JP2005095113A

JP2005095113A - 核酸抽出装置

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Publication number: JP2005095113A
Application number: JP2003357674A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Seto; 義弘瀬戸; Takahiro Miyato; 崇裕宮戸
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2003-08-19
Filing date: 2003-10-17
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2023-10-17
Also published as: JP3635645B1

Abstract

【課題】短時間で効率よく試料液の核酸を自動的に抽出できる装置をコンパクトに構成する。
【解決手段】フィルター部材11ｂを備えた抽出カートリッジ11を用い、核酸を含む試料液を注入し加圧し、その核酸をフィルター部材11ｂに吸着させた後、洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、回収液を分注し加圧して吸着した核酸を回収する抽出動作を行う装置であって、抽出カートリッジ11、試料液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器12および核酸を含む回収液を収容する回収容器13を保持する搭載機構３と、抽出カートリッジ11に加圧エアを導入する加圧エア供給機構４と、抽出カートリッジ11に洗浄液および回収液を分注する分注機構５とを備えてなる。
【選択図】図１

Description

本発明は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用いて試料液の核酸を自動抽出する核酸抽出装置に関するものである。

従来の核酸抽出法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、フィルターを用いるものなどがある。

例えば、フィルターを用いた核酸抽出装置としては、フィルターを収容したフィルターチューブをラックに多数セットし、これに試料液を分注し、上記ラックの底部の周囲をシール材を介してエアチャンバーで密閉して内部を減圧し、全フィルターチューブを同時に排出側より吸引し試料液を通過させて核酸をフィルターに吸着し、その後、洗浄液および溶出液を分注して、同様に減圧吸引して洗浄・溶出するようにした機構が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
特許第２８３２５８６号公報

上記のような従来の自動抽出装置では、装置が大型で多量の検体を分析するのに適したもので、検体数が少なく分析頻度の少ない場合には、高価で不向きであるとともに、処理効率が低くなる問題を有する。

また、このような装置においては、短時間で効率よくコンタミネーションが発生しないように処理し、かつ、装置を小型化するなどの点が要望されるが、特許文献１では次のような問題がある。

採取全血のように各試料液の特性が異なる場合に、特許文献１のように全体を同時に吸引するものでは、一部のフィルターチューブの吸引が終了してその抵抗がなくなると、他のフィルターチューブに作用する減圧が小さくなって粘度の高い試料液の処理が終了しない場合が生じる。その減圧容量を増大することは装置の小型化を図る際の障害となり、減圧容積が大きいために減圧を作用させるまでの時間が掛かり、また、液が全部排出されたことの検出が困難で、時間設定が長く、処理効率の向上の障害となる。一方、粘度の低い試料液では、フィルターチューブより勢いよく液が排出されて、泡状の飛沫が隣接するフィルターチューブおよびラックに付着してコンタミネーションを生じ、精度低下を招く問題がある。

本発明はこのような点に鑑みなされたもので、短時間で効率よく試料液の核酸を自動的に抽出できるようにしたコンパクト化が可能な核酸抽出装置を提供することを目的とするものである。

本発明の核酸抽出装置は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させた後、前記抽出カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記抽出カートリッジに回収液を分注し加圧してフィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する抽出動作を自動的に行う核酸抽出装置であって、
前記抽出カートリッジ、前記試料液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記核酸を含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記抽出カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記抽出カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備えてなることを特徴とするものである。

前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記抽出カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジホルダーの下方で前記抽出カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。

また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記抽出カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける抽出カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなるものが好適である。

また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄液分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載機構に保持された抽出カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなるものが好適である。

一方、前記フィルター部材は、イオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜で構成するのが好適である。例えば、フィルター部材は、水酸基を有する有機材料の多孔性膜で構成される。一例として、前記フィルター部材は、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物、再生セルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜である。また、前記フィルター部材は、シリカ化合物を含有する無機材料、例えばガラスフィルターからなる多孔性膜である。

上記のような本発明によれば、抽出カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、抽出カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、抽出カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備え、フィルター部材を備えた抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入加圧し核酸をフィルター部材に吸着させた後、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出した後、回収液を分注してフィルター部材に吸着した核酸を分離して回収する抽出動作を自動的に行って短時間で効率よく試料液の核酸を自動的に抽出できる機構をコンパクトに構成することとができる。

また、前記搭載機構を、スタンドと、抽出カートリッジを保持する上下移動可能なカートリッジホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダーとを備えて構成すると、抽出カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容器と回収容器の交換が簡易に行える。

また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、抽出カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。

また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、回収液分注ノズルと、抽出カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易な機構で順次洗浄液および回収液の分注が行える。

フィルター部材として、イオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜で構成することにより、良好に試料液中の核酸の吸着・回収が行える。

以下、本発明の実施の形態を図面に沿って説明する。図１は一つの実施の形態における核酸抽出装置のカバーを除去した状態を示す斜視図、図２は核酸抽出装置の概略機構図、図３は搭載機構におけるラックの斜視図、図４はラックの使用状態を示す斜視図、図５は抽出動作の工程図、図６は抽出カートリッジの斜視図である。

一実施形態の核酸抽出装置１の機構を説明する前に、この核酸抽出装置１は、図６に示すような抽出カートリッジ１１（フィルターカートリッジ）を用いて試料液中の核酸を抽出するものである。この抽出カートリッジ１１は、上端が開口した筒状本体１１ａの底部にフィルター部材１１ｂが保持され、筒状本体１１ａのフィルター部材１１ｂより下方部位はロート状に形成され、下端中心部に細管ノズル状の排出部１１ｃが所定長さに突出形成され、筒状本体１１ａの側部両側に縦方向の突起１１ｄが形成されてなる。上部開口より後述の試料液、洗浄液、回収液が分注され、上部開口より加圧エアが導入され、各液をフィルター部材１１ｂを通して排出部１１ｃより後述の廃液容器１２または回収容器１３に流下排出する。なお、図示の場合、筒状本体１１ａは上部と下部に分割され嵌着する構造となっている。

そして、核酸抽出装置１は基本的に図５(ａ)〜(ｇ)に示すような抽出工程によって核酸の抽出精製を行う。まず図５(ａ)工程で、廃液容器１２上に位置する抽出カートリッジ１１に溶解処理された核酸を含む試料液Ｓを注入する。次に図５(ｂ)工程で、抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、フィルター部材１１ｂを通して試料液Ｓを通過させ、このフィルター部材１１ｂに核酸を吸着させ、通過した液状成分は廃液容器１２に排出する。

次に図５(ｃ)工程で抽出カートリッジ１１に洗浄液Ｗを自動分注し、(ｄ)工程で抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、フィルター部材１１ｂに核酸を保持したままその他の不純物の洗浄除去を行い、通過した洗浄液Ｗは廃液容器１２に排出される。この(ｃ)工程および(ｄ)工程を複数回繰り返してもよい。

その後、(ｅ)工程で抽出カートリッジ１１の下方の廃液容器１２を回収容器１３に交換してから、(ｆ)工程で抽出カートリッジ１１に回収液Ｒを自動分注し、(ｇ)工程で抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、フィルター部材１１ｂと核酸の結合力を弱め、吸着されている核酸を離脱させて、核酸を含む回収液Ｒを回収容器１３に排出し回収する。

上記抽出カートリッジ１１におけるフィルター部材１１ｂ（核酸吸着性多孔性膜）は、イオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、洗浄液による洗浄時にはその吸着を保持し、回収液による回収時に核酸の吸着力を弱めて離すように構成されてなる。さらに好ましくは、フィルター部材１１ｂは親水基として水酸基を有する多孔性膜であり、多孔性膜を形成する材料自体が、水酸基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって水酸基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良いが、加工の容易性から、有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。例えば、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、アクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体塩、ポリベンズイミダゾール、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体塩、ポリイミド、ポリフェニレンスルフィド、セルロース、セルロース混合エステル、ニトロセルロース、アセチルセルロース、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、ニトロセルロース、ポリプロピレンおよび／またはポリエステルを含む多孔性膜からなる。

水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースとしては、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースの何れでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。この場合、鹸化処理の程度（鹸化度）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率を挙げるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、鹸化率が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。また、表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理する。この鹸化処理の程度（鹸化度）と多孔性膜の孔径との組合せによりにより空間的な水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔膜であってもよいが、表裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。

水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、他に、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで形成された多孔性膜を挙げることができるが、多糖構造を有する有機材料の多孔性膜を好ましく使用することができる。特に、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜を好ましく使用することができ、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。

また、フィルター部材１１ｂとしては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜を挙げることができ、例えば、前述の各アセチルセルロースの混合物の鹸化物を好ましく使用することができる。鹸化処理は、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム)に接触させるもので、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分に、再生セルロースとなり水酸基が導入される。核酸の分離効率を上げるためには、導入される水酸基の数が多い方が好ましい。例えば、鹸化率が約５％以上、さらには約１０％以上であることが好ましい。鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。

また、フィルター部材１１ｂとしては、再生セルロースの多孔性膜を好ましく使用することができる。再生セルロースとは、アセチルセルロースの固体の表面または全体を、鹸化処理によりセルロース化したもので、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。

さらに他のフィルター部材１１ｂとしては、親水基を有する無機材料である多孔性膜としてシリカ化合物を含有する多孔性膜、例えばガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。

フィルター部材１１ｂとしては、厚さが１０〜５００μｍ、好ましくは、５０〜２５０μｍである多孔性膜を用いることができる。また、最小孔径が０．２２μｍ以上、さらに好ましくは、０．５μｍ以上である多孔性膜を用いることができる。また、最大孔径と最小孔径の比が２以上、さらに好ましくは、５以上である多孔性膜を用いることができる。また、空隙率が５０〜９５％、さらに好ましくは、６５〜８０％である多孔性膜を用いることができる。

また、使用するフィルター部材１１ｂは、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚のフィルター部材１１ｂは、同一のものであっても、異なるものであって良い。無機材料のフィルター部材１１ｂと有機材料のフィルター部材１１ｂとの組合せであっても良い。例えば、ガラスフイルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚のフィルター部材１１ｂは、無機材料のフィルター部材１１ｂと有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフイルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。

前記「核酸を含む試料液Ｓ」は、細胞またはウィルスを含む検体を溶解処理することにより核酸を液中に分散させた溶液に水溶性有機溶媒を添加したものである。例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（またはその一部）、動物（またはその一部）など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。「溶解処理」は、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化する試薬（例えば、カオトロピック塩またはグアニジン塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液）を含む水溶液で処理するもので、例えば、対象となる試料が全血の場合、フィルター部材１１ｂへの非特異吸着および目詰まりを防ぐために赤血球および各種タンパク質を分解、低分子化し、抽出の対象である核酸を可溶化させるために白血球および核膜の溶解を行う。「水溶性有機溶媒」としてはエタノール、イソプロパノールまたはプロパノールなどが挙げられ、中でもエタノールが好ましい。水溶性有機溶媒の濃度は好ましくは５〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０〜６０重量％である。エタノールの添加濃度は、凝集物を生じない程度でできるだけ高くすることが特に好ましい。

「洗浄液Ｗ」は、核酸と一緒にフィルター部材１１ｂに付着した試料液中の不純物を洗い流す機能を有し、核酸の吸着はそのままで不純物を離脱させる組成を有する。主剤と緩衝剤、および必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からなる。主剤としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の約１０〜１００重量％（好ましくは２０〜１００重量％、さらに好ましくは４０〜８０重量％）の水溶液が挙げられる。

「回収液Ｒ」は、塩濃度が低いことが好ましく、特には０．５Ｍ以下の塩濃度の溶液、例えば、精製蒸留水、ＴＥバッファ等が使用される。回収液ＲのｐＨは、ｐＨ２〜１１、さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。

前記核酸抽出装置１は、図１および図２に示すように、装置本体２に、複数の抽出カートリッジ１１、廃液容器１２および回収容器１３を保持する搭載機構３と、抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入する加圧エア供給機構４と、抽出カートリッジ１１に洗浄液Ｗおよび回収液Ｒを分注する分注機構５などを備えてなる。次に各機構３〜５を具体的に説明する。

＜搭載機構＞
搭載機構３は、装置本体２の前方下部に搭載台２１を備え、この搭載台２１上に複数の抽出カートリッジ１１、廃液容器１２および回収容器１３を保持したラック６が載置される。ラック６は、図３にも示すように、スタンド６１とカートリッジホルダー６２と容器ホルダー６３とを備える。

スタンド６１は両側の柱状部６１ａに上下移動可能にカートリッジホルダー６２を保持し、柱状部６１ａの間の下部の底板６１ｂ上に前後移動可能に容器ホルダー６３を保持している。

カートリッジホルダー６２は、前後のプレート材の接合による２分割構造に構成され、横方向に延びる保持部６２ａの両端に上下方向に延びる支持脚６２ｂを備える。その支持脚６２ｂがスタンド６１の柱状部６１ａの上下方向の摺動溝６１ｃに上下移動可能に挿入され、この支持脚６２ｂがスタンド６１に内蔵された付勢部材（不図示）によって上方に付勢されている。保持部６２ａには複数の保持孔６２ｃが並設され、上方より抽出カートリッジ１１が挿入され、抽出カートリッジ１１の筒状本体１１ａの側部両側に形成された突起１１ｄ（図６参照）の下端がカートリッジホルダー６２内の係合部材（不図示）に係合保持される。係合部材は移動可能で、移動時には突起１１ｄとの係合を解除して抽出カートリッジ１１を全部同時に下方に落下廃棄するようになっている。

このカートリッジホルダー６２は上面の両側にピン孔６２ｄを備え、使用状態では後述の位置決め手段としての押えピン４９（図１参照）の先端４９ａが係合して下方に押し下げられる。図３のようにカートリッジホルダー６２が上昇した位置では、カートリッジホルダー６２に保持された抽出カートリッジ１１の排出部１１ｃの下端は容器ホルダー６３にセットされた廃液容器１２および回収容器１３より上方に位置しているが、図４に示すように、カートリッジホルダー６２が下降した際には抽出カートリッジ１１の排出部１１ｃが廃液容器１２または回収容器１３の内部に所定量挿入されるように設定されている。

容器ホルダー６３は、横方向に延びる廃液容器保持孔６３ａと回収容器保持孔６３ｂとを平行２列に備え、後側の廃液容器保持孔６３ａに複数の廃液容器１２が、前側の回収容器保持孔６３ｂに複数の回収容器１３がそれぞれ列状に保持される。廃液容器保持孔６３ａおよび回収容器保持孔６３ｂはカートリッジホルダー６２の保持孔６２ｃと等ピッチで等位置に配設され、保持された各抽出カートリッジ１１の下方にそれぞれ廃液容器１２および回収容器１３が位置するように設定されている。この廃液容器１２と回収容器１３とは混同防止のためにサイズ、形状等が異なったものを使用するのが好ましい。

上記容器ホルダー６３はスタンド６１に内蔵された不図示の付勢部材によって前方に付勢されている。容器ホルダー６３の容器交換移動（前後動）は、搭載台２１に設置された作動部材３１（図２参照）が、スタンド６１の底板６１ｂに形成された開口を通して、容器ホルダー６３の底部の係合孔（不図示）に係合されて行われる。容器交換モータ３２（ＤＣモータ）の駆動に応じた作動部材３１の移動動作に応じて容器ホルダー６３が後退移動され、カートリッジホルダー６２の下方に回収容器１３が位置するように作動する。非作動時には廃液容器１２がカートリッジホルダー６２の下方に位置するように不図示の付勢部材で付勢されている。上記容器交換モータ３２の作動は位置センサ３３ａ，３３ｂの検出に応じて制御される。

＜加圧エア供給機構＞
加圧エア供給機構４は、図１および図２に示すように、前記搭載機構３のラック６に対して昇降移動する加圧ヘッド４０と、該加圧ヘッド４０に１列に並んで設置された複数（図の場合８個）のエアノズル４１と、加圧エアを発生するエアポンプ４３と、リリーフバルブ４４と、各エアノズル４１に設置され個別に開閉する開閉バルブ４５と、各エアノズル４１に設置された圧力センサ４６を備え、順次抽出カートリッジ１１に加圧エアを送給する。

前記加圧ヘッド４０は、装置本体２の中間フレーム２２と上フレーム２３との間に上下方向に設置されたガイドロッド２４に上下移動可能に保持されている。同様に上下方向に設置されたボールネジ２５に加圧ヘッド４０に設置されたボールナット４０ａが螺合し、昇降モータ４７（パルスモータ）の駆動に伴うタイミングベルト、プーリを介したボールネジ２５の回転により加圧ヘッド４０が、フォトセンサ４８ａ〜４８ｃの検出に伴う制御により昇降移動される。加圧ヘッド４０の両側には押えピン４９を有し、この押えピン４９はスプリング４９ｂで下方に付勢されて上下移動可能で、先端４９ａがカートリッジホルダー６２の上面のピン孔６２ｄに係合して位置を規制して押えるようになっている。

上記押えピン４９は、カートリッジホルダー６２を押圧作動している状態で、後述の洗浄液分注ノズル５１ｗおよび回収液分注ノズル５１ｒの横方向移動と干渉しないように、カートリッジホルダー６２の前側位置を押えるように配設されている。

エアノズル４１は加圧ヘッド４０にそれぞれ上下移動可能にかつ下方に付勢されて設置され、その下方にはエアノズル４１に対応した連通孔４２ａ（図２参照）が開口されたシート状のシール材４２が配設され、加圧ヘッド４０が下降移動した際に、カートリッジホルダー６２にセットされた抽出カートリッジ１１の上端開口を、エアノズル４１先端でシール材４２を介して押圧して密閉し、連通孔４２ａを通して抽出カートリッジ１１内へ加圧エアが送給可能となる。

リリーフバルブ４４はエアポンプ４３と開閉バルブ４５との間の通路のエアを排出する際に大気開放作動される。開閉バルブ４５は選択的に開作動されて、エアポンプ４３からの加圧エアを対応するエアノズル４１を経て抽出カートリッジ１１内に導入するようにエア回路が構成されている。圧力センサ４６は各エアノズル４１に設置され、抽出カートリッジ１１の内圧を個別に検出するものであり、検出圧力が所定値（例えば１００ｋＰａ）となったときに対応する開閉バルブ４５を閉作動して加圧エアの送給を停止したり、また、圧力が所定値以下に低下したことの検出により液排出終了を判定する制御などが行われる。

＜分注機構＞
分注機構５は、ラック６上を横方向に移動可能なノズル移動台５０に設置された洗浄液分注ノズル５１ｗおよび回収液分注ノズル５１ｒと、洗浄液ボトル５６ｗに収容された洗浄液Ｗを洗浄液分注ノズル５１ｗに給送する洗浄液供給ポンプ５２ｗと、回収液ボトル５６ｒに収容された回収液Ｒを回収液分注ノズル５１ｒに給送する回収液供給ポンプ５２ｒと、搭載台２１に載置された廃液ボトル５７などを備える。

ノズル移動台５０は、装置本体２の縦壁２６に水平方向に設置されたガイドレール２７に保持されて横方向に移動可能であり、その移動が不図示のノズル移動モータ（パルスモータ）によって各抽出カートリッジ１１上で順次停止し、復帰状態では廃液ボトル５７上に停止するように駆動制御される。洗浄液分注ノズル５１ｗおよび回収液分注ノズル５１ｒは先端が下方に向けて屈曲され、洗浄液分注ノズル５１ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液供給ポンプ５２ｗに接続され、洗浄液供給ポンプ５２ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液ボトル５６ｗに接続され、回収液分注ノズル５１ｒは切替弁５５ｒを介して回収液供給ポンプ５２ｒに接続され、回収液供給ポンプ５２ｒは切替弁５５ｒを介して回収液ボトル５６ｒに接続されている。洗浄液ボトル５６ｗおよび回収液ボトル５６ｒはそれぞれ装置本体２の側部に装着される。洗浄液供給ポンプ５２ｗおよび回収液供給ポンプ５２ｒはシリンジポンプで構成され、そのピストン部材がそれぞれポンプモータ５３ｗ，５３ｒ（パルスモータ）によってセンサ５４ｗ，５４ｒの位置検出に基づいて所定量の洗浄液Ｗおよび回収液Ｒを分注するように駆動制御される。

すなわち、洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを分注する場合には、切替弁５５ｗまたは５５ｒを洗浄液ボトル５６ｗまたは回収液ボトル５６ｒ側に切り替え、ポンプモータ５３ｗまたは５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を後退作動させ、洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの内部に吸引収容し、続いて切替弁５５ｗまたは５５ｒを洗浄液分注ノズル５１ｗまたは回収液分注ノズル５１ｒ側へ切り替え、ポンプモータ５３ｗまたは５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を押込作動させ、廃液ボトル５７に対して通路内のエアを排出するまで洗浄液または回収液を洗浄液分注ノズル５１ｗまたは回収液分注ノズル５１ｒより吐出させた後、洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの駆動を停止させる。その後、洗浄液分注ノズル５１ｗまたは回収液分注ノズル５１ｒを抽出カートリッジ１１上に移動させてから、洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの駆動量を制御して所定量の洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを抽出カートリッジ１１へ分注するものである。

前記洗浄液ボトル５６ｗおよび回収液ボトル５６ｒは、容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂとキャップ５６ｗｕ，５６ｒｕよりなり、両キャップ５６ｗｕ，５６ｒｕにはそれぞれ細パイプ状の吸引チューブ５８ｗ，５８ｒが設置され、該吸引チューブ５８ｗ，５８ｒの下端が容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂの底部近傍に開口して、洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの作動に応じて洗浄液Ｗ、回収液Ｒを吸い上げるようになっている。また、キャップ５６ｗｕ，５６ｒｕには吸引に応じて空気を容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂ内に導入する不図示のパイプ（開口でもよい）が設けられる。なお、洗浄液ボトル５６ｗの容器本体５６ｗｂは、回収液ボトル５６ｒの容器本体５６ｒｂより液の消費量が多いことから全高が大きく形成され、それに応じて吸引チューブ５８ｗも長く形成され、キャップ５６ｗｕ，５６ｒｕに対する口部のねじは同径である。

両ボトル５６ｗ，５６ｒの装置本体２への装着は、吸引チューブ５８ｗ，５８ｒが固着された各キャップ５６ｗｕ，５６ｒｕが止め具２８，２８によってそれぞれ装置本体２の中間フレーム２２に取り付けられ、このキャップ５６ｗｕ，５６ｒｕに対して容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂを下方より、口部に吸引チューブ５８ｗ，５８ｒを挿入してねじ込んで装着するようになっている。これは、吸引チューブ５８ｗ，５８ｒが設置されたキャップ５６ｗｕ，５６ｒｕを容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂより外して洗浄液Ｗ、回収液Ｒを補給するようにした場合、外したキャップ５６ｗｕ，５６ｒｕをテーブル等に置いたときに、チューブ５８ｗ，５８ｒの先端に物質が付着して洗浄液Ｗ・回収液Ｒに混入するのを防止するためである。

そして、特に容器高さが大きい洗浄液ボトル５６ｗでは、容器本体５６ｗｂを外した際における吸引チューブ５８ｗの下端と、その下方の装置本体２を載置したテーブル面との間の距離Ｈは、容器本体５６ｗｂの高さｈより大きくなるようにしている。つまり、止め具２８によるキャップ５６ｗｕの設置高さを、容器本体５６ｗｂの高さｈの約２倍以上にテーブル面より高い位置にする必要がある。これにより、吸引チューブ５８ｗを備えた固定キャップ５６ｗｕに対し、容器本体５６ｗｂの交換、液の補充作業が容易に行える。回収液ボトル５６ｒについても同様である。

次に、上記のような各機構３〜５は、装置本体２の上部に設置された操作パネル７の入力操作に対応し、連係された不図示の制御ユニットにより内蔵されたプログラムに基づいて駆動制御される。

上記核酸抽出装置１による抽出動作を具体的に説明する。まず搭載機構３のラック６におけるカートリッジホルダー６２に抽出カートリッジ１１をセットし、容器ホルダー６３に廃液容器１２および回収容器１３をそれぞれセットし、このラック６を装置本体２の搭載台２１に載置して準備を行う。次に、溶解処理された試料液Ｓをピペット等によって各抽出カートリッジ１１に順次注入する。なお、装置１に搭載する前のラック６にセットした後またはセットする前の抽出カートリッジ１１に試料液Ｓを先に注入するようにしてもよい。

その後、操作パネル７の操作によって装置を作動させると、加圧エア供給機構４の昇降モータ４７の駆動によって加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端４９ａがカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつけて、このカートリッジホルダー６２を下降させて位置を規制すると共に、抽出カートリッジ１１の下端排出部１１ｃを図４のように廃液容器１２内に所定量挿入させて、排出液が飛散等によって外部に漏れてコンタミネーションの原因とならないようにする。さらに加圧ヘッド４０が下降移動してシール材４２を介して各エアノズル４１の下端部が抽出カートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉する。前記押えピン４９がカートリッジホルダー６２の位置を規制していることで、各抽出カートリッジ１１に対し各エアノズル４１が正確に圧接して確実な密閉が確保できる。

その後、加圧エアの供給が行われるもので、全部の開閉バルブ４５が閉状態でエアポンプ４３が駆動され、まず１番目の開閉バルブ４５が開作動される。そして、１番目のエアノズル４１を通して１番目の抽出カートリッジ１１にエアポンプ４３からの加圧エアが供給され、その圧力センサ４６の検出によって所定圧力に上昇すると１番目の開閉バルブ４５を閉作動するのに続いて、２番目の開閉バルブ４５が開作動されて２番目のエアノズル４１を通して２番目の抽出カートリッジ１１に加圧エアが供給される。この動作を順に繰り返して全ての抽出カートリッジ１１に圧力を加える。圧力が作用した試料液Ｓは、フィルター部材１１ｂを通って核酸が吸着保持され、その他の液状成分は下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。試料液Ｓが全てフィルター部材１１ｂを通過すると圧力が液排出完了圧力以下に低下し、各圧力センサ４６によって全部の抽出カートリッジ１１で抽出終了が検出されると、加圧ヘッド４０が上昇作動される。

次に、洗浄処理に移行するが、上記加圧エア供給後の加圧ヘッド４０の上昇は、エアノズル４１が抽出カートリッジ１１より離れ、ノズル移動台５０の移動が許容できる高さまで上昇した位置で停止し、押えピン４９がカートリッジホルダー６２を押さえつけ、抽出カートリッジ１１の下端が廃液容器１２内に挿入されている図４の状態を保持して行う。そして、ノズル移動台５０を移動させて洗浄液分注ノズル５１ｗを１番目の抽出カートリッジ１１上に停止させて洗浄液Ｗを所定量分注し、ノズル移動台５０を次の抽出カートリッジ１１に移動させて順次洗浄液Ｗを分注する。全部の抽出カートリッジ１１への洗浄液Ｗの分注が終了すると、加圧ヘッド４０が下降移動し、各エアノズル４１の下端部がシール材４２を介して抽出カートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉してから、前述と同様に開閉バルブ４５が順次開作動されて各抽出カートリッジ１１に加圧エアが供給される。圧力が作用した洗浄液Ｗは、フィルター部材１１ｂを通って核酸以外の不純物の洗浄除去を行い、洗浄液Ｗは下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。全部の抽出カートリッジ１１における洗浄液Ｗが全てフィルター部材１１ｂを通過して排出されると、加圧ヘッド４０が初期の位置まで上昇作動される。洗浄処理を複数回行う場合には上記動作を繰り返す。

次に、回収処理に移行する。まず洗浄処理後の前記加圧ヘッド４０の上昇により、押えピン４９が上昇してラック６のカートリッジホルダー６２も上昇移動し、抽出カートリッジ１１の下端排出部１１ｃが廃液容器１２より上方へ移動した後、搭載機構３の作動部材３１を作動させて容器ホルダー６３を後退移動させ、抽出カートリッジ１１の下方に回収容器１３を位置させる容器交換を行う。

続いて、加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端がカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつけ、抽出カートリッジ１１の下端が回収容器１３内に挿入されている状態を保持する。そして、ノズル移動台５０を移動させて回収液分注ノズル５１ｒを１番目の抽出カートリッジ１１上に停止させて回収液Ｒを所定量分注し、ノズル移動台５０を次の抽出カートリッジ１１に移動させて順次回収液Ｒの分注を行う。全部の抽出カートリッジ１１への回収液Ｒの分注が終了すると、前述と同様にさらに加圧ヘッド４０が下降し、各エアノズル４１の下端部をシール材４２を介して抽出カートリッジ１１の上端開口に圧接させて密閉してから、開閉バルブ４５が順次開作動されて各抽出カートリッジ１１に加圧エアが供給される。圧力が作用した回収液Ｒは、フィルター部材１１ｂを通ってそれに吸着されている核酸を離脱させて、回収液Ｒとともに核酸が下端部の排出部１１ｃより回収容器１３に排出される。全部の抽出カートリッジ１１における回収液Ｒが全て回収容器１３に排出されると、加圧ヘッド４０が上昇作動され、一連の動作が終了する。

抽出動作が終了したラック６は搭載台２１より下ろされ、抽出カートリッジ１１および廃液容器１２はカートリッジホルダー６２および容器ホルダー６３より取り出されて廃棄され、一方、回収容器１３は容器ホルダー６３より取り出され、必要に応じて蓋がされて、次の核酸分析処理等が施される。

なお、本実施形態では、抽出カートリッジ１１を複数搭載しているが、これに限定されるものではなく、抽出カートリッジ１１を１本としても適用が可能である。

本発明の一つの実施の形態における核酸抽出装置のカバーを除去した状態を示す斜視図核酸抽出装置の概略機構図搭載機構におけるラックの斜視図ラックの使用状態を示す斜視図抽出動作の工程図抽出カートリッジの斜視図

符号の説明

１核酸抽出装置
２装置本体
３搭載機構
４加圧エア供給機構
５分注機構
６ラック
11 抽出カートリッジ
11b フィルター部材
12 廃液容器
13 回収容器
40 加圧ヘッド
41 エアノズル
43 エアポンプ
45 開閉バルブ
46 圧力センサ
49 押えピン（位置決め手段）
50 ノズル移動台
51w,51r 分注ノズル
52w,52r 供給ポンプ
56w,56r ボトル
61 スタンド
62 カートリッジホルダー
63 容器ホルダー
Ｓ試料液
Ｗ洗浄液
Ｒ回収液

Claims

フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させた後、前記抽出カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記抽出カートリッジに回収液を分注し加圧してフィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する抽出動作を自動的に行う核酸抽出装置であって、
前記抽出カートリッジ、前記試料液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記核酸を含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記抽出カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記抽出カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備えてなることを特徴とする核酸抽出装置。
前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記抽出カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジホルダーの下方で前記抽出カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記抽出カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける抽出カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸抽出装置。
前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄液分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載機構に保持された抽出カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなることを特徴とする請求項１，２または３に記載の核酸抽出装置。
前記フィルター部材が、イオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
前記フィルター部材が、水酸基を有する有機材料の多孔性膜であることを特徴とする請求項１または５に記載の核酸抽出装置。
前記フィルター部材が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る多孔性膜であることを特徴とする請求項１，５または６に記載の核酸抽出装置。
前記フィルター部材が、再生セルロースの多孔性膜であることを特徴とする請求項１，５または６に記載の核酸抽出装置。
前記フィルター部材が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜であることを特徴とする請求項１または７に記載の核酸抽出装置。
前記フィルター部材が、シリカ化合物を含有する無機材料からなる多孔性膜であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
前記フィルター部材が、ガラスフィルターであることを特徴とする請求項１または１０に記載の核酸抽出装置。