CN107308087A - 一种金线莲提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及美容医疗领域，具体而言，涉及一种金线莲提取物及其制备方法与应用，所述制备方法包括：1).将金线莲剪碎后加水粉碎，水浴后离心收集提取液；2).将所述提取液浓缩后加入无水乙醇低温沉淀，抽滤并去除沉淀获得醇提物；醇提物浓缩后真空冻干即得。本发明制备得到金线莲提取物能够抑制黑色素产生，可用于天然美白护肤产品。

Description

一种金线莲提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及美容医疗领域，具体而言，涉及一种金线莲提取物及其制备方法与应用。

背景技术

金线莲(Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.))又名金线兰、花叶开唇兰，是兰科(Orchidaceae)，开唇兰属(Anoectochilus)多年生珍稀药用植物。金线莲的主要产地集中在福建和台湾，享有“药王”、“金草”等美称。在民间，金线莲对于肝炎、肾炎、肺炎、糖尿病、风湿病、小儿惊厥、毒蛇咬伤等病症有很好的治疗效果。

随着环境污染越来越严重，导致臭氧层遭到破坏，紫外线到达地面的量增多，使得体表黑色素过多的沉积，虽然黑色素能降低紫外线对皮肤的伤害，但是过多的色素沉积不仅影响美观，而且会引起雀斑、黑斑病，严重影响人们的生活质量。目前市面上的许多化妆品由于化学成分及重金属添加，虽美白效果显著，却存在潜在的不可逆损伤风险，危害到人体健康。人们更青睐于绿色健康的，对人体无害的纯天然植物活性成分，中草药因其药效温和、不良反应小而得到大家的一致认可，抑制黑色素产生的绿色天然活性药物的开发将成为化妆品领域一个备受瞩目的课题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金线莲提取物及其制备方法与应用，所述的金线莲提取物能够抑制黑色素产生，可用于天然美白护肤产品。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种金线莲的提取方法，包括：

1).将金线莲剪碎后加水粉碎，水浴后离心收集提取液；

2).将所述提取液浓缩后加入无水乙醇低温沉淀，抽滤并去除沉淀获得醇提物；醇提物浓缩后真空冻干即得。

优选的，如上所述的金线莲的提取方法，在步骤1)中，所述金线莲与所述水的固液比为1g：3ml～5ml；

更优选的，所述金线莲与所述水的固液比为1g：4ml。

优选的，如上所述的金线莲的提取方法，在步骤1)中，所述水浴后离心收集提取液具体为水浴提取两次，包括：

水浴后离心，收集上清；

将沉淀重复水浴后再次离心收集上清；

合并两次上清得到提取液。

优选的，如上所述的金线莲的提取方法，每次水浴的条件均为：75℃～85℃水浴50min～70min；

更优选的，每次水浴的条件均为：80℃水浴60min。

优选的，如上所述的金线莲的提取方法，在步骤2)中，所述无水乙醇低温沉淀具体为2℃～6℃沉淀8h～16h；

更优选的，所述无水乙醇低温沉淀具体为4℃沉淀12h。

如上所述的金线莲的提取方法提取得到的金线莲提取物。

如上所述的金线莲提取物在制备用于美白的药品中的应用。

如上所述的金线莲提取物在抑制黑色素合成相关基因表达中的应用；

优选的，所述黑色素合成相关基因包括tyr、silv、tyrp1a、tyrp1b、dct以及oca2。

本发明还涉及一种美白护肤品，其包括如上所述的金线莲提取物。

优选的，如上所述的美白护肤品，其还包括溶剂、收敛剂、稳定剂、增稠剂、调理剂、保湿剂、pH调节剂、表面活性剂、抗氧化剂、清凉剂、乳化剂、防腐剂、着色剂、分散剂、芳香剂中的至少一种。

优选的，所述溶剂包括水、丙二醇、丁二醇、甘油、戊二醇中至少一种；

优选的，所述收敛剂为氧化锌或滑石粉；

优选的，所述稳定剂包括羟丙基甲基纤维素、植物卡拉胶、十八醇和二十二醇；

优选的，所述增稠剂包括卡波姆、SEPINOV EMT-10中至少一种；

优选的，所述调理剂包括尿囊素、维生素A棕榈酸酯、甘草酸二钾、积雪草提取物、烟酰胺中、辛酰甘氨酸、季铵盐-73、水杨酸、辛酰水杨酸中至少一种；

优选的，所述保湿剂包括乙基己基甘油、丁二醇、1,2-戊二醇、甘油、丙二醇、透明质酸钠、D-泛醇、PCA-Na中至少一种；

优选的，所述pH调节剂包括氢氧化钠、氢氧化钾、精氨酸、柠檬酸、柠檬酸钠中至少一种；

优选的，所述表面活性剂包括吐温-20、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油中至少一种；

优选的，所述清凉剂包括cooling complex、薄荷脑、薄荷精油、薄荷乳酸酯中至少一种。

优选的，如上所述的美白护肤品，所述美白护肤品的制剂包括水剂、精华液、面膜、乳液和膏霜。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的金线莲提取方法操作简单，且提取得到的金线莲提取物能够有效的抑制黑色素合成相关基因的表达，并抑制黑色素的形成；且本品为纯植物提取物，安全绿色，可用于防止皮肤常见雀斑、黄褐癍、日晒斑、长期使用化妆品及创伤后造成的色素沉积等常见皮肤问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同浓度的金线莲提取物对斑马鱼胚胎死亡率的影响；三条曲线由上到下依次为醇沉组、总提组以及醇提组；

图2为金线莲不同组分对斑马鱼黑色素沉着的影响；

图3为黑色素合成相关基因的表达显著性差异；

分析均是与对照组(0μg/mL)相比较；P*<0.05，P**<0.01，P***<0.001；

图4为斑马鱼黑色素相关基因mRNA的时空表达；

图5为金线莲醇提物对斑马鱼酪氨酸酶活性的影响；

图6为金线莲醇提物对斑马鱼幼鱼美白效果的研究；

图7为金线莲醇提物对斑马鱼黑色素的抑制效果的可逆性实验结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

1.材料与方法

1.1实验材料

福建金线莲由闽南师范大学菌物产业工程技术中心所提供。

斑马鱼(Daniorerio)为TU品系，28℃淡水中饲养,采用14h光照/10h黑暗的光照周期，水循环系统的pH值保持在6.9～7.5，每日喂3次丰年虾。

实验前一日，挑选发育正常，达到性成熟的斑马鱼放置于配鱼缸中，将雌雄鱼用隔板分开，于次日上午8:30抽离中间隔板，30min后收集受精卵于含有Holfreter水(0.05g/LKCl，0.1g/L CaCl₂，0.025g/L NaHCO₃，3.5g/L NaCl)的培养皿中，28℃恒温培养。

1.2方法

1.2.1金线莲组分的分离与提取

准确称量1kg新鲜的金线莲全草，要用剪刀把金线莲全草剪碎，按料液比1:4加入蒸馏水，均质及粉碎，80℃水浴1h，期间不时搅拌，离心收集上清，沉淀物重复水浴1h，离心收集上清，把两次提取液合并，上清用旋转蒸发仪蒸发浓缩至一定体积，一部分用真空冻干机冻干，获得组分一：金线莲总提物。另一部分加入4倍浓缩体积的无水乙醇，放置于4℃冰箱沉淀12h。第二日通过抽滤把醇沉物和醇提物分离，获得的醇提物蒸发浓缩至一定体积，真空冻干机冻干，获得组分二：金线莲醇提物；醇沉物加入蒸馏水溶解，旋转蒸发仪蒸发浓缩至一定体积后用真空冻干机冻干，获得组分三：金线莲醇沉物。

1.2.2金线莲在斑马鱼中美白作用活性组分的筛选

药物浓度的确定：为了探索金线莲各组分(金线莲总提物，金线莲醇沉物，金线莲醇提物)对斑马鱼胚胎作用的最佳浓度，本文以6孔板为实验容器，每个组分设置5个浓度梯度，分别为0μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL、1000μg/mL(所有药剂均溶于Holfreter水)。每孔加入30枚胚胎，每12h挑走死亡胚胎并做好记录，更换药物，放置于28℃恒温培养箱培养。待胚胎发育至72h时统计胚胎死亡数同时观察发育状况。

胚胎暴露实验：收集受精后0.75h的胚胎分到六孔板，每孔30枚。每个组分按照探究好的最佳浓度梯度加药，每12h换药。总提物组分和醇沉物组分最佳浓度梯度均为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL；醇提物组分最佳浓度梯度为100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL。因熊果苷是氢醌的重要衍生物，具有安全性高、美白效果明显等特点,本文以200μg/mL熊果苷(Arbutin，Ar)溶液作为标准阳性对照。待胚胎发育至72h时，在体视显微镜下观察其体表黑色素沉着情况，拍照并记录分析。选择美白效果最佳的组分进行后续的实验。

1.2.3黑色素合成基因的表达

1.2.3.1引物设计

本研究中所有基因序列从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/上下载，引物通过软件Primer 6.0设计。引物序列如表1所示。

表1黑色素相关基因的引物序列

1.2.3.2半定量PCR检测黑色素合成基因的表达

按照(1.4.2)中的方法用金线莲醇提物处理，待胚胎发育至72h，每组各收集50枚，提total RNA，将RNA反转录成cDNA，作为半定量PCR的模板。PCR扩增条件如下所示：1)95℃5min；2)95℃30sec；3)65℃30sec，之后每个循环降低3℃；4)72℃30sec；5)重复2)到4)6个循环；6)95℃30sec；7)56℃30sec；8)72℃30sec；9)重复6)到8)27个循环；10)72℃10min；11)16℃1h。

1.2.3.3整胚原位杂交实验试剂与方法

原位杂交中所用探针的制备方法，原位杂交所需要的试剂的配制方法和具体的操作步骤参照文献：薛钰.斑马鱼胚胎组织中心表达的Bmp信号在背腹分化中的作用.2014,清华大学。

1.2.4斑马鱼胚胎酪氨酸酶酶活性检测

受精后0.75h的胚胎分别加入0μg/mL、100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL金线莲醇提物和200μg/mL熊果苷，待胚胎发育至72h时，每个浓度收集50枚胚胎，置于1.5mL离心管中，先用Holfreter水洗两遍，再用PBS洗两遍，5000r/min离心3min，把液体吸干，得到胚胎。向离心管中加入200μL PBS缓冲液，在冰浴条件下，用高速研磨棒把组分研磨均匀，直至看不见胚胎团块。12000r/min、4℃离心5min，所得到的上清液即为酪氨酸酶酶液。

使用考马斯亮蓝法制作蛋白标曲，绘制成标准曲线，得到标准蛋白方程y＝0.0142x+0.3059(R²＝0.9903)。此方程将用于接下来实验中蛋白含量的计算。

测得的样品蛋白质的OD_595nm值带入标准曲线中计算出样品蛋白含量，再根据ΔA值(样品组吸光值-灭活样品组吸光值)，代入酶活力公式：

酶活力(U/g)＝(ΔOD×V×N×1000)÷(6.22×t×0.5×M)。

1.2.5金线莲醇提物在斑马鱼黑色素大量形成情况下的美白效果的研究

斑马鱼黑色素在24h开始形成，72h黑色素已经大量形成，我们想探究金线莲醇提物在斑马鱼黑色素已经大量形成的情况下是否仍然具有美白效果。按照(1.4.2)中的方法用金线莲醇提物在胚胎发育至72h时加药处理，待斑马鱼幼鱼发育至5d时,用体式显微镜观察斑马鱼体表的黑色素和黄色素沉着情况，并检测幼鱼体内黑色素合成相关基因的表达和酪氨酸酶活性。

2结果与分析

2.1金线莲在斑马鱼中美白作用活性组分的筛选

2.1.1药物浓度的确定

收集受精后0.75h的胚胎，分别暴露于3个组分的金线莲提取物，每组分设置0μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL、1000μg/mL5个浓度梯度。待胚胎发育至72h观察并记录胚胎发育及死亡情况，结果如图1所示。总提物组分浓度在750μg/mL以上时，胚胎死亡率达到100％，在500μg/mL浓度时，有一半的胚胎死亡，并且胚胎有明显的发育延缓现象，在300μg/mL及以下浓度时胚胎发育正常，胚胎死亡率较低，因此最终确定总提物组分浓度梯度为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL。在任一相同浓度下，醇沉组较其他两种组分死亡率均是最高，醇沉组浓度梯度设置与总提物组分相同：100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL。醇提组的致死率为三组中最低，在高浓度(1000μg/mL)时，胚胎死亡率为80％，中浓度下(500μg/mL)死亡率是30％，并且胚胎发育状况良好，故醇提组浓度梯度设置为100μg/mL、300μg/mL和500μg/mL。

2.1.2斑马鱼胚胎暴露实验

斑马鱼胚胎经过不同金线莲提取物处理后观察72h色素沉着情况，结果图2所示。空白对照组眼部、背脊两侧、背脊部黑色素和黄色素沉积明显(图2A，F，K)，金线莲总提物和醇沉物的高浓度组与未经处理的胚胎相比眼部和背脊部黑色素沉着只有少许减少(图2D，I)。与未经处理的胚胎相比，醇提组眼部和背脊部的黑色素和黄色素沉着明显减少，其中对黄色素的抑制作用甚至比阳性对照强(图2N，O)，而且随着药物浓度的增加，抑制黑色素和黄色素沉着的作用逐渐增强。金线莲总提组和醇沉组虽然对黑色素也具有一定的抑制作用，由于总提组成分更加广泛和不确定，而醇沉组对胚胎具有较高的毒性及发育致缓效应，因此本研究以醇提组为主要研究对象进行后续的实验。

2.2半定量PCR检测黑色素合成相关基因的表达

金线莲醇提物在斑马鱼胚胎中的美白效果最明显且毒副作用最小，因此本研究通过检测斑马鱼黑色素相关基因的表达,进一步探索金线莲醇提物如何抑制黑色素的形成。

以β-actin为内参，利用半定量PCR检测dct、oca2、silv、tyrp1b、tyr、mitfa基因的表达，其结果如图3所示。与对照组相比，加入醇提物组分后dct、oca2、silv的电泳条带亮度明显下降，tyrp1b、tyr、mitfa条带亮度相对于对照组有减弱趋势，并且随着金线莲醇提物浓度的升高而逐渐减弱(图3A)。利用ImageJ软件计算各个基因mRNA的相对表达量(图B-G)，统计分析表明：加药组中dct、oca2、silv的mRNA水平相对于对照组明显下降，其中高浓度组(500μg/mL)的基因表达量减少到对照组的50％左右，oca2在低浓度(100μg/mL)下其表达量已显著下降；tyr基因的表达随着加药浓度增加呈浓度梯度减弱，在高浓度(500μg/mL)下表达量明显下降；mitfa的表达虽有减弱，但其差异并不显著。以上结果表明：金线莲醇提物可以抑制黑色素合成相关基因的表达，并且随着浓度的升高抑制效果越明显。

2.3检测斑马鱼黑色素相关基因mRNA的时空表达

本发明进一步通过整胚原位杂交技术验证金线莲醇提物是否影响了黑色素合成相关基因mRNA时空表达。胚胎加入金线莲醇提物处理至72h，检测tyr、silv、tyrp1a、tyrp1b的时空表达变化。

从图中(图4A-E，K-O)可以看出tyr、tyrp1a的染色部位主要在眼部、脊柱两侧区域的表皮细胞，tyr的表达在低浓度处理组(100μg/mL)有略微变弱(图4A-B)，高浓度组(500μg/mL)眼部和脊柱两侧的染色部位颜色比对照组明显变浅，甚至比阳性对照都浅，与半定量PCR结果一致(图4D-E)；tyrp1a加药组与对照组相比颜色变浅较为明显，高浓度组(500μg/mL)染色基本消失(图4K-O)。从图中(图4F-J，P-T)可以看出silv、tyrp1a的染色部位主要在眼部、脊柱两侧、背部神经嵴区域，随着药物浓度的增加，眼部、脊柱两侧、背部神经嵴区域的颜色逐渐变浅，高浓度组(500μg/mL)染色基本消失。上述结果表明金线莲醇提物可以抑制tyr、silv、tyrp1a、tyrp1b的时空表达，并且随着加药浓度的增加，抑制效果逐渐加强。综合以上两部分实验结果表明金线莲醇提物可以通过抑制黑色素合成相关基因的转录水平从而抑制黑色素的形成。

2.4酪氨酸酶活性测定

酪氨酸酶是酪氨酸和多巴向黑色素转变过程中的主要限速酶，在黑色素的合成过程中起着关键性的作用。为了验证金线莲醇提物是否对斑马鱼体内的酪氨酸酶活性有影响，本发明对发育至72h的斑马鱼幼鱼进行了酪氨酸酶活性的测定，结果如图5所示。

从图5中可以看出，与对照组相比，低浓度醇提组幼鱼的酪氨酸酶活性有降低但没有显著性。随着金线莲醇提物浓度的增加，酪氨酸酶的活性逐渐降低，高浓度组(500μg/mL)酪氨酸酶活性显著降低，仅是对照组的1/3，效果甚至强于阳性对照组(Ar)，与半定量PCR和整胚原位杂交结果相一致。表明金线莲醇提物可以抑制酪氨酸酶的活性，从而抑制黑色素的产生。

2.5金线莲醇提物在斑马鱼黑色素大量形成情况下依然具有抑制作用

金线莲醇提物对斑马鱼早期胚胎具有美白效果。斑马鱼黑色素在24h开始形成，72h黑色素已经大量形成，为探究金线莲醇提物在斑马鱼黑色素已经大量形成的情况下是否仍然具有美白效果，本发明在胚胎发育至72h时开始加金线莲醇提物，处理48h之后观察5天幼鱼体表黑色素沉着情况，检测酪氨酸酶活性及黑色素合成相关基因的表达。

从图中(图6A-D)可以看出加入金线莲醇提物组幼鱼眼部和背脊部的黑色素和黄色素沉着与对照组相比有较为明显的减少，与阳性药物的效果相差无几。且加入金线莲醇提物组的酪氨酸酶活性明显低于对照组，高浓度组酪氨酸酶活性降低到了对照组的40％，差异显著(图6E)。进一步通过半定量PCR检测黑色素合成相关基因的表达水平，结果如图6F所示：经过高浓度的金线莲醇提物处理后，tyr、tyrp1b、oca2的mRNA水平均有明显下调，统计分析具有显著性差异。其中tyrp1b、oca2的基因相对表达量减少到对照组的60％左右；金线莲醇提物对tyr基因的抑制效果尤为明显。实验结果表明，在色素已经大量形成的情况下，金线莲醇提物仍然可以抑制斑马鱼幼鱼体内酪氨酸酶的活性及黑色素合成相关基因的表达，具有美白效果。

2.6金线莲醇提物对斑马鱼黑色素的抑制效果具有可逆性

本发明在探讨金线莲对黑色素的抑制效果的同时，也进一步探究了该抑制效果是否具有可逆性。如图7所示，胚胎受精后0.75h加入500μg/mL金线莲醇提物处理至72h，置换回正常培养液(Holfreter水)，持续观察体表色素沉着及发育状况，发现至第7天，约80％的幼鱼体表色素的恢复接近于未处理组(图7A)。另一种情况下，即：在黑色素大量形成的72h时期加入醇提物，处理2天后置换成Holfreter水培养,其色素也会逐渐恢复，直至第9天体表色素的恢复接近于未处理组，比例超过70％。由此推测，在撤销药物之后的第4天开始，黑色素能可逆地恢复到接近未处理组的水平，且加药的斑马鱼发育到第9天时发育状况良好，和未处理组发育时期一致。结果表明：金线莲醇提物对斑马鱼黑色素的抑制效果具有可逆性。

3讨论

本发明利用斑马鱼筛选金线莲具有美白效果的活性组分，克服了体外细胞模型和哺乳动物模型的不足。实验结果表明，加入金线莲醇提物组与加入其他两种组分(醇沉物组和总提取物组)的斑马鱼相比较，黑色素和黄色素沉着明显减少，初步筛选出金线莲醇提物在斑马鱼黑色素形成过程中具有最佳的抑制效果；本研究还对金线莲醇提物的美白功效进行了初步的机理研究，结果显示：金线莲醇提物通过抑制黑色素相关基因的表达，进而抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的合成，从而发挥美白功效；此外，金线莲醇提物在斑马鱼黑色素已经大量形成的情况下其抑制效果依旧显著，并且这种抑制效果具有可逆性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种金线莲的提取方法，其特征在于，包括：

1).将金线莲剪碎后加水粉碎，水浴后离心收集提取液；

2).将所述提取液浓缩后加入无水乙醇低温沉淀，抽滤并去除沉淀获得醇提物；醇提物浓缩后真空冻干即得。

2.根据权利要求1所述的金线莲的提取方法，其特征在于，在步骤1)中，所述金线莲与所述水的固液比为1g：3ml～5ml。

3.根据权利要求1所述的金线莲的提取方法，其特征在于，在步骤1)中，所述水浴后离心收集提取液具体为水浴提取两次，包括：

水浴后离心，收集上清；

将沉淀重复水浴后再次离心收集上清；

合并两次上清得到提取液。

4.根据权利要求3所述的金线莲的提取方法，其特征在于，每次水浴的条件均为：75℃～85℃水浴50min～70min。

5.根据权利要求1所述的金线莲的提取方法，其特征在于，在步骤2)中，所述无水乙醇低温沉淀具体为2℃～6℃沉淀8h～16h。

6.权利要求1～5任一项所述的金线莲的提取方法提取得到的金线莲提取物。

7.权利要求6所述的金线莲提取物在抑制黑色素合成相关基因表达中的应用；

优选的，所述黑色素合成相关基因包括tyr、silv、tyrp1a、tyrp1b、dct以及oca2。

8.一种美白护肤品，其包括权利要求6所述的金线莲提取物。

9.根据权利要求8所述的美白护肤品，其还包括溶剂、收敛剂、稳定剂、增稠剂、调理剂、保湿剂、pH调节剂、表面活性剂、抗氧化剂、清凉剂、乳化剂、防腐剂、着色剂、分散剂、芳香剂中的至少一种。

10.根据权利要求8所述的美白护肤品，其特征在于，所述美白护肤品的制剂包括水剂、精华液、面膜、乳液和膏霜。