TW201322992A - 金線連萃取物之應用及其萃取方法 - Google Patents

Abstract

本發明係以台灣金線連（Anoectochilus formosanus Hayata）萃取物進行抑制細胞酪胺酸酶（Tyrosinase）活性以及細胞黑色素（Melanin）含量進行測試，並評估對黑色素之抑制效果，結果發現金線連萃取物可有效抑制細胞酪胺酸酶活性，並進一步抑制黑色素之生成，因此可應用該金線連萃取物製備具有可抑制人體黑色素生成之美容保養品、化妝品、飲食品或醫藥品等組合物。

Description

金線連萃取物之應用及其萃取方法

　　本發明係與金線連萃取物有關，特別是指一種應用於抑制細胞黑色素生成之金線連萃取物及其萃取方法。

　　按，酪胺酸酶（Tyrosinase）又稱為多酚氧化酶（Polyphenoloxidase; PPO），是皮膚黑色素形成的關鍵酵素，因此抑制酪胺酸酶可阻斷黑色素生成。生物體中種種的內在因素（如遺傳、壓力、疾病等）以及環境中存在的外在因素（如紫外線照射、藥物、不當使用化妝品等）皆有可能會活化酪胺酸酶，進而造成皮膚細胞內黑色素（Melanin）的產生，當黑色素產生的量過多就會沉澱，最後造成膚色轉變成深褐色或黑色，所以皮膚美白產品一直是美容保養品的研發主軸。

　　雖然黑色素的生成對於肌膚而言是一種保護機制，但若長期暴露在上述惡劣的環境中，則可能造成過度的黑色素沉澱（Hyperpigmentation）甚至是黑色素瘤（Melanoma）的發生。

　　而黑色素的產生最主要是肇因於活化的酪胺酸酶將酪胺酸（Tyrosine）羥化成為多巴（Dopa;3,4-dihydroxyphenylalanine），接著繼續將多巴氧化成為多巴醌（DOPAquinone），最後再經由酪胺酸酶相關蛋白（TRP-1; Tyrosinase-related protein-1, TRP-2; Tyrosinase-relatedprotein-2）進行一連串反應而生成真黑色素（Eumelanin）。而若有硫化物存在時，則會氧化為類黑色素（Phaeomelanin）。

　　由上述途徑可知，若要減少黑色素生成，可從抑制酪胺酸酶活性方面著手，因此本案發明人在經過不斷地苦思與反覆試驗後，才終於有本發明之產生。

　　本發明之主要目的，在於提供一種應用於抑制細胞黑色素生成之金線連萃取物及其萃取方法，其具有對抑制細胞黑色素生成有顯著的功效。

　　為達前述之目的，本發明提供一種金線連萃取物之應用，其特徵係應用該金線連萃取物製備具有可抑制細胞黑色素生成之組合物。

　　較佳地，該金線連萃取物係取自台灣金線連（Anoectochilus formosanus Hayata）。

　　而依本發明所製備具有可抑制細胞黑色素生成之組合物係可應用至美容保養品、化妝品、飲食品或醫藥組合物上。

　　另本發明更提供一種如上所述之金線連萃取物之萃取方法，其包含有以下步驟：
　　ａ．將金線連全株以甲醇及三氯甲烷進行加熱萃取獲得一初萃取液，其中，甲醇及三氯甲烷之體積比為1:4；
　　ｂ．於該初萃取液中添加氯化鉀水溶液並予以震盪混合，其中該氯化鉀水溶液佔該初萃取液總容量的20％，並於該初萃取液混合氯化鉀水溶液後，取其上層液並加入足以涵蓋該上層液之甲醇及水，再進行震盪混合以得到一混合液，其中，甲醇及水之體積比為1:1；
　　ｃ．將該混合液中之有機溶劑移除並靜置一段時間後，以其下層液進行過濾並取其濾液。

　　較佳地，係將所獲得之濾液係以-20℃之低溫保存。

　　而本發明之上述及其他目的與優點，不難從下述所選用實施例之詳細說明與附圖中，獲得深入了解。

　　當然，本發明在某些另件上，或另件之安排上容許有所不同，但所選用之實施例，則於本說明書中，予以詳細說明，並於附圖中展示其構造。

　　本發明提供一種金線連萃取物之應用，其特徵係應用該金線連萃取物製備具有可抑制細胞黑色素生成之組合物。

　　其中，該金線連萃取物係取自台灣金線連（Anoectochilus formosanus Hayata），其係可以水萃取或其他有機溶劑進行萃取。該金線連萃取物並可應用至具有抑制細胞黑色素生成之美容保養品（面膜、防曬乳或乳液）、化妝品、飲食品或醫藥組合物上。

　　再者，本發明更提供一種金線連脂類萃取方法，其包含有以下步驟：

　　ａ．取台灣金線連（Anoectochilus formosanus Hayata）全株以甲醇及三氯甲烷進行加熱萃取，而甲醇及三氯甲烷之總量係以足以涵蓋金線連全株為原則，其中，甲醇及三氯甲烷之體積比為1:4，並萃取四次，以獲得一初萃取液；

　　ｂ．於該初萃取液中添加氯化鉀水溶液並予以震盪混合約3小時後分層，其中，該氯化鉀水溶液佔該初萃取液總容量的20％，而該氯化鉀水溶液中則含有約0.67％的氯化鉀，並於該初萃取液與氯化鉀水溶液震盪混合後，利用一分液漏斗將下層水溶液去除後，取其上層液並加入足以涵蓋該上層液之甲醇及水，再進行震盪混合約1小時以得到一混合液，其中，甲醇及水之體積比為1:1；

　　ｃ．利用大型減壓濃縮機進將該混合液中之有機溶劑以加熱蒸發方式移除，並靜置一段時間後使金線連有效成分沉澱，接著將移除有機溶劑之混合液中含有脂類之下層液利用3號濾紙及抽氣幫浦過濾三次後，再將其濾液混合並置於-20℃之低溫保存。

　　而藉由上述金線連脂類萃取方法所獲得之金連萃取物其分子量較小，更可有利於人體皮膚直接吸收，而可在本發明應用至美容保養品、化妝品上時，其抑制細胞黑色素生成之效果可更為顯著。

　　接著，係藉以下試驗例並搭配結果圖，進一步說明本發明可達成之功效。

（ａ）實驗材料與細胞株

試劑：

a. 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,
   5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)；

b. 95% Ethanol；

c. 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)；

d. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)；

e. Penicillin-Streptomycin Solution(P/S)；

f. Fetal bovine serum(FBS)；

g. Trypsin 0.25%(1X)；

h. Phosphate buffered saline(PBS)；

i. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)；

j. 20Mm Tris-0.1%trition X-100－蛋白質分析的試劑。

細胞株：

老鼠黑色素細胞瘤細胞株(B16-F10; BCRC 60031)。

（ｂ）試驗方法

1.細胞培養：

　　將細胞(B16-F10)接種在含有10%血清的DMEM完整培養液的10公分培養皿中，在含有5%CO2、溫度37℃環境下進行培養。細胞在進行繼代培養時，先將細胞以不含血清之培養液清洗過後，在溫度37℃環境下以0.25%胰蛋白酶(0.25%Trypsin)處理細胞3分鐘，待細胞從培養皿上脫附。加入適量完整細胞培養液，均勻混合後轉移至新的培養皿上進行培養。

2.樣品製備與儲存：

　　細胞樣品先經1000rpm、3min離心，再取出上清液以PBS對細胞樣品進行連續稀釋，並保存於4℃。

3.細胞存活率試驗(Cell viability test)：

　　將B16-F10細胞（1×104cells/well）接種含100μl之完整培養液之96孔細胞培養盤中，放置37℃、5% CO2恆溫培養箱，培養24小時。隔天，加入金線連萃取物稀釋的樣品濃度，再放置培養箱24小時。培養後每個孔洞加入100μlMTT溶液(1mg/ml)，放入37 ℃培養箱反應3小時後加入100 μl DMSO溶解結晶體。溶解後使用酵素免疫微盤分析儀(ELISA reader) 測波長570 nm吸光值。其存活率計算公式如下:

Cell viability (%) = (OD570 of sample ／ OD570 of control) x 100

4.蛋白質定量試驗-Bradford method：

　　以20mM Tris-0.1%Triton X-100將細胞溶解後離心，取出20μl之細胞萃取液，加入400μl Bradford 試劑，置於室溫5分鐘後，測595nm吸光值。

5.細胞酪胺酸酶抑制試驗(Inhibition of tyrosinase activity test)：

　　將B16-F10細胞（1.5×106cells/dish）接種含10ml之完整培養液之10公分培養皿中，放置於37℃、5% CO2恆溫培養箱，其中，B16-F10細胞先加入誘導劑0.1mM IBMX，培養24小時。隔日，加入金線連萃取物(樣品濃度依MTT結果所示)，繼續培養24小時後，將細胞收下。以20mM Tris-0.1%TritonX-100將細胞溶解後離心，取部份上清液先進行蛋白質定量分析。再取其上清液加入L-DOPA溶液中，置於37℃、反應10分鐘後，測475nm吸光值。其抑制率計算公式如下：

Tyrosinase activity (%) = (OD475 of sample ／ OD475 of control) x 100

Inhibition of tyrosinase activity (%) =1-tyrosinase activity (%)

6.細胞黑色素含量試驗(Melanin content test)：

　　將B16-F10細胞（1.5×106cells/dish）接種在10公分培養皿中，放置於37℃、5% CO2恆溫培養箱，其中，先加入誘導劑0.1mM IBMX，培養24小時。隔日，加入金線連萃取物(樣品濃度依MTT結果所示)，培養24小時後，將細胞收下以20mM Tris-0.1% Triton X-100將細胞溶解後離心。取部份上清液先進行蛋白質定量分析。將溶解後的細胞分別置換20%TCA及10%TCA，進行蛋白質沉澱，再以(酒精:乙醚)混合液及乙醚沖洗後風乾。風乾後加入0.85M KOH回溶，測440nm吸光值。其黑色素含量計算公式如下：

Melanin content (%) = OD440 of sample／OD440 of control

（Ｃ）試驗結果

1.細胞存活率試驗：

　　依據MTT assay結果顯示，本試驗取不同金線連萃取物濃度(0.02 mg/ml、0.01mg/ml、0.002 mg/ml、0.001 mg/ml、0.0002 mg/ml)進行試驗，取得其樣品之後續酪胺酸酶抑制率與黑色素含量的試驗濃度。樣品之試驗濃度依細胞活性抑制率不大於30%，如下表一及第１圖所示。在B16-F10細胞中，樣品之試驗濃度為0.002 mg/ml、0.001 mg/ml。

表一：B16-F10細胞存活率分析表

2.細胞酪胺酸酶抑制率試驗：

　　由細胞酪胺酸酶試驗中顯示，B16-F10細胞經IBMX誘發後，加入不同樣品之試驗濃度，即可得知酪胺酸酶活性比率，其中酪胺酸酶抑制率(%)=1-酪胺酸酶活性比率(%)。如下表二及第２圖所示，B16-F10細胞中，在實驗組１（試驗濃度0.002mg/ml）酪胺酸酶活性抑制率為81.74%；在實驗組２（試驗濃度0.001mg/ml），酪胺酸酶活性抑制率為72.33 %。

表二：B16-F10細胞中酪胺酸酶活性及其抑制酪胺酸酶活性率之分析表

3.細胞黑色素含量試驗：

　　B16-F10細胞經IBMX誘發後，加入本發明之台灣金線連萃取物後，黑色素含量與控制組相較下之結果，如下表三及第３圖所示。在實驗組１（試驗濃度0.002mg/ml）下，樣品黑色素含量為52.15 %；在實驗組２（試驗濃度0.001mg/ml）下，樣品黑色素含量為64.20 %。並由附件一黑色素觀察結果中之照片可清楚看出其黑色素之變化。

表三：B16-F10細胞中之黑色素含量分析表

　　綜上試驗可證明，本發明之金線連萃取物確實可有效抑制酪胺酸酶之活性，並進而具有可有效抑制黑色素生成之功效，因此確可應用至具有抑制人體黑色素生成之美容保養品（面膜、防曬乳或乳液）、化妝品、飲食品或醫藥組合物上。

　　惟，以上所述實施例之揭示係用以說明本發明，並非用以限制本發明，故舉凡數值之變更或等效元件之置換仍應隸屬本發明之範疇。

（無）

第１圖係本發明動物試驗之細胞存活率分比對圖

第２圖係本發明動物試驗中酪胺酸酶活性及其抑制酪胺酸酶活性率之比對圖

第３圖係本發明動物試驗中之黑色素含量比對圖

無

Claims (12)

1. 一種金線連萃取物之應用，其特徵係應用該金線連萃取物製備具有可抑制人體黑色素生成之組合物。
2. 依申請專利範圍第１項所述之金線連萃取物之應用，其中，該金線連萃取物係取自台灣金線連（Anoectochilus formosanus Hayata）。
3. 依申請專利範圍第１項所述之金線連萃取物之應用，其中，該組合物為美容保養品。
4. 依申請專利範圍第３項所述之金線連萃取物之應用，其中，該美容保養品為面膜、防曬乳或乳液其中一種。
5. 依申請專利範圍第１項所述之金線連萃取物之應用，其中，該組合物為化妝品。
6. 依申請專利範圍第１項所述之金線連萃取物之應用，其中，該組合物為飲食品。
7. 依申請專利範圍第１項所述之金線連萃取物之應用，其中，該組合物為醫藥組合物。
8. 一種如申請專利範圍第１項所述之金線連萃取物之萃取方法，包含有以下步驟：
   　　ａ．將金線連全株以甲醇及三氯甲烷進行加熱萃取獲得一初萃取液，其中，甲醇及三氯甲烷之體積比為1:4；
   　　ｂ．於該初萃取液中添加氯化鉀水溶液並予以震盪混合，其中該氯化鉀水溶液佔該初萃取液總容量的20％，並於該初萃取液混合氯化鉀水溶液後，取其上層液並加入足以涵蓋該上層液之甲醇及水，再進行震盪混合以得到一混合液，其中，甲醇及水之體積比為1:1；
   　　ｃ．接著將該混合液中之有機溶劑移除並靜置一段時間後，以其下層液進行過濾並取其濾液。
9. 依申請專利範圍第８項所述之金線連萃取物之萃取方法，其中，該氯化鉀水溶液中係含有約0.67％的氯化鉀。
10. 依申請專利範圍第８項所述之金線連萃取物之萃取方法，其中，係利用一分液漏斗將混合有氯化鉀水溶液之初萃取液的下層水溶液去除而得該上層液。
11. 依申請專利範圍第８項所述之金線連萃取物之萃取方法，其中，係利用一大型減壓濃縮機蒐集該混合液中之有機溶劑並由該混合液中移除。
12. 依申請專利範圍第８項所述之金線連萃取物之萃取方法，其中，所獲得之濾液係以-20℃之低溫保存。