KR101181910B1

KR101181910B1 - 트리아진계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101181910B1
Application number: KR1020080127140A
Authority: KR
Inventors: 정다운; 김진미; 차충민; 장영태; 김진
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2008-06-23
Filing date: 2008-12-15
Publication date: 2012-09-11
Also published as: KR20090133061A

Abstract

본 발명은 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 화학식 I으로 표시되는 트리아진계 화합물중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물의 유효성분인 트리아진계 화합물은 암세포의 침윤 억제활성 또는 암세포 특이적 독성 활성을 가짐으로써 효과적인 항암용 약물로 응용이 가능하다.

암세포, 침윤, 침윤 저해제, 사이토카인(cytokine), 키모카인(chemokine), 암세포 독성, 표지된 트리아진계 화합물 라이브러리(tagged triazine library), 스크리닝 시스템

Description

트리아진계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Treating or Preventing Cancer Comprising Triazine Compound as an Active Ingredient}

본 발명은 트리아진계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

성장한 암 조직은 처음 발생한 부위의 주변 조직을 파고 들어가며 증식하는 특성을 갖는데 이를 침윤(invasion)이라고 한다. 이러한 암세포의 침윤과 전이(metastasis)는 불가분의 관계로서 침윤과정은 전이의 초기 단계라고 할 수 있다. 암세포의 침윤 과정은 단백질 분해효소의 과다 생산분비로 세포외 기질 (extracellular matrix)을 분해하는 과정과 방향성을 가진 암세포의 이동하는 과정이 주요한 구성 요소를 이루고 있다. 또한, 암세포의 침윤은 암세포의 단독 작용이 아닌 미세 주위 환경을 이루고 있는 세포들의 유도 작용에 의해 일어난다는 학설이 유력해지고 있다. 조직 내 미세주위환경과의 상호 작용의 중요성이 부각되면 서, 조직 내 미세주위환경을 이루는 기질 세포에 의한 상피 암종의 분화, 증식, 사멸의 유도 및 진행, 및 기질 세포에 의해 상피 암종의 진피 유사체내의 침윤이 유도되는 기전을 밝히는 데에 많은 관심이 집중되고 있다.

한편, 섬유모세포(fibroblast)는 기질을 이루는 대표적인 세포로서, 이 섬유모세포가 상피 또는 상피 암종에 미치는 영향에 대한 연구와, 이들 섬유모세포를 표적으로 한 새로운 암 치료법에 대한 연구가 점차 활발히 진행되고 있다. 그 예로서, 유방암에서 암세포로 변이가 시작된 상피 세포 주위에 섬유모세포가 있을 때, 상피 세포가 과다한 세포 증식, 세포 자살 프로그램의 상실, 조직 침입 능력 등 암세포의 특성을 빠른 속도로 획득하는 것이 확인되었다(Sadlonova et al. 2005). 또한, 전립선암에서 유래된 섬유모세포는 전립선 암 세포의 증식을 촉진하고 암세포의 분화에 영향을 준다고 보고되어 있다(Orimo et al. 2005). 더불어, 구강편평세포암종 (Oral squamous cell carcinoma, OSCC) 세포주의 삼차원적 배양에서 종양 세포들은 섬유모세포가 존재할 경우에만 결체 조직으로 침윤되었다(Che et al, 2006).

한편, 국제특허출원 제WO 03/032903호, 제WO 03/050237호, 제WO 04/099106호 등 에는 트리아진계 화합물 라이브러리의 합성방법 및 이들 화합물의 항-튜불린제(anti-tubulin agent)로서의 용도에 대해서 개시되어 있으나, 이들 화합물 라이브러리 중에서 암세포 침윤억제 활성을 나타내는 구체적인 화합물의 선별 및 용도에 대해서는 개시되어 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암세포의 침윤을 저해함으로써 항암활성을 나타낼 수 있는 화합물을 찾기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 암세포 침윤 저해제를 대량 고속의 방식으로 스크리닝할 수 있는 시스템을 확립하였고, 이러한 스크리닝 시스템을 이용하여 암세포의 침윤 억제활성 또는 암세포 특이적 독성 활성을 갖는 트리아진계 화합물을 표지된 트리아진 화합물 라이브러리로부터 선별하여 이들의 항암활성을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 트리아진계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 하기 화학식 I으로 표시되는 트리아진(triazine) 화합물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로, H, -(CH₂)_n-O-(CH₂)_n-0-(CH₂)_n-NH₂, -(CH₂)_n-O-(CH₂)_n-0-(CH₂)_n-NHBz, 상기 Bz는 벤조일기, -(CH₂)_n-O-(CH₂)_nCH₃, -(CH₂)_n-COOH, 히드록시기로 임의로 치환될 수 있는 직쇄 또는 가지쇄의 C₁-C₁₀ 알킬, C₃-C₁₅ 시클로알킬, C₄-C₂₀ 알킬시클로알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, C₁-C₁₀ 알킬아민, 또는 R₁ 및 R₂ 는 서로 연결되어 환 형태의 C₁-C₁₀ 알킬을 이룰 수 있고, 상기 환 형태의 C₁-C₁₀ 알킬은 O, N 또는 S의 헤테로원자를 포함하거나 C₁-C₁₀ 알킬로 치환될 수 있고, 상기 n은 0-10의 정수이고;

R₃, R₄, R₅ 및 R₆는 각각 독립적으로, H, C₁-C₁₀ 알킬아민, C₁-C₁₀ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C₃-C₁₅ 시클로알킬, C₄-C₂₀ 알킬시클로알킬, 또는 C₇-C₁₆ 아랄킬(aralkyl)이고, 상기 아랄킬의 아릴기는 C₁-C₅ 알킬, C₁-C₅ 알콕시 또는 할로겐으로 치환될 수 있고, 상기 아랄킬의 알킬기는 아릴기에 의해 치환될 수 있고; 또는 R₂ 및 R₃, 또는 R₄ 및 R₅는 서로 연결되어 환형태의 C₁-C₁₀ 알킬을 이룰 수 있다.

본 발명자들은 암세포의 침윤을 저해함으로써 항암활성을 나타낼 수 있는 화합물을 찾기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 암세포 침윤 저해제를 대량고속의 방식으로 스크리닝할 수 있는 시스템을 확립하였고, 이러한 스크리닝 시스템을 이용하여 암세포의 침윤 억제활성 또는 암세포 특이적 독성 활성을 갖는 트리아진 계열 화합물을 표지된 트리아진 화합물 라이브러리로부터 선별하여 이들의 항암활성을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 유효성분인 트리아진(triazine)계 화합물은 1040 종의 트리아진계 화합물의 표지된 라이브러리(tagged library)로부터 본 발명자들에 의해 확립된 스크리닝 시스템으로부터 항암 활성을 갖는 것으로 검색된 화합물이다. 본 발명에서 사용된 트리아진 화합물 라이브러리의 합성방법 및 이의 용도에 대해서는 국제특허출원 공개공보 WO 03/032903 및 WO 03/050237에 설명되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 화학식 I에서 용어 "C₁-C₁₀ 알킬아민" 은 메틸아민, 에틸아민, n-프로필아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, sec-부틸아민, tert-부틸아민, n-아밀(amyl), tert-아밀 등의 직쇄(straight chain) 또는 가지쇄(branched chain)의 알킬기를 갖는 아민을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "C₁-C₁₀ 직쇄 또는 가지쇄 알킬아민"은 메틸아민, 에틸아 민, n-프로필아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, sec-부틸아민, tert-부틸아민, n-아밀(amyl), tert-아밀, 헥실 등의 직쇄(straight chain) 또는 가지쇄(branched chain)의 알킬기를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "C₂-C₁₀ 알케닐"은 탄소수 2-10를 가지며, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 직쇄 또는 가지쇄의 알케닐을 의미한다. 예컨대, 비닐, 알릴(allyl), 2-부테닐, 3-부테닐, 4-펜테닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐, 2-헵테닐, 3-헵테닐, 4-헵테틸, 5-헵테닐, 6-헵테닐 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "C₃-C₁₅ 시클로알킬"은 3-15개의 탄소원자로 이루어지는 단일환(mono ring) 또는 다중환(multi rings)의 포화탄화수소를 의미하며, 예를 들어, 시클로프로필환, 시클로부틸환, 시클로부틸환, 시클로헥실환, 또는 시클로헵틸환 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "C₄-C₂₀ 알킬시클로알킬"은 상기 설명된 시클로알킬에서 알킬로 치환된 4-20개의 탄소원자로 이루어지는 알킬을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "C₇-C₁₆ 아랄킬(aralkyl)"은 임의의 위치에서 하나 또는 둘 이상의 페닐환으로 치환된 C₁-C₁₀ 알킬을 의미하며, 예를 들어, 벤질(benzyl), 2-페닐에틸, 3-페닐(n-프로프(prop)-1-일(yl)), 4-페닐(헥(hex)-1-일(yl)), 3-페닐(n-아(am)-2-일(yl)), 3,3-디페닐프로필 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "C₁-C₅ 알콕시(alkoxy)"은 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 할로겐은 F, Cl, Br 및 I를 포함한다.

본 발명의 화학식 I에서 R₁ 및 R₂ 는 서로 연결되어 환 형태의 C₁-C₁₀ 알킬을 이룰 수 있고, 상기 환 형태의 C₁-C₁₀ 알킬은 O, N 또는 S의 헤테로원자를 포함하거나 C₁-C₁₀ 알킬로 치환될 수 있다.

또한, 본 발명의 화학식 I에서 R₃ 및 R₄ 또는 R₅ 및 R₆ 은 서로 연결되어 환형태의 C₁-C₁₀ 알킬을 이룰 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 화학식 I으로 표시되는 트리아진 화합물은 하기 화학식 1-10으로 표시되는 트리아진(triazine) 화합물이다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 화학식 1-10 에서 상기 치환기 R₁ 및 R₂ 를 포함하는 -N R₁R₂ 그룹은 하기 그룹 중 어느 하나이다.

,

,

.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분인 트리아진계 화합물은 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물이다.

보다 바람직하게는, 화학식 6에서 상기 치환기 R₁ 및 R₂ 를 포함하는 -N R₁R₂ 그룹은 다음 그룹 중 어느 하나의 그룹이다.

,

,

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분인 상기 화학식 I의 트리아진 화합물들은 암세포의 침윤 억제 또는 암세포 독성 활성을 나타낸다.

본 발명의 트리아진계 화합물을 스크리닝하는 방법은 암조직유래 섬유모세포(CAF)와 암세포를 공동 배양하면 암조직유래-섬유모세포(CAF)가 암세포의 침윤을 유도한다는 사실에 근거한 것이다. 상기 스크리닝 방법은 다중 챔버(multi-chamber)를 이용하여 종래 화학주성(chemotaxis)에 의한 세포 이동(migration) 또는 침윤(invasion)을 분석하는 보이든 챔버 분석법(Boyden chamber assay) 또는 트랜스웰 분석법(transwell assay)을 적합하게 변형한 것이다. 상기 스크리닝 방법의 기본 원리는 다음과 같다. 즉, 트랜스웰(transwell)의 하부 챔버에 암조직유래-섬유모세포(CAF)를 배양하고 트랜스웰의 상부 챔버에 암세포를 배양하여 암세포의 침윤이 유도될 때, 첨가하는 후보 화합물이 이 침윤을 저해하는지를 확인하는 것이다. 본 발명의 유효성분인 화학식 I으로 표시되는 트리아진계 화합물들은 섬유모세포에서 분비되어 암세포의 침윤을 유도하는 사이토카인(cytokine) 또는 키모카인(chemokine)의 분비를 억제하거나 이의 활성을 방해하는 작용을 하거나, 또는 암세포 자체에 대한 특이적인(specific) 독성을 나타낸다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 암은 예컨대 구강암(oral cancer), 위암(stomach cancer), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 기관지암(bronchogenic cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 후두암(laryngeal cancer), 췌장 암(pancreatic cancer), 방광암(bladder cancer), 대장암(colon cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 뇌암(brain cancer), 전립선암(prostate cancer), 골암(bone cancer), 피부암(skin cancer), 갑상선암(thymus cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(renal cancer) 및 요관암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물이 적용될 수 있는 암은 구강암, 대장암, 폐암, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 암이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 화학식 1-10의 트리아진 계열 화합물의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 트리아진계 화합물은 암세포의 침윤 억제활성 또는 암세포 특이적 독성 활성을 가짐으로써 우수한 항암용 약물로 응용이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.　 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

1. 트리아진 라이브러리( Triazine library ) 화합물

표지된 트리아진 라이브러리(Tagged triazine library) 화합물 1040 개를 준비하고 이를 각각 DMSO(Dimethyl Sulfoxide)에 녹여 5mM 농도로 제조하였다. 표지된 트리아진 라이브러리 화합물 및 이의 제조방법은 종래 문헌에 기술되어 있다 (Facilitated forward chemical genetics using tagged triazine library and zebrafish embryo screening, Khersonsky, S. M; Jung, D. W.; Kang, T. W.; Walsh, D. P.; Moon, H. S.; Jo, H.; Jacobson,E. M.; Shetty, V.; Neubert, T. A.; Chang, Y. T; J. Am . Chem . Soc . 2003, 125, 11804-11805). 트랜스웰 침윤 분석법(transwell invasion assay)에 후보 트리아진 화합물의 최종 농도가 5mM이 되도록 첨가하여 항-침윤(anti-invasive) 효과를 측정하였다.

2. 세포 배양

(i) 구강편평상피암종 ( OSCC , Oral Squamous Cell Carcinoma ) 세포

한국 세포주 은행에 등록된 YD-10B 세포주(Lee EJ et al. Exp Mol Med 2005, 37:379-90)와 일본 세포주 은행에 등록된 HSC-2, HSC-3, Ca9.22 세포주를 구강편평상피암종(OSCC) 세포로서 실험에 사용하였다. HSC-2, HSC-3, Ca9.22 세포주는 DMEM:Hams-F12 (3:1)에 1％ 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 배지를 이용하여 5％ CO₂가 유지되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. YD-10B 세포주는 상기 조성의 배지에 콜레라 독소(cholera toxin) (0.1 mg/㎖, Sigma), 히드로코르티손(hydrocortisone) (0.4 mg/㎖, Sigma), 인슐린(insulin) (5 mg/㎖, Sigma), 아포-트랜스페린(apo-transferrin) (5 mg/㎖, Sigma), 3, 3', 5-트리 요오도-1-티로닌(3, 3', 5-triiodo-1-thyronine) (2 mg/㎖, Sigma)를 추가로 포함한 배지를 사용하여 배양하였다.

(ⅱ) 대장암 세포 ( colon cancer cells )

HT-29, DLD-1, HCT-116 세포주는 연세대학교 암연구소에서 제공 받았다. HT-29, DLD-1 세포주는 RPMI 1640에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 배지에서 배양하였다. HCT-116 세포주는 DMEM 에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 배지에서 배양하였다.

(ⅲ) 폐암 세포 ( lung cancer cells )

NCI-H596, NCI-H460, A549 세포주를 연세대학교 암연구소에서 제공 받았다. NCI-H596 및 NCI-H460 세포주는 RPMI 1640 에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)이 첨가된 배지에서 배양하였다. A549 세포주는 DMEM에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 배지에서 배양하였다.

(ⅳ) 유방암 세포 ( breast cancer cells )

MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하여 DMEM에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS가 첨가된 배지에서 배양하였다.

(ⅴ) 전립선암 세포 ( prostate cancer cells )

PC3 세포주를 연세대학교 암연구소에서 제공받아 Hams-F12에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS가 첨가된 배지에서 배양하였다.

(ⅵ) 정상 상피 세포 ( normal epithelial cells )

교정 목적으로 뽑은 치아의 정상 치은 조직 중 상피에서 유래된 정상 상피 세포를 KGM 배지에서 배양하였다.

(ⅶ) 암 조직 유래 섬유모 세포 ( carcinoma - associated fibroblasts , CAF )

구강암 조직을 베타딘으로 3회 세척한 후, 가위로 조직을 잘라 PBS로 세척하고, 섬유모 세포를 DMEM:Hams-F12 (3:1)에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS가 첨가된 배지에 배양하였다.

3. 침윤 저해제 검색 방법 ( in vitro invasion assay )

암세포의 침윤 저해제를 스크리닝하는 방법은 트랜스웰 분석법(transwell assay)을 적합하게 변형하여 시행하였다. 암세포의 침윤성은 24-트랜스웰 플레이트(24-transwell plate) (Corning 사)를 사용하여 측정하였다. 세공(pore) 직경이 8 μm인 필터(filter)에 콜라겐 타입 I(collagen type I)을 코팅한 후, 필터 아래 하부 웰에는 2.1 X 10⁴ 세포/웰의 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)를 분주하였다. 밤샘 배양한 후 배지를 무혈청 배지로 교체하고, 무혈청 배지에 희석된 2 X 10⁴ 개의 암세포를 콜라겐 코팅된 필터 위에 분주하였다. 스크리닝하고자 하는 트리아진계 화합물은 필터 위쪽에 첨가하였다. 48시간 배양 후, 필터를 통과한 세포를 10％ 포르말린(formalin)으로 고정시킨 후, 0.25％ 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 현미경 아래에서 세포의 수를 측정하였다.

4. 세포 생존율 측정 ( cell viability test )

세포의 생존율을 측정하기 위해, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석법(MTT assay)을 시행하였다. 96 웰 플레이트에 세포를 8 X 10³ 세포/웰로 분주하고 밤샘 배양한 후, 스크리닝 후보 트리아진계 화합물을 첨가하여 24시간, 또는 48시간 더 배양하였다. MTT 시약이 함유된 무혈청 배지로 교체하고 3시간 배양한 후 배양액을 제거하고, DMSO를 첨가하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 용해시킨 후, 540nm 에서 흡광도를 측정하였다.

5. CCL7 측정을 위한 효소 면역 정량법 ( CCL7 ELISA )

세포 배양 배지(cell culture media)로 분비된 CCL7의 양은 Human CCL7 ELISA kit(R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 24-웰 플레이트에 2.1 X 10⁴ 세포/웰 개의 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)를 분주한 후 밤샘 배양하고, 300 ㎕/웰의 무혈청 배지로 교체한 다음, YD-10B 배양액 200 ㎕/웰을 첨가하였다. 이 때 동시에 후보 트리아진계 화합물을 첨가하거나 대조군으로서 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 같은 용량 첨가하고 24시간 추가 배양하여 배양액을 수집하고, 이를 ELISA 분석에 이용하였다.

6. CXCL1 / GRO -α 측정을 위한 효소 면역 정량법 ( CXCL1 / GROO -α ELISA )

세포 배양 배지로 분비된 CXCL-1의 양은 Human CXCL1 ELISA kit (R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 세포 배양액의 수집 방법은 전술한 CCL7 ELISA 법에서 설명된 방법과 동일한 방법으로 행하였다.

7. CXCL8 / IL -8 측정을 위한 효소 면역 정량법 ( CXCL8 / IL -8 ELISA )

세포 배양 배지로 분비된 IL-8의 양은 Human IL-8 ELISA kit (R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 세포 배양액의 수집 방법은 전술한 CCL7 ELISA법에서 설명된 방법과 동일한 방법으로 행하였다.

8. 아폽토시스(apoptosis)의 측정

화합물 및 약물을 처리한 후 Annexin V/carboxyfluorescein diacetate 염색 키트(Sigma)로 세포를 염색하고, 공초점 현미경(confocal microscope)으로 관찰하였다.

실험 결과

1. 침윤 저해제 스크리닝

표지된 트리아진 라이브러리(tagged triazine library)의 1040개 화합물의 침윤 저해 효과(anti-invasive effect)를 스크리닝한 결과, 그 중 침윤 저해 효과가 강력한 화합물들(화합물 B50, H39, G35, G14, J49, SO6, S14, M17, S17, S20)을 선발하였다.

검색을 위해 사용한 스크리닝 방법은 다음과 같았다. 먼저, 트랜스웰(transwell)의 하부 웰에 암조직유래-섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)를 배양하고 트랜스웰의 상부 웰에 암세포로서 구강편평세포암종(OSCC) 세포를 배양하여 구강편평세포암종 세포의 침윤이 유도될 때, 첨가하는 후보 화합물이 이 침윤을 저해하는 지를 확인하였다(도 1 참조). 암세포의 침윤 정도는 트랜스웰의 상부 및 하부 구획(compartment) 사이에 놓여 있는 콜라겐-코팅된 필터(collagen-coated filter)를 통과한 암세포들을 고정하고 염색한 후에 염색된 세포의 수를 측정하여 판단하였다. 또한, 비특이적인 세포 독성에 의한 저해 작용을 나타내는 후보 화합물을 선별로부터 제외하기 위해, 상기한 침윤 억제 활성의 측정과 동시에, 후보 화합물의 암조직유래-섬유모세포(CAF)에 대한 MTT 분석법을 행하였다. MTT 분석법에 의해 암조직유래-섬유모세포에 대해 독성 작용을 나타내는 화합물은 침윤 저해제 선발에서 제외시켰다.

침윤 저해제로서 최종 선발된 10개의 화합물은 암세포에 대한 특이적인 독성을 나타내거나, 섬유모 세포에서 분비되어 암세포 침윤을 유도하는 사이토카인(cytokine) 또는 키모카인(chemokine)의 분비를 억제하거나 작용을 방해하는 것으로 생각되었다. 이를 확인하기 위해, 상기 선별한 10 개의 화합물에 대하여 암세포, 섬유모 세포와 정상세포 각각에 대한 독성, 섬유모 세포에서 분비되는 사이토카인 중 Monocyte Chemotactic Protein-3 (MCP-3/CCL7), CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α의 분비능에 대한 영향을 다시 조사하였다(데이터 제시하지 않음).

그 결과, 10개의 선발된 화합물들 중에서도 화합물 S06(화학식 6의 화합물)이 암세포에 대한 특이적인 독성을 나타내면서 동시에 섬유모 세포에서 분비되는 키모카인(chemokine)으로서 암세포에 대한 화학주성을 나타내는 것으로 알려진 MCP-3/CCL7의 분비를 저하시키는 작용을 하는 것을 확인하였다(도 2 참조).

MTT 분석법을 통해 SO6 화합물의 세포 생존(cell viability) 저해 작용을 조사한 결과, 구강암 세포주(도 3a - 도 3c), 대장암 세포주(도 4), 폐암 세포주(도 5), 유방암 세포주(도 6), 전립선암 세포주(도 7) 모두의 세포 생존력을 저하시키는 것으로 나타났다. 그러나, 암조직유래-섬유모 세포에서는 50 mM까지 처리(24 시간)해도 생존력이 90％까지 유지되는 것을 확인하였으며(도 8), 정상 상피 세포에 대해서도 20 mM 까지는(24시간) 90% 이상, 80 mM에서도 (24시간) 60% 이상 세포 생존력이 유지되는 것으로 확인하였다(도 9).

또한, 화합물 S06에서 화학식 6의 R 위치가 다른 치환기들로 치환된 유도체 화합물들 SO6-1, SO6-2, SO6-3, SO6-4, SO6-5 (화학 구조는 하기 표 1 참조)의 구강암 세포주 (YD-10B, HSC-2, Ca9.22)에 대한 독성을 측정하였다. 그 결과, 도 10a - 도 10d에 나타낸 바와 같이, 이들 화합물들도 강한 항암활성을 나타내는 것을 확인하였다.

[표 1] 화합물 S06의 유도체 화합물

또한, 하기 [표 2]의 화합물 B50, H39, G35, G14, J49, S14, M17, S17, S20 (화학식 1-5 및 7-10의 화합물)들에 대해 구강암 세포 침윤 억제활성을 측정한 결과 이들 화합물들이 구강암 세포의 침윤을 억제하는 활성을 가짐을 확인하였다(도 11a-도 11f의 결과 참조).

2. 침윤 저해제의 섬유모 세포의 사이토카인 분비능에 미치는 영향

다음으로 화학식 6으로 표시되는 트리아진(triazine) 화합물 S06이 암조직유래-섬유모세포 사이토카인 분비능에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 섬유모세포 배양계에 암세포 배양액(conditioned media)을 첨가함으로써 증가되는 MCP-3/CCL7과 CXCL1/GRO-α의 분비가 화학식 6의 화합물(S06) 처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었으며(도 12 및 도 13 참조), CXCL8/IL-8의 분비는 변화가 없었다(도 14).

CCL7(Chemokine C-C motif ligand 7)은 단핵세포 특이적(monocyte-specific) 키모카인(chemokine) 3 (MCP3)으로도 불려왔으며, CC 키모카인 패밀리에 속하는 사이토카인이다. CCL7는 특히 단핵세포(monocytes)의 화학주성을 유도하며, 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 것으로 알려져 왔다. 몇 가지 암세포주와 대식세포 등이 CCL7을 분비한다고 보고되었으며, 본 발명에 사용된 암세포유래 섬유모세포에서도 암세포의 자극에 의해 CCL7의 분비가 촉진된다. 분비된 CCL7은 암세포의 이동성을 증진시켜 침윤을 촉진하는 것으로 생각된다.

CXCL1 (Chemokine C-X-C motif ligand 1)은 CXC 키모카인 패밀리에 속하는 사이토카인이며, GRO1 oncogene, Neutrophil-activating protein 3 (NAP-3), melanoma growth stimulating activity, alpha (MSGA-α)로도 불리어 왔다. CXCL1을 분비하는 암세포로는 인간 멜라노마 세포(human melanoma cells)이 알려져 있으며, 세포분열특성(mitogenic properties)을 가지고 있고, 멜라노마의 발병(melanoma pathogenesis)에 관여할 것이라고 알려져 왔다. CXCL1는 신생혈관생성(angiogenesis), 염증(inflammation), 상처치료(wound healing), 발 암(tumorigenesis) 등에도 관여하는 등 다양한 활성을 갖는 사이토카인이다. CXCL1은 본 발명에서 사용된 섬유모 세포에서도 분비되며 암세포의 자극에 의해서 분비가 더욱 촉진되며 암세포의 침윤과 성장을 촉진하는 작용을 할 것으로 생각된다.

3. 암세포 아폽토시스(apoptosis)의 유도

본 발명에서 검색된 화학식 1-10 화합물의 암세포에 대한 독성 작용의 메커니즘을 확인하기 위해 검색된 화합물의 암세포에 대한 아폽토시스(apoptosis) 유도능을 검사하였다. 아폽토시스 유도능 검사는 Annexin v/ carboxyfluorescein diacetate 염색 키트로 세포를 염색하는 방법을 통해 하였다. Annexin V는 phosphatidylserine(PS)과 높은 결합도로 결합하는 칼슘의존성 인지질 결합 단백질이다. 세포자살시 초기단계에서 세포막 구조가 망가져 세포 내부에서만 노출되는 phophatydylserine(PS)과 같은 인지질이 세포막 바깥으로 노출되고, Annexin V가 이 노출된 PS와 결합하여, 세포의 아폽토시스 여부를 확인할 수 있다. 실험 결과, S06 처리에 의해 암세포의 아폽토시스가 유도되는 것을 확인하였다(도 15).

결론적으로, 본 발명에서 검색된 화학식 1-10의 화합물은 암세포의 침윤을 억제하고, 아폽토시스에 의한 암세포 선택적 독성 작용을 할 뿐만 아니라, 암세포의 침윤을 촉진시키는 작용을 하는 섬유모세포의 사이토카인들의 분비를 저해함으로써 보다 강력한 암 치료 효과를 보일 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고 문헌

1. Sadlonova A, Novak Z, Johnson MR, et al., Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture. Breast Cancer Res. 2005, 7:R46-59

2. Orimo A, Gupta PB, Sgroi DC, et al., Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell, 2005, 121:335-48

3. Che ZM, Jung TH, Choi JH, et al., Collagen-based co-culture for invasive study on cancer cells-fibroblasts interaction. Biochem Biophys Res Commun 2006, 346:268-75

도 1는 종양-기질 상호작용(tumor-stroma interactions)을 조절하는 저분자의 스크리닝 시스템을 설명하는 도면이다. 침윤 저해제 스크리닝을 위해, 8 μm의 세공 사이즈를 갖는 필터를 콜라겐 타입 I(collagen type I)(45g/30L)으로 코팅하였다. 2 X 10⁴ OSCC 세포들을 다공성 필터를 갖는 트랜스웰(transwell)의 상부 웰(upper well)에 접종하고, 2 X 10⁴ CAF 세포 및 CAF-조건화된 배지(CM) 또는 CCL7을 하부 웰(lower well)에 첨가하였다. 필터를 침투한 세포들을 고정화시키고, 0.25％ 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후에, 광학 현미경하에서 세포를 계수하였다.

도 2는 본 발명의 방법에 의해 스크리닝된 화합물 S06이 CAF-유도된 구강암 세포주 YD-10B의 침윤 및 증식을 억제하고, CAF에 의한 CCL7의 분비를 감소시키는 것을 보여주는 도면이다. 암 세포주(YD-10B)을 다공성 필터(세공 사이즈 8 μm)를 갖는 24-트랜스웰 챔버(transwell chamber)의 상부웰(upper well)에 접종하고, CAF는 하부웰(lower well)에 첨가하였다. 세포의 침윤을 측정하기 위해, 콜라겐 코팅된 트랜스웰 막을 통과한 세포를 고정하고, 염색한 후에, 광학현미경 아래에서 그 수를 측정하였다. 세포 침윤은 광학 현미경에 의해 시각화하였고(도 2의 패널 A(i)), 침윤된 세포를 계수하여 정량화하였다(도 2의 패널 A(ⅱ)). MTT 분석법에 의해, 화합물 SO6를 첨가한 후 48 시간 동안의 구강암 세포주 YD-10B 생존능을 측 정하였다(도 2의 패널 B). 웰당 2.1 X 10⁴의 CAF를 24-웰 플레이트에 접종하고, SO6 (1mM 또는 5mM) 또는 대조군으로서 DMSO로 처리하였다. 24 시간 인큐베이션한 후에, CAF 배양액으로부터 상등액을 회수하고, CCL7 농도를 상업적으로 구입가능한 ELISA Kit를 사용하여 측정하였다(Error = S.D.)(도 2의 패널 C).

도 3a - 도 3c는 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 구강암 세포주 YD10B, HSC-2, HSC-3, 및 Ca9.22에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세포 생존능은 화합물 첨가 후 24시간 (도 3a), 48시간 (도 3b) 및 72시간 (도 3c)에서 측정하였다(Error=S.D.).

도 4는 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 대장암 세포주 HCT-116, DLD-1 및 HT-29에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세포 생존능은 화합물 첨가 후, 24 시간 후에 측정하였다(Error=S.D.).

도 5는 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 폐암 세포주 A549, NCI-H596 및 NCI-H460에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세포 생존능은 화합물 첨가 후 24 시간 후에 측정하였다(Error=S.D.).

도 6은 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 유방암 세포주 MDA- MB-231, MDA-MB-435 및 MCF-7에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세포 생존능은 화합물 첨가 후 24시간 후에 측정하였다(Error=S.D.).

도 7은 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 전립선암 세포주 PC-3에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세포 생존능은 화합물 첨가 후 24시간 (도 7의 패널 A) 및 48 시간(도 7의 패널 B) 후에 측정하였다(Error=S.D.).

도 8는 트리아진 화합물 SO6이 CAF의 생존능에 특별한 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 세포의 생존능은 트리아진 화합물 SO6을 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 mM의 각 농도로 처리한 후 24 시간 또는 48 시간 후에 MTT 분석법에 의해 측정하였다(Error=S.D.).

도 9은 트리아진 화합물 SO6의 구강으로부터 분리한 정상 상피세포들에 대한 세포독성 민감도를 MTT 분석법에 의해 측정한 결과를 보여준다(Error=S.D.).

도 10a - 도 10e는 트리아진 화합물 SO6의 유도체인 S06-1 내지 S06-5 화합물의 구강암 세포에 대한 암세포 독성 효과를 보여준다.

도 11a - 도 11f는 화학식 1-5 및 화학식 7-10으로 표시되는 화합물들의 대 표화합물 B50, H39, G35, G14, J49, S14, M17, S17, S20들의 본 발명의 방법에 의한 구강암 세포 침윤 억제활성을 측정한 결과이다. 이 결과에 의하면 이들 화합물들이 구강암세포 침윤을 억제하는 활성을 가짐을 확인할 수 있다.

도 12는 YD-10B 세포주로부터 조절 배지(conditioned media)를 회수하여 트리아진 화합물 S06의 존재(1mM, 2.5mM 또는 5mM) 또는 부존재하에 CCL7 분비 유도를 위해 24-웰 플레이트내의 CAF 배양에 첨가한 결과를 보여준다. 24시간 후에, 각 배지로부터 상등액을 회수하여 CAF 배지에서의 CCL7 농도를 ELISA에 의해 측정하였다(Error=S.D.).

도 13는 YD-10B 세포주로부터 조절된 배지(conditioned media)를 회수하여 트리아진 화합물 S06의 존재(1mM, 2.5mM 또는 5mM) 또는 부존재하에 CXCL1 분비 유도를 위해 24-웰 플레이트내의 CAF 배양에 첨가한 결과를 보여준다. 24시간 후에, 각 배지로부터 상등액을 회수하고, CAF 배지에서의 CXCL1 농도를 ELISA에 의해 측정하였다(Error=S.D.).

도 14는 YD-10B 세포주로부터 조절된 배지(conditioned media)를 회수하여 트리아진 화합물 S06의 존재(1mM, 2.5mM 또는 5mM) 또는 부존재하에 IL-8 분비 유도를 위해 24-웰 플레이트내의 CAF 배양에 첨가한 결과를 보여준다. 24시간 후에, 각 배지로부터 상등액을 회수하고, CAF 배지에서의 IL-8 농도를 ELISA에 의해 측정 하였다(Error=S.D.).

도 15는 S06 처리에 의해 구강암 세포의 아폽토시스(apoptosis)가 유도되는 결과를 보여 준다. 구강암 세포주(YD-10B)에 S06를 10mM 농도 (최종 농도)로 처리하고 12 시간 후에 annexin V/ carboxyfluorescein diacetate 염색 키트로 세포를 염색하여 아폽토시스를 측정하였다. CDF: Carboxyfluorescein diacetate

Claims

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하기 화학식 1 내지 10 중 어느 하나의 화학식으로 표시되는 트리아진 화합물을 유효성분으로 포함하는 암세포의 침윤 또는 전이 억제용 조성물.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

단, 상기 화학식 1 - 10 에서, 상기 치환기 R₁ 및 R₂ 를 포함하는 -N R₁R₂그룹은 하기 그룹 중 어느 하나이다.

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제 3 항에 있어서, 상기 트리아진 화합물은 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 암세포의 침윤 또는 전이 억제용 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 화학식 6에서 상기 치환기 R₁ 및 R₂ 를 포함하는 -N R₁R₂그룹은 하기 그룹 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암세포의 침윤 또는 전이 억제용 조성물.

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제 3 항에 있어서, 상기 암은 구강암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암 및 요관암으로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 암세포의 침윤 또는 전이 억제용 조성물.
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