TW201319572A - 類氨醯氧化酶樣2(lysyl oxidase-like 2)測定及其使用方法 - Google Patents
類氨醯氧化酶樣2(lysyl oxidase-like 2)測定及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TW201319572A TW201319572A TW101119847A TW101119847A TW201319572A TW 201319572 A TW201319572 A TW 201319572A TW 101119847 A TW101119847 A TW 101119847A TW 101119847 A TW101119847 A TW 101119847A TW 201319572 A TW201319572 A TW 201319572A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- loxl2
- disease
- antibody
- level
- individual
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Silicon Polymers (AREA)
Abstract
本揭露提供了檢測和/或量化個體中循環賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)多肽的測定法。該測定法對於診斷和預防應用是有用的,也被提供在此。
Description
本申請要求2011年6月01日提交的美國臨時申請號61/492,210、2011年10月24日提交的美國臨時申請號61/550,895、以及2011年12月21日提交的美國臨時申請號61/578,813的權益,出於所有目的將該等申請的揭露內容藉由引用以其全文結合在此。
賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)係一細胞外基質蛋白。在健康成體組織中很少觀察到細胞外LOXL2,但其表達在各種纖維化疾病和腫瘤中被誘導。它被活化的成纖維細胞、疾病相關平滑肌細胞、內皮細胞以及上皮細胞所隱藏。
本揭露涉及賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)例如LOXL2多肽的檢測、以及它們在診斷、預後和預測方法中的用途。例如,提供了用於檢測和/或量化LOXL2的測定法,例如用於檢測和/或量化個體中循環賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)多肽的測定法。還提供了此類測定法在診斷、預後和預測應用中的方法和用途以及其中所用的測定裝置和試劑盒。
提供了用於檢測在個體中的LOXL2(典型地是循環LOXL2)的方法。在所提供的方法中有檢測、診斷、預測、監測和預後方法。在一些實例中,該等方法係藉由使從個體獲得的樣品(一般為液體樣品)與LOXL2特異性抗體接觸並檢測抗體與該樣品中存在的多肽(例如LOXL2多肽)的結合而進行的。在一些實例中,該測定法檢測液體樣品中的LOXL2係300、250、200、175 pg/mL或更少或檢測該樣品中的LOXL2的濃度係低至300、250、
200、175 pg/mL,例如低至從大約150 pg/mL至大約175 pg/mL、從大約125 pg/mL至大約150 pg/mL、從大約100 pg/mL至大約125 pg/mL、從大約75 pg/mL至大約100 pg/mL、從大約50 pg/mL至大約75 pg/mL、或從大約40 pg/mL至大約50 pg/mL。
在一些實例中,所檢測的LOXL2水平指示了疾病或病症的存在或缺乏。在一些實例中,它指示了該個體將對疾病的特定治療作出反應的可能性、或者指示了治療的效果。在一些實例中,例如當該等方法為預後方法時,所檢測的LOXL2水平指示了疾病或病症的結局、事件或終點的可能性。在一些方面,該疾病或病症的特徵係或者與之相關聯的是循環LOXL2或者循環LOXL2的升高。在一些方面,該個體患有該疾病或病症;在一些方面,該個體被懷疑患有該疾病或病症。在一些方面,該等方法進一步包括確定該個體是否患有該疾病或病症、有無可能對特定治療作出反應、或者有無可能具有特定的結局或事件、或者治療是否是有效的。
在一些實例中,該個體正在經歷對該疾病或病症的治療,並且低於在更早時間點測定的水平(如治療前的水平)的檢測LOXL2水平指示了治療的效果。
該樣品典型地是一液體樣品,例如血液、血成分如血清或血漿、尿、唾液、痰、或支氣管肺泡灌洗液。
在一些實例中,該抗體包括可檢測標記;示例性的標記包括化學發光劑、顆粒標記、比色劑、能量傳遞劑、酶、螢光劑、以及放射性同位素。在一些實例中,藉由使液體樣品與LOXL2的第二特異性抗體相接觸而形成第二抗體-LOXL2複合物,以此將樣品中存在的LOXL2固定在不溶性載體上。在一實例中,該第二載體被固定在該不溶性載體上。在另一實例中,該第抗體-LOXL2複合物係在使樣品與抗體接觸之前形成的。該固定抗體可以是多克隆的或單克隆的。在一些實例中,當LOXL2被結合到一抑制LOXL2的酶活性的試劑(例如LOXL2酶活性的變構抑制劑,例如一抗LOXL2單克隆抗體,例如
結合在SRCR3-4域之內的表位的一抗LOXL2單克隆抗體)上時,該抗體結合了LOXL2。
與所提供的方法和實施方式結合使用的抗LOXL2抗體的實例包括例如:AB0023;AB0024;具有重鏈可變區的抗體,該等重鏈可變區具有的氨基酸序列係如在SEQ ID NO:6、8、10、11、或12中列出的、或者與SEQ ID NO:6、8、10、11、或12具有75%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、或99%或更多的同源性,或者具有如在SEQ ID NO:6、8、10、11、或12中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3;和/或者具有輕鏈可變區的抗體,該等輕鏈可變區具有的氨基酸序列係如在SEQ ID NO:7、9、13、或14中列出的、或與SEQ ID NO:7具有75%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、或99%或更多的同源性,或者具有如在SEQ ID NO:7、9、13、或14中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3,例如以下抗體:其具有CDR1、CDR2、和/或CDR3的重鏈或在SEQ ID NO:8中列出的可變區序列的整個序列以及具有CDR1、CDR2、和/或CDR3的輕鏈可變區或在SEQ ID NO:9中列出的可變區序列的整個序列。
在一些實例中,該等方法進一步包括將檢測水平與正常對照值進行比較,當檢測水平高於正常對照值時指示該疾病或病症的存在、個體將對該疾病或病症的治療作出反應的可能性、或病理學結局的可能性。例如,在一些實例中,該等方法檢測了循環LOXL2的病理學水平。此類方法可以包括將檢測水平與正常對照或其他參考值進行比較,當檢測水平高於正常對照或參考值時指示一病理。
還提供了用於確定個體是否患有特徵為循環賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)升高或與之相關聯的疾病或病症、診斷這樣的疾病或病症、或關於這樣一疾病或病症做出預測或預後決定的方法。在多個實例中,根據在此提供的測定法和方法(如以上說明的那些)檢測來自例如個體的樣品(例如液體樣品)中的LOXL2水平來進行這樣的方法。典型地,大於正常對照水平、參考水平或在某些情況下大於基線的一LOXL2水平指示:該個體患有特
徵為循環LOXL2升高的疾病,或者指示了關於該疾病或病症的預後或預測資訊,例如預測特定結局的可能性或個體將對特定的疾病治療作出反應的可能性。
在所提供的方法的某些方面,該疾病或病症係纖維化或癌症或與之相關的疾病。實例包括肺纖維化(例如特發性肺纖維化)、肝纖維化、腎纖維化、心臟纖維化、骨髓纖維化、肝硬化、慢性病毒性肝炎、丙型肝炎病毒(HCV)感染、以及乙型肝炎病毒(HBV)感染。在一些方面,該疾病或病症係特發性肺纖維化(IPF)。
該等方法可以進一步包括對個體進行一或多種進一步的診斷試驗,該等診斷試驗可以包括肺功能試驗、心功能試驗以及肝功能試驗。
還提供了用於確定患有纖維化疾病的個體將對纖維化疾病的治療顯出有益臨床反應的可能性。此類方法包括例如藉由以上說明的方法確定例如在從個體獲得的液體樣品中的賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)的循環水平。在一方面,大於正常對照水平的LOXL2循環水平表明,該個體具有對纖維化疾病的治療顯出有益臨床反應的增加的可能性。在一些實例中,基於所確定的可能性產生報告。在一些實例中,該等方法進一步包括治療個體的纖維化疾病。在一些實例中,該個體具有活動性纖維化疾病,例如METAVIR F1或F2肝纖維化、和/或晚期纖維化疾病,例如METAVIR F4肝纖維化。
還提供了用於確定一治療對個體中特徵為賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)升高的疾病的效果的方法。在一些實例中,根據以上以及在此提供的檢測方法確定一經歷該疾病治療的個體中在一時間點處的循環LOXL2水平來進行這樣的方法。典型地,該樣品中循環LOXL2水平低於在更早時間點從該個體獲得的水平(如治療前的水平)指示了治療的效果。可替代地,該樣品中的循環LOXL2水平最初可能增加,之後由身體清除。
同樣,在所提供的該等方法之中是針對特發性肺纖維化(IPF)的預測和診斷方法。在一些實例中,藉由從個體中獲得一樣品、並且例如使用
在此說明的方法來檢測該樣品中的LOXL2水平來進行這樣的方法。通常,LOXL2水平指示了在該個體中的IPF疾病結局或事件的可能性。
在此提供的該等以及其他方法還可以包括將LOXL2的檢測水平與LOXL2的正常對照水平進行比較的一步驟,相比于正常對照水平的LOXL2水平升高指示在該個體中的IPF疾病結局或事件出現的可能性增加。在所提供的該等方法的一些實施方式中,高於閾值基線水平的LOXL2水平係與受試者中消極結果和死亡率相關的。在一實例中,樣品中的閾值LOXL2水平係至少800皮克(pg)每毫升(mL)、至少600 pg/mL、至少400 pg/mL、或至少200 pg/mL。在另一實例中,樣品中的閾值LOXL2水平係至少440 pg/mL。在一實例中,該方法指示了在該個體中IPF疾病結局的可能性與具有的LOXL2水平等於正常對照LOXL2水平或基線的受試者相比增加了至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、或7倍。
在該等IPF疾病結局和事件之中有IPF疾病進展(例如定義為由任何原因造成的死亡率、呼吸系統疾病住院治療(respiratory hospitalization)或肺功能方面的絕對下降)、肺功能下降、呼吸系統疾病住院治療、無移植存活率(transplant-free survival)、死亡、以及對治療的反應性。在一些情況下,該等方法預測了在個體中與IPF相關的結局、事件、或終點、或其可能性。在一些情況下,該等方法預測了在一已經藉由另一方法或測定法被認為對於這樣的結局、終點或可能性係“消極”的個體中的結局、終點或可能性,該另一方法或測定法係例如基於個人臨床和分子死亡率指數(PCMI)或一或多種其他生物標記如MMP7、ICAM1、IL8、VCAM1、和S100A12的水平(或這樣的其他方法或測定法不檢測或不能檢測其結局、事件、終點或可能性的那些)。
該預測或預後性IPF方法可以進一步包括檢測個體中對IPF疾病嚴重性或功能狀態的量度,該量度係選自下組,該組由以下各項組成:預測的用力肺活量(FVC)的百分比、預測的一氧化碳彌散量的百分比(DLCO)、6分鐘步行距離(6MWD)、肺動脈平均壓(mPAP)、最低靜息氧飽和度
(SpO2)、複合生理指數(CPI)、聖喬治呼吸問卷得分(SGRQ)、以及變化呼吸困難指數(TDI)得分、對治療的反應、以及IPIF疾病的生物標記。在一些實例中,該等方法進一步包括分析LOXL2水平和/或使用預測模型對疾病嚴重性或功能狀態進行測量。
還提供了用於監測個體對IPF治療的反應或者確定個體將對治療作出反應的可能性的方法。在一實例中,藉由從經歷IPF治療的個體中獲得一樣品、並且檢測在該樣品中的LOXL2水平來進行這樣的方法。典型地,該LOXL2水平指示了個體對治療的反應性或個體將對治療作出反應的可能性。
在一些病例中,該等方法進一步包括開始、改變、或中斷個體中的IPF治療。在一些實例中,基於由該等方法所確定的資訊,例如LOXL2的水平或相對水平或診斷或預測資訊來開始、改變、或中斷治療。在一些實例中,在確定LOXL2水平之前開始治療。
還提供了用於所提供的方法中的測定裝置和試劑盒,例如用於確定從個體獲得的液體生物樣品中的賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)多肽的水平。在一實施方式中,這樣的裝置包括一限定了軸向流動路徑的基質,該基質包括i)在該流動路徑的上游端接收流體樣品的一樣品接收區;ii)位於該流動路徑內並且在該樣品接收區下游的一或多個測試區,該一或多個測試區各自包括一LOXL2特異性抗體,其中該等LOXL2特異性抗體各自能夠結合在該液體樣品中存在的LOXL2多肽而此形成一抗LOXL2抗體/LOXL2複合物;以及iii)位於該流動路徑內並且在該樣品接收區下游的一或多個對照區。
當存在兩個測試區時,該一或多個對照區可以位於該等測試區之間。該等測試區和對照區可以按交替的形式位於該流動路徑內,以位於任何對照區上游的一測試區開始。在一實例中,該等抗LOXL2抗體中的一或多種被固定在測試區中的基質中。
在一些實例中,該裝置進一步包括一標記區,該標記區包括對於LOXL2特異性抗體係特異性的標記抗體。通常,該標記抗體能夠結合在抗LOXL2抗體/LOXL2複合物中存在的抗LOXL2抗體從而形成標記的抗LOXL2
抗體/LOXL2,並且該標記的抗體在液體樣品的存在下是可移動的。該標記的抗體可以包括選自化學發光劑、顆粒標記、比色劑、能量傳遞劑、酶、螢光劑、以及放射性同位素之中的一標記組分。
在該等裝置的一些實例中,該基質位於一包含載體以及任選的覆蓋物的殼體中,其中該殼體含有一施用開口以及一或多個觀察口。在所提供的裝置之中有試條和浸漬測定裝置。
在所提供的用於確定從個體獲得的生物樣品中的賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)多肽水平的試劑盒中有包括對LOXL2特異性的第一抗體和對於LOXL2特異性的第二抗體的那些。該試劑盒還可以包括用於產生標準曲線的純化的LOXL2。在一實例中,該試劑盒中的該等抗體中的至少一種包括可檢測標記,例如化學發光劑、顆粒標記、比色劑、能量傳遞劑、酶、螢光劑、以及放射性同位素。
圖1描繪了87位患有慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染的病人的LOXL2血清濃度對比伊沙克(Ishak)纖維化得分。
圖2描繪了診斷為患有肝纖維化的病人的血清樣品中的LOXL2水平(pg/ml)。
圖3描繪了來自診斷為患有特發性肺纖維化的病人的血清樣品中的LOXL2水平。
圖4提供了人類LOXL2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
圖5顯示了來自人(H)(SEQ ID NO:2)、小鼠(M)(SEQ ID NO:3)、大鼠(R)(SEQ ID NO:4)和短尾猴(C)(SEQ ID NO:5)的LOXL2蛋白的催化區的氨基酸序列的比對。在小鼠、大鼠和短尾猴蛋白中的殘基與人類蛋白的不同,以底線表示。
圖6顯示了在人纖維化肝組織中LOXL2的表達,藉由來自患有慢性HCV感染的病人的肝組織的免疫組織化學(IHC)染色來確定。在左圖(5x物鏡放大)中,黑色箭頭指示了纖維擴展進入肝門區和肝門束中的區域。白色箭頭指示了肝小葉周圍的短纖維性隔膜的區域。右圖(40x物鏡放大)顯示了在纖維性隔膜(S)中、在與肝細胞(H)的介面處、在竇周間隙(箭頭)內、以及在肝實質(箭頭)中的成肌纖維細胞中觀察到的LOXL2免疫反應性。
圖7顯示了LOXL2免疫測定的標準校準曲線,將原始ECL(電化學發光)計數繪製在y軸上並且將LOXL2濃度(nM/L)繪製在x軸上。將純化過的重組全長LOXL2蛋白加入混合正常人血清中、然後在血清中序列稀釋以創建校準曲線。每個數據點代表三個複孔的平均值;顯示了四個獨立板的曲線。
圖8顯示了預分組的(binned)基線伊沙克纖維化得分和時間的LOXL2血清水平。每個圖在所指示的時間點顯示了根據伊沙克纖維化得分而分組的兩組病人(分別是1-3和5-6)的LOXL2濃度(pg/mL)。LOXL2濃度在繪圖範圍之外的三個離群值(LOXL2濃度=5529、6621、8845 pg/mL)全都來自同一受試者,具有的伊沙克纖維化得分為5。
圖9顯示了中位元受試者內LOXL2血清水平,計算為根據伊沙克纖維化得分而分組的兩組病人(分別是1-3和5-6)在經過4-30周的中位LOXL2血清濃度。平均受試者內變異係數為22%。
圖10顯示了預分組的基線伊沙克纖維化得分的隨時間(周)過去的中位LOXL2血清濃度(pg/mL),具有95%的置信區間。僅一位元受試者在研究活組織檢查之間在經過25-28周在伊沙克纖維化得分方面具有大於或等於2的變化。
圖11顯示了具有所指示的伊沙克得分(1-6)的受試者的中位受試者內LOXL2水平對比透明質酸(HA)(左圖)和金屬蛋白酶1(T1MP1)的
組織抑制劑(右圖)的水平。中位受試者內表達被計算為經過4周至30周的中間表達。使用局部加權的散佈圖平滑化來構建該曲線。
圖12顯示了散佈圖矩陣,展示了在基線LOXL2水平(具有圖(a)中未轉換的LOXL2水平以及圖(b)中Log10X-轉換的LOXL2水平)與對特發性肺纖維化(IPF)嚴重性和功能狀態的基線測量之間的相關,如在實例9中所述。在每個圖中,第一行第一列的x和y軸分別代表基線LOXL2水平;第二行第二列的x和y軸分別代表基線預測的用力肺活量(FVC);第三行第三列的x和y軸分別代表預測的一氧化碳彌散量的基線百分比(DLCO);第四行第四列的x和y軸分別代表基線6-分鐘步行距離(6MWD);第五行第五列的x和y軸分別代表基線複合生理指數(CPI);第六行第六列的x和y軸分別代表基線聖喬治呼吸問卷得分;並且第七行第七列的x和y軸分別代表變化呼吸困難指數得分。在LOXL2與IPF嚴重性和性能狀態的基線測量之間的關聯在頂排的圖(a)和(b)的暗框中高亮顯示。
圖13顯示了卡普蘭邁耶曲線,將針對疾病進展(PFS)(圖(a))及其組分:肺功能下降(圖(b))、呼吸系統疾病住院治療(圖(c))和死亡(圖(d))的低(800 pg/mL)和高(>800 pg/mL)LOXL2水平進行比較。在每個圖中,頂部較暗的線代表具有低(800 pg/mL)基線血清LOXL2水平的病人,而下部較亮的線代表具有高(>800 pg/mL)基線LOXL2水平的病人。所有病人都用安貝生坦進行治療。每個y軸顯示了無給定事件(沿該軸標記了0、25、50、75、和100)的病人百分比,並且每個x軸顯示了以天計的時間(沿該軸標記了0、100、200、300、400、500、600、700、和800天)。
圖14顯示了在ARTEMIS-IPF受試者(14A:安慰劑和安貝生坦治療的受試者組合;14B:僅安貝生坦)與GAP群組受試者中的基線LOXL2分佈的比較。
圖15A顯示了在GAP群組研究中的基線之後6個月(左上圖)、12個月(右上圖)、18個月(左下圖)和24個月(右下圖)時根據低(上面的
線,440 pg/mL)對比高(下面的線>440 pg/mL)的血清LOXL2水平的全因死亡率的卡普蘭邁耶曲線。圖15B顯示了在ARTEMIS-IPF研究中的基線之後6個月(左上圖)、12個月(右上圖)、18個月(左下圖)和24個月(右下圖)時根據低(上面的線,800 pg/mL)對比高(下面的線>800 pg/mL)的血清LOXL2水平的全因死亡率的卡普蘭邁耶曲線。
圖16顯示了不同受試者群體的平均血清LOXL2水平(pg/mL)。圖16A顯示了針對基線以及240周的樣品(總計162個樣品,對於每81個受試者一基線以及240周),根據相應受試者的伊沙克纖維化得分(0、1、2、3、4、5、6,從左到右)分組的平均血清LOXL2水平。LOQ=量化水平。圖16B顯示了在基線和240周時具有給定伊沙克階段(0、1、2、3、4、5、6,從左到右)的受試者的基線和240周的平均血清LOXL2水平。圖16C顯示了在1至3之間和4至6之間的相應伊沙克階段的病人的基線、240周、以及總體血清LOXL2水平。
圖17顯示了在該研究中具有每個給定伊沙克階段的被確定為具有給定的血清LOXL2水平(pg/mL)的受試者的百分比(1、2、3、4、5、6,(從左到右的單獨條))。LOD=檢測限;LOQ=定量限。所示的每個範疇從前一範疇的上限擴展,例如1500=1001-1500 pg/mL。
圖18顯示了在對單獨的CHB受試者進行治療之後在基線和240周的血清LOXL2水平(pg/mL)。圖18A:患有永久肝硬化的受試者(n=16);圖18B:到240周肝硬化逆轉的受試者(n=42);圖18C:到240周沒有經歷纖維化階段改變的非肝硬化受試者(伊沙克);圖18D:在研究過程中經歷了到肝硬化進展的受試者;以及圖18E:在纖維化方面具有大於或等於2個階段的減少(伊沙克得分)的非肝硬化受試者。LOQ(定量限)=440 pg/mL,LOD(檢出限)=180 pg/mL。
圖19顯示了作為組織學改進的預測物的基線LOXL2。此圖顯示了在240周顯出組織學改進的、具有給定的基線血清LOXL2水平(<1500、>
1500、1500-3000、<3000、以及>3000 pg/mL)的肝硬化CHB受試者(“Y”)的百分比;以及被確定為在240周沒有組織學改進的、具有相同的給定的基線血清LOXL2水平的肝硬化受試者(“N”)的百分比。
如在此使用的,術語“抗體”表示包括特異性結合抗原表位所必須的可變區序列的一分離或重組結合劑。因此,抗體係展示出所希望的生物活性(例如,結合特異性目標抗原)的任何形式的抗體或其片段。因此,它在最廣的意義上使用並且確切地覆蓋了單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、人抗體、人化抗體、嵌合抗體、奈米抗體、雙體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、以及抗體片段,包括但不限於scFv、Fab、和Fab2,只要它們展示出所希望的生物活性即可。術語“人抗體”因此是指含有人來源的序列的抗體,除了可能的非人類互補決定區(CDR)區域,並且並不意味著存在Ig分子的全結構,而僅僅是該抗體在人體中具有最小的免疫效果。
“抗體片段”包括一完整抗體的一部分,例如該完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段;雙體;線性抗體(Zapata等人,Protein Eng.[蛋白工程]8(10):1057-1062(1995));單鏈抗體分子;以及由抗體片段形成的多特異性抗體。抗體的木瓜蛋白酶消化產生了兩個完全相同的抗原結合片段,稱為“Fab”片段,每個具有單個抗原結合位點;以及一殘餘“Fc”片段,該命名反應了容易結晶的能力。胃蛋白酶治療產生了F(ab')2片段,該片段具有兩個抗原結合位點並且仍然能夠交聯抗原。
“Fv”係含有完整的抗原識別和結合位點、並且由具有處於緊密非共價締合的一重鏈可變域和一輕鏈可變域的二聚體組成的抗體片段。在這種構型中每個可變域的三個CDR相互作用而在該VH-VL二聚體表面上限定一抗原結合位點。六個CDR共同地對該抗體給予了抗原結合特異性。然而,即使單一
可變域(或包含僅三個抗原特異性CDR的Fv的一半)也具有識別和結合抗原的能力,雖然親和力小於整個結合位點。
該“Fab”片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CH1)。Fab片段與Fab'片段的不同之處是在重鏈CH1域的羧基末端添加了少數殘基,包括來自該抗體鉸鏈區的一或多個半胱氨酸。Fab'-SH在此指代Fab',其中該等恒定域的半胱氨酸殘基帶有一自由硫醇基。F(ab')2抗體片段最初是作為Fab'片段對產生的,在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其他化學偶聯也是已知的。
如在此使用的,術語“生物樣品”可以指代多種從個體中獲得的、可以用於檢測、診斷、預後或監測分析的樣品類型。液體生物樣品典型可以包括例如血液、血成分(如血清或血漿)、尿、唾液、支氣管肺泡灌洗液、痰、或腦脊液。該定義還包括已經在其獲取之後以任何方式進行處理的樣品,例如藉由用試劑進行處理、增溶、或富集某些成分例如蛋白質。
如在此使用的“軸向流”係指穿過包括一或多個測試和/或對照區的具體基質或材料的側向、垂直的或橫向的流。在特定的裝置、測定和方法中所考慮的流的類型根據該裝置的結構而變化。不受理論束縛,側向、垂直或橫向流可以是指液體樣品從在特定基質的一端或一側(上游或近端)上的流體接觸點到這個接觸的下游(或遠端)的一區域的流動。該下游區域可以是在距離該流體接觸點的基質的同一側上或對側上。例如,在本發明的某些實施方式的垂直流裝置中,軸向流可以從第一構件(從上到下)到第二構件並且從那裡到吸收介質垂直地前進。作為另一例子並且如熟習該項技術者將會理解的,在例如配置為浸漬片的垂直流裝置中,流體樣品可以完全沿裝置向上流動,然而在此情況下,流體樣品與裝置的第一接觸點仍然被認為是上游(即,近端的)端並且流動終止點係下游(即,遠端的)端。
如在此使用的,在軸向流的背景下術語“上游”和“下游”係指在流體樣品與本揭露的代表性裝置接觸之後流體樣品的流動方向,其中在正常的運行條件下該流體樣品流動方向從一上游位置向一下游位置延伸。例如,當流
體樣品最初與樣品接收區相接觸時,該流體樣品接著向下游流動穿過標記區等等。
在進一步描述本揭露的實施方式之前,應當理解的是本發明不局限於所描述的具體實施方式,同樣地實施方式當然可以改變。還應當理解的是在此使用的術語僅是為了描述具體實施方式的目的、並且不旨在進行限制。
當提供一數值範圍時,應理解的是,涵蓋了該範圍的上限與下限之間的每個居中值、至下限單位的十分之一(除非另外清楚指出),以及所述範圍內的任何其他陳述值或居中值。該等較小範圍的上限和下限可以獨立地包括在該等較小範圍內、並且受制於所述範圍內的任何明確排除的極限也被涵蓋。當所述範圍包括該等極限之一或兩者時,排除了極限所包括的其中之一或兩者的範圍也被包括。
除非另外定義,在此使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。雖然在本發明的實施方式的實踐或試驗中也可以使用與在此描述的該等類似或相同的任何方法和材料,但現在將對較佳的方法和材料進行描述。在此提及的所有公開物都藉由引用結合在此,以便揭露並描述引用該等公開物所結合的方法和/或材料。
必須注意的是,如在此以及在所附申請專利範圍中使用的,單數形式“一/一個/一種”(“a/an”)和“該”包括了複數指代物,除非上下文另外清楚地指出。因此,例如提及“一LOXL2特異性抗體”包括多種這樣的抗體,並且提及“該LOXL2多肽”包括提及一或多種LOXL2多肽以及熟習該項技術者已知的其等效物,等等。進一步要注意的是,該等申請專利範圍可以被起草為排除任何任選的要素。這樣,這種陳述旨在作為前置基礎用於諸如“僅僅”、“只是”等等的排他性術語與申請專利範圍要素的敘述結合使用、或使用“否定”限制。
應當理解的是,本發明的某些為了清楚起見而在單獨的實施方式的背景下描述的特徵也可以與單一實施方式組合地提供。反之,為簡要起見而在單一實施方式的背景下描述的各個提供的特徵也可以單獨地或在任何適當
的亞組合中提供。所提供的實施方式的所有組合都明確地被本揭露包括並且在此被揭露,就正如每個組合都單獨地且明確地被揭露。此外,該等不同的實施方式及其要素的所有亞組合也都明確地被本揭露包括並且在此被揭露,就正如每個這樣的組合都單獨地且明確地被揭露。
提供在此討論的公開物僅僅是因為它們的揭露係在本申請的申請日之前。在此任何內容都不得理解為承認本發明由於之前的發明而沒有資格先於此類公開物。此外,所提供的公開日可以與可能需要單獨確認的實際公開日不相同。
本揭露提供了檢測和/或量化個體中的LOXL2、通常是循環賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)多肽的測定法。該測定法對於也被提供的診斷和預後應用是有用的。
賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)表達在纖維化的人類肝組織中,其中它進行了膠原和其他基質組分的交聯,導致了僵硬、病理性成纖維細胞的活化以及基質重塑和纖維形成的動態過程增加。Barry-Hamilton V,Spangler R,Marshall D等人,“Allosteric inhibition of lysyl oxidase-like-2 impedes the development of a pathologic microenvironment[賴氨醯氧化酶樣2的變構抑制妨礙了病理微環境的發展],”Nat Med.[自然醫學]2010.16:1009-1017。LOXL2表達於來自各種病因的人類疾病的纖維化肝組織中,包括丙型肝炎感染1、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)1、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、威爾遜病(Vadasz Z,Kessler O,Akiri G等人,“Abnormal deposition of collagen around hepatocytes in Wilson’s disease is associated with hepatocyte specific expression of lysyl oxidase and lysyl oxidase like protein-2[在威爾遜病中肝細胞周圍的膠原異常沉積與賴氨醯氧化酶和賴氨醯氧化酶樣蛋白2的肝細胞特異性表達相關],”J Hepatology.[肝臟病學雜誌]2005.43:499-507)、以及原發性膽性肝硬化2、
除此之外還有硬化性膽管炎的小鼠模型。Nakken KE,Nygard S,Haaland T等人.“Multiple inflammatory-,tissue remodelling- and fibrosis genes are differentially transcribed in the livers of Abcb4(-/-)mice harbouring chronic cholangitis[多種炎性、組織重塑和纖維化基因在Abcb4(-/-)小鼠慢性膽管炎中不同地轉錄],”Scand J Gastroent.[斯堪的納維亞胃腸病學雜誌]2007.42:1245-1255。
使用單克隆抗體進行LOXL2的變構抑制對於抑制各種疾病模型(包括肝和肺纖維化的模型)中的纖維化是有效的。抑制LOXL2導致了TGFβ信號和若干關鍵前纖維化介質(例如TGF-β1、CTGF、內皮素、CXCL12)1的下調;LOXL2係纖維化疾病中的核心路徑目標。Mehal WZ,Iredale J,& Friedman SL.,“Expressway to the core of fibrosis[到纖維化核心的快速路徑],”Nat Med.[自然醫學]2011.17:552-553。
膠原在肝實質中的逐步累積是慢性肝病的最後共同通路。這種纖維化的逐漸累積可以最終導致肝硬化和晚期肝病。LOXL2催化了膠原纖維的交聯並且是纖維形成的核心調節蛋白。LOXL2的表達在患病的肝組織中增加。
在健康成體組織中存在極少的LOXL2表達;並且在正常(例如非疾病)狀態下,循環LOXL2的量係低的或不可檢測的。在某些疾病狀況下,循環LOXL2升高。例如,在患有慢性肝病的患者的血清中LOXL2可能升高,例如在慢性丙型肝炎患者中,在患有更晚期纖維化的患者中水平更高。因此檢測循環LOXL2對於確定個體是否患有導致循環LOXL2水平升高的疾病是有用的。這樣的疾病包括纖維化和癌症。本揭露提供了用於確定個體是否患有與循環LOXL2水平升高相關的疾病的診斷方法。循環LOXL2的檢測可以在其他診斷方法之後,用於證實診斷或者排除個體具有特定疾病的可能性。
已經發現,循環LOXL2的水平與纖維化的階段相關。
還已經發現,循環LOXL2的水平可以提供一指示:具有纖維化的個體是否對纖維化治療作出回應,並且提供關於疾病的其他預後和預測資訊,例如具體終點、結局或事件的可能性,例如疾病結局或對治療的反應性。本
揭露提供了用於確定個體將對纖維化疾病作出反應的可能性和/或這樣的結局、終點或事件的可能性。
患有HCV感染的治療決定越來越基於非侵入性血清試驗而不是肝臟活組織檢查。然而,血清試驗並不完全是最優的。參見Castera,L.,“Invasive and non-invasive methods for the assessment of fibrosis and disease progression in chronic liver disease[評定慢性肝病中纖維化和疾病進展的侵入性和非侵入性方法],”Best Pract Res Clin Gastroent.[貝勒臨床胃腸病學最佳實踐與研究]2011.25:291-303。
本揭露提供了檢測和/或量化個體中循環LOXL2的測定法。在實踐中,在從試驗的個體獲得的液體樣品中檢測LOXL2,其中該液體樣品可以是血液或血成分,例如血漿或血清、或其他液體樣品。
在一些實施方式中,所提供的方法和測定法對於肝纖維化程度的非侵入性替代測量是有用的,例如在患有慢性HCV感染或HBV感染的患者中。
“LOXL2多肽”係指這樣的多肽,其包含的氨基酸序列與描繪於圖4中的氨基酸序列具有從大約100個氨基酸至大約200個氨基酸、從大約200個氨基酸至大約300個氨基酸、從大約300個氨基酸至大約400個氨基酸、從大約400個氨基酸至大約500個氨基酸、從大約500個氨基酸至大約600個氨基酸、從大約600個氨基酸至大約700個氨基酸、或從大約700個氨基酸至774個氨基酸的一連續拉伸(contiguous stretch)具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約97%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性。“LOXL2”還指描繪於圖4中的人類LOXL2氨基酸序列、及其天然發生變體(多晶型現象)。
圖4描繪了人類LOXL2的氨基酸序列,顯示了四個清道夫受體半胱氨酸富集(SRCR)域。LOXL2多肽可以是全長多肽或成熟的(裂解形式;處理的形式)LOXL2多肽。預測的信號裂解在Ala25-Gln26之間。來自前多肽原
的信號肽的裂解產生了LOXL2前肽。LOXL2前肽在SRCR2與SRCR3之間裂解(例如所繪於圖4中的序列的氨基酸301與326之間),留下一含SRCR3、SRCR4和賴氨酸氧化酶(催化的)域的LOXL2多肽。
LOXL2多肽可以是酶活性的。例如,LOXL2多肽可以催化賴氨酸和羥賴氨酸殘基的ε-氨基的氧化脫氨,從而導致肽基賴氨酸轉化成肽基-α-氨基脂肪酸-δ-半醛(ε-醛(基)賴氨酸)並且釋放化學計算量的氨和過氧化氫。這個反應最常在細胞外發生,例如在膠原和彈性蛋白中的賴氨酸殘基上。
在一些情況下,使用受試者LOXL2測定法檢測的LOXL2多肽係無信號序列的全長LOXL2多肽,例如包括SRCR1-2、SRCR3-4和催化域。在一些情況下,使用受試者LOXL2測定法檢測的LOXL2多肽係成熟的LOXL2多肽(即,無信號序列並且無SRCR1-2),例如僅包括SRCR3-4域和催化域。可替代地或者另外地,檢測成熟的LOXL2多肽(SRCR3-4域和催化域;無信號序列和SRCR1-2域)時,受試者LOXL2測定法可以檢測N端LOXL2片段,該N端LOXL2片段包括SRCR1-2域並且不含SRCR3-4和催化域。
適當的液體生物樣品包括但不限於:全血;血成分(也稱為“血液製品”),其中適當的血成分包括但不限於:血清和血漿;唾液;尿;支氣管肺泡灌洗液;腦脊液;痰;等。該生物樣品可以是新鮮血或儲存血液(例如,在血庫中)或者血成分。該生物樣品可以是明確地為了本揭露的測定法而獲得的液體樣品或者為另一目的(可以是針對本揭露的測定法的二次抽樣)而獲得的液體樣品。
作為一實例,該生物樣品可以是全血。可以使用標準臨床程式從受試者獲得全血。在另一實施方式中,該生物樣品係血漿。可以從全血樣品藉由抗凝血的離心而獲得血漿。此過程提供了白細胞成分的一血沉棕黃層以及血漿的上清液。在另一實施方式中,該生物樣品係血清。
該樣品可以在必要時藉由在適當的緩衝溶液中稀釋而進行預處理、進行肝素化、希望時進行濃縮、或藉由任何數目的方法進行分餾,該等方法包括但不限於:超速離心、藉由快速蛋白質液相色譜法(PFLC)進行分餾、或者沉澱。該樣品可以例如藉由免疫親和性法進行分餾以從樣品中去除一或多種非LOXL2蛋白或其他非LOXL2成分;例如可以使用抗白蛋白抗體來從樣品中去除白蛋白。可以使用多種標準水性緩衝溶液中的任何一種,採用在生理學pH下的各種緩衝劑中的一種,例如磷酸鹽、Tris等。
一受試者方法使用LOXL2特異性抗體來固定並檢測液體樣品中的LOXL2。在受試者測定方法中使用的抗體係LOXL2特異性的,例如該抗體特異性地結合至LOXL2多肽上,其中特異性結合係指結合的親和力係至少大約10-7 M、至少大約10-8 M、至少大約10-9 M、至少大約10-10 M、至少大約10-11 M、或至少大約10-12 M、或大於10-12 M。非特異性結合係指結合的親和力係小於約10-7 M,例如結合的親和力為10-6 M、10-5 M、10-4 M等等。
LOXL2特異性抗體並不實質性結合到任何除LOXL2多肽之外的賴氨醯氧化酶樣多肽上,例如LOXL2特異性抗體並不實質性結合到LOXL1、LOXL3、或LOXL4多肽上、或結合到賴氨酸氧化酶(LOX)多肽上。
在一些實施方式中,當LOXL2多肽位於液體生物樣品中時,LOXL2特異性抗體結合對於結合是可接近的一或多個表位,例如被該LOXL2特異性抗所結合的這一或多個表位係在該液體生物樣品中可能存在的一或多個非LOXL2蛋白在表面可接近的和/或未被它掩蔽。
適合用於受試者測定方法中的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體、人化抗體、嵌合抗體、奈米抗體、雙體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、以及抗原結合抗體片段。
在一些情況下,用於受試者方法中的抗LOXL2抗體包括一可檢測標記。適當的可檢測標記包括但不限於:磁珠(例如DynabeadsTM)、螢光染料(例如異硫氰酸螢光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋
白、黃色螢光蛋白等等)、放射性標記(例如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(例如,辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、以及在酶聯免疫吸附測定法(ELISA)中常用的其他酶)、以及比色標記如膠體金或有色玻璃或塑膠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等等)珠。
當一抗LOXL2抗體包括一可檢測標記時,可以藉由檢測由該標記產生的信號(例如,生色團、發光體等等,作為附接至該抗LOXL2抗體上的酶的產物而產生;由該標記直接產生的信號等等)檢測該抗LOXL2抗體。在一些情況下,一抗LOXL2抗體不包括可檢測標記;相反,使用包括可檢測標記的二級抗體來檢測該抗LOXL2抗體。適當的第二抗體包括對於抗LOXL2抗體的一或多個恒定區域中的一或多個表位係特異性的單克隆和多克隆抗體。適當的二級抗體可以包括多種可檢測標記中的任何一種,包括但不限於:磁珠(例如DynabeadsTM)、螢光染料(例如異硫氰酸螢光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、黃色螢光蛋白等等)、放射性標記(例如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(例如,辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、以及在酶聯免疫吸附測定法(ELISA)中常用的其他酶)、以及比色標記如膠體金或有色玻璃或塑膠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等等)珠。同樣適合用作可檢測標記的有來自美科美生物商城(MesoScale Discover)的SULFO-TAGTM標記。該SULFO-TAGTM標記係釕(II)三聯吡啶標記,可以藉由釕(II)三聯吡啶-(4-甲碸)N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)-酯與伯胺(例如賴氨酸側鏈)的反應而附接至多肽(例如,二級抗體)上。
在一些情況下,用於受試者測定法中的抗LOXL2抗體將被固定在不溶性載體上。適當的不溶性載體可以包括不同的材料,包括但不限於:聚二氟乙烯(PVDF)、纖維素、硝酸纖維素、尼龍、玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、二氧化矽、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖酐、直鏈澱粉、天然的以及改性的纖維素、聚丙烯醯胺、包埋在聚丙烯醯胺凝膠中的二氧化矽、瓊脂糖、輝長岩、磁鐵礦等等。該不溶性載體可以是多種形式(例如,尺寸,
形狀)中的任何一種,例如片材,例如在試條中使用;浸漬片測定法形式;多孔板(例如在ELISA中使用的那些)等等。
LOXL2特異性抗體的非限制性實例包括在美國專利公開號2009/0104201和美國專利公開號2009/0053224中揭露的LOXL2特異性抗體。
在一些情況下,適當的抗體特異性地結合在LOXL2 SRCR1域中的表位。在一些情況下,適當的抗體特異性地結合在LOXL2 SRCR2域中的表位。在一些情況下,適當的抗體特異性地結合在LOXL2 SRCR3域中的表位。在一些情況下,適當的抗體特異性地結合在LOXL2 SRCR4域中的表位。在一些情況下,適當的抗體特異性地結合在LOXL2催化域中的表位。圖5提供了LOXL2催化域的氨基酸序列。在一些情況下,適當的抗體(例如,多克隆抗體)特異性地結合在一個、兩個、三個或更多個LOXL2域中的表位。
在一些情況下,以抗體檢測沒有信號序列的全長LOXL2多肽,例如包括SRCR1-2、SRCR3-4和催化域。在一些情況下,以抗體檢測成熟LOXL2多肽(例如,沒有信號序列並且沒有SRCR1-2),例如僅包括SRCR3-4域和催化域。在其他情況下,以抗體檢測N端LOXL2片段,該N端LOXL2片段包括SRCR1-2域而不包括SRCR3-4域或催化域。
例如,在一些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在SRCR3-連接物-SRCR4區域之內的表位元,其中此區域被稱為“SRCR3-4”。SRCR3-4區域可以包括這樣的氨基酸序列:它與SEQ ID NO:1的氨基酸325至544、與氨基酸325至547、與氨基酸303至544、或與氨基酸303至547具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性。因此,例如在一些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合與SEQ ID NO:1的氨基酸325至544、與氨基酸325至547、與氨基酸303至544、或與氨基酸303至547具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列之內的表位。
在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在連接物-SRCR3-連接物-SRCR4-連接物區域之內的表位元,例如在一些情況下,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在與SEQ ID NO:1的氨基酸303至544、氨基酸303至545、氨基酸303至546、或氨基酸303至547具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列之內的表位。在某些實施方式中,受試者的抗LOXL2抗體特異性地結合在SRCR3-連接物-SRCR4-連接物區域之內的表位元,例如在一些情況下,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在與SEQ ID NO:1的氨基酸325至544、氨基酸325至545、氨基酸325至546、或氨基酸325至547具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列之內的表位。
在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在SRCR3區域之內(並且不在SRCR4區域之內)的表位元,其中SRCR3區域可以包括與SEQ ID NO:1的氨基酸325至425、與氨基酸303至425、與氨基酸303至434、或與氨基酸325至434具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在連接物-SRCR3區域之內的表位元,例如在一些情況下,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在與SEQ ID NO:1的氨基酸303至425具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列之內的表位。在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在SRCR3-連接物區域之內的表位元,例如在一些情況下,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在與SEQ ID NO:1的氨基酸325至434具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列之內的表位。在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在連接物-SRCR3-連接物區域之內的表位元,例如在一些情況下,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在與SEQ ID NO:1的氨基酸303至434具有至少大約90%、至少大
約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列之內的表位。
在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在連接物-SRCR4-連接物-SRCR4-連接物區域之內的表位元,例如在一些情況下,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在與SEQ ID NO:1的氨基酸426至544、氨基酸426至545、氨基酸426至546、或氨基酸426至547具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列之內的表位。在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在SRCR4區域之內(並且不在SRCR3之內)的表位元,其中SRCR4區域可以包括與SEQ ID NO:1的氨基酸435至544、與氨基酸435至545、與氨基酸435至546、或與氨基酸435至547具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
在一些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在SRCR1-連接物-SRCR2區域之內的表位元,其中此區域被稱為“SRCR1-2”。SRCR1-2區域可以包括與描繪於SEQ ID NO:1中的氨基酸序列(圖4)具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在與描繪於SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的氨基酸58至324具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列之內的表位。在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在SRCR1區域之內(並且不在SRCR2之內)的表位元,其中SRCR1區域可以包括與描繪於SEQ ID NO:1中的氨基酸序列的氨基酸58至159具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在SRCR1-連接物區域之內的表位元,其中SRCR1-連接物區域可以包括與SEQ ID NO:1的氨基酸58至187具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
在某些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體特異性地結合在SRCR1區域之內(並且不在SRC2之內)的表位元,其中SRCR2區域可以包括與描繪於SEQ ID NO:1中的氨基酸188至302具有至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%、至少大約99%、或100%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
作為一非限制性實例,適當的抗體係特異性地結合在LOXL2催化域中的表位的單克隆抗體AB0030。參見例如US 2009/0053224,其中抗體AB0030相應於proBM20。
在一些實施方式中,適當的抗體係當LOXL2結合至抑制LOXL2酶活性的一試劑上時特異性地結合LOXL2的一抗體。抑制LOXL2酶活性的試劑包括LOXL2酶活性的變構抑制劑。在某些情況下,該變構抑制劑係一抗LOXL2單克隆抗體,例如結合在LOXL2的“SRCR3-4”域之內的表位的一抗LOXL2單克隆抗體。抑制LOXL2酶活性並且結合在SRCR3-4域之內的表位的單克隆抗體的非限制性實例係AB0023和AB0024;參見例如US 2009/0053224。因此在一些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體:a)特異性地結合在SRCR3-4之內的表位;並且ii)對於結合到在SRCR3-4之內的表位上而言不與AB0023抗體和/或AB0024抗體競爭。
例如,在一些實施方式中,該抗體係具有含以下CDR以及介入框架區(相應於AB0023的那些,具有帶底線的CDR1、CDR2和CDR3序列)的重鏈可變區的一抗體:MEWSRVFIFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTYYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARNWMNFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:6)。在一些實施方式中,該抗體具有這樣的重鏈可變區:該重鏈可變區具有與SEQ ID NO:6具有75%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、或99%或更多的同源性的氨基酸序列。在一些實施方式中,該抗體具有這樣的
重鏈可變區,該重鏈可變區具有在SEQ ID NO:6中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3。
在一些實施方式中,該抗體這樣的抗體,該抗體具有以下CDR以及介入框架區(相應於AB0023的那些,具有帶底線的CDR1、CDR2和CDR3序列)的輕鏈可變區:MRCLAEFLGLLVLWIPGAIGDIVMTQAAPSVSVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQFLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:7)。在一些實施方式中,該抗體具有這樣的輕鏈可變區:該輕鏈可變區具有與SEQ ID NO:7具有75%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、或99%或更多的同源性的氨基酸序列。在一些實施方式中,該抗體具有這樣的輕鏈可變區,該輕鏈可變區具有在SEQ ID NO:7中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3。在一些實施方式中,該抗體具有這樣的重鏈可變區和輕鏈可變區,該重鏈可變區具有在SEQ ID NO:6中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3,該輕鏈可變區具有在SEQ ID NO:7中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3。
在一些實施方式中,該抗體係此類抗體的一人化形式,例如在美國專利申請公開號US 2009/0053224(2009年2月26日)中描述的一抗體,例如命名為AB0024,和/或具有含有AB0024的CDR(CDR1、CDR2、和CDR3)的重鏈和/或具有含有AB0024的CDR(CDR1、CDR2、和CDR3)的輕鏈一抗體。
例如在一實施方式中,該抗體係這樣一抗體,該抗體具有含以下CDR以及介入框架區(相應於AB0024的那些,具有帶底線的CDR1、CDR2和CDR3序列)的重鏈可變區:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTYYLIEWVRQAPGQGLE
WIGVINPGSGGTNYNEKFKGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARNWMNFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:8)。
在一些實施方式中,該抗體具有這樣的重鏈可變區:該重鏈可變區具有與SEQ ID NO:8具有75%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、或99%或更多的同源性的氨基酸序列。在一些實施方式中,該抗體具有這樣的重鏈可變區,該重鏈可變區具有在SEQ ID NO:8中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3。
在一些實施方式中,該抗體具有這樣的重鏈可變區:該重鏈可變區具有在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10(QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYAFTYYLIEWVKQAPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDSAVYFCARNWMNFDYWGQGTTVTVSS)、SEQ ID NO:11(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTYYLIEWVRQAPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARNWMNFDYWGQGTTVTVSS)、或SEQ ID NO:12(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTYYLIEWVRQAPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNWMNFDYWGQGTTVTVSS)中列出的氨基酸序列或具有與SEQ ID NO:8、10、11、或12具有75%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、或99%或更多的同源性的氨基酸,和/或該抗體具有這樣的輕鏈可變區,該輕鏈可變區具有在SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13(DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQKPGQSPQFLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKVEIK)、或SEQ ID NO:14(DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWYLQKPGQSPQFLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKVEIK)中列出的氨基酸序列、或具有與SEQ ID NO:9、13、或14具
有75%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、或99%或更多的同源性的氨基酸。
在一些實施方式中,該抗體係這樣一抗體,該抗體具有含以下CDR以及介入框架區(相應於AB0024的那些,具有帶底線的CDR1、CDR2和CDR3序列)的輕鏈可變區:DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQKPGQSPQFLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:9)。在一些實施方式中,該抗體具有這樣的輕鏈可變區,該輕鏈可變區具有與SEQ ID NO:9具有75%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、或99%或更多的同源性的氨基酸序列。在一些實施方式中,該抗體具有這樣的輕鏈可變區,該輕鏈可變區具有在SEQ ID NO:9中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3。在一些實施方式中,該抗體具有這樣的重鏈可變區和輕鏈可變區,該重鏈可變區具有在SEQ ID NO:8中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3,該輕鏈可變區具有在SEQ ID NO:9中列出的可變區序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3。
可以使用任何已知的測定法來確定一試劑是否抑制LOXL2酶活性。例如,可以使用二氨基戊烷(DAP)作為底物、或使用膠原為底物來進行LOXL2酶活性的測定。在兩種測定法中,LOXL2的酶活性可以使用以下測定法來測量:將過氧化氫的產生(在底物脫氨後由LOXL2釋放)與Amplex®紅(Invitrogen,Carlsbad,CA)的辣根過氧化物酶催化轉化成試鹵靈(一螢光產物)相結合。
在一些實施方式中,適當的抗LOXL2抗體抑制LOXL2多肽的酶活性。在其他實施方式中,適當的抗LOXL2抗體不抑制LOXL2多肽的酶活性。
適當的抗LOXL2抗體包括例如:RPDS-1M1、RPDS-1M3、RPDS-1M8、RPDS-1M9、RPDS-1M11、RPDS-1M15、RPDS-1M17、RPDS-1M19、RPDS-1M20(AB0030)、RPDS-1M22、RPDS-1M24、RPDS-1M25、RPDS-
1M27、RPDS-1M28、RPDS-1M29、RPDS-1M30、RPDS-1M31、RPDS-1M32、RPDS-2M1、RPDS-2M2、RPDS-2M3、RPDS-2M4、RPDS-2M5、RPDS-2M6、RPDS-2M7、RPDS-2M8、RPDS-2M9、RPDS-2M10、RPDS-2M11、RPDS-2M12、RPDS-2M13、RPDS-2M14、RPDS-2M15、RPDS-2M16、RPDS-2M17、RPDS-2M18、和RPDS-2M19,其中該等抗體描述於美國專利申請序號13/021,555中。單克隆抗體RPDS-1M1、RPDS-1M3、RPDS-1M8、RPDS-1M9、RPDS-1M11、RPDS-1M15、RPDS-1M17、RPDS-1M19、RPDS-1M20(AB0030)、RPDS-1M22、RPDS-1M24、RPDS-1M25、RPDS-1M27、RPDS-1M28、RPDS-1M29、RPDS-1M30、RPDS-1M31、RPDS-1M32、RPDS-2M1、RPDS-2M2、RPDS-2M3、RPDS-2M4、RPDS-2M5、RPDS-2M6、RPDS-2M7、RPDS-2M8、RPDS-2M9、RPDS-2M10、RPDS-2M11、RPDS-2M12、RPDS-2M13、RPDS-2M14、RPDS-2M15、RPDS-2M16、RPDS-2M17、RPDS-2M18、和RPDS-2M19結合在LOXL2的催化域之內。
檢測個體中的循環LOXL2的受試者測定法通常涉及:a)使從該個體獲得的一液體樣品與一LOXL2特異性抗體相接觸;並且b)檢測該抗體與存在於該液體樣品中的LOXL2的結合。適當的測定方法包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫沉澱測定、側向或軸向流動測定、質譜法等等。
受試者測定方法可以檢測液體樣品中直至175 pg/ml或更少的LOXL2,例如一受試者測定方法可以檢測液體樣品中直至從大約150 pg/ml至大約175 pg/ml、直至從大約125 pg/ml至大約150 pg/ml、直至從大約100 pg/ml至大約125 pg/ml、直至從大約75 pg/ml至大約100 pg/ml、直至從大約50 pg/ml至大約75 pg/ml、或直至從大約40 pg/ml至大約50 pg/ml的LOXL2。例如,當液體樣品中LOXL2存在的濃度係小於10 ng/ml時,例如濃度係從大約10 ng/ml至大約5 ng/ml、從大約5 ng/ml至大約1 ng/ml、從大約1 ng/ml至大約500
pg/ml、從大約500 pg/ml至大約400 pg/ml、從大約400 pg/ml至大約300 pg/ml、從大約300 pg/ml至大約200 pg/ml、從大約200 pg/ml至大約175 pg/ml、從大約200 pg/ml至大約150 pg/ml、從大約150 pg/ml至大約100 pg/ml、從大約100 pg/ml至大約75 pg/ml、從大約75 pg/ml至大約50 pg/ml、或從大約50 pg/ml至大約40 pg/ml時,一受試者測定方法可以檢測該液體樣品中的LOXL2。在一些情況下,當存在於液體樣品中LOXL2的濃度係從大約175 pg/ml至大約5 ng/ml(或大於5 ng/ml)時,一受試者測定方法檢測在液體樣品中的LOXL2。在一些情況下,當存在於液體樣品中LOXL2的濃度係從大約40 pg/ml至大約5 ng/ml(或大於5 ng/ml)時,一受試者測定方法檢測在液體樣品中的LOXL2。在一些情況下,受試者測定方法檢測在液體樣品中直至平均背景值加上2.5 x SD(背景值的標準差)的檢出限的LOXL2。
在一些情況下,受試者測定方法涉及使用兩種LOXL2特異性抗體。這兩種LOXL2特異性抗體均可以是單克隆抗體;這兩種LOXL2特異性抗體可以是一種多克隆抗體和一種單克隆抗體;或者一些其他的此類組合。
例如,使第一LOXL2特異性抗體與一液體樣品相接觸,其中該第一LOXL2特異性抗體與存在於該液體樣品中的LOXL2形成了一複合物。該第一LOXL2特異性抗體可以被固定在一不溶性載體上,使得該第一LOXL2特異性抗體/LOXL2複合物被固定在該不溶性載體上。可替代地,該第一LOXL2特異性抗體可以在溶液中,並且該第一LOXL2特異性抗體/LOXL2複合物可以是不溶的,使得該第一LOXL2特異性抗體/LOXL2複合物免疫沉澱。可以使用第二LOXL2特異性抗體檢測該第一LOXL2特異性抗體/LOXL2複合物。在一些情況下,該第一LOXL2特異性抗體係多克隆抗體;並且該第二LOXL2特異性抗體係單克隆抗體。
在一些實施方式中,一受試者測定方法涉及使從個體獲得的一液體樣品與一固定的LOXL2特異性抗體相接觸,其中該固定的LOXL2特異性抗體被固定在一不溶性載體上。存在於該樣品中的任何LOXL2都將結合到該固定的LOXL2特異性抗體上,從而形成固定的抗LOXL2/LOXL2複合物。可以使用
第二(非固定的)LOXL2特異性抗體檢測該固定的抗LOXL2/LOXL2複合物。該第二LOXL2特異性抗體可以帶有可檢測標記、或者可以使用帶有可檢測標記的二級抗體進行檢測。
因此在一些實施方式中,檢測個體中的循環LOXL2的受試者方法涉及:a)使從該個體獲得的一液體樣品與一第一LOXL2特異性抗體相接觸,使得該第一抗體和LOXL2形成一複合物;b)使該LOXL2-第一抗體複合物與一第二LOXL2特異性抗體相接觸;並且c)檢測該第二抗體與該LOXL2-第一抗體複合物的結合。
該不溶性載體可以是一多孔板的一或多個孔、一試條、一浸漬片的形式等等。在上述測定法形式的任何一種中,可以進行一或多個洗滌步驟以去除未結合的組分。
本揭露的測定方法可以檢測個體中的循環LOXL2的病理學水平。例如,一受試者測定方法可以涉及:a)使從該個體獲得的一液體樣品與一LOXL2特異性抗體相接觸;b)檢測該抗體與存在於該液體樣品中的LOXL2的結合;並且c)將檢測水平與正常對照值進行比較。高於正常對照值的檢測水平指示了病理學(例如癌症或纖維化)。
從受試者獲得的液體樣品中的LOXL2的水平可以與一或多個正常對照值或正常對照值範圍進行比較。該對照值可以是基於從對照群體(例如一般群體或選擇的人類受試者群體)獲得的對比樣品(例如血液、血漿、或血清樣品、或其他液體生物樣品)中的LOXL2的水平。例如,該選擇群體可以包括明顯健康的受試者,例如之前沒有任何纖維化或癌症的體征或症狀的個體。明顯健康的受試者通常也不另外顯出疾病症狀。換言之,如果由醫學專業人員來檢查,這樣的個體將被表徵為健康的並且沒有疾病症狀。
該對照值可以採用多種形式。該對照值可以是單一截止值,例如中位值或平均值。正常對照值可以是正常對照範圍。
在某些情況下,對照、正常值係低於受試者測定方法的檢出限的,例如正常值可能小於大約175 pg/ml、小於大約150 pg/ml、小於大約100 pg/ml、小於大約75 pg/ml、小於大約50 pg/ml、或小於大約40 pg/ml。
如以上指出的,使用受試者LOXL2測定法來測試從個體獲得的液體樣品。適合於使用受試者測定法進行測試的個體包括但不限於:尚未被診斷為患有疾病、但醫師認為呈現出症狀和/或主訴的個體(例如,具有未診斷出的失調或疾病的個體);已經被診斷為患有癌症的個體;被懷疑患有癌症但尚未被診斷為患有癌症的個體;明顯健康並且正在經歷例行篩查的個體;已經被診斷為患有纖維化的個體;被懷疑患有纖維化但尚未被診斷為患有纖維化的個體;已經被診斷為患有丙型肝炎病毒(HCV)感染如慢性HCV或乙型肝病毒(HBV)感染如慢性HBV(CHB)感染的個體;以及正在經歷癌症或纖維化疾病治療的個體。
適合於使用受試者LOXL2測定法測試的個體包括:已經被診斷為患有癌症的個體,包括患有良性腫瘤的個體;患有原發性腫瘤的個體;患有瘤轉移的個體;以及患有非實體瘤型癌的個體。適合於使用受試者LOXL2測定法測試的個體包括:患有癌症但尚未被診斷為患有癌症的個體。因此,適合於使用受試者LOXL2測定法測試的個體包括:患有多種多樣的癌症的個體,包括癌、肉瘤、白血病、以及淋巴瘤。
癌包括但不限於:食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌(皮膚癌的一種形式)、鱗狀細胞癌(各種組織)、膀胱癌(包括移行細胞癌,膀胱的一種惡性新生物)、支氣管癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌(包括肺的小細胞癌和非小細胞癌)、腎上腺皮質癌、甲狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、腎細胞癌、導管原位癌或膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚
胎性癌、腎母細胞瘤、宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、骨源性癌(osteogenic carcinoma)、上皮癌、以及鼻咽癌等等。
肉瘤包括但不限於:纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、以及其他軟組織肉瘤。
實體瘤包括但不限於:神經膠質瘤、星形膠質細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、成神經細胞瘤、以及視網膜母細胞瘤。
白血病包括但不限於:a)慢性骨髓增生綜合征(多能造血幹細胞的腫瘤性疾病);b)急性骨髓性白血病(多能造血幹細胞的致瘤性轉化或限制譜系潛能的造血細胞);c)慢性淋巴細胞性白血病(CLL;免疫不成熟和機能不全的小淋巴細胞的克隆樣增生),包括B細胞CLL,T細胞CLL前淋巴細胞性白血病以及毛細胞性白血病;以及d)急性淋巴細胞性白血病(特徵為淋巴母細胞的累積)。淋巴瘤包括但不限於:B細胞淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤);霍奇金淋巴瘤等等。
良性腫瘤包括例如:血管瘤、肝細胞腺瘤、海綿狀血管瘤、灶性結節性增生、聽神經瘤、神經纖維瘤、膽管腺瘤、膽管嚢胞腺腫(bile duct cystanoma)、纖維瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、間皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、結節再生性增生、沙眼和膿性肉芽腫。
原發性和轉移性腫瘤包括例如:肺癌(包括但不限於肺腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌、細支氣管肺泡癌、非小細胞癌、小細胞癌、間皮瘤);乳癌(包括但不限於導管癌、小葉癌、炎性乳腺癌、透明細胞癌、粘液癌);結腸直腸癌(包括但不限於結腸癌、直腸癌);肛門癌;胰腺癌(包括但不限於胰腺癌、胰島細胞癌、神經內分泌瘤);前列腺癌;卵巢癌(包括但不限於卵巢上皮癌或表層上皮間質性腫瘤,包括漿液性腫瘤、內膜樣瘤和粘液性囊腺癌、性索間質細胞瘤);肝癌和膽管癌(包括但不限於肝細胞
癌、膽管癌、血管瘤);食道癌(包括但不限於食道腺癌和鱗狀細胞癌);非霍奇金淋巴瘤;膀胱癌;子宮癌(包括但不限於子宮內膜腺癌、子宮乳頭狀漿液性腺癌、子宮透明細胞癌、子宮肉瘤和平滑肌肉瘤、混合副中腎管腫瘤);神經膠質瘤、成膠質細胞瘤、髓母細胞瘤、以及大腦的其他腫瘤;腎癌(包括但不限於腎細胞癌、透明細胞癌、腎母細胞瘤);頭頸部癌(包括但不限於扁平細胞癌);胃癌(包括但不限於胃腺癌、胃腸道間質瘤);多發性骨髓瘤;睾丸癌;生殖細胞瘤;神經內分泌瘤;子宮頸癌;胃腸道、乳房和其他器官的類癌;以及印戒細胞癌。
在一些情況下,腫瘤學患者係目前正在經歷癌症治療的患者。在一些情況下,該治療包括給予一抑制LOXL2多肽的酶活性的試劑。抑制LOXL2酶活性的試劑包括LOXL2酶活性的變構抑制劑。在一些情況下,該變構抑制劑係一抗LOXL2單克隆抗體,例如結合在LOXL2的“SRCR3-4”域之內的表位的一抗LOXL2的單克隆抗體。抑制LOXL2酶活性並且結合在SRCR3-4域之內的表位的單克隆抗體的非限制性實例係AB0023和AB0024;參見例如US 2009/0053224。
適合於使用受試者測定方法測試的個體包括:其體內已經發生了上皮細胞的上皮到間質轉化(EMT)的個體。適合於使用受試者測定方法測試的個體包括:其體內已經出現粘連形成和成纖維細胞活化(該等被認為是產生腫瘤和纖維化疾病的病理學微環境的因素)的個體。此類個體可以具有癌前細胞和/或處於癌形成的早期。
適合於使用受試者LOXL2測定方法測試的個體包括:已經被診斷為患有纖維化(一纖維化疾病)的個體,例如患有肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、骨髓纖維化、心臟纖維化、或其他類型的纖維化。適合於使用受試者LOXL2測定方法測試的個體包括:患有纖維化疾病(例如肝纖維化、腎纖維
化、肺纖維化、骨髓纖維化、心臟纖維化、或其他類型的纖維化)但尚未被診斷為患有該纖維化疾病的個體。
在一些情況下,適當的測試受試者患有晚期形式的纖維化,但仍可能適合於用纖維化治療方案進行治療。例如,適當的測試受試者包括具有活動性(非末期)纖維化的受試者。在一些情況下,適當的測試受試者係患有纖維化、但預期會經歷快速疾病進展的受試者。
在一些情況下,有待使用受試者LOXL2測定法測試的個體係目前正在經歷纖維化疾病治療的受試者。在一些情況下,該治療包括給予一抑制LOXL2多肽的酶活性的試劑。抑制LOXL2酶活性的試劑包括LOXL2酶活性的變構抑制劑。在一些情況下,該變構抑制劑係一抗LOXL2單克隆抗體,例如結合在LOXL2的“SRCR3-4”域之內的表位的一抗LOXL2的單克隆抗體。抑制LOXL2酶活性並且結合在SRCR3-4域之內的表位的單克隆抗體的非限制性實例係AB0023和AB0024;參見例如US 2009/0053224。
在大量肝病的病理學中牽涉到肝的纖維化。纖維化作為血色病、威爾遜病、酒精中毒、血吸蟲病、病毒性肝炎、膽管閉塞、毒素暴露以及代謝失調的併發症而出現。留下未檢查的肝纖維化進展成肝硬化(由包裹結節的存在所限定)、肝衰竭、以及死亡。
肝纖維化包括但不限於:肝硬化以及相關病症,例如慢性病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原發性膽汁性肝硬變(PBC)、膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、以及自身免疫性肝炎。
肝的慢性損傷,如來自該等來源(例如,乙型肝病毒(HBV)、HCV、人類免疫缺陷病毒(HIV)、血吸蟲病)的寄生蟲和病毒感染或來自酒精消耗的長期應激典型地導致肝的重塑,預計將包裹受損區域並保護剩餘的肝組織免於損害。(Li和Friedman,Gastroenterol.Hepatol.[胃腸肝病學]14:618-633,1999)。肝纖維化導致了細胞外基質的改變,包括總膠原含量以
及高密度基質對低密度基膜的取代增加了3-10倍,這損害了肝細胞、肝星狀細胞以及內皮細胞的代謝和合成功能。(Girogescu,M.,Non-invasive Biochemical Markers of Liver Fibrosis[肝纖維化的非侵入性生化標誌],J.Gastrointestin.Liver Dis.[胃腸病學與肝病學雜誌],15(2):149-159(2006))。
存在多種標準化的評分系統,該等系統提供了對肝纖維化的程度和嚴重性的定量評價。該等包括METAVIR、Knodell、Scheuer、Ludwig、和Ishak評分系統。患有肝纖維化的個體包括基於METAVIR、Knodell、Scheuer、Ludwig、和伊沙克評分系統而具有任何程度或嚴重性的肝纖維化的個體。
METAVIR評分系統係基於對肝活檢的不同特徵的分析,包括纖維化(肝門纖維化、小葉中心纖維化以及肝硬化);壞死(碎片狀壞死和小葉壞死、嗜酸性退縮、以及氣球樣變性);炎症(肝門束炎症、肝門淋巴樣聚合、以及肝門炎症的分佈);膽管變化;以及Knodell指數(門靜脈周圍壞死、小葉壞死、肝門炎症、纖維化、以及總體疾病活動度的得分)。METAVIR系統中的每個階段的定義如下:得分:0,無纖維化;得分:1,肝門束的星狀擴大而無隔膜形成;得分:2,肝門束擴大,有極少的隔膜形成;得分:3,大量隔膜而無肝硬化;以及得分:4,肝硬化。
Knodell評分系統,也稱為組織學活動指數,基於四個範疇的組織學特徵中的得分來對樣品分級:I.門靜脈周圍的和/或橋接壞死;II.小葉內惡化以及局灶性壞死;III.肝門炎症;以及IV.纖維化。在Knodell評級系統中,得分如下:得分:0,無纖維化;得分:1,輕度纖維化(纖維性肝門膨脹);得分:2,中度纖維化;得分:3,重度纖維化(橋接纖維化);以及得分:4,肝硬化。得分越高,肝組織損傷越嚴重。Knodell(1981)Hepatol.1:431。
在Scheuer評分系統中,得分如下:得分:0,無纖維化;得分:1,擴大的纖維化的肝門束;得分:2,門靜脈周圍的或肝門-肝門的隔膜,但
結構完整;得分:3,具有結構扭曲的纖維化,但無明顯肝硬化;以及得分:4,很可能的或確定的肝硬化。Scheuer(1991)J.Hepatol.13:372。
伊沙克評分系統在Ishak(1995)J.Hepatol[肝臟病雜誌].22:696-699中進行了說明。0期,無纖維化;1期,一些門管區纖維性膨脹、有或沒有短纖維隔膜;2期,多數門管區域纖維性膨脹,有或沒有短纖維隔膜;3期,多數門管區域纖維性膨脹,偶爾有門管到門管(P--P)的橋接;4期,門管區纖維性膨脹、由顯著的橋接(P--P)以及門管到中心((P--C)的橋接;5期,顯著的橋接(P--P)和/或((P--C),偶爾有小結節(不完全肝硬化);6期,肝硬化,可能的或確定的。
像肝纖維化一樣,腎纖維化可以由於各種疾病以及對腎的損傷而產生。此類疾病和損傷的實例包括慢性腎臟疾病、代謝綜合征、膀胱輸尿管反流、腎小管間質纖維化、糖尿病(包括糖尿病腎病)、以及導致的腎小球腎炎(GN),包括但不限於:局灶性節段性腎小球硬化和膜性腎小球腎炎、腎小球膜毛細血管GN。
已經認識到代謝綜合征係一群異常情況,包括糖尿病標誌,例如胰島素抵抗以及向心性肥胖或內臟型肥胖以及高血壓。幾乎在所有情況下,葡萄糖的失調都導致了對細胞因數釋放的刺激以及對細胞外基質沉積的上調。導致慢性腎臟疾病、糖尿病、代謝綜合征和腎小球腎炎的其他因數包括高脂血症、高血壓、以及蛋白尿,所有該等都導致了對腎臟的進一步損害並且進一步刺激了細胞外基質的沉積。因此,無論主因如何,對腎的損傷可能導致腎纖維化以及伴隨的腎功能喪失。(Schena,F和Gesualdo,L.,Pathogenic Mechanisms of Diabetic Nephropathy[糖尿病腎病的致病機製],J.Am.Soc.Nephrol.[美國腎臟病學會雜誌],16:S30-33(2005);Whaley-Connell,A.,和Sower,J.R.,Chronic Kidney Disease and the Cardiometabolic Syndrome[慢性腎臟疾病和心臟代謝綜合征],J.Clin.Hypert.[臨床高血壓雜誌],8(8):546-48(2006))。
肺的纖維化包括許多綜合征和疾病。示例性的疾病包括特發性肺纖維化(IPF)、特發性間質性肺炎、以及急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。肺纖維化還包括但不限於隱原性纖維化肺泡炎、慢性纖維性間質性肺炎、間質性肺病(ILD)、以及彌漫性實質性肺疾病(DPLD)。
大多數肺纖維化(包括上述疾病在內)的發病機理尚未完全瞭解,然而所有的都具有以下特徵:炎症細胞移入並且隨後富含膠原的細胞外基質的合成和沉積增加。(Chua等人.,Am J.Rsspir.Cell.Mol.Biol.[美國呼吸細胞和分子生物學雜誌],33:9-13(2005);Tzortzaki等人,J.Histochem.& Cytochem.[組織化學與細胞化學雜誌],54(6):693-700(2006);Armstrong等人,Am.J.Respir.Crit.Care Med.[美國呼吸與重症醫學雜誌],160:1910-1915(1999))。
IPF的特徵係肺組織的炎症、以及最後的纖維化;但這兩種症狀也可能分開。IPF的原因係未知的;它可以從自身免疫失調或由於感染而出現。IPF的症狀包括呼吸困難(即,呼吸急促),這隨著疾病的進展而成為主要症狀,以及乾咳。低氧血症、右心衰竭、心臟病發作、肺栓塞、中風或肺感染可能導致死亡,所有該等都是由該疾病引起的。
在一些情況下,有待使用受試者LOXL2測定法測試的個體係目前正在經歷IPF治療的受試者。在一些情況下,該治療包括給予一抑制LOXL2多肽的酶活性的試劑。抑制LOXL2酶活性的試劑包括LOXL2酶活性的變構抑制劑。在一些情況下,該變構抑制劑係一抗LOXL2單克隆抗體,例如結合在LOXL2的“SRCR3-4”域之內的表位的一抗LOXL2單克隆抗體。抑制LOXL2酶活性並且結合在SRCR3-4域之內的表位的單克隆抗體的非限制性實例係AB0023和AB0024;參見例如US 2009/0053224。
在原發性骨髓纖維化中的致病過程涉及原發性巨核細胞加權的克隆性骨髓增生(primary megakaryocyte-weighted clonal myeloproliferation)以及癌旁間質反應(paraneoplastic stromal reaction),該反應包括骨髓纖維化、骨
質硬化、血管發生、以及髓外造血。骨髓反應包括細胞外基質蛋白(例如纖維膠原)的過度沉積、細胞過少、骨髓成纖維細胞的活化和募集、過度的細胞因數和生長因數的產生、以及導致造血能力下降的其他變化。繼發性骨髓纖維化可以由真性紅細胞增多症或真性血小板增多症引起。
在一些情況下,有待使用受試者LOXL2測定法測試的個體係目前正在經歷纖維化疾病或癌症的治療的受試者。在一些情況下,該治療包括給予一抑制LOXL2多肽的酶活性的試劑。抑制LOXL2酶活性的試劑包括LOXL2酶活性的變構抑制劑。在一些情況下,該變構抑制劑係一抗LOXL2單克隆抗體,例如結合在LOXL2的SRCR3-4域之內的表位的一抗LOXL2單克隆抗體。抑制LOXL2酶活性並且結合在SRCR3-4域之內的表位的單克隆抗體的非限制性實例係AB0023和AB0024;參見例如US 2009/0053224。
本揭露提供了用於與LOXL2相關的疾病和病症的各種診斷方法,包括與LOXL2水平升高(例如循環LOXL2升高)相關或具有該特徵的疾病或病症。例如,提供了用於確定個體是否患有特徵為循環LOXL2升高的疾病的方法。還提供了用於評定這樣的疾病或病症的活動度或嚴重性的方法。該等診斷方法總體上涉及使用如以上說明的受試者LOXL2測定方法來檢測個體中的循環LOXL2的水平。特徵為循環LOXL2升高的疾病包括癌症和纖維化。
給定樣品中的LOXL2水平可以按濃度、重量的形式的如在此說明的檢測測定法的其他讀數的形式來表示。在一方面,大於正常對照水平或其他參考水平的循環LOXL2水平指示該個體患有特徵為循環LOXL2升高的疾病。例如,循環LOXL2的水平比正常對照水平或其他參考水平高出至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、或50%以上,可以指示該個體患有特徵為循環LOXL2升高的疾病。作為另一實例,循環LOXL2的水平係大於大約40 pg/ml、大於大約50 pg/ml、大於大約75 pg/ml、大於大約100 pg/ml、大於大約150 pg/ml、大於大約175 pg/ml、大於大
約200 pg/ml、大於大約250 pg/ml、大於大約300 pg/ml、大於大約350 pg/ml、大於大約400 pg/ml、大於大約450 pg/ml、大於大約500 pg/ml、大於大約550 pg/mL、大於大約600 pg/mL、大於大約650 pg/mL、大於大約700 pg/ml、大於大約750 pg/mL、或大於大約800 pg/mL,可以指示該個體患有特徵為循環LOXL2升高的疾病,和/或給出關於該疾病或病症的預後或預測資訊,例如藉由指示活動性疾病或特定的活動度水平。在一些情況下,該水平指示受試者中的活動性纖維形成。如在此使用的,在LOXL2的背景下,術語“正常對照水平”和“參考水平”係指將與樣品(例如測試樣品)中的LOXL2水平進行比較的LOXL2水平。在一實例中,該正常對照或參考水平係在來自健康個體的樣品中普遍觀察到的水平,例如在沒有受試者疾病或病症(例如與LOXL2相關的疾病或病症)的個體中。在另一實例中,它係在患有與LOXL2相關的疾病或病症的個體中觀察到的水平,例如在患有較不活動性的疾病、具有與特定的結局、終點或事件相關的相對更好的預後或更有利的機會的個體中,例如存活或對治療的反應。例如,該參考或正常對照水平可以是在特定時間點觀察到的水平,例如來自最終顯示出有利的結局、終點或事件的個體的樣品中的基線水平。在另一實例中,該正常對照或參考水平係在從同一體中、在與所測定的樣品相比不相同的時間點獲取的樣品中觀察到的水平,例如治療之前的基線水平、或在疾病進展中或在檢測該疾病之前更早的水平。在另一實例中,該正常或參考水平係一標準水平,例如在製備成具有預定LOXL2濃度的樣品中的水平或簡單地是一預定水平。如在此使用的,“基線”係指在特定事件或時期之前的時間點處的一具體變數的量、水平或量度,例如在治療之前或者在監測疾病進展的研究開始之前的時間點。因此,在一方面,LOXL2的參考或正常對照水平係一基線水平,例如來自同一體或者來自另一個體的基線水平。
可以將從測試受試者獲得的液體樣品中的LOXL2的水平與一或多個正常對照值或正常對照值範圍進行比較。該對照值可以是基於從對照群體
(例如一般群體或選擇的人類受試者群體)獲得的對比樣品(例如血液、血漿、或血清樣品、或其他液體生物樣品)中的LOXL2的水平。例如,該選擇群體可以包括明顯健康的受試者,例如之前沒有任何纖維化或癌症的體征或症狀的個體。明顯健康的受試者通常也不另外顯出疾病症狀。換言之,如果由醫學專業人員來檢查,這樣的個體將被表徵為健康的並且沒有疾病症狀。可替代地,可以將該等評定值與其他參考值進行比較,例如與對於患有特定疾病或病症的受試者群體所觀察到的一或多個平均、中間或中位的值。例如,這樣的參考值可以用於與對於特定個體所評定的水平進行比較,該等個體之後被確定為例如患有與從其獲得參考值的總體患者群組相比更具活動性的疾病。
該對照值可以採用多種形式。該對照值可以是單一截止值,例如中位值或均值。正常對照值可以是正常對照範圍。
測試受試者包括以上列出的那些。適合於使用受試者測定法測試的個體包括但不限於:尚未被診斷為患有疾病、但醫師認為呈現出症狀和/或主訴的個體(例如,具有未診斷出的失調或疾病的個體);已經被診斷為患有癌症的個體;被懷疑患有癌症但尚未被診斷為患有癌症的個體;明顯健康並且進行例行篩查的個體;已經被診斷為患有纖維化的個體;被懷疑患有纖維化但尚未被診斷為患有纖維化的個體;已經被診斷為患有丙型肝炎病毒(HCV)感染或乙型肝病毒(HBV)感染(並且任選地被診斷為患有HCV感染或HBV感染相關的肝損害)的個體;以及正在經歷癌症或纖維化疾病治療的個體。
在一些情況下,有待測試的個體係患有未診斷的失調或疾病的個體,例如呈現出症狀和/或主訴的個體。可以使用受試者診斷方法來確定這樣的個體是否會患有纖維化疾病或癌症。受試者診斷方法可以是鑒別診斷的一部分;並且在一些情況下可以與一或多個診斷試驗結合使用,例如用於證實或排除一診斷。
受試者診斷方法可以包括生成一份報告,該報告提供了個體是否有可能患有纖維化疾病或癌症的指示。這樣的報告可以包括以下資訊,例如關於進一步的評估的推薦;關於治療性藥物治療的推薦等等。
受試者報告可以進一步包括以下一項或多項:1)服務提供者信息;2)病人數據;3)關於LOXL2水平的數據;4)隨訪評估推薦;5)治療性藥物治療;以及6)其他特徵。
基於LOXL2水平的檢測、和/或基於報告(如以上說明的),醫師或其他有資格的醫務人員可以確定是否需要對測試受試者(患者)進行進一步評估。進一步的評估可以包括例如:肺功能試驗(例如,懷疑有肺纖維化時);肝功能試驗(例如,懷疑有肝纖維化時);以及對癌症的各種試驗,該等試驗可以根據所懷疑的癌症的類型而變化。
作為一實例,當懷疑個體患有癌症時,可以進行各種癌症試驗中的任何一種,其中此類試驗包括例如針對癌細胞的存在的組織活檢的組織化學分析;針對腫瘤相關抗原的存在的試驗等等。
作為另一實例,當懷疑個體患有肺纖維化失調時,可以評定該個體的肺纖維化失調的症狀。肺纖維化失調的症狀可以包括但不限於:體重減少、肺重增加、肺纖維化、病理性肺結構(例如“蜂窩”肺)、Ashcroft得分增加、肺膠原水平增加、CD45+/膠原+細胞數目增加、肺細胞增殖和膨脹、以及在支氣管肺灌洗(BAL)液中的白細胞數目增加。症狀還可能包括例如以下一或多種分子的肺部水平增加:LOXL2、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉化生長因數β-1(TGFβ-1)、間質衍生因數-1(SDF-1)(例如SDF-1α)、內皮素-1(ET-1)以及磷酸化SMAD2。
作為另一實例,當懷疑個體患有肝纖維化時,可以評定該個體的肝功能標記。肝功能包括但不限於:蛋白質(例如白蛋白、凝固因數、鹼性磷酸酶、轉氨酶(例如丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶)如血清蛋白、5'-核苷
酶、γ-穀氨醯轉肽酶等等)的合成、膽紅素的合成、膽固醇的合成、以及膽汁酸的合成;肝代謝功能,包括但不限於碳水化合物代謝、氨基酸和氨代謝、激素代謝、以及脂類代謝;外源藥物的解毒;血流動力學功能,包括內臟和肝門的血流動力學等等。例如,使用標準測定法來測量血清丙氨酸轉氨酶(ALT)的水平。總體而言,小於約45國際單位的ALT水平被認為是正常的。ALT水平升高可以指示肝功能受損。肝儲備功能的定量試驗也可以用來評定肝功能,其中此試驗包括例如:吲哚氰綠清除率(ICG)、半乳糖清除量(GEC)、氨基比林呼吸試驗(ABT)、安替比林清除率、一乙基甘油二甲基苯胺(MEG-X)清除率、以及咖啡因清除率。
基於對LOXL2水平的檢測、和/或基於報告(如以上說明的),醫師或其他有資格的醫務人員可以確定適當的治療性藥物治療來例如治療纖維化疾病或治療癌症等等。
例如,基於LOXL2的循環水平以及任選的進一步的評估(例如對組織活檢的組織化學分析)已經被確定為患有早期癌症的個體可以開始進行癌症化學治療藥物方案和/或可以用放射治療進行治療和/或可以經歷癌症的外科切除。
癌症化學治療劑(“化療劑”)包括細胞毒素和細胞穩定藥物。化療劑可以包括對細胞具有其他作用的那些,例如將轉化狀態逆轉至一分化狀態;或者抑制細胞複製的那些。已知的細胞毒素劑的實例在例如Goodman等人,“The Pharmacological Basis of Therapeutics[治療劑的藥理學基礎],”第六版,A.B.Gilman等人,eds./麥克米蘭出版公司[Macmillan Publishing Co.]紐約,1980中列出。該等包括紫杉烷類,例如紫杉醇和多西他賽;氮,例如氮芥、美法侖、尿嘧啶氮芥和苯丁酸氮芥;乙撐亞胺衍生物,例如噻替派;磺酸烷基酯,例如白消安;亞硝基脲,例如洛莫司汀、司莫司汀和鏈佐星;三氮烯類,例如達卡巴嗪;葉酸類似物,例如甲氨蝶呤;嘧啶類似物,例如氟尿嘧啶、阿糖胞苷和阿紮立平;嘌呤類似物,例如巰基嘌呤和硫鳥嘌呤;長春花
生物鹼,例如長春堿和長春新堿;抗生素,例如更生黴素、柔紅黴素、多柔比星、和絲裂黴素;金屬錯合物,例如鉑配位錯合物,如順鉑;取代的脲,例如羥基脲;甲基肼衍生物,例如丙卡巴肼;腎上腺皮質抑制劑,例如米托坦;激素和拮抗劑,例如腎上腺皮質類固醇(潑尼松)、黃體酮(己酸羥孕酮、乙酸酯和醋酸甲地孕酮)、雌激素(己烯雌酚和乙炔雌二醇)、以及雄激素(丙酸睾丸酮以及氟甲睾酮)。
作為另一實例,例如基於LOXL2的循環水平以及任選的進一步的評估(例如肺功能試驗)已經被確定為具有IPF的個體可以用針對IPF的藥物治療和/或針對IPF的其他治療來進行治療。IPF的初級治療係藥物,用於治療IPF的最常用藥物係皮質激素(例如潑尼松)、青黴胺、和各種抗腫瘤藥(例如環磷醯胺、氮雜硫代嘌呤(azathiporene)、苯丁酸氮芥、長春新堿和秋水仙堿)。其他治療包括給氧並且在極端情況下包括肺移植。
作為另一實例,基於LOXL2的循環水平以及任選的進一步的評估(例如肺功能試驗;用於HCV、HBV感染的試驗等等)已經被確定為患有肝纖維化的個體可以用例如抗病毒劑、例如適合於治療HCV或HBV感染或其他肝炎病毒感染的藥劑進行治療。例如,可以用干擾素α(IFN-α)、韋拉米啶(viramidine)、利巴韋林、左利巴韋林(levovirin)、CV NS3抑制劑、HCV NS5B抑制劑或前述一或多種的組合來治療HCV感染。
本揭露提供了用於監測LOXL2相關疾病或病症(例如特徵為循環LOXL2升高的疾病)的治療效果的方法,該方法總體上涉及在一時間點使用受試者LOXL2測定法確定個體中的循環LOXL2水平。在一方面,該樣品中循環LOXL2水平低於在較早時間點從該個體獲得的水平指示了治療的效果。在另一方面,與對照或參考樣品相比更低的水平指示了治療效果。在另一方面,LOXL2的水平,例如高LOXL2水平,指示了個體將有利對地治療(例如對用LOXL2靶向療法進行的治療)作出反應。
例如,在個體中在第一時間點和第二時間點確定循環LOXL2水平,其中該第二時間點晚於第一時間點。第一時間點可以在治療開始之前,並且第二時間點可以在治療過程中(例如在治療方案開始之後)。該第一時間點可以在治療過程中,並且該第二時間點可以在治療過程中的較晚時間。該第二時間點可以在第一時間點之後大約1小時至大約1年,例如該第二時間點可以在該第一時間點之後從大約1小時至大約2小時、從大約2小時至大約4小時、從大約4小時至大約8小時、從大約8小時至大約16小時、從大約16小時至大約24小時、從大約24小時至大約36小時、從大約36小時至大約72小時、從大約72小時至大約4天、從大約4天至大約1周、從大約1周至大約2周、從大約2周至大約1個月、從大約1個月至大約3個月、從大約3個月至大約6個月、或從大約6個月至大約1年、或1年以上。
因此,例如在一些實施方式中,確定一特徵為循環LOXL2升高的疾病的治療的效果的受試者方法包括:a)確定在第一時間點在個體中的LOXL2循環水平(藉由確定在第一時間點從該個體獲得的液體樣品中的LOXL2水平);b)確定在第二時間點在該個體中的LOXL2循環水平(藉由確定在該第二時間點從該個體獲得的液體樣品中的LOXL2水平);並且將來自第一和第二時間點的LOXL2水平進行比較。
如果在第二時間點的循環LOXL2水平低於在第一時間點的循環LOXL2水平,可以做出的結論係對特徵為循環LOXL2升高的疾病的治療係有效的;在該等情況下,可以做出建議繼續該治療方案。如果在第二時間點的循環LOXL2水平高於在第一時間點的循環LOXL2水平,可以做出的結論係對特徵為循環LOXL2升高的疾病的治療不是有效的;在該等情況下,可以做出建議以中斷該治療方案、增加在該治療方案中所使用的藥物的劑量、增加給藥頻率、或者給予替代的治療方案。如果在第二時間點的循環LOXL2水平與第一時間點的循環LOXL2水平沒有顯著不同,可以做出的結論係對特徵為循環LOXL2升高的疾病的治療不是有效的,或者應該改變該治療方案;在該等
情況下,可以做出建議以中斷該治療方案、增加在該治療方案中所使用的藥物的劑量、增加給藥頻率、或者給予替代的治療方案。
可以使用監測治療效果的受試者方法來測試許多個體中的任何之一,例如包括:已經被診斷為患有癌症並且正在經歷治療的個體;已經被診斷為患有纖維化並且正在經歷纖維化治療的個體;已經被診斷為患有HCV或HBV感染並且正在經歷HCV或HBV感染治療的個體;已經被診斷為患有HCV或HBV感染相關的肝損傷並且正在經歷HCV或HBV感染和/或肝損傷治療的個體;等等。
在一些情況下,有待使用受試者LOXL2測定法測試的個體係目前正在經歷癌症治療的受試者。該癌症的化學療法可以是多種細胞毒劑中的任何一種。此類細胞毒劑包括紫杉烷類,例如紫杉醇和多西他賽;氮,例如氮芥、美法侖、尿嘧啶氮芥和苯丁酸氮芥;乙撐亞胺衍生物,例如噻替派;磺酸烷基酯,例如白消安;亞硝基脲,例如洛莫司汀、司莫司汀和鏈佐星;三氮烯類,例如達卡巴嗪;葉酸類似物,例如甲氨蝶呤;嘧啶類似物,例如氟尿嘧啶、阿糖胞苷和阿紮立平;嘌呤類似物,例如巰基嘌呤和硫鳥嘌呤;長春花生物鹼,例如長春堿和長春新堿;抗生素,例如更生黴素、柔紅黴素、多柔比星、和絲裂黴素;金屬錯合物,例如鉑配位錯合物,如順鉑;取代的脲,例如羥基脲;甲基肼衍生物,例如丙卡巴肼;腎上腺皮質抑制劑,例如米托坦;激素和拮抗劑,例如腎上腺皮質類固醇(潑尼松)、黃體酮(己酸羥孕酮、乙酸酯和醋酸甲地孕酮)、雌激素(己烯雌酚和乙炔雌二醇)、以及雄激素(丙酸睾丸酮以及氟甲睾酮)。
在一些情況下,該癌症治療包括給予一抑制LOXL2多肽的酶活性的試劑。抑制LOXL2酶活性的試劑包括LOXL2酶活性的變構抑制劑。在一些情況下,該變構抑制劑係一抗LOXL2單克隆抗體,例如結合在LOXL2的“SRCR3-4”域之內的表位的一抗LOXL2單克隆抗體。抑制LOXL2酶活性並且
結合在SRCR3-4域之內的表位的單克隆抗體的非限制性實例係AB0023和AB0024;參見例如US 2009/0053224。
作為另一實例,經歷肝纖維化治療的個體或經歷可能導致肝纖維化的疾病的治療的個體適合於使用一受試者方法進行測試。作為一實例,經歷HCV感染治療的個體適合於使用一受試者方法進行測試。例如,HCV感染可以用IFN-α、韋拉米啶、利巴韋林、左利巴韋林、CV NS3抑制劑、HCV NS5B抑制劑或前述一或多種的組合進行治療。
作為另一實例,經歷IPF治療的個體適合於使用一受試者方法進行測試。治療IPF的常用藥物包括皮質激素(例如潑尼松)、青黴胺、和各種抗腫瘤藥(例如環磷醯胺、氮雜硫代嘌呤、苯丁酸氮芥、長春新堿和秋水仙堿)。
可以將從測試受試者獲得的液體樣品中LOXL2的水平與一或多個正常對照值或正常對照值範圍或其他參考值進行比較,如在此所說明的。該對照值可以是基於從對照群體(例如一般群體或選擇的人類受試者群體)獲得的對比樣品(例如血液、血漿、或血清樣品、或其他液體生物樣品)中的LOXL2的水平。例如,該選擇群體可以包括明顯健康的受試者,例如之前沒有任何纖維化或癌症的體征或症狀的個體。明顯健康的受試者通常也不另外顯出疾病症狀。換言之,如果由醫學專業人員來檢查,這樣的個體將被表徵為健康的並且沒有疾病症狀。
該對照值可以採用多種形式。該對照值可以是單一截止值,例如中位值或平均值。正常對照值可以是正常對照範圍。在一些情況下,對照、正常值係低於受試者測定方法的檢出限的,例如小於約175 pg/ml、小於約150 pg/ml、小於約125 pg/ml、小於約100 pg/ml、小於約75 pg/ml、小於約50 pg/ml、或小於約40 pg/ml。
還提供了不同的預後和預測方法。例如,本揭露提供了確定患有纖維化疾病的個體將對纖維化疾病的治療顯出有益臨床反應的可能性。在另一實例中,該方法確定了具體的疾病結果或終點的可能性或風險或對治療的反應。該方法總體上涉及使用受試者LOXL2測定法來檢測例如從個體獲得的液體樣品中的LOXL2循環水平。在一方面,大於正常對照或其他參考水平的LOXL2水平指示該個體具有對纖維化疾病的治療顯出有益臨床反應的增加的可能性。在另一方面,較低的水平指示了產生特定疾病結果或終點、或其他預後資訊的可能性或風險較低。同樣,較高的LOXL2水平可以指示更差的預後,例如產生特定疾病或病症結果或達到特定終點的可能性或風險增加。纖維化疾病包括肺纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、以及骨髓纖維化,如以上說明的。在一些情況下,例如當循環LOXL2水平指示受試者很可能對纖維化疾病的治療顯出有益臨床反應時,受試者方法進一步涉及治療該個體的纖維化疾病。
適合於使用受試者測定方法測試的個體包括:已經被診斷為患有纖維化的個體,例如患有肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、骨髓纖維化、心臟纖維化、或其他類型的纖維化。肝纖維化包括但不限於:肝硬化以及相關病症,例如慢性病毒性肝炎(例如由HCV或HBV感染引起)、NAFLD、ASH、NASH、PBC、膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、以及自身免疫性肝炎。腎纖維化可以由多種疾病和損傷引起,其中此類疾病和損傷的實例包括慢性腎臟疾病、代謝綜合征、膀胱輸尿管反流、腎小管間質纖維化、糖尿病(包括糖尿病腎病)、以及作為結果的腎小球腎炎(GN),包括但不限於:局灶性節段性腎小球硬化和膜性腎小球腎炎、腎小球膜毛細血管GN。肺的纖維化包括許多綜合征和疾病,其中示例性的疾病包括IPF、特發性間質性肺炎以及ARDS。肺纖維化還包括但不限於隱原性纖維化肺泡炎、慢性纖維性間質性肺炎、ILD、以及DPLD。
在一些情況下,適當的測試受試者患有晚期形式的纖維化,但仍可能適合於用纖維化治療方案進行治療。例如,適當的測試受試者包括具有活動性(非末期)纖維化的受試者。在一些情況下,適當的測試受試者係患有纖維化、但預期會經歷快速疾病進展的受試者。作為一實例,個體可能患有晚期(例如METAVIR F4)的肝纖維化,具有METAVIR F4纖維化和陽性LOXL2(例如,大於液體樣品中的正常LOXL2水平,如使用受試者LOXL2測定法確定的)的個體仍然可以作為纖維化治療的候選人。具有陰性LOXL2(例如,液體樣品中正常的LOXL2水平,如使用受試者LOXL2測定法確定的)的METAVIR F4肝纖維化患者不可以被考慮為纖維化治療的候選人。作為另一實例,具有升高的LOXL2(例如,大於液體樣品中的正常LOXL2水平,如使用受試者LOXL2測定法確定的)、具有早期肝硬化(例如METAVIR F1或F2)的個體可以被考慮為纖維化治療的候選人。
可以將從受試者獲得的液體樣品中的LOXL2的水平與一或多個正常對照值或正常對照值範圍進行比較。該對照值可以是基於從對照群體(例如一般群體或選擇的人類受試者群體)獲得的對比樣品(例如血液、血漿、或血清樣品、或其他液體生物樣品)中的LOXL2的水平。例如,該選擇群體可以包括明顯健康的受試者,例如之前沒有任何纖維化或癌症的體征或症狀的個體。明顯健康的受試者通常也不另外顯出疾病症狀。換言之,如果由醫學專業人員來檢查,這樣的個體將被表徵為健康的並且沒有疾病症狀。
該對照值可以採用多種形式。該對照值可以是單一截止值,例如中位值或平均值。正常對照值可以是正常對照範圍。在某些情況下,對照、正常值係低於受試者測定方法的檢出限的,例如小於約175 pg/ml、小於約150 pg/ml、小於約125 pg/ml、小於約100 pg/ml、小於約75 pg/ml、小於約50 pg/ml、或小於約40 pg/ml。
藉由確定LOXL2的循環水平來評定患者將對纖維化疾病的治療顯出有益臨床反應的可能性。在報告中提供了患者的對纖維化疾病的治療顯出有益臨床反應的可能性。該報告可以進一步包括關於患者的反應可能性的資訊。例如,受試者方法可以進一步包括以下一步驟:生成或輸出一份提供了受試者反應可能性評定的結果的報告,該報告能以電子介質的形式(例如,電腦監視器上的電子顯示)或以有形介質的形式(例如,印刷在紙上或其他有形介質上的報告)來提供。
如在此說明的,“報告”係包括報告要素的電子或有形文件,該等報告要素提供了關於受試者可能性評定的感興趣的資訊及其結果。受試者報告至少包括可能性評定,例如指示患有纖維化疾病的患者將對纖維化疾病的治療顯出有益臨床反應的可能性。受試者報告可以完全或部分地是電子生成的。受試者報告可以進一步包括以下一項或多項:1)關於測試手段的資訊;2)服務提供者的信息;3)患者數據;4)樣品數據;5)解釋性報告,可以包括不同的資訊,包括:a)指示;b)測試數據,例如循環LOXL2水平;以及6)其他特徵。
在一些實施方式中,提供了用於特發性肺纖維化(IPF)的診斷、預後和預後方法。如在此的實例中所示,與正常對照樣品相比,在IPF患者的血清中檢測到了LOXL2的表達增加;另外,增加的循環LOXL2水平指示了活動性IPF表型以及各種疾病結局的風險增加。在IPF患者的肺組織中也檢測到了更高的LOXL2表達。因此,提供了使用LOXL2作為IPF疾病標記(例如,IPF疾病活動度或活動性IPF表型的標記)的方法。因此,在所提供的方法的一些實施方式中,LOXL2被用作IPF的診斷、預後和/或預測標記。在一方面,使用LOXL2水平來評估纖維形成和/或各個IPF階段、嚴重性或結局,例如特定疾病結局或對治療的反應性的可能性。
在另一方面,LOXL2水平指示了活動性疾病或疾病活動度的水平。在另一方面,相比於對照或其他參考樣品更高的LOXL2水平,典型地是血清水平,指示了產生特定疾病結局或產生特定時間段內特定疾病結局的風險。在其他方面,LOXL2水平指示了患者將對特定治療作出反應的可能性或者給出了關於對正進行的治療作出反應性的資訊,例如用LOXL2抑制劑進行的治療或其他治療。因此在一些實施方式中,該等方法進一步包括基於預測或檢測的LOXL2水平來啟動、中斷、或改變一疾病治療方法。
使用該等方法評估或預測的示例性疾病結局包括IPF疾病進展(定義為以下之一的複合終點:任何原因的死亡、差的無進展生存期(PFS)、呼吸系統疾病住院治療、肺功能的降低,例如肺功能的絕對降低(可以定義為用力肺活量(FVC)的10%降低伴有一氧化碳擴散能力(DLCO)的5%降低或DLCO的15%降低伴有FVC的5%降低)以及死亡。
該等方法總體上涉及獲得一患者樣品和/或確定該樣品中的LOXL2水平(例如,使用在此說明的方法)並且基於這個以及其他資訊進行不同的統計分析。在一實例中,確定了該患者或一樣品係具有高或低的LOXL2水平,例如低或高的循環或血清LOXL2水平。這個資訊可以例如藉由基於在給定群體(如樣品集合)中所確定的LOXL2水平的分佈來二分LOXL2水平、指定“低”和“高”LOXL2水平截止點來確定的。例如,高LOXL2水平可以認為是至少等於或高於給定樣品中的具體濃度的一水平,例如大於或大約800皮克(pg)LOXL2每毫升(mL)血清。可替代地,高LOXL2血清水平可以基於一群體之內的樣品的水平的分佈或者基於相比於對照或參考樣品的特定倍數變化而定義。
在一些方面,該等方法係如下進行的:與其他測量方法相結合來確定LOXL2水平,例如疾病嚴重性或功能狀態的標記,例如IPF的基線測量,例如反映IPF嚴重性的那些,例如預測的用力肺活量(FVC)的百分比、預測的一氧化碳彌散量的百分比(DLCO)、6分鐘步行距離(6MWD)、肺動脈平均壓(mPAP)、最低靜息氧飽和度(SpO2)、複合生理指數(CPI)、聖喬治
呼吸問卷得分(SGRQ)、以及變化呼吸困難指數(TDI)得分、對治療的反應、和/或疾病或疾病嚴重性的其他生物標記。因此,在該等預測模型和方法的一些方面,LOXL2係IPF疾病結果的生物標記以及疾病嚴重性或功能狀態的尺度和/或其他生物標記。
在一些實例中,基於LOXL2水平和其他測定結果來進行統計分析。在一實例中,例如使用標準長條圖來評估LOXL2的水平,以便評估未轉化的或log10x轉化的LOXL2水平。統計分析可以包括確定單獨的樣品和/或患者的LOXL2表達水平和/或基線變數的各種值,例如平均值,例如幾何平均值或中位值,並且計算各個樣品或病症中的標準差和倍數變化,並且可以使用許多熟知的檢驗(例如學生t檢驗)中的任何一種來比較基線變數和LOXL2表達水平的分佈而比較表達水平和/或其他變數。
在一些方面,使用皮爾遜相關(PC)來評定多對值之間的線性關係(相關)(例如藉由計算PC係數),例如LOXL2表達水平與其他變數(例如基線IPF變數)之間,如在此說明的。這樣的分析可以用來藉由計算單獨變數對的PC係數而線性分離表達圖案中的分佈(繪製在單獨矩陣的x和y軸上,如在實例9中所示)。
在一些實施方式中,該等預測方法進一步包括另外使用統計分析並且使用預測模型和系統。在一些方面,基於LOXL2以及典型地其他資訊(如指示疾病嚴重性和其他生物標記的變數),使用此類模型和系統來預測疾病結局、終點、反應性、和/或事件。例如,可以使用存活模型來檢查在LOXL2水平與其他協變數以及一或多個事件、終點或結局之間的關係,例如疾病結局,例如IPF結局和對一或多種治療的反應性;此類模型可以用來預測特定患者將具有該事件、終點或結局的可能性,或者這樣的結局將在特定時間量內發生的可能性。
在一這樣的實例中,進行Cox比例危險模型建立(例如逐步Cox比例危險模型建立)來檢驗LOXL2水平(以及任選地其他協變數,如在此說明的基線IPF變數以及可能與疾病結局相關的其他變數,例如其他疾病生物標記)與結局(如IPF結局)之間的關係。使用熟知的統計方法計算危險比(HR),其代表協變數(例如LOXL2水平)與受試者結局、終點或事件之間的關係。因此,在一些方面,基於LOXL2水平和其他協變數的值,所提供的該等方法包括使用此類模型來預測個體患者中的結局、終點和/或事件,例如IPF疾病結局。在一實例中,該模型包括LOXL2水平(例如,“高”LOXL2水平的存在或缺乏)、6MWD、和/或CPI。
用於這樣的模型建立中的IPF結局、事件和終點包括指示疾病進展或嚴重性的終點或事件,例如典型地在IPF臨床試驗或治療方案中指定的任何終點、這樣的IPF疾病進展、肺功能下降、呼吸系統疾病住院治療、以及死亡。在一些方面,疾病進展代表被定義為以下之一的一複合終點:任何原因的死亡率、呼吸疾病住院治療、或在肺功能方面的絕對降低(定義為用力肺活量(FVC)的10%降低伴有一氧化碳擴散能力(DLCO)的5%降低、或DLCO的15%降低伴有FVC的5%降低)。可以使用肺功能試驗來確定肺功能終點。在一些實例中,使用至少兩個試驗,間隔至少4周而進行。其他示例性終點係全因死亡率、無移植存活率、以及死亡。結局可以定義為在達到此終點之前經過的時間。
可以用接收器工作特性90(ROC)曲線來評估系統的敏感性對特異性。使用熟知的方法來計算曲線下面積(AUC)。
在該等預測模型的一些實例中,基於小於特定閾限量的P值(例如0.05),例如在特定的置信區間(CI)和置信水平下,例如95%的置信區間,LOXL2與一或多個結局或事件(例如疾病進展)顯著相關。可以使用危險比來確定一給定協變數(例如高LOXL2水平)的特定結局的風險的倍數變化。在一些方面,將一給定的LOXL2水平與產生特定結局(例如疾病進展、住院治療、肺功能降低、或如在此說明的其他結局)的至少2倍、3倍、3倍、4
倍、5倍、6倍、或7倍風險相關聯(例如統計性地顯著關聯)。風險的倍數變化例如可以在與正常受試者比較的意義上表示,例如不具有LOXL2水平升高或具有“低”的LOXL2水平的受試者。在一實例中,LOXL2水平,例如“高”LOXL2水平,與結局(例如疾病進展)統計性地顯著相關,當該模型中包括其他協變數(例如6MWD和CPI)時。
本揭露提供了用於進行循環LOXL2的受試者測定的試劑盒以及測定裝置。
在一些實施方式中,一受試者試劑盒包括:a)第一LOXL2特異性抗體;以及b)第二LOXL2特異性抗體。在一些情況下,該第一抗體係多克隆LOXL2特異性抗體;並且該第二抗體係單克隆LOXL2特異性抗體。在其他情況下,該第一抗體係單克隆LOXL2特異性抗體;並且該第二抗體係單克隆LOXL2特異性抗體。在其他情況下,該第一抗體係多克隆LOXL2特異性抗體;並且該第二抗體係多克隆LOXL2特異性抗體。該第一和/或第二抗體在一些情況下將包括一可檢測標記。在一些情況下,該第一和第二抗體均不包括可檢測標記。
該第一抗體在一些實施方式中將被固定在不溶性載體上。可替代地,與該試劑盒一起提供了一不溶性載體,並且用戶將完成第一抗體到該不溶性載體上的固定。因此,在一些情況下,一受試者試劑盒包括:a)第一LOXL2特異性抗體;b)第二LOXL2特異性抗體;以及c)一不溶性載體。該不溶性載體可以被提供為多種材料和形式中的任何一種,如以上說明的。例如在一些情況下,該不溶性載體係塑膠的多孔板、試條、或浸漬片。
如以上指出的,在一些情況下,該第一和第二抗體均不包括可檢測標記。在該等情況下,可以提供一包括可檢測標記並且結合到第二抗體上的第三抗體;此抗體通常被稱為二級抗體。該可檢測標記可以是例如化學發光劑、顆粒標記、比色劑、能量傳遞劑、酶、螢光劑、或放射性同位素。因此,在一些實施方式中,一受試者試劑盒包括:a)第一LOXL2特異性抗體;b)
第二LOXL2特異性抗體;以及c)一第三抗體,其中該第三抗體包括一可檢測標記並且結合到第二抗體上。在一些情況下,一受試者試劑盒包括:a)第一LOXL2特異性抗體;b)第二LOXL2特異性抗體;以及c)一第三抗體,其中該第三抗體包括一可檢測標記並且結合到第二抗體上;以及d)一不溶性載體。該不溶性載體可以按多種材料和形式中的任何一種來提供,如以上說明的。例如在一些情況下,該不溶性載體係塑膠的多孔板、試條、或浸漬片。
受試者試劑盒還可以包括用於產生標準曲線的純化的LOXL2。
受試者試劑盒可以進一步包括一或多個另外的組分,例如緩衝劑;蛋白酶抑制劑;可檢測標記;洗滌試劑;阻滯劑等等。該試劑盒的不同組分可以存在於分離的容器中或者若希望的話某些相容的組分可以預先組合到單一容器中。
除了上述組分之外,一受試者試劑盒可以包括對使用該試劑盒的組分來實施受試者方法的說明。實施受試者方法的說明通常記錄在適當的記錄介質上。例如,該等說明可以印刷在基底如紙或塑膠等等之上。這樣,該等說明可以在試劑盒中作為包裝說明書(package insert)存在、在該試劑盒的容器或其部件(即,與該包裝或子包裝相關聯的)等等的標籤中存在。在其他實施方式中,該等說明係作為存在於適當電腦可讀存儲介質上的電子儲存數據文件案存在,例如光碟唯讀記憶體(CD-ROM)、數位多用盤(DVD)、軟碟等。仍然在其他實施方式中,在試劑盒中不存在實際的說明,而是提供了用於從遠端來源(例如藉由網際網路)獲得說明的裝置。這個實施方式的實例係一包含網址的試劑盒,在該網址上可以查看該等說明和/或可以下載說明。關於該等說明,這種用於獲得說明的裝置被記錄在適當的基底上。
本揭露進一步提供了用於檢測從個體獲得的液體生物樣品中的LOXL2的測定裝置。該裝置可以包括限定了軸向流動路徑的一基質。
該基質可以包括:i)在該流動路徑的上游端接收流體樣品的一樣品接收區;ii)位於該流動路徑內並且在該樣品接收區下游的一或多個測試區,
該一或多個測試區各自在每個測試區中包括一固定在其中的LOXL2特異性抗體,以形成一固定的抗LOXL2抗體/LOXL2複合物;以及iii)位於該流動路徑內並且在該樣品接收區下游的一或多個對照區,其中該一或多個對照區包括陽性和/或陰性對照。該等測試區和對照區可以按交替的形式定位於該流動路徑內,以位於任何對照區上游的一測試區開始。
該基質可以包括:i)在該流動路徑的上游端接收流體樣品的一樣品接收區;ii)位於該流動路徑內並且在該樣品接收區下游的一或多個測試區,該一或多個測試區各自在每個測試區中包括一LOXL2特異性抗體,以形成一抗LOXL2抗體/LOXL2複合物;以及iii)位於該流動路徑內並且在該樣品接收區下游的一或多個對照區,其中該一或多個對照區包括陽性和/或陰性對照。該等測試區和對照區可以按交替的形式位於該流動路徑內,以位於任何對照區上游的一測試區開始。在一些實施方式中,該LOXL2特異性抗體沒有被固定;並且當該抗LOXL2抗體結合存在於該樣品中的任何LOXL2時,該抗LOXL2抗體/LOXL2複合物係可移動的。例如,在第一測試區中形成的抗LOXL2抗體/LOXL2複合物可以移動,使得它進入包含一固定的抗LOXL2抗體的第二測試區中,在這裡該抗LOXL2抗體/LOXL2複合物結合到該固定的抗LOXL2抗體上,從而形成一固定的抗LOXL2抗體/LOXL2複合物。
在使用這樣的測定裝置時,在一些實施方式中,在將液體樣品施加到該裝置的樣品接收區中之前可以首先將一標記的LOXL2特異性抗體與該液體樣品混合,其中這樣的混合產生了一標記的抗體/LOXL2複合物。在該等實施方式中,將該含有標記的抗體/LOXL2複合物的液體樣品施加到該測定裝置的樣品接收區。該液體樣品沿著該裝置流動,直到液體樣品到達測試區。存在于該測試區中的抗體結合存在於該標記的抗體/LOXL2複合物中的LOXL2;並且然後可以被檢測。
該測定裝置可以進一步包括一含有標記的LOXL2特異性抗體的標記區,其中該標記抗體能夠結合存在於固定的LOXL2/抗LOXL2抗體複合物中的LOXL2,從而形成標記的LOXL2/抗LOXL2抗體複合物,其中該標記的抗體在
液體樣品的存在下是可移動的。在使用這樣的測定裝置時,將一可包含LOXL2的液體樣品施加到該裝置的樣品接收區;存在于該標記區中的抗LOXL2抗體結合LOXL2,從而形成標記的抗體/LOXL2複合物,該複合物像該標記的抗體一樣是可移動的;並且該標記的抗體/LOXL2複合物沿該裝置流動直到該液體樣品到達一測試區。該測試區中存在的抗LOXL2抗體結合存在於該標記的抗體/LOXL2複合物中的LOXL2;並且然後可以被檢測。
可替代地,該測定裝置可以包括一標記區,該標記區含有對一抗LOXL2抗體特異性的標記抗體,其中該標記抗體結合到形成在該一或多個測試區中的任何抗LOXL2抗體/LOXL2複合物上。在一些情況下,該標記抗體係可移動的。
該標記抗體可以包括一標記,例如化學發光劑、顆粒標記、比色劑、能量傳遞劑、酶、螢光劑、或放射性同位素。
對照區包括陽性對照區和陰性對照區。
該基質通常是一種不溶性載體,其中適當的不溶性載體包括但不限於聚二氟乙烯(PVDF)、纖維素、硝酸纖維素、尼龍等等。該基質可以是柔性的、或者可以是相對柔性的。該基質被定位於一包含載體以及任選的覆蓋物的殼體中,其中該殼體包含一施用開口以及一或多個觀察口。該測定裝置可以處於多種形式中的任何一種,例如試條、浸漬片等等。
以下實例並非旨在限制諸位發明人對其發明所認為的範圍;它們也不旨在代表以下實驗係所進行的全部或僅有的實驗。已經做出努力確保關於所用數位(例如量、溫度等)的準確性,但應當考慮一些實驗誤差和偏差。除非另外指出,份數係重量份數,分子量係平均分子量,溫度係攝氏度,並且壓力係或者接近大氣壓。可以使用標準縮寫,例如bp,堿基對;kb,千堿
基;pl,皮升;s或sec,秒;min,分鐘;h或hr,小時;aa,氨基酸;kb,千堿基;bp,堿基對;nt,核苷酸;i.m.,肌肉的(地);i.p.,腹膜內的(地);s.c.,皮下的(地);等等。
建立了抗重組純化全長LOXL2蛋白的多克隆兔抗體(“兔A”);該抗體識別在LOXL2的所有域中的多個表位。小鼠單克隆抗體AB0030結合到LOXL2的催化域上並且識別該全長LOXL2蛋白和成熟的LOXL2蛋白兩者(在SRCR2與SRCR3域之間裂解)。
將來自MesoScale Discovery(MSD)的標準單點未包被電極板用30 μl體積的、配製在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的μg/ml兔抗人LOXL2多克隆抗體溶液在4℃包被過夜。在包被之後,藉由添加在PBS中的5%(w/v)Blocker A(MSD cat#R93AA-1)溶液而封閉該等板的所有孔。在封閉步驟之後,將板在含0.05%吐溫20非離子型去污劑的PBS中使用自動洗板機洗滌3次。藉由將待測試的人樣品(血清或血漿)在PBS中稀釋為1:4(1份血清、3份PBS)而分開製備。然後將樣品加入板的每個孔中。在旋轉振動(300-600 rpm)下將樣品在室溫孵育2-3小時。在樣品結合之後,將板再次在含0.05%吐溫20去污劑的PBS中使用自動洗板機洗滌3次。
初級抗體AB0030係鼠抗人LOXL2單克隆抗體,該抗體結合LOXL2催化域。將在PBS中的2%(w/v)Blocker A中的1 μg/ml AB0030溶液加入每個孔中,並然後將該等板在旋轉振動(300-600 rpm)下在室溫孵育1小時。AB0030結合之後,將板再次在含0.05%吐溫20洗滌劑的PBS中使用自動洗板機洗滌3次。
二級抗體係羊抗鼠IgG分子,該分子結合至SulfoTag染料(MSD cat#R32AC-5)上。將在PBS中的2%(w/v)Blocker A中的1 μg/ml第二抗體溶
液加入每個孔中,並將該等板在旋轉振動(300-600 rpm)下在室溫孵育1小時。在二級抗體結合之後,將該等板在含0.05%吐溫20去污劑的PBS中使用自動洗板機洗滌3次。
將具有表面活性劑的1x Read Buffer T(MSD cat#R92TC-2)加入每個孔中,然後立即在MSD SectorImager 2400儀器上測量該板。
藉由與在相同測定板上的校準曲線相比較,對測試人樣品給予了相對定量值的LOXL2,包括按已知濃度加入從正常健康供體集合的人血清或血漿中的純化的重組人LOXL2蛋白(R&D系統)。使用標準技術進行校準曲線擬合以及未知的樣品內插。
使用Costar 3922高結合力多孔板。將多克隆兔抗體(Ab)(兔“A”)在CB2包被緩衝劑中稀釋至0.625 μg/ml(免疫化學技術CB2(6248))將稀釋的多克隆Ab以50 μl/孔的體積加入該板的孔中,並將該等板在4℃保持過夜。在用該多克隆抗體包被該等孔之後,將孔用200 μl/孔的BB1封閉溶液封閉該等孔(免疫化學技術產品# 640)在室溫(RT)下持續1-3小時。封閉之後,將該等板用200 μl每孔的PBS-T(含0.05%吐溫20的PBS)洗滌3次。
將25 μl HiSpec稀釋劑(AbD Serotec BUF049B)加入到每個孔中。然後將相等體積的試驗血清加入每個孔中;並將板在室溫下保持2小時。在使血清樣品結合之後,將該等板洗滌三次。
將初級抗體(AB0030)在PBS-T+0.5%牛血清白蛋白(BSA)中稀釋至5 μg/ml;將50 μl的稀釋的初級抗體加入每個孔中。將板在室溫下保持一小時、然後用PBS-T洗滌三次。將二級抗體(辣根過氧化物酶(HRP)-結合的羊抗鼠抗體,Jackson Immunoresearch,0.8 mg/ml)在PBS-T+0.5% BSA中稀釋至1:10,000。將50 μl稀釋的二級抗體加入每個孔中。將板在室溫下保持一小時、然後用PBS-T洗滌三次。
藉由免疫組織化學(IHC)對纖維化肝組織的分析揭示了在纖維形成的介面處的局部LOXL2表達,該介面由成纖維細胞、新血管系統、炎症細胞和肝細胞構成,表明LOXL2與活動性纖維發生疾病是相關聯。為了進一步探究血清LOXL2與纖維化肝病之間的關係,使用了如在實例1中說明的LOXL2特異性ELISA。從患有慢性HCV感染的87位患者收集血清樣品以及肝臟活組織。藉由免疫測定法測量LOXL2以及所確立的生物標記透明質酸(HA)和金屬蛋白酶-1(TIMP1)組織抑制劑的血清水平,並且使用伊沙克評分系統評定了每個活檢的肝纖維化的組織學階段。單獨地,還從超過30位健康供體收集血清樣品並評定其血清LOXL2水平。使用ANOVA檢驗來研究血清生物標記與纖維化得分之間的關聯,並且對藉由纖維化得分而預分組的樣品進行曼-惠特尼U檢驗。
結果在圖1和2中示出。檢測了在83%的患有慢性HCV感染的患者的血清中的LOXL2蛋白,但是沒有檢測來自任何正常健康供體的血清中的LOXL2蛋白。在HA、TIMP1、和LOXL2的血清水平與纖維化階段之間存在著正相關。血清結果與IHC分析係一致的,該分析揭示了與在來自非感染或健康的個體的樣品中低的或不可檢測的水平相比的在活動性纖維化區域中的高水平LOXL2蛋白。
測試了來自15位診斷有特發性肺纖維化(IPF)的患者的血清樣品的LOXL2。結果在圖3中示出。顯示了單獨患者的識別號碼。15位元患者中的十位元測試為陽性;另外5位低於檢出限並且被報告為“沒有檢出”。還測試了年齡匹配的正常受試者;它們對於血清LOXL2全都為陰性(“沒有檢出”,低於檢出限)。
研究了用抗LOXL2(AB0024)抗體治療癌症的八位癌症患者。病人識別“Pt ID”;癌症診斷;抗LOXL2抗體的劑量水平;進展時間;以及LOXL2表達,正如藉由在從初始原發性腫瘤或相關樣品中分離的固定組織的樣品(約5 μm切片)中藉由免疫組織化學所測定的,都提供在了下表1中。
在開始抗LOXL2治療的第1天獲得血樣(在抗LOXL2治療之前獲取樣品);並且在開始抗LOXL2治療之後第29和57天獲得血樣。
在可得的所有時間點,檢測了在8位病人中的8位的血漿中、以及在8位病人的5位的血清樣品中的LOXL2。AB0024給藥沒有消除或掩蔽LOXL2信號。
從患有慢性HCV感染的患者獲得的切片的結果顯示於圖6中,該圖顯示了在這個患者的肝組織中的LOXL2蛋白表達。在圖6的左圖(5x物鏡放大)中,黑色箭頭指示了纖維膨脹到肝門區域和肝門束中的區域。白色箭頭指示了在肝小葉周圍的短纖維性隔膜的區域。圖6的右圖(40x物鏡放大)顯示了在纖維性隔膜(S)中、在與肝細胞(H)的介面處、在竇周間隙(箭頭)內、以及在肝實質(箭頭)中的成肌纖維細胞中觀察到的LOXL2免疫反應性。結果顯示,在本研究中,LOXL2表達於患有慢性HCV感染的患者的肝組織中,並且這種表達藉由所提供的測定法的實施方式係可測量的。在另一IHC研究中,在NASH、HCV相關的纖維化和ASH中的活動性疾病介面處的肝組織中存在LOXL2表達的強的局部化,但在健康的肝臟中沒有(數據未顯示)。
使用在實例1中描述的LOXL2免疫測定法(在MesoScale Discovery平臺上開發的夾心免疫測定法),在來自健康個體的血清中沒有檢測出LOXL2。為了產生校準曲線,將純化的重組全長LOXL2蛋白加入混合正常人血清中,然後連續稀釋在血清中。
結果在圖7中示出。每個數據點代表3個重複孔的平均值;顯示了4個獨立板的曲線。
表2顯示了在人血清基質中的校準標準的特徵。在表2中,檢測下限(LLOD)係平均值+2.5 *空白孔的標準差(原始值,外推的);定量下限
(LLOQ)係對原始測量值而言相對誤差<30%並且變異係數<30%的最低校準標準。使用真正的樣品(incured sample)來確定批內分析和批間分析的精確度。
從患有慢性丙型肝炎感染的、納入臨床試驗的安慰劑組中的二十六位成人收集患者血清樣品。將受試者按伊沙克纖維化得分進行分組(1-3:輕度至中度纖維化;5-6:肝硬化)。該等受試者的人口統計特徵在表3中示出。
在相對於研究基線的六個時間點:第4、8、16、24、26和30周獲取血清樣品。以盲的方式由中心病理學家來評估成對的肝活組織(篩選和第24周)。參見Manns M,Palmer R,Flisiak E等人,J Hepatology[肝臟病學雜誌].2011,54增刊1:S55-S56。使用在實例1中描述的LOXL2免疫測定法(在MesoScale Discovery平臺上開發的夾心免疫測定法)測量血清LOXL2。
對於統計分析,將受試者按伊沙克纖維化得分進行分組(1-3:輕度至中度纖維化;5-6:肝硬化)。在該研究中沒有觀察到受試者具有為4的基線伊沙克纖維化得分。將具有低於該測定法的定量下限(LLOQ)的可檢測LOXL2的血清樣品設定至LLOQ。描述性地並且圖解地總結了生物標記水平的差異。使用以所觀察的每組樣品尺寸的替換抽樣藉由對中位值的10,000次自展來構建95%的置信區間(CI)。當比較在一時間點之內的多個群組時使用Wilcoxon秩和檢驗並且當比較所有時間點上的多個群組時藉由使用具有受試者內隨機效應的重複測量線性模型來計算P值。
圖8顯示了藉由預分組的基線伊沙克纖維化得分和時間的血清水平。每個圖在所指示的時間點(第4、8、16、24、26和30周)顯示了根據伊沙克纖維化得分而分組的兩組病人(分別是1-3和5-6)的LOXL2濃度(pg/mL)。LOXL2濃度在作圖範圍之外的三個離群值(LOXL2濃度=5529、6621、8,845 pg/ml)全都來自同一受試者,具有的伊沙克纖維化得分為5。
圖9顯示了中位元受試者內LOXL2血清水平,被計算為根據伊沙克纖維化得分而分組的兩組病人(分別是1-3和5-6)在經過4-30周的中位LOXL2血清濃度。平均的受試者內的變異係數為22%。
圖10顯示了藉由預分組的基線伊沙克纖維化得分的隨時間(周)變化的中位LOXL2血清濃度(pg/mL),具有95%的置信區間。僅一位元受試者在研究活組織檢查之間經過25-28周在伊沙克纖維化得分中具有大於或等於2的變化。
表4顯示了每個時間點的中位LOXL2濃度(pg/mL),與患有輕度至中度肝纖維化的受試者相比,其中p值顯示了在患有肝硬化的受試者中的統計學顯著的增加。
該等結果證實了所提供的免疫測定法的實施方式對於測量LOXL2蛋白的血清濃度的能力。該等結果還證明,在本研究中,與患有輕度至中度肝纖維化的受試者相比,在患有肝硬化的受試者中的血清LOXL2蛋白的顯著增加,並且這種增加在血清中是使用所提供的測定法的實施方式可測量的。
如在實例7中那樣進行免疫測定和統計分析。另外,使用商用免疫測定試劑盒來測量透明質酸(HA)和TIMP1。使用斯皮爾曼等級相關來評定在生物標記(LOXL2與HA或TIMP1)之間的關聯。
圖11顯示了具有所指示的伊沙克得分(1-6)的受試者的中位受試者內LOXL2水平對比透明質酸(HA)(左圖)和金屬蛋白酶1(T1MP1)的
組織抑制劑(右圖)的水平。中位受試者內表達被計算為經過第4周至30周的中位表達。使用局部加權的散佈圖平滑化來構建該曲線。
該等結果證明,在本研究中,血清LOXL2水平與血清HA和TIMP1水平相關,如使用所提供的免疫測定法的實施方式所測量的。
從參與該ARTEMIS-IPF試驗的受試者收集血清樣品。該等一隨機的、雙盲的、安慰劑對照的、事件驅動的試驗。將受試者以2:1的比率隨機化以接收安貝生坦(一ETA受體的選擇性拮抗劑)、或安慰劑。本研究被過早終止;有660名受試者加入。
收集了反映IPF嚴重性和功能狀態的基線變數。該些基線變數包括:預測的用力肺活量(FVC)的百分比、預測的一氧化碳彌散量的百分比(DLCO)、6分鐘步行距離(6MWD)、肺動脈平均壓(mPAP)、最低靜息氧飽和度(SpO2)、複合生理指數(CPI)、聖喬治呼吸問卷得分(SGRQ)、以及變化呼吸困難指數(TDI)得分。經由右心導管插入術而獲得mPAP,這係所有在基線的研究受試者所需要的。CPI係經確認的多維模型,該模型結合了FVC、第一秒用力呼氣量(FEV1)和DLCO以估計在患者胸部的電腦斷層掃描上看到的纖維化程度。主要終點係IPF疾病進展時間,係被定義為以下之一的複合終點:任何原因的死亡率、呼吸系統疾病住院治療、或肺功能的絕對降低(被定義為用力肺活量(FVC)的10%降低伴有一氧化碳擴散能力(DLCO)的5%降低、或DLCO的15%降低伴有FVC的5%降低)。藉由間隔至少4周進行的兩次肺功能試驗來確認肺功能終點。
使用在MesoScale Discovery平臺上開發的免疫測定法以實例1中說明的抗LOXL2抗體以一式三份來量化LOXL2的基線水平。使用標準長條圖來評估未轉化的以及log10X轉化的LOXL2基線水平。使用學生T檢驗來比較基線變數的分佈。使用皮爾森相關係數來檢驗LOXL2基線水平與基線
變數之間的關係。使用逐步Cox比例危險模型建立來檢驗LOXL2基線水平與IPF結局之間的關係。使用接受者操作特性曲線來估計曲線下面積。
來自準備治療的組群中的69位受試者的血清樣品可用於該分析。在與來自ARTEMIS-IPF的423位受試者(對他們沒有獲得血清樣品)比較時,在IPF嚴重性或功能狀態(表5)的基線測量中沒有統計學顯著性差異。然而,在這69位受試者中,當比較安貝生坦和安慰劑治療群體(表6)時,在IPF嚴重性和功能狀態的基線測量中存在著統計學顯著性差異。安貝生坦群體中的受試者具有更低的DLCO(p=0.035)、更低的基線6MWD(p=0.004)、更高的基線mPAP(p=0.016)、更高的基線CPI(p=0.05)以及更高的基線SGRQ(p=0.011)。平均基線LOXL2水平高於安貝生坦受試者(p=0.026)。
LOXL2基線水平的分佈的分析顯示了8位元受試者具有小於約88 pg/mL的LOXL2水平,34位受試者具有約88 pg/mL至大約440 pg/mL的LOXL2水平,並且28位受試者具有大於大約440 pg/mL的LOXL2水平。中位LOXL2水平係大約325 pg/mL,四分位數間距係約147 pg/mL至大約770 pg/mL,並且最小值為約18 pg/mL並且最大值為約5,400 pg/mL。
基於皮爾森相關係數,在LOXL2基線水平與IPF嚴重性和功能狀態的該等基線測量之間的關聯是弱的。圖12顯示了代表LOXL2基線水平與FVC、DLCO、6MWD、CPI、SGRQ、和TDI之間關係的散佈圖矩陣。LOXL2與基線嚴重性測量之間的關聯在頂排的圖(a)和(b)的暗框中高亮顯示。LOXL2與單獨的基線嚴重性測量之間的相關係數如下:-0.21(FCV)、-0.11(DLCO)、0.03(6MWD)、0.10(mPAP)、-0.07(SpO2)、0.14(CPI)、0.06(SGRQ)、和-0.05(TDI)。然而LOXL2基線水平的Log10X轉化使得這種分佈標準化,LOXL2與IPF嚴重性和功能狀態的基線測量之間的關聯仍然是弱的(圖12b)。
如果大多數LOXL2基線水平小於約800 pg/mL,則將該等LOXL2基線水平二分為800 pg/mL(“低”)對>800 pg/mL(“高”)以用於剩餘的分析。在具有大於大約440 pg/mL的LOXL2基線水平的28個受試者中,12個具有大約440-800 pg/mL的低LOXL2基線水平並且被分組到低組中;並且16個具有大於800 pg/mL的LOXL2基線水平並且被分組到高組中。
在圖13中顯示了在“高”與“低”LOXL2基線水平組之間的疾病進展的比較。因為在安慰劑組中僅兩位患者具有“高”LOXL2基線(均沒有任何事件),圖13僅比較了在安貝生坦組中的“低”和“高”LOXL2基線水平。結果表明,高LOXL2基線水平與更多的疾病進展事件相關(圖13a)並且高LOXL2基線水平與更多的肺功能下降事件(圖13b)、更多的呼吸系統疾病住院治療(圖13c)以及更多的死亡(圖13d)相關。
另外,如在表7中所示,Cox比例危險模型建立表明,高LOXL2基線水平的存在與疾病進展風險增加5倍(危險比[HR]4.95,95%置信區間[CI]1.52-16.18,p=0.008)肺功能下降風險增加7倍(HR 7.36、95% CI 1.16=46.74、p=0.034)、以及呼吸系統疾病住院治療風險增加5倍(HR 4.85、95% CI 1.09-21.68、p=0.039)相關。所有該等統計模型都針對治療任務和基線6MWD以及CPI得分進行了調整。高LOXL2基線水平並不與死亡風險的顯著增加顯著相關(HR 1.59、95% CI 0.24-10.53、p=0.633)。
還分析了樣品的MMP7、ICAM1、IL8、VCAM1、以及S100A12水平。該等蛋白質均不與治療結局顯著相關。結果顯示,高LOXL2基線水平與IPF疾病進展風險增加5-7倍相關,但與死亡不相關。
在第二個臨床IPF前瞻性隨訪研究中評定了受試者中的血清LOXL2水平,評定了在111個無其他肺病歷史的IPF患者(稱為GAP組群)中的疾病進展。根據ATS/ERS指南,所有GAP組群受試者被診斷為患有IPF,這係藉由在年齡超過55歲並且無確定病因的患者中的外科肺活檢或胸膜下蜂窩變化(subpleural honeycomb change)的放射線發現、牽拉性支氣管擴張症、以及最小肺泡充盈所證實的。肺功能試驗揭示了為40%-70%預測的用力肺活量。受試者能夠接收所有正在進行的護理以及在臨床部門的隨訪。
在初次隨訪中,每個參與者進行抽血、肺功能試驗、6分鐘步行試驗(6MWT)、超聲心動圖、以及CT掃描、以及被設計用來測量患者感覺如何的若干問卷調查。在3-8個月間隔的隨訪中,收集血樣並重複PFT、問卷調查和6MWT。中位FVC、FEV1和DLCO分別是預期值的65.7%±17.5%、76.8%±18.7%、以及47.3%±17.9%。
如上所述對ARTEMIS-IPF受試者進行LOXL2的基線血清水平的量化。使用標準長條圖來評估自然對數形式的LOXL2基線血清水平。藉由實驗確定了LLOD為180 pg/mL並且LLOQ為440 pg/mL。
在使用回歸法進行自然對數轉換之後將GAP組群的LOXL2水平標準化為ARTEMIS-IPF數據。結果在圖14中示出。
評定了全因死亡率時間,其中將肺移植被認為是死亡事件(大多數肺移植患者死亡)。將分類和回歸樹(CART)方法作為無偏倚途徑來選擇用於將基線血清LOXL2水平進行二分的最佳閾值或截止點。在該GAP組中,當Log(LOXL2)係唯一的變數時,CART分析選擇了440 pg/mL(在自然對數標度處為6.08)作為截止點。
表8A顯示了在該GAP組群中的受試者的基線和人口統計特徵,並且圖8B顯示了在這個組群中各個基線值之間的關聯。
在基線之後第六(6)個月、十二(12)個月、十八(18)個月、和二十四(24)個月使用Cox比例危險模型建立和卡普蘭-邁耶曲線評估了二分的LOXL2水平與全因死亡率之間的關聯。由於數據不可得,沒有評估LOXL2基線水平與住院治療和肺功能下降之間的關聯。
LOXL2基線水平的分佈的分析顯示了朝更低光譜的偏態分佈,類似於對ARTEMIS-IPF組群所觀察到的。中位基線LOXL2水平係716.5 pg/mL(四分位數間距358.3 pg/ml,1446.6 pg/ml)。在LOXL2與IPF嚴重性的基線人口統計和基線臨床指標之間的關聯是弱的(相關係數對於年齡是-0.07,FVC -0.03,DLCO -0.28)。沒有另外的疾病嚴重性臨床指標可用於進一步的分析。
結果顯示,440 pg/ml閾值的基線血清LOXL2水平與全因死亡率的風險相關聯。在血清中高於440 pg/mL的基線LOXL2水平與基線之後12、18和24個月時的更多死亡相關(圖15A和B)。
多變數Cox比例危險模型建立(協變數包括年齡和性別)表明,高於440 pg/mL的基線LOXL2水平的存在與基線之後12、18和24個月時死亡風險增加2.3倍相關(見圖9A和B)。
對於一受試者子集,前瞻性地收集了另外的血清樣品。在研究持續期間,從60個患者中收集兩個(2)樣品,從42個受試者中收集三(3)個樣品,從31個受試者中收集四(4)個樣品,從17個受試者中收集五(5)個樣品,從12個受試者中收集六(6)個樣品,從3七(7)受試者中收集七(7)個樣品,並且從兩(2)個受試者中收集八(8)個樣品。該等樣品沒有一個係與急性加重相關而收集的。
使用多變數Cox比例危險模型建立(協變數包括年齡和性別),在每個樣品中引入LOXL2水平作為時間依賴性連續變數,以評估在血清LOXL2水平與全因死亡率之間的關係。隨時間測量的血清LOXL2水平與死亡率的風險相關(p=0.003)。在該GAP組群中,對於在研究過程中的任何時間抽取的血清LOXL2水平的每2.7倍的增加,死亡率的風險增加了1.63倍(95%置信區間1.19-2.25)。
表10顯示了在基線之後不同時間的血清LOXL2水平的多變數分析的結果。
該GAP組群的結果類似於以上說明的ARTEMIS-IPF研究的結果。這兩個研究均顯示,高於閾值水平的基線血清LOXL2水平與IPF患者的消極結局風險增加相關。
評定了患有慢性乙型肝炎病毒(CHB)感染和肝纖維化的受試者的血清LOXL2水平,均在治療之前以及用300 mg富馬酸替諾福韋酯(TDF)治療240周之後。在治療之前以及用TDF治療240周之後從348位患有CHB的人類受試者獲取肝活組織。使用伊沙克標度由病理學家對該等活組織評分,以評定纖維化。在該研究中,96.3%的受試者展現了在肝纖維化方面的改進或沒有
肝纖維化的進展。在開始了用活檢證明的肝硬化的研究的這96個受試者中,74%在治療240周之後肝硬化消退。
回顧性地評定了在基線處以及在第240周的348位受試者中的81位的血清LOXL2水平,該等受試者包括在纖維化得分上顯出改進的若干受試者。在治療後第240周,這81位受試者中的42位肝硬化消退,16位具有永久肝硬化,2位在治療過程中進展到肝硬化,18位係在纖維化方面無變化的非肝硬化受試者,並且3位係在纖維化方面減輕至少2個點(藉由伊沙克測量的)的非肝硬化受試者。
在這81位CHB受試者中的91%以及肝硬化受試者中的97%的基線血清LOXL2水平升高。如以下示出的,與患有較不嚴重的肝纖維化的患者相比,患有肝硬化的患者(伊沙克得分為5或6)在基線處的中位LOXL2血清水平升高。這個觀察結果類似於在患有慢性丙型肝炎病毒感染的患者中觀察到的LOXL2血清水平。而且,組織學研究顯示,LOXL2蛋白集中在活動性纖維形成位置(數據未顯示)。該等結果表明,患有肝硬化的患者在肝中仍然正在經歷活動性纖維形成。而且,在240周的治療過程中,這60位患有基線肝硬化的患者中的72%顯示了伊沙克纖維化得分的回歸或改進。而且,該等患者在第240周時與基線相比具有更低的中位血清LOXL2水平。該等結果表明,總體纖維化和纖維形成兩者均藉由抗病毒治療而減少。
圖16A顯示,血清LOXL2水平(pg/mL)與纖維化得分相關,並且圖16B和16C顯示血清基線LOXL2水平(pg/mL)與基線伊沙克纖維化得分相關。在治療之後第240周時,平均血清LOXL2水平已經降低並且不再與伊沙克纖維化得分相關。還參見表11。
如在圖17中所示,所有具有1與3之間的基線伊沙克階段的受試者具有低於1500 pg/mL的血清LOXL2水平,並且具有在4與6之間的基線伊沙克階段的受試者中的49%具有高於1500 pg/mL的血清LOXL2水平。
這81位受試者中的79%經歷了血清LOXL2水平的降低。11%的受試者(每個具有低於定量限的基線水平)的LOXL2水平無變化。
圖18顯示了以下組中的個體受試者的基線和第240周的血清LOXL2水平(pg/mL):在第240周患有永久肝硬化的受試者(n=16,圖18A);到第240周具有肝硬化逆轉的受試者(n=42,圖18B);到第240周沒有經歷纖維化階段改變的非肝硬化受試者(伊沙克)(n=18,圖18C);在研究過程中經歷了到肝硬化的進展的受試者(圖18D);以及到第240周在纖維化方面具有大於或等於2個階段的減少的非肝硬化受試者(圖18E)。
表12比較了在第240周患有永久肝硬化的受試者、在第240周具有肝硬化逆轉的受試者、以及在研究過程中沒有經歷纖維化階段改變的非肝硬化受試者(“非肝硬化編號△”)的基線以及第240周時的血清LOXL2水平(pg/mL)。
如在表12中所示,88%的肝硬化受試者具有LOXL2水平降低。另外,在第240周患有永久性肝硬化的那些受試者中的基線血清LOXL2水平被確定為最高。
圖19顯示了被確定為在240周具有組織學改進的、具有給定的基線血清LOXL2水平(<1500、>1500、1500-3000、<3000、以及>3000 pg/mL)的肝硬化CHB受試者(“Y”)的百分比;以及被確定為在240周沒有組織學改進的、具有相同的給定的基線血清LOXL2水平的肝硬化受試者(“N”)的百分比。如所示,具有小於1500 pg/mL的基線血清LOXL2水平的肝硬化受試者具有88%的消退機會。具有在1500 pg/mL與3000 pg/mL之間的基線血清LOXL2水平的肝硬化受試者具有70%的消退機會,而具有高於3000 pg/mL的基線血清LOXL2水平的肝硬化受試者僅具有29%的消退機會。因此,在肝硬化患者中,低於1500 pg/mL的基線血清LOXL2水平與88%的消退可能
性相關,而高於3000 pg/mL的基線血清LOXL2水平與29%的消退可能性相關。
基線血清LOXL2水平與240周的伊沙克纖維化階段的關聯較之與基線纖維化階段更高。這表明高血清LOXL2水平反映了活動性纖維形成。
這個研究的結果證明,血清LOXL2水平在患有CHB的患者中升高並且在有最多纖維化的患者中最高,證明了在血清LOXL2與纖維化得分之間的一般相關。血清LOXL2水平反映了活動性疾病和活動性纖維形成(例如,假定較高的基線水平與第240周時較高的纖維化階段相關)。治療潛在的CHB導致了大多數患者中LOXL2的下降,表明纖維形成的下調。在5年之後,甚至在臨床表現良好的、具有不變的纖維化得分的患者中血清LOXL2也下降。該等結果證明血清LOXL2水平係活動性疾病的標記並且高LOXL2預測了消退的缺乏。
雖然已經參照本發明的具體實施方式描述了本發明,但熟習該項技術者應當理解的是,可以進行不同的改變並且可以取代等效物而不背離本發明的真正精神和範圍。此外,可以進行許多修改以使特定情況、材料、物質組成、工藝、一或多個工藝步驟適應本發明的目的、精神和範圍。所有這樣的修改預期係在於此隨附的申請專利範圍的範圍之內。
<110> 吉利德生物技術公司
SMITH,Victoria
ADAMKEWICZ,Joanne
LYMAN,Susan K.
CHIEN,Jason
LI,Xiaoming
SHAO,Lixin
<120> 賴氨醯氧化酶樣2測定及其使用方法
<130> 246102008340
<140> 尚未指定
<141> 同此
<150> US 61/492,210
<151> 2011-06-01
<150> US 61/550,895
<151> 2011-10-24
<150> US 61/578,813
<151> 2011-12-21
<160> 14
<170> Windows版本4.0的FastSEQ
<210> 1
<211> 774
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> misc_特徵
<222> (1)...(774)
<223> LOXL2
<400> 1
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> 域
<222> (1)...(227)
<223> LOXL2蛋白的催化域
<400> 2
<210> 3
<211> 227
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 域
<222> (1)...(227)
<223> LOXL2蛋白的催化域
<400> 3
<210> 4
<211> 227
<212> PRT
<213> 黑家鼠
<220>
<221> 域
<222> (1)...(227)
<223> LOXL2蛋白的催化域
<400> 4
<210> 5
<211> 227
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<221> 域
<222> (1)...(227)
<223> LOXL2蛋白的催化域
<400> 5
<210> 6
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> 鏈
<222> (1)...(135)
<223> 重鏈可變區
<400> 6
<210> 7
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> 鏈
<222> (1)...(132)
<223> 輕鏈可變區
<400> 7
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> 鏈
<222> (1)...(116)
<223> 重鏈可变区
<400> 8
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> 鏈
<222> (1)...(112)
<223> 輕鏈可變區
<400> 9
<210> 10
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> 鏈
<222> (1)...(116)
<223> 重鏈可变区
<400> 10
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> 鏈
<222> (1)...(116)
<223> 重鏈可变区
<400> 11
<210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> 鏈
<222> (1)...(116)
<223> 重鏈可变区
<400> 12
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> 鏈
<222> (1)...(112)
<223> 輕鏈可變區
<400> 13
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> 鏈
<222> (1)...(112)
<223> 輕鏈可變區
<400> 14
Claims (40)
- 一種用於檢測、預測或監測疾病或病症的方法,該方法包括:a)使從個體獲得的一液體樣品與一賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)特異性抗體相接觸;並且b)檢測該抗體與存在於該液體樣品中的LOXL2的結合,由此檢測該液體樣品中的LOXL2水平,其中所檢測的LOXL2水平指示了該疾病或病症在該個體中存在或缺乏或者由該個體對該疾病或病症的治療作出反應的可能性。
- 一種用於疾病或病症的預後方法,該方法包括:a)使從患有該疾病或病症的個體獲得的一液體樣品與一賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)特異性抗體相接觸;並且b)檢測該抗體與存在於該液體樣品中的LOXL2的結合,由此檢測該液體樣品中的LOXL2,其中,所檢測的LOXL2水平指示了該疾病或病症的結局、事件或終點的可能性。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,其中:該個體正在經歷針對該疾病或病症的治療;並且在步驟(b)中檢測的LOXL2水平低於在該個體中在更早時間點所確定的水平指示了該治療的效果。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法,其中在該更早時間點確定的水平係一治療前水平。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,其中該液體樣品係血液、血成分、尿、唾液、痰、或支氣管肺泡灌洗液。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,其中該LOXL2特異性抗體包括一可檢測標記。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,進一步包括將存在於該液體樣品中的LOXL2固定到一可溶性載體上,其中該固定係如下 進行的:藉由使該液體樣品與一LOXL2特異性第二抗體相接觸以便形成一第二抗體-LOXL2複合物,其中該第二抗體被固定在該可溶性載體上。
- 如申請專利範圍第7項所述之方法,其中該固定係在步驟(a)之前進行的。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,其中當LOXL2結合到一抑制LOXL2的酶活性的試劑上時,在步驟(a)中的抗體能夠結合到LOXL2上。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法,其中該試劑係LOXL2酶活性的變構抑制劑。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法,其中該變構抑制劑係一抗LOXL2單克隆抗體。
- 如申請專利範圍第11項所述之方法,其中該抗LOXL2單克隆抗體結合到在LOXL2的SRCR3-4域之內的表位上。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,進一步包括:c)將所述檢測水平與正常對照值進行比較,其中高於正常對照值的檢測水平指示該疾病或病症的存在或者該個體將對該疾病或病症的治療作出反應的可能性。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,其中該疾病或病症係一纖維化疾病或癌症。
- 如申請專利範圍第14項所述之方法,其中該疾病或病症係一纖維化疾病,並且大於正常對照水平的LOXL2循環水平指示該個體很可能對纖維化疾病的治療顯出有益的臨床反應。
- 如申請專利範圍第14項所述之方法,其中該疾病或病症係肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、心臟纖維化、或骨髓纖維化、肝硬化、慢性病毒性肝炎、丙型肝炎病毒(HCV)感染、或乙型肝病毒(HBV)感染。
- 如申請專利範圍第16項所述之方法,其中該疾病或病症係特發性肺纖維化(IPF)。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法,其中該檢測水平指示了該個體中的IPF疾病結局、終點或事件的可能性。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法,其中該IPF疾病結局、終點或事件係IPF疾病進展、肺功能下降、呼吸系統疾病住院治療、無移植存活率、死亡、或治療反應性。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法,其中該方法進一步包括檢測個體中的IPF疾病嚴重性或功能狀態的量度,該量度係選自下組,該組由以下各項組成:預測的用力肺活量(FVC)的百分比、一氧化碳彌散量的百分比(DLCO)、6分鐘步行距離(6MWD)、肺動脈平均壓(mPAP)、最低靜息氧飽和度(SpO2)、複合生理指數(CPI)、聖喬治呼吸問卷得分(SGRQ)、以及變化呼吸困難指數(TDI)得分、對治療的反應、以及IPIF疾病的生物標記。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,進一步包括使用一預測模型來分析LOXL2水平。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,進一步包括開始、改變或中斷對該個體中的疾病或病症的治療。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,進一步包括使該個體經受一或多個進一步的診斷試驗。
- 如申請專利範圍第23項所述之方法,其中該一或多個進一步的診斷試驗係肺功能試驗或肝功能試驗。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,其中該檢測水平指示該個體具有活動性纖維化疾病或者晚期纖維化疾病。
- 如申請專利範圍第25項所述之方法,其中該活動性纖維化疾病係METAVIR F1或F2肝纖維化,或該晚期纖維化疾病係METAVIR F4肝纖維化。
- 一種用於確定從個體獲得的液體生物樣品中的賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)多肽水平的測定裝置,該裝置包括:一限定了軸向流動路徑的基質,該基質包括:i)在該流動路徑的上游端的一接收該流體樣品的樣品接收區;ii)一或多個位於該流動路徑內並且在該樣品接收區下游的測試區,所述一或多個測試區各自包括一LOXL2特異性抗體,其中所述LOXL2特異性抗體各自能夠結合到存在於液體樣品中的LOXL2多肽上,從而形成一抗LOXL2抗體/LOXL2複合物;以及iii)一或多個位於該流動路徑內並且在該樣品接收區下游的對照區。
- 如申請專利範圍第27項所述之測定裝置,其中,當該一或多個測試區包括至少兩個測試區時,該一或多個對照區中的至少之一被定位於兩個測試區之間。
- 如申請專利範圍第28項所述之測定裝置,其中該至少兩個測試區和至少一個對照區係以交替的形式定位於該流動路徑內,以一個位於任何對照區上游的測試區開始。
- 如申請專利範圍第28或29項所述之測定裝置,其中所述該等抗LOXL2抗體中的一或多種被固定在測試區中的基質上。
- 如申請專利範圍第27至29項中任一項所述之測定裝置,進一步包括一標記區,該標記區包括對於LOXL2特異性抗體係特異性的一標記抗體,其中:該標記抗體能夠結合到存在於抗LOXL2抗體/LOXL2複合物中的抗LOXL2抗體上從而形成標記的抗LOXL2抗體/LOXL2,並且該標記抗體在液體樣品的存在下是可移動的。
- 如申請專利範圍第31項所述之測定裝置,其中該標記抗體包括選自下組的一標記組分,該組由以下各項組成:化學發光劑、顆粒標記、比色劑、能量傳遞劑、酶、螢光劑、以及放射性同位素。
- 如申請專利範圍第27至29項中任一項所述之測定裝置,其中該基質定位於一包含載體以及任選的覆蓋物的殼體中,其中該殼體包含一施用開口以及一或多個觀察口。
- 如申請專利範圍第28至29項中任一項所述之測定裝置,其中該裝置係一試條。
- 如申請專利範圍第28至29項中任一項所述之測定裝置,其中該裝置係浸漬片測定裝置。
- 一種用於確定從個體獲得的液體生物樣品中的賴氨醯氧化酶樣2(LOXL2)多肽水平的試劑盒,該試劑盒包括:a)一第一LOXL2特異性抗體;以及b)一第二LOXL2特異性抗體。
- 如申請專利範圍第36項所述之試劑盒,進一步包括用於產生標準曲線的純化LOXL2。
- 如申請專利範圍第36或申請專利範圍37項所述之試劑盒,其中所述該等抗體中的至少一種包括可檢測標記。
- 如申請專利範圍第38項所述之試劑盒,其中該可檢測標記包括化學發光劑、顆粒標記、比色劑、能量傳遞劑、酶、螢光劑、以及放射性同位素。
- 如申請專利範圍第1或申請專利範圍2項所述之方法,其中該接觸和檢測係使用如申請專利範圍第27至35項中任一項所述之測定裝置或如申請專利範圍第36至39項所述之試劑盒進行的。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161492210P | 2011-06-01 | 2011-06-01 | |
US201161550895P | 2011-10-24 | 2011-10-24 | |
US201161578813P | 2011-12-21 | 2011-12-21 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201319572A true TW201319572A (zh) | 2013-05-16 |
Family
ID=46208194
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW101119847A TW201319572A (zh) | 2011-06-01 | 2012-06-01 | 類氨醯氧化酶樣2(lysyl oxidase-like 2)測定及其使用方法 |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20140206017A1 (zh) |
EP (1) | EP2714744A1 (zh) |
JP (3) | JP2014523521A (zh) |
KR (1) | KR20140048156A (zh) |
CN (1) | CN103946241A (zh) |
AP (1) | AP2013007285A0 (zh) |
AR (1) | AR086657A1 (zh) |
AU (2) | AU2012261883A1 (zh) |
BR (1) | BR112013030682A2 (zh) |
CA (1) | CA2837534A1 (zh) |
CL (1) | CL2013003445A1 (zh) |
CO (1) | CO6940375A2 (zh) |
CR (1) | CR20130657A (zh) |
EA (1) | EA201391627A1 (zh) |
EC (1) | ECSP13013092A (zh) |
IL (1) | IL229631A0 (zh) |
MA (1) | MA35212B1 (zh) |
MD (1) | MD20130098A2 (zh) |
MX (1) | MX2013013905A (zh) |
PE (1) | PE20141450A1 (zh) |
TW (1) | TW201319572A (zh) |
UY (1) | UY34115A (zh) |
WO (1) | WO2012167181A1 (zh) |
ZA (1) | ZA201308812B (zh) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030114410A1 (en) | 2000-08-08 | 2003-06-19 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Pharmaceutical compositions and methods useful for modulating angiogenesis and inhibiting metastasis and tumor fibrosis |
CA2693208A1 (en) | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Victoria Smith | Methods and compositions for treatment and diagnosis of fibrosis, tumor invasion, angiogenesis, and metastasis |
US9107935B2 (en) | 2009-01-06 | 2015-08-18 | Gilead Biologics, Inc. | Chemotherapeutic methods and compositions |
BR112012008054A2 (pt) | 2009-08-21 | 2017-05-23 | Gilead Biologics Inc | domínios catalíticos de lisil oxidase e loxl2 |
JP6134142B2 (ja) | 2010-02-04 | 2017-05-24 | ギリアド バイオロジクス, インク.Gilead Biologics, Inc. | リシルオキシダーゼ様2(loxl2)に結合する抗体及びその使用方法 |
CN107982531A (zh) * | 2012-10-30 | 2018-05-04 | 吉利德科学公司 | 与赖氨酰氧化酶样蛋白2 (loxl2)相关的治疗和诊断方法 |
WO2015187499A1 (en) | 2014-06-03 | 2015-12-10 | Gilead Sciences, Inc. | Use of an ask1 inhibitor for the treatment of liver disease, optionally in combination with a loxl2 inhibitor |
EA201692202A1 (ru) * | 2014-06-11 | 2017-06-30 | Джилид Сайэнс, Инк. | Способы лечения сердечно-сосудистых заболеваний |
MA41252A (fr) | 2014-12-23 | 2017-10-31 | Gilead Sciences Inc | Formes solides d'un inhibiteur d'ask 1 |
CA3016081A1 (en) | 2016-03-04 | 2017-09-08 | Gilead Sciences, Inc. | Compositions and combinations of autotaxin inhibitors |
AU2017248354A1 (en) | 2016-04-08 | 2018-10-04 | Gilead Sciences, Inc. | Compositions and methods for treating cancer, inflammatory diseases and autoimmune diseases |
GB201704206D0 (en) * | 2017-03-16 | 2017-05-03 | Nordic Bioscience As | Lysyl oxidase like-2 assay |
US20230152330A1 (en) * | 2021-11-17 | 2023-05-18 | AmMax Bio, Inc. | Detection and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6352862B1 (en) * | 1989-02-17 | 2002-03-05 | Unilever Patent Holdings B.V. | Analytical test device for imuno assays and methods of using same |
FI92882C (fi) * | 1992-12-29 | 1995-01-10 | Medix Biochemica Ab Oy | Kertakäyttöinen testiliuska ja menetelmä sen valmistamiseksi |
US20030114410A1 (en) * | 2000-08-08 | 2003-06-19 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Pharmaceutical compositions and methods useful for modulating angiogenesis and inhibiting metastasis and tumor fibrosis |
CA2693208A1 (en) * | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Victoria Smith | Methods and compositions for treatment and diagnosis of fibrosis, tumor invasion, angiogenesis, and metastasis |
JP2010038735A (ja) * | 2008-08-05 | 2010-02-18 | Terumo Corp | 腹膜機能の評価方法および腹膜機能評価用イムノクロマト試験紙 |
CA2771786A1 (en) * | 2009-08-21 | 2011-02-24 | Gilead Biologics, Inc. | In vivo screening assays |
JP6134142B2 (ja) * | 2010-02-04 | 2017-05-24 | ギリアド バイオロジクス, インク.Gilead Biologics, Inc. | リシルオキシダーゼ様2(loxl2)に結合する抗体及びその使用方法 |
US9556882B2 (en) * | 2011-05-10 | 2017-01-31 | Borgwarner Inc. | Turbocharger with variable turbine geometry |
-
2012
- 2012-06-01 EP EP12725601.4A patent/EP2714744A1/en not_active Withdrawn
- 2012-06-01 AP AP2013007285A patent/AP2013007285A0/xx unknown
- 2012-06-01 UY UY0001034115A patent/UY34115A/es not_active Application Discontinuation
- 2012-06-01 EA EA201391627A patent/EA201391627A1/ru unknown
- 2012-06-01 PE PE2013002739A patent/PE20141450A1/es not_active Application Discontinuation
- 2012-06-01 US US14/122,984 patent/US20140206017A1/en not_active Abandoned
- 2012-06-01 WO PCT/US2012/040585 patent/WO2012167181A1/en active Application Filing
- 2012-06-01 MX MX2013013905A patent/MX2013013905A/es not_active Application Discontinuation
- 2012-06-01 US US13/487,109 patent/US20120309020A1/en not_active Abandoned
- 2012-06-01 KR KR1020137034711A patent/KR20140048156A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-06-01 AR ARP120101959A patent/AR086657A1/es unknown
- 2012-06-01 MD MDA20130098A patent/MD20130098A2/ro not_active Application Discontinuation
- 2012-06-01 BR BR112013030682A patent/BR112013030682A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-06-01 TW TW101119847A patent/TW201319572A/zh unknown
- 2012-06-01 AU AU2012261883A patent/AU2012261883A1/en not_active Abandoned
- 2012-06-01 CN CN201280037235.7A patent/CN103946241A/zh active Pending
- 2012-06-01 JP JP2014513770A patent/JP2014523521A/ja not_active Withdrawn
- 2012-06-01 CA CA2837534A patent/CA2837534A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-11-25 ZA ZA2013/08812A patent/ZA201308812B/en unknown
- 2013-11-26 IL IL229631A patent/IL229631A0/en unknown
- 2013-11-29 CL CL2013003445A patent/CL2013003445A1/es unknown
- 2013-12-13 CR CR20130657A patent/CR20130657A/es unknown
- 2013-12-19 EC ECSP13013092 patent/ECSP13013092A/es unknown
- 2013-12-27 CO CO13301122A patent/CO6940375A2/es unknown
- 2013-12-30 MA MA36627A patent/MA35212B1/fr unknown
-
2016
- 2016-06-09 JP JP2016115175A patent/JP2016164578A/ja active Pending
- 2016-10-12 AU AU2016244254A patent/AU2016244254B2/en not_active Ceased
- 2016-12-01 US US15/366,986 patent/US20170269085A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-11-16 JP JP2017221000A patent/JP2018049033A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20120309020A1 (en) | 2012-12-06 |
ECSP13013092A (es) | 2014-08-29 |
EP2714744A1 (en) | 2014-04-09 |
AP2013007285A0 (en) | 2013-11-30 |
WO2012167181A1 (en) | 2012-12-06 |
CL2013003445A1 (es) | 2014-07-25 |
MD20130098A2 (ro) | 2014-06-30 |
MX2013013905A (es) | 2014-05-14 |
JP2016164578A (ja) | 2016-09-08 |
NZ618682A (en) | 2016-04-29 |
MA35212B1 (fr) | 2014-06-02 |
ZA201308812B (en) | 2014-08-27 |
AU2016244254B2 (en) | 2018-10-18 |
EA201391627A1 (ru) | 2014-08-29 |
CA2837534A1 (en) | 2012-12-06 |
AU2012261883A1 (en) | 2013-05-02 |
CO6940375A2 (es) | 2014-05-09 |
JP2018049033A (ja) | 2018-03-29 |
US20140206017A1 (en) | 2014-07-24 |
KR20140048156A (ko) | 2014-04-23 |
US20170269085A1 (en) | 2017-09-21 |
AU2016244254A1 (en) | 2016-11-03 |
IL229631A0 (en) | 2014-01-30 |
AR086657A1 (es) | 2014-01-15 |
CN103946241A (zh) | 2014-07-23 |
UY34115A (es) | 2013-01-03 |
PE20141450A1 (es) | 2014-11-06 |
BR112013030682A2 (pt) | 2016-12-06 |
CR20130657A (es) | 2014-05-16 |
JP2014523521A (ja) | 2014-09-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2016244254B2 (en) | Lysyl oxidase-like 2 assay and methods of use thereof | |
US20170327595A1 (en) | Therapeutic and diagnostic methods related to lysyl oxidase-like 2 (loxl2) | |
US8247188B2 (en) | FAS binding antibodies | |
JP7191813B2 (ja) | 急性心不全に罹患している対象におけるうっ血を評価するためのアドレノメデュリン | |
Singer et al. | SULF2, a heparan sulfate endosulfatase, is present in the blood of healthy individuals and increases in cirrhosis | |
JP2023516615A (ja) | ショックを患っている患者におけるnt-adm抗体治療法ガイダンス、モニタリング、及び層別化のためのdpp3 | |
CN110678757A (zh) | 诊断或监测肾功能或诊断肾功能障碍的方法 | |
US20230258658A1 (en) | Assay for Assessing Heart Failure | |
NZ618682B2 (en) | Lysyl oxidase-like 2 assay and methods of use thereof | |
JP2023517717A (ja) | コロナウイルスに感染した患者におけるプロアドレノメデュリンまたはそのフラグメント、およびアドレノメデュリンに対する結合剤による治療 | |
JP2023518731A (ja) | コロナウイルスに感染した患者におけるdpp3 | |
Fabrellas i Padrès et al. | Prevalence of hepatic steatosis as assessed by controlled attenuation parameter (CAP) in subjects with metabolic risk factors in primary care. A population-based study. |