TW201412981A

TW201412981A - 氣壓式萃取核酸之方法及其裝置

Info

Publication number: TW201412981A
Application number: TW102133269A
Authority: TW
Inventors: Te-Cheng Lee
Original assignee: Accubiomed Co Ltd
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2013-09-13
Publication date: 2014-04-01
Also published as: WO2014048263A1

Abstract

本發明有關一種新穎之抽取核酸的方法及其裝置，其係利用氣壓式萃取核酸之方法，在純化管上端與一可施以正或負氣體壓力裝置接合，即可由純化管下尖部吸取/排出檢體、清洗液及沖提液，達到不需要離心機即可簡便抽取核酸的效果。

Description

氣壓式萃取核酸之方法及其裝置

本發明有關一種抽取核酸的方法及其裝置，特別是關於一種氣壓式抽取核酸的方法及其裝置，以及利用該方法所設計的自動化機台。

隨著生物科技的發展以及遺傳物質的解碼，越來越多的生物相關實驗室或醫院甚至法醫檢驗等等，皆頻繁的使用抽取檢體內的核酸來進行實驗或檢查。抽取並純化核酸的方法很多，而目前最常見的方法分成三類：管柱萃取法、磁珠萃取法以及試劑萃取法，而試劑萃取法又分成兩類，分別是有機溶劑萃取法和非有機溶劑萃取法。各種萃取方法皆有其優缺點，然而，管柱萃取法是目前操作上最安全簡便且效果最佳的方式。

而利用該管柱萃取法的萃取流程又可分成兩種，一種是管柱離心萃取法，另一種則為管柱真空萃取法。第1圖為習知的管柱離心萃取法，首先，裝於微量離心管10內的處理過的檢體(如利用陰離子清潔劑將細胞打破釋放出核酸，並使蛋白質變性)轉置於一純化管20中，該純化管20通成可分成三部分，上頸部201、中間管體部202，以及下尖部204；中間管體部202的底部具有純化膜203，而下尖部204則具通道可使液體流出，通常檢體是利用微量分注器(pipette)將微量離心管10內的檢體吸取後，由純化管20的上方注入至純化管20中。純化管20外套有一廢液管30，將套合而為一體的雙管置於離心機中離心，由於核酸帶負電，會與帶正電的純化膜203結合而吸附於其上，而其它雜質則會因為離心力的關係而穿透純化膜203且通過純化管20的下尖部的通道而流到廢液管30內，此步驟稱為「結合步驟」；接著，於純化管20內加入清洗液後再次離心，使純化膜203上的雜質被離心出來提高核酸的純度，此步驟稱為「清洗步驟」；最後，將純化膜203上帶有核酸的純化管20轉置到收集管40中，加入特殊鹽度及pH值的沖提液改變純化膜203的電性，並再度離心，使核酸與純化膜203分離而流出，收集核酸於收集管40中，此步驟稱為「收集步驟」。管柱離心萃取法需要經過至少三次的離心，過程較為繁複且萃取時間會因等後離心而拉長。雖然市面上已有自動化的管柱離心萃取機台，但由於機台內必須設有離心設備，因此機台通常體積較大，且其萃取較為耗時的缺點並未克服。

另外一種管柱真空萃取法如第2圖所示，其原理也與管柱離心萃取法雷同，只是其「結合步驟」以及「清洗步驟」的步驟是用真空吸引取代離心方式，其係直接將純化管20插入壓力盒50中，利用氣體壓力，給予負壓使液體流出純化管20而直接進入液體收集瓶(未圖示)，但是在最後的「收集步驟」仍然必須利用離心方式將核酸收集至收集管40中。因此，即便是自動化機台，也必須要有離心設備設置於其中。

綜上所述，目前市面上雖然已有許多廠商研發出各種的管柱萃取套組及自動化機台，但其原理及萃取流程皆與上述之習知技術雷同，其存在的體積大且耗時較久的缺陷尚未被克服，因此，本技術領域中尚需一種新的方式及機台來克服這些缺點。

為了解決上述萃取核酸所產生耗時且耗費人力的問題，以及自動化機台體積過大等的缺陷，本發明人出人意料地發想，利用習知的純化管，直接在純化管中利用氣壓的方式，完全僅利用純化管的下端抽吸及排放檢體、清洗液、沖提液等，完全不需要利用離心機，且不需要從純化管上頸部處注入檢體、清洗液或沖提液，即可有效地萃取核酸。因此，本發明人提供了一種氣壓式抽取核酸的方法及其裝置，以及利用該方法所設計的自動化機台。

本文中術語「一」及「一種」代表於本文中之語法對象有一個或多於一個(即至少一個)。

本發明之一方面係提供一種氣壓式萃取核酸之方法，其包含：(a)將一純化管上端與一可施以正或負氣體壓力之壓力設備氣密接合，其中該純化管為具有半透膜之通孔管體；(b)開啟該壓力設備對該純化管施以負氣壓，利用該純化管之下端吸取含有核酸之檢體，使該檢體通過該半透膜後，該核酸與該半透膜電性或極性結合；(c)開啟該壓力設備對該純化管施以正氣壓，使殘餘檢體以相反於步驟(b)之方向通過半透膜後，由純化管之下端流出，且其中該步驟(b)及(c)可僅進行一次或重複進行多次；(d)開啟該壓力設備對該純化管施以負氣壓，利用該純化管之下端吸取沖提液，使該沖提液通過半透膜後，改變該半透膜電性或極性使核酸與半透膜分離並溶於沖提液中；及(e)開啟該壓力設備對該純化管施以正氣壓，使該溶有核酸之沖提液相反於步驟(d)之方向通過半透膜後，由該純化管之下端排出並收集，且其中該步驟(d)及(e)可僅進行一次或重複進行多次。

本文中術語「純化管」係為技術領域中習知之用於純化核酸之管柱，通常而言其包含一上頸部、一中間管體部、一半透膜以及一下尖部，該下尖部具有一通孔而可用於排出液體，但本發明中之該純化管並不限於此結構，只要該純化管為具有半透膜之通孔管體即在本發明之範圍內，管體的材料可為塑料如聚丙烯、聚苯乙醯、聚碳酸酯或聚氯乙烯等，或生物可降解性材料。該半透膜亦已為技術領域中所習知，該材質可為二氧化矽，表面電荷帶有正電，可與檢體中帶負電的核酸電性結合，並受沖提液改變其電性後，釋放核酸；於本文中，該「半透膜」又稱「純化膜」，為可使溶液由其內部通過，亦即，當在與半透膜的一面接觸的空間與該半透膜的另一面空間之間存有壓力差時，溶液可由高壓空間往低壓空間流動而穿透該半透膜；或者，當該半透膜受到離心力時，溶液可沿著離心力的方向穿透該半透膜，但核酸則與該半透膜作用而吸附於該膜上；而本發明中所使用的半透膜透過該膜與核酸之間的相互作用來吸附核酸，其中，核酸與半透膜是透過極性或電性而互相吸引，於本發明之較佳實施例中，該半透膜為具有親水性基團之多孔膜(又稱親水性膜)，且推測核酸之親水性基團與半透膜之親水性基團透過改變周圍的極性而互相吸引；本文中所稱之具有親水性基團之半透膜是指構成多孔膜材料本身具有親水性基團(如聚丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧乙烯、醋酸纖維素、醋酸纖維素皂化物、醋酸纖維素混合物等，優選可使用具有羥基的有機聚合物)，或者是對構成多孔膜的材料進行處理或塗敷，從而引進親水性基團，而任意的有機或無機材料均適合做為該多孔膜的材料，也可以是多種多孔膜的組合；所述之多孔膜中，為了能使溶液由內部通過，因此該膜的孔徑優選為大於或等於0.2μm，厚度優選為10μm至500μm，更佳為50μm至250μm。又本文中，純化管之上端及下端的定義為，一般的純化管結構中，較靠近該純化膜位置者為下端，而遠離該純化膜位置者為上端，但本發明並不限於此，而係以與壓力設備接合處者稱為純化管之上端，而用於吸取液體者稱為純化管之下端。

本文中術語「可施以正或負氣體壓力之壓力設備」係包含任何裝置可提供正或負氣體壓力者，最簡易之裝置如唧筒，可藉由抽或壓該唧筒體內的推桿而提供正或或負氣體壓力；抑或如習知技術中的針筒、移液器、泵或氣壓缸，其包含一氣壓閥以及一壓力器，可受控制而產生正或負氣體壓力，其中，使溶液可穿透半透膜之壓力值為10kPa至300kPa，優選為40kPa至200kPa，最優選之壓力值為60kPa。

在本發明之一實施例中，為了可進一步洗掉半透膜上的雜質，而可純化萃取出的核酸，因此，本發明上述之方法的步驟(c)及(d)之間可進一步包含清洗步驟，該清洗步驟包含：(c-1)開啟該壓力設備對該純化管施以負氣壓，利用該純化管之下端吸取清洗液，使該清洗液通過該半透膜；及(c-2)開啟該壓力設備對該純化管施以正氣壓，使該清洗液以相反於(c-1)之方向通過半透膜後，由純化管之下端流出。

本文中術語「清洗液」係包含習知技術中任何可用於清洗純化管的液體，其包含但不限於水、酒精或其他不會改變半透膜電性或極性之緩衝液，亦即該清洗液能夠洗出核酸混合物溶液中的雜質，該雜質是與核酸一起吸附於該半透膜上，就此方面而言，該清洗液僅使雜質由半透膜上被沖提，而不會使核酸被沖提，為達到此目的，由於核酸難溶於水性的有機溶液，因此使用適合的水性有機溶液，皆在本發明之範圍當中，例如醇類，包含甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇或丁醇，優選為乙醇。

本文中術語「充提液」係包含習知技術中任何可用於將核酸由該半透膜上解離的液體，其包含可將半透膜的極性或電性改變，而使核酸由其上解離下來之液體，例如為含有1.2M NaCl、50mM 3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)、15%乙醇且pH 8.0之緩衝液；或如為含有0.5M乙酸銨、10mM乙酸鎂(pH7.5)及1.5mM EDTA之緩衝液；或如為含有1.25M NaCl、50mM Tris-HCl pH 8.5及15%異丙醇之緩衝液等。

為了避免純化管內的檢體受到負氣壓的吸取，沖到壓力設備上造成汙染，在本發明之一較佳實施例中，該純化管上端與該壓力設備中間可進一步設有一具濾膜之轉接頭，當然，該轉接頭係與純化管上端以及壓力設備氣密接合。此外，為了使吸取液體或收集液體時更方便操作，在純化管下端可進一步設有與其氣密接合之移液器吸管(tip)，藉此，純化管可利用該移液器吸管吸取少量的液體或是將純化的檢體收集到微離心管中，以利保存或進一步的實驗。在本發明較佳之實施例中，該移液吸管上端結構為一套體，該套體可氣密地包覆該純化管部分的中間管體至下端處，使其套合於該純化管，且該移液吸管與該純化管接合處的結構係與不同廠牌的純化管具有通用性，而可廣泛應用於各類型的純化管，該手段例如但不限於該移液吸管之套體與該純化管接合處的結構係使用橡膠材質，使其為彈性結構，而可與不同規格之純化管接合；或該套體部分具有兩層不同的斜度，第一層靠近純化管中間管體的斜度較平緩，第二層靠近純化管下端的斜度較陡，利用此兩層不同之斜度而使其可適用並氣密地套合於市面上各種廠牌的純化管。

依據本發明之方法，在萃取檢體內的核酸時，完全不需要如同先前技術一樣，必須使用離心機離心掉廢液或是沖提液；反之，僅需要簡單地利用正負氣壓，而使純化管抽吸或排放的動作，就可簡便地純化出檢體內的核酸；此外，也不需要如同先前技術一般必須利用微量分注器由純化管的上頸部開口加入檢體、清洗液或是沖提液，反之，本發明之方法都是從純化管的下端直接吸取檢體、清洗液或是沖提液即可。

本發明之另一方面係提供一種氣壓式萃取核酸之裝置，其包含：一針筒，該針筒包含一筒體、設置於該筒體內之一推桿，其特徵在於該筒體內之推桿下方設有一可與核酸電性或極性結合之半透膜。其中，該裝置可進一步包含一可拆卸式地與筒體結合之一針頭組件。

藉由本發明之裝置，使用者可利用推桿上拉時所產生的負氣壓，使針頭產生吸力而可吸取檢體，當檢體通過針頭進入體內時，檢體內帶有負電的核酸會與半透膜電性或極性結合，而殘餘的檢體此時可藉由推動推桿產生的正氣壓，而由針頭排出，此為「結合步驟」，該「結合步驟」可重複一至多次，而可提高檢體內核酸結合至該半透膜的效率；接著，再次將推桿上拉，並由針頭吸取清洗液，使純化膜上的雜質被受清洗後而可提高核酸的純度，清洗後再推動推桿產生的正氣壓，將清洗液由針頭排出，此步驟稱為「清洗步驟」，該清洗步驟可依照需求重複一到多次；最後，再次將推桿上拉，並由針頭吸取沖提液，使特殊鹽度及pH值的沖提液改變純化膜的電性或極性，讓核酸由半透膜上沖提出來而溶於沖提液中，此時，即可將推桿推動使溶有核酸的沖提液經由針頭排出而收集於收集管中，此步驟稱為「收集步驟」，該「收集步驟」亦可重複一至多次，而可提高檢體內核酸回收的效率。藉由本發明的裝置，使用者完全不需要使用真空裝置或離心機，即可簡便地由檢體中抽取出核酸，且先前技術中，所有的液體材料均為一次性通過膜後，液體即被吸走或排掉，而無法反覆通過該半透膜來提高核酸萃取的效率，但本發明克服了該缺陷，透過本發明之裝置，可簡便地將液體材料反覆通過半透膜，而有效地提高核酸萃取量。

本發明之再一方面係提供一種使用本發明之方法萃取核酸之氣壓式萃取核酸之自動化機台，其包含一主機台，具有運作所需的電子零件組、一移動裝置，與該主機台電性相連、一唧筒，與該主機台電性相連以及一操作檯，與該主機台電性相連，該操作檯包含一純化套組。在本發明之一較佳實施例中，該自動化機台可進一步包含一加熱模組及/或一振盪器，使檢體在操作過程中可選擇性地受振盪或加熱，以提高核酸純化之產量。

於本發明一實施例中，該純化套組包含：(a)一具有半透膜之純化管、(b)一具濾膜之轉接頭、(c)一移液器吸管、(d)一用於容置檢體之孔盤、(e)至少一個用於容置緩衝液之孔盤；及(f)一用於容置萃取後產物之孔盤。其中，上述套組中之(a)至(c)組件可為一體成形者，於本發明之一較佳實施例中，該純化套組係一體排列為一行純化匣之形式。

根據本發明的氣壓式萃取核酸之自動化機台，其中該移動裝置較佳為機械手臂，可用於移動唧筒及/或移動純化套組，唧筒前方具有尖端係用於組合該純化套組內的轉接頭、純化管以及移液器吸管(由上往下的順序)，當此三者組合完畢(以下簡稱組合件)，唧筒與組合件氣密接合後，即可提供負氣壓使移液器吸管吸取純化套組內檢體孔盤中的檢體至純化管中，使檢體中的核酸與其內的半透膜電性或極性反應，且轉接頭可避免檢體上沖至唧筒，而避免汙染，當反應完成後，唧筒給予正氣壓，純化管可將殘餘檢體經由移液器吸管直接排入純化套組內檢體孔盤，而此步驟可重複一至多次，以提高核酸結合至半透膜之量；接著，機器手臂機械式地帶動組純化套組中裝填有清洗液的孔盤至唧筒上套合的組合件下方，唧筒提供負氣壓使移液器吸管吸取清洗液至純化管中，經清洗後，唧筒提供正氣壓，將清洗液排入原先吸取出來的同一孔盤中，此清洗步驟可重複一至多次；最後，機器手臂機械式地帶動純化套組中裝填有沖提液的孔盤上端至該唧筒上套合的組合件下方，提供負氣壓使移液器吸管吸取沖提液至純化管中，使電性結合於半透膜上的核酸溶出至沖提液中，接著唧筒提供正氣壓，將沖提液排入原先吸取出來的同一孔盤中，或是機器手臂可機械式地帶動純化套組的另一收集孔盤中至該唧筒上套合的組合件下方，收集所純化的核酸，此步驟亦可重複一至多次，以提高核酸萃取量。依據本發明之氣壓式萃取核酸之自動化機台，其純化套組可依照不同的需求而設計，如該孔盤可依照實驗所需的清洗次數，增加緩衝液的孔盤，該緩衝液為細胞溶解液、清洗液、酒精、水或沖提液等等，皆在本發明的範圍之內。

藉由本發明的氣壓式萃取核酸之自動化機台，該機台不僅不需要離心機的設備設置於其中，且僅需要簡便的移動裝置以及可提供正或負氣壓的唧筒，即可以真空方式抽吸檢體以及反應液體，不僅時間上可省略離心所需的時間，且在配置整個機台的反應行程亦較為簡單，因為唧筒僅需要簡單的抽吸，只需要走同一列的直線即可由最前端的結合步驟到最後的沖提步驟，且中間各種步驟須要重複多次也均可執行，且反應可在一體排列為一行純化匣的純化套組內完成，而不像傳統的自動化離心機萃取核酸機台，因為離心的關係，機械手臂可能會橫越多個方向抓取檢體，提高汙染率；更有甚者，本發明的轉接頭和移液吸管具有通用性，因此不必再開發新的純化管，而可利用習知的各種廠牌純化管即可。因此，本發明之氣壓式萃取核酸之自動化機台改良了習知技術的機台缺陷，且提供了一種新穎、簡便但效率更高的自動化技術。

在本發明之技術領域中存在有一種技術偏見，亦即本發明所屬技術領域之技藝人士通常認為，須要將具有核酸的檢體，由純化管上端提供，而使其中的核酸與半透膜結合後，殘餘檢體由純化管的另外一端(純化管下端)排出；然而，本發明克服了技術偏見，在對該純化管提供具有核酸的檢體之前，便先將純化管一端(純化管上端)與壓力設備結合，而使萃取核酸時所須用到的所有液體材料(包含具有核酸的檢體、核酸已被半透膜吸附的殘餘檢體、清洗液、廢棄清洗液、充提液或溶有核酸之充提液)均僅由純化管的另一端(純化管下端)進出。使用本發明之方法的優點在於，由於所有液體材料僅由純化管的一端進出，此外，由於當該具有核酸之檢體由純化管下端吸取而通過半透膜後，核酸先與該半透膜結合，而當對該純化管施以正氣壓，將該檢體排出時，檢體又會再通過一次半透膜並於純化管下端排出，若有殘餘未與該半透膜結合的核酸，可有再次的機會與半透膜結合，因此，於本發明中操作一次的結合步驟，實際上已經重複了兩次的結合步驟；而清洗步驟以及收集步驟亦為相同原理，於本發明中操作一次的清洗或收集步驟中，實際上已經重複了兩次的清洗和收集步驟，故而萃取核酸的量會增加，且效率更高。此外，在萃取過程中還可反覆利用壓力裝置提供的正/負氣壓，使萃取所用之液體可反覆通過半透膜，又進一步增進核酸結合、清洗或沖提的效率，有效提升核酸的萃取量；相較於先前技術中，所有反應液體均是一次性地通過半透膜，而液體即被排掉或抽走，但本發明之方法則可增進萃取量且提高萃取效率。

再者，使用本發明之方法以及裝置，所有使用的液體材料均可「原位吸取/排除」，亦即，萃取過程中的液體材料由何處被吸取，即可排回其被吸取之處或其他所欲之容器中，而不須使用特出的廢液桶進行收集。因此，若使用一行的純化匣時，而當萃取核酸結束後，所有的廢液均還是回到其原本於純化匣中的位置，而可直接將該使用過後的純化匣丟棄，不僅方便且亦可減少交叉汙染的風險。

10‧‧‧微量離心管

100‧‧‧檢體孔盤

110‧‧‧產物孔盤

120‧‧‧緩衝液孔盤

150‧‧‧純化套組

20‧‧‧純化管

201‧‧‧上頸部

202‧‧‧中間管體

203‧‧‧純化膜

204‧‧‧下尖部

30‧‧‧廢液管

40‧‧‧收集管

50‧‧‧壓力盒

60‧‧‧壓力設備

70‧‧‧針筒

701‧‧‧筒體

702‧‧‧推桿

703‧‧‧針頭組件

80‧‧‧移液器吸管

90‧‧‧轉接頭

901‧‧‧濾膜

第1圖顯示習知之管柱離心萃取法萃取核酸流程圖。

第2圖顯示習知之管柱真空萃取法萃取核酸流程圖。

第3圖為本發明之氣壓式萃取核酸裝置之一實施例示意圖。

第4圖為本發明之氣壓式萃取核酸裝置之另一實施例示意圖。

第5圖為本發明之氣壓式萃取核酸之自動化機台中所使用之純化套組示意圖。

首先，參見第3圖，其發明之氣壓式萃取核酸裝置之一實施例示意圖。該氣壓式萃取核酸裝置包含一純化管20以及一可施以正或負氣體壓力之壓力設備60。該純化管20上端與該壓力設備60氣密接合，而該純化管由上而下分別為一上頸部201、一中間管體部202、一純化膜203以及一下尖部204，該下尖部204具有一通孔。藉由該裝置，首先進行「結合步驟」：開啟該壓力設備60對該純化管20施以負氣壓，該純化管20之下尖部204吸取含有核酸之檢體，使檢體通過該純化膜203，而使該核酸與該純化膜203電性或極性結合；開啟該壓力設備60對該純化管20施以正氣壓，使殘餘檢體以相反方向再度通過該純化膜203後，由純化管20之下尖部204流出，此步驟可視需要重複一至多次。

接著進行「收集步驟」：開啟該壓力設備60對該純化管20施以負氣壓，利用該純化管20之下尖部204吸取沖提液，使該沖提液通過純化膜203後，改變該純化膜203電性或極性使核酸與純化膜203分離並溶於沖提液中；開啟該壓力設備60對該純化管20施以正氣壓，使該溶有核酸之沖提液以相反方向再度通過該純化膜203後，由該純化管20之下尖部204排出並收集，此收集步驟可視需要重複一至多次。而使用者可依據需要，在結合步驟完成後進一步進行一至多次之清洗步驟。

根據本發明之氣壓式萃取核酸裝置，該純化管20可利用各種習知技術中已存在的純化管，市面上不同廠牌的純化管均可利用於本發明。再者，為了避免純化管20內的檢體受到負氣壓的吸取，沖到壓力設備60上造成汙染，圖中可見，該純化管20上端與該壓力設備60中間可進一步設有一具濾膜901之轉接頭90，該轉接頭90係與純化管20上端(即上頸部201)以及壓力設備60氣密接合。此外，為了使吸取液體或收集液體時更方便操作，在純化管20下尖部204可進一步設有與其氣密接合之移液器吸管80，藉此，純化管20可利用該移液器吸管80吸取少量液體或將純化的檢體收集到微離心管中。

由圖中可見，在本發明較佳之實施例中，該移液吸管80上端可進一步具備一套體，該套體可氣密地由該純化管部分的中間管體202至下尖部204處套合，據此，使該移液吸管80可廣泛應用於各種不同類型的純化管；此外，為使該轉接頭90與該移液吸管80與該純化管接合處的結構係與不同廠牌的純化管具有通用性，可將該轉接頭90與該移液吸管80與該純化管20接合處的結構係使用橡膠材質，使其為彈性結構，而可與不同規格之純化管20接合。在本發明中，由於元件間皆必須氣密接合，才可利用氣壓式方式萃取核酸。各個元件間氣密接合的方式可使用任何習知的技術，如增設O型環等方式，並未有所限制。

接著，請參見第4圖，其為本發明之氣壓式萃取核酸裝置之另一實施例示意圖。可見該氣壓式萃取核酸裝置可為一針筒70，該針筒70即係一種可施以正或負氣體壓力之壓力元件。該針筒70包含一筒體701、設置於該筒體701內之一推桿702及可拆卸式地與筒體701接合之一針頭組件 703，其特徵在於該筒體內701之推桿702下方設有一可與核酸電性結合之純化膜203。藉由本發明的裝置，可依循上述的方法，直接使用該針筒70利用推桿702的抽吸及推排，進行「結合步驟」、「清洗步驟」以及「收集步驟」；詳言之，先利用推桿702上拉時所產生的負氣壓，使針頭組件703吸取檢體，當檢體通過針頭進入筒體701內時，檢體由下往上通過該純化膜203，檢體內帶有負電的核酸會與純化膜203電性或極性結合，而殘餘的檢體藉由推動推桿702產生的正氣壓，由上往下再度通過該純化膜203後由針頭排出，完成「結合步驟」；接著，再次將推桿702上拉，並由針頭組件703吸取清洗液，該清洗液由下往上通過該純化膜203，使純化膜203上的雜質被受清洗後而可提高核酸的純度，並再度推動推桿702產生的正氣壓，將清洗液由上往下通過該純化膜203後由針頭排出，完成「清洗步驟」，該清洗步驟可依照需求重複一到多次；最後，再次將推桿702上拉，並由針頭吸取沖提液，該沖提液由下往上通過該純化膜203，使特殊鹽度及pH值的沖提液改變純化膜203的電性或極性，讓核酸由半透膜上沖提出來而溶於沖提液中，並將推桿702推動使溶有核酸的沖提液由上往下通過該純化膜203後經由針頭排出而收集於收集管中，完成「收集步驟」。

本發明之另一方面係利用本發明之方法所設計的氣壓式萃取核酸之自動化機台(未圖示)，其包含一機械手臂、一組或一組以上之唧筒以及一操作檯，且該操作檯包含一純化套組150。在本發明之一較佳實施例中，該自動化機台可進一步包含一加熱模組及/或一振盪器，使檢體在操作過程中可選擇性地受振盪或加熱，以提高核酸純化之產量。

第5圖為於本發明一實施例中的純化套組150示意圖，該純化套組150包含：一具有一上頸部、一中間管體部、一半透膜以及一下尖部之純化管20、一具濾膜之轉接頭90、一移液器吸管80、一用於容置檢體之孔盤(簡稱檢體孔盤100)、至少一個用於容置緩衝液之孔盤(簡稱緩衝液孔盤120)；及一用於容置萃取後產物之孔盤(簡稱產物孔盤110)。

根據本發明的氣壓式萃取核酸之自動化機台，其機械手臂上具有唧筒，唧筒前方具有尖端係用於組合該純化套組150內的轉接頭90、純化管20以及移液器吸管80(由上往下的順序)，當此三者組合完畢(以下簡稱組合件)，唧筒可與組合件氣密接合後，提供負氣壓使移液器吸管80吸取純化套組150內檢體孔盤100中的檢體至純化管中，使檢體中的核酸與其內的半透膜電性或極性反應，且轉接頭90可避免檢體上沖至唧筒，而避免汙染，當反應完成後，唧筒給予正氣壓，純化管20將殘餘檢體經由移液器吸管80直接排入純化套組150內檢體孔盤100(此為「結合步驟」)，其中，於該結合步驟中，可重複將該檢體通過該純化管20一至多次，提高核酸結合於半透膜之量；接著，機器手臂機械式地帶動組合件至純化套組150中裝填有清洗液的孔盤上端(即緩衝液孔盤120)，提供負氣壓使移液器吸管80吸取清洗液至純化管20中，經清洗後，唧筒提供正氣壓，將清洗液排入原先吸取出來的同一孔盤中(此為「清洗步驟」)，該清洗步驟可重複一至多次；而當清洗步驟結束後，可進一步將該純化管20以加熱機構加熱以蒸散清洗液中的乙醇，及/或透過多次的以唧筒提供正/負氣壓使該半透膜乾燥；最後，機器手臂機械式地帶動組合件至純化套組150中裝填有沖提液的孔盤上端(即緩衝液孔盤120)，唧筒提供負氣壓使移液器吸管吸取沖提液至純化管20中，使電性/極性結合於半透膜上的核酸溶出至沖提液中，接著唧筒提供正氣壓，將沖提液排入原先吸取出來的同一孔盤中，或是機器手臂可機械式地帶動組合件至純化套組150之收集孔盤110中，收集所純化的核酸(此為「收集步驟」)，該收集步驟可重複一至多次，亦即，將同一沖提液重覆通過該半透膜上一至多次，使核酸的萃取量可有效提高。

該純化套組150可為兩個分開的組件，亦可形成一體成型的組件，並未限制，較佳係一體成型者為佳。此外，純化套組150中的緩衝液孔盤120可根據需求而有不同的數量，但其排列方式最佳為根據萃取核酸時的步驟，依序為細胞溶解液、清洗液、酒精、水或沖提液，藉此，當點膠機帶動組合件移動時，可有順序地一步步直線移往後方進行核酸萃取。

此外，由於該含有核酸的檢體通常係包含溶解緩衝液(lysis buffer)以打破檢體中所含細胞的細胞膜而使其釋放出核酸，該緩衝液中含有大量的界面活性劑，故而當「結合步驟」進行完畢後，將殘餘檢體排出時，若排出至空的孔盤中，容易產生大量氣泡而不利於操作，因此，於一較佳之實施例中，該純化套組150可包含一用於容置該殘餘檢體之孔盤(圖中未示)，且其中該孔盤中包含100% EtOH，則該EtOH可吸收氣泡，使該殘餘檢體排出至該孔盤時不會產生氣泡；其中，EtOH的量並無限制，但較佳為100至500μl，更佳為200至400μl，最佳為300μl。

再者，當「結合步驟」進行完畢後，由於該半透膜上可能有殘存的檢體，因此，若直接吸取清洗液，容易產生較多氣泡，故而可先吸取一次100% EtOH，將半透膜上的殘餘檢體清除乾淨，也增加該半透膜的通透性，而能使下一清洗步驟的清洗液較好通過該半透膜，增進該清洗效率，因此，該純化套組150可包含：含有100% EtOH之孔盤(圖中未示)於該緩衝液孔盤120之前，其中，EtOH的量並無限制，但較佳為100至500μl，更佳為200至400μl，最佳為300μl。

以下實施例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

[實施例]純化魚肝臟的gDNA

前置作業

所有的試劑均使用QIAamp DNA試劑套組(凱杰生物科技有限公司(Qiagen Taiwan Co.Ltd.))中所附者，內含組織溶解液、細胞溶解液、清洗液I、清洗液II、沖提液及蛋白質分解酶K(proteinase K)，以及純化管，其中該純化管中之半透膜為二氧化矽(silica)膜。

取約5x5mm大小的魚肝臟，置入2ml的螺蓋試管，加入800μl磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer saline,PBS)以及一顆5mm鋼珠，以組織均質機均質化30秒。接著，加入800μl細胞溶解液，以振盪器混勻，再加入80μl蛋白質分解酶K，並使用振盪器混勻。於60℃下培育30分鐘使檢體溶解。之後，加入800μl的乙醇並以振盪器振盪30秒。於13000rpm下離心3分鐘，各取200μl上清液至四個樣品管中，分別為實施例1檢體、實施例2檢體、比較例1檢體及比較例2檢體。

實施例1

首先，先將純化管上頸部與一針筒氣密接合，純化管下尖部與一移液器吸管氣密接合。

結合步驟：拉動針筒的推桿，將實施例1樣品管中的實施例1檢體經由該移液器吸管的吸取，由純化管的下尖部通過純化膜後，吸取至中間管體部，接著，將針筒推桿下推，排出未與純化膜結合的殘餘檢體，而核酸則電性結合於純化膜。

清洗步驟：拉動針筒的推桿，將500μl清洗液I經由該移液器吸管的吸取，由純化管的下尖部通過純化膜後，吸取至中間管體部，接著，將針筒推桿下推，排出該已清洗過純化膜的清洗液I。同樣的再一次進行清洗步驟，將750μl清洗液II由經由該移液器吸管的吸取，由純化管的下尖部通過純化膜後，吸取至中間管體部，接著，將針筒推桿下推，排出該已清洗過純化膜的清洗液II。

後清洗步驟：拉動針筒的推桿，將800μl的100%酒精經由該移液器吸管的吸取，由純化管的下尖部通過純化膜後，吸取至中間管體部，接著，將針筒推桿下推，排出該已清洗過純化膜的酒精；此步驟重複兩次。接著，將針筒抽吸並推排至少15次，使殘於在純化管內的酒精揮發。

收集步驟：拉動針筒的推桿，將200μl沖提液經由該移液器吸管的吸取，由純化管的下尖部通過純化膜後，吸取至中間管體部，並靜置3分鐘，接著，將針筒推桿下推，排出該溶有核酸的沖提液至1.5ml的微量離心管中。

實施例2

實施例2的步驟與實施例1一樣，重複實施例1的步驟，僅將檢體換為實施例2檢體。

比較例1

依據QIAamp DNA試劑套組產品說明書，進行核酸萃取。結合步驟：利用微量分注器(pipette)將比較例1檢體吸取至純化管內，檢體係由純化管上方注入。接著，在純化管下方裝一廢液管，兩管件一起至離心機中於轉速13000rpm下離心2分鐘，殘餘檢體將通過純化膜而經由純化管下尖部的通道離心至廢液管中，離心完後，倒掉廢液管中的廢液，而核酸電性結合於純化膜上，純化管再套回廢液管中。

清洗步驟：利用微量分注器將500μl清洗液I吸取至純化管內，清洗液I係由純化管上方注入。兩管件一起至離心機中於轉速13000rpm下離心1分鐘，清洗液I通過純化膜而經由純化管下尖部的通道離心至廢液管中，離心完後，倒掉廢液管中廢液，純化管再套回廢液管中。同樣的再一次進行清洗步驟，將750μl清洗液II吸取至純化管內，清洗液II係由純化管上方注入。兩管件一起至離心機中13000rpm離心1min，清洗液II通過純化膜而經由純化管下尖部的通道離心至廢液管中，離心完後，倒掉廢液管中廢液，純化管再套回廢液管中。

後清洗步驟：將兩套件於轉速13000rpm下離心額外的三分鐘以確保將清洗液完全移除。

收集步驟：移除廢液管，並換上1.5ml的微量離心管套於純化管外。利用微量分注器將200μl沖提液吸取至純化管內，沖提液係由純化管上方注入至中間管體部，並靜置3分鐘，接著，將兩套件置入離心機中於轉速13000rpm下離心1分鐘以獲得該溶有核酸的沖提液至1.5ml的微量離心管中。

比較例2

比較例2的步驟與比較例1一樣，重複比較例1的步驟，僅將檢體換為實施例2檢體。

以上實施例1、2以及比較例1及2的抽取出的gDNA之結果彙整於下表1中。

由上表1可見，使用本發明的方法及裝置所抽取出的DNA濃度與使用習知方式所收取出的DNA濃度差不多，且方法較為簡便。

此外，本發明之方法及裝置可適用於不同廠牌的抽取核酸之純化管套組。

接著，為了比較使用親水性膜與疏水性膜對於本發明之方法的影響，且為了比較使用本發明之裝置與傳統離心方式的影響，進一步使用不同廠牌的半透膜並利用本發明之裝置以及使用傳統離心方式，進行核酸萃取試驗。

實施例3

實施例3的步驟與樣品皆同於實施例1，但將該純化管之半透膜置換為PALL公司之一種親水性二氧化矽膜(品名：Glass Fiber Media)，膜孔徑為1.0μm；重複實施例1的步驟，但係於本發明之裝置中進行核酸萃取，所使用的正負氣壓為60kpa/-60kpa，且收集步驟重複兩次。

實施例4

實施例4的步驟與樣品皆同於實施例1，但將該純化管之半透膜置換為PALL公司之親水性硝化纖維膜(品名：BioTrace)，膜孔徑為0.2μm；重複實施例1的步驟，但係於本發明之裝置中進行核酸萃取，所使用的正負氣壓為60kpa/-60kpa，且收集步驟重複兩次。

實施例5

實施例5的步驟與樣品皆同於實施例1，但將該純化管之半透膜置換為Advantec公司之親水性硝化纖維膜(品名：Mixed Cellulose Esters)，膜孔徑為0.2μm；重複實施例1的步驟，但係於本發明之裝置中進行核酸萃取，所使用的正負氣壓為60kpa/-60kpa，且收集步驟重複兩次。

實施例6

實施例6的步驟與樣品皆同於實施例1，但將該純化管之半透膜置換為Advantec公司之親水性醋酸纖維素膜(品名：Cellulose Acetate)，膜孔徑為0.45μm；重複實施例1的步驟，但係於本發明之裝置中進行核酸萃取，所使用的正負氣壓為60kpa/-60kpa，且收集步驟重複兩次。

比較例3

比較例3的步驟及檢體均與比較例1相同，重複比較例1的步驟，僅將所使用的純化管中的半透膜置換為實施例3所使用的半透膜。

比較例4

比較例4的步驟及檢體均與比較例1相同，重複比較例1的步驟，僅將所使用的純化管中的半透膜置換為實施例4所使用的半透膜。

比較例5

比較例5的步驟及檢體均與比較例1相同，重複比較例1的步驟，僅將所使用的純化管中的半透膜置換為實施例5所使用的半透膜。

比較例6

比較例6的步驟及檢體均與比較例1相同，重複比較例1的步驟，僅將所使用的純化管中的半透膜置換為實施例6所使用的半透膜。

以上實施例3至6以及比較例3至6的抽取出的gDNA之結果彙整於下表2中。

由表2中可見，使用本發明之裝置所萃取出的核酸萃取量較習知技術為高，此係因使用本發明之裝置時，由於液體材料僅由純化管的下端進出，因此，在收集步驟中可重覆利用壓力裝置提供的正/負氣壓，使沖提液反覆通過半透膜，而增進核酸沖提的效率，而有效提升核酸的萃取量。相較於使用離心的方式，所有反應液體均是一次性地通過半透膜，而液體即被排除，使用本發明之方法及裝置可增進萃取量且提高萃取效率。

比較例7A

比較例7A的步驟與樣品皆同於實施例1，但將該純化管之半透膜置換為PALL公司之疏水性羧化聚偏二氟乙烯(品名：Fluoro Trans G)，膜孔徑為0.2μm；重複實施例1的步驟，但係於本發明之裝置中進行核酸萃取，所使用的正負氣壓為60kpa/-60kpa，且收集步驟重複兩次。

比較例8A

比較例8A的步驟與樣品皆同於實施例1，但將該純化管之半透膜置換為PALL公司之疏水性尼龍((品名：Hydrolon)，膜孔徑為1.2μm；重複實施例1的步驟，但係於本發明之裝置中進行核酸萃取，所使用的正負氣壓為60kpa/-60kpa，且收集步驟重複兩次。

比較例9A

比較例9A的步驟與樣品皆同於實施例1，但將該純化管之半透膜置換為PALL公司之疏水性聚醚碸(品名：Supor-450PR)，膜孔徑為0.45μm；重複實施例1的步驟，但係於本發明之裝置中進行核酸萃取，所使用的正負氣壓為60kpa/-60kpa，且收集步驟重複兩次。

比較例10A

比較例10A的步驟與樣品皆同於實施例1，但將該純化管之半透膜置換為Advantec公司之疏水性聚四氟乙烯(品名：Supported PTFE)，膜孔徑為0.45μm；重複實施例1的步驟，但係於本發明之裝置中進行核酸萃取，所使用的正負氣壓為60kpa/-60kpa，且收集步驟重複兩次。

比較例7B

比較例7B的步驟及檢體均與比較例1相同，重複比較例1的步驟，僅將所使用的純化管中的半透膜置換為實施例7A所使用的半透膜。

比較例8B

比較例8B的步驟及檢體均與比較例1相同，重複比較例1的步驟，僅將所使用的純化管中的半透膜置換為實施例8A所使用的半透膜。

比較例9B

比較例9B的步驟及檢體均與比較例1相同，重複比較例1的步驟，僅將所使用的純化管中的半透膜置換為實施例9A所使用的半透膜。

比較例10B

比較例10B的步驟及檢體均與比較例1相同，重複比較例1的步驟，僅將所使用的純化管中的半透膜置換為實施例10A所使用的半透膜。

以上比較例7A至10A以及比較例7B至10B的抽取出的gDNA之結果彙整於下表3中。

由表3中可見，使用疏水性半透膜由於無法與核酸的親水性基團透過改變周圍的極性互相吸引，因此無論是使用本發明之方法及裝置，或是使用習知的管柱離心萃取法，均無法有良好的萃取效能。

綜上所述，本發明克服了技術偏見，不如習知技術中必須由純化管的上端加入檢體，而係在對該純化管提供具有核酸的檢體之前，便先將純化管一端(純化管上端)與壓力設備結合，而使萃取核酸時所須用到的所有液體材料均僅由純化管的另一端(純化管下端)進出。如此一來，使用本發明之方法、裝置或自動化機台，於萃取核酸中的所有步驟均可簡易地利用提供正負壓力的方式，由純化管的同一端吸取/排出液體，不僅可簡化萃取步驟，且可使液體反覆通過半透膜而達到增進萃取效率的結果，且該自動化機台可不必配置離心機，僅須配置能夠提供壓力差的裝置，而可達到縮小體積的功效。