JP2002531104A - 異種細胞を魚に導入するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
権を主張する。共有に係る同時係属中のUSSN60/100,959(199
8年9月18日出願)およびUSSN60/075,785(1998年2月2
2日出願)ならびにWO99/03852は、関連する主題に関する。上記出願
の各々は、全ての目的にためにその全体が参考として援用される。
reinerら、1998)。細胞が若齢マウスまたは成体マウスに注射され、
それに続いて、そのマウスに化合物を注射し、そして生存度および腫瘍サイズに
ついて試験される(Yangら、1997;Katsanisら、1998)。
細胞拒絶を防止するために、ヒト細胞の移植は、Nudeマウス系統またはSC
DIマウス系統のいずれか由来の、免疫抑制されたマウスを使用して実施されな
ければならない(Yangら、1997;Greinerら、1998;Kat
sanisら、1998)。しかし、これらのマウスは、免疫応答を示さないの
で、これらは、正常マウスよりも強くなく、そしてその化合物の毒性効果により
感受性である。さらに、これらの動物は、発生および維持するために高い費用が
かかる。さらに、マウスは、子宮で(en utero)発生するので、マウス
胚をアッセイすることが不可能であり、発生プロセスに対する化合物の効果の評
価を非常に複雑にする。中空繊維モデル(ここで、腫瘍細胞で満たされた小さい
管が、マウスの種々の部位に移植される)もまた、薬物スクリーニングに使用さ
れる。移植片に対する薬物の腫瘍細胞殺傷効果をモニターすることによって、研
究者は、薬物が異なる経路で投与される場合に、実際にどの薬物が、その腫瘍部
位に対してその効果を生じるかを試験し得る(例えば、静脈内 対 経口)。
試験するように駆り立て、そして、このInstituteは、現在、全ての主
要なヒト悪性腫瘍のサンプルを含む、60のヒト腫瘍細胞株のパネルに依存する
。試験されるべき薬物は、腫瘍細胞型に基づいて、このパネルのサブセットに供
給され、そしてそれらの細胞殺傷活性がモニターされる。
患者の腫瘍細胞は、ペトリ皿または培養フラスコ中で増殖され、そして種々の抗
癌処置に対するこれらの細胞応答が、モニターされる。しかし、これらのアッセ
イもまた、問題を有する。時折、これらのアッセイは行えない。なぜなら、それ
らの細胞が、培養物中で簡単に分裂しないからである。さらに、結果は、抗癌薬
物が、体内でどのように機能するか予測しない。
組織型に基づいて細胞を再分類することを始めた−例えば、それらの細胞が保有
する遺伝的欠損の型に従う、乳癌 対 結腸癌。特定の欠損を相殺する薬物が最
も効果的に処方されることを可能にするために、研究者はまた、特定の欠損を矯
正する薬物が同定され得るか否かを決定するために、各患者の腫瘍における遺伝
子欠損を分析するための技術を開発している。なぜなら、次いで、これらは、各
々の個々の腫瘍細胞構成に適合され得るからである。
遺伝子変異に関連するヒト癌の増加した知見を利用している。彼らは、遺伝的に
マウスを改変し、その結果、これらのマウスは、オンコジーンを促進する癌の異
常な活性化またはヒトにおいて癌を導く腫瘍サプレッサー遺伝子の損失のいずれ
かの、同じ種の変化を保有する。このマウスが、ヒト腫瘍と同じように挙動する
腫瘍を発生することであることが希望である。ある変異体マウス系統は、例えば
、機能的APC遺伝子(欠失または不活性化される場合に結腸癌を誘導する腫瘍
サプレッサー)を欠失する。現在まで、これらの結果は混乱している。
上の異種細胞を魚に導入する工程、およびその細胞または魚の特性を分析する工
程を包含する。これらの方法は、魚の胚(特に、ゼブラフィッシュ胚)への異種
細胞の導入に適切である。導入された細胞は、少なくともそのアッセイ工程が実
施されるまで、生存可能に存続する。いくつかの細胞型は、レシピエントの魚に
おける増殖を生じる。いくつかの方法において、この魚は、薬剤と接触され、そ
してその分析工程が、その特性がその薬剤の投与に応答性であるか否かを決定す
る。分析され得る異種細胞または魚の特性としては、分化マーカー、r、魚の生
存、異種細胞の増殖、異種細胞の最初の導入部位に対する移動、異種細胞または
魚の細胞の死、あるいは該異種細胞の増殖が挙げられる。いくつかの方法におい
て、この異種細胞は、癌細胞である。いくつかの方法において、この異種細胞は
、幹細胞である。いくつかの方法において、この異種細胞は、分化した細胞であ
る。いくつかの方法において、この異種細胞は、ヒト細胞である。いくつかの方
法において、この異種細胞は、細菌細胞または真菌細胞である。いくつかの方法
において、この細胞は、ウイルス感染された細胞である。いくつかの方法はさら
に、レシピエントの魚から異種細胞を回収する工程をさらに包含する。
を提供する。いくつかの方法は、1以上の癌細胞を魚の集団に導入する工程、薬
剤をこの魚の集団に投与する工程、およびこの魚の集団におけるこれらの癌細胞
の発生に対するこの薬剤の効果をモニターする工程を包含する。いくつかの方法
において、このモニターする工程は、この魚におけるこれらの癌細胞の発生に対
するこの薬剤の効果についてのEC50を決定する工程を包含する。いくつかの
方法において、このモニターする工程は、この魚の集団に対するこの薬剤のLD
50を決定する工程をさらに包含する。必要に応じて、この方法は、複数の薬剤
について繰り返され、そして低いEC50|LD50比を有する薬剤が、キャリ
アを用いて薬学的組成物として処方される。
上の異種細胞を魚に導入する工程、これらの細胞が増殖する条件下でこの魚を培
養する工程、およびこの増殖された細胞を回収する工程を包含する。いくつかの
方法において、この細胞は、増殖の過程において分化し、そしてこれらの細胞は
、分化した組織として回収される。いくつかの方法において、回収された細胞は
、患者に移植され、この患者は、必要に応じて、この異種細胞が得られた患者と
同じ患者である。
する。このような方法は、細胞の集団を含む患者からサンプルを得る工程;この
細胞の集団を魚に導入する工程;およびこの細胞の集団の特性を検出して、この
集団が癌細胞または病原体を含むか否かを示す工程を、包含する。
が、分裂を続け得るかまたは分化し得る。幹細胞は、全能性、多能性または単能
性であり得る。全能性幹細胞(例えば、胚性幹細胞)は、成体生物体の全ての細
胞型を生じ得る。多能性幹細胞は、1つより多くの分化細胞型を生じ得る。単能
性細胞は、単一の分化細胞型を生じ得る。幹細胞は、小さいサイズ、低顆粒性、
核に対する細胞質の低い比率、ならびにオステオポンチン、コラーゲンおよびア
ルカリホスファターゼを発現しないことにより、一般的に特徴付けられる。幹細
胞は、表皮系、腸系、上皮系および造血系について公知である。骨、軟骨、脂肪
および3つの型の筋肉(平滑筋、骨格筋および心筋)の細胞についての幹細胞が
、一般的な間葉幹細胞前駆体と考えられる(Owenら、Ciba Fdn.S
ymp.136、42〜46、(1988);Owenら、J.Cell Sc
i.87、731〜738(1987))。
上の表現型特性を意味する。分化マーカーは、細胞系統の種々の段階で一過的に
提示され得る。系統への拘束なしに再生し得る多能性細胞は、細胞系統への拘束
がなされる場合に、失われ得る、マーカーのセットを発現する。前駆細胞は、そ
の細胞が成熟に向かって細胞系統経路を通って進行する時に発現され続け得るか
、または発現されない続けないかもしれない、分化マーカーのセットを発現する
。成熟細胞により排他的に発現される分化マーカーは、通常、細胞産物、細胞産
物を産生するための酵素およびレセプターを産生するための酵素のような機能的
な特性である。
じ細胞または細胞のクローン集団においてともに同定される場合の、心臓ミオシ
ンアイソザイム発現、およびクレアチンキナーゼアイソザイム発現の心臓特異的
パターンが、心筋細胞についてのマーカーである。心筋細胞(cardiocy
tes)はまた、光学顕微鏡分析による、その分岐した外見、およびギャップジ
ャンクションを形成する能力により認識され得る。このような細胞は、コンフル
エントな細胞を横切る電位を形成することおよびそれらの細胞を横切るシグナル
の伝達を検出することにより、認識され得る。筋肉のα−アクチンmRNA、お
よび平滑筋細胞アクチンは、筋細胞の分化マーカーである。細胞またはクローン
集団において同定される場合の、ミオシンアイソザイム発現、およびクレアチン
キナーゼアイソザイム発現の筋特異的パターンは、骨格筋細胞についてのマーカ
ーである。骨芽細胞は、骨基質物質を分泌し、細胞または細胞のクローン集団に
おいて共に同定される、ALP、オステオカルシン発現、PTH誘導型cAMP
発現および骨鉱化作用(bone mineralization)能力は、骨
芽細胞についての分化のマーカーである。軟骨細胞は、軟骨を分泌する。細胞ま
たは細胞のクローン集団において同定されるアグリカン(aggrecan)お
よびコラーゲンIIB型は、軟骨細胞についてのマーカーである。ケラチノサイ
トはケラチンを分泌し、そして市販されている染料を用いて認識され得る。脂肪
細胞は、脂質を産生し、そしてOil Red O染色により認識され得る。
には、この異なる個体は、魚以外の種由来であり、例えば、哺乳動物由来である
。
を提供する。この魚は、異種細胞が、多くの生理学的プロセス(増殖、分化、発
現、分泌、および転移を含む)を受け得る、インビボインキュベーターを提供す
る。この方法は、細胞プロセスに対する効果ついての潜在的薬物のスクリーニン
グ、細胞治療または組織工学における後の使用のための細胞の増殖、ならびに増
殖細胞および/または転移細胞の存在についての患者の生検の診断を含む、多く
の適用を有する。この方法は、他の種(特に、ヒト)由来の細胞が、異なる種間
の体温の相違に関わらず魚において増殖し得るという見識を、幾分、前提とする
。例えば、ヒトの体温は、約36℃であり、一方、ゼブラフィッシュは、27℃
で通常発生し、そして32℃以上の温度では、生育され得ない。本出願は、異種
細胞が、それにもかかわらず、魚において生存および/または増殖し得る証拠を
提供する。
にはいくつかの利点がある。第1に、初期の魚の胚は、まだ免疫系を発生してい
なく、そして先天性免疫系の任意の効果から隔離されており、その結果、異種細
胞は、免疫拒絶に供されない。第2に、魚の胚の小さなサイズのために、比較的
少数の移植細胞(例えば、胚あたり1,10、または1000細胞)を分析およ
び/または回収することが可能である。第3に、いくつかの型の魚の胚は、比較
的透明であり、これは、細胞を用いる多くの生理学的プロセスの直接の顕微鏡観
察を容易にする。第4に、魚の胚は、異種細胞と潜在的薬物との接触を容易にす
る溶液中で、培養され得る。
)はまた、魚に移植された場合も増殖する。それらのネイティブな環境において
増殖可能でない細胞(例えば、CCL37リンパ細胞)は、通常、魚において増
殖しないが、いくつかの事例において、適切な増殖因子または他の因子を用いた
処置により、増殖するよう誘導され得る。誘導された細胞は、代表的には、以下
に記載される種々の分析を行うのに十分な期間(例えば、少なくとも1時間、お
よび代表的には少なくとも1日、ならびに時には3日、1週間以上まで)、生存
可能に存続する。増殖を受ける細胞は、レシピエントの魚の構成要素として、好
ましくは、少なくとも1回、5回または10回の倍加を受ける。一般的に、未分
化細胞は、魚への導入において分化を受けるが、一方、最終分化細胞は、その状
態のままである。異種細胞は、レシピエントの魚とは異なる種から得られ得、そ
して代表的には、哺乳動物(例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、マウス、ラット
、ウサギ、モルモット、霊長類、および特にヒト;細菌、植物および鳥類)から
得られる。
魚の例としては、真骨魚類(特に、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアントレ
リオまたはフグ)が挙げられる。異なる型の魚を培養するための手順は、類似で
あり、そして例えば、Medaka(killifish):Biology
and Strains(Keigaku Pub.Co.、Tokyo、Ya
mamoto T.編、1975)により記載される。細胞は、代表的に、魚の
胚の形態に導入される。細胞の導入のための胚発生の好ましいステージは、12
8細胞ステージ、256細胞ステージ、1k細胞ステージ、高いステージ(th
e high stage)(卵黄細胞上の高所に位置する(perches)
胚盤(blastodisc)によって特徴づけられる)、長楕円ステージ(t
he oblong cell)(卵黄細胞を圧縮する胚盤を有し、肺胞の動物
−植物軸(the animal−vegetal axis)が短縮する)、
および球ステージ(sphere stage)(動物−植物軸に沿った継続的
な短縮化が、なめらかでほとんど球形の後期胞胚を生成する)である。代表的に
は、少なくとも、1、10、100、1000、10,000、100,000
、1,000,000の細胞が、レシピエントの魚に導入される。
好ましいレシピエントである。ゼブラフィッシュにおけるパターン形成および発
生の分子的基礎は、ヒトと同一かまたは類似しているかのいずれかである(Ch
enおよびFishman、1996;GrantoおよびNusselien
−Volhard、1996、Wylie編、1996)。さらに、胸腺は約7
2時間で形成することから、この時間までに免疫系はまだ発生しておらず、初期
ゼブラフィッシュ胚は、異種移植片(heterograft)(または異種移
植片(xenograft))に対し良好な耐性を示す。この耐性は、同種移植
片がゼブラフィッシュにおいて極度に良好に許容され、そして多年の間、移植実
験において使用されている事実により示される。さらに、胚は透明であることか
ら、内部形態学的変化(器官発生、腫瘍の転移および成長を含む)ならびに薬物
の効果が、容易に試験され得る。単回交配が、100〜200の外部で受精され
た卵を産生するので、多数の胚が、細胞に注入され得る。化学物質が魚が泳ぐ溶
液に直接添加され得、インタクトな胚に浸透し、薬物の曝露およびその後の試験
を比較的簡単にする。このゼブラフィッシュはまた、他の動物モデルを越える利
点を提供する。なぜなら、ゼブラフィッシュ胚は、他の動物胚が発生するよりも
、より迅速に発生するからである。一般に、ゼブラフィッシュの体制プラン(b
ody plan)、器官、組織および他の系は、他の脊椎動物モデル(例えば
、マウス)における類似の構成要素が発生するよりもずっとより迅速に発生する
。ゼブラフィッシュの脊椎動物体制プラン全体は、代表的には、24時間内に確
立される。十分に機能する心血管系は、発生から最初の24時間内に明らかにな
る(StainierおよびFishman、1994)。ゼブラフィッシュの
残りの器官(腸、肝臓、腎臓および血管系を含む)は、48時間内に確立される
。孵化したゼブラフィッシュの胚は、120時間内に形態発生をほぼ完了する。
これにより、その胚を、操作および観察に非常に利用しやすくし、そして高処理
能力の自動化された観察および検出手順に受け入れられる(amendable
)ようにする。
存し得、従って完全な循環システムがなくても早期発生の間は十分耐えられる(
Weinsteinら、1995)。単一のゼブラフィッシュ胚は、発生の最初
の6日間、100マイクロリットル程度の液量で、維持され得;続いて、胚は、
個々のマイクロタイターウェルまたはマルチウェルプレートの培養物中で維持さ
れ得る。試験化合物は、魚が浸けられている溶液に直接添加され得る。ゼブラフ
ィッシュ胚に添加されたこの試験化合物は、インタクトな胚に直接浸透し、この
ことは、このマルチウェル形式を、高処理能力および自動化された化合物スクリ
ーニングにとって特に魅力的にする。
細胞移植は、マイクロインジェクション(ゼブラフィッシュで十分に確立された
技術)により実行される(HoおよびKane、1990;Harnmersc
hmidtら、1996)。単回交配は100〜300の胚を産生し得るので、
多数の異種移植宿主胚の生成が、比較的簡単である。さらに、近交系が利用可能
であり、そして数千の魚が、水槽の小部屋で安価に生育され得る。ゼブラフィッ
シュアッセイの潜在的な重大な利点はコストである。現在、平均的なマウスアッ
セイは、政府によりなされる場合、約1630ドルかかり、そして商業的になさ
れる場合、2900ドルかかる。この高いコストは、マウスの育種および維持の
高いコストならびに非常に手動的な注射および引き続く分析について自動化の欠
如に起因する。対照的に、ゼブラフィッシュは、維持が比較的安く、そして胚が
、個々のマイクロウェルに配置され得ることから、標準的な液体操作装置を用い
た自動化分析が可能である。脊椎動物モデル系の鍵となる特徴の比較は、以下で
ある。
は転移を阻害する能力について薬剤をスクリーニングする手段を提供する。この
方法は、癌細胞を1つ以上の魚に移植し、そしてスクリーニングされるべき薬剤
を投与することにより機能する。代表的に、この癌細胞はまた、比較の目的のた
めに、薬剤を受けていない1以上のコントロールの魚に移植されるが、歴史的コ
ントロールもまた使用され得る。次いで、この癌細胞の運命は、同時性コントロ
ール動物または歴史的コントロール動物と比較して、この魚においてモニターさ
れる。このコントロール動物において、癌細胞は存続され、増殖および/または
転移する。処置された動物において、薬剤の所望の活性は、癌細胞の増殖の阻害
、および/または転移の阻害、ならびに/または細胞の完全な排除により表され
る。
尺度としてモニターされる。ゼブラフィッシュのような魚の透明な性質は、魚の
組織および器官の発生に対する薬剤の任意の摂動の可視化を容易にする。さらに
、魚の胚内でのmRNAおよびタンパク質の組成および分布が、インサイチュハ
イブリダイゼーションによりモニターされ得る。処置された魚に対する薬剤の効
果は、その薬剤の副作用の尺度として、同時性コントロールまたは歴史的コント
ロールと比較され得る。理想の薬剤は、魚細胞に対する副作用に対して高い比率
の癌細胞に対する活性を示す。
れる他の型のアッセイにおける薬剤は、ペプチドまたは低分子、ホルモン、成長
因子、およびサイトカインのコンビナトリアルライブラリー由来であり得るか、
または天然に存在する分子であり得るか、もしくは製薬工業によって合成された
化学化合物の現存のレパートリーに由来し得る。コンビナトリアルライブラリー
は、1段階ごとの様式で合成され得る多数の型の化合物について作製され得る。
このような化合物としては、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖類、リン脂質
、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物
、ベンゾジアゼピン、オリゴマーのN置換型グリシンおよびオリゴカルバメート
が挙げられる。化合物の大きいコンビナトリアルライブラリーは、Affyma
x、WO 95/12608、Affymax、WO 93/06121、Co
lumbia University、WO 94/08051、Pharma
copeia、WO 95/35503およびScripps、WO 95/3
0642(このそれぞれは、すべての目的のために参考として援用されている)
に記載のコードされた合成的ライブラリー(encorded synthet
ic libraries)(ESL)法により構築され得る。ペプチドライブ
ラリーはまた、ファージディスプレイ方法により作製され得る。例えば、Dev
lin、WO 91/18980を参照のこと。スクリーニングされる化合物は
また、National Cancer Institute’s Natur
al Product Repository、Bethesda、MDから得
られ得る。既知の抗腫瘍性活性を有する既存の化合物または薬物もまた、副作用
プロフィールに対する決定された活性に対してスクリーニングされ得る。
む。いくつかの異なる癌細胞型(血液細胞に発症する白血病、骨格筋または結合
組織において発症する肉腫、および上皮細胞において発症する癌腫を含む)があ
り、癌の最も一般的な型としては、乳癌、結腸癌、肺癌が挙げられる。癌細胞と
してはまた、リンパ腫、芽腫、神経膠腫、奇形腫および神経線維腫が挙げられる
。癌細胞はまた、無限に増殖し、かつマウスのような実験動物において腫瘍を生
じる細胞株を含む。癌細胞はまた、実験動物において腫瘍を生じないが、癌細胞
を正常細胞と区別する少なくとも1つの分化マーカーを保有する前癌細胞を含む
。前駆体癌細胞は、しばしば無限に増殖する能力によりさらに特徴付けられる。
に投与される。この魚は、代表的に野生型であるが、魚の変異体系統もまた、治
療薬剤と特異的な遺伝的欠陥との間の相互作用の分析のために使用され得る。魚
は、代表的に、初期段階の胚であるが、幼生ゼブラフィッシュまたは成体ゼブラ
フィッシュもまた使用され得る。細胞は、魚の胚の卵黄または魚の胚の体内のい
ずれかまたは両方に注入され得る。細胞は、単一または複数の部位で注入され得
る。魚の胚は、代表的に、薬剤の投与前の期間に培養され、癌細胞が新しい環境
に適応し、増殖および/または転移することを可能にする。癌細胞の移植に生存
しない任意の魚は、薬剤の投与の前に除去され得る。
され得る。通常、薬剤は、癌細胞の導入、およびその後のこの癌細胞がゼブラフ
ィッシュにおいて増殖および/または転移を開始するのに十分な期間の後に投与
される。この間隔は、代表的に、細胞導入後12時間〜36時間であり、好まし
くは、細胞導入後約24時間である。薬剤の投与後、魚はさらなる期間培養され
、代表的には、少なくとも約24時間、および時には1ヶ月、3ヶ月または6ヶ
月、あるいは死ぬまで培養される。代表的なモニタリングレジメンは、8日間ま
たは魚が死ぬまで24時間ごとにモニターする。その後、この魚は、さらに1ヶ
月間、24時間ごとにモニターされる。
このアプローチは、魚の胚に麻酔薬および他の化学物質を導入するために長く使
用されていた(Westerfield、1993)。あるいは、薬剤は、癌細
胞と同じ部位または他の場所で魚に微量注入され得る。
動物もしくは履歴制御動物に対して、注射された癌細胞を除去するかもしくはそ
の数を減少させるか、それらの増殖を阻害もしくは除去する、および/またはそ
れらの転移を阻害もしくは予防する、その能力である。移植された癌細胞および
それらの子孫の運命は、レシピエント魚に見出されない癌細胞抗原に特異的な抗
体を用いて免疫染色することによってモニターされ得る。いくつかの型の癌細胞
が、癌細胞の不透明な性質によって、目視により、魚細胞と区別され得る。癌細
胞はまた、移植前または移植後に標識され得る。適切な標識としては、蛍光標識
が挙げられる。あるいは、細胞は、癌細胞によって特異的に取り込まれる色素を
用いて標識され得る。モニタリングは、薬剤の投与後に間隔を開けて行われる。
例えば、24時間の間隔が適切である。染色パターンは、胚における細胞のおよ
その数およびその位置を示す。細胞数は、増殖の指標である。細胞における位置
の変化(例えば、経時的な細胞クラスターの分配)は、細胞転移の指標である。
薬剤の活性は、EC50として表され得る。EC50は、処置した魚の50%に
おいて所望の終点活性を達成するために必要とされる薬剤の用量を意味する。所
望の終点の例としては、癌細胞の除去、癌細胞の増殖速度を阻害するに有意な能
力、および癌細胞の転移を阻害するに有意な能力が挙げられる。
ニングされ得る。魚への移植後、癌細胞は、周囲の魚内皮細胞における新たな血
管増殖を促進する、増殖因子(例えば、VEGF)を分泌する。ゼブラフィッシ
ュは、新脈管形成を分析するために特に適切である。なぜなら、それらの透明な
性質は、血管を顕微鏡下で直接可視化することが可能であるからである。ゼブラ
フィッシュにおける新脈管形成をモニターするための手順は、WO99/038
52に詳細に記載される。手短には、宿主胚は、以下の通りに染色される:胚を
、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、そして内因性アルカリホスファターゼ
活性について染色する。固定後、胚を100%メタノールで一晩、−20℃にて
処理する。胚を再水和し、そしてNTMT緩衝液(0.1M Tris−HCl
;50mM MgCl2;0.1M NaCl;0.1% Tween 20)
中で室温にて平衡化し、次いで75mg/ml NBTおよび50mg/ml
X−ホスフェートで染色する。必要に応じて、腫瘍細胞および魚細胞の発現プロ
フィールは、潜在的な抗新脈管形成剤での処置の前および後に決定され得る。示
差的に発現された遺伝子のプロフィールが同定される。このようなプロフィール
は、新たな血管が容易には観察できない他の動物またはヒト被験体に対する薬物
のアッセイに用いられ得る。
ェル形式を用い、このマイクロプレートの1以上のウェルにおいて魚全体(代表
的には、胚の段階)を用いて並行して行われ得る。この形式は、複数の魚に対し
て同じ薬剤をスクリーニングするために、または複数の魚に対して複数の薬剤を
スクリーニングするために、用いられ得る。サンプル操作および検出手順の両方
は、色素および化合物の迅速な再現性のある適用ならびに標的化合物の自動化ス
クリーニングのために、市販の機器およびソフトウェアシステムを用いて自動化
され得る。
、癌細胞の増殖を停止させるために用いられる多くの化合物がまた、増殖してい
る非癌細胞に対して有害な効果を有することである。小児に罹患した癌を扱う場
合にこれは特に問題である。なぜなら、小児の器官および組織の多くが依然とし
て増殖および発達しているからである。魚細胞および/または胚形成に対する薬
剤投与の副作用は、薬剤の投与後に間隔を置いてモニターされ得る。代表的に、
投与された薬剤の活性を評価するための測定と同時に測定が行われる。
3852に記載される。壊死組織は、例えば、蛍光顕微鏡法、光学顕微鏡法、測
色法、化学ルミネセンス、デジタル画像解析または標準的なマイクロプレートリ
ーダー技術を含む種々の技術によって検出され得る。例えば、魚胚は、細胞死活
性(例えば、アポトーシスまたは壊死)の検出を可能にする、膜不透性の核染色
蛍光色素を用いて染色され得る。好ましい色素としては、その多くが市販されて
いる、キノリウム色素ファミリーの色素(例えば、ベンゾチアゾリウム−4−キ
ノリウム色素(Molecular Probes))が挙げられる。ベンゾチ
アゾリウム−4−キノリウムは、生きている胚の細胞のインタクトな膜を通過で
きない。しかし、この色素は、膜が不連続になったかまたは破壊された(細胞死
を受けている細胞の特徴、LiepinsおよびBustamante,199
4)、死んだ細胞または死につつある細胞に侵入して、死んだ細胞または死につ
つある細胞のDNAへとインターカレート(intercalate)し得る。
DNAにインターカレートしたら、この色素は、激しく蛍光性になり、単一蛍光
顕微鏡を用いての標識細胞の迅速な検出を可能にする。シグナルの大きさは、壊
死細胞の数の尺度として役立つ。この蛍光色素は代表的に、魚を含む培地中に色
素を添加することによって魚に投与される。あるいは、この色素は、魚に直接注
射され得る。
、RNAのインサイチュハイブリダイゼーションまたは特定のタンパク質の抗体
染色によって検出され得る。mRNAのインサイチュハイブリダイゼーションは
、魚における慣用的な分子アプローチである(Westerfield、199
3)。Boehringer Mannheimからのジゴキシゲニン標識キッ
トは、RNAプローブを標識するために用いられ得る。ホールマウント(who
le mount)インサイチュハイブリダイゼーションは、以下の通りに実施
され得る:胚を、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、プロテイナー
ゼKで軽く消化し、そして65℃でハイブリダイズする。アルカリホスファター
ゼ結合体化抗ジゴキシゲニン抗体を用いてシグナルを検出する。NBT/X−ホ
スファターゼ(Boehringer Mannheim)で染色した後、胚を
100%メタノール中で漂白し、4%パラホルムアルデヒド中で再度固定し、そ
してPBS中で保存する。複数インサイチュハイブリダイゼーションを、マルチ
ウェルディッシュにおいて異なる魚に対して同時に行い得る。
シダーゼ)の使用に基づく迅速染色手順を用いて、カルボキシラーゼ酵素を、胚
全体の肝臓において検出し得る。このような酵素は天然でビオチン化される。こ
れらのビオチニル−リジン含有酵素(例えば、アセチル−CoAカルボキシラー
ゼおよび他のカルボキシラーゼ)は、主に肝臓に位置する。この群の酵素は肝臓
に濃縮されているので、染色は器官特異的である。
、室温にて固定し、そしてメタノール100%で一晩、−20℃にて処理した。
この胚を、PBSTで再水和し、そして漂白溶液(H2O210%)で20分間処
理した。PBSTでの洗浄後、胚を、ブロッキング溶液(PBST中、3% B
SA、100mM NaCl)においてインキュベートした。胚を、ストレプト
アビジン結合体化ペルオキシダーゼ(Pierce)(ブロッキング溶液中での
1:100希釈物)とともに、振盪しながら室温にて2時間インキュベートした
。次いで、これらを、PBSTで20分間づつ3回洗浄し、そしてジアミノベン
ジジン(DBA)染色溶液(1mlのDBAストック溶液[PBS(pH7.4
)中5gのジアミノベンジジン/l]、9mlのPBS、10μlのH2O2[3
0%])を用いてペルオキシダーゼについて染色した。通常、特異的肝臓染色は
、1〜5分間で可視化される。染色を、水での何回かの洗浄によって停止させた
。
与し、そしてどの比率の魚が各希釈物で死ぬかを決定することにより、決定され
得る。LC50は、胚の50%の致死を引き起こすために必要とされる濃度であ
る。100または1,000のような高い治療ウィンドウ(Therapeut
ic Window)(LC50/EC50)を示す化合物は、良好な潜在的薬
物候補である。なぜなら、治療濃度での毒性が低いからである。
ラテジーおよび原理と密接に類似したストラテジーおよび原理を用いて、他の細
胞型に対する薬剤についての種々のアッセイを行い得る。例えば、薬剤が、移植
された病原性細胞(例えば、細菌細胞または真菌細胞)に対する細胞傷害性につ
いてスクリーニングされ得る。薬剤はまた、移植された細胞のウイルス感染また
は病因を阻害する能力についてスクリーニングされ得る。このような方法では、
異種細胞を、魚への移植の前または後にウイルスと接触させ得る。ウイルスは通
常、レシピエント魚に感染することなく、移植された異種細胞に感染するウイル
スである。この方法は、培養で複製できない、増殖するウイルス(例えば、HB
V、HCVおよびいくつかの株のHPV(例えば、RosenおよびGretc
h,Mol.Med.Today 5,393−399(1999)))につい
て特に有用である。この方法はまた、移植されたヒト細胞のHIVおよびヘルペ
スウイルスの感染を研究するために有用である。薬剤は、ウイルスの導入の前ま
たは後に投与されて、それぞれ、予防活性および治療活性を試験し得る。
についてスクリーニングされ得る。上記の任意の型の薬剤が用いられ得るが、増
殖因子(例えば、サイトカイン、GM−CF、EPO、FGF、PDGF、VE
GFおよび幹細胞因子)が特に適切である。分化状態の変化は代表的に、1以上
の分化マーカーのセットんいおける変化を観察することにより示される。このよ
うな薬剤は、一旦同定されたら、損傷組織もしくは壊死組織のインサイチュでの
修復を促進するために、または細胞治療もしくは組織操作におけるその後の使用
のためにインビトロで細胞の分化および/もしくは増殖を促進するために、治療
的価値を有する。しばしば、このような方法において用いられる細胞は、全能性
幹細胞、多能性幹細胞および間葉幹細胞を含む、幹細胞である。例えば、薬剤は
、ニューロンへの神経幹細胞の分化を促進する活性について試験され得る。活性
は、神経導入または成熟細胞の分化マーカーからモニターされ得る。同様に、薬
剤は、筋細胞への心臓幹細胞の分化を促進する活性について試験され得、活性は
、励起レベル、拍動能力または成熟細胞の分化マーカーによってモニターされる
。
クリーニングされ得る。このような機能としては、タンパク質の発現または分泌
の促進が挙げられる。このような機能を有すると同定された薬剤は、コード配列
が遺伝子治療によって被験体に導入される内因性タンパク質または外因性タンパ
ク質の発現を調節するための治療において有用である。例えば、薬剤は、島細胞
からのインスリンの分泌を促進する能力についてスクリーニングされ得る。ある
いは、薬剤は、遺伝子治療において用いられるべきヒト幹細胞へと遺伝子操作に
よって導入された外因性酵素の発現を促進する能力について試験され得る。
するために有用である。このような方法は、インビトロで増殖できない細胞、ま
たはその特性がインビトロ増殖によって有害に影響する細胞について特に有用で
ある。いくつかの方法では、魚は、移植された細胞の増殖のためのインキュベー
ターとして役立ち、最終的な分化状態に到達せずに細胞の数が有意に増殖するの
を可能にする。次いで、このような細胞は、この魚から回収され、そして組織再
生が必要な部位で患者に導入される。次いで、細胞は、レシピエントにおいてイ
ンサイチュでさらなる増殖および分化を受ける。エキソビボ細胞治療のための方
法は、Mayhewら,Tissue Eng.4,325−34(1998)
;Wakitaniら,Tissue Eng.4,429−44(1998)
によって記載される。他の方法では、魚における細胞の増殖は、認識可能な異種
組織型(例えば、皮膚のパッチ)への分化をもたらす。次いで、異種組織は魚か
ら採取され、そして被験体へとインタクトで移植される。例えば、異種皮膚は、
魚から取り出され得、そして被験体における損傷または失われた皮膚のパッチを
置き換え得る。皮膚移植についての方法は、Mansbridgeら,Tiss
ue Eng 4,403−14(1998)によって考察される。他の方法で
は、異種細胞は、遺伝子治療に適切な核酸配列を用いて形質転換される。次いで
、この異種細胞は、患者への導入の前に増幅のために魚に導入される。他の方法
では、ヒトの造血幹細胞が、ヒト血小板および赤血球の大規模産生のために魚に
導入され、ヒト血小板および赤血球は、患者の処置のために収集され得る。他の
方法では、ヒト骨髄細胞が魚に増幅のために導入され、続いて、収集され、そし
て自己骨髄移植または同種異系骨髄移植において使用される。このような方法の
他の適用としては、組織操作のための骨格の生成、軟骨の生成、心臓弁(har
t valve)、骨修復、靭帯修復、半月板(menischal)インプラ
ント、自己軟骨細胞移植、神経再生脈管形成、および膵細胞、肝細胞もしくはグ
リア細胞の増殖が挙げられる。
るためのインキュベーターを提供する。このような方法では、癌細胞は、患者の
生検から得られ、魚に移植され、そして増殖する。次いで、移植された細胞と比
較して数がかなり増加した、増殖した細胞が収集される。次いで、収集された細
胞は殺傷され、そして患者に再度移植される。殺傷された細胞は、患者中に残存
する生癌細胞に対する免疫応答を刺激する腫瘍抗原を保有する(例えば、Eck
ら,Cancer Immunol.Immunother.6,336−41
(1999);Carr−Brendelら,J.Immunother.22
,415−22(1999)を参照のこと)。収集された細胞はまた、実験動物
において免疫原として用いられて、患者における受動免疫治療のための抗体を生
成し得る。
胞は、クローン単離体へと分離され、そして異なるクローン単離体が異なる魚に
導入される。次いで、細胞を、魚中で増殖させる。増殖後、細胞を、癌特異的抗
原の存在についてスクリーニングする。このような抗原を欠く細胞は、それらの
宿主魚から回収され、そしてその細胞を入手した患者へと再度移植される。この
ような方法は、骨髄移植患者において癌細胞および非癌細胞を区別するために特
に有用である。
魚に移植され、そして第II節において記載した通りに、特に増殖および/また
は転移についてモニターされる。移植された細胞の増殖および/または転移は、
生検が癌細胞を含むことの表示である。増殖および/または転移の割合は、腫瘍
の悪性度および患者の予後の指標である。移植された細胞はまた、種々の抗新生
物処置(例えば、放射線および化学療法)を用いてスクリーニングされて、特定
の患者における癌細胞に対してどの治療が最も適切であるかが決定され得る。こ
のバイオアッセイを用いて、骨髄、末梢血および体液における残りのリンパ腫細
胞のクローン原性の可能性が決定され得る。類似の方法を用いて、患者からの組
織サンプルにおける細胞病原体またはウイルス病原体を検出し得る。レシピエン
ト魚内で細胞を培養することは、病原体がより容易に検出される増幅を提供する
。このような方法は、移植された組織を受けた患者由来の生検を分析するために
特に有用である(例えば、Cohenら,Pediatr.Transplat
n.3,322−7(1999);Carmanら,J.Heptatol.2
,195−201(1999年8月)を参照のこと)。
の方法を用いて、同じ生物からの他の細胞型とは独立して細胞系列の分化をモニ
ターし得る。このようなことは、最後までは分化していない細胞を、魚の集団に
移植し、次いで移植された細胞および/または宿主魚における分化のマーカーを
経時的にモニターすることにより、達成され得る。mRNAに相補的なプローブ
を含むアレイは、モニタリングのために適切な手段を提供する(例えば、WO9
7/10365を参照のこと)。プローブの適切な選択により、mRNAの同じ
混合物において、魚mRNAを移植細胞のmRNAと区別することが可能である
。あるいは、微小組織操作を用いて、別個の組織サンプルを異種細胞および宿主
細胞から調製し得る。このような発現パターンは、薬物スクリーニングアッセイ
においてそれ自体有用である。例えば、特定のパターンが、特定の文化状態に特
有であると決定された場合、そのパターンを、分化を阻害または促進する能力に
ついてのスクリーニング薬剤において終点として用い得る。
、本発明者らは、ヒト癌組織由来の細胞(ヌードマウスに注射した場合に致死的
な腫瘍を形成することが以前に示された(Wengerら,1995;Chin
ら,1997)ヒト胚芽細胞腫由来のHepG2細胞(ATCC HB−806
5))を移植した。腫瘍を形成することに加えて、HepG2細胞はまた、血管
誘導タンパク質であるVEGFを含む、正常な肝細胞において存在する多数の因
子を分泌する。このことは、腫瘍増殖を見ること、ならびに死んだ細胞および死
につつある細胞を同定する生体染色の使用の両方により、VEGFの効果(He
pG2細胞の増加した血管形成および心臓の欠陥を含む)(DrakeおよびL
ittle,1995;Feuchtら,1997)について観察することによ
り、HepG2細胞の生存能力をアッセイすることを可能にした。さらに、本発
明者らは、視覚的外観、およびヒト抗原を認識するがゼブラフィッシュ抗原を認
識しない特異的抗体を用いることの両方により、HepG2細胞を同定し得る。
ection(ATCC)手順に記載される通りに維持した。手短には、細胞を
、グルタミン、必須アミノ酸およびピルベートを補充したMEM(最少必須培地
)(Gibco)中で培養した。細胞を、80%コンフルエンスになるまで増殖
させ、そしてトリプシン/EDTAを添加することにより収集し、同じ培養培地
で2回洗浄し、そして注射の直前にPBS中に再懸濁した。
術と類似する。手短には、細胞をPBS中に再懸濁した後、細胞を、先端のi.
d.直径が15ミクロンで、そしてo.d.直径が18ミクロンの、引いたガラ
スマイクロピペットに充填した。これは、容易な胚の貫通およびインタクトな細
胞の注入を可能にする。このマイクロピペットを、マイクロマニピュレーターお
よび空気式Cell Tram(Eppendorf)に取り付けた。このマイ
クロマニピュレーターを用いて、マイクロピペットの先端を、胚に挿入し、そし
てCell Tramからの陽圧を用いて10〜50個の細胞をチップから放出
した。移植を、胚の以下の3つの異なる領域において行った(図6): 1)宿主における移植細胞の位置についての演繹的知識を伴わずに、胚の動物
部分へと; 2)卵黄細胞においてランダムな位置へと;および 3)胚と卵黄球との縁部へと。
が一緒に凝集する代わりに組織全体に分配される、複数部位移植。全ての移植を
、発生の高次の段階(1000〜2000細胞)でまたはその付近で行った。
の胚を、プロテアーゼ(1mg/mlの胚培地)で5分間処理して、卵殻を除去
する。次いで、胚を、胚培地中で5回洗浄して、プロテアーゼおよび消化された
卵殻の両方を除去した。次いで、胚を、高次の段階の発生に到達するまで、ガラ
スビーカーにおいて胚培地中で27℃で数時間回復させた。次いで、この胚を、
胚培地中で1%アガロースから作製された保持ウェル中に配置した。30〜40
個の胚を、並行して、かつ方向付けて並べた。移植後、胚を保持トレイから取り
出し、そして寒天でコーティングした培養プレートに置き、そして回復させた。
24時間後、この胚を新たな培養プレートに移し、そして魚水(Santa C
ruz Technology)中で実験の持続時間の間維持した。
.05% diI)中で15分間インキュベートした。DiIは、移植移動研究
(Serbedzijaら,1992)を含む種々の長期の細胞追跡適用におい
て用いられる親油性カルボシアニントレース(Molecular Probe
s)である。上方蛍光顕微鏡法(epifluorescence micro
scopy)を用いて、DiI標識は、個々の移植細胞ならびに細胞塊の両方に
おいて可視化された。
疫検出した。サイトケラチン18は、中間径フィラメントタンパク質であり、こ
のタンパク質は、種々の条件下でHepG2中で発現することが示された(Cr
uickshankら、J.Hepatol.29:550−8(1998))
。移植胚を、パラホルムアルデヒドで室温で1時間固定し、そしてメタノール1
00%を用いて−20℃で一晩処理した。この胚を、PBST(PBS中0.1
% Tween 20)で再水和し、そして漂白溶液(H2O2 10%)で20
分間処理した。PBSTで洗浄した後、この胚をブロッキング溶液(PBST中
、20% 非働化ウシ血清、1% DMSO)中で室温で1時間、振盪しながら
インキュベーションした。次いで、一次抗体(モノクローナルマウスIgG抗ヒ
トケラチノサイト18(Santa Cruz Technology))を、
添加し(1:2000希釈)、そして室温で振盪しながら2時間インキュベート
した。同じブロッキング溶液で4回洗浄を行い、次いで、二次抗体(アルカリホ
スファターゼ結合体化ウサギ抗マウスIgG)を添加し(1:2000希釈)、
そして室温で振盪しながら2時間インキュベートした。胚を同じブロッキング溶
液で2回洗浄し、そして最終的にNTMT溶液(50mM MgCl2、100
mM NaCl、100mM Tris/HCl pH9.5)で平衡化した。
最後に、この胚を、NBT/BCIPを用いてアルカリホスファターゼについて
染色し、そして光学顕微鏡下で可視化した。
ーゼ活性について染色した。固定後、胚を−20℃でアセトンを用いて透過化処
理し、次いで、75mg/ml NBTおよび50mg/ml X−ホスフェー
トを用いて染色する。
ディング緩衝液中で再懸濁し、2分間煮沸し、そして14,000rpmで10
分間遠心分離した。次いで、上清サンプルを、10% SDSポリアクリルアミ
ドゲルにロードした。Kaleidoscope prestained pr
otein(Bio−Rad)を標準物質として用いた。電気泳動後、タンパク
質を、4℃で120〜200mAを用いて4時間の間、ニトロセルロース膜に転
写した(BA85,Schleicher&Schuell)。このフィルター
を、5%ミルク含有TBST(10mM Tris/HCl pH8.0、15
0mM NaCl、0.05% Tween 20)で一晩ブロッキングした。
次いで、このフィルターを、一次抗体(モノクローナルマウスIgG抗ヒトケラ
チノサイト18、Santa Cruz Technology、1:2000
希釈)とともに室温で30分間振盪しながらインキュベートした。同じブロッキ
ング溶液で4回洗浄を行い、次いで、二次抗体(アルカリホスファターゼ結合体
化ウサギ抗マウスIgG)を添加し(1:2000希釈)、そして室温で振盪し
ながら2時間インキュベートした。抗ケラチノサイト18結合反応を、One
Step TMB Blotting(3,3’−5,5’テトラ−メチル−ベ
ンジジン)(Pierce)を用いて可視化した。
ト18モノクローナル抗体(HepG2細胞を認識するが、内因性魚抗原には結
合しない)で染色した。この抗体を使用して、本発明者らは、肺組織および卵黄
の両方で標識細胞を検出し得た。本発明者らはさらに、これらの細胞が、しばし
ば移植細胞により誘導されると予測される形態学的欠損の部位と隣接していたこ
とを観察した。
である。増殖についてアッセイするために、BrdU(Sigma)の3μM溶
液を、以前細胞を移植した異種移植片の24時間ゼブラフィッシュ胚に注入した
。胚を、24時間インキュベートして、移植細胞および宿主細胞のDNAにBr
dUを組み込ませた。次いで、胚を採取し、4% PFAを用いて室温で固定し
、そして100%メタノールで脱水した。
epG2細胞が、生存動物の約10%において観察された。注入位置とその後の
胚における細胞観察との間に明らかな相関は認められなかった。移植して24時
間後、HepG2細胞が可視化された胚は、3つの異なる群に分けることができ
た: 1.正常と認められたが、卵黄に大きな細胞塊を有した胚(図1)、 2.正常と認められたが、胚体(body)において個々の細胞を有した胚(
図2)、および 3.形態的欠損および大きな細胞塊を有した胚(図3)。
両方の場合において、観察された細胞塊は、時間がたつにつれてより大きくなり
、このことは、HepG2細胞が増殖していたことを示唆する。さらに、この塊
が、胚体中に存在する場合、本発明者らは、細胞塊の物理的存在だけでは説明で
きない、胚に対する催奇形効果を観察した(図4)。このことは、HepG2細
胞が胚をもたらす因子を分泌していることを示唆する。さらに、本発明者らは、
しばしば、細胞塊に取り込まれたゼブラフィッシュ細胞を観察した(図5)。こ
のことは、HepG2細胞がゼブラフィッシュ細胞を形質転換してい得ることを
示唆した。第2群はまた、HepG2細胞が魚の胚に転移し得ることを示唆する
。いくつかの例においては、大きなHepG2細胞塊を有する胚は、移植して4
8〜72時間後に死亡した。対照的に、小さな塊または散在した個々の細胞を有
する胚は、7日間生存し、この時点で実験を終了した。
HepG2細胞により分泌されることが公知である)は、脈管形成の増加および
心臓欠損の両方を引き起こす(DrakeおよびLittle、1995;Fe
uchtら、1997)。これらの現象はともに、認識できるHepG2細胞塊
を有する胚において観察された。図5は胚を示し、ここで、HepG2細胞は、
心膜に存在していた。心臓は、明らかに先天異常である。卵黄に大きな細胞塊を
有する胚の脈管形成についての内因性アルカリフォスファターゼ染色は、卵黄中
および卵黄周辺の血管の過剰生成を示した。卵黄において、これらは、通常には
観察されない。本発明者らはまた、大きな脈管(背側の大動脈および背側静脈を
含む)の厚さの増加を観察した。
、ヒトVEGF(hVEGF)およびヒトAFP(fAFP)の存在について異
種移植片胚を試験した(これらの2つのタンパク質は、通常は、培養物中でHe
pG2細胞により分泌され、そして肝細胞癌と診断された患者の血液中に存在す
る)(Huber、1985;Eraiserら、1998;Louhaら、1
997)。高レベルのhVEGFはまた、ゼブラフィッシュおよび他の脊椎動物
における心臓発達に対する有害効果と相関づけられた(Drakeら、1995
;Feuchtら、1997、Serbedzija、1999)。これらの実
験のために、異種移植片胚を、hVEGFまたはhAFPのいずれかに対するヒ
ト特異的抗体で染色し、そしてこれらの抗体をRPE標識した二次抗体を用いて
検出した。DiIおよびRPEの蛍光スペクトルは類似しているので、移植を未
標識HepG2細胞を用いて行った。胚を移植して24〜72時間後に採取した
。移植細胞は、タンパク質の生成を含む適切な細胞特性を示す。VEGFについ
て染色した胚(100)のうち100%が、細胞塊中に標識細胞を含んでいた。
さらに、hVEGF陽性胚のうち50%において、個々のRPE標識細胞は、細
胞塊の非常に近くに検出された。hVEGF染色で示されたように、hAFPに
ついて染色した胚のうち100%が、細胞塊中に標識細胞を有した(図5Cおよ
び5D)。hVEGF染色とは対照的に、hAFP陽性胚において、胚が採取さ
れた時間に拘わらず、細胞塊の外で観察された細胞は存在しなかった。hVEG
FおよびhAFP抗体の両方について、染色をHepG2細胞に制限した。hV
EGF標識もhAFP標識も、異種移植片ではないコントロール胚においては観
察されなかった。
、細胞を以前移植した異種移植片の24時間ゼブラフィッシュ胚に注入した。胚
を、24時間インキュベートして、移植細胞および宿主細胞のDNAにBrdU
を組み込ませた。次いで、胚を採取し、4% PFAを用いて室温で固定し、そ
して100%メタノールで脱水した。抗BrdUおよび抗CK18二重標識:B
rdUを組み込んだHepG2細胞を同定するために、胚をBrdUおよびCK
18に対する抗体を用いて二重染色した。このプロトコルは、上記の抗体プロト
コルと同様であったが、以下を改変した:1)ブロッキング溶液中でのインキュ
ベーション前に、BrdU標識胚を、2N HCl中に30分間浸漬して、抗体
に対するDNAの接近性を増大させた;2)抗CK18およびそのRPE結合体
化二次抗体とともにインキュベーションした後に、胚を、BrdUに対するFI
TC結合体化モノクローナル抗体(Sigma)とともにインキュベートした。
次いで、この抗体を、エピ蛍光顕微鏡を用いて可視化した。
には、増殖HepG2細胞を同定するために、本発明者らは、ヒト特異的抗CK
18抗体を用いて二重標識実験を行った。本発明者らは、BrdUおよび抗CK
18を、それぞれFITC結合体化二次抗体およびRPE結合体化二次抗体を用
いて検出した。以前に記載されたように、移植を未標識HepG2細胞を用いて
行った。HepG2細胞塊が肉眼で認識される100の異種移植片胚を、移植し
て24時間後に採取した。次いで、BrdUの3μM溶液を、異種移植片胚のう
ち80の卵黄へ注入した。次いで、この胚を、さらに24時間発生させ、その後
固定および染色した。抗BrdU抗体を用いて、HepG2細胞および宿主細胞
両方を標識したが、HepG2細胞のみが両方の抗体によって標識された(図7
)。BrdU注入の後に、80の異種移植片胚のうち72が両方の抗体で標識さ
れた細胞を含んでいた。対照的に、コントロール異種移植片胚(BrdUを注入
しなかった)は、抗CK18標識細胞のみを含んでいた。この実験は、移植He
pG2細胞がゼブラフィッシュ胚において増殖することを明らかに示した。ゼブ
ラフィッシュ胚中のHepG2細胞塊は、成体マウス中の異種移植片HepG2
腫瘍と組織学的に類似している。HepG2細胞塊が、マウスモデルおよびそれ
らのヒト対応モデルにおいて生じた腫瘍に形態学的に類似していることを決定す
るために、本発明者らは、移植して24時間後および48時間後に採取した異種
移植片胚の組織学的試験を行った。ゼブラフィッシュ胚中の細胞塊は、マウスで
観察された腫瘍(7〜10mm;Vucenikら、1998)より小さかった
(直径100〜300μm)が、細胞塊中のHepG2細胞の一般的形態は、類
似していた(Kleinら、1989)。具体的には、HepG2細胞は丸く、
そして小さな細胞質を有した(図8)。HepG2細胞は、組織切片中で容易に
同定可能であった。なぜなら、HepG2細胞の核は、ゼブラフィッシュ細胞の
核より、大きくかつ密集していたからである。宿主細胞とは対照的に、HepG
2細胞は、非常に密集し、細胞間にほとんどまたは全く細胞外空間が存在しなか
った。より小さな核を有する細胞(ゼブラフィッシュ細胞と予測される)もまた
、HepG2細胞塊中に存在した。細胞塊のいずれにも空胞のある空間があると
いう証拠は存在しなかった。このことは、移植細胞が死滅していたことを示唆し
た。
移植した。移植の前に、HepG2細胞をDiIで標識し、次いで、トリプシン
/EDTAを添加し、2回培養培地で洗浄することにより採取し、そして宿主胚
中に移植する前に、PBS中に再懸濁した。移植して24時間後に、宿主胚をス
クリーニングして、標識細胞の単一塊を有する胚を同定した。本発明者らは、こ
れらの胚を観察し続け、細胞塊が残っている細胞をチェックし、そして胚の他の
領域にいきわたらせた。標識細胞がHepG2細胞であったことを確認するため
に、本発明者らは、抗サイトケラチン18抗体を用いて胚を染色した。本発明者
らは、100の胚を移植した;発生の24時間で生存した胚のうち95全てが、
標識細胞塊を含んでいた。次いで、標識細胞の単一の粘着性塊を含んでいた24
の胚を続けて観察して選択した。発生の48時間で、22/24の胚が、本来の
細胞塊の外側にDiI標識細胞を含んでいた(図9);発生の72時間で、個々
のDiI標識細胞を含んでいた22全ての胚は、血管系と関連づけられた。具体
的には、個々の細胞を、以下に見出した:1)背側血管および/または身体中心
部の静脈に隣接した尾の間葉において、2)頭側脈管に隣接する頭部全体に、お
よび3)心筋または心内膜のいずれかにおける心臓の壁内部に。6日間までに、
新たな細胞塊を尾(図9)および頭で観察した。このことは、個々の標識Hep
G2細胞が、初期の時点でそれらの位置で観察され、増殖していることを示した
。
においては27℃)で生存することができないという従来の知見が正しくないこ
とを示す。さらに、細胞は、生存するばかりでなく、HepG2がヌードマウス
に注入された場合に形成された腫瘍に類似し得る塊を形成するようである。さら
に、いくつかの腫瘍は、ゼブラフィッシュ胚に転移するようである。従って、ゼ
ブラフィッシュを用いて、ヒト癌細胞に対する活性についての薬剤をスクリーニ
ングし得る。
いてゼブラフィッシュに移植した。結果を、表1にまとめる。
らかの増殖を示す。細胞塊増殖は、より過剰な増殖を示す。移植細胞が、Hep
G2およびCCL−18細胞についての場合と同じように、胚全体にわたって存
在することは、転移を示す。CNS中のNT2D細胞(神経幹細胞)の存在は、
移植細胞がレシピエント魚内からの内因性シグナル伝達に応答することを示す。
は明らかであるはずである。本発明は、異種細胞の生存を維持および/または異
種細胞を増殖するために、レシピエントとして魚の使用を包含する。本発明はさ
らに、細胞の応答についての潜在的な薬物をスクリーニングするために魚に導入
した異種細胞の使用を包含する。本発明はさらに、患者の処置のための医薬の製
造に関して、魚に導入された異種細胞の使用を包含する。本発明はさらに、患者
組織サンプル内の病原体または癌細胞の診断のために、魚に移植された異種細胞
の使用を包含する。前述の発明は、明確性および理解の目的でいくらか詳細に記
載されてきたが、本開示を読むと、形態および詳細の種々の変更が本発明の真の
範囲から逸脱することなく行われ得ることは、当業者に明らかである。上記の実
施例は、本発明を例示するために提供されるが、その範囲を限定するためではな
い;本発明の他の改変は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲に
包含される。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるのでは
なく、代わりに、添付の特許請求の範囲を参照して均等物の全範囲に沿って決定
されるべきである。本出願に引用される全ての刊行物、参考文献および特許文献
は、個々の刊行物各々または特許文献が、個々に記載されているのと同じように
、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
可視化された胚。細胞塊を除き、胚は全く正常にのように見える。眼(E)およ
び耳胞(OT)を、位置づけのために印している。
化された胚。背びれ(DF)、腹びれ(VF)および卵黄(Y)を、位置づけの
ために印している。
細胞塊(矢印)として可視化された胚。尾(T)および卵黄を、位置づけのため
に印している。
矢印)として見られ得る。HepG2細胞の存在は、大きさが減少し、そして不
規則に拍動することが観察された発生中の心臓(短い矢印)に対する、催奇効果
を有したようであり、おそらく、HepG2細胞からのVEGFの分泌によって
引き起こすようである。心房(A)、心室(V)および卵黄を、印している(Y
)。
化される。ゼブラフィッシュの細胞は、この細胞塊(矢印)に取り込まれる。脊
索(No)、背びれ(DF)、腹びれ(VF)および卵黄(Y)を、位置づけの
ために印している。
た:胚(Em)の動物部分(宿主における移植された細胞(長い矢印)の位置の
予備知識なしで);卵黄細胞(Y;矢じり)におけるランダムな位置および;胚
と卵黄球(yolk ball)との間の縁(短い矢印)。
K−18抗体染色(A)卵黄の位置およびHepG2細胞塊の位置を示す暗視野
画像;(B)ローダミンフィルターセットを用いた同じ胚のエピ蛍光(Epif
luorescence)画像は、細胞塊に対するCK18の位置を示す。CK
18染色は、宿主組織またはコントロール胚において観察されなかった。(フル
オレセインフィルターを使用した同じ胚のCOエピ蛍光画像は、HepG2細胞
塊におけるBrdU標識を示す。卵黄が球状であることから、卵黄のシンシチウ
ム層のBrdu標識されたほとんどの細胞が焦点外にある)白矢印は、BrdU
を用いて標識された宿主細胞を示している。
る斜矢状(oblique sagittal)断面の明視野画像。脊索(NC
)および前中枢神経系(ANT.CNS)が、標識化または位置付けされる。(
B)および(C)細胞塊および前CANの高倍率像。HepG2細胞の核は、宿
主核より大きくそして色が明るい。HepG2細胞塊は、細胞外空間をほとんど
または全く有さない、密接に詰め込まれた細胞を含む。
異種移植胚の位相差画像および蛍光画像。72時間で、初期塊(primary
mass)(P)の細胞は、分散するようである。144時間までに、位相差
および蛍光の両方で可視化される衛星細胞塊は、胚の尾全体に存在した。位置付
けのために、肛門を印す。
Claims (66)
- 【請求項1】 細胞分析の方法であって、以下: 1以上の異種細胞を魚に導入する工程;および 該細胞または該魚の特性を分析する工程、 を包含する、方法。
- 【請求項2】 前記魚が、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアントレリオ
、またはフグである、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記異種細胞が、少なくとも前記分析工程まで生存可能に残
存する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記魚を培養し、これによって、前記異種細胞が該魚におい
て増殖する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 前記特性が、前記細胞または前記魚のmRNA発現プロフィ
ールである、請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 前記分析工程が、前記異種細胞または前記魚における分化マ
ーカーのセットの存在について試験する工程を包含する、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項7】 前記魚を薬剤に接触させる工程をさらに包含し、かつここで
、前記分析工程が、前記特性が該薬剤の投与に応答性であるか否かを決定する、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 前記薬剤が、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、天然物、
またはコンビナトリアルライブラリーのメンバーである、請求項7に記載の方法
。 - 【請求項9】 前記薬剤が、細胞傷害性である、請求項7に記載の方法。
- 【請求項10】 前記特性が、分化マーカー、前記魚の生存、前記異種細胞
の増殖、該異種細胞の最初の導入部位に対する移動、該異種細胞または該魚の細
胞の死、あるいは該異種細胞の増殖である、請求項7に記載の方法。 - 【請求項11】 前記特性が、前記異種細胞の増殖である、請求項7に記載
の方法。 - 【請求項12】 前記特性が、前記異種細胞の導入に対する前記魚の催奇形
性応答である、請求項7に記載の方法。 - 【請求項13】 前記特性が、前記異種細胞内でのタンパク質の発現である
、請求項7に記載の方法。 - 【請求項14】 前記特性が、前記異種細胞からのタンパク質の分泌である
、請求項7に記載の方法。 - 【請求項15】 前記細胞が、幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項16】 前記細胞が、多能性幹細胞または間葉幹細胞である、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項17】 前記細胞が、分化した細胞である、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項18】 前記細胞が、筋細胞である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項19】 前記細胞が、軟骨細胞である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項20】 前記細胞が、膵臓細胞、腎細胞、肝細胞、神経膠細胞、内
皮細胞または表皮細胞である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項21】 前記異種細胞が、ヒト細胞である、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項22】 前記異種細胞を前記魚から回収する工程をさらに包含する
、請求項1に記載の方法。 - 【請求項23】 前記異種細胞が、前記魚における増殖後に回収される、請
求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 前記異種細胞が、患者生検由来であり、前記特性が、該細
胞の増殖または転移であり、そして前記分析工程が、該患者の予後を示す、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項25】 前記異種細胞が、細菌細胞である、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項26】 前記異種細胞を前記魚に導入する前または後に、該細胞を
ウイルスに感染させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項27】 前記ウイルスが、前記魚の細胞に感染することなく前記異
種細胞に感染する、請求項26に記載の方法。 - 【請求項28】 前記細胞が、癌細胞である、請求項7に記載の方法。
- 【請求項29】 前記分析工程が、前記癌細胞に対する前記薬剤の効果をモ
ニターする工程を包含する、請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 前記癌細胞が、ヒト細胞である、請求項28に記載の方法
。 - 【請求項31】 前記癌細胞が、ヒト細胞株由来である、請求項28に記載
の方法。 - 【請求項32】 前記癌細胞が、ヒト腫瘍由来である、請求項28に記載の
方法。 - 【請求項33】 前記癌細胞が、白血病、肉腫、芽腫、奇形腫、神経膠腫、
神経線維腫および癌腫からなる群より選択される、請求項28に記載の方法。 - 【請求項34】 前記導入工程が、前記異種細胞を前記魚の胚形態に微量注
入する工程を包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項35】 前記導入工程が、前記異種細胞を前記魚の胚形態に微量注
入する工程を包含する、請求項34に記載の方法。 - 【請求項36】 前記細胞が、前記胚の体内に微量注入される、請求項35
に記載の方法。 - 【請求項37】 前記細胞が、前記胚の卵黄内に微量注入される、請求項3
5に記載の方法。 - 【請求項38】 前記薬剤が、前記魚を含む培地中に導入されるか、または
該魚への注射によって導入される、請求項7に記載の方法。 - 【請求項39】 前記異種細胞が、前記薬剤が投与される前に導入される、
請求項28に記載の方法。 - 【請求項40】 前記異種細胞が、前記薬剤が投与される前に前記魚におい
て増殖する、請求項28に記載の方法。 - 【請求項41】 前記異種細胞が、前記薬剤が投与される前に前記魚におい
て転移する、請求項28に記載の方法。 - 【請求項42】 前記薬剤が、前記癌細胞が導入される前に投与される、請
求項28に記載の方法。 - 【請求項43】 前記薬剤の効果が、前記癌細胞が該薬剤を伴わずに導入さ
れたコントロールの魚における増殖と比較した、該癌細胞の阻害である、請求項
28に記載の方法。 - 【請求項44】 前記薬剤の効果が、前記癌細胞が該薬剤を伴わずに導入さ
れたコントロールの魚において生じる転移と比較した、該癌細胞の転移の阻害で
ある、請求項28に記載の方法。 - 【請求項45】 前記薬剤が前記魚における細胞に対する活性を有するか否
かを決定するためのアッセイを実行する工程をさらに包含する、請求項28に記
載の方法。 - 【請求項46】 前記アッセイが、魚の胚における1以上の器官の発生をモ
ニターする工程を包含する、請求項45に記載の方法。 - 【請求項47】 前記モニターする工程が、魚の胚における形態学的欠損を
検出する工程を包含する、請求項45に記載の方法。 - 【請求項48】 前記アッセイが、魚の胚における壊死性細胞を検出する工
程を包含する、請求項45に記載の方法。 - 【請求項49】 前記アッセイが、インサイチュハイブリダイゼーションを
実行して、魚の胚におけるmRNAを検出する工程を包含する、請求項45に記
載の方法。 - 【請求項50】 前記アッセイが、標識化抗体で染色して、魚の胚における
タンパク質を検出する工程を包含する、請求項45に記載の方法。 - 【請求項51】 前記癌細胞が、マーカーで標識される、請求項45に記載
の方法。 - 【請求項52】 前記マーカーが、蛍光マーカーである、請求項51に記載
の方法。 - 【請求項53】 薬学的組成物として前記薬剤を薬学的に受容可能なキャリ
アを用いて処方する工程をさらに包含する、請求項7に記載の方法。 - 【請求項54】 癌細胞に対する活性について薬剤をスクリーニングする方
法であって、以下 1以上の癌細胞を魚の集団に導入する工程; 該薬剤を該魚の集団に投与する工程;および 該魚の集団における該癌細胞の発生に対する該薬剤の効果をモニターする工程
、 を包含する、方法。 - 【請求項55】 前記モニターする工程が、前記魚における前記癌細胞の発
生に対する前記薬剤の効果についてのEC50を決定する工程を包含する、請求
項54に記載の方法。 - 【請求項56】 前記魚の集団に対する前記薬剤のLD50を決定する工程
をさらに包含する、請求項54に記載の方法。 - 【請求項57】 請求項54に記載の方法であって、ここで、該方法が複数
の薬剤について繰り返され、そして低いEC50|LD50比を有する薬剤が、
キャリアを用いて薬学的組成物として処方される、方法。 - 【請求項58】 前記魚が、ゼブラフィッシュである、請求項54に記載の
方法。 - 【請求項59】 細胞を増殖させる工程であって、以下 1以上の異種細胞を魚に導入する工程; 該細胞が増殖する条件下で、該魚を培養する工程;および 該増殖された細胞を回収する工程、 を包含する、方法。
- 【請求項60】 前記細胞が、増殖の過程において分化し、そして該細胞が
、分化した組織として回収される、請求項59に記載の方法。 - 【請求項61】 前記細胞が、幹細胞である、請求項59に記載の方法。
- 【請求項62】 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項59に記載の方法。
- 【請求項63】 回収された細胞を患者に導入する工程をさらに包含する、
請求項59に記載の方法。 - 【請求項64】 前記異種細胞が、回収された細胞が移植される同じ患者か
ら得られる、請求項59に記載の方法。 - 【請求項65】 前記異種細胞が、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、筋細胞
、ニューロン、膵臓細胞、肝細胞、神経膠細胞および腎細胞からなる群より選択
される、請求項59に記載の方法。 - 【請求項66】 癌細胞または病原体についてサンプルを診断する方法であ
って、以下: 細胞の集団を含む患者からサンプルを得る工程; 該細胞の集団を魚に導入する工程;および 該細胞の集団の特性を検出して、該集団が癌細胞または病原体を含むか否かを
示す工程、 を包含する、方法。
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