果,可更进一步获得与生物内的条件类似的培养结果。3维培养法有,例如,在胶原蛋白、基质胶(Matrigel)等细胞外基质中包埋的方法,以培养面为低粘附性的培养容器培养的方法,以培养面是U形底的培养容器培养的方法,以培养面构成微小图案的培养器培养的方法,在培养液滴中培养的方法等,但不限于这些。如果将使用本发明的组合物获得的细胞在滴块状凝胶中包埋培养,可从更少量的细胞进行各种分析。滴块状凝胶例如可列举在平面基材上显示凸表面形状的滴块状凝胶。滴块状凝胶的容积的一个例子是3-300μL、3-150μL、5-100μL、15-50μL等。滴块状凝胶的高度例如2mm以下。滴块状凝胶例如可列举,对400nm的光显示透射率1-95%的透明度的滴块状凝胶。从兼顾容易操作和维持作为滴块状凝胶的形状的观点来看,滴块状凝胶的粘度例如为50-2000厘泊、100-1000厘泊等。滴块状凝胶可包含凝胶化剂。凝胶化剂可列举酸可溶性I型胶原蛋白等胶原蛋白;基质胶等细胞外基质、软琼脂等。从兼顾维持作为滴块状凝胶的形状的观点来看,滴块状凝胶中胶原蛋白的含量例如为0.1-2.0重量%。进一步地,滴块状凝胶也可包含多糖类与其它细胞外基质等高分子材料、血清培养基等培养基成分等。滴块状凝胶例如也可通过缓冲液等,例如设定为pH6.2-7.6、pH6.8-7.4等。滴块状凝胶的盐强度或离子强度例如100-180mmol、140-160mmol等。
滴块状凝胶可包埋以本发明的组合物处理来自生物组织的样品得到的细胞而使用。包埋至滴块状凝胶的细胞的浓度例如是102-107细胞/mL,优选地103-106细胞/mL。包埋细胞的滴块状凝胶可如下制备,例如,将包含凝胶化剂的溶液与细胞等成分混合,将得到的混合液以冰冷却,用移液管滴至基材上,在30-45℃静置30分钟-2小时。基材具备可固定滴块状凝胶的表面。基材可列举,例如,平皿、多孔板等培养皿;烧瓶与其它一般的培养容器;将玻璃、塑料成形为薄片状的盖玻片或细胞盘(celldisk)等培养板等。从容易评价细胞培养结果的观点来看,基材优选地在光学上透明。滴块状凝胶中包埋的培养例如进行1-10日,优选地3-8日。
评价的培养结果例如可列举,培养前后的生存细胞数的变化、培养前后的细胞内的产物的变化等。细胞内的产物可列举DNA、RNA等核酸,蛋白质等。细胞培养时,也可对滴块状凝胶添加药剂。此时,通过比较培养前的细胞和培养后的细胞、比较添加药剂培养的细胞与不添加药剂培养的细胞,可评价药剂对细胞的影响。
作为药剂评价,例如可列举,评价药剂对细胞的作用的方法,其包含在使含有药剂的溶液接触包埋细胞的滴块状凝胶后,使包埋细胞的滴块状凝胶与培养基接触,在包埋细胞的滴块状凝胶中培养细胞,评价培养的结果。
药剂评价中的药剂可列举对疾病的治疗、预防或改善剂。疾病可列举癌症等。作为对癌症的治疗、预防或改善剂,除了直接作用于癌细胞的抗癌剂,可列举不直接攻击癌细胞、但通过与生物内的免疫细胞或其它药剂协同作用而发挥抑制癌细胞的增殖、缓和癌细胞的活动、杀死癌细胞是功能的药剂。作为抗癌剂,例如可列举:5-FU等代谢拮抗剂;SN-38等伊立替康(irinotecan)系抗癌剂;多西他塞(docetaxel)等微管解聚抑制药;顺铂、l-奥沙利铂(1-oxaliplatin)等铂制剂等。其它可列举与细胞增殖有关的增殖因子及其受体,以及选择性修饰与细胞增殖、细胞周期、凋亡及其信号传导有关的分子或酶等,要获得抗癌效果的分子靶标药。例如,有曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gifitinib)等作用于增殖因子受体的药物,伊马替尼(imatinib)、克唑替尼(crizotinib)等作用于融合基因的信号传导的药物,贝伐单抗(bevacizumab)等抑制癌组织的血管新生的药物等。作为其它药剂,可列举抗癌剂的前体药物、调整抗癌剂或其前体药物的代谢相关的细胞内代谢酶活性的药剂、免疫疗法剂等。
作为药剂评价中评价的作用,例如可列举,对该细胞的来源生物施用该药剂的情况下,与获得该生物的治疗、预防或改善的可能性有关的作用。作为治疗、预防或改善的效果,例如可列举,疾病细胞的增殖的降低、细胞的伤害、组织的缩小等。
药剂评价的方法中,对于滴块状凝胶与含有药剂的溶液的接触,例如,为了不使滴块状凝胶干燥成为平坦的干燥物,对位于基材上的滴块状凝胶,将含有药剂的溶液多层化,通过含有药剂的溶液覆盖整个滴块状凝胶而进行是优选的。接触的含有药剂的溶液除了药剂之外可含有血清培养基等培养基。溶液中药剂的浓度优选为,在对细胞的来源生物施用药剂时该细胞附近的药剂浓度。
与含有药剂的溶液接触后的细胞的培养使包埋细胞的滴块状凝胶与培养基接触来进行,接触的培养基优选地是液体培养基。作为接触的液体培养基,从抑制成纤维细胞的增殖的观点看来,或者从维持、表现成纤维细胞的功能的观点看来,优选无血清培养基。对于与液体培养基的接触,为了不使滴块状凝胶干燥成为平坦的干燥物,通过液体培养基覆盖整个滴块状凝胶而进行是优选的。进行培养的时间例如1-10日,优选地3-8日。与液体培养基接触的滴块状凝胶也可在与含有药剂的溶液接触后,通过洗涤将药剂洗涤除去。
药剂评价可包含使包埋细胞的滴块状凝胶与培养基接触,进行培养,对培养的结果进行评价。该培养的结果的评价,例如,通过比较培养前后生存细胞的数量、比较添加药剂进行培养时生存细胞的数量与不添加药剂进行培养时生存细胞的数量来进行。生存细胞的数量的计测可通过用显微镜目视观察而进行。另外,生存细胞的数量的计测也可通过进行对活细胞选择性染色的染色法、测定由染色造成的显色而进行。对活细胞选择性染色的染色法可列举,中性红染色法等利用细胞的吞噬作用的染色法、乳胶粒子染色法、荧光素二乙酸染色法等利用细胞内酶活性的染色法、使用其它荧光试剂的染色法等。染色后的细胞也可通过福尔马林固定等固定。由此,可暂时防止染色剂的溶出,进行灵敏度高的染色。染色后的滴块状凝胶也可使其干燥。由此,可防止变质、劣化。滴块状凝胶的干燥例如可通过风干、以10-50℃左右的加热强制干燥等进行。染色造成的显色的测定也可通过对染色后的滴块状凝胶摄影、将摄影的图像数值化进行评价而进行。数值化后的评价也可包含根据被染色细胞的图像的形状的数值修正。癌细胞有形成块状且深色图像的倾向,成纤维细胞有形成细纤维状且浅色图像的倾向,通过选择块状的染色图的数值进行修正,可更正确且简单地检测出生存的癌细胞。
对于该培养结果的评价的其它方法,例如通过比较培养前后、药剂接触有无下细胞的基因表达变化而进行。对于基因表达变化,对培养后细胞内的mRNA表达,可通过实时RT-PCR法、应用DNA芯片的方法等公知的方法分析而进行。作为当成对象的基因,可比较所有的基因,也可分别或组合比较与成为药剂的靶标的分子、其功能有关的基因,与药剂的代谢有关的基因,与细胞周期、细胞的生死有关的基因等。也可将基因的分析所需的药剂在培养中添加至滴块状凝胶。
另外,其它方法例如,通过比较培养前后、药剂接触有无下细胞表达的细胞表面抗原、受体蛋白质、药剂代谢酶等蛋白质而进行。蛋白质的检测可使用免疫染色法、ELISA法、酶活性测定法等公知的技术。另外,也可在将培养后的滴块状凝胶回收固定、包埋后,制备病理标本,并通过免疫组织染色法比较。也可将蛋白质分析所需的药剂添加至培养中的滴块状凝胶等培养基。
另外,其它方法例如,通过比较培养前后、药剂接触有无下细胞具有的突变基因而进行。突变基因的检测可使用PCR、DNA测序等公知的基因分析方法、原位杂交等公知的技术。也可将突变基因分析所需的药剂添加至培养中的滴块状凝胶。
使用本发明的组合物的细胞的获得方法以及细胞的培养结果的评价方法也可使用包含本发明的组合物的试剂盒进行。试剂盒除了本发明的组合物也可包含胶原蛋白溶液以及液体培养基。也可在试剂盒中包含的胶原蛋白溶液用于与从来自生物组织的样品获得的细胞混合,制备滴块状凝胶。作为胶原蛋白溶液中包含的胶原蛋白,例如可列举,酸可溶性的I型胶原蛋白或IV型胶原蛋白、或胃蛋白酶可溶性的I型胶原蛋白或III型胶原蛋白等。也可在试剂盒中包含的液体培养基为用于在滴块状凝胶中培养细胞的培养基。液体培养基也可为浓缩培养基。浓缩培养基例如可列举,McCoy’s5A、RPMI-1640、D-MEM、MEM、MCDB-131、Ham’sF-12、D-MEM/F-12、Medium-199等哺乳类细胞培养基本培养基。
进一步地,试剂盒可含有重构缓冲液。重构缓冲液中和酸可溶性胶原蛋白溶液并固化滴块状凝胶。重构缓冲液例如可列举,调整为pH7-10的氢氧化钠水溶液等。另外,试剂盒可包含接种培养来自生物组织的样品的载体。载体的例子可列举胶原蛋白?凝胶?烧瓶、培养载体用管等。培养载体用管可列举平底管容器等,其将管容器的一部分裁切为对容器中心轴有平缓角度的形状,将表面积为0.01-25.0cm2的其平坦裁切面作为载体,该载体的表面为使细胞粘附进行培养的部分。试剂盒除了用于在滴块状凝胶中培养细胞的液体培养基之外,也可含有用于载体上的培养的培养基。用于载体上的培养的培养基可列举,对来自生物组织的动物细胞具有增殖作用以及生理活性维持作用、同时对细菌具有杀死作用和/或增殖抑制作用的培养液。具体地,例如可列举,Ham’sF-12或D-MEM,或D-MEM/F-12混合液中以成为5-20%的方式添加胎牛血清(FBS)的培养基,或进一步添加各种生长增殖因子的培养基等。这些培养基也可包含抗生素。
另外,试剂盒可包含用于评价细胞的培养结果的细胞染色剂。细胞染色剂例如可列举,中性红等利用细胞的吞噬作用的染色剂。中性红在与利用对溶酶体的吞噬作用的细胞活性相关性高的观点来看是优选的。试剂盒除了上述构成物品以外,也可含有其它构成物品。
实施例
以下,通过实施例对本发明进行说明,但本发明不限于这些实施例。
试验例1 抗癌剂感受性试验:
以下的试验例中,在没有特别记载的情况下,抗癌剂感受性试验按照以下的顺序进行。
1.分析物洗涤:
从癌症患者的胃癌、大肠癌、胰腺癌等消化器官癌、乳癌、肺癌、头颈癌、癌性胸?腹膜炎、宫颈癌、子宫体癌或卵巣癌等固形癌组织摘出分析物。通过以下方法,去除分析物表面附着的杂菌。首先,准备3个10cm的皿(dish),各加入20mL添加抗生素的培养基溶液(分析物洗涤液)。将分析物在第1个皿的分析物洗涤液中,充分清洗分析物表面。将分析物移至第2个、以及第3个皿中,进行洗涤操作。应用的分析物洗涤液为,在DF培养液(DF:达尔贝科改良伊格尔(DME)培养液与Ham’sF12培养液1:1的混合培养液)中,将Pentcillin(富山化学公司,Pentcillin注射用)以相对于基础培养基的最终浓度为1mg/mL、卡那霉素(明治制果株式会社,硫酸卡那霉素注射液)以相对于基础培养基的最终浓度为0.5mg/mL、两性霉素B(和光纯药物公司)以最终浓度为2.5μg/mL添加而成。
2.组织的细切处理:
将进行洗涤的分析物移至新的皿,在皿上使用剪刀以及镊子,将作为分析物的肿瘤组织快速细切成3-5mm见方大小。
3.组织的切碎处理:
将进行细切处理的分析物在皿上使用夹在持针器上的剃刀刃进行切碎,直至细切的肿瘤组织成为糊状。向切碎的肿瘤组织加入20mL的DF培养液,将DF培养液与组织一起回收至50mL离心管。进一步地加入10mL的DF培养液,充分回收粘附于培养皿的组织。用桌上型离心机以400×g离心3分钟。
4.组织分散:
离心后,通过抽吸除去上清。向离心后的沉淀物添加9mL的DF培养液,摇晃离心管使组织片很好地分开。根据酶组合物也可添加10%FBS(FBS是胎牛血清)。添加1mL调整至处方浓度的10倍浓度的细胞分散用酶组合物,调整处方浓度的细胞分散溶液。在37℃恒温器内搅拌振荡1-2小时左右。
5.回收:
加入10mL的DF培养液成为20mL,以400×g离心3分钟,除去上清。除去上清后,轻轻摇晃离心管使细胞团块分开,在添加10mL培养基后,进行剧烈的移液,使细胞团块进一步地很好地分开。应用孔径尺寸为300μm的尼龙网,过滤含有细胞的悬浮液。添加10mL的DF培养液,将离心管与尼龙网充分地预洗。
6.预培养:
将回收处理得到的细胞离心回收,吸引除去上清。使离心后的细胞沉淀物在Primaster试剂盒(仓敷纺绩株式会社)的5mL预培养培养基(PCM-1)中悬浮。将悬浮细胞的PCM-1培养液接种至胶原蛋白?凝胶?烧瓶内。在CO2培养箱内静置,培养一夜。培养一夜后,吸引除去包含血细胞、不需要细胞成分等的培养液。观察到肿瘤细胞植入胶原蛋白?凝胶?烧瓶。
7.细胞回收:
吸引除去胶原蛋白?凝胶?烧瓶内的培养液,加入5mL的DF培养液洗涤后,加入2mL的DF培养液。进一步地,加入0.2mL调整为处方浓度的10倍浓度的细胞分散用酶组合物,调整处方浓度的酶溶液。以37℃振荡15-30分钟,溶解烧瓶内的胶原蛋白?凝胶。将从胶原蛋白?凝胶?烧瓶剥离的细胞回收至50mL离心管。另外,在确认细胞粘附至烧瓶的情况下,加入3mL的EDTA-胰蛋白酶振荡5分钟。确认细胞的剥离后,添加5mL的10%血清培养基仔细预洗烧瓶内部,回收至50mL离心管。加入10mL的DF培养液后,离心回收细胞。
8.包埋:
除去上清,向离心后的沉淀物加入2mL的EDTA-胰蛋白酶溶液处理3-7分钟后,加入10mL的10%血清培养基进行移液,以孔径尺寸100μm的尼龙网过滤细胞悬浮液。加入10mL的DF培养液,充分预洗离心管与尼龙网。将滤液离心后,吸引除去上清,回收细胞。在回收的细胞中混入胶原蛋白溶液。将混入细胞的胶原蛋白溶液用冰冷却,使用微量移液管,以30μL/滴,在板上每1孔滴下3滴。在37℃的CO2培养箱内静置1小时,使胶原蛋白?滴凝胶化。凝胶化后,将含有10%FBS的DF培养基以每3mL/孔重叠。无血清培养基(PCM-2)也可。将培养基重叠后,在CO2培养箱内培养一夜。
9.药剂接触:
一夜培养后,以成为预定浓度的方式将浓缩药剂液添加混合至培养基。在CO2培养箱内进行对应于药剂的规定时间的接触培养。
10.药剂除去以及培养:
药剂接触结束后吸引除去培养液,在各孔中以每4mL重叠Primaster试剂盒(仓敷纺绩株式会社)的无血清培养基(PCM-2),在之后5天进行无血清培养。
11.评价:
无血清培养后,在各孔中各添加40μL中性红(NR)溶液。在CO2培养箱温育2小时,进行细胞染色。中性红染色后,吸引除去含有染色液的培养液。除去培养液后,各添加4mL的10%中性福尔马林溶液,在室温进行约1小时的细胞固定。细胞固定后,除去中性福尔马林溶液。将培养板浸渍在自来水中,水洗20分钟。水洗后,仔细沥干板的水分,进行送风干燥。进行中性红固定的细胞的图像分析处理。图像分析处理应用日本特开平10-115612(癌细胞的定量测定方法)公开的图像分析处理方法。
试验例2
混合市售的胶原酶、分散酶、透明质酸酶、以及脱氧核糖核酸酶,制备胰蛋白酶活性以及胶原酶活性为下表1所示的实施例1以及比较例1的组合物。制备的组合物用于试验例1的4.组织分散。
【表1】
胶原酶活性(U/mL) | 胰蛋白酶活性(U/mL) | |
实施例1 | 0.367 | 9.8 |
比较例1 | 0.242 | 38.4 |
实施例1以及比较例1的组合物的胶原酶活性通过以下的FALGPA分解活性测定的方法测定。
1.FALGPA分解活性测定的方法:
以下的方法刊载在Sigma-Aldrich公司网站(http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-collagenase-using-n-3-2furylacryloyl-leu-gly-pro-ala.html)。
(1)缩写:
【表2】
FALGPA | N-(3-[2-呋喃基]丙烯酰基)-Leu-Gly-Pro-Ala |
FAL | N-(3[2-呋喃基]丙烯酰基)-Leu |
Leu | 亮氨酸 |
Gly | 甘氨酸 |
Pro | 脯氨酸 |
Ala | 丙氨酸 |
(2)原理:
测定在胶原酶的作用下FALGPA分解为FAL和Gly-Pro-Ala时,来自FALGPA的345nm吸光度(A345nm)的减少变量,算出活性。
(3)方法:
a.试剂:
(a)试剂B50mM两性离子缓冲液(tricine)、10mMCaCl2、400mMNaCl、pH7.5(25℃)缓冲液:
将两性离子缓冲液(Sigma-Aldrich、T0377)0.896g、NaCl(Sigma-Aldrich、S9888)2.34g、CaCl2?2H2O(Sigma-Aldrich、C3881)0.147g溶解于80mL蒸馏水,用1MNaOH溶液(Sigma-Aldrich、S2567)、或1MHCl溶液(Sigma-Aldrich、H3162)调整为pH7.5(25℃)后,加入蒸馏水至100mL。
(b)试剂C1.0mMN-(3-[2呋喃基]丙烯酰基)-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA):
将9.6mg的FALGPA(Sigma-Aldrich、F5135)添加至20mL的A的溶液,搅拌30分钟以上完全溶解。
(c)试剂D蒸馏水:
(d)试剂E酶溶液:
将酶以使用时的5-10倍浓度溶解于蒸馏水。
b.条件:
反应液pH=7.5、反应温度=25℃、吸光度=A345nm、光程长度=1cm
c.反应液的试剂组成以及操作:
【表3】
试剂 | 空白试验 | 正式试验 |
B | 2.9mL | 2.9mL |
C | 0.1mL | - |
D | - | 0.1mL |
将2.9mL的试剂B放入1cm光程长度的比色池,加温至25℃。如果A345nm稳定则添加0.1mL的试剂C(空白试验)或试剂D(正式试验),立即混合于25℃记录A345nm的降低5分钟。
(4)活性单位的定义和计算方法
在前述条件下,在pH7.5、25℃、钙离子的存在下,于1分钟水解1.0μmole的FALGPA的酶量作为1FALGPA单位。FALGPA单位由下式求出。
FALGPA单位/mL={(E1-E2)×3/(F×0.1)}/0.53
上式中的符号或数值如下显示。
【表4】
E1: | 正式试验的每1分钟的吸光度变化 |
E2: | 空白试验的每1分钟的吸光度变化 |
0.53: | FALGPA的分子吸光系数(⊿ε345/cm/mM) |
3: | 反应液的总量(mL) |
0.1: | 酶溶液的使用量(mL) |
F: | 酶溶液使用时对浓度的倍率 |
实施例1以及比较例1的组合物的胰蛋白酶活性通过以下的BAEE水解活性测定的方法测定。
2.BAEE水解活性测定的方法:
以下的方法刊载在Sigma-Aldrich公司的网站(http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-trypsin.html)。
(1)缩写:
BAEE=Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐
(2)原理:
测定胰蛋白酶的作用下BAEE水解为Nα-苯甲酰基-L-精氨酸和乙醇时的253nm吸光度(A253nm)的增加变量,算出活性。
(3)方法:
a.试剂:
(a)试剂A67mM磷酸钠缓冲液、pH7.5(25℃)缓冲液:
将0.804g磷酸二氢钠(Sigma-Aldrich、S0751)溶解于80mL蒸馏水,用1MNaOH溶液(Sigma-Aldrich、S2567)调整至pH7.6(25℃)后,加入蒸馏水至100mL。
(b)试剂B0.25mMNα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐:
将4.3mg的Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐(Sigma-Aldrich、B4500)添加并溶解于50mL的A的溶液。
(c)试剂C蒸馏水:
(d)试剂D酶溶液:
将酶以使用时的5-10倍浓度溶解于蒸馏水。
b.条件:
反应液pH=7.6、反应温度=25℃、吸光度=A253nm、光程长度=1cm
c.反应液的试剂组成以及操作:
【表5】
试剂 | 空白试验 | 正式试验 |
B | 3.0mL | 3.0mL |
C | 0.2mL | - |
D | - | 0.2mL |
将3.0mL试剂B放入1cm光程长度的比色池,加温至25℃。如果A253nm稳定则添加0.1mL的试剂C(空白试验)或试剂D(正式试验),立即混合于25℃记录A253nm的降低5分钟。
d.活性单位的定义和计算方法:
在前述条件下,在pH7.6、25℃、反应液量3.2mL、光程长度1cm下,将于1分钟使A253nm升高0.001的酶量作为1BAEE单位。BAEE单位由下式求出。
BAEE单位/mL=(E1-E2)/{0.001×(F×0.1)}
上式中的符号或数值如下显示。
【表6】
E1: | 正式试验的每1分钟的吸光度变化 |
E2: | 空白试验的每1分钟的吸光度变化 |
0.001: | 在pH7.6、25℃、反应液量3.2mL、光程长度1cm的条件下,每1分钟,增加酶1单位的A253nm的值 |
0.1: | 酶溶液的使用量(mL) |
F: | 酶溶液使用时对浓度的倍率 |
试验例3酶消化能力的比较:
使用用于评价消化能力的猪皮,对实施例1的组合物和比较例1的组合物,比较猪皮的消化效率。具体地,在切碎的猪皮中混合0.1mL的实施例1或比较例1的组合物与0.9mL的加入10%FBS的DF培养基,在37℃振荡,观察猪皮的大小。0小时和2小时后的状态示于图1。
如图1所示,实施例1的组合物中,得到比比较例1的组合物好的消化结果。
试验例4
应用实施例1的组合物或比较例1的组合物,进行胃癌10个分析物、以及大肠癌10个分析物的癌组织的消化反应,目视确认未分解残渣量进行比较评价。结果在下表7中示出。在下表7中,实施例1表示实施例1的未分解残渣量比比较例1的未分解残渣量少的分析物的数量,比较例1表示比较例1的未分解残渣量比实施例1的未分解残渣量少的分析物的数量。相同程度表示两者的未分解残渣量无大差别的分析物的数量。
【表7】
胃癌 | 大肠癌 | |
分析物数 | 10 | 10 |
实施例1 | 5 | 5 |
比较例1 | 0 | 0 |
相同程度 | 5 | 5 |
如表7所示,实施例1的组合物为,与比较例1的组合物比较,对胃癌组织以及大肠癌组织显示非常优良的消化性。如此,实施例1的组合物不论癌组织的种类,表示高消化性。
试验例5对株化细胞的细胞毒性的比较:
使用来自结肠癌的HCT-116细胞与来自肺癌的PC-14细胞,比较实施例1或比较例1的组合物造成的细胞毒性。具体地,在实施例1或比较例1的组合物中,混合约50万个/mL的HCT-116细胞或PC-14细胞的悬浮液(加入10%FBS的DF培养基),以37℃温育,每隔2小时确认细胞数。
结果在图2中示出。图2为以0小时的细胞数作为100%的细胞数%为纵轴而制成的图。如图2所示,对HCT-116细胞,在实施例1的组合物的情况或比较例1的组合物的情况下,均与没有酶一样,几乎没有细胞的增减。对于PC-14细胞,没有酶时细胞增加,在实施例1的组合物的情况下或比较例1的组合物的情况下,细胞都略微增加,没有确认到比初期细胞数少的情况。如此,实施例1的组合物以及比较例1的组合物的细胞毒性没有大差别,实施例1的组合物与比较例1的组合物的细胞毒性几乎相同程度地低。
试验例6
应用实施例1的组合物以及比较例1的组合物,通过试验例1的2-7记载的方法从癌组织回收癌细胞,通过试验例1的8以及10记载的方法将得到的癌细胞包埋培养于胶原蛋白?凝胶?滴7天。培养第2日以及培养7日后的细胞的中性红(NR)染色图在图3示出。
如图3所示,在应用比较例1的组合物的情况下,7日培养得到的增殖率是3.5倍,在应用实施例1的组合物的情况下,增殖率是4.5倍。如此,在应用实施例1的组合物的情况下,与应用比较例1的组合物的情况相比,得到适于在胶原蛋白?滴中培养的细胞。
试验例7细胞回收量:
将大肠癌、胃癌、肺癌组织通过试验例1的2、3记载的方法制成糊状后分成2组,分别使用实施例1的组合物或比较例1的组合物,通过试验例1的4、5记载的方法回收癌细胞,用试验例1的6记载的方法预培养一夜后,用试验例1的7记载的方法回收细胞,用台盼蓝染色法测定活细胞数。测定的细胞数在下表8-1至表8-3中示出。表8-1至表8-3中,组织的重量表示为了回收细胞使用的癌组织每1组的重量。回收细胞数比较表示同一分析物的实施例1的细胞数除以比较例1的细胞数的值。与回收的糊状组织片中的细胞数不同,通过测定刚刚预培养后的细胞数,可更正确地测定未受损伤的细胞数。
【表8-1】
【表8-2】
【表8-3】
如果将回收细胞数的相对差异不足25%作为相同程度、25%以上作为一方比另一方多,则如表8所示,在使用实施例1的组合物的情况下,与使用比较例1的组合物的情况相比可从癌组织回收相同程度或较多数的细胞。
试验例8
使用实施例1的组合物或比较例1的组合物,通过试验例1的1-5记载的方法,从10个被分析物的胃癌组织、10个被分析物的大肠癌组织、6个被分析物的肺癌组织、2个被分析物的乳癌组织以及2个被分析物的胰腺癌组织回收癌细胞。应用胶原蛋白?凝胶?烧瓶(仓敷纺绩株式会社),通过试验例1的6记载的方法,预培养回收的癌细胞。预培养后,通过试验例1的7记载的方法,从胶原蛋白?凝胶?烧瓶回收细胞。测定回收的细胞数量,进行实施例1的情况与比较例1的情况的比较。结果在下表9中示出。表9中,实施例1表示在实施例1的情况的回收细胞数比比较例1多25%以上的被分析物数。比较例1表示在比较例1的情况的回收细胞数比实施例1多25%以上的被分析物数。相同程度表示实施例1与比较例1的回收细胞数的相对差异不足25%的被分析物数。
【表9】
如表9所示,在应用实施例1的组合物的情况下,对全部4种癌细胞,可确保与在比较例1的组合物的情况下同等以上的细胞数。另外,在应用实施例1的组合物回收的情况下,与应用比较例1的组合物的情况相比,从胶原蛋白?凝胶?烧瓶回收细胞时粘附于烧瓶的残存细胞少,可有效地进行回收操作。
在回收来自乳癌组织的癌细胞的情况下,与应用实施例1的组合物的情况相比,在应用比较例1的组合物的情况下,酶反应后的未分解残渣量少。但是,从胶原蛋白?凝胶?烧瓶的细胞回收量在实施例1的组合物的情况下较多。根据这一点认为,即使实施例1的组合物没有完全消化乳癌组织,也可使癌细胞从乳癌组织露出,可从乳癌组织有效回收癌细胞。
在如此使用实施例1的组合物的情况下,与比较例1的组合物的情况相比,可以不论癌种类地有效回收癌细胞。
试验例9
作为培养细胞株,应用来自结肠癌的HCT-116和来自肺癌的PC-14这2种,验证实施例1的组合物以及比较例1的组合物对于培养细胞株的增殖性的影响。具体地,在含有比较例1或实施例1的组合物的酶液中温育细胞株2小时后,通过试验例1的8以及10的步骤,实施胶原蛋白?滴包埋培养,验证24、48、120小时后的细胞增殖性。
结果在图4示出。如图4所示,在酶未处理的情况、比较例1的情况、实施例1的情况,没有确认细胞增殖性的不同。如此,通过应用实施例1的组合物,可获得在滴块状凝胶中显示适合的增殖性的细胞。
试验例10应用培养细胞的抗癌剂感受性试验:
设想组织消化,使来自结肠癌的HCT-116和来自肺癌的PC-14细胞与实施例1或比较例1的酶组合物接触2小时后,用试验例1的方法进行抗癌剂感受性试验(CD-DST法),求出图像分析值,比较各种药剂感受性。
结果在图5中示出。图5中的T/C率(%)是,将各药剂浓度下120小时后的图像分析值除以无药剂的图像分析值的值。未处理表示使用不进行酶液处理的细胞的情况下的实验结果。如图5所示,HCT-116以及PC-14中的任一细胞,在使用实施例1的组合物的情况下,对5-FU、顺铂(CDDP)以及SN-38的药剂感受性与比较例1的组合物的情况为相同程度。另外,对于多西他塞以及奥沙利铂,同样地,在调查药剂感受性时,在实施例1的组合物的情况、比较例1的组合物的情况、以及未处理的情况,药剂感受性为相同程度。如此,通过应用实施例1的组合物,可获得对5-FU、CDDP、SN-38、多西他塞以及奥沙利铂等各种抗癌剂表示同等的药剂感受性的细胞。
试验例11
对大肠癌细胞,通过与试验例10同样的方法求得使用实施例1或比较例1的情况的T/C(%)值进行1比1作图。结果在图6中示出。
如图6所示,从图数据获得斜率为1确认到高相关性的回归线。根据这一点,可认为实施例1的组合物和比较例1的组合物在大肠癌有同等的药剂感受性评价。
试验例12抗癌剂感受性试验(CD-DST法)的成功率:
使用实施例1的组合物或比较例1的组合物,通过试验例1的方法,实施抗癌剂感受性试验(CD-DST法)。CD-DST法的实施分别对多数的被分析物进行。
结果,一部分被分析物的情况无法完成CD-DST法。无法完成的原因是,没有确认集落状的癌细胞增殖,没有通过图像分析得到有效的数值数据。将没有这样的问题、能够进行感受性试验的分析的被分析物数作为成功数。将成功数相对于作为实施的被分析物数的实施数的比例作为成功率(%)。将成功率等数值结果在下表10中示出。
【表10】
如表10所示,在使用实施例1的组合物的情况下,对任一癌症种类都得到高的CD-DST法的成功率。根据这一点可知,实施例1的组合物在用于回收适于感受性试验的形式的癌细胞中是有益的。
试验例13胃癌病例的胶原蛋白?凝胶?滴培养细胞染色图的比较:
试验例12中,在胃癌的情况下,对于培养的结果确认到癌细胞的增殖的3个被分析物,将增殖后的细胞的中性红染色图在图7中示出。
如图7所示,对于分析物1,实施例1这一方为深染色的癌细胞的增殖良好。另一方面,比较例1通过图像分析得不到有效的数值数据,没有进行CD-DST法。在实施例1的情况,认为能够回收更多细胞也是主要因素之一。
对于分析物2、3,虽然接种相同程度的细胞数,但对于在培养144小时后的深染色癌细胞的增殖性,实施例1这一方是良好的。在分析物2的比较例1的情况下,通过图像分析得不到有效的数值数据,没有进行CD-DST法,但在分析物2的实施例1得到有效的数值数据,完成CD-DST法。
如上述,应用实施例1的组合物的情况下,从胃癌、大肠癌、乳癌等各种癌组织获得以适于抗癌剂感受性试验的形式增殖的合适细胞。
Claims (9)
1.用于使生物组织分散的组合物,所述组合物的处方溶液中的胶原酶活性通过FALGPA分解活性测定的方法测定为0.30U/mL-10U/mL,所述组合物的处方溶液中的胰蛋白酶活性通过BAEE水解活性测定的方法测定为0U/mL-30U/mL。
2.权利要求1的组合物,其用于药剂评价。
3.权利要求1或2的组合物,其中生物组织是癌组织。
4.来自生物组织的细胞的获得方法,其包含将来自生物组织的样品以权利要求1-3中任一项的组合物处理。
5.细胞的培养结果的评价方法,其中培养的细胞是以权利要求1-3中任一项的组合物处理的细胞。
6.权利要求5的方法,其中细胞的培养结果是2维的培养结果。
7.权利要求5的方法,其中细胞的培养结果是3维的培养结果。
8.权利要求7的方法,其中3维的培养在滴块状凝胶内进行。
9.用于实施权利要求4-8中任一项的方法的试剂盒,其包含权利要求1-3中任一项的组合物。
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