JP2016501021A - 癌の進行および処置に対する応答の早期予測 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年12月2日に出願した米国仮特許出願第61/732,375号に基づく優先権の利益を主張し、それは一部引用により本明細書中に包含される。
本発明は、ヒト腫瘍細胞を注入することによりゼブラフィッシュにおいて腫瘍を確立する方法に関する。また、腫瘍細胞を特徴付けるため、薬物を試験するため、および個別化医療のために、ゼブラフィッシュにおける確立されたヒト腫瘍の使用にも関する。さらに、一般的に、マルチウェルマイクロインジェクションシステム、より具体的には、ゼブラフィッシュ胚についてのマルチウェルマイクロインジェクションシステムにも関する。
細胞内シグナル伝達の適切な制御は、正常な細胞複製、増殖、細胞生理および細胞死を含む種々の生物学的機能に関与している。細胞内の正常なシグナル伝達の混乱は、身体に種々の疾患状態を引き起こし得て、該疾患状態は、複数の細胞型および身体全体の生理学的状態の関与の結果であることが多い。具体的には、癌の場合、この状況は、とりわけ、ヒト身体の多くの基礎的な炎症状態の関与があるために複雑である。肥満、アレルギー、関節炎、および糖尿病のような種々の炎症状態は、全て、如何に癌が進行し、如何に処置され得るかに大きな影響を及ぼす。従って、癌のような複雑な状態を模倣するインビボモデルの作製は、能動免疫系を有する動物モデルを必要とする。能動免疫系がなければ、癌において観察された動的細胞不均一性は、完全に再現することができない。さらに、癌の動物モデルのような臨床的有用性のために、とりわけ各個々の癌の生物学的予測、臓器侵襲および身体の他の部分への癌細胞転移の予測のために、極短期間に(化学療法を開始する前に)個々の患者の癌を模倣し、癌細胞の治療に対する応答を予測する方法が必要である。
米国特許出願第10/923,253号(またはUS2005/0112030A1)は、Stephanie E. Gausにより2004年8月20日に出願され、“メッシュウェルプレート”と題して、溶液の迅速な排出を可能とし、かつウェル間の溶液の“吸い上げ”を阻止するために開口部を有するメッシュ構造の取り外して交換される底部を有する96ウェルプレートのようなマルチウェルプレートを開示している。“メッシュウェルプレート”は、ゼブラフィッシュ胚をアッセイするのに特に有用であることが意図されると記載されている。
本発明の目的
本発明の目的は、動物モデルにおける初代腫瘍細胞およびCTCのプロファイリングおよび特徴付けの技術的問題を克服すること、およびゼブラフィッシュ胚の効率的な操作および注入を可能にするシステムを提供することである。
本発明の一面において、生検または外科的に切除された腫瘍から得られた初代腫瘍細胞から三次元の腫瘍を発生させるために、
(a)腫瘍細胞を単離し、
(b)腫瘍細胞を細胞追跡用色素で標識し、
(c)受精後24から48時間(hpf)のゼブラフィッシュ胚に該細胞をインジェクションし、
(d)該胚を24時間またはそれ以上インキュベートする
各工程を含んでなる方法が提供される。
(a)腫瘍細胞をゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入し、
(b)注入された腫瘍細胞を有する胚をインキュベートし、
(c)インキュベーション後、腫瘍細胞の位置を観察し、
(d)(i)腫瘍細胞が、卵黄嚢を経て胚体部分に浸潤するか、または(ii)該細胞が卵黄嚢内に留まり、非浸潤性初代腫瘍細胞に近い挙動をするかを解析すること、
を含む方法を提供する。
(a)初代腫瘍細胞を胚の卵黄に注入し、
(b)注入された腫瘍細胞を有する胚をインキュベートし、
(c)インキュベーション後、腫瘍細胞の位置を観察し、
(d)該腫瘍細胞が胚体部分に進入するとき、原発腫瘍の浸潤および転移の可能性が高いとすること
を含む。
(a)固形腫瘍から腫瘍細胞を単離し、
(b)該細胞を細胞追跡用色素で標識し、
(c)受精後24−48時間(hpf)のゼブラフィッシュ胚の卵黄に該細胞をマイクロインジェクションし、
(d)該胚を摂氏35℃で24時間またはそれ以上インキュベートし、
(e)蛍光顕微鏡下で腫瘍細胞の蛍光画像を自動取得し、
(f)画像解析ソフトウェアを用いて腫瘍巣(tumor foci)の自動化分析を行い(ここで、得られるデータは、腫瘍巣の幅(W)および長さ(L)、各病巣のシグナルの強度、および画像内のスポットの位置である。)、
(g)取得した画像上の腫瘍巣の面積が病巣のサイズおよび体積を提供し、体積は1/2WL2(式中、Wは幅であり、Lは長さである。)により計算され得て、
(h)原発腫瘍の浸潤の可能性を測定するために腫瘍巣の位置を用いること{ここで、侵襲性の指標(invasive index)は、侵襲指標(II)=1/n Σ(T時間での胚における腫瘍巣の数/胚に注入された腫瘍細胞の総数)(式中、nは、実験で考慮される胚の数であり、Tは、インキュベーション時間である)として測定され得る。}、
(i)腫瘍の侵襲性を測定するために腫瘍巣の位置を用い得ること{ここで、移動指数は、移動指数(MI)=1/n Σ(T時間でのCD/T時間での腫瘍巣の総数)(式中、CDは腫瘍細胞が伝播する累積距離であり、nは実験で考慮される胚の数であり、Tはインキュベーション時間である)として計算され得る。}
を含む工程により定量化され得る。
(a)固形腫瘍から腫瘍細胞を単離し、
(b)例えばPKH−26(Sigma)またはDiD(Lifetech)等の赤色蛍光を有する細胞追跡用色素を用いて細胞を標識し、
(c)受精後24−48時間(hpf)のTg(Fli:EGFP)ゼブラフィッシュ胚の卵黄に該細胞をマイクロインジェクションし、
(d)該胚を摂氏35℃で24時間またはそれ以上インキュベートし、
(e)緑色および赤色蛍光の両方のフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で腫瘍細胞の蛍光画像を自動取得し、
(f)画像解析ソフトウェアを用いて腫瘍巣の自動化分析を行い(得られたデータは、画像中の病巣の位置を示す。)
(g)画像解析を用いて、自動化された方法で腫瘍のホーミング指数を予測すること{ホーミング指数(HI)=1/n Σ(T時間での臓器中の病巣の総数/T時間での腫瘍巣の総数)(式中、nは実験で考慮される胚の数であり、Tはインキュベーション時間である。)として計算され得る}
を含む。
(a)免疫細胞において発現された蛍光タンパク質を有する遺伝的に改変された胚を用いて、特定の免疫細胞の局在および数の変化をモニターすること。例えば、gata2−GFPを発現するゼブラフィッシュ胚は、ゼブラフィッシュの身体のあらゆる部分に存在する好酸球の局在をモニターし、ならびにその数を測定するために用いることができる。
(b)胚全体の免疫組織化学的染色を用いて免疫細胞の局在および計数をモニターすること
を含む、方法を提供する。
(a)ゼブラフィッシュ胚をプロテアーゼ溶液中で消化し、
(b)細胞をピペッティングにより穏やかに分散させて、ゼブラフィッシュ胚を解離させて単一細胞懸濁液とし、
(c)細胞を固定し、蛍光顕微鏡下で計数し、
(d)生存蛍光腫瘍細胞の総数と細胞の注入数の比を処理ゼブラフィッシュ胚と未処理ゼブラフィッシュ胚とで比較して、合成または天然の化合物および生物学的物質の効果を未処理胚と比較して予測すること
を含む方法が提供される。
(a)腫瘍細胞を含む全胚またはゼブラフィッシュ組織の一部を酵素消化し、
(b)消化された胚または組織からDNAを単離し、
(c)ヒトの遺伝子配列に対して設計されたPCRプライマーを用いて目的の遺伝子をPCR増幅し、
(d)配列決定して、変異を位置決定し、
(e)バイサルファイトシーケンシングを行い、後成的修飾の位置を示すこと
を含む方法が提供される。
(a)腫瘍細胞を含む全胚またはゼブラフィッシュ組織の一部を酵素消化し、
(b)消化された胚または組織からRNAを単離し、
(c)ヒトの遺伝子配列に対して設計された特定のプライマーを用いて遺伝子発現の定量的リアルタイムPCR分析を行うこと、
を含む方法が提供される。
(a)4%パラホルムアルデヒドのような化学固定液を用いて全胚を固定し、ヒトタンパク質に特異的な抗体を用いる免疫組織化学を用いてタンパク質発現を可視化すること、
(b)腫瘍細胞を注入した後、ゼブラフィッシュ胚の組織切片スライド上の免疫組織化学を用いてタンパク質発現を可視化すること、
(c)タンパク質発現をELISA(酵素免疫測定アッセイ)またはウェスタンブロットを用いて可視化すること、
のうち1つを含む方法が提供される。
本発明の一面において、マルチウェルマイクロインジェクションシステムの変形は、以下のものを含む。
複数の胚ホールディングウェルのそれぞれが、溝板の外周縁にてウェルモジュールの底部へ円錐形底部で相互に接続されているもの;
マイクロインジェクションの自動化が、ロボットアームにより制御されるマイクロピペットホルダーを用いて行われるもの;
マイクロインジェクションの自動化が、ロボットアームによって制御されるマイクロピペットユニットを用いて行われるもの;
マイクロピペットインジェクションシステムが、可変角度および/または高さで胚を注入するために、回転可能に位置決めするように構成され、配置されるもの;
ロボットアームの位置および/または角度が、手動で、または市販のソフトウェアコントロールインターフェースにより調節可能であるか、または特にゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションのために設計されている特定の自動注入システムの開発によって調節可能であるもの;
ロボットアームが、胚構造のヒトによる視覚認識、または細胞の蛍光標識手段、または液体の注入の成功を検出可能にプログラムされているソフトウェア手段(該ソフトウェアは、市販のソフトウェアコントロールインターフェースであるか、または特にゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションのために設計されている特定の自動注入システムの開発によるもの)による胚構造の視覚認識によって制御されるもの;
注入部位および注入プロトコルの選択のための自動化がソフトウェアのアップデートにより変更されるもの;および
自動化マイクロインジェクションシステムが、市販のマイクロインジェクターインジェクションシステムにより制御されるか、または特にゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションのために設計されている特定の自動注入システムの開発によって制御されるもの。
当該装置は、適当な位置にホールディングフレームおよび溝板を有し、取り外し可能なインサートなしで用いられ得て、それにより、溝板の溝に胚を保持するのが可能であり、可変角度でのマイクロインジェクションのためにマイクロピペットによりアクセス可能である。この構成において、溝板によって形成される各円錐ウェルを覆うゴムで裏打ちされた開口部を有する取り外し可能なインジェクションカバープレートは、溝板上に位置され得て、受精後48時間のゼブラフィッシュ胚の注入をガイドするために使用され得る。
概要
癌細胞の分子および遺伝子プロファイリングは、標的療法および腫瘍学研究において新たな傾向となっている。しかしながら、癌細胞の分子多様性およびそれらの絶え間なく変化する性質の関連付け、原発腫瘍の分子特性ならびにそれらの浸潤または転移腫瘍細胞の関連付けには限界がある。転移性癌に対する現在の化学療法の限定された有効性、および癌細胞のゲノムプロファイリングの限定された適用で定義されるシナリオにおいて、本発明者等は、侵襲および転移について臨床的に関連する生理的情報を取得するために、腫瘍組織(例えば、外科的に切除される原発腫瘍、生検、CTCなど)から代表的かつ生物学的に適切な生存3D腫瘍を作成する可能性を探究した。
本明細書で用いる以下の用語は、特に他に記載されない限り、それら本来の意味を有する。
実施例1:ゼブラフィッシュへの乳癌細胞株 MDA−MB−231の注入
ゼブラフィッシュの卵を収集し、摂氏36℃にて48時間、E3培地(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mM MgSO4、0.1%メチレンブルー)中でインキュベートした。該胚をトリカインで麻酔し、ピンセット(Dumont #5 forceps)を用いて卵殻を剥がした。
CTCは、脳に転移を有するステージ4の肺癌患者および1名の対照となる健康な個体からの20mlの血液(抗凝固剤としてEDTA−Ca)から収集された。CTCは、製造業者の指示書に従い、抗体で被覆した磁気ビーズ(Dynabeads, Lifetech)を用いて順次正(抗EpCam BerP4 抗体、AbCaM)および負(抗CD45、AbCam)の選択により収集された。各工程で2回のキャプチャー−ウォッシュ−リリース(Two−capture−wash−release)を行った。収量は、転移患者から約110細胞であったが、健康なドナーからは細胞が検出されなかった。得られたCTCをDiO(Vibrant, Lifetech, 終濃度200mM)を用いて、37℃にて20分間染色した。総数100個の染色されたCTC細胞を、1つのトリカインで麻酔した受精後48時間(hpf)のゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入した。画像をインジェクションの24時間後に得た。
脳への転移を示した末期の肺癌患者からの腫瘍組織を切片にし、業者指示書に従いリベラーゼDL(Roche)中でインキュベートした。肺細胞を70μmのセルストレーナーに通し、2mlのRPMI1640に再懸濁させて計数した。細胞生存性をトリパンブルー排除法により確認した。細胞を、業者指示書に従って蛍光追跡PKH−67(Sigma)色素で標識し、25mMのグルコースを含むPBS中に再懸濁した。NanojectIIマイクロマニピュレータ装置を用いて、100個の細胞を卵黄嚢にインジェクトした。1グループの胚は、対照としてPBS+グルコースのみをインジェクトした。次いで、該胚を抗生物質/抗真菌剤を含むTE水溶液中でインキュベートし、インキュベーター中、摂氏35℃で一晩培養した。腫瘍移植後24時間のインキュベーション後、卵黄嚢中の腫瘍細胞の存在を確実にするために、胚を蛍光顕微鏡下で撮像した。薬物/処置剤を種々の濃度で添加し、胚を含むプレートをさらに3日間、35℃でインキュベートした。胚をトリカインで麻酔し、蛍光顕微鏡下で再度画像を取得した。この実験で用いた薬物は、パクリタキセルのみ、またはパクリタキセルとカルボプラチンの組み合わせであった。薬物応答を、生存について9遺伝子(増殖および細胞周期)および死について9遺伝子(アポトーシス)の、18遺伝子(BCL2、BCL−X、BCL−B、BFL−1、BCL−W、MCL1、CDC2、CYCLIN−D、CYCLIN−A1、BAX、BAK、BOK、BID、BIM、BAD、BMF、NOXA、PUMA)の発現を通して測定した。
図2から5の説明
図2から5に示す通り、本発明の一面のマルチウェルプレートアセンブリ10は、複数の胚ハンドリングウェル24を支持するベースプレート28を含むホールディングフレーム12を含む。この態様において、アセンブリ10は、96ウェルプレート形式で作られ、他の基準を用いることもできるが、国際標準に準拠している。従って、このセットアップは、全ての標準的なマイクロタイタープレートリーダーで使用可能であり、全ての好適な液体ハンドラーで操作することができる。マルチウェルプレートアセンブリ10は、好ましくはマルチウェルプレートアセンブリ10のウェルの位置をマークするラベルを備えている、安全性、単離、およびウェルからの液体の乾燥を防ぐ、蓋16を含む。
図6Aは、受精後48時間(hpf)のゼブラフィッシュ胚の水平方向の横断面であり、図6Bは、受精後48時間(hpf)のゼブラフィッシュ胚の垂直横断面図である。
図7に示す通り、マイクロピペットユニット40は、好ましくはガラス製であり、交換可能なマイクロピペット42を有していてよい。受精後48時間のゼブラフィッシュ胚48は、円錐形セクション32の下側の狭い端内にその背側50を、そして円錐形セクション32の上側の広い端にその卵黄52を配して、胚ハンドリングウェル24の円錐形の底部セクション32に配置される。そのように提供されるユニットは、カバープレート36により保護されている。マイクロピペットユニット40は、カバープレート38の開口部を通して卵黄52へ血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンと共に腫瘍細胞をインジェクトするために配置される。
図9は、卵黄52への、血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンと共に腫瘍をインジェクションするためのガイドとしてのカバープレート36の使用を示す図7の単純な複製である。
胚は、受精後48時間で卵殻を剥がし、ガラスピペットを用いてウェルに移動させる。要すれば、胚は、腫瘍細胞の取り込み可能性および効率を増大するために、血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンで処理され得る。培地をカバープレート36を通して一部除去し、トリカインを添加して、胚を麻酔する。トリカイン溶液は、工程の時間短縮のために各ウェル24に添加され得る。胚は麻酔され、溝板20の胚ハンドリングウェル24の下部の円錐形の底部32に落ちる。胚ハンドリングウェル24の底部に円錐形32があり、卵黄52が胚体部50の他の部分よりも軽いため、幼生は、卵黄52を上向きにして落ちる。必要に応じて、インジェクションカバープレート36は、血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンと共に腫瘍細胞を誘導するように位置し得る。ガラスマイクロピペット40を取り付けたロボットアーム54を用いて、血管新生促進因子、好ましくは増殖因子アンジオポエチンと共に腫瘍細胞を胚の卵黄52へ注入する。卵黄嚢は、それ自体迅速に密封される。
Claims (34)
- 生検または外科的に切除された腫瘍から得られた初代腫瘍細胞より腫瘍を確立する方法であって、
(a)初代腫瘍細胞を単離し、
(b)該腫瘍細胞を細胞追跡用色素で標識し、
(c)受精後24から48時間のゼブラフィッシュ胚に該細胞を注入し、
(d)該胚を24時間またはそれ以上インキュベートすること
を含む、方法。 - 腫瘍細胞が、血中循環腫瘍細胞から得られる、請求項1に記載の方法。
- 細胞追跡用色素が蛍光色素である、請求項1に記載の方法。
- 原発腫瘍の浸潤または転移の可能性を予測する方法であって、
(a)腫瘍細胞をゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入し、
(b)腫瘍細胞を注入された胚をインキュベートし、
(c)インキュベーション後、腫瘍細胞の位置を観察し、
(d)(i)腫瘍細胞が、卵黄嚢を経て胚体部分に浸潤するかどうか、または(ii)該細胞が卵黄嚢内に留まり、非浸潤性初代腫瘍細胞に近い挙動をするかどうかを解析すること
を含む、方法。 - 疾患の再発可能性がより高い癌患者を同定する方法であって、
(a)初代腫瘍細胞を胚の卵黄に注入し、
(b)腫瘍細胞を注入された胚をインキュベートし、
(c)インキュベーション後、腫瘍細胞の位置を観察し、
(d)該腫瘍細胞が胚体部分に浸潤するとき、原発腫瘍の浸潤および転移の可能性が高いこと示すこと
を含む、方法。 - 癌細胞侵襲を定量化する方法であって、
(a)固形腫瘍から腫瘍細胞を単離し、
(b)腫瘍細胞を細胞追跡用色素で標識し、
(c)受精後24−48時間のゼブラフィッシュ胚の卵黄に該細胞をマイクロインジェクションし、
(d)該胚を摂氏35℃で24時間またはそれ以上インキュベートし、
(e)蛍光顕微鏡下で腫瘍細胞の蛍光画像を自動取得し、
(f)腫瘍巣の幅(W)および長さ(L)、各病巣のシグナル強度、および画像内のスポットの位置を取得するために画像解析ソフトウェアを用いて腫瘍巣の自動化分析を行い、
(g)病巣の体積を1/2WL2(式中、Wは幅であり、Lは長さである。)により計算し、
(h)原発腫瘍の浸潤の可能性を測定するために腫瘍巣の位置を用いること{ここで、侵襲性の指標(invasive index)は、侵襲指標(II)=1/n Σ(T時間での胚における腫瘍巣の数/胚に注入された腫瘍細胞の総数)(式中、nは、実験で考慮される胚の数であり、Tは、インキュベーション時間である)として測定され得て、より高いII値は、原発腫瘍の浸潤の可能性がより高いとする。}、
(i)侵襲性を測定するために腫瘍巣の位置を用いること{ここで、移動指数は、移動指数(MI)=1/n Σ(T時間でのCD/T時間での腫瘍巣の総数)(式中、CDは腫瘍細胞が伝播する累積距離であり、nは実験で考慮される胚の数であり、Tはインキュベーション時間である)として計算され、より高いMI値は、腫瘍細胞の侵襲性がより高いとする。}
を含む、方法。 - 腫瘍細胞による化合物に対する応答が、腫瘍巣の体積、侵襲指標または移動指数のいずれか1つが、該化合物が存在するときに存在しない場合と比較して異なるかどうかを決定することにより測定される、請求項6に記載の方法。
- 腫瘍細胞のホーミングに好適な臓器を予測する方法であって、
(a)固形腫瘍から腫瘍細胞を単離し、
(b)例えばPKH−26またはDiD等であって、これに限定されない赤色蛍光を有する細胞追跡用色素を用いて細胞を標識し、
(c)受精後24から48時間のTg(Fli:EGFP)ゼブラフィッシュ胚の卵黄に該細胞をマイクロインジェクションし、
(d)該胚を摂氏35℃で24時間またはそれ以上インキュベートし、
(e)緑色および赤色蛍光の両方のフィルターを用いて蛍光顕微鏡下で腫瘍細胞の蛍光画像を自動取得し、
(f)画像解析ソフトウェアを用いて腫瘍巣の自動化分析を行い、画像中の病巣の位置を得て、
(g)画像解析を用いて腫瘍のホーミング指数を計算すること{ホーミング指数(HI)=1/n Σ(T時間での臓器中の病巣の総数/T時間での腫瘍巣の総数)(式中、nは実験で考慮される胚の数であり、Tはインキュベーション時間である。)}
を含む、方法。 - 腫瘍の侵襲、転移または臓器へのホーミング過程の間のゼブラフィッシュの免疫系における変化をモニターする方法であって、
(a)例えばgata2−GFPを発現するゼブラフィッシュ胚であるが、これに限定されない免疫細胞において発現された蛍光タンパク質を有する遺伝的に改変された胚を用いて、例えば好酸球であるが、これに限定されない、ゼブラフィッシュの身体のあらゆる部分に存在する特定の免疫細胞の局在および数の変化をモニターし、
(b)胚全体の免疫組織化学的染色を用いて免疫細胞の局在および計数をモニターすること
を含む、方法。 - 合成または天然の化合物または生物学的物質の有無下でインキュベーション後に腫瘍細胞の生存数を測定する方法であって、
a.ゼブラフィッシュ胚をプロテアーゼ溶液中で消化し、
b.細胞をピペッティングにより穏やかに分散させて、ゼブラフィッシュ胚を解離させて単一細胞懸濁液とし、
c.細胞を固定し、蛍光顕微鏡下で計数し、
d.生存蛍光腫瘍細胞の総数と注入細胞数の比を処理ゼブラフィッシュ胚と未処理ゼブラフィッシュ胚とで比較して、合成または天然の化合物および生物学的物質の効果を未処理胚と対比して予測すること
を含む、方法。 - 腫瘍細胞の侵襲性パターンを薬物の存在下または不存在下で測定し、比較すること、および細胞の侵襲性が薬物の存在下で異なるかどうかを比較することを含む、腫瘍細胞の侵襲性に対する薬物の効果を予測するための方法。
- 薬物の存在下と対比して、その不存在下で注入された腫瘍細胞の臓器へのホーミングパターンの変化を観察することを含む、癌細胞の臓器ホーミング嗜好に対する薬物の効果を予測するための方法。
- 腫瘍細胞のDNAにおける変化を評価する方法であって、
a.腫瘍細胞を含む胚全体またはゼブラフィッシュ組織の一部を酵素消化し、
b.消化された胚または組織からDNAを単離し、
c.ヒトの遺伝子配列に対して設計されたPCRプライマーを用いて目的の遺伝子をPCR増幅し、
d.配列決定して、遺伝子変異を同定し、
e.バイサルファイトシーケンシングを行い、後成的修飾の位置を示すこと
を含む、方法。 - 癌細胞における遺伝子発現を分析する方法であって、
a.腫瘍細胞を含む全胚またはゼブラフィッシュ組織の一部を酵素消化し、
b.消化された胚または組織からRNAを単離し、
c.ヒトの遺伝子配列に対して設計された特定のプライマーを用いて遺伝子発現の定量的リアルタイムPCR分析を行うこと、
を含む、方法。 - 癌細胞におけるタンパク質発現を分析する方法であって、
a.4%パラホルムアルデヒドのような化学固定液を用いて全胚を固定し、ヒトタンパク質に特異的な抗体を用いる免疫組織化学を用いてタンパク質発現を可視化し、
b.腫瘍細胞を注入した後、組織切片スライド上でゼブラフィッシュ胚の免疫組織化学を用いてタンパク質発現を可視化すること、
c.タンパク質発現をELISA(酵素免疫測定アッセイ)を用いて可視化すること、および
d.タンパク質発現をウェスタンブロットを用いて可視化すること
のうち1つを含む、方法。 - (A)ホールディングフレーム、複数の取り外し可能なマルチウェルモジュール(ここで、各マルチウェルモジュールは溝板および取り外し可能なインサートから構成され、各溝板は、直線状に配置された円錐形開口底部を有する複数の胚ホールディングウェルを有し、溝板の外周縁のウェルモジュールが、このウェルを通して液体ハンドリングを可能にする円筒形状を有し、取り外し可能なインサートは、垂直な側面および溝板の各溝と位置を合わせた上部の円形開口部を有し、それ故に、溝板の上に配置されたとき、胚ホールディングウェルおよび胚ハンドリングウェルを形成する)、ならびにホールディングフレーム、溝板および取り外し可能なインサートを覆う蓋
および
(B)胚を可変角度および/または高さで注入可能にするためのマルチウェルプレート上に回転可能に位置するマイクロインジェクションマイクロピペット
を含む、受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクションを自動化するマルチウェルマイクロインジェクションシステム。 - 複数の胚ホールディングウェルのそれぞれが、その円錐形開口底部で溝板の外周縁にてウェルモジュールの開口底部へ接続されている、請求項16に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステム。
- マイクロインジェクションの自動化が、ロボットアームにより制御されるマイクロピペットホルダーを用いて行われる、請求項16または17に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステム。
- マイクロインジェクションの自動化が、ロボットアームによって制御されるマイクロピペットユニットを用いて行われることを含む、請求項16から18のいずれか一項に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステム。
- マイクロピペットインジェクションシステムが、胚を可変角度および/または高さで注入するために、回転可能に位置決めされるように構成され、配列されている、請求項16または17に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステム。
- ロボットアームの位置および/または角度が、手動で、またはソフトウェアコントロールインターフェースにより調節可能であることを含む、請求項16から20のいずれか一項に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステム。
- ソフトウェアによりコントロールされるインターフェースが、市販されているマイクロインジェクターインジェクションシステムであるか、または特にゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクション用に設計されている特定の自動注入システムの開発によるものである、請求項21に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステム。
- ロボットアームが、胚構造のヒトによる視覚認識、または細胞の蛍光標識手段もしくは液体の注入の成功を検出可能にするようにプログラムされているソフトウェア手段(該ソフトウェアは、市販のマイクロインジェクターインジェクションシステムであるか、または特にゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションのために設計されている特定の自動注入システムの開発によるもの)による胚構造の視覚認識によって制御されている、請求項21に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステム。
- 注入部位および注入プロトコルの選択のための自動化がソフトウェアのアップデートにより変更されることを含む、請求項21から23のいずれか一項に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステム
- 受精後24から72時間後のゼブラフィッシュ胚の自動化されたマイクロインジェクションのための方法であって、
a.請求項16から24のいずれか一項に記載のマルチウェルマイクロインジェクションシステムのマルチウェルモジュールに複数の受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚を配置し、
b.ゼブラフィッシュ胚の卵黄に選択された分子をマイクロインジェクションすること
を含む、方法。 - 選択された分子が腫瘍細胞を含む、請求項25に記載の受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚の自動化されたマイクロインジェクションのための方法。
- 腫瘍細胞のマイクロインジェクション前、マイクロインジェクション中またはマイクロインジェクション後のいずれかに、ゼブラフィッシュ胚を含む水中に血管新生促進因子を添加することを含む、受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚の自動化マイクロインジェクションのための方法。
- 血管新生促進因子が増殖因子アンジオポエチンである、請求項27に記載の受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚の自動化マイクロインジェクションのための方法。
- 受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚の卵黄に腫瘍細胞をマイクロインジェクションし、腫瘍細胞のマイクロインジェクション前、マイクロインジェクション中またはマイクロインジェクション後のいずれかに、ゼブラフィッシュ胚を含む水中に血管新生促進因子を添加することを含む、腫瘍細胞がゼブラフィッシュの胚に効率的に取り込まれるようにするための方法。
- 血管新生促進因子が増殖因子アンジオポエチンである、請求項29に記載の腫瘍細胞がゼブラフィッシュの胚に効率的に取り込まれるようにするための方法。
- 腫瘍細胞に対する効果について薬物を試験するための方法であって、
a.受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚に腫瘍細胞をマイクロインジェクションし、
b.腫瘍を、所定の時間、ゼブラフィッシュ胚内で増殖させ、
c.薬物を含む水系中で胚をインキュベートするか、またはその腫瘍細胞に対する効果について試験される薬物を受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションし、そして
d.受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚における腫瘍細胞の量を測定することにより腫瘍細胞に対する薬物の効果をモニターすること
を含む、方法。 - 腫瘍細胞のマイクロインジェクション前、マイクロインジェクション中またはマイクロインジェクション後のいずれかに、ゼブラフィッシュ胚を含む水中に血管新生促進因子を添加することを含む、受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚において請求項31に記載の腫瘍細胞に対する効果について薬物を試験するための方法。
- 血管新生促進因子が増殖因子アンジオポエチンである、請求項32に記載の腫瘍細胞に対する効果について薬物を試験するための方法。
- 血管新生促進因子が受精後24から72時間のゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションされる、請求項27、29または32に記載の腫瘍細胞に対する効果について薬物を試験するための方法。
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