KR101508356B1 - 제브라피시 인간 종양 이종이식 모델을 이용한 항암제 스크리닝 방법 - Google Patents

제브라피시 인간 종양 이종이식 모델을 이용한 항암제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다음 단계를 포함하는 항암제의 제브라피시-기반된 스크리닝 방법에 관한 것이다: (a) 인간 암세포를 제브라피시(Danio rerio)의 난황낭에 주입하여 이식하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물과 시험물질을 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 결과물을 30-33℃에서 배양하는 단계; 및 (d) 3-9 dpi(days per injection)에, 상기 인간 암세포가 파종(dissemination)된 제브라피시를 계수하는 단계; 상기 인간 암세포가 파종된 제브라피시의 수가 대조군을 기준으로 10% 이상 감소되면, 상기의 시험물질은 항암제로 판단된다. 본 발명에 따르면 제브라피시에 인간 암세포를 주입한 이종이식 모델을 이용한 최적의 스크리닝 시스템을 설립하여 항암제 후보물질을 신속하고, 편리하게 검출할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하여 스크리닝된 트리아진계 화합물은 암세포의 파종, 침윤 또는 생존력을 감소시킨다.

Description

제브라피시 인간 종양 이종이식 모델을 이용한 항암제 스크리닝 방법{Methods for Anti-Cancer Drug Screening Using Zebrafish Human Tumor Xenograft Model}
본 발명은 제브라피시 인간 종양 이종이식 모델을 이용한 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
신약 개발 연구는 지난 20년 동안 주요한 기술적 진보를 이루어왔다. 이러한 지놈 시퀀싱, 마이크로어레이, 생물 정보학 및 로봇 공학과 같은 분야에서 실험적 진보는 약물 스크리닝을 위한 강력한 방법의 개발을 촉진해왔다. 고속 대량 스크리닝 및 결합 화학의 발달은 선택된 대상에 대한 친화력 또는 질환 모델 내 활성을 보이는 히트 물질을 찾기 위한 수천 개의 화합물을 포함하는 라이브러리의 임의 스크리닝을 가능하게 하였다.
그러나 신약 개발 연구는 새로운 약품 개발에 있어 둔화를 겪고 있다. 심각한 문제는 흡수도, 용해도, 대사 안정성 및 독성과 같은 사항들 때문에 약물 스크리닝에 의하여 얻어진 대부분의 히트 물질들이 동물 실험에서 실패하는 것이다(6). 포유류는 대규모 스크리닝에 적합하지 않은데, 이는 비용적 사항 및 물류적 문제, 예컨대 기술적 지원과 함께 특수한 동물 설비 내 하우징(housing) 요건 때문이다. 따라서 높은 번식력과 단순한 하우징의 요건을 갖는 상대적으로 작은 크기의 동물 모델이 신약 개발을 위한 스크리닝 도구로 인기를 얻고 있다(3, 7, 8). 예시적으로 선충인 예쁜 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans) 및 초파리인 드로소필라 멜라노게스터(Drosophila melanogaster)가 포함된다(8). 작은-유기체 기반 약물 스크리닝의 또 다른 이점은 약물 표적의 사전 동정이 필요하지 않다는 것이다. 이는 포유류 실험 모델에서 유효한 새로운 활성 화합물의 발견을 가능하게 한다.
제브라피시(Danio rerio)는 담수 열대어이고 피라미과(minnow family)의 일종이다(9). 1980년대 초, 제브라피시는 유전학 및 발생 생물학을 연구하기 위한 척추동물 모델로 확립되었다(10). 제브라피시의 유지 비용은 마우스의 1 % 미만이다(11). 더욱 최근에, 제브라피시는 약물 스크리닝 및 암 연구에 이용되어지고 있다(12-16). 제브라피쉬는 멀티-형식 플레이트에서 생육할 수 있는 유일하게 확립된 척추동물 모델이다. 또한, 다수의 유전적 제브라피쉬 암 모델이 개발되고 있다(13). 제브라피쉬의 배아는 파종(dissemination) 및 종양-유도된 혈관 신생과 같은 이종이식된 종양 세포의 거동을 연구에도 이용 가능하다(13, 14, 16).
제브라피시의 배아는 신약 개발에 적합한데, 이는 이들이 작은 분자 화합물에 대해 높은 투과성을 나타내기 때문이다(17). 또한, 다양한 화학 치료가 제브라피시 배아 및 인간에서 매우 유사한 독성 및 기형학상의 효과를 초래함이 나타났다(18). 제브리피시에서의 종양 이종이식물의 거동은 리 등에 의하여 2005년에 보고되었다(19). 리 등은 1-100개의 인간 흑색종 세포를 수정 후 3.54.5 h(3.54.5 hpf(hour post-fertilization)) 배아에 주입(injection)한 경우, 발생하는 배아에서 암 세포의 이동성 거동을 보았다. 중요한 발전은 이듬해 보고되었는데, 이때 Haldi 등이 48 hpf 유생의 난황낭(yolk sac)에 주입한 대략 50개의 인간 흑색종 세포가 종양 집단의 증식, 이동, 형성 및 혈관신생을 유도함을 보였다(12). 제브라피시 내 암세포 이종 이식의 후속 연구는 혈관신생과 같은 종양 형성의 파라미터에 초점이 맞춰져왔다(12, 20).
그러나 실용적 약물 스크리닝을 위한 도구로서 제브라피시 종양 이종 이식 모델의 최적화 및 유효성을 설명하고 있는 광범위한 연구는 현재까지 없었다. 본 발명의 명세서에 기재한 본 발명에서, 본 발명자들은 인큐베이션 온도 및 주입된 세포 수와 같은 이종이식의 최적화를 위한 다른 실험적 조건을 시험하였다. 또한, 본 발명자들은 이식 이후 암 세포 유형의 이동성 거동을 평가하고, 다른 화학적 변형 및 작용 기전을 갖는 항암제의 범위를 시험하였다. 나아가, 본 발명의 제브라피시 인간 종양 이종이식 모델에서 케미컬 라이브러리를 스크리닝하여 신규한 항암제를 발견하였다. 본 발명은 제브라피시가 항암제 스크리닝을 위한 신속, 간단 및 재현가능한 동물 모델이 될 수 있음을 보여준다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 신약 개발을 위한 도구로서 단순한 척추동물-기반된 스크리닝 시스템을 구축하기 위하여 제브라피시 종양 이종이식 모델의 최적화를 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 표지된 인간 암세포를 제브라피시 난황낭에 일정 수만큼 주입하여 특정 온도에서 일정 시간 배양하는 경우, 인간 암세포가 파종(dissemination)되는 것을 확인하였으며, 상기 인간 암세포를 주입한 제브라피시 이종이식 모델 시스템에 공지된 다양한 항암제를 처리한 경우 상기 인간 암세포의 파종이 감소하고, 이는 투여량 의존적임을 발견하였다. 또한, 상기 제브라피시 이종이식 모델 시스템을 이용하여 트리아진계 케미컬 라이브러리로부터 파종을 감소시키는 화합물을 스크리닝하여, 이들의 암세포 침윤 및 생존력 감소 활성을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 항암제의 제브라피시-기반된 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 항암제의 제브라피시-기반된 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 인간 암세포를 제브라피시(Danio rerio)의 난황낭에 주입하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물과 시험물질을 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 결과물을 30-33℃에서 배양하는 단계; 및 (d) 3-9 dpi(days per injection)에, 상기 인간 암세포가 파종된 제브라피시를 계수하는 단계; 상기 인간 암세포가 파종된 제브라피시의 수가 대조군을 기준으로 10% 이상 감소되면, 상기의 시험물질은 항암제로 판단된다.
본 발명자들은 신약 개발을 위한 도구로서 단순한 척추동물-기반된 스크리닝 시스템을 구축하기 위하여 제브라피시 종양 이종이식 모델의 최적화를 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 표지된 인간 암세포를 제브라피시 난황에 일정 수만큼 주입하여 특정 온도에서 일정 시간 배양하는 경우, 인간 암세포가 파종(dissemination)되는 것을 확인하였으며, 상기 인간 암세포를 주입한 제브라피시 이종이식 모델 시스템에 공지된 다양한 항암제를 처리한 경우 상기 인간 암세포의 파종이 감소하고, 이는 투여량 의존적임을 발견하였다. 또한, 상기 제브라피시 이종이식 모델 시스템을 이용하여 트리아진계 케미컬 라이브러리로부터 파종을 감소시키는 화합물을 스크리닝하여, 이들의 암세포 침윤 및 생존력 감소 활성을 실험적으로 확인하였다.
따라서, 본 발명은 제브라피시에 표지된 인간 암세포가 주입된 제브라피시 이종이식 모델을 이용하여 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 화합물을 동정하는 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 방법을 각각의 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 인간 암세포를 제브라피시에 이식
우선 인간 암세포를 제브라피시 난황낭에 주입하여 이식한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제브라피시는 제브라피시 배아이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 1-3 dpf(day post fertilization) 배아이고, 다른 구현예에 따르면 2 dpf 배아이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 인간 암세포는 25-300개이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 인간 암세포는 50-300개, 70-300개, 70-250개, 70-200개, 70-150개 또는 70-130개이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 뇌암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 구강암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 구강암 또는 결장암이다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 본 발명의 인간 암세포는 검출가능한 표지(detectable label)로 레이블링될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지(detectable label)는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광 표지[예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl, FAM 및 DiI], 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 표지는 형광 표지이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 형광 표지는 DiI(fluorescent lipophilic indocarbocyanine dye)이다.
단계 (b): 단계 (a)의 결과물과 시험물질을 접촉
단계 (a)의 실시 이후, 상기 단계 (a)의 결과물인 인간 암세포가 주입된 제브라피시와 시험물질을 접촉시킨다.
본 명세서의 용어 “접촉”이란, 물질과 물질이 맞닿는 것을 의미한다. 상기 단계 (a)에서 제브라피시와 시험물질을 접촉시키는 방법은 제브라피시와 시험물질을 맞닿게 할 수 있는 어떠한 경우도 포함되며, 예컨대 제브라피시가 배양 또는 유지되는 배지(예컨대, E3 물과 같은 피시 워터(fish water) 등)에 상기 시험 물질을 첨가(add) 또는 투여(administer)하여 제브라피시와 시험물질이 맞닿을 수 있는 상태에 놓이게 하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 하기 실시예에서 개시한 바와 같이 본 발명의 시험물질은 설치류-기반된 스크리닝 방법과 비교할 때 0.1-30% 투여량으로 실시하여도 상기 시험물질의 효과를 평가하는데 충분하다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 시험물질은 설치류-기반된 스크리닝 방법과 비교할 때 0.1-10%, 0.1-5%, 0.1-3%, 0.1-1%, 0.1-0.5%, 0.1-0.3% 또는 0.2-0.3% 투여량으로 사용할 수 있다.
단계 (c): 단계 (b)의 결과물을 배양
단계 (b)의 실시 이후, 상기 단계 (b)의 결과물을 30-33℃에서 배양한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 배양은 30-32℃, 30.5-31.5℃ 또는 30.8-31.2℃에서 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 배양은 24-216시간, 24-168시간, 24-120시간, 24-72시간, 30-66시간, 36-60시간, 42-54시간, 45-51시간, 47-79시간 또는 48시간 실시한다.
본 발명의 인간 종양세포 이종이식된 제브라피시를 배양 하는데 있어서 공지된 배양 방법 및 배양배지를 이용하여 배양할 수 있다.
단계 (d): 인간 암세포가 파종된 제브라피시를 계수
단계 (c)의 실시 이후, 3-9 dpi(days per injection)에, 상기 인간 암세포가 파종된 제브라피시를 계수한다. 단계 (b)의 시험물질의 접촉에 의하여, 상기 인간 암세포가 파종된 제브라피시의 수가 대조군을 기준으로 10% 이상 감소되면, 상기의 시험물질은 항암제로 판단된다.
본 발명의 용어 “파종(dissemination)”은 제브라피시의 난황낭으로 주입된 인간 암세포 중 5개 이상이 초기 주입 위치인 난황낭의 경계를 벗어난 경우를 의미한다. 상기 인간 암세포는 미세한 형광점(fluorescent microfocus)으로 관찰된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 파종된 인간 암세포의 수를 대조군을 기준으로 10-70%, 20-70%, 25-70%, 25-50%, 30-50% 또는 30-40% 감소시키는 경우, 단계 (b)의 시험물질이 항암제로 판단된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 계수는 3-7 dpi, 3-5 dpi, 3.25-4.75 dpi, 3.5-4.5 dpi 또는 3.75-4.25 dpi에서 실시한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 계수는 4 dpi에서 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 계수는 현미경 하에서 실시하며, 다른 구현예에 따르면, 형광 현미경 하에서 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 계수는 현미경 하에서 실시하며, 다른 구현예에 따르면, 형광 현미경 하에서 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 스크리닝된 시험물질은 다음 화학식 I로 표시되는 화합물이다:
화학식 I
Figure 112013039848538-pat00001
상기 화학식에서, R1은 H 또는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이고; R2는 -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NHCOPh(상기 m, n 및 p는 각각 1-5의 정수이다)이며; R3, R4, R5 및 R6는 각각 독립적으로, H, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C3-C15 사이클로알킬, C4-C20 사이클로알킬알킬, C7-C16 아랄킬(aralkyl), C7-C16 알카릴(alkaryl), -PhCONH-(CH2)q-[(CH2)r-O]s-N3(상기 q, r 및 s는 각각 1-5의 정수이다)이고; 상기 사이클로알킬 및 사이클로알킬알킬의 고리 탄소는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬에 의해 치환될 수 있고; 상기 아랄킬의 아릴기는 C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시, C1-C5 알킬렌디옥시 또는 할로겐으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “알킬”은 비치환 또는 치환된 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 및 데실 등을 포함한다. C1 -10 알킬은 탄소수 1 내지 10의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1 -10 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 명세서에서 용어 “C1-C10 직쇄 또는 가지쇄 알킬”은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-아밀(amyl), tert-아밀, 헥실 등의 직쇄(straight chain) 또는 가지쇄(branched chain)의 알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 용어 “C3-C15 사이클로알킬”은 3-15개의 탄소원자로 이루어지는 단일환(mono ring) 또는 다중환(multi rings)의 포화탄화수소를 의미하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 3-10개의 탄소원자로 이루어져 있고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면 4, 5, 6 또는 8개의 탄소원자로 이루어져 있다. 예를 들어, 사이클로부틸환, 사이클로펜틸환, 사이클로헥실환 또는 사이클로옥틸환 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 “C4-C20 사이클로알킬알킬”은 사이클로알킬이 치환된4-20개의 탄소원자로 이루어지는 알킬을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 탄소원자는 3-10개의 탄소원자로 이루어져 있다.
본 명세서에서 용어 “C7-C16 아랄킬(aralkyl)”은 임의의 위치에서 하나 또는 둘 이상의 페닐환으로 치환된 C1-C10 알킬을 의미하며, 예를 들어, 벤질(benzyl), 2-페닐에틸, 3-페닐(n-프로프(prop)-1-일(yl)), 4-페닐(헥(hex)-1-일(yl)), 3-페닐(n-아(am)-2-일(yl)), 3,3-디페닐프로필 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 페닐 메틸이다.
본 명세서에서 용어 “아릴(aryl)”은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 모노아릴이다. 아릴기는 페닐기, 치환된 페닐기, 나프틸기, 치환된 나프틸기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서의 아릴기에 대하여 사용되는 용어 “치환”은 C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시 또는 할로겐의 치환을 포함하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 1-3의 치환기를 포함한다.
본 명세서에서 용어 “C1-C5 알콕시(alkoxy)”는 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알콕시는 메톡시이다.
본 명세서에서 용어 “C1-C5 알킬렌디옥시(alkylenedioxy)”는 R-O-(CH2)n-CH2-O-R(단, n은 정수이다)의 화학식을 갖는 구조로 예를 들어 메틸렌디옥시, 에틸렌디옥시, 프로필렌디옥시 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알킬렌디옥시는 메틸렌디옥시이다.
본 명세서에서 용어 “할로겐”은 F, Cl, Br 및 I를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 할로겐은 F 또는 Cl이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 I에서 R1은 H 또는 C1 -3 알콕시이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 R1은 H이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 I에서 R2는 -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NHCOPh(상기 m, n 및 p는 각각 1-3의 정수이다)이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 I에서 R2는 -[(CH2)2-O]2-(CH2)2-NHCOPh이다. 상기 -NHCOPh는 -NHBz로도 표시 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 I에서 R3, R4 , R5 및 R6은 각각 독립적으로, H, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, 또는 C3-C15 사이클로알킬이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 I에서 R3, R4 , R5 및 R6은 각각 독립적으로, H, C3-C7 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, 또는 C3-C10 사이클로알킬이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 I에서 R3은 H이고; R4는 사이클로펜틸 또는 사이클로옥틸이며; R5는 에틸프로필 또는 사이클로부틸이고; R6은 H이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 I에서 R1은 H이고; R2는 -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NHCOPh(상기 m, n 및 p는 각각 1-5의 정수이다)이며; R3 및 R5는 H이고; R4 및 R6는 C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C3-C15 사이클로알킬, C4-C20 사이클로알킬알킬, C7-C16 아랄킬(aralkyl), -PhCONH-(CH2)q-[(CH2)r-O]s-N3(상기 q, r 및 s는 각각 1-5의 정수이다)이고; 상기 사이클로알킬 및 사이클로알킬알킬의 고리 탄소는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬에 의해 치환될 수 있고; 상기 아랄킬의 아릴기는 C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시 또는 할로겐으로 치환될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 트리아진(triazine)계 화합물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:
화학식 I
Figure 112013039848538-pat00002
상기 화학식에서, R1은 H 또는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이고; R2는 -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NHCOPh(상기 m, n 및 p는 각각 1-5의 정수이다)이며; R3, R4, R5 및 R6는 각각 독립적으로, H, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C3-C15 사이클로알킬, C4-C20 사이클로알킬알킬, C7-C16 아랄킬(aralkyl), C7-C16 알카릴(alkaryl), -PhCONH-(CH2)q-[(CH2)r-O]s-N3(상기 q, r 및 s는 각각 1-5의 정수이다)이고; 상기 사이클로알킬 및 사이클로알킬알킬의 고리 탄소는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬에 의해 치환될 수 있고; 상기 아랄킬의 아릴기는 C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시, C1-C5 알킬렌디옥시 또는 할로겐으로 치환될 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 화합물인바, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 Ⅰ로 표시되는 트리아진계 화합물은 하기 화학식 1-14 로 표시되는 화합물 중 어느 하나이다:
[화학식 1]
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[화학식 2]
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[화학식 3]
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[화학식 4]
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[화학식 5]
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[화학식 6]
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[화학식 7]
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[화학식 8]
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[화학식 9]
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[화학식 10]
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[화학식 11]
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[화학식 12]
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[화학식 13]
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[화학식 14]
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본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화합물 Ⅰ로 표시되는 본 발명의 방법에 의하여 스크리닝된 시험물질은 암세포의 파종(dissemination), 침윤(invasion) 또는 생존력(viability)을 감소시킨다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 시험물질 대조군을 기준으로 20-70%, 25-70%, 25-50%, 30-50% 또는 30-40% 암세포의 파종을 감소시킨다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 시험물질 대조군을 기준으로 10-80%, 30-80%, 50-80% 또는 70-80% 암세포의 침윤을 감소시킨다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 시험물질 대조군을 기준으로 10-80%, 30-80%, 50-80% 또는 70-80% 암세포의 생존력을 감소시킨다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 항암제의 제브라피시-기반된 스크리닝 방법 및 이를 이용하여 선별된 트리아진계 화합물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
(b) 본 발명은 제브라피시에 인간 암세포를 주입한 이종이식 모델을 이용한 최적의 스크리닝 시스템을 설립하여 항암제 후보물질을 신속하고, 편리하게 검출할 수 있는 효과가 있다.
(c) 본 발명의 방법에 의하여 스크리닝된 트리아진계 화합물은 암세포의 파종, 침윤 또는 생존력을 감소시킨다.
도 1은 약물 스크리닝을 위한 제프라피쉬 인간 종양 이종이식 모델의 모식도를 나타낸다. 암세포(YD10B)를 DiI로 염색하고, 제브라피쉬 배아(2 dpf)의 난황낭에 주입하였다[이식 후(주입 후 0일) 배아의 대표 이미지를 보여줌). 이종이식 배아를 시험물질이 존재 또는 부존재하는 24 웰 또는 96 웰 플레이트에 분배하였다. 처리 4일 후, 시험물질을 평가하기 위하여 주입부위로부터 파종(dissemination)된 형광 암세포를 보이는 배아를 현미경으로 계수하였다.
도 2는 제브라피시에 이종이식된 암 세포의 파종 및 집단 형성을 나타낸다. (도 2a) 2 dpf Tg(fli1:EGFP) 제브라피시 배아의 난황낭에 DiI-염색된 암세포(YD10B)를 주입하였다. 상기 이종이식물을 4 dpi에서 직립 현미경으로 이미지화 하였다. Bar=200 μm. 적색 형광(DiI)-표지된 암세포가 주입 위치로부터 녹색 형광-표지된 혈관계로 이동하였다. 화살표는 혈관계 외부에 위치한 암세포를 나타낸다(분출됨). (도 2b) 종양 집단 형성. Bar=200 μm. 약 10%의 YD10B 또는 HCT116 이종이식된 배아가 복부로부터 돌출된 종양 집단을 형성하였다. (도 2c) 형광 비드(직경: 15 μm)가 2 dpf 배아의 난황낭으로 주입되었다. 주입 4일 후 배아를 관찰하고 이미지화 하였다.
도 3a는 이종이식된 YD10B 암세포의 파종에 대한 인큐베이션 온도의 영향. 이종이식 배아를 메틸렌블루 부재 E3 배지에서 28℃, 31℃ 또는 35℃의 온도에서 인큐베이션 하였다. 주입 후(dpi, days post injection) 4일째에 형광현미경으로 암세포 파종을 관찰하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험결과의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01.
도 3b는 이종이식된 배아의 생존에 대한 인큐베이션 온도의 효과를 나타낸다. 육안으로 계수된 약 100개의 YD10B 세포를 난황낭에 주입하였다. 28℃, 31℃ 또는 35℃에서 배양 4일 후 생존율을 평가하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 두 번의 실험의 평균 ±SD값이다. * = P < 0.05.
도 4는 제브라피쉬 이종이식 모델을 이용한 구강 암세포(YD10B) 및 이와 관련된 섬유아세포(CAF: Carcinoma associated fibroblasts)의 비교. 이종이식 배아를 메틸렌 블루가 없는 E3 배지에서 31℃의 온도에서 인큐베이션 하였다. 세포 파종을 4 dpi 및 5 dpi에서 관찰하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험결과의 평균 ±SD값이다.
도 5는 이종이식된 암세포 수가 암세포 파종에 미치는 영향을 보여준다. (도 5a) 대략 25개, 100개 및 200개의 세포(YD10B)를 육안으로 계수하고, 난황낭에 주입하였다. 한 시간 후, 이종이식 배아(5 배아/군)의 효소처리에 의한 분리 후, 이종이식된 암세포를 형광현미경으로 계수하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01. (도 5b) 이종이식 배아로부터 추출된 YD10B 암세포의 위상 콘트라스트 이미지, 형광 이미지 및 병합(merged) 이미지. (도 5c) 대략 25개, 100개 및 200개의 세포(YD10B)를 육안으로 계수하고, 난황낭에 주입하였다. 주입된 부위로부터 파종된 형광 암세포를 보이는 배아를 3, 4 및 5 dpi에서 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. * = P < 0.05, # = P < 0.01. (도 5d) 형광 이미지 및 병합(merged) DIC/형광 이미지. 화살표는 주입부위(난황낭)로부터 파종된 종양 위치(foci)를 나타낸다. Bar = 200 μm.
도 6은 이종이식 후 세포 파종을 보이는 다양한 암종 세포(carcinoma cell)를 보여준다. (도 6a) 구강 편평상피암종 및 결장암으로부터 유래된 다양한 세포주의 파종능 비교. YD10B 및 HSC-2는 구강 편평상피암종 세포주(OSCC:oral squamous carcinoma cell line)이고, DLD-1 및 HCT116은 결장암 세포주이다. 대략 200개의 세포를 2 dpf 배아의 난황낭에 주입하였다. 3, 4 및 5 dpi에서, 암세포 파종을 보이는 배아를 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. * = P < 0.05, # = P < 0.01. (도 6b) 형광 이미지 및 병합(merged) DIC/형광 이미지. 화살표는 주입부위(난황낭)로부터 파종된 종양 위치(foci)를 나타낸다. Bar = 200 μm. (도 6c) YD10B, HSC-2, DLD-1 및 HCT116의 인 비트로 증식율. 1000개의 세포를 96 웰 플레이트에 분주하고, 72시간 동안 인큐베이션 하였다. 1, 12, 24, 48 및 72시간에서, 세포증식을 MTT 분석으로 확인하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01. (도 6d) 세포이동 분석. CAF(2 X 104/웰)를 암세포의 이동을 유도하기 위하여 하단 웰에 분주하였다. 암세포(4 X 104/웰)를 상단 트랜스웰 챔버에 놓고, 12시간 동안 이동하도록 하였다. 필터를 통과한 암세포를 고정시키고, 현미경을 이용한 계수를 위하여 염색하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다.
도 7a 내지 7c는 이종이식된 암세포 파종에 대한 파클리탁셀의 효과를 보여준다. (도 7a) 인 비트로 암세포 증식에 미치는 파클리탁셀의 효과. YD10B 세포를 96 웰 플레이트에 분주하고, 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 약물처리 전에 배양배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 약물 처리 48시간 후, 세포증식을 MTT 분석으로 확인하였다. DMSO는 대조군으로 사용하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. (도 7b) 암세포 파종에 미치는 파클리탁셀의 투여량-의존적 효과. 대략 100개의 YD10B 세포를 배아의 난황낭에 주입하였다. 96 웰 플레이트에 배아를 분배한 다음, 이종이식 배아에 0.78, 12.5 및 50 nM의 파클리탁셀을 처리하였다. 4 dpi에서, 암세포 파종을 보이는 배아를 현미경으로 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. * = P < 0.05, # = P < 0.01. (도 7c) 형광 이미지 및 병합(merged) DIC/형광 이미지. 화살표는 주입부위(난황낭)로부터 전반된 종양 foci를 나타낸다. Bar = 200 μm. 도 7d 내지 7e는 이종이식된 암세포 증식에 대한 파클리탁셀의 효과를 보여준다. (도 7d) 약 100개의 YD10B 세포를 난황낭에 주입하였다. 4 dpf에서, 이식된 배아(5 배아/군)의 효소적 분리 후 형광 현미경하에서 상기 이종이식된 암 세포를 계수하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01. (도 7e) 이식된 배아로부터 추출된 암세포의 위상 콘트라스트 이미지, 형광 이미지 및 병합(merged) 이미지.
도 8은 항-파종 항암제 LY294002의 효과에 관한 것이다. (도 8a) 인 비트로 암세포 이동에 대한 LY294002(PI3K 억제제)의 효과. 24 웰 플레이트에서 1.25 μM, 2.5 μM 또는 5 μM의 LY294002를 18시간 동안 YD10B 세포에 처리하였다. DMSO는 대조군으로 사용하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. * = P < 0.05, # = P < 0.01. (도 8b) 인 비트로 암세포 증식에 대한 LY294002의 효과. YD10B 세포를 96 웰 플레이트에 분주하고 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 약물처리 전에 배양배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 약물 처리 18시간 후, 세포증식을 MTT 분석으로 확인하였다. DMSO는 대조군으로 사용하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. * = P < 0.05. (도 8c) 이종이식된 암세포의 파종에 미치는 LY294002의 효과. 대략 100개의 YD10B 세포를 배아의 난황낭에 주입하였다. 2.5 μM의 LY294002를 이종이식된 배아에 처리하였다. (i) 형광 이미지 및 병합(merged) DIC/형광 이미지. Bar = 200 μm. (ⅱ) 4 dpi에서, 암세포 파종을 보이는 배아를 현미경으로 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01.
도 9는 이종이식된 암세포 파종에 대한 Hsp90 억제제 및 신규한 트리아진의 효과를 보여준다. (도 9a) 암세포 파종에 미치는 Hsp90 억제제의 효과. 대략 100개의 YD10B 세포를 배아의 난황낭에 주입하였다. 96 웰 플레이트에 상기 배아를 분배한 다음, 이종이식 배아에 1 μM의 GM 또는 1 μM의 17-DMAG를 4일 동안 처리하였다. (i) 형광 이미지 및 병합(merged) DIC/형광 이미지. Bar = 200 μm. (ⅱ) 4 dpi에서, 암세포 파종을 보이는 배아를 현미경으로 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. * = P < 0.05, # = P < 0.01. (ⅲ) 인 비트로 세포증식에 미치는 Hsp90 억제제의 효과. YD10B 세포를 96 웰 플레이트에 분주하고, 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 약물처리 전에 배양배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 약물 처리 48시간 후, 세포증식을 MTT 분석으로 확인하였다. DMSO는 대조군으로 사용하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. (도 9b) 200개의 트리아진 라이브러리 화합물의 항암활성에 대한 스크리닝을 위한 본 발명의 이종이식 모델의 응용. (i) 스크리닝 절차의 모식도. 광학현미경을 사용하여 투명한 배아의 난황낭에 주입된 암세포를 볼 수 있다(화살표). (ⅱ) 대략 100개의 YD10B 세포를 배아의 난황낭에 주입하였다. 이종이식 배아에 20 μM의 BII-B9를 4일 동안 처리하였다. 4 dpi에서, 암세포 파종을 보이는 배아를 현미경으로 계수하였다(24 배아/군). DMSO 및 50 nM의 파클리탁셀을 음성 및 양성 대조군으로 각각 사용하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01. (ⅲ) 인 비트로 세포증식 및 침윤(invasion)에 대한 BII-B9의 효과. 세포증식을 평가하기 위하여, YD10B 세포에 대한 약물처리(2.5 μM, 5 μM, 10 μM 또는 20 μM의 BII-B9) 40시간 후, MTT 분석을 실시하였다. 세포침윤을 평가하기 위하여, 콜라겐 코팅-24 트랜스웰 플레이트를 사용하였다. 간략히 설명하면, 암세포의 침윤을 유도하기 위하여 CAF(1 X 104/웰)를 하단 웰에 분주하였다. YD10B 세포(1 X 104/웰)를 상단 트랜스웰 챔버에 놓고, 48시간 동안 상단 웰에 BII-B9를 다양한 농도로 처리하였다. 필터를 통과한 암세포를 고정시키고, 현미경 하에서의 계수를 위하여 염색하였다. DMSO는 대조군으로 사용하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다.
도 10은 암세포 파종에 대한 튜불린 불안정화제인 빈크리스틴의 효과를 나타낸다. 약 100개의 YD10B 세포를 배아의 난황낭에 주입하였다. 이종이식된 배아에 300 nM 빈크리스틴을 처리하였다. (도 10a) 형광 이미지 및 병합 DIC/형광 이미지. Bar=200 μm. (도 10b) 4 dpf에서, 현미경 하 암세포의 파종을 보이는 배아를 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01. (도 10c) 인 비트로에서의 암세포 증식에 대한 빈크리스틴 효과. YD10B 세포를 96 웰 플레이트에 분주하고 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 상기 배양 배지를 약물 처리 전 무혈청 배지로 교체하였다. 약물 처리 48 h 후, MTT 분석에 의하여 세포 증식을 평가하였다. 대조군으로는 DMSO를 사용하였다. 데이터는 독립적인 두 번의 실험의 평균 ±SD값이다.
도 11은 제브라피시 이종이식 모델에서의 HCT116 결장암 세포 파종에 대한 다양한 항암제의 효과를 나타낸다. HCT116 결장암 세포(약 300 세포)를 배아의 난황낭에 주입하였다. 96 웰 플레이트에 배아를 분주한 후, 상기 이종이식된 배아에 약물을 4일 동안 처리하였다. (도 11a) 암세포 파종에 대한 100nM 파클리탁셀의 효과. (i) 형광 이미지 및 병합 DIC/형광 이미지. Bar=200 μm. (ⅱ) 4 dpf에서, 현미경 하 암세포의 파종을 보이는 배아를 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01. (ⅲ) HCT116 결장암 세포의 인 비트로 배양에 대한 파클리탁셀의 항-증식 효과를 MTT 분석을 이용하여 평가하였다(48 h의 약물 처리). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. (도 11b) 암세포 파종에 대한 300nM 빈크리스틴의 효과. (i) 형광 이미지 및 병합 DIC/형광 이미지. Bar=200 μm. (ⅱ) 4 dpf에서, 현미경 하 암세포의 파종을 보이는 배아를 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01. (ⅲ) HCT116 결장암 세포의 인 비트로 배양에 대한 빈크리스틴의 항-증식 효과를 MTT 분석을 이용하여 평가하였다(48 h의 약물 처리). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. (도 11c) 암세포 파종에 대한 Hsp90 억제제인 17-DMAG의 효과. 1 μM 17-DMAG을 이종이식된 배아에 처리하였다. (i) 형광 이미지, DIC 이미지 및 형광 이미지로부터 병합된 이미지. Bar=200 μm. (ⅱ) 4 dpf에서, 현미경 하 암세포의 파종을 보이는 배아를 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01. (ⅲ) HCT116 결장암 세포의 인 비트로 배양에 대한 17-DMAG의 항-증식 효과. HCT116 세포를 96 웰 플레이트에 분주하고 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 상기 배양 배지를 약물 처리 전 무혈청 배지로 교체하였다. 약물 처리 48시간 이후, MTT 분석에 의하여 세포 증식을 평가하였다. DMSO를 대조군으로 사용하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다.
도 12는 인 비보에서의 암세포 파종에 대한 신규한 트리아진-기반된 항암제 후보인 AP-I-h7의 효과를 나타낸다. (도 12a) AP-I-h7의 화학 구조. (도 12b) 인 비트로에서의 암세포 증식에 대한 AP-I-h7의 효과. YD10B 또는 HCR116 세포를 96 웰 플레이트에 분주하고 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 상기 배양 배지를 약물 처리 전 무혈청 배지로 교체하였다. 약물 처리 48시간 이후, MTT 분석에 의하여 세포 증식을 평가하였다. DMSO를 대조군으로 사용하였다. 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. (도 12c) 인 비보에서의 세포 파종에 대한 AP-I-h7의 효과. 약 100개의 YD10B 세포 또는 300개의 HCR116 세포를 배아의 난황낭에 주입하였다. 이종이식된 배아에 4일 동안 10 μM AP-I-h7을 처리하였다. 4 dpf에서, 현미경 하 암세포의 파종을 보이는 배아를 계수하였다(24 배아/군). 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다. # = P < 0.01. 양성 대조군으로 50 nM 및 100 nM 파클리탁셀을 YD10B-주입된 배아 및 HCR116-주입된 배아에 각각 처리하였다. (i) 형광 이미지, DIC:형광 병합 이미지(약물 처리 또는 미처리된 YD10B-주입된 배아). Bar=200 μm. (ⅱ) 데이터는 독립적인 세 번의 실험의 평균 ±SD값이다.
도 13은 200개의 트리아진 라이브러리 화합물로부터 암세포 파종을 억제하는 신규한 항암 화합물의 스크리닝 결과로서 선발된 22 종의 화합물에 대한 재시험 결과를 나타낸다. (도 13a-13b) 인 비보에서의 암세포 파종에 대한 22종 화합물의 효과. 약 100개의 YD10B 세포를 배아의 난황낭에 주입하였다. 5 또는 10 μM의 약물을 4일 동안 이종이식된 배아에 처리하였다. 4 dpf에서, 현미경 하 암세포의 파종을 보이는 배아를 계수하였다(10 배아/군). DMSO를 대조군으로 사용하였다. (도 13b) ‘히트’ 화합물의 화학 구조.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실험 재료 및 방법
시약
17-디메틸아미노에틸아미노-17-디메톡시겔다나마이신(17-DMAG), 트리케인(tricaine, 에틸 3-아미노벤조산 메탄술폰산 염), LY294002, 파클리탁셀(paclitaxel) 및 빈크리스틴(vincristine)을 시그마社(미국)에서 구입하였다. 겔다나마이신(Geldanamycin)은 셀 시그널링社(미국)에서 구입하였다. 1,10-디옥타데실-3,3,30,30-테트라메틸-인도카보시아닌 과염소산(DiI)은Invitrogen社(미국)에서 구입했다.
세포 배양
F-배지(DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 및 F-12 배지를 3:1로 배합하고, 10% 우태아혈청(FBS: fetal bovine serum)과 50 units mL-1 페니실린 및 50 mg mL1-1 스트렙토마이신(PenStrep)을 보충한 배지)에서 YD10B 및 HSC-2 인간 구강 편평상피암종(OSCC) 세포주를 배양하였다. YD10B는 한국 세포주 은행(한국)로부터 구입하였고, HSC-2는 JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources)으로부터 구입하였다. HCT116 인간 직장 결장 암종 세포를 10% FBS 및 PenStrep가 보충된 DMEM에서 배양하였다. DLD-1 인간 직장 결장 샘암종 세포를 10% FBS 및 PenStrep가 보충된 RPMI1640에서 배양하였다. HCT116 및 DLD-1는 American Type Culture Collection에서 구입하였다. CAF는 OSCC 환자로부터 유도하였다(36). 본 발명의 연구에 대한 사전 동의는 연세대학교 치과대학(대한민국)에 의하여 획득하였다. 모든 세포를 0.5% CO2를 포함한 가습 환경에서 배양하였고, 37℃로 유지하였다.
형광 비드 주입
녹색 형광 폴리스티렌 비드(Molecular Probes社, 미국)의 주입을 위하여 실온에서 PBS로 두 번 세척하고 10% FBS로 현탁하였다. 붕규산 유리 모세관(World Precision Instruments, 미국)이 장착되어 있는 주입기(PV820 pneumatic picopump, World Precision Instruments社, 미국)를 이용하여 난황낭(2 dpf)에 주입하였다. 주입 된 배아는 200 μL E3 배지(메틸렌블루 부재)를 포함하는 96 웰 플레이트(1 배아/웰)로 옮기고, 31 ℃로 유지하였다. 직립 현미경(Leica DM2500 Microscope, 독일)으로 4 dpi에서 배아를 관찰하고 이미지화하였다.
세포 생존에 대한 MTT 분석
세포를 4 x 103 세포/웰 밀도로 96 웰 플레이트에 분주하고 하룻밤 동안 인큐베이션했다. 약물 처리 전에 배양 배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 세포에 약물을 48시간 동안 처리하였다. 세포에 100 mL의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드인 테트라졸(MTT) 시약을 3시간 동안 첨가하였다. 상층액을 제거하고, 10분 동안 진탕하면서 DMSO(Generay biotech, 중국)를 50 mL/웰로 세포에 첨가하였다. 마이크로 플레이트 리더(VERSA max, Molecular Devices社, 미국)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Tg-z제브라피시 유지(husbandary)
표준 지침에 따라서 Tg(fli1:EGFP) 제브라피시를 유지하였다. 대한민국 광주과학기술원(Gwangju Institute of Science and Technology) 지침에 따라서 제브라피시를 보존 및 처리하였다. 표준 교배 조건을 이용하여 배아를 얻고 세포 이종이식 실험을 위하여 수정 후 48시간 단계에 놓았다.
트랜스웰 이동 분석
피브로넥틴(fibronectin, 10 mg/50 mL, R&D社, 미국)으로 필터를 코팅한 후 이동 분석을 위하여 8 μm-포아 필터(Corning社, 미국)가 장착된 24 트랜스웰을 이용하였다. 암 세포 이동을 유도하기 위하여 웰 바닥에 CAF를 분주하였다. 하룻밤 동안 인규베이션 후 배양 배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 이후, 암세포를 상단 트랜스웰 챔버에 위치시키고 8-12시간 동안 이동하게 하였다. 필터를 통과한 상기 암 세포를 고정하고, 0.25% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 세포 이동은 필터 당 5개의 개별 현미경 필드(50X 배율)에서 이동된 세포를 계수하여 정량하였다.
트랜스웰 침윤 분석
24 트랜스웰 플레이트 내 8 μm-포아 필터(Corning社, 미국)를 코팅하기 위하여 타입 I 콜라겐(45 mg/30 mL, 시그마社, 미국)을 이용하였다. 웰 바닥에 CAF를 분주하고 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이후 배지를 무혈청 배지로 교체하고, 암세포를 상단 트랜스웰 챔버에 위치시키고 48시간 동안 인큐베이션 하였다. 고정, 염색 및 세포 계수 절차는 상술한 트랜스웰 이동 분석에서 기재한 바와 같다.
종양 세포의 이종이식과 현미경 검사
암세포를 염색 후 마이크로-포셉을 이용하여 배아의 융모막을 제거하고, 0.0016% 트리케인(tricaine)으로 마취한 후 1.0% 아가로오스 습패드의 좌측에 위치시켰다. 종양세포를 0.05% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 이용하여 배양 접시로부터 분리하고 상온에서 PBS로 두 번 세척하였다. PBS에 희석한 2 mg ml-1 DiI로 세포를 염색하고 네 번 세척하였다: FBS로 1회, PBS로 2회, 10% FBS로 1회. 세포를 주입 전에 얼음에 보관하였다. 현미경 하에서 암 세포를 계수하고 10% FBS로 현탁하여 붕규산 유리 모세관이 장착되어 있는 주입기(PV820 pneumatic picopump, World Precision Instruments社, 미국)를 이용하여 난황낭의 중앙에 주입하였다. 주입된 배아를 E3 배지(메틸렌블루 부재)로 희석된 관심 약물을 포함하고 있는 96 웰 플레이트(1 배아/웰)에 옮기고 미리 설정한 온도로 유지하였다. 직립 현미경(Leica DM2500 Microscope, 독일)에 의하여 주입 위치로부터 암세포 파종을 보이는 배아를 계수하였다. 직립 현미경을 이용하여 포착하였다.
이종이식된 암세포의 정량
제브라피시 배아 내 암세포의 증식을 정량하기 위하여 0 dpi 및 4 dpi 제브라피시 배아를 이용하고, 50 μL 프로테아제 용액(DMEM 내 2 units/ml 콜라게나아제(로슈社, 미국) 및 60 units/ml 디스파아제(로슈社, 미국))에서 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 이식된 배아를 하나의 세포 현탁액으로 분리하기 위하여 피펫팅하여 분리하였다. 분리한 세포를 고정시키기 위하여 8% 파라포름알데하이드 용액 50 mL을 직접 웰에 첨가하였다. 상기 세포를 계수하고 도립형광현미경으로 이미지화 하였다.
통계
실험군의 비교를 위하여 student’s t-test(Microsoft Excel)를 이용하였다. 0.05 이하의 P 값을 유의한 것으로 간주하였다.
실험 결과
제브라피시 내 이종이식된 인간 암세포는 혈관계로 이동 및 파종한다.
DiI-염색된 인간 암세포는 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 면역억제제의 처리 없이 성공적으로 수정 후 2일(2 dpf(day post fertilization))의 제브라피시 배아의 난황낭으로 이식하였다. 약물 스크리닝을 위하여, 96 웰 플레이트 형식(1 배아/웰; 시간-의존적 반응 연구를 위하여 동일한 수용체 배아의 추적이 가능함) 뿐만 아니라, 24 웰 형식(2-8 배아/웰) 및 6 웰 형식(24 배아/웰)에서 이종이식된 배아를 시험하였다. 주입 4일 후, 이종이식된 세포 파종을 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 본 발명자들은 상기 이종이식된 세포가 난황낭으로부터 심장 및 간과 같은 주요한 기관을 포함하여 꼬리 및 머리 부분으로 이동함을 발견하였다(도 1). 대부분의 이동된 세포가 혈관에서 관찰되었으나, 몇몇 세포들은 4 dpi에서 혈관계로부터 분출되었다(도 2a). 또한, 이종이식 이후 종양 집단 형성이 때때로 관찰되었다(도 2b). 각 군별로 형광을 띠는 미세한 점(microfocus)으로 관찰되는 암세포 중 난황낭을 벗어난 암세포가 5개 이상인 경우를 주입한 암세포가 파종된 제브라피시 배아로 판단하였다.
이종이식된 세포의 파종에 대한 인큐베이션 온도의 영향을 평가하기 위하여, 이종이식 이후 제브라피시 배아를 다른 온도(28℃, 31℃ 또는 35℃)에서 인큐베이션하고, 4 dpi에서 세포 파종을 관찰하였다(도 3a). 인큐베이션 온도가 증가함에 따라, 이종이식된 배아는 증가된 이동을 보였다. 반면, 본 발명자들은 35℃에서 이종이식된 배아의 생존율이 31℃와 비교하여 20% 감소한 것을 발견하였다(도 3b).
따라서 추가적인 실험에 31℃가 선택되었다. 이종이식된 인간의 암세포는 또한 비-발암성의 CAF(4 dpi에서 2%)와 비교하여 제브라피시에서 증가된 파종(4 dpi에서 76%)를 나타냈고, 이는 주입 위치로부터의 빠른 이동이 암세포의 특성임을 나타낸다(도 4). 또한, 본 발명자들은 형광 비드(직경: 15 μm)가 난황낭(0%, n = 26)으로 주입된 후 제브라피시 혈관으로 파종하지 않음을 관찰하였는데, 이는 이식된 암세포의 파종이 수동적 분포 보다는 능동적 이동 및 침윤 과정을 포함함을 제시한다.
세포의 파종은 이종이식된 세포의 수에 의존하고, 좋은 재현성을 보인다.
25개, 100개 또는 200개의 암세포(주입 파종의 세포 수에 의하여 계산됨)를 세 군의 배아에 이종이식하였다. 이식된 세포의 실제적인 숫자는 이종이식된 배아로부터 추출한 DiI-양성 세포를 계수하여 확인하였다. 주입된 세포 수가 증가함에 따라, 세포의 파종을 보이는 배아의 수는 상당히 증가하였다(도 5c). 도면은 주입 후 1일 및 4일에 촬영된 것이다(도 5d).
본 발명의 이종이식된 모델은 또한 좋은 재현성을 보였다; 세포 파종에 대한 ‘일내(within day)’ 변동 계수(CV: coefficient of variation)는 3.98 %이고, 세포 파종에 대한 ‘일차(between day)’ 변동 계수는 6.14%(표 1 및 표 2)이다.
Figure 112013039848538-pat00017
Figure 112013039848538-pat00018
나아가, 두 구강암 세포주(YD10B 및 HSC-2) 및 2 개의 결장암 세포주(HCT116 및 DLD-1)를 이종이식하고, 본 발명의 이종이식 모델에서 이들의 이동 잠재력을 비교하였다. YD10B, HSC-2 및 HCT116은 이종이식 이후 세포 파종에서 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 DLD-1 결장암 세포주는 시험 한 모든 시점에서 유의하게 적은 세포 파종을 보였다(3 dpi, 4 dpi 및 5 dpi, 도 6a). 도면은 4 dpi에서 촬영된 것이다(도 6b). 인 비보 시스템을 이용한 종양 세포 이동/파종 분석은 증식율, 이동 잠재성 및 침윤성과 같은 개별 종양 세포의 성격뿐만 아니라 숙주 요인(host factor)에 의존한다. 이종이식된 암세포의 증식율 및/또는 이동 잠재성이 이들의 인 비보 파종에 영향을 미치는지 여부를 밝히기 위하여, 본 발명자들은 MTT 분석 및 트랜스웰-기반된 이동 분석을 수행하였다(도 6c 및 6d). 인 비보에서 가장 낮은 세포 파종을 보여주는 DLD-1은 YD10B, HSC-2 및 HCT116 세포와 비교하여 현저하게 느린 증식 및 이동 비율을 보였다. 흥미롭게도, YD10B와 비교하여 제브라피시 배아에서 약간 낮은 세포 파종이 나타난 HCT116은 YD10B와 비슷한 인 비트로 증식 비율을 보였다(도 6a 및 6c). 반면, 상기 HCT116의 이동 비율은 YD10B에 비하여 상당히(p < 0.05) 낮았다(도 6d). 따라서 이종이식된 세포의 이동 잠재성 및 증식율은 함께 본 발명의 제브라피시 이종이식 모델에서의 세포 파종에 영향을 미칠 수 있다.
파클리탁셀 처리는 이종이식된 배아에서의 투여량-의존적으로 세포 파종을 감소시킨다.
본 발명자들은 제브라피시 이종이식 모델을 이용한 공지된 항암제의 효과를 평가하여 본 발명의 모델 시스템의 유효성을 검사하였다. 파클리탁셀(paclitaxel)은 미세소관을 안정화하고 유사분열(mitosis)을 억제하는 자연적으로 발생하는 디테르페노이드(diterpenoid) 암 화학치료요법이다(21). 도 7a에서 볼 수 있는 바와 같이, 파클리탁셀은 인 비트로에서 투여량 의존적 방식으로 세포 증식을 억제하였다. 본 발명의 이종이식 모델에서, 파클리탁셀은 세포 파종을 투여량-의존적으로 감소시켰다(도 7b). 이종이식된 배아는 50 nM 및 12.5 nM 파클리탁셀 처리에 의하여 각각 38.5±3.2% 및 54.0±4.0%의 암세포 파종을 보였고, 상대적으로 상응하는 대조군(미처리군)은 배아의 72.0±6.5%가 암세포 파종을 보였다. 반면, 0.78 nM 파클리탁셀의 처리는 암세포 파종에서 현저한 감소를 유발하지 못했다. 4dpi에서 촬영된 도 7c의 이를 나타낸다. 더불어, 분리된 이종이식된 배아를 이용한 세포 계수로부터 얻은 상기 결과는 파클리탁셀이 인 비보에서 암세포 증식을 억제하여, 그 결과 암세포 파종을 감소시킴을 뒷받침한다(도 7d 및 7e).
다양한 항암제는 이종이식된 배아에서 세포 파종을 억제한다.
본 발명의 제브라피시 이종이식 모델의 유효성을 검사하기 위하여, 하기의 다양한 항암제를 이종이식 시스템에서 시험하였다: LY294002(포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K) 억제제), 겔다나마이신(Hsp90(heat shock protein 90) 억제제), 17-DMAG, (겔다나마이신의 수용성 아날로그(22)) 및 빈크리스틴(미세소관 불안정화제).
LY294002는 암세포 이동을 억제함을 보여왔다(23). 1.25 μM 및 2.5 μM LY294002 처리 시 인 비트로에서 생존력에 영향을 미치지 않고 암세포 이동이 억제됨을 확인하였다(도 8a 및 8b). 따라서 본 발명의 모델에서 암세포 파종을 감소시킬 수 있는 항-이동성 약물인지 여부를 결정하기 위하여 2.5 μM LY294002를 선택하였다. 본 발명자들은 LY294002 처리가 암세포 파종을 나타내는 이종이식된 배아의 수를 현저히 감소시킴을 확인하였다(도 8c).
17-DMAG는 Hsp90 억제제로 보고된(24) 겔다나마이신의 수용성 아날로그이다. Hsp90 억제는 정상 세포에 비하여 암세포에서 현저한 선택성 및 자발적인 발암성 신호 전달 경로를 막음을 보임에 의하여 상당한 관심을 끌어왔다(25). 제브라피시 배아에서는 독성을 보이지 않았으나 인 비트로에서 세포 증식을 현저하게 억제했던 농도인 1 μM 겔다나마이신 및 1 μM 17-DMAG을 이종이식된 배아에 처리하였다(도 9a ⅲ). 17-DMAG 처리는 겔다나마이신에 비하여 암세포 파종을 현저하게 강한 감소시켰다(도 9a iⅱ).
빈크리스틴은 튜불린 다이머에 결합하고, 미세소관을 불안정화시키며, 세포 분열을 억제하는 일일초(Catharanthus roseus)에서 유래한 일일초 알칼로이드(vinca alkaloid)이다(26). 도 10a 및 10b에 나타난 바와 같이, 빈 크리스틴 처리는 대조군(이종이식된 배아의 71.0±4.6%)에 비하여 암세포 파종을 감소시켰다(이종이식된 배아의 52.7±2.3%). 이종이식모델에서 빈크리스틴의 항암효과를 시험하기 위하여 농도 300 nM를 선택하였는데, 이는 빈크리스틴이 제브라피시 배아에는 독성이 없이 YD10B 암세포에 대하여 300 nM에서 가장 높은 세포독성을 보였기 때문이다(도 10c).
본 발명의 제브라피시 이종이식 모델이 다른 종류의 암세포에서 항암제의 효과를 평가하는데 적합한지 여부를 결정하기 위하여, HCT116 결장 암세포를 2 dpf 제브라피시 배아에 이종이식 한 후 파클리탁셀, 빈크리스틴 및 17-DMAG를 각각 처리하였다.
100 nM 파클리탁셀에서 인 비트로 세포 증식에 대한 항-증식 효과가 나타났고, 상기 이종이식 모델에서 결장 암세포 파종이 억제됨을 발견하였다(도 11a). 또한, 300 nM 빈크리스틴 및 1 μM 17-DMAG은 암세포의 파종을 현저하게 감소시켰는데(도 11b 및 11c), 이는 본 발명의 이종이식 모델이 인 비보에서 결장 암세포 거동에 대한 항암제 효과를 평가하는데도 적합함을 나타낸다.
본 발명의 제브라피시 종양 이종이식 모델의 또 다른 중요한 시험은 신규한 항암 후보 약제가 인 비보에서 활성을 갖는지를 확인하는 것이다. 본 발명자들은 최근 신규한 트리아진-기반된 인슐린 모방 화합물을 발견하고, AP-I-h7(도 12a)로 명명한 바 있다(27). 항-당뇨 약제는 항암 활성을 갖는 것이 알려져 있다(28, 29). 따라서 본 발명자들은 상기 AP-I-h7의 항암 잠재성을 시험하였다. AP-I-h7은 투여량-의존적 방식으로 암세포 생존력을 감소시켰다(도 12b). 또한, 인간 암세포 이종이식된 배아에 10 μM AP-I-h7를 처리한 경우 세포 파종이 억제되었다(도 12c i 및 ii).
신규 항암제 후보를 발견을 위한 이종이식 배아에서의 케미컬 라이브러리 스크리닝
본 발명의 이종이식 모델 시스템의 유효성 검사를 위하여, 본 발명자들은 태깅된 트리아진 분자들의 케미컬 라이브러리를 스크리닝하였다(30). 도 9b i에서 볼 수 있는 바와 같이, 수백 개의 이종이식된 배아를 페트리디쉬 내에 모아, 24 웰 플레이트에 무작위로 분배하고(10 배아/웰), 200 개의 트리아진-기반된 라이브러리 화합물을 스크리닝하기 위하여 처리하였다. 1차 스크리닝에서 각 화합물을 20 μM로 처리하였다. 암세포 파종을 나타내는 배아의 수가 30% 이상 감소된 경우(파클리탁셀 처리와 유사)의 화합물을 ‘히트’화합물로 동정하였고, 22개의 히트 화합물을 동정하였다. 2차 스크리닝에서는, 상기 히트 화합물을 낮은 농도(5 μM 및 10 μM)에서 재시험하였다. 이 결과, 5 μM 또는 10 μM 시험에서 상당한 억제 효과 및 투여량-의존적 반응을 보이는 14 개의 화합물을 동정하였다(도 13a 및 13b). 본 발명자들은 도 9b ⅱ에서 볼 수 있는 바와 같이, 증가된 배아의 수(24 배아/군, n = 3)를 이용하여 이종이식된 세포 파종에 대한 BII-B9의 효과를 확인하였다. 더불어, 본 발명자들은 상기 약제가 2.5 μM에서 암세포 침윤을 현저하게 감소(대조군의 20%)시키고, 가장 높은 농도(10 μM; 도 6b ⅲ)에서 세포 생존력을 20%까지 감소시킴을 발견하였다. 신규한 항암제 후보로서의 BII-B9의 동정은 잠재적 항-침윤성 약제를 밝히는 스크리닝에 본 발명의 제브라피시 모델이 유용할 수 있음을 나타낸다.
고찰
암에 대한 약물의 발견은 고비용 및 시간이 소요됨
국립 암 연구소는 시장에 신약을 출시하기까지 연구 및 개발에 8-17억 달러의 비용 및 15년의 시간이 소요될 것으로 추정하였다. 따라서 신약 개발 과정의 속도를 높이기 위하여 새로운 전략이 필요하다. 동물 시험은 신약 개발의 중요한 부분이다. 본 발명은 신속하고 재현성 인간 종양 이종이식 모델을 확립하기 위하여 제브라피시를 사용하였다. 본 발명자들은 또한 트리아진 라이브러리 화합물 스크리닝에 의하여 신규한 항-침윤성/항-이동성 약물 후보의 발견이 가능함을 보임으로써 본 발명의 이종이식 모델의 유용성을 증명하였다.
본 발명자들은 인간 암세포를 이종이식한 제브라피시 배아를 다른 온도(28℃, 31℃ 또는 35℃)에서 배양하고, 이종이식된 암세포의 이동적 거동을 관찰하였다. 배양온도가 증가함에 따라, 더 많은 수의 제브라피시 이종이식물이 세포 파종을 보였다(도 3a). 반면, 이종이식된 배아의 생존율은 31℃에 비하여 35℃에서 20% 감소하였다(도 3b). 제브라피시는 통상 인간 체온보다 9℃ 낮은 28℃에서 유지한다(9). 반면, 제브라피시 배발생은 통상적으로 24℃ 내지 32℃에서만 진행이 가능하다(32). 따라서 본 발명자들은 배양온도로서 31℃의 선택이 항암제 효과를 시험할 때 중요한 정상 배아의 건강 및 발달을 유지하면서 숙주에서 이종이식된 암세포가 이동할 수 있는 합리적인 타협점이라 믿었다.
본 발명에서, 주입 위치로 난황낭을 선택하였는데, 이는 상기 난황낭이 주입된 세포의 다수(약 300개 세포 이상)를 방출 없이 유지 가능하고 세포 증식을 지원할 수 있기 때문이다. 또한, 난황낭에서 혈관계로의 이식된 세포의 이동은 수동적 이동에 의해서는 일어나지 않을 가능성이 크다(12, 19). 리 등은 제브라피시 유생으로 이식된 섬유아세포가 종양세포보다 덜 이동성임을 보고하였다. 본 발명자들은 또한 환자의 생검 내 인접 부위로부터 추출한 기질의 섬유아세포와 비교하여 이종이식된 암세포가 매우 높은 파종율을 나타냄을 관찰하였다(도 4). 상기 결과는 수동적-분포보다 능동적 이동 및 침윤과정이 이종이식된 암세포 파종에 포함됨을 뒷받침한다. 또한, 본 발명자들은 형광 비드(직경: 15 μM)가 난황낭으로 주입된 후 제브라피시 혈관으로 파종하지 않음을 관찰하였다(도 10).
더불어, 제브라피시 이종이식 모델의 확립 시 중요한 파라미터는 주입된 세포의 수이다. 그러나 적절한 주입 세포의 수를 결정하기 위한 표준화된 시험이 보고되어 있지 않다. 본 발명의 결과는 난황낭으로 주입된 세포의 수가 매우 일관성 있음을 보여준다(도 5a 및 5b): 예컨대, 100개 및 200개(추정치)의 예측된 주입은 각각 116±27 및 234±14(이종이식된 수)으로 평가되었다. 게다가, 주입된 세포의 수의 증가는 암세포 파종을 보이는 배아의 수를 증가시켰다(도 5c 및 5d). 약물 시험을 위한 최적의 이식 세포 수로 약 100개의 YD10B 세포를 선택하였는데, 이는 상기 수가 4 dpi에서 60% 내지 80% 범위의 충분한 세포 파종율을 보였기 때문이다.
다른 암세포 종류는 다양한 이동율 및 증식율과 같은 다른 특성을 보인다. 암 연구를 위한 신규한 동물 모델을 위한 중요한 시험은 이식 후 인 비보에서 상기의 차이가 반영되는지를 증명하는 것이다. 본 발명의 결과는 증식율 및/또는 이동율이 낮은 암세포가 제브라피시 배아에서 적은 세포 파종을 나타냄을 보여준다(도 6). 상기 발견은 제브라피시 이종이식 모델이 암세포 증식 및/또는 이동을 억제하는 항암제 후보의 고속 및 안정적인 시험을 제공할 수 있다는 확신을 높였다.
본 발명자들은 제브라피시 이종이식 모델에서 항암제의 대규모 시험을 수행하였다(도 7-9). 파클리탁셀은 암세포 파종 감소에 효과적이었고, 마우스 연구에 비하여 투여량을 대폭 줄여 사용할 수 있었다(2 μM과 비교하여 50 nM). 따라서 제브라피시 이종이식 모델에서는 상대적으로 적은 양으로 신규한 항암제 후보를 시험할 수 있었다. 이는 예비적 시험에 천연물로부터 분류한 신규한 분자를 적은 양으로만 이용할 수 있음을 고려할 때 설치류-기반된 시험과는 구별되는 이점을 제공한다. 튜불린 안정 또는 불안정, PI3K 억제 또는 Hsp90 억제와 같은 다른 작용 양식을 갖는 항암제는 비특이적 독성을 유도하지 않는 투여량에서 배아에서 모두 암세포 파종을 감소시킬 수 있다(도 7-9a 및 도 10 및 11). 따라서 본 발명의 제브라피시 이종이식 모델은 암세포 파종과 같은 같은 실험적 파라미터를 이용하여 항암제의 범위를 시험하고, 효과를 평가하는데 이용할 수 있다.
의약화학의 접근은 항암제 효과의 증대에 이용된다. 본 발명에서, 본 발명자들은 제브라피시 이종이식 모델이 약물 변형 시험에 이용될 수 있음을 보였다. 폭넓게 연구된 Hsp90 억제제 및 겔다나마이신(33)의 변형과 같은 약물 용해도를 향상시키기 위하거나, 17-DMAG 유도체(22)를 생산하기 위한 화학적 변형물을 제브라피시에서 측정 가능하다.
본 발명의 제브라피시 인간 종양 이종이식 모델의 주요한 이점은 신규한 항암제의 편리하고 빠른 동정이다. 본 발명의 이종이식 모델을 트라아진-기반된 케미컬 라이브러리 스크리닝에 이용하여, 본 발명자들은 잠재적 항-침윤성 효과를 나타내는 신규한 항암제 후보를 발견하였다(도 9b 및 도 13). 더불어, 본 발명자들은 본 발명의 제브라피시 모델이 인 비보 분석에서 선택된 신규한 항암제의 유효성 검사를 위하여 사용될 수 있음을 증명하였다(도 12). 제브라피시 이종이식 모델이 신규한 항암제 후보 화합물을 동정하기 위한 스크리닝에 사용될 수 있음을 증명한 것은 최초이다. 비록, 본 발명자들이 본 발명의 이종이식 모델에서 암세포의 파종만을 측정하였으나, 본 발명자들은 본 발명의 모델이 암세포 전이(metastasis)를 억제하는 화합물의 발견에 응용될 수 있다고 생각한다. 이는 본 발명의 신규한 히트 화합물인 BII-B9가 전이의 훨씬 상위 단계이나 필수적인 단계인 암세포 이동, 침윤에 대하여 억제 효과를 보였기 때문이다.
더욱 최근에, 초기 제브라피시 배아 내 백혈병 이종이식물의 약물 민감성을 개시한 2개의 최근 보고서가 있다(34, 35). 그러나 본 발명은 상기 보고서의 연구를 현저하게 확장시켰다. 본 발명자들은 주입 세포 수, 인큐베이션 온도 및 배아를 이미지화하기 위한 적절한 시점과 같은 최적화 이식물을 위한 많은 실험적 조건을 시험하였다. 또한, 본 발명자들은 이식 후 종양 세포 종류 범위의 이동적 거동을 평가하였고, 인 비트로에서의 제브라피시 모델에서의 암세포 거동을 개괄할 수 있었다. 본 발명자들은 또한 다른 화학적 변형 및 작용 메커니즘을 갖는 다양한 함암제도 시험하였다. 나아가, 본 발명자들은 본 발명의 이종이식 모델이 신규한 항암제 후보를 스크리닝하고 유효성을 검사하는데 척추동물-기반된 플랫폼으로 매우 유용함을 성공적으로 증명하였다. 종합하면, 본 발명자들은 본 발명의 제브라피시 종양 이종이식 모델이 다른 암 진행 동물 모델과 구분되는 이점을 제공하고, 신규한 항암제의 발견에 상당히 공헌하는 잠재성이 있음을 확신한다.
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30. S. M. Khersonsky, D. W. Jung, T. W. Kang, D. P. Walsh, H. S. Moon, H. Jo, E. M. Jacobson, V. Shetty, T. A. Neubert and Y. T. Chang, J. Am . Chem . Soc ., 2003, 125, 1180411805.
31. Drug Discovery at the National Cancer Institute: Fact Sheet; URL: http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/NCI/drugdiscovery; accessed 11 August 2011.
32. R. C. Schirone and L. Gross, J. Exp . Zool ., 1968, 169, 4352.
33. L. Whitesell, E. G. Mimnaugh, B. De Costa, C. E. Myers and L. M. Neckers, Proc . Natl . Acad. Sci . U. S. A., 1994, 91, 83248328.
34. D. P. Corkery, G. Dellaire and J. N. Berman, British Journal of Haematology, 2011, 153, 786789.
35. B. Pruvot, A. Jacquel, N. Droin, P. Auberger, D. Bouscary, J. Tamburini, M. Muller, M. Fontenay, J. Chluba and E. Solary, Haematologica, 2011, 96, 612616.
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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 다음 단계를 포함하는 항암제의 제브라피시-기반된 스크리닝 방법:
    (a) 인간 암세포를 제브라피시(Danio rerio)의 난황낭에 주입하여 이식하는 단계;
    (b) 시험물질의 라이브러리(library)를 준비(preparing)하는 단계;
    (c) 상기 단계 (a)의 결과물과 상기 시험물질의 라이브러리를 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물을 30-33℃에서 배양하는 단계; 및
    (e) 3-9 dpi (days per injection)에, 상기 인간 암세포가 파종(dissemination)된 제브라피시를 계수하는 단계; 상기 인간 암세포가 파종된 제브라피시의 수가 대조군을 기준으로 10% 이상 감소되면, 상기의 시험물질은 항암제로 판단된다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 제브라피시는 1-3 dpf(day post fertilization) 제브라피시 배아인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 인간 암세포는 25-300개인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 구강암 또는 결장암인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 투여량 의존적으로 상기 인간 암세포가 파종된 제브라피시의 수를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 시험물질의 라이브러리는 다음 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법:
    화학식 I
    Figure 112014104824301-pat00019

    상기 화학식에서, R1은 H 또는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이고; R2는 -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NHCOPh(상기 m, n 및 p는 각각 1-5의 정수이다)이며; R3, R4, R5 및 R6는 각각 독립적으로, H, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C3-C15 사이클로알킬, C4-C20 사이클로알킬알킬, C7-C16 아랄킬(aralkyl), C7-C16 알카릴(alkaryl), -PhCONH-(CH2)q-[(CH2)r-O]s-N3(상기 q, r 및 s는 각각 1-5의 정수이다)이고; 상기 사이클로알킬 및 사이클로알킬알킬의 고리 탄소는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬에 의해 치환될 수 있고; 상기 아랄킬의 아릴기는 C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시, C1-C5 알킬렌디옥시 또는 할로겐으로 치환될 수 있다.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 내지 (e) 단계의 스크리닝 방법을 제1차 스크리닝 방법으로 수행하여 상기 시험물질의 라이브러리에서 제1차 항암제 후보군을 선별한 후, 상기 선별된 제1차 항암제 후보군을 시험물질의 라이브러리로 이용하여 상기 (a) 내지 (e) 단계의 스크리닝 방법을 제2차 스크리닝 방법으로 수행하여 최종적으로 항암제를 결정하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 제1차 스크리닝 방법에서 이용되는 시험물질의 라이브러리의 시험물질은 제2차 스크리닝 방법에서 이용되는 시험물질의 라이브러리의 시험물질보다 상대적으로 높은 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 제1차 스크리닝 방법에서 이용되는 시험물질의 라이브러리의 시험물질의 농도는 10 μM 초과 내지 50 μM 이하이고, 제2차 스크리닝 방법에서 이용되는 시험물질의 라이브러리의 시험물질의 농도는 0 μM 초과 내지 10 μM 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
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