TW201138974A - Process for trypsin and chymotrypsin purification utilizing hydrophobic interaction chromatography - Google Patents

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201138974 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於層析介質用於分離及純化蛋白質之用途。 更特定而言，本發明揭示疏水性層析介質用於分離及純化 密切相關之蛋白水解酶胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶之用途。 本發明中所提供之製造方法意欲使用疏水性層析法（通常 稱為HIC ’疏水性作用層析法（Hydrophobic Interaction Chromatography))用於分離絲胺酸蛋白酶之混合物（例如胰 蛋白酶及姨凝乳蛋白酶）與其污染物。此外，該方法亦提 供胰蛋白酶及膜凝乳蛋白酶之病毒清除（去除）。 【先前技術】 在胰臟中發現的重要消化蛋白酶有三種，即，膜蛋白 酶、胰凝乳蛋白酶及胃蛋白酶。胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶 係絲胺酸蛋白酶家族之成員。在消化過程中，胰蛋白酶與 其他蛋白酶-起作用以將膳食蛋白質分子分解成其組份狀 及胺基酸。胰蛋白酶使在胃中開始的消化過程在小腸中繼 續，小腸中之微驗性環境（約邱8)促使其最大酶活性。由 姨臟以非活性形式產生之騰蛋白酶在化學組成及結構上明 顯與另-種主要騰臟蛋白酶姨凝乳蛋白酶相似。兩種酶似 乎具有相似的作用機制；在二者之活性位點中均發現组胺 酸與絲胺酸之殘基。胰蛋白酶與騰凝乳蛋㈣分子之間之 主要差異似乎係其特異性，，每一者僅對具 基酸所提供羧基之蛋白質分子 某二胺 ^ 買刀子中之狀鍵的C-末端有活性。 對於胰蛋白酶而言，該等胺基酸係精胺酸及離胺酸，當任 154260.doc 201138974 一者之後跟著脯胺酸時除外；對於識別芳香族殘基之胰凝 乳蛋白酶而言，該等胺基酸係酪胺酸、苯丙胺酸、色胺 酸、甲硫胺酸及白胺酸，而胰蛋白酶識別離胺酸及精胺 • 酸。特定側鏈之識別完全由結合袋之結構及性質決定。 就將攻擊之化學鍵之限定數目而言，胰蛋白酶係所有蛋 白水解酶中最具鑑別力者。研究蛋白質之胺基酸序列測定 之化學家已對此事實進行了良好利用。胰蛋白酶已廣泛用 作有序及明確裂解該等分子之試劑。該過程通常稱為蛋白 質水解或胰蛋白酶化且據說經胰蛋白酶消化/處理之蛋白 質已經胰蛋白酶化。 胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶二者均自各種動物之胰臟及胰 液（包括牛及豬的胰臟及胰液）提取。其通常使用多個沈 澱、分級分離及過濾步驟來分離。由於胰蛋白酶與胰凝乳 蛋白酶結構間之相似性及相似的物理化學性質，因此胰蛋 白酶之商業源幾乎總是含有大量胰凝乳蛋白酶，且反之亦 然。胰蛋白酶之純化可藉由多種方法執行，其包括（但不 限於）硫酸銨沈澱、離子交換層析法及親和層析法。視純 化方法而定’經純化胰蛋白酶含有不同量的胰凝乳蛋白 . 31。因此’業内需要用於產生具有可忽略量、最低量或不 • 可檢測量的胰凝乳蛋白酶的胰蛋白酶之方法。 而且’源自哺乳動物之胰蛋白酶可能含有對胰蛋白酶或 腺凝乳蛋白酶之最終用途有害之外來試劑（例如病毒）。因 此，業内需要用於產生沒有或基本上沒有病毒污染姨蛋白 酶或姨凝乳蛋白酶之經純化胰蛋白酶及膜凝乳蛋白酶之方 154260.doc 201138974 法0 【發明内容】 本發明係關於基於選擇性吸附劑使用疏水性作用層析介 質來分離生物活性化合物胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶之方 法。根據本發明，用於分離及純化膜蛋白酶及騰凝乳蛋白 酶之方法包含使胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶之粗製混合物與 疏水性作用層析介質接觸，其中該方法包含使該粗製混合 物穿過疏水性層析介質，藉此胰凝乳蛋白酶結合至該疏水 性層析介質，且胰蛋白酶穿過該介質而未結合至該介質， 以產生經純化胰蛋白酶，且之後自該介質洗脫出經結合胰 凝乳蛋白酶以經純化胰凝乳蛋白酶。更特別較佳者係使用 含有疏水性基及弱陰離子交換基二者之疏水性混合型介 質。疏水性作用層析法（HIC)不同於反相HPLC，此乃因後 者需要強有機溶劑來洗脫分子，而HIC通常使用水性緩衝 液操作並藉由鹽濃度調節溶質分子之結合及洗脫。疏水性 作用層析法利用層析介質之疏水性表面與蛋白質分子上之 疏水性基間之作用。此作用強烈受某些鹽之存在的影響。 某些鹽自約G.8 Μ至約1.5 Μ之高鹽漢度通常使蛋白質與疏 水性表面間之作料加^•低鹽濃度使該作用降f在本發 明中’闡述使用疏水性作用層析介質分離及純化騰蛋白酶 =腺凝乳蛋白酶之新穎方法。更㈣而言，在較佳實施例 作用有疏水性基及弱陰離子交換功能二者之疏水性 作用層析介質實施該方法。 在本發明之方法φ *中了抓用任何適宜疏水性作用。用於本 154260.doc 201138974 發明方法中之尤佳者係具有烷基、烷醯基、苯基、苯曱醯 基、笨基烧基或笨基统酿基官能基之疏水性作用層析介 質。更特是具有疏水性基（例如烧基、烷醯基、苯基、苯 曱醯基、苯基烷基或苯基烷醯基官能基）以及弱陰離子交 換功能之疏水性作用層析混合型介質較佳。在此方法中， 在約0·8 Μ至約1.5 Μ之高鹽條件下，胰凝乳蛋白酶結合至 疏水性作用層析介質，且胰蛋白酶穿過該介質而未結合至 該介質。疏水性介質可為幾種市售介質之一，例如GE Healthcare之丁基瓊脂糖凝膠（Sephar〇se)、辛基瓊脂糖凝 膠、苯基瓊脂糖凝膠，或T〇s〇h Bioscience LLC之 Toyopearl buty卜 Toyopearl pheny卜 Toyopearl hexyl 。更 特別且較佳地，該介質係疏水性作用層析混合型介質具 有烷基、烷醯基、苯基、苯曱醯基、苯烷基或苯基烷醯基 官能基連接至聚合層析介質之聚合表面或無機層析介質上 之一些聚乙亞胺配體。共價連接至聚合表面或無機材料上 之未官能化聚乙亞胺基提供弱陰離子交換位點。該聚合介 質可基於任何適宜天然或合成聚合物，例如瓊脂糖、聚甲 基丙烯酸酯及聚苯乙烯。無機介質可基於二氧化鈦、二氧 化锆或二氧化矽。烷基、烷醯基、苯基烷基或笨基烷醯基 官能基之烷基或烷醯基在烷基或烷醯基中可具有丨至8個碳 原子、較佳1至4個、更佳1至3個碳原子。該等疏水性層析 介質可自以上提及之供應商購得，且基於聚乙亞胺共價連 接至聚合物（特別是聚甲基丙烯酸酯聚合物）表面或無機介 質（特別是二氧化矽凝膠）的混合型疏水性層析介質可根據 154260.doc 201138974 美國專利申請公開案第US 20080203029號及美國專利第 4,551，245號中之揭示内容製備，該等文獻以引用的方式併 入本文。該混合型疏水性介質係購自JT Baker，產品編號 7588為基於聚甲基丙烯酸酯之材料，7182為基於二氧化矽 之材料。在本發明方法中使用疏水性作用層析介質可使純 化方法能夠在較低pH(約3)下運行，且已知此較低pH可使 病毒不活化。 【實施方式】 本發明係藉由（但不限於）圖示中所展示之圖解說明來圖 解說明。 本發明係關於基於選擇性吸附劑使用具有弱陰離子及疏 水性（反相）官能基之混合型介質來分離生物活性化合物胰 蛋白酶及膜凝乳蛋白酶之方法。 本發明之一個態樣包含用於分離及純化胰蛋白酶及胰凝 乳蛋白酶之方法，該方法包含使胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶 之粗製混合物與層析管柱中之疏水性作用層析介質、更佳 混合型疏水性作用層析介質接觸，其中該疏水性作用層析 介質較佳係具有弱陰離子交換功能及烷基、烷醯基、苯 基、苯甲醯基、苯基烷基或苯基烷醯基疏水性官能基之疏 水性作用層析混合型介質，藉此胰凝乳蛋白酶結合至層析 介質’且胰蛋白酶穿過該介質而未結合至該介質，以產生 經純化胰蛋白酶’且之後自該介質洗脫出經結合胰凝乳蛋 白酶以產生經純化胰凝乳蛋白酶。 本發明之另一態樣包含該方法，其中該經結合胰凝乳蛋 154260.doc 201138974 白酶係在低鹽條件下自層析介質中洗脫出，即，含有小於 約50至100 mM常用鹽，例如乙酸鹽或硫酸鹽等。在本發 明之較佳實施例中，粗製混合物係在約〇8 M至約15 M鹽 之咼鹽條件下穿過疏水性作用層析介質，且經結合胰凝乳 蛋白酶係在約50 mM至約1 〇〇 mM鹽之低鹽條件下自疏水性 作用層析介質洗脫出。 本發明之另一態樣包含該方法，其中混合型疏水性作用 層析介質係具有烷基、烷醯基、苯基、苯曱醯基、苯基烷 基或苯基烷醯基者，該等基連接至聚合聚甲基丙烯酸酯介 質之聚合表面或二氧化矽凝膠介質上之聚乙亞胺配體。 本發明之另一態樣包含該方法，其中該聚合表面包含聚 甲基丙烯酸酯聚合表面且該等烷基、烷醯基、笨基烷基及 苯基烷醯基在該等烷基或烷醯基中具有丨至8個碳原子。 本發明之另一態樣包含該方法，其中該等烷醯基及苯基 烷醯基在該等烷醯基中具有丨至4個、更佳丨至3個碳原子。 本發明之另一態樣包含該方法，其中該等疏水性官能基 係丙醯基。 · 本發明之另-態樣包含該方法，其中該等疏水性官能基 係丁醯基。 本發明之另-態樣包含該方法，其中該等疏水性官能基 係苯基丙醯基。 本發明之另-態樣包含該方法，其中該等疏水性官能基 係苯基丁醯基。 本發明之另-態樣包含該方法’其中該經結合胰凝乳蛋 154260.doc 201138974 白酶係用乙酸洗脫。 本發明之另—態樣包含該方法，其中該粗製混合物作為 該粗製混合物與硫酸錄之pH 3溶液與該疏水性作用層析介 質接觸。 本發明之另-態樣包含該方法，其中該流過純化之姨蛋 白酶冷凍乾燥成半結晶粉末。 本發明之另一態樣包含該方法，其中該經純化胰蛋白酶 之胰蛋白酶活性為3500 USP單位/mg或更高且胰蛋白酶/胰 凝乳蛋白酶活性比率超過5 〇。 實例 實例Ϊ將171.8 g硫酸銨溶於800 mL 5 0 mM乙酸中並用 硫酸將pH調節至3.0。將溶液用5 〇 mM乙酸稀釋至1 l，以 獲得1.3 Μ硫酸銨（PH 3.將20 g粗製胰蛋白酶（含有1775 USP單位/mg且胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶活性比率為8 2)溶 於2L 1.3 Μ硫酸敍（pH 3.0)中，獲得1〇 mg/mL溶液。將溶 液過濾並以50 mL/min (150 cm/hr)之流速加載於尺寸為 (5.0 cm ID及200 mL體積）的管柱上，該管柱裝載有聚曱基 丙烯酸酯聚合物之層析介質，該層析介質具有結合至其表 面且經疏水性丙醯基官能化之聚乙亞胺配體，其係根據美 國專利申請公開案第US20080203029號之實例19製備。然 後將管柱用600 ml (3管柱體積（column volume，CV))的1.3 Μ硫酸銨（pH 3.0)洗滌，且然後利用步驟梯度（4 CV)達35% 50 mM乙酸洗脫緩衝液、隨後線性梯度達100% 50 mM乙酸 (8 CV)進行洗脫。使用美國藥典方法（US Pharmacpoeia 154260.doc •10· 201138974 method) (USP Monographs，3823-3824, USP 32，第 III卷， 2009)分析各流份之胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性並展示 於圖1中，且將具有較高胰蛋白酶含量之流份合併並脫除 鹽分，並冷束乾燥，獲得純淨形式的胰蛋白酶。象乾彙集 物含有3500 USP單位的胰蛋白酶/mg且胰蛋白酶/胰凝乳蛋 白酶活性比率為86。A280係在280奈米下之總吸光度。 實例2 將28.1 g粗製胰蛋白酶（含有2795 USP單位/mg 且胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶活性比率為8)溶於562 0.25%(w/w)硫酸中並利用濃氫氧化銨將pH調節至3。將562 mL存於100 mM乙酸中之2.彡Μ硫酸敍添加至溶液中，以使 得在pH 3下胰蛋白酶濃度為25 mg/ml，其中硫酸録為1 25 Μ。將約10克矽藻土添加於溶液中並藉助0.45微米過據器 過濾溶液。然後將所得澄清溶液以50 mL/min (150 cm/hr) 之流速加載於管柱（5 cm直徑，200 mL)上，其含有實例1 中所採用類型之混合型介質。加載之後，將管柱用3 CV 1.25 Μ硫酸銨（pH 3)洗滌，並用4 CV 50 mM乙酸洗脫。·使 用美國藥典方法（USP Monographs，3823-3824, USP 32，第 III卷，2009)分析流份之胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性並 展示於圖2中^ A280係於280奈米下之總吸光度。將具有較 高胰蛋白酶含量之流份合併並脫除鹽分，並冷凍乾燥，以 提供胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶活性比率為48之經純化形式 之胰蛋白酶。 實例3 將22·4 g粗製胰蛋白酶（含有3022 USP單位/mg 胰蛋白酶）溶於56〇 mL 0.25%(w/w)硫酸中並利用濃氣氡化 154260.doc 201138974 錄將pH調節至3。560 mL存於100 mM乙酸中之2.6 Μ硫酸 敍添加至溶液中，以使得在ρΗ 3下胰蛋白酶濃度為2〇 mg/ml ’其中硫酸銨為1.3 Μ。將約1 〇克石夕藻土添加於溶液 中並藉助0·45微米過濾、器過遽溶液。然後將胰蛋白酶與胰 凝乳蛋白酶活性比率為約6的所得澄清溶液以50 mL/min (150 cm/hr)之流速加載於管柱（5 cm直徑，200 mL)上，該 管柱填充有實例1中所採用之介質。加載之後，將管柱用3 CV 1.25 Μ硫酸敍（pH 3)洗膝’並用4 CV 50 mM乙酸洗 脫。使用美國樂典方法（USP Monographs，3823-3824，USP 32 ’第III卷，2009)分析流份之胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶 活性並展示於圖3中。A280係於280奈米下之總吸光度。將 具有較高騰蛋白酶含量之流份合併並脫除鹽分，並冷;東乾 燥’以獲得活性高於3500 USP單位/mg之盛純化形式之胰 蛋白酶。對於含有3500 UPS單位/ml之經純化騰蛋白酶活 性之收集彙集物而言，騰蛋白酶/騰凝乳蛋白酶活性從j j 增加至69。 實例4 將1.68 g粗製胰蛋白酶（含有3022 USP單位騰蛋 白酶/mg)溶於42 mL 0.250/〇(w/w)硫酸中並利用濃氫氧化敍 將pH調節至3。將42 mL存於100 mM乙酸中之2.6 Μ硫酸銨 添加至溶液中，以使得在pH 3下膝蛋白酶濃度為2〇 mg/ml ’其中硫酸鍵為1.3 Μ。將約2克石夕藻土添加至溶液 中並藉助0.45微米過濾器過濾溶液。然後將所得澄清溶液 以1.8 mL/min(140 cm/hr)之流速加載於管柱〇 cm直徑， 7·8 mL)上。該管柱含有包含聚甲基丙烯酸酯聚合物之混 154260.doc •12· 201138974 合型介質，該聚合物具有結合至其表面並經疏水性丁醯基 官能化之聚乙亞胺配體，其係根據美國專利申請公開案第 US20080203029號之實例19中所闡述之方法用戊酸酐代替 丁酸酐反應物來製備《加載之後，管柱用3 CV 1.25 Μ硫 酸銨（pH 3)洗滌並用4 CV 50 mM乙酸洗脫。使用美國藥典 方法（USP Monographs，3823-3824，USP 32，第 III 卷， 2009)分析流份之胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性並展示於 圖4中。A280係於280奈米下之總吸光度。將具有較高胰蛋 白酶含量之流份合併並脫除鹽分，並冷凍乾燥，以獲得經 純化形式之胰蛋白酶。對於含有超過3500 USP胰蛋白酶單 位/mL之經純化形式胰蛋白酶的流份而言，胰蛋白酶/胰凝 乳蛋白酶活性比率自2.4增加至82。 實例5將丨.68 g粗製胰蛋白酶（含有3022 USP單位胰蛋 白酶/mg)溶於42 mL 0.25%(w/w)硫酸中，並利用濃氫氧化 銨將pH調節至3。將42 mU?H〇〇 mM乙酸_之2 6 M硫酸銨 (其已用硫酸調節至pH 3)添加至溶液中，以使得在pH 3胰 蛋白酶濃度20 mg/ml，硫酸銨^ Μβ將約2克矽藻土添加 至溶液中，溶液經0.45微米過滤器過渡。然後所得澄清溶 液以1.8 mL/min (140 cm/hr)之流速加載於管柱⑽直 徑’ 7.8 mL)上。該管柱含有混合型介質，包含聚甲基丙 烯酸酯聚合物具有結合至其表面並經疏水性苯醯基官能化 之聚乙亞胺配體，其係根據美國專利申請公開案第 US 20_2_29號之實例19中所闡述之方法用苯曱酸肝代 替丁酸酐反應物製備。加載後，管柱用3 CVU.25M硫酸 154260.doc 201138974 銨（pH 3)洗，並用4 CV之50 mM乙酸洗脫。使用美國藥典 方法（USP Monographs, 3823-3824，USP 32，% III 4， 2009)分析流份之胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性，展示於 圖5中。A280係於280奈米之總吸光度。將具有較高胰蛋白 酶含量之流份合併並脫除鹽分，並冷凍乾燥，以獲得純化 形式之胰蛋白酶。對於含有超過3500USP胰蛋白酶單位 /mg的經純化胰蛋白酶的彙集物而言，胰蛋白酶/胰凝乳蛋 白酶活性比率自6增加至超過5 0。 實例6 將1.60 g粗製胰蛋白酶（含有3022 USP單位胰蛋 白酶/mg)溶於40 mL 0.25%(w/w)硫酸中，並利用濃氫氧化 銨將pH調節至3。將40 mL於100 mM乙酸中之2.6 Μ硫酸銨 添加至溶液中，以使得在pH 3胰蛋白酶濃度20 mg/ml，硫 酸銨1.3 Μ。將約2克矽藻土添加於溶液中，溶液經0.45微 米過濾器過濾。然後所得澄清溶液以1.8 mL/min (140 cm/hr)之流速加載於管柱（1 cm直徑，7.8 mL)上。該管柱 含有混合型介質，包含聚曱基丙烯酸酯聚合物具有結合至 其表面並經疏水性苯基丙醯基官能化之聚乙亞胺配體，其 係根據美國專利申請公開案第US 20080203029號之實例19 中所闡述之方法用苯甲酸酐代替丁酸酐反應物製備。加載 後，管柱用3 CV之1.25 Μ硫酸銨（pH 3)洗，並用4 CV之50 mM乙酸洗脫。使用美國藥典方法（118?1^1〇11〇层^卩113，3823-3 824, USP 32，第III卷，2 009)分析流份之胰蛋白酶及胰凝 乳蛋白酶活性，展示於圖6中。A280係在280奈米之總吸光 度。將具有較高胰蛋白酶含量之流份合併並脫除鹽 154260.doc 14 201138974 分，並冷凍乾燥’以獲得純化形式之胰蛋白酶。於含有超 過3 500 USP胰蛋白酶單位/mg之經純化姨蛋白酶之彙集 物’姨蛋白酶/姨凝乳蛋白酶活性比率自5增加至超過5 〇。 實例7 將1.60 g粗製胰蛋白酶（含有3022 USP單位胰蛋 白酶/mg)溶於40 mL 0.25%(w/w)硫酸中並用濃氫氧化銨將 pH調郎至3。將40 mL存於100 mM乙酸中之2.6 Μ硫酸錄添 加至溶液中，以使得在pH 3下胰蛋白酶濃度達2〇 mg/ml， 其中硫酸錄為1 ·3 Μ。將約2克矽藻土添加於溶液中並藉助 0.45微米過濾器過濾溶液，以產生含有2〇 mg/mL粗製胰蛋 白酶/胰凝乳蛋白酶之粗製溶液。藉由使此粗製胰蛋白酶 溶液穿過1 cm直徑之管柱來純化，該管柱具有7.8 mL之管 柱體積且填充有自 Tosoh Bioscience LLC(Montgomeryville， PA)購得之疏水性介質T〇y〇peari Butyi 650S。該粗製腹蛋 白酶以約1.8 mL/min之流速穿過管柱。管柱加載完.成之 後’且在管柱用pH為3的1 ·25Μ硫酸敍洗蘇之後，使用59 mM乙酸完成洗脫。所得流過流份將含有超過35〇〇 usp胰 蛋白酶單位/mg且胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶活性比率將自5 增加至約5 0。 儘管本文已參照本發明之特定實施例對本發明進行闡 述’但應瞭解’可作出改變、修改及變化而不背離本文所 揭示本發明概念之精神及範圍。因此，意欲囊括屬於隨附 請求項之精神及範圍内之所有該等改變、修改及變化。 【圖式簡單說明】 圖1係實例1中所例示純化製程之USP單位/ml對流份數之 154260.doc -15· 201138974 圖表。 圖2係實例2中所例示純化製程之USP單位/ml對流份數之 圖表。 圖3係實例3中所例示純化製程之USP單位/ml對流份數之 圖表。 圖4係實例4中所例示純化製程之USP單位/ml對流份數之 圖表。 圖5係實例5中所例示純化製程之USP單位/ml對流份數之 圖表。 圖6係實例6中所例示純化製程之USP單位/ml對流份數之 圖表。 154260.doc -16-

Claims (1)

1. 201138974 七、申請專利範圍： l 一種分離及純化胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶之方法，其包 3使胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶之粗製混合物與疏水性作 用層析介質接觸，其中該方法包含使該粗製混合物穿過 疏水性作用層析介質，藉此胰凝乳蛋白酶結合至該疏水 性層析介質，且胰蛋白酶穿過該介質而未結合至該介 處以產生經純化之胰蛋白酶，及然後自該介質洗脫出 經結合之胰凝乳蛋白酶，以產生經純化之胰凝乳蛋白 酶。 2. 如凊求項1之方法，其中該疏水性作用層析介質含有選 自由以下組成之群之疏水性官能基：烷基、烷醯基、苯 基、苯甲醯基、苯基烷基及苯基烷醯基官能基。 3. 如凊求項2之方法，其中該等疏水性官能基選自烷醯 基、苯甲醯基及苯基烷醯基官能基，且該等官能基連接 至疏水性聚合層析介質之聚合表面或無機層析介質上之 聚乙亞胺（polyethyleneimine)配體。 4. 如請求項1之方法，其中該粗製混合物係在約〇 8 M至約 1.5 Μ鹽之高鹽條件下穿過該疏水性作用層析介質，且該 經結合之胰凝乳蛋白酶係在約50至約1〇〇 mM鹽之低鹽條 件下自該疏水性作用層析介質洗脫。 5. 如請求項2之方法其中疏水性作用層析介質係具有烷 酿基、笨甲醢基或苯基烷醯基連接至聚合之聚甲基丙烯 酸酯介質之聚合表面上之聚乙亞胺配體者。 6. 如請求項5之方法，其中該聚合表面包含聚甲基丙烯酸 154260.doc 201138974 -B聚α表面，且該等燒基、院酿基、苯基炫基及苯基烧 醯基在烷基或烷醯基中具有1至8個碳原子❶ 7. 如明求項6之方法’其中該等烷基、烷醯基、苯基院基 及苯基烷醯基在烷基或烷醯基中具有丨至3個碳原子。 8. 如凊求項7之方法，其中該等官能基係丙醯基。 9. 如凊求項7之方法，其中該等官能基係丁醯基。 10·如清求項7之方法’其中該等官能基係苯基丙醯基。 11.如明求項j之方法，#申該經結合之胰凝乳蛋白酶係利 用乙酸洗脫。 12_如請求項1之方法，其中該粗製混合物係以該粗製混合 物與硫酸狀ΡΗ 3溶液與該疏水性作用層析介質接觸。 13. 如晴求項！之方法，其令將該流過純化之姨蛋白酶冷床 乾燥成半結晶粉末。 14. 如„月求項1至13中任一項之方法，其中該經純化之胰蛋 白酶具有3500 USP單位/mg或更大之腺蛋白酶活性且 胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶活性比率大於5〇。 154260.doc