JP6996720B2 - フラビウイルス感染に対する抗ウイルス治療 - Google Patents
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Description
フラビウイルス属ウイルスは、主に節足動物ウイルスであり、しばしば哺乳動物および鳥類において有意な罹患率および死亡率を引き起こす(非特許文献1)。JEVはアジアの南および東南地方に分布し、ブタまたは鳥類と蚊との間で人畜共通感染している(非特許文献1、2)。
このように、期待される治療成績が得られているものの、フラビウイルス感染症対策として、決定的な治療薬が無いのが、現状である。
<抗ウイルス医薬組成物>
[1]
生物学的細胞における核小体の形態に影響を与える物質を含む抗フラビウイルス医薬組成物。
[2]
生物学的細胞における核小体の形態に影響を与える物質を、抗フラビウイルス活性を有する有効成分として含む、[1]記載の抗フラビウイルス医薬組成物。
[3]
生物学的細胞における核小体の形態に影響を与える物質が、核小体の形態異常を引き起こす物質である、[1]または[2]記載の医薬組成物。
[4]
生物学的細胞における核小体の形態に影響を与える物質が、ウイルスのコアタンパク質の生物学的細胞における局在変化をも伴う、[1]から[3]のいずれか記載の医薬組成物。
[5]
生物学的細胞における核小体の形態に影響を与える物質が、ウイルス複製阻害を引き起こす、[1]から[4]のいずれか記載の医薬組成物。
抗フラビウイルス活性について、フラビウイルスが日本脳炎ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルスの中から選ばれる抗フラビウイルス活性である、[1]から[5]のいずれか記載の医薬組成物。
[7]
生物学的細胞における核小体の形態に影響を与える物質が、CDK阻害活性を有する物質、rRNA転写阻害活性を有する物質、DNAトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質、またはGSK-3阻害活性を有する物質である、[1]から[6]のいずれか記載の医薬組成物。
[8]
CDK阻害活性を有する物質が、2-シアノエチルアルステロパウロン、5-アミノ-3-((4-(アミノスルフォニル)フェニル)アミノ)-N-(2,6-ジフルオロフェニル)-1H-1,2,4-トリアゾール-1-カルボチオアミド、(4-(2-アミノ-4-メチルチアゾール-5-イル)ピリミジン-2-イル)-(3-ニトロフェニル)アミン、P276-00、A-674563、SU9516、SNS-032 (BMS-387032)、ディナシクリブ、フラボピリドール、AT7519、フラボピリドール塩酸、AT7519 HCl、AZD5438、R547、およびケンパウローンの中から選ばれる、[7]記載の医薬組成物。
[9]
CDK阻害活性を有する物質が、2-シアノエチルアルステロパウロン、5-アミノ-3-((4-(アミノスルフォニル)フェニル)アミノ)-N-(2,6-ジフルオロフェニル)-1H-1,2,4-トリアゾール-1-カルボチオアミド、および(4-(2-アミノ-4-メチルチアゾール-5-イル)ピリミジン-2-イル)-(3-ニトロフェニル)アミンの中から選ばれる、[8]記載の医薬組成物。
rRNA転写阻害活性を有する物質がアクチノマイシンD、ドキソルビシン、およびアクラルビシンの中から選ばれる、[7]記載の医薬組成物。
[11]
DNAトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質が、ドキソルビシン、アクラルビシン、エリプチシン、イダルビシン、イダルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩、およびダウノルビシン塩酸塩の中から選ばれる、[6]記載の医薬組成物。
[12]
DNAトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質が、ドキソルビシン、アクラルビシン、およびエリプチシンの中から選ばれる、[11]記載の医薬組成物。
[13]
GSK-3阻害活性を有する物質が、1-アザケンパウロンである、[7]記載の医薬組成物。
[14]
以下の工程を含む、抗フラビウイルス活性を有する物質をスクリーニングする方法:
(a)生物学的細胞を、抗フラビウイルス活性を有する物質の候補化合物とインビトロで接触させ、
(b)前記候補化合物が、前記生物学的細胞における核小体の形態に対し、影響を与えるか調べ、
(c)前記候補化合物が、影響を与えていれば、抗フラビウイルス活性を有する物質として同定する、方法。
[15]
工程(c)において、前記候補化合物による影響が、生物学的細胞において核小体の形態異常である、[14]記載の方法。
[16]
生物学的細胞における核小体の形態異常を、核小体に局在するタンパク質または核酸の形成および/または局在の変化によって判別する、[14]または[15]記載の方法。
核小体に局在するタンパク質の形成および/または局在の変化が、核小体に局在するタンパク質における対照化合物の影響と比較する変化である、前記候補化合物が核小体の形態に対し、影響を与えると判断する、[16]記載の方法。
[18]
生物学的細胞において核小体に局在するタンパク質が、ネクロフォスミン、ヌクレオリン、フィブリラリン、RNAポリメラーゼIおよびフラビウイルスのコアタンパク質、のなかから選ばれる一つまたはそれ以上のタンパク質である、[14]から[17]のいずれか記載の方法。
[19]
生物学的細胞が、肝臓由来のHuh7細胞などヒトを含む真核生物由来の培養細胞株、初代培養細胞、サル腎由来Vero細胞など霊長類由来の細胞株、C6/36細胞など蚊より樹立された細胞である、[14]から[18]のいずれか記載の方法。
特に、JEV、YFV、TBEV感染症に対するヒト用の認可ワクチンは存在するが、それぞれ年間数千~数万例以上の患者が現在でも世界で報告されている。フラビウイルスはヒト以外の動物が保有・増幅宿主となること、感染蚊あるいは感染ダニとの接触を完全に絶つことは困難であるため、特異的治療法やワクチンの開発は重要課題である。
本発明によれば、新たな抗フラビウイルス治療薬を作成することができ、新たな治療物質を提供することができる。
本発明は一つの態様として、以下の工程を含む、抗フラビウイルス活性を有する物質をスクリーニングする方法:
(a)生物学的細胞を、抗フラビウイルス活性を有する物質の候補化合物とインビトロで接触させ、
(b)前記候補化合物が、前記生物学的細胞における核小体の形態に対し、影響を与えるか調べ、
(c)前記候補化合物が、影響を与えていれば、抗フラビウイルス活性を有する物質として同定する、方法を提供する。以下、具体的に説明する。
「フラビウイルス」という用語は、プラス鎖RNAをゲノムとするエンベロープウイルスで構成されるフラビウイルス科フラビウイルス属のウイルスを意味し、現在知られている70種以上のウイルスを包含する。例えば、蚊媒介性フラビウイルスとしては、日本脳炎ウイルス(JEV)、デングウイルス(DENV)、ジカウイルス(ZIKV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、黄熱ウイルス(YFV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、クンジンウイルス(KUN)、マレーバレー脳炎(MVEV)などがあり、ダニ媒介性フラビウイルスとしては、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)などが挙げられる(Gubler DJ, Kuno G, Markoff L: Flaviviruses. In: Fields virology (Fifth edition). Knipe DM, Howley PM (Ed), Lippincott-Raven, Philadelphia, PA, 1153-252, 20071)。この他、媒介動物不明のフラビウイルスが14種報告されている。
JEVは、JEVが感染した蚊が刺咬することによりヒトを含む行き止まり宿主に広がり、死亡率の高い中枢神経系の感染を引き起こす(Burke, D. S., and T. P. Monath. 2001. Flaviviruses, p. 1043-1125. In D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, R. A. Lamb, M. A. Martin, B. Roizman, and S. E. Straus (ed.), Fields virology, 4th ed., vol. 1. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa)。JEVは、約11kbの長さの一本鎖プラス鎖RNAゲノムを有し、これは5’末端でキャップされるが、ポリアデニル化によって3’末端の修飾を欠いている(Lindenbach, B. D., and C. M. Rice. 2001. Flaviviridae: The viruses and their replication, p. 991-1041. In D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, R. A. Lamb, M. A. Martin, B. Roizman, and S. E. Straus (ed.). Fields virology, 4th ed., vol. 1. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)。ゲノムRNAは単一の大きなオープンリーディングフレームをコードし、ゲノムから翻訳されたポリタンパク質は宿主およびウイルスプロテアーゼによって翻訳と同時および翻訳後に切断され、コア、前駆膜(prM)およびエンベロープ(E)タンパク質の3つの構造タンパク質、ならびにNS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4BおよびNS5の7つの非構造タンパク質を生じる(Sumiyoshi, H., et al. Virology 161:497-510)。JEVのコアタンパク質(別名、Cタンパク質またはカプシドタンパク質)は他のフラビウイルスとのアミノ酸相同性は殆どなく、例えばダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)とは僅か25%の相同性しかなく、一方で、疎水性プロファイル、塩基性アミノ酸残基の数や二次構造は非常によく類似している(Dokland, T., et al. Structure 12:1157-1163.;Jones, C. T., et al. J. Virol. 77:7143-7149.;Ma, L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:3414-3419)。フラビウイルスのコアタンパク質は共通して、中央およびカルボキシル末端に2つの疎水性配列を含み、カルボキシル末端疎水性領域はprMのシグナル配列として働く。シグナルアンカー配列は、ウイルスプロテアーゼNS2B-3によって切断され、この切断は、宿主シグナルペプチダーゼによるprMアミノ末端のその後の遊離のために必要である(Lobigs, M., and E. Lee. 2004. J. Virol. 78: 178-186;Stocks, C. E., and M. Lobigs. 1998. J. Virol. 72:2141-2149;Yamshchikov, V. F., and R. W. Compans. 1994. J. Virol. 68:5765-5771)。小胞体(ER)膜から放出された成熟コアタンパク質は、アミノ末端およびカルボキシル末端の塩基性アミノ酸クラスターを介してゲノムRNAに結合し、ヌクレオキャプシドを形成すると考えられる(Khromykh, A. A., and E. G. Westaway. 1996. Kunjin. Arch. Virol. 141:685-699)。コアタンパク質の中央の疎水性領域はER膜と関連している可能性があり、この相互作用はヌクレオキャプシドと2つの膜タンパク質prMおよびEとのアッセンブリーを促し、ビリオンとしてER内腔に出芽すると考えられる(Markoff, L., B. Falgout, and A. Chang. 1997. Virology 233:105-117)。TBEVコアタンパク質の中央疎水性領域が除去すると、(pr)MおよびEタンパク質からなるが、コアタンパク質およびゲノムRNAを欠くサブウイルス粒子の産生が増大する(Kofler, R. M., F. X. Heinz, and C. W. Mandl. 2002. J. Virol. 76:3534-3543.;Kofler, R. M., et al. 2003. J. Virol. 77:443-451.)。
(b)前記候補化合物が、前記生物学的細胞における核小体の形態に対し、影響を与えるか調べ、
(c)前記候補化合物が、影響を与えていれば、抗フラビウイルス活性を有する物質として同定する。具体的には、工程(c)において、前記候補化合物による影響が、生物学的細胞における核小体の形態異常である。
フラビウイルスはウイルス複製機能の一端として、構成タンパク質のひとつであるコアタンパク質が宿主細胞の核小体機能を活用しており、それがウイルス複製に必須であると考えられる。本発明においては、特定の理論に囚われるものでないが、核小体の形態異常がコアタンパク質の機能発揮に悪影響を与えていることが考えられる。核小体はリボソームRNA(rRNA)の転写やリボソームの合成場所であり、正常状態であれば、コアタンパク質が核小体に局在することにより宿主のタンパク質合成に関わっている。たとえば、正常な核小体は、ウイルス由来のタンパク質の合成促進または宿主細胞のタンパクの合成抑制によって、相対的にウイルスタンパク質の翻訳を亢進させていることが想定される。本発明において見出された、ある種の物質における核小体の形態への影響は、この正常な核小体機能を低減あるいは破壊する作用に由来すると考えられる。
核小体に局在するタンパク質または核酸の存在および/または局在の変化とは、対照化合物の影響と比較して見出される、核小体そのものの形成状態における変化を代替するものである。核小体に局在するタンパク質または核酸の存在および/または局在の変化は、核小体が大きな塊から、多くの小さな油滴状に変化する、あるいは極小の粒が分散し見えなくなる、あるいは逆に核小体の塊がさらに大きな塊になる等によって判別される。核小体に局在するタンパク質における対照化合物の影響と比較して、このような変化があれば、候補化合物が核小体の形態に対し、影響を与えると判断する。
ネクロフォスミンとは、核小体構造の最も外側に位置している顆粒性要素(GC)領域に存在するリボ核酸(RNA)に結合するタンパク質である。ヌクレオリンとは、主に核小体の高密度線維性要素(DFC)に局在し、リボソームデオキシリボ核酸(rDNA)の転写などに関わるタンパク質である。フィブリラリンとは、核小体の線維性要素(FC)、高密度線維性要素(DFC)に局在し、RNAと結合して,rRNA前駆体のプロセッシングや修飾に機能するタンパク質である。RNAポリメラーゼIとは、DNAの鋳型鎖(一本鎖)の塩基配列を読み取って相補的なRNAを合成する反応(転写)を触媒する酵素(RNAポリメラーゼ)のひとつである。RNAポリメラーゼIは核小体に存在してrRNA前駆体を合成する。
これらrDNAの存在および/または局在の変化はFISH(Fluonecsence In Situ Hybridization)法で観察できる。FISH法とは、たとえばrDNAの特定の遺伝子配列を蛍光物質などで標識したオリゴヌクレオチドプローブを用い、目的の遺伝子とハイブリダイゼーションさせ蛍光顕微鏡で検出する手法である。
フラビウイルスのコアタンパク質は、リポフェクトアミン(ThermoFisher)など遺伝子導入試薬により細胞内で発現させる、もしくは大腸菌や昆虫細胞から精製した組み換えタンパク質をガラス針を用いてマイクロインジェクションすることによって生物学的細胞の細胞質に注入し、その局在を観察する。フラビウイルスのコアタンパク質は、コアタンパク質をコードするDNAを組み込んだプラスミドを大腸菌やバキュロウイルスに遺伝子導入し、大腸菌の場合はその菌体内で、バキュロウイルスの場合はsf9昆虫細胞に感染し昆虫細胞中で発現させ、菌体、昆虫細胞を破砕して発現したタンパク質と特異的な抗体やグルタチオン-S-トランスフェラーゼといったタグタンパク質をそれに対する特異的な結合タンパク質を架橋したセファローズビーズで吸着、精製して製造することができる。
フラビウイルスのコアタンパク質の局在の変化は、例えば、抗フラビウイルス抗体やFlagタグなどを融合したコアタンパク質に対する抗Flag抗体などを用いた免疫蛍光抗体法、GFPなどの蛍光タンパク質を融合した融合タンパク質を発現、もしくは導入した細胞を蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、超解像顕微鏡、電子顕微鏡などによって、観察できる。
(1)生物学的細胞を、抗フラビウイルス活性を有する物質の候補化合物とインビトロで接触させ、前記候補化合物が前記生物学的細胞における核小体の形態に影響を与えるのに十分な条件下および時間にわたりインキュベートし、
(2)前記候補化合物が、前記生物学的細胞における核小体の形態に対し、影響を与えるか調べ、
(3)影響を与えている前記候補化合物を、抗フラビウイルス活性を有する物質として同定する。前記生物学的細胞における核小体の形態に影響を与える候補化合物が、潜在的な抗フラビウイルス薬物として同定される。
(1)生物学的細胞を、抗フラビウイルス活性を有する物質の候補化合物とインビトロで接触させ、前記候補化合物が前記生物学的細胞における核小体の形態に影響を与えるのに十分な条件下および時間にわたりインキュベートし、
(2)前記候補化合物が、前記生物学的細胞における核小体の形態に対し、影響を与えるか調べ、
(3)影響を与えている前記候補化合物を選別し、さらに
(4)選別された前記候補化合物について、ウイルスのコアタンパク質の生物学的細胞における局在変化を調べ、
(5)核小体の形態への影響とともに、コアタンパク質の局在も変化していれば、抗フラビウイルス活性を有する物質として同定する。
本発明は、別の態様として、生物学的細胞における核小体の形態に影響を与える物質を含む抗フラビウイルス医薬組成物、好ましくは生物学的細胞における核小体の形態に影響を与える物質を、抗フラビウイルス活性を有する有効成分として含む、抗フラビウイルス医薬組成物、具体的には核小体の形態異常を引き起す物質を含む抗フラビウイルス医薬組成物、好ましくは核小体の形態異常を引き起す物質を、抗フラビウイルス活性を有する有効成分として含む、抗フラビウイルス医薬組成物を提供する。以下、具体的に説明する。
「フラビウイルス」という用語は前述の意義を有し、「抗フラビウイルス」または「抗フラビウイルス活性」なる用語は互換可能に使用され、フラビウイルスの複製、細胞への侵入および/または細胞のフラビウイルス感染を低下、阻害、遮断または予防する、結果的にフラビウイルスの生活環を抑制、阻害し、ウイルス活性を消滅、低減させるあらゆる効果を意味する。
アクラルビシン(同上);
フラビウイルスコアタンパク質を細胞に発現させ、その局在を調べた。
参考例1-1:一過性培養細胞発現プラスミドの構築
日本脳炎ウイルス(JEV)、デングウイルス(DENV)、ジカウイルス(ZIKV)のコア(core)タンパク質cDNAは、国立感染症研究所より分与を受けた。ウエストナイルウイルス(WNV)のcoreタンパク質cDNAは、Integrated DNA Technologies(IDT, Inc., Illinois)で受託合成した。それぞれのcoreタンパク質cDNAを、下記プライマーを用いてPCR反応により増幅し、増幅した各cDNAを、Flag-tagを含むpCAGGSベクター(Miyazaki et al., (1989)Gene. 79: 269-77)のEcoRI部位にIn-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio Inc. Japan)を用いて組み込みこみ、pCAGGS/flag-JEVcore、pCAGGS/flag-DENVcore、pCAGGS/flag-ZIKAcoreおよびpCAGGS/flag-WNVcoreを構築した。
Fw GCTGTACAAGCTCGAGATGACTAAAAAACCAGGAGG(配列番号:1)
Rv ACAGGTTTTCCTCGAGTCTTTTGTTTTGCTTTCTGC(配列番号:2)
DENV core:
Fw GCTGTACAAGCTCGAGATGAATAACCAACGGAAAAA(配列番号:3)
Rv ACAGGTTTTCCTCGAGTCTGCGTCTCCTATTCAAGA(配列番号:4)
ZIKV core:
Fw GCTGTACAAGCTCGAGATGAAAAACCCAAAGAAGAA(配列番号:5)
Rv ACAGGTTTTCCTCGAGACGTCTCTTCCTCTCTTTCC(配列番号:6)
WNV core:
Fw GCTGTACAAGCTCGAGATGTCTAAGAAACCAGGAGG(配列番号:7)
Rv ACAGGTTTTCCTCGAGTCTTTTCTTTTGTTTTGAGC(配列番号:8)
肝細胞がんHuh7細胞(国立感染症研究所より分与)は、ダルベッコ改変イーグル培地(含10% 牛胎児血清、100 μg/mLペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン)中で、37 ℃、5% CO2下で培養した。1 x 105個のHuh7細胞を15 mm丸形マイクロカバーガラス(Matsunami, Japan)を入れた35 mm dish(IWAKI, Japan)に播種し24時間培養後、pCAGGS/flag-JEVcore, pCAGGS/flag-DENVcore, pCAGGS/flag-ZIKAcore, pCAGGS/flag-WNVcoreそれぞれをTransIT-LT1 Transfection Reagent(Mirus Bio LLC, WI)を用いて導入した。24時間後、細胞を4% パラホルムアルデヒドで固定した後、0.5% Triton-X100 で5 分間処理した。1000倍希釈した抗Flag-tag抗体(SIGMA)で 60分インキュベートした後、PBSで洗浄後、2000倍希釈した抗マウス二次抗体(invitrogen)を加え 60分インキュベートした。PBSで洗浄した後、蛍光顕微鏡(olympus)により観察した。得られた結果を図1(A)に示す。細胞核はDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩、DOJINDO, Japan、終濃度0.2 μg/mL)で染色した。Flag(上段)は、検討したコアタンパク質(JEV core, DENV core, ZIKV core, WNV core)の細胞内局在を示す。どのタンパク質も細胞質と核内(核小体)に局在することがわかる。DAPI(下段)はゲノムDNA(細胞核)を示す。
参考例1-1と同様、JEV、DENV、ZIKVおよびWNVそれぞれのコアタンパク質cDNAをPCRにより増幅し、N末端にAcGFP(Clontech)を、C末端にFLAG-One-STrEP(FOS)tag(Kouwaki T, et al.(2016) Journal of virology 90: 3530-3542)を融合した形でバキュロウイルス発現ベクターpFastBac1(Thermo Fisher Scientific Inc, MA)のEcoRI部位にIn-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio Inc., Japan)を用いて組み込み、pFastBac1/AcGFP-JEVcore-FOS、pFastBac1/AcGFP-DENVcore-FOS、pFastBac1/AcGFP-ZIKAcore-FOSおよびpFastBac1/AcGFP-WNVcore-FOSを構築した。
AcGFP-JEVコアとインジェクションマーカーである抗マウス2次抗体(Alexa Fluor Plus 555, Thermo Fisher Scientific Inc.)を混和し、Huh7細胞の細胞質にマイクロインジェクションした。30分間インキュベーション後、細胞を固定し、抗ネクロフォスミン抗体(抗NPM1抗体)(ab10530, Abcam, UK)を用いた免疫蛍光抗体法を行った。二次抗体は抗マウス2次抗体(Alexa Fluor 645, Thermo Fisher Scientific Inc.)を使用し、ゲノムDNA(細胞核)はDAPIで染色した。
得られた結果を図1(C)に示す。図中、Injection markerは、インジェクションマーカーであるAlexa Fluor Plus 555マウスIgGの蛍光が細胞質に存在することを表している。これは、インジェクションマーカーが打ち込まれた細胞質に留まっており、核には移行しないことを示している。JEV coreは、Alexa Fluor Plus 555マウスIgGとともに細胞質にマイクロインジェクションされたJEVコアタンパク質が核小体マーカーであるNPM1と共局在することを表している。これは、JEVコアタンパク質が核に移行し、核小体に局在する活性があることを示している。NPM1およびDAPIはそれぞれ、核小体とゲノムDNA(細胞核)の存在を示している。
JEV coreの細胞内局在変化を指標とする、抗フラビウイルス活性を有する物質のスクリーニング
JEV coreの細胞内局在変化を示す細胞核内に存在するGFP蛍光(緑色)面積を指標に、抗フラビウイルス活性を有する物質のスクリーニングを行った。
実施例1-1:JEVコアタンパク質の安定発現細胞株の作製
参考例1-1と同様に、PCR反応により増幅したJEVcore遺伝子cDNAを、スーパーフォルダーGFP-11(sfGFP11)を含むレンチウイルスベクターpLV-CAG(Okada Y, et al.(2007)Nat. Biotechnol 25: 233-237)のEcoRI部位にIn-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio Inc.)を用いて組み込み、安定発現細胞株作成用プラスミドpLV-CAG/sfGFP-JEVcoreを構築した。sfGFP1-10-SV40NLS遺伝子cDNAはIntegrated DNA Technologies(IDT, Inc., Illinois)で受託合成し、IRES(mRNA内部のリボソーム進入部位)配列下にネオマイシン耐性遺伝子とともにレンチウイルスベクターpFUGW(Addgene, plasmid #14883)の EcoRI部位にIn-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio Inc.)を用いて組み込み、プラスミドpFUGW/sfGFP1-10-SV40NLSを構築した。
実施例1-1にて作製したsfGFP-JEVcore安定発現Huh7細胞1 x 104個を96-well マイクロプレート(Greiner bio-one)に播種し、37 ℃、5% CO2インキュベータで24時間培養した後、標準阻害剤キット3 ver1.5(表1:キナーゼ阻害剤キット, 文部科学省新学術領域研究「がん研究分野の特性等を踏まえた支援活動」化学療法基盤支援活動(https://scads.jfcr.or.jp/kit/kit.html))の低分子化合物をそれぞれ終濃度1 μMとなるよう培地に加え、さらに24時間培養した。
培養後、細胞をPBSで洗浄した後、3.7%ホルマリン溶液で15分インキュベートして細胞を固定し、ゲノムDNA(細胞核)を(DOJINDO, Japan、終濃度0.2 μg/mL)で染色した。プレートをハイスループット細胞機能探索システム CV7000S(横河電機株式会社)にかけ、1つのウエルにつき3点の蛍光写真を撮影してGFPの蛍光強度、細胞内局在を解析した。
・2-シアノエチルアルステロパウロン:3-(6-オキソ-9-ニトロ-5,6,7,12-テトラヒドロインドロ[3,2-d][1]ベンズアゼピン-2-イル)プロピオンニトリル(Kunick, C., et al. 2005. ChemBioChem. 6, 541-549.)
・Cdk1/2 阻害物質III:5-アミノ-3-((4-(アミノスルフォニル)フェニル)アミノ)-N-(2,6-ジフルオロフェニル)-1H-1,2,4-トリアゾール-1-カルボチオアミド(Lin, R., et al. 2005. J. Med. Chem. 48, 4208-4211.)
・Cdk2/9阻害物質:(4-(2-アミノ-4-メチルチアゾール-5-イル)ピリミジン-2-イル)-(3-ニトロフェニル)アミン(Kontopidis, G., et al. 2006. Chem. Biol. 13, 201.)
実施例1-1にて作製したsfGFP-JEVcore安定発現Huh7細胞1 x 105個を15 mm丸形マイクロカバーガラス(Matsunami, Japan)を入れた35 mm dish(IWAKI, Japan)を24時間培養したのち、終濃度1 μMとなるよう、CDK阻害物質(Selleck Customized Library of 30 compounds: Cherry Pick Library (96-well)-L2000-Z237098-100uL(Selleck.co.jp, Japan、表2))を加え、さらに24時間培養した。
1 x 105個のHuh7細胞を15 mm丸形マイクロカバーガラス(Matsunami, Japan)を入れた35 mm dish(IWAKI, Japan)を24時間培養後、参考例1-1で作製したpCAGGS/flag-JEVcore をTransIT-LT1 Transfection Reagent(Mirus Bio LLC, WI)を用いて導入しさらに24時間後、終濃度1 μMとなるよう、CDK阻害剤(Selleck Customized Library of 30 compounds(Selleck.co.jp, Japan、表2参照))を加えさらに24時間培養した。培養後、参考例1-2にて行った免疫抗体法により細胞を固定、染色した。JEVcore(Flag-core)の核小体局在が変化したCDK阻害剤を表2に示す。
Cdk1/2 阻害物質IIIによる核小体の形態変化
実施例1において、3種のCDK阻害物質、2-シアノエチルアルステロパウロン、Cdk1/2 阻害物質IIIおよびCdk2/9阻害物質が実際に蛍光面積を小さくすることを示した。
使用している細胞は、コアタンパク質がすでに核内(核小体)に存在しているsfGFP-JEVcore安定発現細胞株であり、ここでは、この細胞株に、後からCDK阻害物質を加えている。コアタンパク質の局在がどのような作用で変化しているかを調べるため、以下の実験を行った。
実施例2-1:Cdk1/2 阻害物質III処理による核小体形態異常
Huh7細胞を終濃度1 μMのCdk1/2 阻害物質III存在下で24時間培養後、抗NPM1抗体による免疫蛍光抗体を行った。二次抗体は抗マウス2次抗体(Alexa Fluor 645)を使用し、ゲノムDNA(細胞核)はDAPIで染色した。得られた結果を図3(A)に示す。
DMSO処理(上段左から1枚目図NPM1染色(x40対物レンズ使用)および同上段左から2枚目図NPM1染色(強拡大図)、対照)とCdk1/2 阻害物質III処理(上段左から3枚目図NPM1染色(x40対物レンズ使用)および同上段左から4枚目図NPM1染色(強拡大図)、阻害物質処理)とを比較すると、NPM1の局在が対照では核内の大きくて明確な核小体に局在するのに対し、阻害物質処理では、核質全体と小さな構造体に存在していることが分かる。核質の判別はDAPIによるゲノムDNA染色から分かる(下段図4枚、上段のNPM1染色と同じ細胞を示している)。NPM1は核小体特異的なマーカータンパク質であることから、核内の小さな構造体は核小体であるといえる。以上のことから、Cdk1/2 阻害物質III処理により、核小体の形態異常が生じていることが判明した。
2 x 104個のHuh7細胞を15 mm丸形マイクロカバーガラス(Matsunami)を入れた12ウエルプレートに播種し、37 ℃の5% CO2インキュベータ中で24時間培養した。培養後、終濃度1 μMとなるよう2-シアノエチルアルステロパウロ(標準阻害剤キット3 ver1.5(キナーゼ阻害剤キット))を培地に加え24時間培養した。バキュロウイルスより精製したAcGFP-JEV core組換えタンパク質 (終濃度100 ug/mL)をインジェクションマーカーであるヤギ抗-マウスIgG (H+L) high cross-adsorbed 2次抗体Alexa Fluor Plus 555(Thermo Fisher Scientific Inc, 終濃度100 ug/mL)と混和し、ガラス針を用いてHuh7の細胞質にマイクロインジェクションした。37 ℃の5% CO2インキュベータ中で30分培養した後、3.7%ホルマリン溶液で15分インキュベートして細胞を固定した。細胞をPBSで洗浄した後、DAPI溶液(終濃度0.2 ug/mL))を加えて室温で20分間インキュベートしてゲノムDNA(細胞核)を染色した。細胞の観察は共焦点顕微鏡TCS SP8(Leica)を用いて行った。
特定されたCDK阻害物質によるJEVの複製抑制
3 x 104個のHuh7細胞を24ウエルプレートに播種し、37 ℃の5% CO2インキュベータ中で24時間培養した。その後、JEV(AT31株)を細胞に感染多重度(multiplicity of infection;Moi)=1で2時間感染させた。JEV感染Huh7細胞をPBSで洗浄し、3種のCDK阻害物質Cdk1/2阻害物質III、Cdk2/9 阻害物質および2-シアノエチルアルステロパウロンを含む培地で24時間培養した。感染力価と細胞生存率は、それぞれフォーカスフォーミングアッセイと、CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay kit(Promega Corporation, WI)により解析した。
rRNA転写阻害活性を有する物質による核小体の形態変化
rRNA転写阻害剤を処理することにより、生物学的細胞における日本脳炎ウイルスコアタンパク質の核小体局在が変化しているかを調べるため、以下の実験を行った。
使用している細胞は、実施例1-1にて作製したsfGFP-JEVcore安定発現Huh7細胞株であり、1 x 104個を96-well マイクロプレート(Greiner bio-one)に播種し、37 ℃、5% CO2インキュベータで24時間培養した後、終濃度1 μMとなるようrRNA転写阻害物質アクチノマイシンD、ドキソルビシンおよびアクラルビシンを加えさらに24時間培養した。
培養後、細胞をPBSで洗浄した後、3.7%ホルマリン溶液で15分インキュベートして細胞を固定し、ゲノムDNA(細胞核)を(DOJINDO, Japan、終濃度0.2 μg/mL)で染色した。プレートをハイスループット細胞機能探索システム CV7000S(横河電機株式会社)にかけ、1つのウエルにつき3点の蛍光写真を撮影してGFPの蛍光強度、細胞内局在を解析した。
GSK-3阻害活性を有する物質によるフラビウイルス増殖抑制
GSK-3阻害剤ライブラリー(https://www.selleck.co.jp/GSK-3.html)から入手される低分子化合物を、抗フラビウイルス活性を有する候補物質として使用する以外は、実質的に実施例1の手法に従い、スクリーニングを行った。
得られた結果を図6(A)に示す。これにより1-アザケンパウロンが、GFP蛍光強度を抑制することが判明した。
3 x 104個のHuh7細胞を24ウエルプレートに播種し、37 ℃の5% CO2インキュベータ中で24時間培養した。その後、日本脳炎ウイルス(JEV, AT31株)、デングウイルス(DENV, H241株) 、ジカウイルス(ZIKV, MR766株)を細胞に感染多重度(multiplicity of infection;Moi)=1で2時間感染させた。感染Huh7細胞をPBSで洗浄し、1-アザケンパウロン(終濃度1μM)を含む培地で24時間培養した。感染力価は、フォーカスフォーミングアッセイ(実施例3参照)により解析した。
実施例6
抗フラビウイルス活性を有する物質のさらなるスクリーニング
LOPAC1280 (京都大学大学院薬学研究科から分与)およびFDA-approved Drug Library(大阪大学薬学研究科から分与)から入手される低分子化合物を、抗フラビウイルス活性を有する候補物質として使用する以外は、実質的に実施例1の手法に従い、スクリーニングを行った。
これにより、DNAトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質:エリプチシン、イダルビシン、イダルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩およびダウノルビシン塩酸塩が、GFP蛍光強度を抑制することが判明した。
使用している細胞は、実施例1-1にて作製したsfGFP-JEVcore安定発現Huh7細胞株であり、1 x 104個を96-well マイクロプレート(Greiner bio-one)に播種し、37 ℃、5% CO2インキュベータで24時間培養した後、終濃度1 μMとなるようDNAトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質エリプチシン、イダルビシン、イダルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩およびダウノルビシン塩酸塩を加え、さらに24時間培養した。
培養後、細胞をPBSで洗浄した後、3.7%ホルマリン溶液で15分インキュベートして細胞を固定し、ゲノムDNA(細胞核)を(DOJINDO, Japan、終濃度0.2 μg/mL)で染色した。プレートをハイスループット細胞機能探索システム CV7000S(横河電機株式会社)にかけ、1つのウエルにつき3点の蛍光写真を撮影してGFPの蛍光強度、細胞内局在を解析した。
Claims (14)
- CDK阻害活性を有する物質を有効成分として含む抗フラビウイルス医薬組成物であって、CDK阻害活性を有する物質が、2-シアノエチルアルステロパウロン、5-アミノ-3-((4-(アミノスルフォニル)フェニル)アミノ)-N-(2,6-ジフルオロフェニル)-1H-1,2,4-トリアゾール-1-カルボチオアミド、および(4-(2-アミノ-4-メチルチアゾール-5-イル)ピリミジン-2-イル)-(3-ニトロフェニル)アミンの中から選ばれる、医薬組成物。
- 抗フラビウイルス活性について、フラビウイルスが日本脳炎ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルスの中から選ばれる抗フラビウイルス活性である、請求項1記載の医薬組成物。
- 前記フラビウイルスが、デングウイルスである、請求項2記載の医薬組成物。
- 抗フラビウイルス医薬組成物の製造におけるCDK阻害活性を有する物質の使用であって、CDK阻害活性を有する物質が、2-シアノエチルアルステロパウロン、5-アミノ-3-((4-(アミノスルフォニル)フェニル)アミノ)-N-(2,6-ジフルオロフェニル)-1H-1,2,4-トリアゾール-1-カルボチオアミド、および(4-(2-アミノ-4-メチルチアゾール-5-イル)ピリミジン-2-イル)-(3-ニトロフェニル)アミンの中から選ばれる、使用。
- 抗フラビウイルス医薬組成物の抗フラビウイルス活性について、フラビウイルスが、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルスの中から選ばれるフラビウイルスに対する抗フラビウイルス活性である、請求項4記載の使用。
- 前記フラビウイルスが、デングウイルスである、請求項5記載の使用。
- 以下の工程を含む、抗フラビウイルス活性を有する物質をスクリーニングする方法:
(a)生物学的細胞を、抗フラビウイルス活性を有する物質の候補化合物とインビトロで接触させ、
(b)前記候補化合物が、前記生物学的細胞における核小体の形態に対し、影響を与えるか調べ、
(c)前記候補化合物が、影響を与えていれば、抗フラビウイルス活性を有する物質として同定する、方法。 - 工程(c)において、前記候補化合物による影響が、生物学的細胞において核小体の形態異常である、請求項7記載の方法。
- 生物学的細胞における核小体の形態異常を、核小体に局在するタンパク質または核酸の形成および/または局在の変化によって判別する、請求項7または8記載の方法。
- 核小体に局在するタンパク質の形成および/または局在の変化が、核小体に局在するタンパク質における対照化合物の影響と比較する変化である、前記候補化合物が核小体の形態に対し、影響を与えると判断する、請求項9記載の方法。
- 生物学的細胞において核小体に局在するタンパク質が、ネクロフォスミン、ヌクレオリン、フィブリラリン、RNAポリメラーゼIおよびフラビウイルスのコアタンパク質、のなかから選ばれる一つまたはそれ以上のタンパク質である、請求項7から10のいずれか記載の方法。
- 生物学的細胞が、肝臓由来のHuh7細胞などヒトを含む真核生物由来の培養細胞株、初代培養細胞、サル腎由来Vero細胞など霊長類由来の細胞株、C6/36細胞など蚊より樹立された細胞である、請求項7から11のいずれか記載の方法。
- 抗フラビウイルス医薬組成物の製造方法であって、
(a)請求項7から12のいずれか記載の方法によってCDK阻害活性を有する物質、rRNA転写阻害活性を有する物質、DNAトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質、またはGSK-3阻害活性を有する物質についてスクリーニングすることで抗フラビウイルス活性を有する物質を同定し、
(b)前記物質の有効量と、薬学的に許容され得る担体または賦形剤とを混合する、
製造方法。 - (a)の工程において、CDK阻害活性を有する物質についてスクリーニングする、請求項13記載の製造方法。
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CN117110269B (zh) * | 2023-10-20 | 2024-01-26 | 浙江迪福润丝生物科技有限公司 | Jev蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018017426A1 (en) | 2016-07-16 | 2018-01-25 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Compounds and methods for treatment and prevention of flavivirus infection |
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Patent Citations (1)
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---|---|---|---|---|
WO2018017426A1 (en) | 2016-07-16 | 2018-01-25 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Compounds and methods for treatment and prevention of flavivirus infection |
Non-Patent Citations (1)
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---|
J. Gen. Virol., 2008 Vol.89, Pt.5, p.1254-1264 |
Also Published As
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