TW201121564A

TW201121564A - Fully human antibodies to BTLA

Info

Publication number: TW201121564A
Application number: TW099124759A
Authority: TW
Inventors: Jennifer Marie Mataraza; Elsas Andrea Van; Alan J Korman; Edward L Halk; Kent B Thudium; Mark Selby; Timothy W Sproul; Heidi N Leblanc
Original assignee: Organon Nv; Medarex Inc
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2011-07-01
Also published as: US20190119381A1; EP3199551A2; ZA201200732B; IN2012DN00863A; US10155813B2; AR077594A1; WO2011014438A1; AU2010276580A1; SG177689A1; CN102762593A; US20120183565A1; EP2459594A1; US20140017255A1; KR20120090037A; US20160222114A1; CN102762593B; BR112012007875A2; EA201270228A1; US9346882B2; CO6612216A2

Description

201121564 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明大體而言係關於結合於BTLA之抗體或抗原結合片段及其用途。更特定言之，本發明係關於識別人類 BTLA且調節其活性，特定言之在發炎性、自體免疫性及增生性病症中之活性的完全人類抗體。本申4案主張2009年7月3 1曰申請之美國臨時專利申請案第61/230,332號及2009年11月3日申請之美國臨時專利申請案第61/257,612號之權益，各申請案皆以全文引用的方式併入本文中。【先前技術】免疫系統起保護個體免遭感染物（例如細菌、多細胞生物體及病毒）以及癌症侵襲的作用。此系統包括若干類型之淋巴及骨髓細胞，諸如單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（DC)、嗜伊紅血球、τ細胞、B細胞及嗜中性白企球。此等淋巴及骨髓細胞常產生稱為細胞激素的信號傳導蛋白質。免疫反應包括發炎，亦即全身性或在身體特定部位累積免疫細胞。作為對感染物或外來物質之反應，免疫細胞分泌細胞激素，其又會調節免疫細胞增殖、發育、分化或遷移。免疫反應例如當涉及過度發炎時可能會產生病理學後果，如在自體免疫性病症中所見（參見，例如Abbas等人 (編)（2000) Ce//w/ar <37^ Mo/ecw/ar /wmw«c>/〇^y，W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppenheim 及 Feldmann (編）（2001)

Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA ； von 149758.doc 201121564

Andrian 及 Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034 ; Davidson 及 Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350) ° 正性及負性協同刺激信號在調節B細胞及T細胞活性中起關鍵作用，且已證實介導此等信號之分子為免疫調節劑之有效目標。除需要接合T細胞受體（TCR)之外，亦需要正性協同刺激來最佳活化初級T細胞（naive T cell)，而咸信需要負性協同刺激來使自身獲得免疫耐受性以及終止效應 T細胞功能。在與抗原呈現細胞（APC)表面上之B7.1或B7.2 相互作用之後，原型T細胞協同刺激分子CD28回應於TCR 接合發出促進T細胞增殖及分化之信號，而CD28同源細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)介導對T細胞增殖及效應功能的抑制（Chambers等人，Ann. Rev. Immunol·，19:565-594, 2001 ; Egen等人，Nature Immunol，3:611-618，2002)。已發現若干與B7家族同源之新穎分子（Abbas等人，Nat. Med.， 5:1345-6, 1999 ; Coyle 等人，Nat. Immunol., 2: 203-9, 2001 ; Carreno 等人，Annu. Rev. Immunol., 20: 29-53, 2002 ； Liang 等人，Curr. Opin. Immunol., 14: 384-90, 2002)，且其在T細胞活化中之作用正開始闡明。

此等新穎協同刺激配位體包括B7h、PD-L1、PD-L2及 B7-H3。B7h(Swallow等人，Immunity, 11: 423-32，1999)，亦稱為 B7RP-l(Yoshinaga 等人，Nature, 402: 827-32, 1999)、GL50(Ling等人，J. Immunol” 164:1653-7，2000)、 B7H2(Wang 等人，Blood, 96: 2808-13，2000)及 LICOS I49758.doc -4- 201121564 (Brodie等人，Curr. Biol.，10: 333-6, 2000)，結合於已活化 T細胞上之可誘導協同刺激因子（IC〇s)且協同刺激T細胞增殖及細胞激素（諸如介白素4(IL-4)及IL-10)的產生。 PD-Ll(Freeman 等人，J. Exp. Med., 192: 1027-34, 2000) ，亦稱為B7-Hl(Dong等人，Nat· Med., 5，1365-9, 1999) ’ 及 PD-L2(Latchman 等人，Nat_ Immunol., 2:261-8, 2001) ，亦稱為 B7-DC(Tseng 等人，J. Exp. Med·，193, 839-46，2001) ’結合於T細胞及B細胞上之漸進式死亡l (programmed death 1，PD-1)受體〇最終’ B7-H3結合已活化T細胞上當前尚未知之反受體 (counter-receptor)，且據報導增強CD4+輔助T(Th)細胞及 CD8+細胞毒性T淋巴細胞（CTL·或Tc)之增殖且選擇性增強 IFN-γ 表現（Chapoval 等人，Nat. Immunol，2, 269-74, 2001 ; Sun等人 ’ J. Immunol·，168, 6294-7，2002)。由於其它具有T細胞協同刺激活性之分子的基礎生物學重要性及能夠影響其活性之藥劑的治療潛力，對該等分子之鑑別受到強烈關注。能夠調節協同刺激信號且由此能夠調節CD8+ CTL及CD4+ Th細胞之活化及/或效應功能的藥劑可用於調節免疫反應且高度合乎需要。特定言之’已知許多自體免疫性病症涉及自體反應性T 細胞及自體抗體。能夠在不損害免疫系統抵禦病原體之能力下抑制或消除自體反應性淋巴細胞的藥劑高度合乎需要。相反’許多癌症免疫療法（諸如授受免疫療法）擴增腫瘤 149758.doc 201121564 特異性τ細胞群且指引其攻擊及殺滅腫瘤細胞（Dudiey等人 ’ Science 298:850-854, 2002 ; Pardoll，Nature Biotech·, 20: 1207-1208, 2002 ； Egen^ A > Nature Immunol., 3:611-618, 2002^能夠增強腫瘤攻擊之藥劑亦高度合乎需要。此外，儘官針對不同抗原（例如微生物抗原或腫瘤抗原）之免疫反應可偵測，但經常量級不足以防止由表現彼等抗原之病原體（例如感染性微生物或腫瘤細胞）介導的疾病過程。常需要連同抗原一起投與個體用以增強個體中對抗原之免疫反應的佐劑。在某些情況下亦需要抑制對抗原之正常免疫反應。舉例而言，需要遏制接受移植物之患者中的正常免疫反應，且展現此免疫抑制活性之藥劑高度合乎需要。協同刺激信號，特定言之正性協同刺激信號，亦在調節 B細胞活性中發揮作用。舉例而言，除由抗原刺激之外， B細胞活化及生發中心（gerniinai center)B細胞之存活亦需要T細胞來源之信號。存在於辅助T細胞表面上之CD40配位體與B細胞表面上之CD40相互作用，且介導b細胞中許多此等τ細胞依賴性效應。蛋白質BTLA(B及T淋巴細胞衰減因子（B and T lymphocyte attenuator))為亦包括 CD28、CTLA-4、ICOS及 PD-1之受體CD28家族的成員❶該家族之最初成員CD28及 ICOS由於在添加單株抗體之後具有增強τ細胞增殖之功能效應而被發現（Hutloff 等人（1999) Nature 397:263-266; 149758.doc -6- 201121564

Hansen等人，（1 980) Immunogenics 1 0:247-260)。BTLA藉由篩檢TH1細胞中之差異表現而發現。此外，BTLA已描述為提供負性抑制信號，此與CTLA-4類似。在促效劑抗 BTLA Mab、抗CD3及抗CD28存在下，已活化T細胞顯示 IL-2產生及增殖降低（Kreig等人，J· Immunol., 175, 6420-6472，2005)。缺乏完整BTLA基因之小鼠顯示在經DNP-KLH免疫後對其具有較高效價且顯示對EAE之敏感性增加 (Watanabe 等人，Nat. Immunol, 4，670-679，2003)。 HVEM(疱疹病毒進入介體）已證明為BTLA之配位體（Scully 等人（2005) Nat. Immunol. 6:90-98 ; Gonzalez 等人（2005) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 102: 1116-1121)。因此，需要識別BTLA之藥劑，特定言之識別BTLA之抗體及其結合劑，及使用此等藥劑之方法。抗體可用作治療劑。某些抗體用作活體内治療劑時可能產生不欲之抗體免疫原性。因為大多數單株抗體來源於齧齒動物，所以在人類中重複使用導致產生對抗治療抗體之免疫反應（例如人類抗小鼠抗體或HAMA)。此種免疫反應最小導致治療功效損失，最大導致潛在致命過敏反應。一種降低齧齒動物抗體免疫原性之方法涉及產生嵌合抗體，其中小鼠可變區（Fv)與人類恆定區融合（Liu等人（1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43)。然而，用人類可變區與小鼠恆定區之雜交物注射之小鼠產生針對人類可變區的強烈抗抗體反應，表明在此等嵌合抗體中保留完整齧齒動物F v區仍可在患者中導致不當免疫原性。 149758.doc 201121564 另外’已使用齧齒動物可變域之互補決定區（CDR)環移植於人類構架上（亦即人類化）來進一步最小化齧齒動物序列。Jones 等人（1986) ㈣ 321:522 ; Verh〇eyen 等人 (1988)5^6/^^ 239:1530然而，CDR環交換仍然不能均一地產生與來源抗體相同結合性質的抗體。通常亦需要改變人類化抗體中之構架殘基（FR)，涉及（：]〇11環支撐之殘基，來保留抗原結合親和力。Kabat等人（1991) X Jmmwwo/. 147:1709。儘管已報導在許多人類化抗體構築體中使用 CDR移植及構架殘基保留，但是難以預測特定序列是否將產生具有所要結合性質及有時生物性質的抗體。參見例如

Queen 等人（1989) w"· zca£/. C/M 86: 10029 ;

Gorman等人（1991) Pr〇c· iVa". Jcai Sci. tASJ 88: 4181 ; 及 Hodgson (1991) 幻；9:421-5。此外，大多數先前研究使用不同人類序列作為動物輕鏈可變序列及重鏈可變序列，致使此等研究之預測性可疑。已使用已知抗體之序列，或更通常具有已知χ射線晶體結構之抗體（諸如抗體NEW及K0L)的序列。參見例如J〇nes等人，同上文；Verhoeyen等人，同上文；及Gorman等人，同上文。已報導幾個人類化構築體之確切序列資訊。對於治療人類病症（諸如發炎、自體免疫及增生性病症）之抗BTLA抗體，特別是抗BTLA單株抗體存在需要。此等抗體較佳在人類個體中顯示低免疫原性，允許重複投藥而無不良免疫反應。【發明内容】 149758.doc 201121564 本發明係關於在人類個體中具有一或多種合乎需要之性質，包括高結合親和力、中和活性、良好藥物動力學及低抗原性的抗人類BTLA抗體。本發明亦係關於本發明抗體在治療疾病中之用途。在某些實施例中，本發明係關於結合於人類B及T淋巴細胞衰減因子（BTLA)之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含一或多種選自由以下組成之群的性質：a)不阻斷 BTLA與疱疹病毒進入介體（HVEM)之結合；b)與獼猴 BTLA交叉反應；c)顯示結合於人類BTLA之KD至多為約 2.4χ1(Γ9 ;及d)在量測B或T細胞活化之活體外檢定中顯示 EC50為約 10-100 nM。在其它實施例中，本發明係關於結合於人類BTLA之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含一或多種選自由以下組成之群的性質：a)阻斷BTLA與HVEM之結合；b)與獼猴 BTLA交叉反應；及c)顯示結合於人類BTLA之KD至多為約 4.6χ1〇-9。在其它實施例中，本發明係關於結合BTLA之經分離促效劑抗體或其抗原結合片段，其選自由hu Mab8D5及hu Mab8A3組成之群，其中該抗體特異性結合BTLA且不阻斷與HVEM之結合。在其它實施例中，本發明係關於結合BTLA之經分離促效劑抗體或其抗原結合片段，其選自由hu Mab21H6 hu及 Mabl9A7組成之群，其中該抗體特異性結合BTLA且亦阻斷與HVEM之結合。 149758.doc 201121564 在其它實施例中，本發明係關於結合BTLA之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含至少一個選自由SEQ ID No.:12、· 13及14組成之群的VL CDR域及至少一個選自由 SEQ ID No_:5、6及7組成之群的VH CDR域。在其它實施例中，本發明係關於結合BTLA之經分離拮抗劑抗體或其抗原結合片段，其包含至少一個選自由SEQ ID No_:26、27、28組成之群的VL CDR域及至少一個選自由SEQ ID No.:19、20及21組成之群的VH CDR域。在其它實施例中，本發明係關於經分離抗體或其抗原結合片段’其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中：（a)該重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO:ll(8D5重鏈）；及（b) 該輕鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO:18(8D5輕鏈）。在其它實施例中，本發明係關於經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：（a)包含胺基酸序列ID NO:5(8D5 HCDR1) 之重鏈可變區CDR1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO:6 (8D5 HCDR2)之重鏈可變區CDR2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO:7(8D5 HCDR3)之重鏈可變區CDR3 ; (d)包含胺基酸序列SEQ ID NO:12(8D5 LCDR1)之輕鏈可變區 CDR1 ; (e)包含胺基酸序列 SEQ ID NO:13(8D5 LCDR2)之輕鏈可變區CDR2 ;及（f)包含胺基酸序列SEQ ID NO:14 (8D5 LCDR3)之輕鏈可變區CDR3 ;其中該抗體特異性結合 BTLA且不阻斷與HVEM之結合。在其它實施例中，本發明係關於經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：（a)為人類VH基因（SEQ ID NO:8)[編碼 149758.doc •10- 201121564 8D5]之產物或來源於人類VH基因的重鏈可變區；及（b)為人類Vk基因（SEQ ID NO:15)[編碼8D5]之產物或來源於人類Vk基因的輕鏈可變區；其中該抗體特異性結合BTL A。在其它實施例中’本發明係關於經分離抗體或其抗原結合片段’其中5亥抗體與參考抗體交叉競爭結合於BtlA，該參考抗體包含：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:ll(8D5重鏈）之重鏈可變區；（b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18(8D5輕鍵）之輕鏈可變區；其中該經分離單株抗體或其抗原片段為BTXA促效劑。在某些實施例中’重鏈與輕鏈由可撓性連接子連接以形成單鏈抗體。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段為單鏈!^抗體。在某些實施例中’抗體或抗原結合片段為抗體。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段為Fab，抗體。在某些實施例中’抗體或抗原結合片段為（Fab，）2抗體。在某些實施例中’抗體或抗原結合片段為完全人類單株或重組抗體。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段降低BTLA活性及/或信號傳導。在某些實施例中’抗體或抗原結合片段增強BTLA活性及/或信號傳導。在其它實施例中，本發明係關於經分離多肽，其包含任何本文所述抗體或抗原結合片段之VL域或vH域。在其它實施例中，本發明係關於經分離核酸，其編碼任 149758.doc 201121564 何本文所述抗體或抗原結合片段之vL域或vH域。在其它實施例中’本發明係關於包含一或多種如本文所述之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之载劑或稀釋劑的組合物。在其它實施例中，本發明係關於治療個體中由BTLa之表現及/或活性降低引起之病狀的方法，其包含投與該個體有效量之如本文所述之醫藥組合物。特定言之，特徵為 T細胞或B細胞之存在或活性之任何疾病或病症皆可由 BTLA促效劑抗體治療（亦即涉及存在BTLA陽性免疫細胞之疾病或病症可藉由活化BTLA受體功能來管理或治療）。在某些實施例中，一或多種抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群.hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、 hu Mabl9A7*hu Mab4C7。在其它實施例中’本發明係關於治療個體中發炎性或自體免疫性病症之方法，其包含投與該個體有效量之如本文所述之抗體或抗原結合片段。在某些實施例中，發炎性或自體免疫性病症係選自由以下組成之群·.發炎性腸道病症 (例如克隆氏病（Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎及發炎性腸病）、發炎性纖維化（例如硬皮病、肺纖維化及肝硬化症）、類風濕性關節炎（RA)、骨關節炎、骨質疏鬆症、哮 °而（包括過敏性哮喘）、過敏症、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、夕發性硬化症、牛皮癣、葡萄膜炎、移植物抗宿主疾病 (GVHD)、青少年早發性I型糖尿病（juvenile early-onset >"Pe I diabetes)、移植排斥、SLE及修格連氏症候群 149758.doc -12- 201121564 (Sj0gren,s synd_e)。此等治療方法可進-步包含投盘一或多種其它治療劑，諸如免疫抑制劑或消炎劑。在其：實施例中’病症為類風濕性關節炎。，在其它實施例中，發炎性腸道病症係選自由克隆氏病、潰瘍性結腸炎及發炎性腸病組成之群。在其它實施例中’本發明係關於治療移植排斥及/或移植物抗宿主疾病之方法。在其它實施例中，本發明係關於治療1型糖尿病之方法。在其它實施例中’本發明係關於如本文所述之抗體或抗原結合片段用於製備用於治療個體之發炎性或自體免疫性病症之藥劑的用途。在其它實施例中，本發明係關於如本文所述之抗體或抗原結合片段用於製備用於降低BTLA活性之藥劑的用途。在其它貫施例中，本發明係關於增強個體之免疫反應之方法’其包含投與該個體有效量之醫藥組合物。在某些實施例中’ 一或多種抗體或其抗原結合片段為hu Mab4C7。在其它實施例中，本發明係關於如本文所述之拮抗劑抗體用於製備用於增強BTLA活性之藥劑的用途。在其它實施例中’本發明係關於任何本文所述之抗體或抗體片段用於診斷用途的用途。在其它實施例中，本發明係關於包含任何本文所述抗體或抗原結合片段之套組。在其它實施例中，本發明係關於包含BTLA及任一本文 149758.doc •13· 201121564 所述之抗體或抗原結合片段的複合物。在其它實施例中，本發明係關於包含編碼多肽之經分離核酸的表現載體，該多肽編碼任何本文所述之vH或vL鏈。在其它實施例中’本發明係關於包含本文所述之表現載體的宿主細胞。在其它實施例中，本發明係關於產生如本文所述之抗體或其抗原結合片段之方法，其包含： (a) 在核酸序列可表現之條件下在培養基中培養本文所述之宿主細胞，由此產生包含輕鏈及重鏈可變區之多肽；及 (b) 自宿主細胞或培養基回收多肽。在其它實施例中’本發明係關於經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體與包含以下之參考抗體交又競爭結合於BTLA : (a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:23(4C7重鏈）之重鏈可變區； (b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:30(4C7輕鏈）之輕鏈可變區，其中該經分離單株抗體或其抗原片段為BTLA拮抗劑。在其它實施例中，本發明係關於編碼包含存在於輕鏈可變區中之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之免疫球蛋白多肽的經分離核酸，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 1 8中所述之胺基酸序列。在其它實施例中，本發明係關於包含存在於輕鏈可變區中之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之經分離免疫球蛋白多 149758.doc •14- 201121564 肽，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 1 8中所述之胺基酸序列。在其它實施例中，本發明係關於編碼包含存在於重鏈可變區中之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之免疫球蛋白多肽的經分離核酸，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 11中所述之胺基酸序列。在其它實施例中，本發明係關於包含存在於重鏈可變區中之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之經分離免疫球蛋白多肽，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 11中所述之胺基酸序列。在其它實施例中，本發明係關於編碼包含存在於輕鏈可變區中之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之免疫球蛋白多肽的經分離核酸，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:3 2中所述之胺基酸序列。在其它實施例中，本發明係關於包含存在於輕鏈可變區中之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之經分離免疫球蛋白多肽，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:32中所述之胺基酸序列。在其它實施例中，本發明係關於編碼包含存在於重鏈可變區中之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之免疫球蛋白多肽的經分離核酸，該重鏈可變區包含SEQ ID NO:25中所述之胺基酸序列。在其它實施例中，本發明係關於包含存在於重鏈可變區中之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之經分離免疫球蛋白多 149758.doc 15 201121564 肽，該重鏈可變區包含SEQ ID NO:25中所述之胺基酸序列。在某些實施例中，此等核酸構築體及/或多肽適用於製備抗體之方法中。【實施方式】哺乳動物免疫系統已發展出若干控制T及B淋巴細胞之潛在有害活性之路徑。其包括多種涉及如CD28、CTLA-4、PD-1及BTLA之受體的細胞激素-受體路徑以及協同刺激路徑。儘管CD28-B7相互作用為正性協同刺激路徑（亦即 CD28觸發增強針對抗原特異性觸發物之T細胞反應）之實例，但是其它三種受體為抑制性協同刺激路徑之代表。 CTLA-4、PD-1及BTLA顯示重疊但截然不同之表現概況，且以非冗餘（non-redundant)方式限制T及B淋巴細胞以及其它免疫細胞之活性（參見Deppong等人J Immunol 2006 ; Tao 等人，J Immunol 2005)。儘管CTLA-4與CD28競爭結合 B7.1及B7.2(CD80及CD86)且設定淋巴結及脾中初級T細胞活化之原始臨限值（primordial threshold)，但是PD-1及 BTLA各自具有其自身的獨特配位體（分別為PD-L1/-L2及 HVEM)且似乎控制周邊T細胞内穩定及再活化（參見Krieg 等人Nat Immunol 2007)。 BTLA下調B細胞及T細胞活化如B及T淋巴細胞衰減因子（BTLA)之名稱所指示，其表現於靜止及已活化之B及T淋巴細胞兩者上。BTLA為I型跨膜醣蛋白且具有含有若干抑制性酪胺酸基元之細胞質尾部 149758.doc -16- 201121564 (Watanabe，2003)。BTLA與CD28/CTLA-4家族成員具有一些結構相似性，但若干因素使其成為獨特成員。人類 BTLA含有以下特性化域：Ig細胞外域：殘基51-117;跨膜域：殘基153-173 ; ITIM域：殘基255-260 ;及ITSM域：殘基280-285(參考人類SEQ ID NO:2)。ITIM表示基於酪胺酸之免疫受體抑制基元，而ITSM表示基於酪胺酸之免疫受體開關基元。對應於8£卩10 1^0:2之殘基43-134的61^八1§中間型（第1 組型）細胞外域負責配位體結合且未在CD28/CTLA-4家族之其它成員中發現。此外，BTLA之配位體不為B7家族成員，而是為TNFR超家族受體疱疹病毒進入介體（HVEM) (Sedy，2005)。HVEM在周邊B細胞及T細胞及單核細胞上表現，且結合於BTLA之HVEM的晶體結構已獲得解析 (Compaan, 2005)。若干活體内研究證明了 BTLA在淋巴細胞反應中之抑制性作用。由Murphy及同事（聖路易斯華盛頓大學（·\νΒ8ΐιίη§1;οι1 University St. Louis))產生之BTLA缺乏小鼠顯示igG產生回應於T依賴性抗原而增加三倍。此外，自BTLA·7·小鼠分離之T細胞及B細胞對分別使用-CD3及抗IgM進行之抗原-受體刺激顯示較強增殖反應。在過度表現研究中，發現 BTLA與B細胞受體複合物及與T細胞受體相關。與此發現一致，使用Con A(T細胞）或LPS(B細胞）進行之抗原-受體非依賴性刺激在BTLA缺乏淋巴細胞中不受影響且不能使用抗BTLA抗體加以調節。 149758.doc 201121564 BTLA基因易除小鼠已顯示會隨時間發展出自發性自體免疫疾病且壽命減少（Oya, 2008)。對BTLA連接上HVEM會導致T細胞活化及增殖之下調（Sedy，2005)。BTLA基因剔除小鼠在自體免疫腦脊髓炎（EAE)及過敏性氣管發炎模型中顯示疾病嚴重性增加，該兩種模型均依賴於T細胞活性 (Watanabe，2005 ; Deppong，2006)。已顯示人類BTLA基因中之SNP與對rA之敏感性之間的關聯（Lin，2006)。然而，關於BTLA信號傳導在病理學病狀中之作用仍然知之甚〇因此’對於自體免疫及某些增生性疾病，正需要開發利用BTLA在淋巴細胞反應中之抑制性作用同時允許BTLA-HVEM結合的治療。促效劑BTLA抗體尤其十分適合此作用。在對200種以上使用Ultimab平台產生之mAb進行選擇的過程中，鑑別出了大量促效劑抗體及拮抗劑BTLA抗體。自200種以上mAb中鑑別出若干活化抑制性BTLA受體功能之抗體（亦即促效劑抗體），包括 hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6及 hu Mabl9A7。Hu Mab8D5 及 hu Mab8A3為不阻斷HVEM 配位體結合於BTLA的BTLA促效劑。：Hu Mab21H6及hu Mabl9A7活化抑制性BTLA受體功能，同時亦阻斷HVEM配位體結合於BTLA。此等促效劑抗體顯示對BTLA之結合親和力為約12-14 nM，且亦以約30-100 nM之EC5〇抑制人類供體血液中之T細胞及B細胞反應。當以IgG4以及單價Fab，片段形式再表現時，hu Mab8D5保持其活體外免疫抑制活 149758.doc -18- 201121564 性。此等促效劑BTLA抗體亦以類似只似規和力結合於獼猴 TLA且顯示對獼猴T細胞反應之等效抑制。然而，此等促效劑抗體不與小鼠BTLA交叉反應。在小鼠藥理學研究中，hu Mab8D5顯示約16天之半衰期與對人類㈣之期望-致。此等受體促效性mAb抑制且遏制活體外τη淋巴細胞活性，且亦在活體内模型系統中顯示此活性。本發明促效劑抗體之獨特之處在具有在不耗盡_胞下抑制同源抗原所致之_胞活化的能力。另外，本發明促效劑抗體之獨特之處亦在於能夠同時靶向B細胞及τ細胞活化。除上述四種促效劑抗BTLA抗體外，選擇亦鑑別出了拮抗劑抗體hu Mab4C7。此抗體顯示如圖叱。及圖8A B中所示之免疫刺激作用且因此預期其適用作癌症治療劑、或用於&療某些病原性感染、及作為疫苗佐劑。預期抗劑（諸如Mabowmt形巾用㈣激免疫反應之用途與此等結果以及說明在初級CD8+ τ細胞預致敏期間阻斷 BTLA-HVEM連接可促進T細胞增殖增強的結果相關（參見

Derr0 等人 J. Clin· Invest. 2010, 120: 157-167)。對於BTLA促效劑，遏制抗原特異性τ細胞及B細胞反應兩者之旎力將提供調節BTLA活性之方法，預期該等方法適用於諸如關節炎、SLE、修格連氏病、潰瘍性結腸炎及克隆氏病之病狀以及實體器官移植（亦即腎、肝及其它器官’包括組織移植）。當前治療顯示缺點，部分因為單獨遏制Τ細胞不足以達成所要效果。本發明抗btlA抗體可由於能夠遏制T細胞及B細胞反應兩者而有效治療關節炎、潰 149758.doc 19 201121564 瘍性結腸炎及克隆氏病，以及實體器官移植（亦即腎、肝及其它器官）。本發明之各促效劑抗體在以IgG4以及單價 Fab'片段形式再表現時在活體外及活體内模型中保留免疫抑制活性的能力提供適用於新穎治療之所需特性。縮寫在本發明之實施方式及實例中將通篇使用下列縮寫： ADCC 抗體依賴性細胞毒性 BTLA B及T淋巴細胞衰減因子 HVEM 疱疹病毒進入介體 Hu Mab8D5 完全人類單株促效劑抗BTL Α抗體 Hu Mab8A3 完全人類單株促效劑抗BTLA抗體 Hu Mab21H6 完全人類單株促效劑抗BTLA抗體 Hu Mabl9A7 完全人類單株促效劑抗BTLA抗體 Hu Mab4C7 完全人類單株拮抗劑抗BTLA抗體 Hu Mab 20H4 完全人類單株抗BTLA抗體 Hu Mab 15C5 完全人類單株抗BTLA抗體 CDC 補體依賴性細胞毒性 CDR 免疫球蛋白可變區中之互補決定區，使用 Kabat編號系統定義 CHO 中國倉鼠卵巢 CTL 細胞毒性T淋巴細胞 ec5〇產生50%功效或結合之濃度 ELISA 酶聯結免疫吸附劑檢定 FW 抗體構架區：排除CDR區之免疫球蛋白可 149758.doc -20- 201121564 變區 HRP IL-2 IL-5 IFN IC50 IgG Kabat 辣根過氧化酶介白素2 介白素5 干擾素

產生50%抑制之濃度免疫球蛋白G 一種由Elvin A. Kabat首創之免疫球蛋白比對及編號系統（（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) mAb或Mab或MAb 單株抗體 MES 2-(N-嗎啉基）乙烷磺酸 MOA 作用機制 NHS 正常人類血清 PCR 聚合酶鏈反應 PK 藥物動力學 . SEB 葡萄球菌腸毒素 B(Staphylococcus Enterotoxin B) TT 破傷風類毒素 V區 IgG鏈中序列在不同抗體間可變之區段。其在輕鏈中延伸至Kabat殘基109且在重鏈中延伸至Kabat殘基113。 VH 免疫球蛋白重鏈可變區 149758.doc -21 - 201121564

Vk 免疫球蛋白k輕鏈可變區定義為使本發明可更容易理解，下文明確定義某些技術及科學術語。除非在本文件中之別處明確定義，否則本文所用之所有其它技術及科學術語皆具有本發明所屬技術中之— 般技術者通常所理解的含義。如本文（包括隨附申請專利範圍）中所用，除非本文另有明確規定，否則諸如「一」及「該」之單數形式措詞亦包括其相應複數參考物。當「活化」、「刺激」及「處理」應用於細胞或受體時，例如用配位體活化、刺激或處理細胞或受體，除非另外由本文或明確指示，否則其可具有相同含義。「配位體」涵蓋天然及合成配位體，例如細胞激素、細胞激素變異體、類似物、突變型蛋白質（mutein)及衍生自抗體之結合化合物。「配位體」亦涵蓋小分子，例如細胞激素之肽模擬2 及抗體之肽模擬物。「活化」可指如受内部以及外部機制或％境因素調控之細胞活化。例如細胞、組織、器官戋生物體之「反應」涵蓋生物化學或生理學特性之變化，例如濃度、密度、黏著性、或在生物代謝區内之遷移、基因表現速率、或分化狀態之變化，其中該變化與活化、刺激戈處理、或與内部機制（諸如遺傳程式設計（genetic programming))相關。分子之「活性」可描述或指分子與配位體或受體之結 &，催化活性，刺激基因表現或細胞信號傳導、分化或成 149758.doc -22· 201121564 熟之能力；抗原活性；其它分子活性之調節；及其類似方面。分子之「活性」亦可指調節或維持細胞間相互作用 (例如黏著)之活性或維持細胞結構(例如細胞膜或細胞骨架）之活性。「活性」亦可意謂比活性（例如[催化活性]/[蛋白質毫克數]或[免疫活性]/[蛋白質毫克數])、生物代謝區中之濃度、或其類似方面。「活性」·^指調節先天性或應變性免疫系統之組分。「增殖活性」涵蓋促進以下方面、為以下方面所必需或與以下方面特定相關之活性：例如正常細胞分裂、以及癌症、腫瘤、發育不良、細胞轉化、轉移及血管生成。當「投藥」及「治療」應用於動物、人類、實驗個體、細胞、組織、旨官或生物流體時’其係指使外源醫藥劑、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人類、個體、細胞、組織、器官或生物流體接觸。「投藥」及「治療」可指例如治療方法、藥物動力學方法、診斷方法、研究方法及實驗方法。治療細胞涵蓋使藥劑與細胞接觸以及使藥劑與流體接觸，其中該流體與該細胞接觸。「投藥」及「治療」亦意謂用試劑、診斷化合物、結合化合物或用另一細胞對例如細胞進行活體外及離體治療。術語「個體」包括任何生物體，較佳為動物，更佳為哺乳動物（例如大鼠、小鼠、犬、貓、兔），且最佳為人類。如本文所用，BTLA促效劑抗體係指結合於ΒΤχΑ且增強其傳遞至B細胞及T細胞之協同抑制信號的抗體。如本文所用，BTLA拮抗劑抗體係指結合於btla且阻止 149758.doc •23· 201121564 協同抑制信號傳遞至B細胞及T細胞的抗體。在本發明之一實施例中，在可能時，本發明組合物根據 Physicians' Desk Reference 2003(Thomson Healthcare ;第 5 7版（2002年11月1日）)投與個體。在某些實施例中，抗BTLA抗體或其抗原結合片段可經由侵襲性途徑’諸如藉由注射（參見上文）來投與。經由非侵襲性途徑（例如經口；例如以丸劑、膠囊劑或錠劑形式）進行之投藥亦在本發明範疇内。在本發明之一實施例中’ 抗BTLA抗體或其抗原結合片段、或其醫藥組合物經靜脈内、皮下、肌肉内、動脈内、關節内（例如在關節炎關節中）、吸入、喷霧劑傳遞、或腫瘤内投與。在某些實施例中，抗BTLA抗體或其抗原結合片段與以鍵劑形式經口投與之化學治療劑（例如吉非替尼（gefitinib)(例如Iressa™))組合投與。在另一實施例中’化學治療劑為靜脈内投與之太平洋紫杉醇（paclitaxel)(例如Taxol®)。在另一實施例中，抗BTLA抗體或其抗原結合片段與至少一種諸如（但不限於）以下之額外治療劑組合投與·針對 CTLA-4(例如 AVASTIN(貝伐單抗（beVaciZUmab))、 MYLOTARG(吉妥珠單抗（gemtuzumab))、BEXXAR(托西莫單抗（tositumomab))、RITUXAN(利妥普單抗（ntUXimab)) HERCEPTIN(曲妥珠單抗（trastuzumab)))或具有類似作用之 0 L Λ 抗原呈現細胞（樹突蛋白質配位體的其它单株抗體；活化机、之藥劑1包括1型狀細胞、巨噬細胞、Β細胞、單核細胆）、 149758.doc -24- 1 + nCG ;提供任何及所干擾素（例如干擾素α及β);干擾素γ ; 201121564

有形式之腫瘤抗原（包括蛋白質抗原、肽抗原、完整細胞溶胞物及其衍生物）之藥劑；遺傳編碼之抗原（例如腺病毒編碼之抗原）；已經活體内或離體改變來增強其免疫性質之免疫系統細胞組分（例如自體樹突狀細胞、淋巴細胞、熱休克蛋白等），化學治療劑，諸如尤其（但不限於）環填醯胺（cyclophosphamide)、曱胺喋呤（meth〇trexate)、依託泊普（etoposide)、阿德力黴素（adriamycin)、紫杉烷（Uxane)、氟尿嘧啶（fluorouracil)、胞嘧啶阿拉伯糖苷（cyt〇sine arabinoside，AraC)及含鉑藥劑。抗原實例包括pSA抗原 (例如PROSTVAC/TRICOM)及來源於黑色素瘤之即1〇〇抗原。該組合亦可與細胞激素或生長因子（諸如（但不限於）GM-CSF)或與免疫刺激核苦酸（諸如（但不限於）CpG ODN PF3512676(亦稱為 pr〇Mune，參見W02007/008463)) 組合投與。另外，在某些實施例中，抗BTLA抗體或其抗原結合片段可與諸如抗CTLA-4及抗PD1之抗體（包括分別描述於美國專利第6,682,736號及美國專利第7,563,869號中者）組合投與。組合物可用此項技術中已知之醫用裝置來投與。舉例而言’本發明醫藥組合物可藉由用皮下注射針注射投與。本發明醫藥組合物亦可用無針皮下注射裝置投與；該裝置諸如揭示於美國專利第6,62〇，135號；第6,096,002號；第 5,399，163號；第 5,383,851號；第 5,3 12,335號；第 5,064,413 號；第4,941，880號；第4,790,824號或第4,596,556號中之 149758.doc •25· 201121564 裝置。投與醫藥組合物之熟知植入物及模組形式之實例包括. 美國專利第4,487,6G3號，其揭示—種用於以控制速率分配藥物之可植入微型輸注泵；美國專利第4,447,233號，示-種用於以精確輸注速率傳遞藥物之藥物輸注泵；美: 專利第4,447,224號，其揭示—種用於連續傳遞藥物之机可植入輸注裝置；美國專利第4,439，196號，其揭示一種具有多腔隔室之滲透藥物傳遞系統。許多其它此等植入物、傳遞系統及模組為熟習此項技術者所熟知。「治療」意謂以内部或外部方式向患有一或多種疾病症狀之患者投與治療劑，諸如含有任何本發明結合化合物之組合物，其中所投與治療劑對於該等疾病症狀具有已知户療活性。藥劑通常以無論藉由以任何臨床可量測程度誘導 ^⑷症狀復原或抑制此⑷症狀進展來有效減輕所治療心者或群體中-或多種疾病症狀的量投與。有效減輕任何 ^疋疾病症狀之治療劑的量（亦稱為「治療有效量」）可根 =下因素變化：諸如患者之疾病病況、年齡及體重、及樂物在患者中引發所要反瘅 I夂應之此力。疾病症狀是否已減輕它熟練保健提供者通常用來評估彼症狀之嚴 ’一士進展狀態的任何臨床量測法進行評估。儘管本發明 :&例（例如/α療方法或製品）可能不能有效減輕每個 ^者中之目標疾病症狀’但是其應減輕如藉由此項技術中何統計檢驗所測定之統計顯著數目患者中的目標疾病症狀，該統計檢定諸如學红檢驗、卡方檢驗（Μ· 149758.doc -26- 201121564 test)、根據 Mann及 Whitney之 U-檢驗、Kruskal-Wallis檢驗 (H-檢驗）、J0nckheere-Terpstra 檢驗及 Wilcoxon 檢驗。當「治療」應用於人類個體、獸醫學個體或研究個體時，其係指治療性治療措施、防治性措施或預防性措施、研究及診斷應用。當「治療」應用於人類個體、獸醫學個體、或研究個體、或細胞、組織、或器官時，其涵蓋使 BTLA促效劑或拮抗劑與人類或動物個體、細胞、組織、生理代謝區或生理流體接觸。「治療細胞」亦涵蓋BTLA促效劑或拮抗劑接觸例如流體相或膠態相中之Btl A受體的情況，而且亦涵蓋促效劑或拮抗劑不接觸細胞或受體之情況。在某些實施例中，可單獨或組合使用抗BTLA抗體或其抗原結合片段來治療或預防需要此治療或預防之個體中之任何疾病或病狀。對於拮抗劑抗BTLA抗體，在某些實施例中，病狀例如由BTLA之表現或活性升高' 或由其配位體（例如HVEM)之表現升高所介導，且可藉由調節BTLA-HVEM配位體結合、活性或表現來治療或預防。在某些實施例中，疾病或病狀由BTLA及/或HVEM之含量增加所介導，且藉由降低 BTLA-HVEM配位體結合、活性或表現來治療或預防。如本文所述之拮抗劑抗BTLA抗體將作為負性信號傳導分子阻斷BTLA活性且將導致上調τ細胞及B細胞對腫瘤之反應。術語「B及T淋巴細胞衰減因子」及「BTLA」基因/蛋白 149758.doc •27· 201121564 質可互換使用，其包括變異體、同功異型物、同源物、直系同源物及旁系同源物。舉例而言，在某些實施例中，對人類BTLA具有特異性之抗體與來自除人類以外之物種的 BTLA交叉反應。在其它實施例中，對人類BTLA具有特異性之抗體可對人類BTLA具有完全特異性且可能不顯示物種或其它類型之交叉反應性。除非另有說明，否則術語「人類BTLA」係指人類BTLA序列。除非另有說明，否則人類BTLA序列涵蓋所有人類同型及BTLA變異體，諸如具有Genbank寄存編號AAP44003之人類BTLA的完整胺基酸序列。亦存在至少兩種人類BTLA轉錄物變異體。以 GenBank寄存編號NP_861445描述之轉錄物變異體1為289 個胺基酸長且顯示與寄存編號AAP44003之BTLA序列接近 98%的一致性。此變異體代表較長轉錄物且編碼具有289 個胺基酸之較長同功異型物。轉錄物變異體2(GenBank寄存編號ΝΜ_001085357)相較於變異體1缺乏替代同框外顯子，從而產生相較於同功異型物1具有241個胺基酸之較短蛋白質（同功異型物2，GenBank寄存編號ΝΡ_0〇1〇78826)。人類BTLA序列可能由於具有例如保守突變或在非保守區域中具有突變而不同，且BTLA具有與SEQ id NO:2、 SEQ ID NO:3 5或SEQ ID n〇:37之人類BTLA實質上相同的生物功能。舉例而言，人類BTLA之生物功能為遏制免疫反應，諸如.T細胞反應。亦即BTLA被視為一種負性調節劑。其具有涉及減少IL-2產生及T細胞擴增之C端抑制劑基元（Watanabe 等人，Nat· Immunol., 4, 670-679, 2003 ; 149758.doc • 28 - 201121564

Chemnitz 等人，J. Immunol., 176， 6603-6614, 2006) 。 it匕外，人類BTLA之生物功能可為在BTLA之細胞外域中具有例如由本發明抗體特異性結合的抗原決定基。特定 BTLA序列將一般與 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:35 或SEQ ID NO:37之人類BTLA或其它同功異型物具有至少 90%的胺基酸序列一致性，且含有當與其它物種（例如鼠類）之BTLA胺基酸序列相比較時使胺基酸序列鑑別為屬於人類的胺基酸殘基。在某些情況下，人類BTLA與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:35 或 SEQ ID NO:37 之人類 BTLA 或其它同功異型物或變異體之一致性可為至少95%、或甚至至少 96%、97%、98%或99%。在某些實施例中，人類BTLA序列將顯示與 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:35 或 SEQ ID NO:37 之BTLA或其它同功異型物或變異體具有不超過10個胺基酸差異。在某些實施例中，人類BTLA可顯示與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:35 或 SEQ ID NO:37之 BTLA或其它同功異型物或變異體具有不超過5個、或甚至不超過4個、3 個、2個或1個胺基酸差異。一致性百分比可如本文所述測定。術語「免疫反應」係指例如淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、粒細胞及由以上細胞或肝產生之可溶性巨分子（包括抗體、細胞激素及補體）自人體選擇性損壞、破壞或消除侵襲性病原體、受病原體感染之細胞或組織、癌細胞或（在自體免疫性或病理性發炎之情況下）正常人類細胞或組織的作用。在某些情況下，宜對小鼠類似物抗體進行引申研究。如 149758.doc -29- 201121564 本文所述之適合方法可用於產生抗BTLA小鼠抗體以及選擇及表徵小鼠抗BTLA抗體。儘管任何具有所要特徵及活性之小鼠BTLA肽皆可用於產生小鼠ΒΤχΑ抗體，但由

Watanabe等人Nat. Immunol. 4 (7)，670-679 (2003)所描述包括GenBank寄存編號AY293285所編碼之GenBank寄存編號 AAP44002(306個胺基酸）的序列較佳。另外，已表徵大量小鼠BTLA剪接變異體，且在某些情況下，可利用其中任何變異體來產生抗小鼠BTLa抗體。小鼠BTLA剪接變異體包括較長轉錄物變異體個胺基酸長）之編碼序列ΝΜ_0010377 19及相應胺基酸序列 NP—001032808，且較短轉錄物變異體2序列描述於 GenBank NP_808252(305個胺基酸長）；相較於變異體i，支異體2使用3'編瑪區中之替代同框剪接位點，從而產生較短蛋白質（同功異型物2)。如本文所用，術語r抗體」係指顯示所要生物活性之抗體的任何形式。因此，該術語以最廣泛意義使用且具體涵蓋（但不限於）單株抗體（包括全長單株抗體）、多株抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、人類化抗體、完全人類抗體、嵌合抗體及駱駝化單域抗體。如本文所用，術語「抗BTLA抗體」或抗體（「親本抗體」）之「抗原結合片 #又j涵蓋抗體之片段或衍生物，通常包括至少親本抗體之抗原結合或可變區（例如一或多個Cdr)之片段，該片段保留親本抗體之至少一些結合特異性。抗體結合片段之實例包括（但不限於）Fab、Fab，、F(ab，）2及Fv片段；微型雙功能 149758.doc •30- 201121564 抗體，線抗體，单鍵抗體分子，例如sc-Fv ;奈米抗體 (nanobody)及由抗體片段形成之多特異性抗體。通常，當以莫耳為基礎表示活性時，結合片段或衍生物保留其 BTLA結合活性之至少10% 〇結合片段或衍生物較佳保留親本抗體BTLA結合親和力之至少20%、50%、70%、 80%、90%、95%或100%或1〇〇%以上。亦意欲抗btlA抗原結合片段可包括不實質上改變其生物活性之保守或非保守胺基酸取代（稱為抗體之「保守變異體」或「功能保守變異體」）。術語「結合化合物」係指抗體及其結合片段兩者。「經分離抗體」係指純化狀態之結合化合物且在此情形下意謂分子實質上不含其它生物分子，諸如核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物、或其它物質，諸如細胞碎片及生長培養基。-般而t，術語「經分離」並不欲指完全不存在此物質或不存在水、緩衝劑或鹽，除非其存在量實質上干擾如本文所述結合化合物之實驗或治療用途。「Fab片段」包含-條輕鏈及_條重鏈之^及可變區。 Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。「Fc」區含有兩個包含抗體之Ch1及W域之重鏈片段。該兩個重鏈片段由兩個或兩個如以上一硫鍵及由C„3域之疏水性相互作用保持在一起。「Fab片段」含有—條輕#、B … 鏈及—條重鏈中含有VH域及 CH1域以及CH1與CH2域之間的區域之一在兩個Fab，片段之兩條重鏈 \ 刀S 又，從而可重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成 149758.doc 201121564 F(ab>分子。「F(ab·)2片段」含有兩條輕鏈及兩條含有Ch1與^Η2域之間之怪定區部分的重鏈’從而在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。F(ab，）2片段因此由兩個藉由兩條重鏈間之二硫鍵保持在一起的Fab’片段構成。「Fv區」包含重鏈及輕鏈兩者之可變區，但缺乏恆定區。術語「單鏈Fv」或「scFv」抗體係指包含抗體之Vh及乂域之抗體片段，其中此等域存在於單一多肽鏈中qFv多肽通常進一步在VH與VL域之間包含多肽連接子，其使得^卜能夠形成抗原結合所需之結構。對於scFv之回顧，參見

Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，

Verlag，New York，第269_315頁。亦參見國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第 5,260,203 號。「域抗體」為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功月匕性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上Vh 區用肽連接子共價聯接以產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可具有雙特異性（參見下文）。如本文所用，除非另有指示，否則「抗BtLA」抗體係 149758.doc •32- 201121564 生之抗體或其任何抗原性指針對人類BTLA或其變異體產片段。如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上體的群體獲得之抗體，亦即除可以少旦六^ 、 & 4 , 里存在之可能天然存在，犬變以外’構成該群體之個別抗體相同。單株抗體針對單-抗原決定基具有高度特異性。相反習知（多株）抗體製劑通常包括大量針對不同抗原決定基(或對不同抗原決定基.具有特異性）之抗體。修飾語「單株」指示抗體係自實質上均質之抗體群體獲得的特性，且其不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由K〇hler等人（1975) 256: 495描述之融合瘤法來製備，或可由重組dna法（參見，例如美國專利第4,816,567號）來製備。亦可使用例如

Clackson 等人（1991) 352: 624-628 及 Marks 等人 (1991) 乂 Mo/.价〇/. 222: 581-597中描述之技術自噬菌體抗體文庫分離「單株抗體」。亦參見presta (2005) 乂 Clin. Immunol. ]Λ6:Ί?Λ。在某些實施例中’單株抗體包括「嵌合」抗體（免疫球蛋白）’其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體種類或子類之抗體中的相應序列一致或同源’而該（等）鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體種類或子類之抗體中的相應序列一致或同源，以及該等抗體之片段，只要其顯示所要生物活性即可（美國專利第 4,816,567 號及 Morrison 等人，（1984) #加/. Jcai/· H9758.doc -33- 201121564 版 C/以 81: 685 卜6855) » 如本文所用，「嵌合抗體」為具有來自第一抗體之可變域及來自第二抗體之恆定域之抗體，其中第一及第二抗體來自不同物種。通常，可變域係自來自實驗動物（諸如齧齒動物）之抗體（「親本抗體」）獲得，而恆定域序列係自人類抗體獲得，以便所得嵌合抗體相比於親本齧齒動物抗體不太可能在人類個體中引發不利免疫反應。在某些實施例中，本文中之單株抗體亦包括駱駝化單域抗體。參見，例如 Muyldermans 等人（2001)

Biochem. Sci. 26:230 ； Reichmann ^ A (1999) J. Immunol. Mei/ζσ心 231:25 ; WO 94/04678 ; WO 94/25591 ;美國專利第6,005,079號。在一實施例中，本發明提供單域抗體，其包含兩個具有修飾之VH域以便形成單域抗體。

如本文所用’術語「微型雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含重鏈可變域（Vh) 連接至同一多肽鏈中之輕鏈可變域（VL)(VH_VL或VL-VH)。藉由使用過短而使同一鏈上之兩個域之間無法配對的連接子’迫使該等域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。微型雙功能抗體更充分描述於例如以下中·· EP 404,097 ; WO 93/11161 及 Holliger 等人（1993)户削.7\^/· deac?· t/iSd 90: 6444-6448。對於經工程改造抗體變異體之回顧’一般參見Holliger及Hudson (2005) iVai.价〇⑽/mo/. 23:1126-1136 。如本文所用’術語「人類化抗體」係指含有人類及非人 149758.doc -34- 201121564 類（例如鼠類，大鼠）抗體兩者之序列的抗體形式。一般而言，人類化抗體將包含至少—個且通常兩個可變域之實質上全部’纟’之全部或實f上全部對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且所有構架（FR)區之全部或實質上全部為人類免疫球蛋白序列之構架區。人類化抗體可視情況包含人類免疫球蛋白恆定區（Fc)之至少一部分。本發明抗體亦包括具有經修飾（或封端）之以區以提供改變之效應功能的抗體。參見，例如美國專利第5,624,821 號；W02003/086310 ; W02005/120571 ; W02006/0057702。此修飾可用於增強或遏制免疫系統之各種反應，在診斷及治療中具有可能有益之作用。改變Fc區包括胺基酸變化 (取代、缺失及插入）、糖基化或去糖基化、及添加多個 Fc。Fc之變化亦可改變治療性抗體中之抗體半衰期從而能夠使給藥頻率降低且因此增加便利性且減少物質使用。參見 Presta (2005) cm 116:731 第 734- 35頁。術語「完全人類抗體」係指僅包含人類免疫球蛋白蛋白質序列之抗體。若完全人類抗體係於小鼠、小鼠細胞或來源於小鼠細胞之融合瘤中產生，則其可含有鼠類碳水化合物鏈。類似地’「小鼠抗體」係指僅包含小鼠免疫球蛋白序列之抗體。或者，若完全人類抗體係於大鼠、大鼠細胞或來源於大鼠細胞之融合瘤中產生，則其可含有大鼠碳水化合物鏈。類似地，「大鼠抗體」係指僅包含大鼠免疫球蛋白序列之抗體。 149758.doc -35- 201121564 抗體結構一般而言，已知基本抗體結構單元包含四聚體。各四聚體包括兩對相同多肽鏈’各對皆具有一條「輕」鏈（約25 kDa)及一條「重」鏈（約50-70 kDa)。各鏈之胺基端部分或片段可包括主要負責抗原識別之含有約100個至110個或 110個以上胺基酸的可變區。各鏈之羧基端部分或片段可界定主要負責效應功能之恆定區。人類輕鏈通常分類為κ 及λ輕鏈。此外，人類重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈内，可變區及恆定區由含有約12個或12個以上胺基酸之「J」區聯接，其中重鏈亦包括含有約10個或10個以上胺基酸的「D」區。一般參見Fundamenta丨Immunology 第 7章（Paul, W.編，第 2版 Raven Press, Ν·Υ. (1989))。各輕鏈/重鏈之可變區配對形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整IgG抗體具有兩個結合位點。除在雙官能或雙特異性抗體中之外，一般兩個結合位點相同。該等鏈通常均顯示由三個高變區聯接之相對保守構架區 (FR)之相同一般結構’該等高變區亦稱為互補決定區或 CDR。各對之兩條鏈的CDR通常由構架區對準，以使其能夠結合於特定抗原決定基。一般而言，自N端至c端，輕鏈及重鏈兩者均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 CDR3及FR4域。分配給各域之胺基酸通常根據以下文獻之疋義.Sequences of Proteins of Immunologicail Interest，

Kabat專人；National Institutes of Health，Bethesda, Md·;第 149758.doc -36- 201121564 5版；NIH 出版號 91-3242 (1991) ; Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75 ; Kabat 等人，（1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616 ; Chothia 等人，（1987) J Mol. Biol. 196:901-917或 Chothia等人，（1989) Nature 342:878-883。如本文所用，術語「高變區」係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區包含「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基（亦即輕鏈可變域中之殘基24-34(CDRLl)、50-56(CDRL2)及89-97(CDRL3)及重鏈可變域中之殘基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)及 95-102(CDRH3); Kabat 等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest j 第 5版 Public Health Service，National Institutes of Health,

Bethesda，Md.)及/或「高變環」之彼等殘基（亦即輕鏈可變域中之殘基 26-32(CDRLl)、50-52(CDRL2)及 91-96(CDRL3) 及重鏈可變域中之 26-32(CDRHl)、53-55(CDRH2)及 96- l〇l(CDRH3) ; Chothia 及 Lesk (1987) J· Mo/.⑽/· 196: 901-917)。如本文所用，術語「構架」或「FR」殘基係指除本文定義為CDR殘基之高變區殘基之外的彼等可變域殘基。「結合物質」係指能夠結合於目標之分子、小分子、巨 /刀子、杬體、其片段或類似物、或可溶性受體。「結合物質」亦可指能夠結合於目標之分子複合物(例如非共價複 :物）、㉟子化分子及經共價或非共價修飾之分子，例如藉由磷酸化、醯化、交聯、環化或限制性裂解修飾之分子。「結合物質」亦可指能夠結合於目標的分子與穩定 149758.doc •37· 201121564 劍賦也劑、鹽、緩衝劑、溶劑或添加劑之組合。「結 &」可疋義為結合物質與目標之締合，其中在該結合物質可浴解於或懸浮於溶液中之情況下，該缔合導致該結合物質之正常布朗運動（Brownian m〇ti〇n)降低。「有效量」涵蓋足以改善或預防醫學病狀之症狀或病徵的罝。有效量亦意謂足以允許或促進診斷之量。用於特定患者或獸醫學個體之有效量可視以下因素而改變：諸如所治療之病狀、患者之總體健康狀況、投藥之方法途徑及劑量、及副作用之嚴重性（參見，例如頒予Netti等人之美國專利第5,888,530號）。有效量可為避免顯著副作用或毒性作用之最大劑量或給藥方案。作用將使診斷指標或參數改良至少5°/。、通常至少1〇%、更通常至少2〇%、最通常至少 30〇/〇、較佳至少40%、更佳至少5〇%、最佳至少6〇%、理想地至少70%、更理想地至少8〇%且最理想地至少9〇%，其中100%定義為正常個體所顯示之診斷參數（參見，例如等尺（\996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL ； Dent (2001)

Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK)。「外源」係指視情形而定產生於生物體、細胞或人體外部之物貝。「内源」係指視情形而定產生於生物體、細胞或人體内部之物質。「同源性」係指兩個聚核苷酸序列之間或兩個多肽序列之間的相似性。當兩個比較序列兩者中之一位置由相同鹼 149758.doc -38- 201121564 基2基酸單體次單位伯據時，例如若兩個dna分子之每 :IT —位置由腺°票呤佔據，則該等分子在彼位置處同源。兩個序列夕pq & π _ 曰1的同源性百分比為兩個序列共有之匹配或同源位置數昤LV & & & _ ^ y、斤比杈位置數且乘以100之函數。舉例而言’若當序列最佳對準時，在兩個序列中之職位置中

有6個位置匹n、E -成冋源，則兩個序列6〇%同源。一般而 a ’在對準兩個序列汁幻以產生最大同源性百分比時進行比較。、免疫病狀」或「免疫病症」涵蓋例如病理性發炎、發乂 1·生病症及自體免疫性病症或疾病。「免疫病狀」亦指感染、持續性感染及增生性病&，諸如癌症、腫瘤及血管生成，包括對破免疫系統根除具有抗性之感染、腫瘤及癌症。「癌性病狀」&括例如癌症、癌細胞、腫瘤、血管生成及癌症前期病狀，諸如發育不良。「發炎性病症」意謂病理學完全或部分由例如免疫系統之細胞數目邊化 '遷移速率變化或活化變化導致的病症或病理學病狀。免疫系統之細胞包括例如T細胞、B細胞、單核細胞或巨噬細胞、抗原呈現細胞（Apc)、樹突狀細胞、微神經膠質細胞、NK細胞、Νκτ細胞、嗜中性白血球、嗜伊紅血球、肥大細胞或與免疫學特定相關之任何其它細胞’例如產生細胞激素之内皮或上皮細胞。「經分離結合化合物」係指純化狀態之結合化合物且在此情形下意謂分子實質上不含其它生物分子，諸如核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物、或其它物質，諸如細胞碎片 M9758.doc -39- 201121564 及生長培養基。一般而言，術語「經分離」並不欲指完全不存在此物質或不存在水、緩衝劑或鹽，除非其存在量實質上干擾如本文所述結合化合物之實驗或治療用途。「經分離核酸分子」意謂基因組、mRNA、cDNA、或合成來源之DNA或RNA、或其一些組合，該經分離核酸分子不與自然界中該經分離聚核苷酸存在於其中之聚核苷酸的全部或一部分締合’或連接於在自然界其並不連接之聚核苷酸。出於本發明之目的，應瞭解「包含特定核苷酸序列之核酸分子」不包涵完整染色體。「包含」指定核酸序列之經分離核酸分子除該指定序列外亦可包括多達十種或甚至多達二十種或二十種以上其它蛋白質或其部分或片段的編碼序列，或可包括控制所述核酸序列之編碼區之表現的可操作地連接之調控序列，及/或可包括載體序列。片語「控制序列」係指可操作地連接之編碼序列在特定宿主生物體中表現所必需的〇财序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、聚腺普酸化信號及強化子。核酸序列在功能上相關時，該核 §使某一核酸與另， .，—’1 口唧町，碌核為可操作地連接的」。舉例而言，若前序列（卿equenc 或分^前導序列之職表現為參與多肽分泌之前蛋白，其可：作地連接至該多肽之DNA;若啟動子或強化子影丨 ==轉錄，則其可操作地連接至該序列；或細點經定位錢轉譯，«可操作地連接至· 149758.doc 201121564 序列。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之dna序列鄰接，且在分泌前導序列之情形下鄰接且在閱讀相 (reading phase)中。然而，強化子不必鄰接。連接藉由在適宜限制性位點處連接來完成。若此等位點不存在，則根據慣例使用合成寡核芽酸接附子或連接子。如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用且所有此等名稱均包括子代。因此，詞語「轉型體」及「經轉型細胞」包括原代個體細胞及來源於其之培養物（不考慮傳代次數）。亦應瞭解所有子代可能由於有意或無意突變而在DNA含量方面不精確一致。功能或生物活性與在原始轉型細胞中所篩檢之功能或生物活性相同的突變型子代包括在内。當意欲使用不同名稱時，應將其與上下文區分。如本文所用’「聚合酶鏈反應」或「PCR」係指如例如美國專利第4,683,195號中所述，擴增極少量特定核酸 (RNA及/或DNA)片段的程序或技術。一般而言，需要獲得相關區域末端或末端以外之序列資訊，以便可設計出寡核苷酸引子；此等引子在序列方面將一致或類似於欲擴增之模板之相對股。兩個引子之5,末端核苷酸可與所擴增物質的末端一致。PCR可用於擴增特定RNA序列、來自總基因組DNA之特定DNA序列、及自總細胞RNA轉錄之CDNA、噬菌體或質體序列等。一般參見Mullis等人（1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 5 1:263 ; Erlich 編， (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)。如本文所 149758.doc •41 - 201121564 用，PCR視為擴增核酸測試樣品之核酸聚合酶反應方法之個但非唯一貫例，該方法包含使用已知核酸作為引子及使用核酸聚合酶來擴增或產生特定核酸片段。如本文所用，術語「生殖系序列」係指未重排免疫球蛋白DNA序列之序列。可使用未重排免疫球蛋白之任何適合來源。「抑制劑」及「拮抗劑」或「活化劑」及「促效劑」分別指抑制性或活化性分子，例如用於活化例如配位體、受體、輔因子、基因、細胞、組織或器官。例如基因、受體、配位體或細胞之調節劑為改變該基因、受體、配位體或細胞之活性的分子，其中可活化、抑制、或改變其調控性質方面之活性。調節劑可單獨起作用或其可使用辅因子，例如蛋白質、金屬離子或小分子。抑制劑為減少、阻斷、阻止、延遲活化、失活、脫敏或下調例如基因、蛋白質、配位體、受體或細胞的化合物。活化劑為增加、活化、促進、增強活化、敏化或上調例如基因、蛋白質、配位體、受體或細胞的化合物。抑制劑亦可定義為降低、阻斷或失活組成性活性之化合物。「促效劑」為與目標相互作用以導致或促進目標之活化增強的化合物。「拮抗劑為與促效劑之作用相反的化合物。拮抗劑阻止、降低、抑制或中和促效劑之活性《拮抗劑亦可阻止、抑制或降低目標（例如目標受體）之組成性活性，甚至在無經鑑別之促效劑的情況下。在BTLA之情況下，BTLA促效劑將啟始及加強由BTLA傳遞至B細胞及T細胞之負性信號。χ__ U 力—万面， 149758.doc •42· 201121564 BTLA拮&劑將t阻斷彼信號傳遞至B細胞及τ細胞，因此增強Β細胞及Τ細胞活化/增殖。為了檢驗抑制程度，例如用潛在活化劑或抑制劑處理包 3例如&定蛋白質、基因、細胞或生物體之樣品或檢定物且與無抑制劑之對照樣品進行比較。對照樣品亦即未用拮抗诏處理之樣品，其相對活性值指定為丨〇〇%。當活性值相對於對照為以下時達成抑制：約9()%或9Q%以下 '通常 85%或85%以下、更通常8〇%或8〇%以下、最通常挪或 75%以下、一般7〇%或7〇%以下、更一般65%或μ%以下、最一般6G%或6G%以下、通常55%或55%以下、通常5〇%或 50%以下、更通常45%或45%以下、最通常桃或辦〇以下、較佳35%或35¾以下、更佳3〇%或3〇%以下仍更佳 5 /。或25 /。以下、且最佳小於25%。當活性值相對於對照為以下時達成活化··約110%、一般至少12〇%、更一般至 140/。、更一般至少i 6〇%、經常至少^ 、更經常至少 2倍、最經常至少2.5倍、通常至少5倍、更通常至少1〇倍、較佳至少20倍、更佳至少4〇倍、且最較佳高於牝倍以上。可如下監測活化或抑制之終點。可利用终點來監測例如、、田胞生理/爪體、組織、器官、及動物或人類個體之活化、抑制及對治療之反應。終點可包含預定之量或百分比的例如發炎、致癌性或細胞去顆粒化或分泌（諸如釋放細胞激素、毒性氧或蛋白酶）的指標。終點可包含例如預定量之離子流動或轉運；細胞遷移；細胞黏著；細胞增殖； 149758.doc -43· 201121564 轉移之可能性；細胞分化；及表型變化，例如與發炎、細胞 >周亡、轉化、細胞週期或轉移相關之基因的表現變化 (參見’例如Knight (2000) J亂 c/z„. Scz·· 30:145- 158 ; Hood 及 Cheresh (2002) TVoiwre hv· Cancer 2:91-100 ’ Timme 專人（2003) Cwrr· rar发eis 4:251-261 ;

Robbins及 Itzkowitz (2002) Md. C/h. iVori/z Jm. 86:1467-1495 ; Grady 及 Markowitz (2002)心脱心v. 开請.3:101-128; Bauer 等人（2001) (?/k 36:235-243 ; Stanimirovic 及 Satoh (2000) l〇:i13_ 126)。抑制終點一般為對照之75%或75%以下、較佳對照之 50%或50%以下、更佳對照之25%或25%以下、且最佳對照之1 〇%或1 0%以下。一般而言，活化終點為對照之至少 150 4較佳對照之至少兩倍、更佳對照之至少四倍、且最佳對照之至少十倍。「配位體」係指例如可充當受體之促效劑或拮抗劑的小分子、肽、多肽、及膜相關或膜結合分子、或其複合物。「配位體」亦涵蓋不為促效劑或拮抗劑但可結合於受體的戈劑此外’配位體」包括已例如藉由化學或重組方法改變成可溶形式之膜結合配位體的膜結合配位體。根據慣例§配位體結合於第一細胞之膜上時，受體通常存在於第一細胞上。第二細胞可具有與第一細胞相同或不同之特性。配位體或受體可完全在細胞内，亦即其可存在於細胞办質、核或一些其它細胞内代謝區中。配位體或受體可改 § 149758.doc • 44 · 201121564 變其位置，例如自細胞内代謝區至質獏外表面。配位體與受體之複合物稱為「配位體受體複合物」。當配位體及受體涉及信號傳導路徑時，配位體存在於信號傳導路徑之上游位置且受體存在於信號傳導路徑之下游位置。HVEM為 TNF-受體超家族成員。除結合BTLA外，其亦可結合 LIGHT、LTa及 CD160。「小分子」定義為具有以下分子量之分子：小於10 kDa、通常小於2 kDa、較佳小於1 kDa、且最佳小於約500 Da。小分子包括（但不限於）無機分子、有機分子、含有無機組分之有機分子、包含放射性原子之分子、合成分子、肽模擬物及抗體模擬物。小分子作為治療劑可更容易渗透至細胞中、對降解不太敏感、且相比於大分子不太易於引起免疫反應。已描述小分子’諸如抗體及細胞激素之肽模擬物、以及小分子毒素（參見，例如Casset等人（2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205 ； Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302 ； Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:125 1-1256 ; Apostolopoulos 等人（2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420 ; Monfardini 等人（2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199 ; Domingues 等人（1999) Nat· Struct. Biol. 6:652-656 ; Sato及Sone (2003) Biochem. J. 371:603-608 ; 頒予Stewart等人之美國專利第6,326,482號）。當「特異性」或「選擇性」結合關於配位體/受體、抗體/抗原或其它結合對提及時，其指示確定蛋白質存在於蛋白質及其它生物製劑之異源群體中的結合反應。因此， 149758.doc -45- 201121564 在指定條件下，指定配位體結合於特定受體且並不以顯著量結合於存在於樣品中的其它蛋白質。預期方法之抗體或來源於抗體之抗原結合位點的結合化合物以以 ★ r視和力結合於其抗原、或其變異體或突變型蛋白：為與任何其它抗原之親和力的至少兩倍高、較佳至少十倍高、更佳至少倍高、且最佳至少1〇〇倍高的親和力。如本文所用，術語「免疫調節劑」係指遏制或調節免疫反應之天然或合成藥劑。免疫反應可為體液性或細胞反應。免疫調節劑涵蓋免疫抑制劑或消炎劑。如本文所用之「免疫抑制劑」'「免疫抑制藥物」或「免疫遏制劑」為免疫抑制療法中用來抑制或阻止免疫系統活性的治療劑。其在臨床上用於防止移植器官及組織:例如骨髓、心臟、腎、肝）之排斥反應及/或用於治療自體免疫 ^病或最可能具有自體免疫起因之疾病（例如類風濕性關節炎、重症肌無力、全身性紅斑狼瘡、潰癌性結腸炎、多發性硬化症）。免疫抑制藥物可分類為：糖皮質激素；細胞抑制藥；抗體；生物反應調節齊卜諸如包括CTLA 4: (AWaceP^)之1g融合蛋白；作用於免疫親和素§ (nn_ophilin)之藥物；其它藥物，包括治療增生性病广中所用之已知化學治療劑，冑如黴龄酸嗎琳乙： (mycopheno丨atemofeti丨’ MMF)。對於多發性硬化症，特定言之’本發明抗體可結合一類新型_合蛋白樣治療劑 (稱為克帕松（copaxone))—起投與。「消炎劑」或「消炎藥」係指類固醇及非類固醇治療劑 149758.doc -46· 201121564 :者。類固醇亦稱為皮質類固醇，為極其類似於皮質醇之樂物’皮質醇為—種由腎上腺天然產生之激素。類固醇用作以下某些發炎性病狀之主要治療：諸如全身性血管炎 (&毛人）及肌炎（肌肉發炎）。類固醇亦可用於選擇性治 Μ炎性病狀，諸如：類風濕性關節炎（發生在身體兩側關節中之^ J4發炎性關節炎）；全身性紅斑狼療（由免疫系統功能異常引起之全身性疾病）；修格連氏症候群（導致乾眼病及口腔乾燥之慢性病症）。通常縮寫成NSAID之非類固醇消炎藥為具有鎮痛、退熱及消炎作用之藥物’其減少疼痛、發熱及發炎。術語「非類固醇」用於區分此等藥物與類固醇’類固醇（在大量其匕作用中）具有類似類廿院酸抑制、消炎作用。一般指示 NSAID可用於減輕以下病狀之症狀：類風濕性關節炎；骨關節炎，發炎性關節病（例如僵直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、雷德氏症候群（Reiter，s syndr〇me));急性痛風；痛經’轉移性骨痛；頭痛及偏頭痛；術後疼痛；歸因於發炎及組織損傷之輕度至中度疼痛；發熱；及腎絞痛。nsaid 匕.括夂鹽、方基烧酸、2 -芳基丙酸（洛芬（profe:n))、N_ 芳基鄰胺基苯曱酸（芬那酸（fenamic acid))、昔康 (oxicam)、考昔（c〇xib)及磺醯基苯胺。改良疾病之抗風濕病藥物（DMARD)常與NSAID組合投系開具之處方DMARD包括經氯奎（hydroxychloroquine)/ 氣奎（chloroquine)、甲胺嗓π令、金療法（g〇id therapy)、柳氛石尹、私:。比 °定（sulfasalazine)及硫。坐嘌呤（azathioprine)。 149758.doc -47- 201121564 「信號轉導路徑」係指在將信號自細胞之一部分傳輸至細胞之另一部分中起作用的多個信號轉導分子之間的生物化學關係。如本文所用，片語「細胞表面受體」包括例如能夠接受信號且能夠跨越細胞之質膜傳輸此種信號的分子及分子複合物。本發明「細胞表面受體」之一實例為 BTLA受體。對人類BTLA具有特異性之抗體本發明大體係關於結合BTLA之經分離抗體或其抗原結合片段及此等抗體或其抗原結合片段之用途。更特定言之，本發明提供經分離完全人類抗BTLA抗體及使用該等抗體或其抗原結合片段治療疾病之方法。完全人類抗 BTLA抗體之實例包括（但不限於）：Hu Mab8D5、hu Mab8A3 ' hu Mab21H6、hu Mabl9A7及 hu Mab4C7。本發明提供經分離抗BTLA促效劑抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段顯示一或多種以下性質： (1)不阻斷HVEM或LIGHT與人類BTLA之結合；（2)與獼猴 BTLA交叉反應；（3)在蛋白質結合檢定（例如Biacore)中結合於人類BTLA之KD為至多約2.5xl0·9 ;及（4)在T細胞及B 細胞活化檢定中之EC5〇為至少約10 nM。在一實施例中，抗BTLA抗體或其抗原結合片段在蛋白質結合檢定（例如 Biacore ;實例2-3)中結合於人類BTLA之KD為至多約 2.5x10_9且在T細胞及B細胞活化檢定中之EC5〇為約10-100 nM 〇在另一實施例中，抗體或抗原結合片段為阻斷HVEM與 149758.doc •48· 201121564 BTLA之結合之經分離完全人類抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，此等抗體之實例包括（但不限於）完全人類抗 BTLA抗體 hu Mab4C7。結合BTLA之經分離抗體或其抗原結合片段可包含本發明之所述抗體及抗原結合片段之一個、兩個、三個、四個、五個或六個互補決定區（CDR)。該一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR可獨立地選自本發明之抗體及抗原結合片段之所述C D R序列（例如表1、表2)。或者，該一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR可選自單一所述本發明之抗體或抗原結合片段之CDR序列。在某些實施例中’一個、兩個或三個CDR係選自所述促效劑抗體之VL 〇011(例如表1;8£(5 10 1^0:12-14)及/或一個、兩個或三個 CDR係選自所述本發明之VH CDR(例如表2 ; SEQ ID NO:5-7)。在另一實施例中’一個、兩個或三個CDR係選自所述拮抗劑抗體之VL CDR(例如表1 ; SEQ ID NO:26-28)及/或一個、兩個或三個CDR係選自所述本發明之VH CDR(例如表 2 ; SEQ ID NO:19-21)。結合BTLA之經分離抗體或其抗原結合片段可包含至少一個包含一或多個選自由以下組成之群之CDR-L 1、CDR-L2或CDR-L3的抗體輕鍵可變（Vl)域：（a)抗體huMab8D5之可變區的 CDR-L1、CDR-L2及 CDR-L3 ; (b)抗體 hu Mab8A3 之可變區的 CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3 ; (c)抗體 hu Mab21H6 之可變區的 CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3 ;及（d) 抗體 hu Mabl9A7 之可變區的 CDR-L1、CDR-L2 及 CDR- 149758.doc -49- 201121564 L3。結合BTLA之經分離抗體或其抗原結合片段可包含至少一個包含一或多個選自由以下組成之群之CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3的抗體重鏈可變（VH)域：（a)抗體hu Mab8D5 之可變區的 CDR-H1、CDR-H2 或 CDR-H3 ; (b)抗體 hu Mab8A3之可變區的 CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3 ; (c)抗體 hu Mab21H6之可變區的CDR-H1、CDR-H2 或 CDR-H3 ;及 (d)抗體 hu Mabl9A7之可變區的 CDR-H1、CDR-H2 或 CDR-H3。在一較佳實施例中，結合BTLA之經分離抗體或其抗原結合片段包含至少一個包含選自由以下組成之群之CDR-Ll、CDR-L2或CDR-L3的抗體輕鏈可變（VL)域：（a)抗體hu Mab8D5 之可變區的 CDR-L1、CDR-L2及 CDR-L3 ; (b)抗體 hu Mab8A3之可變區的 CDR-L1、CDR-L2及 CDR-L3 ; (c)抗體 hu Mab21H6 之可變區的 CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3 及 (d)抗體 hu Mabl9A7之可變區的 CDR-L1、CDR-L2及 CDR-L3 ;及至少一個包含選自由以下組成之群之CDR-H1、 CDR-H2或CDR-H3的抗體重鏈可變（V„)域：（a)抗體hu Mab8D5之可變區的 CDR-H1、CDR-H2 或 CDR-H3 ; (b)抗體 hu Mab8A3之可變區的CDR-H1、CDR-H2 或 CDR-H3 ; (c) 抗體 hu Mab21H6之可變區的CDR-H1、CDR-H2 或CDR-H3 及（d)抗體hu Mabl9A7之可變區的CDR-H1、CDR-H2或 CDR-H3。本發明抗體之輕鏈及重鏈CDR之序列分別提供於表1及 149758.doc -50- 201121564 表2中。舉例而言且不構成限制，促效劑抗體之vL域CDR 係選自SEQ ID NO:12-14，而拮抗劑抗體之vL域CDR係選自SEQ ID NO:26-28。類似地，促效劑抗體之係選自SEQ ID NO:7-9 ’而拮抗劑抗體之vH域CDR係選自 SEQ ID NO:10-12。

表1 :輕鏈CDR 抗體 CDR1 CDR2 CDR3 8D5(促效劑） (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) 4C7(结抗劑） (SEQ ID NO:26, Vk) (SEQ ID NO:27, Vk) (SEQ ID NO:28, Vk)

表2 :重鏈CDR 抗體 CDR1 CDR2 CDR3 8D5(促效劑） (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6) (SEQ ID NO:7) 4C7(拮抗劑） (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO:20) (SEQ ID NO:21) 本發明進一步提供結合BTLA且充當促效劑抗體且包含抗體Hu Mab8D5之成熟VL域（SEQ ID NO:18)的經分離抗體或其抗原結合片段。在一較佳實施例中，抗體為完全人類單株抗體。較佳完全人類促效劑抗BTLA抗體之實例包括 (但不限於）hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mabl9A7及其抗原結合片段。本發明進一步提供結合BTLA且充當拮抗劑且包含抗體 Hu Mab4C7之成熟VL域（SEQ ID NO:32)的經分離抗體或其抗原結合片段。在一較佳實施例中，抗體為完全人類單株抗體。較佳完全人類拮抗劑抗BTLA抗體之實例包括（但不限於）hu Mab4C7及其抗原結合片段。本發明進一步提供結合BTLA且充當促效劑且包含至少 149758.doc -51 - 201121564 一個選自由（a)抗體Hu Mab8D5之成熟VH域（SEQ ID ΝΟ:11) 組成之群之VH域的經分離抗體或其抗原結合片段。在一較佳實施例中，抗體為完全人類單株促效劑抗BTLA抗體。較佳完全人類促效劑抗BTLA抗體之實例包括（但不限於）hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mabl9A7及其抗原結合片段。本發明進一步提供結合BTLA且充當拮抗劑且包含至少一個選自由（a)抗體Hu Mab4C7之成熟VH域（SEQ ID NO:25) 組成之群之VH域的經分離抗體或其抗原結合片段。在一較佳實施例中，抗體為完全人類拮抗劑抗BTLA抗體。較佳完全人類拮抗劑抗BTLA抗體之實例包括（但不限於）hu Mab4C7及其抗原結合片段。本發明提供經分離促效劑抗體或其抗原結合片段，其結合BTLA且具有至少一個選自由SEQ ID No·: 12、13及14組成之群的Vl域及至少一個選自由SEQ ID No.:5、6及7組成之群的VH域。在一較佳實施例中，抗體為完全人類促效劑抗BTLA抗體。較佳完全人類促效劑抗BTLA抗體之實例包括（但不限於）hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mabl9A7及其抗原結合片段。本發明提供經分離拮抗劑抗體或其抗原結合片段，其結合BTLA且具有至少一個選自由SEQ ID No· :26、27、28組成之群的VL域及至少一個選自由SEQ ID No.: 19、20及21 組成之群的VH域。在一較佳實施例中，抗體為完全人類拮抗劑抗BTLA抗體。較佳完全人類拮抗劑抗BTLA抗體之實 149758.doc -52· 201121564 例包括（但不限於）hu Mab4C7及其抗原結合片段。在一實施例中’本發明經分離抗體包含重鏈恆定區，較佳人類恆定區，諸如γ丨、γ2、γ3或γ4人類重鏈恆定區或其變異體。在另一實施例中，結合化合物包含輕鏈恆定區，較佳人類輕鏈恆定區，諸如人或κ人類輕鏈區或其變異體。舉例而言且不構成限制，人類重鏈恆定區可為γΐ且人類輕鏈恆定區可為Κ。在一替代實施例中，抗體Fc區為具有

Ser228Pro突變之Y4(Schuurman，J等人，Mo/· 38: 1-8, 2001) 〇在一實施例中’抗原結合片段係選自由以下組成之群： Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’）2及微型雙功能抗體。本發明亦提供包含^域（例如SEq ID n〇.:16、18、30、 32、37及3 8)之經分離多肽及包含本發明抗體之vh域（例如 SEQ ID No· :9、11、23及25)之經分離多肽。在一實施例中’本發明提供結合BTLA且具有序列同源性為至少 950/。、90%、85%、80%、75%或5〇%之火域、^域的抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明之結合化合物包含具有至多0、i'2'3'4'5'6'7'8'9、1〇個或 10個以上保守或非保守胺基酸取代、但仍顯示所要結合性質的VL及VH域（有及無信號序列）。「保守修飾變異體」或「保守取代」係指用具有類似特徵（例如電荷、惻鏈尺寸、疏水性/親水性、骨架構形及剛性等）之其它胺基酸取代蛋白質中之胺基酸’以使可常在 149758.doc -53- 201121564 不改變蛋白質之生物活性下進行改變。熟習此項技術者認識到，一般取代多肽非必要區域中之單個胺基酸不會實質上改變生物活性（參見，例如Watson等人（1987) Mo/ecw/ar Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co. > 第 224頁（第4版））。此外，取代結構或功能上類似之胺基酸很少會破壞生物活性。本發明結合化合物之各種實施例包含與本文揭示之特定胺基酸序列（例如SEQ ID NO:5、6、7、 9、11、12、13、14、16、18、19、20、21、23、25、 30、32及3 7)比較時序列包括至多0(無變化）、1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個或 20個以上保守胺基酸取代的多肽鏈。如本文所用，片語「至多X個」保守胺基酸取代包括0個取代及至多且包括X個取代之任何數目的取代。此等例示性取代較佳根據如下在表3中所示者來進行：表3 例示性保守胺基酸取代原始殘基保守取代 Ala (A) Gly; Ser Arg (R) Lys; His Asn (N) Gin; His Asp (D) Glu; Asn Cys (C) Ser; Ala Gin (〇) Asn Glu (E) Asp; Gin Gly (G) Ala His (H) Asn; Gin He⑴ Leu; Val Leu (L) lie; Val Lys (K) Arg; His Met (M) Leu; lie; Tyr 149758.doc -54- 201121564 原始殘基保守取代 Phe(F) Tyr; Met; Leu Pro (P) Ala Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp(W) Tyr; Phe Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) lie; Leu 本發明亦涵蓋本發明抗體之功能保守變異體。「功能保守變異體」為蛋白質或酶中之一或多個胺基酸殘基已在不改變多肽之總體構形及功能下而改變的變異體，該改變包括（但決不限於）用具有類似性質之胺基酸置換某一胺基酸。胺基酸取代本發明亦提供具有至多〇、1、2、3、4或5個或5個以上胺基酸取代、但仍顯示結合於BTLA之能力的包含促效劑 BTLA抗體之VL域（例如SEQ ID No.:16及18)的經分離多肽及包含本發明促效劑BTLA抗體之VH域（例如SEQ ID No.:9 及11)的經分離多肽。在其它實施例中，本發明提供具有至多0、1、2、3、4 或5個或5個以上胺基酸取代、但仍顯示結合於BTLA之能力的包含拮抗劑BTLA抗體之VL域（例如SEQ ID Νο·:30或 32)的經分離多肽及包含本發明拮抗劑BTLA抗體之VH域 (例如SEQ ID Νο·:23或25)的經分離多肽。在另一實施例中，本發明提供結合人類BTLA且具有與一或多個本文所述之VL域或VH域之序列同源性為至少 95%、90%、85%、80%、75% 或 5 0%之 VL域、VH域且顯示 149758.doc -55- 201121564 結合於人類BTLA的抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明結合化合物包含具有至多0、1、2、3、4或5 個或5個以上胺基酸取代之VL及VH域（有及無信號序列）且顯示結合於人類BTLA。在某些實施例中，將需要使含有曝露側鏈之某些胺基酸改變為另一胺基酸殘基以使最終抗體具有較高化學穩定性，如下所述。舉例而言，可使天冬醯胺（Asn)殘基改變為Gin或Ala以降低在CDR内任何Asn-Gly序列處形成異天冬胺酸的可能性。類似問題可能會在Asp-Gly序列處發生。參見 Reissner 及 Aswad (2003) Ce//· Mo/. Scz.· 60:1281。異天冬胺酸形成可能會削弱或完全消除抗體與其目標抗原之結合。參見？1^咖（2005)1/_3//以尽>；(：//«· 11 6:731第734頁。在一實施例中’使天冬醯胺改變為麩醯胺酸（Gin)。亦可能需要改變鄰近天冬醯胺（Asn) 或麩醯胺酸（Gin)殘基之胺基酸以降低脫醯胺作用之可能性，脫醯胺作用在小胺基酸存在於天冬酿胺或楚醯胺酸附近時以較大速率發生。參見Bischoff及Kolbe (1994) X CT/rowWog. 662:261。此外，可使CDR中之任何甲硫胺酸殘基（通常為溶劑曝露]Viet)改變為Lys、Leu、Ala或Phe以降低曱硫胺酸之硫將會氧化的可能性，該氧化可能會降低抗原結合親和力且亦促成最終抗體製劑中之分子異質性。同上文。在一實施例中，使甲硫胺酸改變為丙胺酸（Ala)。另外，為防止潛在易斷裂Asn-Pro肽鍵或使其變得最少，可能需要將存在於CDR中之任何Asr^-Pro組合改變為Gin_ 149758.doc -56- 201121564

Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。隨後篩檢具有此等取代之抗體以確保取代未使BTLA結合親和力或其它所要生物活性降至不可接受的程度。表4 :例示性穩定化CDR變異體 CDR殘基/s— 穩定化變異體序列 Asn-Gly Gln-Gly、Ala-Gly 或Asn-AIa (N-G) (Q-G)、（A-G)或(N-A) Asp-Gly Glu-Gly、Ala-Gly 或Asp-Ala (D-G) (E-G)、（A-G)或(D-A) Met(通常曝露於溶劑） Lys、Leu、Ala 或Phe (Μ) (K)、（L)、（A)或(F) Asn Gin 或 Ala (Ν) (Q)或(A) Asn-Pro Gin-Pro、Ala-Pro 或Asn-Ala (Ν-Ρ) (Q-P)、（A-P)或(N-A) 8D5VH之例示性CDR變異體包括： CDR1 ： SYDMH(SEQ ID NO:5) CDR1 變異體 SYDXH=其中 X為 Μ、K、L、A或 F(SEQ ID NO:38) CDR3 ： EGMAAHNYYGMDV(SEQ ID NO:7) CDR3 變異體 EGX1AAHX2YYGX1DV=其中 X,為 Μ、K、 L、A 或 F ; X2為 N、Q或 A(SEQ ID NO:39) VH CDR之X改變可以任何組合獨立地選擇。 8D5VL之例示性CDR變異艎包括： CDR2 ： DASNRAT(SEQ ID NO:13) CDR2變異體：DASXRAT=其中X為 Q或 A(SEQIDNO:40) CDR3 ： QQRSNWPPIT(SEQ ID NO:14) 149758.doc -57- 201121564 CDR3變異體：QQRSXWPPIT=其中 X為 Q 或 A(SEQ ID NO:41) VL CDR之X改變可以任何組合獨立地選擇。另外，本文所述任何X改變可以任何組合獨立地選擇，只要所要活性或結合能力得以保留即可。 4C7VH之例示性CDR變異體包括： CDR2 ： YIYYSGSTKYNPSLKS(SEQ ID NO:20) CDR2變異體：YIYYSGSTKYXiXzSLKSs 其中 X】X2 為>1-P、Q-P、A-P或N-A(SEQ ID NO:42) CDR3 ： EWPYYYYEMDV(SEQ ID NO:21) CDR3 變異體：EWPYYYYEXDV=其中 X為 Μ、K、L、A 或 F(SEQ ID NO:43) VH CDR之X改變可以任何組合獨立地選擇。如本說明書及申請專利範圍通篇使用之術語「基本上由…組成」或其變化形式指示包括任何所述要素或要素群，且視情況包括具有與所述要素類似或不同性質的其它要素，該等其它要素不本質上改變指定給藥方案、方法或組合物之基本或新穎性質。作為一非限制性實例，基本上由所述胺基酸序列組成之結合化合物亦可包括一或多個不本質上影響結合化合物之性質的胺基酸。核酸雜交背景本發明包括抗BTLA抗體及其片段，諸如由如表卜2中所述之核酸、或編碼如表4中所述胺基酸殘基之核酸、以及與其雜交之核酸編碼者。較佳地，核酸在低嚴格度條件 149758.doc -58 · 201121564 下更佳在中等嚴格度條件下且最佳在高嚴格度條件下雜交且較佳顯示BTLA結合活性。當單股形式之核酸分子可在適當溫度及溶液離子強度條件（參見Sambrook等人，同上文）下與另一核酸分子黏接時’則該核酸分子「可與另一核酸分子雜交」’諸如cDNA、基因組DNA、或rNA。溫度及離子強度條件決定雜交之「嚴格度」。典型低嚴格度雜交條件包括55°C、5xSSC、0.1% SDS及無曱醯胺；或在 42°C下3 0%曱醯胺、5xSSC、0_5% SDS。典型中等嚴格度雜交條件類似於低嚴格度條件，但雜交在42°c下在具有5 X 或6xSSC及0·1〇/。SDS之40%甲醯胺中進行。高嚴格度雜交條件類似於低嚴格度條件，但雜交條件在50%甲醯胺、5χ 或6xSSC中在42°C下或視情況在更高溫度（例如57t：、 59°C、60°C、62°C、63°C、65t 或 68°C)下進行。一般而言’ SSC為0.15 M NaCl及0.015 M檸檬酸鈉。儘管雜交取決於雜交之嚴格度’但其要求兩個核酸含有互補序列，在鹼基之間可能發生錯配。用於雜交核酸之適當嚴格度取決於核酸長度及互補度’其為此項技術中熟知之變數β兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性之程度愈大，則核酸可雜交之嚴格度愈高。對於長度大於100個核苦酸之雜交體’已推導出rf*算溶融溫度之專式（參見Sambrook等人，同上文，9.50-9.51)。對於較短核酸（亦即寡核苷酸）之雜交，錯配位置變得更加重要且寡核苷酸之長度決定其特異性（參見Sambrook等人’同上文，11.7-11.8)。本發明亦包括包含核苷酸序列之核酸及包含胺基酸序列 149758.doc -59- 201121564 之多肽，當利用BLAST演算法對該等核苷酸序列及該等胺基酸序列與參考核苷酸及胺基酸序列進行比較時，兩者至少約70%—致、較佳至少約80%—致、更佳至少約90% — 致且最佳至少約95% —致（例如95%、96%、97%、98%、 99%、100%)，其中選擇該演算法之參數以得到各別參考序列之整個長度上各別序列之間的最大匹配。本發明亦包括包含當用BLAST演算法進行比較時與任何參考胺基酸序列至少約70%相似、較佳至少約80%相似、更佳至少約 90%相似且最佳至少約95%相似（例如95%、96%、97%、 98°/〇、99%、100%)之胺基酸序列的多肽，其中選擇該演算法之參數以得到各別參考序列之整個長度上各別序列之間的最大匹配。序列一致性係指所比較兩個序列之核苷酸或胺基酸之間的精確匹配。序列相似性係指所比較兩個多肽之胺基酸之間的精確匹配以及非一致生物化學相關胺基酸之間的匹配兩者。共有類似性質且可互換之生物化學相關胺基酸如上文所論述。以下關於BLAST演算法之參考文獻為適用的：BLAST ALGORITHMS: Altschul，S.F·等人，…^)】.^!。^^· 215:403-410 ; Gish，W.等人，（1993) Nature Genet. 3:266-272 ； Madden, T.L.等人，（1996) Meth. Enzymol. 266:131-141 ； Altschul, S.F.等人，（1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Zhang, J.等人，（1997) Genome Res. 7:649-656 ； Wootton, J.C.等人，（1993) Comput. Chem. 17:149- 149758.doc -60- 201121564 163 ; Hancock, J,Μ.等人，（1994)(1；〇111卩111:.八卩卩1.81〇5(^· 10:67-70 ； ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O.等人，「A model of evolutionary change in proteins」， Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978)第 5 卷，增刊 3. M_0. Dayhoff (編），第 345-352 頁，Natl. Biomed. Res. Found., Washington，DC ; Schwartz, R.M.等人，「Matrices for detecting distant relationships」，Atlas of Protein Sequence and Structure，（1978)第 5 卷，增刊 3" M.O. Dayhoff (編），第 353-358 頁，Natl. Biomed. Res. Found.， Washington, DC ； Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565 ; States, D.J.等人，（1991) Methods 3:66-70 ; Henikoff，S.等人，（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 ; Altschul, S.F.等人，（1993) J. Mol· Evol· 36:290-300 ； ALIGNMENT STATISTICS: Karlin，S.等人， (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 ； Karlin, S·等人，（1993) Proc. Natl. Acad· Sci. USA 90:5873-5877 ; Dembo, A.等人，（1994) Ann. Prob· 22:2022-2039 及 Altschul, S_F.「Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments」，Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai編）， (1997)第 1-14 頁，Plenum，New York。在另一實施例中，本發明係關於編碼本發明經分離抗體或抗原結合片段之經分離核酸，例如DNA。在一實施例中，經分離核酸編碼包含至少一個成熟抗體輕鏈可變（VL) 149758.doc -61 · 201121564 域及至少一個成熟抗體重鏈可變（vH)域之促效劑抗體或其抗原結合片段，其中該VL域包含至少三個具有選自Seq ID NO:12-14之序列的CDR，且該VH域包含至少三個具有選自SEQ ID NO:5-7之序列的CDR。在一實施例中，經分離核酸分別編碼SEQ ID NO:18及SEQ ID ΝΟ:11之成熟輕鏈及重鏈可變區序列。在一些實施例中，經分離核酸在單一核酸分子上編碼輕鏈及重鏈兩者，且在其它實施例中，輕鏈及重鏈在兩個或兩個以上單獨核酸分子上編碼。在另一實施例中’核酸進一步編碼信號序列。本發明亦提供包含本發明經分離核酸之表現載體，其中該核酸可操作地連接至當用載體轉染宿主細胞時由該宿主細胞識別的控制序列。亦提供包含本發明表現載體之宿主細胞。本發明進一步係關於產生本發明結合化合物之方法，其包含在培養基中培養含有編碼結合化合物之表現載體的宿主細胞，及自宿主細胞或培養基分離該結合化合物。本發明亦係關於與抗體hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu

Mab21H6或hu Mabl9A7(亦即促效劑抗體）或以Mab4C7(亦即阻斷與HVEM結合之拮抗劑抗體）結合於人類BTLa上之相同抗原決定基的抗體或其抗原結合片段，例如能夠交叉阻斷任何本發明抗體之結合的抗體。舉例而言且不構成限制，本發明之完全人類抗體以不超過約100 ηΜ(1Μ〇-7 M)、較佳不超過約10 nM、更佳不超過約1 nM之KD值結合人類BTLA〇抗體具有不超過約2〇〇 149758.doc -62 - 201121564

pM(2xlG Μ)、1GG pM、50 pM、2G pM、10 pM、5 PM 或甚至2 PM之KD值的實施例甚至更佳。產生抗體之任何適合方法皆可用於產生本發明抗體。任何適合形式之人類BTLA皆可用作產生抗體之免疫原（抗原）。舉例而言且不構成限制，任何人類BTLA同功異型物 ' 或其片段皆可用作免疫原。實例包括（但不限於）如本文所述之人類BTLA之同功異型物及剪接變異體。在一替代實施例中，恆河猴（rhesus)BTLA可用作產生抗體之免疫原。在一較佳實施例中，使用攜帶部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉殖基因小鼠來產生針對Btla之完全人類單株抗體。此等在本文中可稱為「HuMAb」小鼠之轉殖基因小鼠含有編碼未重排人類重鏈（μ及丫）及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微型基因座（minil〇ci)以及失活内源 μ及κ鏈基因座之乾向突變（L〇nberg, N.等人，（1994) Nature 368(6474): 856-859)。因此’小鼠顯示小鼠igM或κ之表現減少’且回應於免疫接種’所引入人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換（class switching)及體細胞突變以產生高親和力人類IgGK單株抗體（Lonberg，N.等人，（1994)，同上 . 文；回顧於Lonberg，N. (1994) Handbook of Experimental

Pharmacology 113:49-101 中；Lonberg，Ν·等人，（1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 及 Harding, F.等人，（1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536-546)。HuMab小鼠之製備在此項技術中通常已知且描述於例如以下中：Taylor，L.等人， (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295 ; Chen，J.等 -63- 149758.doc 201121564 人，（1993) International Immunology 5: 647-656 ; Tuaillon 等人，（1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi 等人，（1993) Nature Genetics 4:117-123 ; Chen，J.等人，（1993) EMBO J. 12: 821-830 ; Tuaillon等人，（1994) J Immunol. 152:2912-2920 ； Lonberg 等人，（1994) Nature 368(6474): 856-859 ； Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 ; Taylor, L·等人， (1994) International Immunology 6: 579-591 ; Lonberg, N. 等人，（1995) Intern. Rev. Immunol•第 13 卷：65-93 ; Harding, F.等人，（1995)八1111.：^_丫八〇3€1.8<^ 764:536-546 ; Fishwild，D.等人，（1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 及 Harding 等人，（1995) Annals NY Acad. Sci. 764:536-546。進一步參見美國專利第5,545,806號；第 5,569,825 號；第 5,625,126 號；第 5,633,425 號；第 5,789,650 號；第 5,877,397 號；第 5,661,016 號；第 5,814,318 號；第 5,874,299 號；第 5,770,429 號及第 5,545,807號；及國際專利申請公開案第貿〇 98/24884號；第 WO 94/25585號；第 WO 93/12227號；第 WO 92/22645號及第 WO 92/03918號。為了產生針對BTL A之完全人類單株抗體，如Lonberg， N.等人，（1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild，D. 等人，（1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 及 WO 98/24884所述，可用抗原性BTLA多肽、較佳SEQ ID NO:35之殘基31-152免疫HuMab小鼠。小鼠在首次免疫時 149758.doc -64- 201121564 較佳為6-1 6週齡。舉例而言，可使用經純化BTLA製劑來腹膜内及/或皮下免疫HuMab小鼠。亦可用經BTLA基因穩定轉染之完整HEK293或CHO細胞來免疫小鼠。「抗原性 BTLA多肽」可指BTLA多肽或其任何片段，較佳為能在較佳HuMab小鼠中引發抗BTLA免疫反應的任何BTLA片段。一般而言，HuMAb轉殖基因小鼠在初始用於MPL® + TDM佐劑（Sigma，產品編號M65 3 6)中之抗原腹膜内（IP)及/ 或皮下免疫、隨後每隔一週或每兩週或三週用於MPL® + TDM佐劑中之抗原腹膜内免疫（通常至多總計6次）時充分反應。小鼠可首先用表現BTLA之細胞（例如穩定轉染之 HEK293或CHO細胞）、接著用BTLA之可溶性片段（例如 8丑(^10 1^0:35之殘基31-152)來免疫且連續接受用兩種抗原進行之交替免疫。可在免疫方案過程中監測免疫反應，其中血漿樣品係藉由眼眶後放血而獲得。可例如藉由 ELISA篩檢血漿中抗BTLA抗體之存在，且具有足夠免疫球蛋白效價之小鼠可用於融合。可在處死及移除脾之前4 天用抗原對小鼠進行靜脈内增強免疫。預期各抗原可能需要進行2-3次融合。各抗原可免疫若干小鼠。可藉由此項技術中通常已知之方法來製備產生單株完全人類抗BTLA抗體的融合瘤細胞。此等方法包括（但不限於）最初由 Kohler等人，（1975)(Nature 256:495-497)開發之融合瘤技術、以及三體瘤技術（Hering等人，（1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:211-216及 Hagiwara 等人，（1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4:15)、人類B細胞融合瘤技術 149758.doc ·65· 201121564 (Kozbor 等人，（1983) Immunology Today 4:72 及 Cote 等人，（1983) Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A 80:2026-2030)、 EBV-融合瘤技術（Cole等人 ’ Monocloua丨 Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，Inc.，第 77-96 頁，1985)及使用Cyto Pulse大腔室細胞融合電穿孔器（Cyt〇 pulse Sciences, Inc” Glen Burnie，MD)之基於電場的電融合。較佳地’根據標準方案分離小鼠.脾細胞且用peg或利用電融合使其與小鼠骨髓瘤細胞株融合。接著可針對抗原特異性抗體之產生來篩檢所得融合瘤。舉例而言，可用5〇% peg 將來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液與六分之一數目的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤細胞 (ATCC ’ CRL 1580)融合。將細胞以約2xl05個細胞/毫升塗鋪於平底微量滴定板中，隨後在含有20%胎純系血清、 18%「653」條件培養基、5%三曱氧唾辛（origen，IGEN)、 4 mM L-麩醯胺酸、1 mM L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉、5 mM HEPES、0.055 mM 2-酼基乙醇、50單位/毫升青黴素、50 mg/ml鏈黴素、50 mg/ml僅大黴素（gentamycin)及 lxHAT(Sigma ;在融合24小時後添加HAT)之選擇性培養基中培育兩週。兩週後，可在用HT替換HAT之培養基中培養細胞。接著可藉由ELISA篩檢個別孔中之人類抗BTLA單株IgG抗體。一旦出現廣泛融合瘤生長，可通常在1〇_14天後觀測培養基。可再塗鋪、再次篩檢抗體分泌型融合瘤，且若其對人類IgG(抗BTLA單株抗體）仍為陽性，則可藉由限制稀釋法將其次選殖至少兩次。接著可活體外培養穩定 149758.doc -66 - 201121564 一人純系以在M織培養基中產生少量抗體用於特性化。亦可（例如在如上所論述之大腸桿菌（五^⑼口表現系統中）重組產生本發明之抗BTLA抗體及其抗原結合片段。在此只施例中’可將編碼本發明抗體分子（例如vh或vL)之核酸插入基於pET之質體中且在[c〇/z7T7系統中表現。存在若干此項技術中已知用來產生重組抗體之方法。重組產生抗體之方法的一實例揭示於美國專利第4,816,567號中。可藉由將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知方法來進行轉型。將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在此項技術中為熟知的且包括聚葡萄糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、政聚胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、聚核苷酸囊封於脂質體中、基因搶注射（bi〇iistic injection)及直接顯微注射DNA至核中。此外，可利用病毒載體將核酸分子引入哺乳動物細胞中。轉型細胞之方法在此項技術中為熟知的。參見例如美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第 4,740,461 號及第 4,959,455號。亦可藉由美國專利第6,331，4 15號中闡述之任何方法來合成抗BTLA抗體。可用作表現伯主之哺乳動物細胞株在此項技術中為熟知的且包括可自美國菌種保存中心（American Type Culture Collection ’ ATCC)獲得之許多永生化細胞株。其尤其包括中國倉鼠卵巢（CH0)細胞、NS0、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎（BHK)細胞、猴腎細胞（COS)、人類肝細胞癌細胞（例如Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞及 149758.doc -67- 201121564 大量其它細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬及倉鼠細胞。特別較佳之細胞株藉由確定哪些細胞株具有高表現量來選擇。可使用之其它細胞株為昆蟲細胞株（諸如Sf9細胞）、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。當將編碼重鏈或其抗原結合部分或片段、輕鏈及/或其抗原結合片段之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞一段足以允許抗體在宿主細胞中表現或更佳允許抗體分泌至宿主細胞所生長之培養基中的時間來產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。此外，可使用許多已知技術使本發明抗體（或來自其中之其它部分）自產生細胞株的表現增強。舉例而言，麩醯胺酸合成酶基因表現系統（GS系統）為一種在某些條件下增強表現的常用方法。GS系統完全或部分結合歐洲專利第〇 2丨6 846 號、第0 256 〇55號及第〇 323 997號及歐洲專利申請案第 89303964.4號進行論述。由不同細胞株表現或在轉殖基因動物中表現之抗體將可月b具有彼此不同的糖基化。然而，由本文提供之核酸分子編碼或包含本文提供之胺基酸序列之所有抗體皆為本發明之一部分，而與抗體之糖基化無關。類似地，在某些實施例中，非岩藻糖基化抗體為有利的，因為其通常在活體外及在活體内兩者中均顯示比其岩藻糖基化對應物更有效之功效，且不可能具有免疫原性，因為其碳水化合物結構為天然人類血清IgG的正常組分。 149758.doc -68 - 201121564

'…肪·之有利之處在，基本上不受其它免疫球蛋白如本文所用之術語「體的群體獲得之抗體，在之突變以外，構成該：對單一抗原位點具有高. 於其可由融合瘤培養物合成， >可染。修飾語「單株」指示抗體在實質上均質之抗體的群體中的特性，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。如上文所提及，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，（1975) Nature 256: 495描述之融合瘤法來製備。多株抗體為在一或多種其它非一致抗體中或存在下產生的抗體。一般而言，在若干其它產生非一致抗體之B淋巴細胞存在下自B淋巴細胞產生多株抗體。多株抗體通常直接自經免疫動物獲得。雙特異性或雙功此抗體為具有兩個不同重鍵/輕鍵對及兩個不同結合位點的人造雜交抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法（包括融合瘤融合或Fab，片段連接）產生。參見，例如 Songsivilai等人，（1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-32 1、Kostelny 等人，(1992) J Immunol. 148:1 547-1 553。此外’雙特異性抗體可形成為「微型雙功能抗體」 (Holliger等人，（1993) PNAS USA 90:6444-6448)或「雙特異性卓鍵分子（Janusins)」（Traunecker等人，（1991) EMBO J. 10:3655-3659及 Traunecker 等人，（1992) Int. J. Cancer 增刊 7:51-52)。 149758.doc -69- 201121564 本發明包括「後合抗體」-一種包含本發明可變區與來自另一非人類物種（例如小鼠、馬、兔、犬、牛、雞）之抗體區域（例如恆定區）融合或嵌合的抗體。此等抗體可用於調節BTLA在非人類物種中之表現或活性。「單鏈Fv」或「sFv」抗體片段具有抗體之vH及vL域，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，sFv多肽在 VH與VL域之間進一步包含使sFv能夠形成抗原結合所需之結構的多肽連接子。所述用於產生單鏈抗體之技術（美國專利第5,476,786號，第5,132,405號及第4,946,778號）可適於產生抗BTLA特異性單鏈抗體。對於sFv之回顧，參見 Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies > 第 113 卷，Rosenburg及 Moore 編 Springer-Verlag, N.Y·，第 269-315頁（1994)。「一硫化物穩定之Fv片段」及「dsFv」係指包含由二硫橋連接之可變重鏈（VH)及可變輕鏈（VL)的抗體分子。本發明範疇内之抗體片段亦包括可藉由用例如胃蛋白酶酶促裂解IgG產生的F(ab)2片段。Fab片段可藉由例如用二硫蘇糖醇或疏基乙胺還原F(ab)2來產生。Fab片段為Vl-Cl 鏈藉由二硫橋附接至Vh_Ch1鏈。；p(ab)2片段為又藉由兩個一硫橋附接的兩個Fab片段。F(ab)2分子之Fab部分包括f 區域中二硫橋位於其間的部分。Fv片段為乂或Vh區。免疫球蛋白可視其重鏈恆定域之胺基酸序列而指定為不同種類。存在至少五個免疫球蛋白主要種類：IgA、IgD、 IgE、IgG及IgM，且其中數種可進一步分為子類（同型）， 149758.doc -70- 201121564 例如 IgG-l、IgG_2、IgG-3及 IgG-4 ; IgA-1 及 IgA-2。抗艎工程改造本發明之經工程改造抗體包括已對vH及/或vL内之構架殘基進行修飾以例如改良抗體性質者。通常進行此等構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為使一或多個構架殘基「回復突變（backmutate)」成相應生殖系序列。更特定言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有與該抗體所來源之生殖系序列不同的構架殘基。此等殘基可藉由將該等抗體構架序列與該抗體所來源之生殖系序列相比較來鑑別。舉例而言’表A顯示構架區胺基酸位置（使用Kabat編號系統）不同於生殖系之區域及此位置如何可藉由指定取代而回復突變成生殖系：

表A-例示性回復突變構架胺基酸位置(Kabat編號）回復突變 4C7 V7~~ 25 H25S 4C7V7~ 68 S68T 4C7 VH 82a T82aT 另一類型之構架修飾涉及使構架區内或甚至—或多個 CDR區内之一或多個殘基突變以移除τ細胞抗原決定基，由此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」’且進一步詳述於美國專利公開案第2003〇153〇43號中。除在構架區或CDR區内進行之修飾外或作為該等修飾之替代’本發明抗體可經工程改造以包括Fc區内之修飾，通 149758.doc 71 · 201121564 常用以改變抗體之一或多種功能性質，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外’本發明抗體可經化學修飾（例如，可將一或多個化學部分連接於該抗體）或經修飾以改變其糖基化，再次改變該抗體之一或多種功能性質。以下進一步詳述此等實施例之各者。Fc區域中殘基之編號為Kabat之eu索引的編號。在一較佳實施例中’抗體為IgG4同型抗體，其包含重鏈恆定區之鉸鏈區中對應於位置228之位置處絲胺酸突變成脯胺酸的突變（S228P; EU索引）。已報導此突變消除了鉸键區中重鏈間二硫橋的異質性（Angal等人同上文；位置 241係基於Rabat編號系統）。舉例而言，在各種實施例中，本發明抗BTLA抗體可包含8D5(SEQ ID NO:9或11)或 4C7(SEQ ID NO:23或25)的重鏈可變區連接於人類IgG4恆定區，其中該人類IgG4恆定區中對應於如Angal等人同上文中所述之位置241之位置處的絲胺酸已突變成脯胺酸。因此’對連接於人類1§(34恆定區之8D5及4C7重鏈可 '憂區，此突變對應於依據EU索引之S228P突變。在一實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目得以改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於美國專利第5,677,425號中。改變之鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目例如以促進輕鏈及重鏈之裝配或增強或降低抗體穩定性。在另貫轭例中，使抗體之Fc鉸鏈區突變以降低抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入 149758.doc -72· 201121564 錢鍵片段之CH2-CH3域界面區中以使抗體所具有的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合相對於天然Fc鉸鏈域SpA結合削弱。此方法進一步詳述於美國專利第6,165,745號中。在另一實施例中’修飾抗體以增加其生物半衰期。有多種方法可行。舉例而言，如美國專利第6,277,375號中所述’可引入一或多個以下突變：T252L、T254S、T256F。或者’如美國專利第5,869,〇46號及第6，121，〇22號中所述，為增加生物半衰期’可在CH1或CL區内改變抗體以使其含有取自IgG Fc區之CH2域之兩個環的救助受體結合抗原決定基。在其它實施例中，藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變F c區以改變抗體之效應功能。舉例而言’一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、 297、318、320及322之胺基酸可用不同胺基酸殘基置換以使抗體對效應配位體之親和力改變但保留親本抗體之抗原結合能力。對其親和力改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C 1組分。此方法進一步詳述於美國專利第 5,624,821 號及第 5,648,260號中。在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基329、33 1及 322之胺基酸可用不同胺基酸殘基置換以使抗體具有改變之Clq結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性 (CDC)。此方法進一步詳述於美國專利第6，194,551號中。在另一實施例中，改變一或多個在胺基酸位置23 1及239 内之胺基酸殘基以由此改變抗體固定補體之能力。此方法 149758.doc •73· 201121564 進一步描述於PCT公開案WO 94/29351中。在另一實例中，修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC)之能力及/或以藉由修飾一或多個以下位置處之胺基酸來增加抗體對Fey受體的親和力：238、239、 248 、 249 、 252 、 254 、 255 、 256 、 258 、 265 ' 267 ' 268 、 269 、 270 、 272 、 276 、 278 、 280 、 283 、 285 、 286 、 289 、 290 ' 292 、 293 ' 294 ' 295 ' 296 、 298 、 301 、 303 、 305 ' 307 、 309 、 312 、 315 、 320 、 322 、 324 、 326 、 327 、 329 、 330 、 331 、 333 、 334 、 335 、 337 、 338 、 340 、 360 、 373 、 376 、 378 、 382 、 388 、 389 、 398 、 414 、 416 、 419 、 430 、 43 4、435、437、43 8或439。此方法進一步描述於PCT公開案WO 00/42072中。此外，已定位人類IgGl上對於 FcyRl、FcyRII、FcyRIII及FeRn之結合位點且已描述結合經改良的變異體（參見Shields等人（2001)«/·价〇/. CAem. 276:6591-6604)。顯示位置 256、290、298、333、334及 339處之特定突變改良了對FcyRIII的結合。另外’顯示以下組合突變體改良了 FcyRIII結合：T256A/S298A、 S298A/E333A、S298A/K224A及 S298A/E333A/K334A。在另一實施例中，抗體之糠基化經修飾。舉例而言’可製備無糖基化抗體（亦即抗體缺乏糖基化）。可改變糖基化以例如增強抗體對抗原之親和力。此等碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列内一或多個糖基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，其消除一或多個可變區構架糖基化位點以由此消除彼位點處之糖基化。此無 149758.doc •74- 201121564 糖基化可增強抗體對抗原之親和力。參見，例如美國專利第 5,714,350號及第 6,350,861 號。或者或另外’可製備糖基化類型改變之抗體，諸如岩藻糖基殘基直減少之低岩藻糖基化抗體或對分GlcNac結構增加之抗體。已證明此等改變之糖基化模式增強抗體之 ADCC能力。此等碳水化合物修飾可藉由例如在糖基化機構改變之宿主細胞中表現抗體來完成。糖基化機構改變之細胞已在此項技術中描述且可用作表現本發明之重組抗體以由此產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，細胞株Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基轉移酶基因 FUT8(tx (1,6)-岩藻糖基轉移酶）’從而使表現於Ms704、 Ms705及Ms709細胞株中之抗體在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。藉由使用兩個置換載體靶向破壞CHO/DG44細胞中之FUT8基因來產生Ms704、Ms705及Ms709 FUT8-"細胞株 (參見美國專利公開案第20〇4〇1 10704號及Yamane-Ohnuki 等人（2004) 87:614-22)。作為另一實

例，EP 1，176,195描述一種編碼岩藻糖基轉移酶之FUT8基因的功能已經破壞的細胞株’從而使表現於此種細胞株中之抗體由於α-1，6鍵相關酶減少或消除而顯示低岩藻糖基化。EP 1，1 76,195亦描述用於將岩藻糖添加至結合於抗體 Fc區之Ν-乙醢葡萄糖胺上之酶活性較低或不具有該酶活性的細胞株，例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公開案WO 03/035835描述一種變異型CHO細胞株Lecl3細胞，其將岩藻糖連接於Asn(297)連接型碳水 149758.doc •75· 201121564 化合物的能力降低，從而亦導致表現於彼宿主細胞中之抗體具有低岩藻糖基化（亦參見Shields等人（2002) J.价〇/· C/zew. 277:26733-26740)。如 PCT公開案 WO 06/08923 1 中所述’糖基化概況經修飾之抗體亦可在雞蛋中產生。或者，糖基化概況經修飾之抗體可在植物細胞（諸如浮萍 (lew⑽)）中產生（美國專利7,632,983)。在植物系統中產生抗體之方法揭示於美國專利6,998,267及7,3 88,081中。PCT 公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現醣蛋白修飾糖基轉移酶（例如β(1,4)-Ν-乙醯葡萄糖胺轉移酶III(GnTIII)) 之細胞株’以使表現於該等工程改造細胞株中之抗體顯示增加之對分GlcNac結構，此使抗體之ADCC活性增強（亦參見 Umana 等人（1999) iVai.別 oiec/z. 17:176-180)。或者，可使用岩藻糖苷酶裂解掉抗體之岩藻糖殘基；例如岩藻糖苦酶α-L-岩藻糖苷酶將岩藻糖基殘基自抗體移除（Tarentin〇等人（1975) 5/oc/zem. 14:5516-23)。本發明涵蓋之本文中抗體的另一修飾為聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以便例如增加抗體之生物（例如血清）半衰期。為使抗體聚乙二醇化，通常使該抗體或其片段與聚乙二醇（PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物）在使一或多個PEG基團連接於該抗體或抗體片段之條件下反應。較佳地’經由與反應性PEG分子（或類似反應性水溶性聚合物）的酿化反應或烷基化反應來進行聚乙二醇化。如本文所用’術語「聚乙二酵」意欲涵蓋已用於衍生化其它蛋白質之任何形式的PEG，諸如單（C卜C10)烷氧基-聚乙二醇或芳 149758.doc -76- 201121564 氧基-聚乙二醇或聚乙二醇_順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，欲進行聚乙二醇化之抗體為無糖基化抗體。使蛋白質聚乙二醇化之方法在此項技術中為已知的且可應用於本發明抗體。參見’例如EP 0 1 54 3 1 6及EP 0 401 384。抗體物理性質本發明抗體可藉由其用以偵測及/或區分其不同種類的各種物理性質表徵。本發明抗體在輕鏈或重鏈可變區中可含有一或多個糖基化位點。此等糖基化位點可由於抗原結合改變而使抗體之免疫原性增強或改變抗體之pK值（Marshall等人（1972) 41:673-702 ; Gala及 Morrison (2004) / /m㈣⑽/ 172:5489-94 ; Wallick 等人（1988) 五xp 168:1099-109 ； Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R ；

Parekh 等人（1985) 316:452_7; Mimura 等人（2000)

Mo/ //wmwwo/ 37:697-706)。已知糖基化在含有 n-X-S/T序列之基元處發生。在一些情況下，較佳具有不含可變區糖基化之抗BTLA抗體。此可藉由選擇在可變區中不含糖基化基元之抗體或藉由使糖基化區域内之殘基突變來達成。在一較佳實施例中，本發明抗體不含天冬醯胺異構位點。天冬醯胺之脫醯胺作用可在N-G或D-G序列上發生且導致產生將扭接（kink)引入多肽鏈中且降低其穩定性（異天冬胺酸作用）之異天冬胺酸殘基。各抗體將具有獨特等電點（pi)，其一般在6與9.5之間的 pH值範圍内。IgGl抗體之pi值通常在7_9.5之pH值範圍内 149758.doc •77- 201121564 且IgG4抗體之pi值通常在6-8之pH值範圍内。推測pI值在正常範圍以外之抗體在活體内條件下可能具有一些伸展 (unfolding)及不穩定性。因此，較佳具有pI值在正常範圍内之抗BTLA抗體。此可藉由選擇#值在正常範圍内之抗體或藉由使帶電表面殘基突變來達成。各抗體將具有特徵性炼融溫度’較高熔融溫度指示在活體内總體穩定性較尚（Krishnamurthy R及Manning MC (2002) CwrP/iarm 价3:361-71)。一般而言，較佳 TM1 (初始伸展溫度）高於6〇°C、較佳高於65。(：、甚至更佳高於70°C。可使用差示掃描熱量測定（Chen等人（2003) P/zarm Λα 20:1952-60 ; Ghirlando 等人（1999) 68:47-52)或圓二色性（Murray 等人（2002) J. «Sc/ 40··343-9)來量測抗體之熔點。在一較佳實施例中，選擇不快速降解之抗體。可使用毛細管電泳法（CE)及MALDI-MS來量測抗體之降解 (Alexander AJ及 Hughes DE (1995) C/zew 67:3626-32)。在另一較佳實施例中，選擇具有最小聚集效應之抗體’ 該聚集效應可能會導致觸發不當免疫反應及/或改變或不利之藥物動力學性質。一般而言，可接受聚集為25%或 25%以下、較佳20〇/〇或20%以下、甚至更佳15%或15%以下、甚至更佳10%或10%以下且甚至更佳5%或5%以下的抗體。可利用若干技術來量測聚集，該等技術包括尺寸排阻管柱法（SEC)、高效液相層析法（HPLC)及光散射法。 149758.doc •78· 201121564 抗體接合物本發明抗BTLA抗體分子亦可接合於化學部分。化學部分可尤其為聚合物、放射性核種或細胞毒性因子。化學部 y刀較佳為增加抗體分子在個體體内之半衰期的聚合物。適合聚合物包括（但不限於）聚乙二醇（p]EG)(例如分子量為2 kDa、5 kDa、10 kDa、12 kDa、20 kDa、30 kDa或 40 kDa 之PEG)、聚葡萄糖及單曱氧基聚乙二醇（mpEG)。Lee等人 ’（1999)(Bioconj. Chem. 10:973-981)揭示 PEG 接合之單鏈抗體。Wen等人，（2001)(Bioconj. Chem. 12:545-553)揭示使抗體與連接於放射性金屬螯合劑（二伸乙三胺五乙駿 (DTPA))之 PEG接合。本發明之抗體及抗體片段亦可與以下標記接合 :諸如 99Tc、 9〇Υ、"丨In、32Ρ 、14C 、125I 、 3H、13丨 I、nc 、丨5o、 13N、 18F、35s、51Cr 、57To 、⑵Ra 、60c〇、59Fe、 57Se、 ,52Eu 、67CU、217Ci、 211At、 212Pb、 47Sc、 109Pd、 234Th、及40κ ' l57Gd ' 55Mn ' 52Tr 及 56Fe。本發明之抗體及抗體片段亦可與以下接合：螢光或化學發光標記，包括螢光團，諸如稀土螯合劑、螢光素及其衍生物、若丹明（rhodamine)及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅素（phycoerythrin)、藻藍蛋白（phycocyanin)、別藻藍蛋白 (allophycocyanin)、鄰苯二醛、胺螢（fluorescamine)、 152Eu、丹醯基、繳酮（umbelliferone)、蟲螢光素（luciferin)、魯米納爾標記（luminal label)、異魯米納爾標記（is〇iuminai label)、芳族吖旋酯標記、咪唑標記、吖錠鹽標記、草酸 149758.doc -79- 201121564 酯標記、水母素標記（aequorin label)、2,3-二氫酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記及穩定自由基。抗體分子亦可接合於細胞毒性因子，諸如白喉毒素 (diptheria toxin);綠膿桿菌外毒素 A 鍵 exotoxin A chain);蓖麻毒素 A鏈(ricin A chain); 相思子毒素A鏈（abrin A chain);莫迪素A鏈（modeccin A chain) ; a-帚麵菌素（alpha-sarcin);油桐（d/ewrz’/e·? /or山7) 蛋白質及化合物（例如脂肪酸）；康乃馨（dianthin)蛋白質；美洲商陸americana) ^ f PAPI ' PAPII 及 PAP-S，古瓜抑制劑（wowoni/ca inhibitor);麻瘋樹毒蛋白（curcin);巴豆毒素（crotin);肥皂草抑制劑 (saponar/a inhibitor);有絲分裂素（mitogellin); 侷限麴菌素（restrictocin);盼黴素（phenomycin)及依諾黴素 (enomycin) 〇可使用此項技術中已知用於將本發明抗體分子接合於各種部分的任何方法，包括Hunter等人，（1962) Nature 144.945，David專人 ’（1974) Biochemistry 13:1014 ; Pain 等人，（1981) J. Immunol. Meth. 40:219 及 Nygren，J_, (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407所述之方法。用於接合抗體之方法在此項技術中為習用的且極熟知。在其它實施例中，可將不同恆定域連接於來源於本文提供之CDR的人類化VL及VH區。舉例而言，若本發明抗體 (或片奴）之特疋預定用途要求改變效應功能，則可使用除 IgG1以外之重鏈恆定域或可利用雜交IgGl/IgG4。 149758.doc •80- 201121564 儘管IgGl抗體提供長半衰期及效應功能，諸如補體活化及抗體依賴性細胞毒性，但是此等活性可能並不為抗體之所有用途所需。在此等情況下，例如可使用IgG4恆定域。在hu Mab8D5中’ IgG4恆定域在位置1〇8(對應於EU系統中之位置228及KABAT系統中之位置241)處不同於天然人類 IgG4恆定域（Swiss-Prot寄存編號P01861.1)，其中天然 861*108經？1<〇置換以防止〇丫8 106與〇丫3 109(對應於£1；系統中之位置€丫8 226及0丫3 229及1^八8入丁系統中之位置€丫3 239及 Cys 242)之間的潛在鏈間二硫鍵，該潛在鏈間二硫鍵將會干擾適當鏈内二硫鍵的形成。參見Angal等人（1993)从〇/. /所训〇/. 30:1 05 〇對於 hu Mab21H6、hu Mab8A3、hu Mabl5C5、hu

Mabl9A7及hu Mab 20H4，表7中所述之序列係基於人類重鍵 IgG 1。疾病本發明亦提供用本發明之抗體或其抗原結合片段、較佳完全人類抗體來治療需要用經分離抗體或其抗原結合片段治療之個體（包括人類個體）的方法。此等個體可具有發炎性或自體免疫性病症，諸如發炎性腸道病症（例如克隆氏病、潰瘍性結腸炎及發炎性腸病）、發炎性纖維化（例如硬皮病、肺纖維化及肝硬化症）、類風濕性關節炎（ra)、骨關節炎、骨質疏鬆症、哮喘（包括過敏性哮喘）、過敏症、慢性阻塞性肺病（COPD)、多發性硬化症、牛皮癬、葡萄膜炎、移植物抗宿主疾病（GVHD)、青少年早發性〖型糖尿 149758.doc 201121564 病、移植排斥、SLE及修格連氏症候群。此等治療方法可進-步包含投與-或多種其它治療劑，諸如免疫抑制劑或消炎劑。舉例而言且不構成限制，藉由本文所述之方法來治療發炎性腸道病症。在一特別較佳實施例中，藉由本文所述之方法來治療克隆氏病及潰瘍性結腸炎。發炎性腸病（IBD) 腦為-組腸道變得發炎從而導致腹部痙攣及疼痛、腹瀉、體重減輕及腸道出血之病症（例如克隆氏病及潰瘍性結腸炎）的名稱。IBD影響超過60〇〇〇〇名美國人。克隆氏病之習知治療選擇包括柳氮磺胺吼啶、皮質類固醇（例如潑尼松（prednisone))、免疫系統抑制劑（諸如硫唑嘌呤及硫醇嗓吟（mercaptopurine))或抗生素（例如曱硝健唾 (metr〇nidazole))。治療性單株抗體治療包括依那西普 (etanercept)、那他珠單抗（naUlizumab)及英利昔單^ (infliximab)。本發明之抗BTLA抗體可用於治療需要此治療之個體中的IBD。本發明之抗BTLA抗體亦可與用於IBD之其它治療組合，該等其它治療例如IL-10(參見美國專利第5,368,854 號、第7,052,686號）、類固醇及柳氮磺胺吡啶。移植物抗宿主疾病（GVHD) 移植物抗宿主疾病（GVHD)為同種異體骨髓移植之常見併發症，其中所移植骨髓中之功能性免疫細胞將接受者識別為「外來物」且發動免疫攻擊。其亦可在某些情況下發生在輸血中。三個準則通常與GVHD相關： J49758.doc -82- 201121564 1)投與具有有活力及功能性之免疫細胞之有免疫能力移植物（immunocompetent graft); 2) 接受者在免疫方面迥異-組織不相容性；及 3) 接受者免疫功能不全且因此不能破壞或失活所移植細胞。在骨髓移植之後，存在於移植物中之T細胞在將宿主組織視為抗原性外來物時便攻擊移植接受者之組織。T細胞產生過量細胞激素，包括TNFa及干擾素-y(lFNg)。多種宿主抗原（尤其為人類白血球抗原（HLA))可引發移植物抗宿主疾病。然而’移植物抗宿主疾病可甚至在HLA相同之兄弟姐妹為供體時發生。HLA相同之兄弟姐妹或HLA相同之無關供體常具有在遺傳上不同之蛋白質（亦即次要組織相容性抗原），該等蛋白質可由MHC分子呈現至接受者之τ細胞，T細胞將此等抗原視為外來物且因此發動免疫反應。預期BTLA促效劑抗體將抑制對存在於接受者或宿主組織中之同種異體抗原（包括（但不限於）次要及主要組織相容性抗原）起反應之所移植T細胞及B細胞的活化、增殖及效藉助論束應功能。預期抑制此等移植物來源之丁細胞及B細胞可於其在細胞表面上表現BTLA而發生。儘管不受理強制接合（forced BTLA促效劑抗體缚，但是預期BTLA促效劑抗體將藉由 engagement)』來抑制致病性免疫反應。可例如藉由活化其它拍j告，丨4 — ^ 抑制14細胞（诸如調節性T細胞）或藉由調έ卩抗原呈現細舶f决p。卩祐七。4 兄，田腮不間接抑制致病性免疫反應。預期 BTLA促效劑抗體將單獨或盥倒^ M用於預防或治療移植物抗宿 149758.doc •83- 201121564 主疾病症狀之其它免疫抑制劑組合來遏制或抑制由來源於移植物之淋巴細胞所產生的抗宿主反應。在另一實施例中，本發明亦係關於治療方法，其包含與一或多種其它治療劑組合投與治療有效量之抗BTLA抗體或其抗原結合片段。舉例而言且不構成限制，一或多種治療劑包括抗 IL-23、IL-Ιβ、IL-6、TGF-β、CTLA4 融合蛋白、及小分子消炎藥，諸如黴酴酸嗎琳乙酯曱胺嗓呤（參見，例如 Veldhoen (2006) iwwwm'/y 24:179-1 89 ; Dong (2006) iWu· hv. 6⑷:329_333)或組合。在各種實施例中’一或多種其它治療劑在抗BTLA抗體或其抗原結合片段之前、與其並行或在其之後投與。另外’在某些實施例中，抗BTLA抗體或其抗原結合片段可與包括一或多種以下之任何組合之用於治療移植排斥的免疫抑制藥物組合投與：弼调神經磷酸酶（calcineurin)抑制劑（例如環孢素 (ciclosporin)及他克莫司（tacr〇iimus))、 mT〇R抑制劑（例如西羅莫司（sirolimus)及依維莫司 (everolimus))、抗增殖劑（例如硫唑嘌呤及黴酚酸）、皮質類固醇（例如潑尼龍（prednisolone)及氫皮質納 (hydrocortisone))、具有免疫抑制作用之抗體（例如單株抗IL-2Ra受體抗體’包括巴利昔單抗（basiUximab)及達利珠單抗 (daclizumab))、 149758.doc -84- 201121564 及多株抗T細胞抗體（例如抗胸腺細胞球蛋白（ATG)及抗淋巴細胞球蛋白（ALG))。本發明亦係關於本發明抗體或其抗原結合片段之組合物及調配物，其包含結合化合物及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑、及視情況選用之一或多種免疫抑制劑或消炎劑。實驗及診斷用途本發明之抗體及片段可用作親和力純化劑。在此過程中，使用此項技術中熟知之方法將抗體或片段固定在固相 (諸如葡聚糖凝膠（Sephadex)樹脂或濾紙）上。使經固定抗體或片段與含有欲純化BTLA蛋白質（或其片段）之樣品接觸，且其後用將移除樣品中實質上所有物質（結合於經固定抗體或片段之BTLA蛋白質除外）的適合溶劑洗滌支撐物。最終，用自管柱溶離所結合BTLA之溶劑（例如蛋白質 A)洗滌支撐物。此等經固定抗體形成本發明之一部分。本發明亦提供用於產生適用於例如進行本文論述之西方墨點法（Western blot)及其它免疫檢定之二次抗體的抗原。特定言之，本發明包括包含可用於產生抗BTLA或抗BTLA 二次抗體之可變區及/或CDR序列的多肽。經可偵測標記之抗 hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mabl9A7、hu Mab4C7 或抗 Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mabl9A7、hu Mab4C7二次抗體在本發明範疇内。抗BTLA抗體或其片段亦可適用於BTLA蛋白之診斷檢定中，例如偵測其在特定細胞、組織或血清中之表現。此等 149758.doc -85- 201121564 診斷方法可適用於各種疾病診斷中。舉例而言’本發明實施例包括合併使用本發明抗ΒτχΑ 抗體或其片段之ELISA檢定（酶聯結免疫吸附劑檢定）。舉例而言’在本發明之一實施例中’此種方法包含以下步驟： (a) 用抗BTLA抗體或其抗原結合片段塗佈基板（例如微量滴定板孔之表面，例如塑膠板）； (b) 將欲測試BTLA之存在的樣品施加於基板； (c) 洗蘇板以移除樣品中未結合之物質； (d) 施加亦對BTLA抗原具有特異性之經可偵測標記的抗體（例如酶聯結抗體）； (e) 洗務基板以移除未結合之經標記物質； (f) 若經標s己抗體為酶聯結抗體’則施加可由該酶轉化成螢光信號之化學品；及 (g) 偵測經標記抗體之存在。在本發明之一實施例中，用與ABTS(例如2,2,_次偶氮基_ 雙（3 -乙基笨并嗟吐琳-6-績酸））或3,3’，5,5，-四甲基聯苯胺反應產生可偵測之顏色變化的過氧化酶來標記經標記抗體。或者，用可利用閃爍計數器在閃爍體存在下偵測的可偵測放射性同位素（例如3H)來標記經標記抗體。本發明抗 BTLA抗體可用於西方墨點或免疫蛋白質墨點程序中。此種程序形成本發明之一部分且包括例如： (1)使欲測試結合BTLA或其片段存在的膜或其它固體基板與本發明抗BTLA抗體或其抗原結合片段接觸^此種 149758.doc -86- 201121564 膜可採用確化纖維素膜或基於乙烯基（例如聚偏二氟乙烯 (PVDF))膜之形式’其中欲在非變性pAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳）凝膠或SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳）凝膠中測試BTL A存在之蛋白質已轉移（例如在凝膠中電泳分離之後）至該膜上。在使膜與抗Btl A抗體或片段接觸之前’視情況例如用脫脂乳或其類似物來阻斷該膜以便結合膜上的非特異性蛋白質結合位點。 (2) 洗務膜一或多次以移除未結合抗btlA抗體或片段及其它未結合物質；及 (3) 请測結合之抗BtLa抗體或片段。可藉由用經可偵測標記之二次抗體（抗免疫球蛋白抗體）結合抗體或片段且接著偵測該二次抗體之存在來偵測結合之抗體或片段。本發明抗BTLA抗體及其抗原結合片段亦可用於免疫組織化學。此種方法形成本發明之一部分且包含例如（丨）使欲測試BTLA之存在的細胞與本發明抗btlA抗體或其抗原結合片段接觸；及（2)偵測該細胞上或該細胞中之抗體或片段。若抗體或片段自身經可偵測標記，則可直接對其進行偵測。或者’抗體或片段可用所偵測之經可偵測標記的二次抗體結合。本發明之某些抗BTLA拮抗劑抗體及其抗原結合片段亦可用於活體内腫瘤成像。此種方法形成本發明之一部分且可包括將本發明之經放射性標記之抗BTLA抗體或其抗原 149758.doc

S 201121564 結合片段注射至欲測試與BTLA表現相關之腫瘤存在的患者體内，隨後對患者身體進行核成像以偵測例如在包含高濃度之結合於腫瘤之抗體或片段的基因座處經標記抗體或片段之存在。成像技術包括SPECT成像（單光子發射電腦斷層攝影術）或PET成像（正電子發射斷層攝影術）。標記包括例如碘-123(1231)及鍩-99m(99mTc)(例如與SPECT成像聯合）或UC、 13N、150或18F(例如與PET成像聯合），或銦-111(參見例如 Gordon等人，（2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440)。套組本發明亦提供包含呈套組形式之本發明組合之組分的套組。本發明套組包括一或多種組分，包括（但不限於）如本文所論述特異性結合BTLA的結合組合物（例如促效劑抗體 hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6或 hu Mabl9A7，或拮抗劑抗體hu Mab4C7)，以及一或多種其他組分，包括 (但不限於）如本文所論述之醫藥學上可接受之載劑及/或化學治療劑。結合組合物及/或化學治療劑可調配成純組合物或與醫藥學上可接受之載劑組合調配於醫藥組合物中。在一實施例中，套組包括於一容器（例如在無菌玻璃或塑膠小瓶中）中之本發明結合組合物（例如促效劑抗體hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6或 hu Mab 19A7，或括抗劑抗體hu Mab4C7)或其醫藥組合物，及於另一容器（例如在無菌玻璃或塑膠小瓶中）中之其醫藥組合物及/或化學 149758.doc •88- 201121564 治療劑。在本發明之另一實施例中，套組於單一共同容器中包含本發月之組合，包括結合組合物組分㈠列如促效劑抗體hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu 仏⑵則或 hu ，或括抗劑抗體hu Mab4C7)連同醫藥學上可接受之載劑，視情況或夕種化‘冶療劑組分組合調配在一起，視情況調配於醫藥組合物中。若套組包括用於非經腸投與個體之醫藥組合物，則該套組可包括用於進行此投藥之裝置。舉例而$，套組可包括如上所論述之一或多種皮下注射針或其它注射裝置。套組可包括藥品說明書，包括關於該套組中醫藥組合物及劑型之資訊。一般而言，★匕資訊有助於患者及醫師有效且安全地使用所包裝之醫藥組合物及劑型。舉例而言，可在藥品說明書中提供以下關於本發明組合之資訊：藥物動 ^學、藥效學、嘆床研究、功效參數、適應症及用法、禁忌、警告、預防措施、不良反應、過量劑量、適當劑量及投藥、如何供給、適#儲存條件、參考文獻、製造商/經銷商資訊及專利資訊。醫藥組合物及投藥為了製備本發明抗huBTLA抗體之醫藥組合物或無菌組合物，將抗體與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合。參 I，例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences and u.s.

Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing

Company，Easton, PA (1984)。 149758.doc 89- 201121564 治療劑及診斷劑的調配物可藉由與可接受載劑、賦形劑或穩定劑混合製備成例如凍乾粉末、漿料、水溶液或懸浮液形式（參見’例如Hardman等人（2001) Goot/waί/

Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics， McGraw-Hill, New York, NY ； Gennaro (2000) Remington:

The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins，New York, NY ; Avis 等人（編）（1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker，NY ; Lieberman等人（編）（1990) P/mrmacewi/ca/ Γαά/eij·，Marcel Dekker, NY ; Lieberman等人（編）（1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse 办siewi，Marcel Dekker, NY ; Weiner 及 Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York，NY)。在一實施例中，本發明抗BTLA抗體用pH 5-6 之乙酸鈉溶液稀釋至適當濃度，且添加NaCl或蔗糖調節張力。可添加諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80之其它試劑來增強穩定性。單獨或與另一藥劑組合投與之抗體組合物之毒性及治療功效可藉由細胞培養物或實驗動物中例如用於測定ld50 (致死50%群體之劑量）及ED5Q(在50%群體中治療有效之劑量）的標準醫藥程序來測定。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數（LD5G/ED5())。顯示高治療指數之抗.體較佳。自此等細胞培養檢定及動物研究獲得之資料可用於調配在人類中使用的劑量範圍。此等化合物之劑量較佳處於 149758.doc •90- 201121564 包括具有極小或無毒性之ed之循 5〇κ盾裱濃度的範圍内。劑量可在視所用劑型及投藥途徑在此範圍内變化。投藥模式可改變。適當投藥途#包括經口、經直腸、經黏膜或腸内投藥；非經腸傳遞，包括_、皮下、髓内注射以及朝内、直接心室内、靜脈内、腹膜内、鼻内或眼内注射藥可以多種習知方式進行，諸如口服攝取、吸入、吹入、局部施用或皮膚、經皮、纟下、腹膜内、非經腸、動脈内或靜脈内注射。靜脈内投與患者較佳。 &或者’可以局部而非全身性方式投與抗體，例如藉由通 “儲積ϋ或持續釋放調物形式將抗體直接注射至關節炎關即或特徵為免疫病理學之病原體誘發之病變中。此外’可以乾向藥物傳遞系統、例如以塗有乾向例如關節炎關即或特徵為免疫病理學之病原體誘發病變之組織特異性抗體的脂質體來投與抗體。月旨f體將乾向患病組織且由患病組織選擇性吸收。投藥方案視若干因素而定，包括治療性抗體之血清或组織週轉率、症狀程度、治療性抗體之免疫原性及生物基質中目標細胞之可達性。較佳地，投藥方案傳遞充足治療性抗體來貫現目標疾病病況之改善，而同時使不合需要之副作用降至最小。因此，所傳遞生物製劑之量部分視特定治療性抗體及所治療病狀之嚴重性而定。可獲得關於治療性抗體之適當劑量之選擇的指南（參見，例如Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy^ Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK ； Kresina (編）（1991) Monoclonal 149758.doc 91 201121564

Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY ； Bach (，編）（1993) Monoclonal Antibodies and JDbeajes, Marcel Dekker， New York，NY ; Baert 等人（2003) 五《g/. ·/. Mec/. 348:601-608 ; Milgrom 等人（1999) £叹/. «/. Med. 341:1966-1973 ; Slamon 等人（2001) J. Mec?· 344:783-792 ; Beniaminovitz等人（2000) J. Mei 342:613-619 ; Ghosh 等人（2003) New J. Met/. 34L24- 32 ; Lipsky 等人（2000) TVew 五《容/· /· jv/e£/ 343:1594· 1602) 〇由臨床醫師例如使用此項技術中已知或懷疑會影響治療之參數或因素來確疋適當劑量。一般而言，劑量始於稍小於最佳劑量之量且此後以小增量增加直至相對於任何消極副作用遠成所要或最佳作田。击® a- ~ e t ...

吸入來提供。 I·、直腸、肌肉内總每週劑量為通、大腦内、脊椎内或藉由常每公斤體重至少0.05微 149758.doc •92- 201121564 克、更通常至少 0.2 pg/kg、0.5 pg/kg、1 pg/kg、10 pg/kg、100 pg/kg、0.25 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、 5.0 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg或 50 mg/kg以上（參見，例如 Yang等人（2003) 五《g/· 乂 Md 349:427- 434 ; Herold 等人（2002) £叹/. J. Mec/. 346:1692- 1698，Liu等人（1999) J. A^ewro/. TVewroswrg. 67:451- 456 , Portielji 等人(20003) Cimcer /mmw«o/. 52:133-144)。亦可提供劑量來達成抗btLA抗體在個體血清中之預定目標濃度，諸如0.1、〇.3、1、3、10、30、 100、3 00 pg/ml或3〇〇 eg/ml以上。在其它實施例中，本發明之完全人類BTLA抗體以每個個體1〇、20、50、80、 100、200、500、1〇〇〇或 2500 mg 每週、每兩週或「每 4 週」皮下或靜脈内投與一次。如本文所用，「抑制」或「治療」包括延緩與病症相關之症狀的發展及/或降低此病症之症狀的嚴重性。該等術語進一步包括改善現有不受控制或不當之症狀、預防其它症狀及改善或預防此等症狀之潛伏病因。因此，該等術語表示已賦與患有病症、疾病或症狀或可能發展此種病症、疾病或症狀之脊椎動物個體以有益結果。如本文所用’術語「治療有效量」、「治療有效劑量」及「有效量」係指當單獨或與另一治療劑組合投與細胞、組織或個體時，有效預防或改善疾病或病狀之—或多種症狀或此疾病或病狀之進展之本發明BTLA結合化合物的量。治療有效劑量進一步指足以使症狀改善（例如治療、治 149758.doc -93- 201121564 癒、預防或改善相關醫學病妝 )或使此專病狀之治療、治癒、預防或改善率增加之έ士人人，，之π合化合物的量。當應用於單獨投與之個別活性成分時，治療有效劑量係指彼單獨成分。當應用於組合時’治療有效劑量係指無論是組合、連續抑或同時投藥’產生該治療作用之活性成分的組合量。治療劑之有效量將使診斷指標或參數改良至少1〇% ;通常至少 20%，較佳至少約3G% ;更佳至少4()%且最佳至少5〇%。與第二治療劑，例如細胞激素、另一治療抗體、類固

醇、化學治療劑或抗生素共投與之方法在此項技術中為熟知的，參見，例如Hardman 等人（編）（2〇〇1) G〇〇dman afjd Gilman's The PharmaC〇l〇gical Basis 〇fTherapeutics，第版，McGraw-Hill，New Y〇rk，NY ; p〇〇le 及 peters〇n PharmaC〇therapeutics for Adv_ed practice: A

Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., 少，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA。本發明醫藥組合物亦可含有免疫抑制劑或免疫調節劑。可使用任何適合免疫抑制劑，包括（但不限於）消炎劑、皮質類固醇、環孢靈（cyclosporine)、他克莫司（亦即fk-506)、西羅莫司、干擾素、可溶性細胞激素受體（例如sTNRF及sIL-1R)、中和細胞激素活性之藥劑（例如英利昔單抗、依那西普）、黴酚酸嗎啉乙酯、15-去氧斯匹胍素（15-deoxyspergualin)、沙立度胺（thalidomide)、格拉替雷 (glatiramer)、硫嗤嗓吟、來氟米特（leflunomide)、環磷醯

S 149758.doc -94- 201121564 胺、甲胺喋呤及其類似物。醫藥組合物亦可與其它治療模態一起使用，諸如光電治療術及輻射。本發明BTLA結合化合物亦可與一或多種其它細胞激素的促效劑或拮抗劑（例如抗體）組合使用，包括（但不限於） IL-23、IL-Ιβ、il-6、CTLA-4、CTLA-4/Ig融合物及 tgf-β。參見’例如 Veldhoen (2006) 少 24:179-189 ;

Dong (2006) Λ/αί. /wmwwo/· 6(4):329-333。在各種實施例中’本發明BTLA結合化合物可在投與其它促效劑或拮抗劑之前、與其並行或在其之後投與。在一實施例中，本發明BTLA結合化合物單獨或與IL-23拮抗劑組合用於治療急性早期不良免疫反應（例如MS、克隆氏病、青少年早發性1型糖尿病）。在後一情況下，可逐漸減少BTLA結合化合物且繼續僅用IL-23拮抗劑進行治療以維持對不良反應之遏制。或者’可與本發明BTLA結合化合物並行、在其之前或在其之後投與IL-Ιβ、IL-6及/或TGF-β之拮抗劑。參見

Cua及 Kastelein (2006) /wmwno/· 7:557-559 ; Tato及 O'Shea (2006) 441:166-168 ; Iwakura 及 lshigame (2006) TVzvesi. 1 16:1218-1222。典型獸醫學、實驗或研究個體包括猴、犬、貓、大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、馬及人類。用途本發明提供使用經工程改造之抗BTLA抗體來治療及診斷發炎性病症及病狀以及自體免疫性及增生性病症的方法。提供診斷、預防或治療發炎性腸病（IBD.)、多發性硬 149758.doc -95· 201121564 化症（MS)、慢性阻塞性肺病（COPD)、囊性纖維化（CF)、牛皮癣、全身性硬皮病、GVHD、同種異體移植排斥反應、SLE、修格連氏症候群、青少年早發性I型糖尿病、自體免疫性心肌炎及腹膜黏著之方法（參見，例如Chung等人 (2002)丄五xp. Med. 195:1471-78)。在某些實施例中，特異性結合於人類BTLA之本發明抗體或抗原結合片段可用於增加、增強、刺激或上調與 BTLA活性相關之免疫反應。在某些實施例中，不阻斷 BTLA與HVEM之結合的本發明抗體（例如促效劑抗體Hu Mab8D5、huMab8A3)在治療上用於穩定有延長BTLA活性需要之個體中的BTLA。抗BTLA促效劑抗體（例如Hu Mab8D5、huMab8A3、hu Mab21H6 及 hu Mabl9A7)活化 BTLA之抑制性受體功能°將受益於此治療之個體包括罹患以下發炎性或自體免疫性病症的患者：諸如發炎性腸道病症（例如克隆氏病、潰瘍性結腸炎及發炎性腸病）、發炎性纖維化（例如硬皮病、肺纖維化及肝硬化症）、類風濕性關節炎（RA)、骨關節炎、骨質疏鬆症、哮喘（包括過敏性哮喘）、過敏症、慢性阻塞性肺病（COPD)、多發性硬化症、牛皮癬、葡萄膜炎、移植物抗宿主疾病（GVHD)、青少年早發性I型糖尿病、移植排斥、SLE及修格連氏症候群。此等治療方法可進一步包含投與一或多種其它治療劑，諸如免疫抑制劑或消炎劑。類風濕性關節炎（RA) RA為特徵為滑膜關節發炎之進行性全身性疾病，其影 149758.doc -96- 201121564 響世界人口之約 0.5%。參見 Emery (2006) J?Μ/ 332:152-1 5 5。關節發炎可導致畸形、疼痛、僵硬及腫脹且最終導致關節之不可逆退化。受影響關節包括膝、肘、頸及手及腳之關節。習知治療涉及使用NSAID來減輕症狀，隨後投與改善疾病之抗風濕病藥物（DMARD)，諸如金、青黴胺 (penicillamine)、柳氮績胺吡啶及曱胺喋呤。新近進展包括用TNF-α抑制劑進行治療，TNF-α抑制劑包括單株抗體 (諸如英利昔單抗、阿達木單抗（adalimumab)及戈利木單抗 (golimumab))及受體融合蛋白（諸如依那西普）。用此等 TNF-α抑制劑進行治療顯著減少由疾病導致之結構損傷。本發明抗BTLA促效劑抗體可用於治療需要此治療之個體中的RA。本發明抗BTLA抗體亦可與用於rA的其它治療組合’例如曱胺喋呤、硫唑嘌呤、環磷醯胺、類固醇、黴酚酸嗎啉乙酯、NSAID或TNF-α抑制劑（抗體或受體片段）。在—實施例中’本發明抗BTLA抗體用於治療先前對單獨用DMARD治療反應不足的人類個體。在另_實施例中，用本發明抗BTLA抗體治療始於疾病過程早期，而不要求先前DMARD療法失效。例如只要抗體療法之安全性已穩固確立’則此早期介入可為適當的。如實例18中更詳細描述，藉由確定ACR得分來量測臨床改良。在各種實施例中，ACR得分為2〇、5〇及7〇為所要終點，且此等終點可在治療過程中之任何適當時點（諸如5、 10 1 5 ' 24、40、50週或5〇週以上）評估。 149758.doc -97. 201121564 發炎性腸病（IBD) IBD為腸變得發炎從而導致腹部痙攣及疼痛、腹瀉、體重減輕及腸出血之一組病症（例如克隆氏病及潰瘍性結腸炎）的名稱。IBD影響超過600,000名美國人。克隆氏病之習知治療選擇包括柳氮磺胺吡啶、皮質類固醇（例如潑尼松）、免疫系統抑制劑（諸如硫唑嘌呤及硫醇嘌呤）或抗生素 (例如曱硝噠唾）。治療性單株抗體治療包括依那西普、那他珠單抗及英利昔單抗。本發明抗BTLA促效劑抗體可用於治療需要此治療之個體中的IBD。本發明抗BTLA促效劑抗體亦可與用於18〇之其它治療組合’例如IL-10(參見美國專利第5,368,854號、第7,052,686號）、類固醇及柳氮磺胺吡啶。牛皮癖皮膚充當内部環境與外界環境之間的重要邊界，防止與潛在有害抗原接觸。在抗原/病原體渗透之情況下，誘導發炎性反應以消除抗原。此反應導致產生主要由T細胞、多形核細胞及巨噬細胞組成的皮膚滲入物（參見，例如

Williams及 Kupper (1996) h/e <Scz··，58:1485-1507)。通常，由病原體觸發之此發炎性反應受到緊密控制且在消除病原體之後停止。 .在某些情況下’此發炎性反應在無外部刺激及無適當控制下發生，導致皮膚發炎。本發明提供治療及診斷皮膚發炎之方法。由上述細胞滲入物以及自此等細胞分泌之細胞激素所導致的皮膚發炎涵蓋若干發炎性病症，諸如瘢痕類 149758.doc -98- 201121564 天癌瘡、硬皮病、化腹性汗腺炎（hidradenitis suppurativa)、中毒性表皮壞死溶解、痤瘡、骨炎、移植物抗宿主疾病 (GvHD)、壞殖性腹皮症（pyroderma gangrenosum)及貝赛特氏症候群（Behcet's Syndrome)(參見，例如 Williams 及 Griffiths (2002) Ch·«•五x/7. 27:585-590)。最常見形式之皮膚發炎為牛皮癬。牛皮癬之特徵為T細胞介導的連同發炎性渗入物之角質化細胞之過度增殖。疾病具有某些明顯重疊的臨床表型，包括慢性斑塊病變、皮膚出疹及膿皰病變（參見，例如

Gudjonsson 等人（2004) £印· /mwwwo/. 135:1·8)。約 10%牛皮癖患者發生關節炎。該疾病具有強烈但複雜之遺傳素因’在同卵雙胞胎中一致性達600/ρ 典型牛皮癬病變為明確確定之由厚的銀色垢狀物覆蓋的紅斑性斑塊。牛皮癣組織之發炎及過度增殖與不同於正常皮膚之組織、抗原及細胞激素概況相關。與牛皮癬相關之細胞激素有：丁灿(1、11^19、11^18、11^15、江-12、比-7、IFNY、IL-17A 及 IL-23(參見 Gudjonsson等人，同上文）。本發明抗BTLA抗體亦可單獨或與其它藥劑組合用於預防、治療、診斷及預測牛皮癖發作。全身性紅斑狼瘡（SLE) 紅斑狼瘡為一種結締組織疾病。狼瘡為一種在身體免疫系統攻擊其自身組織及器官時發生的慢性發炎疾病。由狼瘡引起之發炎可影響許多不同身體系統，包括關節 '皮膚、腎、血球、心臟及肺。狼瘡在女性中發生頻率高於男 149758.doc •99· 201121564 性，但此原因未知。存在四種類型的狼瘡一全身性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、藥物誘發之紅斑狼瘡及新生兒狼瘡。其中’全身性紅斑狼瘡為狼瘡之最常見且嚴重形式。在某些實施例中’本發明抗BTLA促效劑抗體可用於治療狼瘡於需要此治療之個體。抗BTLA抗體可與狼瘡的其它治療組合’包括NSAID、某些抗瘧疾藥物（例如羥氣奎及皮質類固醇）、免疫抑制藥物（例如環磷醯胺（Cyt〇xan)&硫唑嘌呤（Imuran)及黴酚酸嗎琳乙酯（CeiiCept))、利妥昔單抗及去氫表雄固酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA)。修格連氏症候群為導致乾眼病及口乾之另一慢性病症。在某些實施例中，本發明抗BTLA抗體可適用於治療患有修格連氏症候群之個體。本發明抗BTLA^^體亦可與用於修格連氏症候群的其它治療組合，類似於狼瘡所述。多發性硬化症（MS) MS被認為是一種涉及神經纖維喪失髓鞘而產生斑塊或病變的中樞神經系統（CNS)之自體免疫疾病。最常見形式為復發/緩解型MS，其中發生明確之症狀發作，隨後為部分或完全緩解之時期。f知治療選擇包括干擾素々 Μα 、米托蒽醌（mitoxantr〇ne) 、四肽乙酸格拉替雷、治療性 cx-4-整合素特異性抗體（那他珠單抗）或㈠整合素之小分子拮抗劑（例如W02003/084984中揭示者）。在某些實施例中，本發明抗BTLA促效劑抗體可用於治療MS於需要此治療之個體。抗飢人抗體亦可與ms的其它治療組合’例如干擾素_β、干擾素-、類固醇或“·整合 149758.doc -100· 201121564 素特異性抗體。癌症本發明拮抗劑抗體或抗原結合片段（例如hu Mab4C7)可用於治療癌症（亦即抑制腫瘤細胞之生長或存活）。可使用本發明拮抗劑抗體抑制生長的較佳癌症包括通常對免疫療法有反應之癌症，但亦包括迄今尚未與免疫療法相關聯之癌症。所治療較佳癌症之非限制性實例包括黑色素瘤（例如轉移性惡性黑色素瘤）、腎癌（例如透明細胞癌）、前列腺癌（例如激素難治性前列腺癌）、胰腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例如非小細胞肺癌）、食道癌、頭部及頸部之鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤'神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤及其它贅生性惡性疾病。另外’本發明包括可使用本發明抗體抑制生長的難治性或復發性惡性疾病。本發明拮抗劑抗體或抗體片段可單獨或與以下藥劑組合使用：其它抗贅生劑或免疫原劑（例如減毒癌細胞、腫瘤抗原（包括重組蛋白質、肽及碳水化合物分子）、經腫瘤來源之抗原或核酸脈衝處理的抗原呈現細胞（諸如樹突狀細胞）、免疫刺激細胞激素（例如IL-2、IFNa2、GM-CSF)、及用編碼諸如（但不限於）GM_CSF之免疫刺激細胞激素之基因轉染的細胞）；標準癌症療法（例如化學療法、放射線療法或手術）；或其它抗體（包括（但不限於）針對以下之抗體：VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受體、其它生長因子受體、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-IBB、pd]、 149758.doc -101 - 201121564 PD-Ll、CTLA-4、ICOS、及負性調控路徑中之其它分子）。感染性疾病本發明拮抗劑抗體或抗原結合片段（例如hu Mab4C7)亦可用於預防或治療感染及感染性疾病。抗體或抗體片段可單獨或與疫苗組合用於刺激對病原體、毒素及自身抗原的免疫反應。抗體或其抗原結合片段可用於刺激對可感染人類之病毒的免疫反應’諸如（但不限於）人類免疫缺乏病毒；A型、B型及C型肝炎病毒；艾泊斯坦巴爾病毒 (Eppstein Barr Virus)、人類細胞巨大病毒、人類乳頭狀瘤病毒、疱疹病毒。抗體或其抗原結合片段可用於刺激對細菌性或真菌性寄生物及其它病原體之感染的免疫反應。疫苗接種佐劑本發明拮抗劑抗體或抗原結合片段（例如hu Mab4C7)可與其它重組蛋白及/或肽（諸如腫瘤抗原或癌細胞）聯合使用以增強對此等蛋白質的免疫反應（亦即用於疫苗接種方案中）。舉例而言，在某些實施例中，抗BTLA拮抗劑抗體及其抗體片段可藉由將抗BTLA抗體與相關抗原（例如疫苗）共投與而用於刺激抗原特異性免疫反應。因此，在另一態樣中’本發明提供增強個體中對抗原之免疫反應的方法，其包含投與該個體；⑴該抗原；及（u)本發明之抗BTLa抗體或其抗原結合片段，以使該個體中對該抗原之免疫反應得以增強。抗原可為例如腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或 149758.doc -102· 201121564 病原體之抗原。此等抗原之非限制性實例包括（但不限於）腫瘤抗原、或病毒、細菌或其它病原體之抗原。

Th2介導之疾病在某些實施例中，本發明抗BTLA拮抗劑抗體及抗體片段（例如hu Mab4C7)亦可用於治療Th2介導之疾病，諸如哮喘及過敏。此係基於本發明抗體可幫助誘導Thl反應之發現。因此，本發明抗體可用於Th2介導之疾病中來產生更平衡之免疫反應。 T細胞之離體活化在某些實施例中，本發明抗體及抗原片段（例如hu Mab4C7)亦可用於才几原肖異性τ細胞之離體活化及擴增及將此等細胞授受轉移至接受者中以增加對抗腫瘤的抗原特八性T、，’®胞此等方法亦可用於活化T細胞對感染物（諸如 CMV)之反應。可預期在抗BTLA抗體存在下進行離體活化將使杈受轉移之T細胞的頻率及活性增強。其它組合療法如先前所述，本發明抗BTLA抗體可與—或其它多種治療劑-起共投與’例如細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑°抗體可連接至藥劑（呈免疫複合物形式）或可與藥劑分開投與。在後—情況（分開投藥）下，抗體可在藥劑之前、之後或與其並行投與或可與其它已知療法共投與。本發明抗體及抗原結合片段亦可用於增強供體接枝腫瘤特異性T細胞的功效。可在不脫離本發明之精如熟習此項技術者所顯而易知 149758.doc 201121564 神及範疇下對本發明進行許多修改及變化。本發明由隨附申請專利範圍之條款以及此申請專利範圍所賦予之等效物的全部範疇一起界定。本文所述之特定實施例（包括以下貫例）僅以貫例方式提供且本發明之範疇不受其細節限制。一般方法刀子生物學中之標準方法已有描述（Maniatis等人（1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；

Sambrook及 Russell (2001) Mo/ecw/ar 第 3 版，

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ; Wu (1993) ⑼，第 217卷，Academic

Press，San Diego, CA)。標準方法亦出現在Ausbel等人 (2QQ1) Current Protocols in Molecular Biology，第卷， John Wiley and Sons，Inc, New York，NY 中，其描述細菌細胞中之選殖及DNA突變誘發（第1卷）、哺乳動物細胞及酵母中之選殖（第2卷）、糖接合物及蛋白質表現（第3卷）及生物資訊學（第4卷）。蛋白質純化方法’包括免疫沈澱法、層析法、電泳法、離心法及結晶法已有描述（Coligan等人（2000)

Protocols ，第 1 卷，John Wiley and

Sons，Inc.，New York)。蛋白質之化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白產生、糖基化已有描述（參見，例如 Coligan ^ A (2000) Current Protocols in Protein Science » 149758.doc -104- 201121564 第 2卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York ; Ausubel等人[2001) Current Protocols in Molecular Biology，第 3 卷， John Wiley and Sons，Inc.，NY，NY，第 16.0.5-16.22.17 頁； Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science iiesearc/z，St· Louis, MO ;第 45-89頁；Amersham Pharmacia Biotech (2001) Piscataway, N.J.，第 384-391 頁）。多株及單株抗體之產生、純化及斷裂已有描述 (Coligan 等人（2001) Cwrrewi Proico/·? h ，第 1 卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York ; Harlow及 Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ; Harlow及Lane，同上文）。可獲得表徵配位體/受體相互作用之標準技術（參見，例如 Coligan等人（2001) Cwrrewi ZVoioco/·? ζ·« /mmwno/ogy，第 4 卷，John Wiley, Inc·，New York) ° 可製備單株、多株及人類化抗體（參見，例如Sheperd及 Dean ( ^ )(2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York，NY ; Kontermann 及 Dubel (編）（2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag，New York ; Harlow Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY * 第 139-243 頁；Carpenter等人（2000) «/. 165:6205 ;

He 等人（1998) J. 160:1029; Tang 等人（1999) J.

Biol. Chem. 274:27371-27378 ； Baca 等人（1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684 ; Chothia 等人（1989) iVaiwre 149758.doc -105- 201121564 342:877-883 ； Footed Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499 ;美國專利第6,329,51 1號）。

人類化之替代方案為使用呈現於噬菌體上之人類抗體文庫或轉殖基因小鼠中之人類抗體文庫（Vaughan等人（1996) Nature Biotechnol. 14:309-314 ^ Barbas (1995) Nature MecZ/c/ne 1:837-839 ; Mendez 等人（1997) iVaiwre Geneiics 15:146-156 ； HoogenboomA Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377 ; Barbas等人（2001) P/zage J

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，New York ; Kay 等人（1996) P/zage Dz'sp/a;; 〇/ Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press，San Diego, CA ; de Bruin 等人（1999) iVaiwre Biotechnol. \7:397-399)。單鏈抗體及微型雙功能抗體已有描述（參見，例如 Malecki 等人（2002) Jcrai *Scz·· 99:213_ 218 ； Conrath 等人（2001) J. Biol. Chem. 276:7346-73 50 ； Desmyter 等人（2001) ·/. 5io/. C//em. 276:26285-26290 ; Hudson^Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189^. 美國專利第4,946,778號）》雙功能抗體已有提供（參見，例如 Mack 等人（1995) Proc. iVa". jcai Sci. £75^4 92:702卜 7025 1 Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15 i Volkel 等人（2001) /Voiei«五《gz’weerkg· 14:8 15-823 ; Segal 等人 (2001) ·/· /wmwwo/· 248:1-6 ; Brennan 等人（1985)

Science 229:81-83 ; Raso 等人（1997) ·/· C/zewi. 149758.doc -106- 201121564 272:27623 ； Morrison (1985) Science 229:1202-1207 ；

Traunecker 等人（1991)五·/. 10:3655-3659及美國專利第 5,932,448號、第 5,532,210號及第6，129,914號）。雙特異性抗體亦有提供（參見，例如Azzoni等人（1998) 乂 Immunol. 161:3493 ; Kita 等人（1999) 乂 162:6901 ; Merchant 等人（2000) «/.仏σ/. C/zew. 74:9115 ; Pandey 等人（2000) J. 5ζ·〇/. C/zew. 275:38633 ; Zheng 等人 (2001) 乂 5/o/ C〜w· 276:12999 ; Propst 等人（2000)乂 Immunol. 165:2214 , Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875)。抗原之純化不為產生抗體所必需。可用攜帶相關抗原之細胞來免疫動物。接著可自經免疫動物分離脾細胞，且可使該等脾細胞與骨髓瘤細胞株融合以產生融合瘤（參見，例如 Meyaard 等人（1997) 7:283-290; Wright 等人 (2000) 13:233-242 ; Preston 等人，同上文；

Kaithamana 等人（1999) 乂 163:5 157-5 164)。可使抗體接合於例如小藥物分子、酶、脂質體、聚乙二醇（PEG)。抗體適用於治療、診斷、套組或其它目的，且包括偶合至例如染料、放射性同位素、酶或金屬（例如膠體金）之抗體（參見，例如Le Doussal等人（1991) /· /所臟⑽/. 146:169-175 ; Gibellini 等人（1998) j /w卿㈣厂 160:3891-3898 ； Hsing ^ Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811 ; Everts 等人（2〇〇2) /卿,168:883_ 889)。 149758.doc •107· 201121564 可獲得用於流動式細胞測量術（包括螢光活化細胞淘選 (FACS))之方法（參見，例如Owens等人（1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ *» Givan (2001) Flow ，第 2 版；Wiley-Liss，Hoboken, NJ ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ)。可獲得適於修飾用作例如診斷試劑之核酸 (包括核酸引子及探針）、多肽及抗體的螢光試劑 (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR ； Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis，MO)。免疫系統之組織學之標準方法已有描述（參見，例如 Muller-Harmelink (編）（1986) TTzymM·?.· awe? Ραί/ζο/ο呈少，Springer Verlag，New York，NY ; Hiatt等人 (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins，Phila，PA ; Louis 等人（2002) /fbio/og少·· rexi awe/ di/as，McGraw-Hill, New York, NY) 0 可獲得用於確定例如抗原片段、前導序列、蛋白質摺疊、功能域、糖基化位點及序列比對之套裝軟體及資料庫 (參見，例如 GenBank，Vector NTI® Suite(Informax，Inc, Bethesda, MD) ； GCG Wisconsin Package(Accelrys, Inc., San Diego，CA) ; DeCypher® (TimeLogic Corp” .Crystal Bay, Nevada) ; Menne 等人（2000) 16: 741- 742 ； Menne 等人（2000) Bioinformatics Applications Note 149758.doc -108- 201121564 16:741-742 ; Wren 等人（2002) Mei/zoc/5 /Vograms

Biomed. 68:177-181 i von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21 ； von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690) 〇實例1 完全人類BTLA抗體使用Medarex Inc.之UltiMAb抗體產生平台，藉由用過度表現膜結合huBTLA及huBTLA-Fc融合蛋白之CHO細胞於 MPL®+TDM佐劑中的組合免疫小鼠來產生對人類BTLA具有特異性之完全人類單株抗體。用BTLA-Fc融合蛋白或表現顯示成熟細胞外域（SEQ ID NO:35之殘基31-152)之膜結合BTLA的細胞來免疫小鼠。此序歹丨J對應於在GenBank寄存編號NP_861445序列（其匹配人類BTLA轉錄物1變異體 (NP_861445))下描述之轉錄物1變異體的細胞外域，其中相對於NP_861445(SEQ ID NO:37)在細胞内域中位置267處具有一個胺基酸差異（Pro267Leu，SEQ ID NO:35，由SEQ ID NO:3 6編碼）。在多輪免疫及血清滴定之後，挑選所選小鼠用於融合。一個融合體產生49種抗BTLA Mab，其中大多數具有IgG4同型。另一融合體產生154種MAb，其中大多數具有IgGl同型，包括Mab8D5。在人類γ/κ篩檢之後，基於利用ELISA測得之與BTLA-Ig 之結合、在CHO/huBTLA及CHO親本細胞上進行之 FACS/FMAT篩檢以消除CHO陽性Mab、及針對阻斷HVEM 與BTLA CHO細胞之結合的能力對抗BTLA Mab進行初始 149758.doc -109· 201121564 表徵及選擇。使用BIACore表面電漿子共振分析進行相對親和力測定。hu Mab8D5同樣良好結合於人類BTLA及獼猴 BTLA兩者，但無阻斷活性。Hu Mab8D5亦在如本文所述之B細胞及T細胞功能檢定中顯示促效劑活性。

Hu Mab8D5為以約2 nM親和力（BIAcore)結合於人類 BTLA之IgG4/K同型完全人類單株抗體（含有穩定化228脯胺酸突變）。Hu Mab8D5抗體為非阻斷性抗體且不干擾HVEM 結合。三個其它抗體hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mabl9A7顯示與hu Mab8D5類似但不相同的功能性質。儘管hu Mab8 A3亦為不干擾HVEM結合之非阻斷性促效劑抗體，但是hu Mab21H6及hu Mabl9A7為亦阻斷HVEM與 BTLA結合之促效劑。抗BTLA抗體同型選擇

IgG4同型之抗體與補體C 1 q之結合較弱且因此並不顯著活化補體。IgG4抗體亦微弱結合於FcY受體，導致抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)低效或缺乏（回顧於 Presta，2002中）。使初始選擇之8D5 IgGl Mab再表現為含有穩定化亞代爾（Adair)S228P突變之人類lgG4以產生缺乏效應功能之抗BTLA抗體。將可變區次選殖至含有人類κ恆定區及具有S228P鉸鏈突變之人類γ4恆定區的廣泛染色質開放元件（Ubiquitous Chromatin Opening Element，UCOE ; Millipore，Billerica，MA)載體（Angal，1993)中。使重鏈及輕鍵表現載體線性化且共轉染至CHO-S細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA)中且在含有G41 8及0票吟黴素（puromycin)之 149758.doc -110· 201121564 CD CHO培養基（Invitrogen，Carlsbad，CA)中選擇穩定純系。使用人類γ/κ夾心ELISA篩檢純系用於表現，且最佳產生細胞株按比例放大至2 L以用於生產及純化。原始8D5 Mab之IgG4形式在本文中稱為hu Mab8D5(或hu Mab8D5 G4)。8D5之IgGl形式在本文中稱為hu Mab8D5 G1。抗BTLA抗體序列使用基於簡併性引子PCR之方法，測定hu Mab8D5及hu Mab4C7序列之重鏈及輕鏈可變區的DNA序列。使用 RNeasy小型套組根據製造商說明書（Qiagen，Valencia，CA, USA)自5xl06個融合瘤細胞製備總RNA。藉由5'-RACE方案，用 SMART RACE cDNA擴增套組（Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, US A)及 Superscript II 逆轉錄酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA, US A)根據製造商說明書來製備 cDNA。使用與5' RACE通用引子混合物配對之3'人類特異性恆定區引子（VH引子HLB02(SEQ ID NO:33) ; VK引子 LY49(SEQ ID NO:34))來擴增各抗體之V區。將含有V區之 PCR產物選殖至pCR4-TOPO 載體（Invitrogen, Carlsbad, CA， USA)中且轉型至大腸桿菌（五.菌株TOP10(Invitrogen, Carlsbad,CA,USA)中。製備小規模純化DNA或Templiphi (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, USA)’ 且進行 DNA定序分析（Sequetech，Mountain View，CA, USA)。針對同框重排及其它抗體特徵對所得DNA序列進行分析。hu Mab8D5之重鏈及輕鏈可變區序列顯示於圖1A-C中。互補決定區（CDR)經標記。序列特徵概述於圖1C中。拮抗劑抗 149758.doc 201121564 體Hu Mab4C7之重鏈及輕鏈可變區序列顯示於圖2A-C中。實例2 抗BTLA抗體結合親和力使用基於細胞之流動式細胞測量術來測定hu Mab8D5(圖 3A-B)及hu Mab4C7對人類及獼猴BTLA(圖3C-D)之表觀結合親和力。對於hu Mab8D5之IgGl及IgG4形式，均在約12 nM下發生人類及獼猴BTLA的半數最大結合。對於促效劑結合分析（圖3A-B)，用表現人類BTLA之CHO細胞自20 pg/ml開始3倍滴定hu Mab8D5或用表現獼猴BTLA之CHO細胞自50 pg/ml開始2倍滴定hu Mab8D5，CHO細胞處於含有 0.02%疊氮化鈉的4°C緩衝液中進行以防止受體内化。使用 PE-抗huFc進行偵測。資料說明huMab8D5結合於人類及獼猴 BTLA。促效劑 huMab8A3、hu Mab21H6及hu Mabl9A7 顯示與hu Mab8D5類似的結合親和力。表5 : BIAcore結果純系ID KD X 10'9(M) k.„ >O04(1/Ms) k〇ffxl0'4(l/s) 8D5 (G4)促效劑 2.99 4.58 1.37 21H6 (G1) 5.50 5.11 2.82 8A3 (G1) 9.27 2.88 5.96 19A7 (G1) 20.7 2.88 5.96 對於拮抗劑結合分析（圖3C-D) ’用表現人類BTLA之 CHO細胞自20 pg/ml開始3倍滴定hu Mab4C7或用表現獼猴 BTLA之CHO細胞自50 pg/ml開始2倍滴定hu Mab4C7， CHO細胞處於含有0.02°/。疊氮化鈉的4°C缓衝液中以防止受體内化。使用PE-抗huFc進行偵測。對於hu Mab4C7，如 149758.doc •112- 201121564 圖3C-D中所示，對於hu Mab4C7之IgGl及IgG4形式，均在約1.6 nM下發生人類及獼猴BTLA的半數最大結合。此資料說明hu Mab4C7結合於人類及獼猴BTLA。實例3 BIAcore 進一步描述抗體概況以闡明結合動力學且使用顯示快開慢關（fast-on slow-off)動力學之BIAcore分析來計算平衡結合常數。對於BIAcore，將測試抗體捕捉於抗CH1晶片上。

Hu Mab8D5 G4顯示2.4 nM之表觀Kd。拮抗劑抗體hu Mab4C7顯示4·6 nM之表觀Kd 〇表6 BIAcore結果

HuMAb Ka (1/Ms)*(104) 1^(1/8)^(10-4) KD(nM) 8D5 (G4)促效劑 7.9 1.9 2.4 4C7拮抗劑 9.25 4.3 4.6 實例4 HVEM阻斷能力測試抗體以測定其阻斷HVEM與人類BTLA結合之能力。使用基於細胞之競爭性流動式細胞測量檢定來量測阻斷HVEM與人類BTLA結合的能力。將連續稀釋之hu Mab8D5施加於表現人類BTLA之CHO細胞（於含有0.02。/。疊氮化鈉的緩衝液中以防止受體内化）持續1 5分鐘，隨後在 4°C下添加生物素標記之人類HVEM-Fc(R&D Systems ; 1 pg/mL)持續30分鐘。對於圖4B中所示之結果，自50 pg/ml 149758.doc -113 - 201121564 開始3倍滴定hu Mab8D5且使用ΡΕ-SA進行偵測。自同一檢定獲得之hu Mab4C7的HVEM阻斷能力顯示於圖4A中。將連續稀釋之hu Mab4C7施加於表現人類BTLA 之CHO細胞（於含有0.02%疊氮化鈉的緩衝液中以防止受體内化）持續15分鐘，隨後在4°C下添加生物素標記之人類 HVEM-Fc(R&D Systems ; 1 pg/mL)持續 30分鐘。對於圖 4八中所示之結果，自50 pg/ml開始3倍滴定hu Mab4C7且使用 PE-S A進行偵測。經洗滌細胞再懸浮於含有碘化丙錢以及0.02%疊氮化鈉（防止受體内化）的4°C緩衝液中且藉由流動式細胞測量術進行分析。基於自FSC/SSC門控通道 (FSC/SSC gate)排除PI陽性細胞來選擇活細胞且量測其幾何平均螢光。圖4A中之結果顯示Ιιμ Mab4C7阻斷人類 HVEM(hHVEM)與表現hBTLA之CHO細胞的結合。如圖4B中所示，hu Mab8D5不抑制或競爭HVEM與人類 BTLA之結合。對於抗體huMab8A3，獲得類似結果。如圖 4A中所示，huMAb4C7抑制或競爭HVEM與人類BTLA之結合。對於抗體hu Mab21H6、hu Mabl9A7，獲得類似阻斷結果β 實例5 人類Τ細胞對CD3交聯之反應受hu Mab8D5抑制使用來自在各種環境下刺激之健康自願者的血球，測試抗BTLA促效劑抗體及抗體片段活體外降低T細胞活性之能力。利用經典T細胞刺激檢定，其使用抗CD3 Mab來交聯所有勝任人類T細胞之細胞表面上的T細胞受體複合物。 149758.doc -114- 201121564 使用PHA及IL-2在培養物中自人類PBMC產生T細胞母細胞。用經固定抗CD3 Ab在存在或不存在可溶性hu Mab8D5、hu Mab8D5 Fab片段或IgGl同型對照下刺激母細胞48小時。如圖5中所示藉由胸苷合併來量測增殖。在此檢定中，hu Mab8D5證明可抑制增殖，表明並行刺激T細胞上之抗原受體及BTLA的結果為遏制T細胞反應（圖 5)。以單價Fab'片段形式添加至此等培養物中之hu Mab8D5抗體顯示類似活性，強烈表明hu Mab8D5藉由結合功能性抗原決定基而不是藉由交聯細胞表面上之多個 BTLA分子來活化BTLA受體功能。此資料說明hu Mab8D5 抑制抗CD3誘導之人類T細胞母細胞的增殖。實例6 人類Τ細胞對SEB之反應受hu Mab8D5抑制且受hu Mab4C7 增強用於表徵活化BTL A受體之功能性後果之另一檢定使用葡萄球菌腸毒素B(SEB)來接合及活化表現νβ3、νβ12、 νβ14、νβ17及一些其它Τ細胞受體鏈的所有人類Τ細胞，此視SEB劑量而定。視供體而定，SEB活化全部Τ細胞的至多2〇%，如由IL-2產生所測定。在本分析中’健康人類（圖6Α)或獼猴供體血液（圖6Β)以 1:10稀釋且與抗體一起預培育，隨後添加超級抗原SEB(1 pg/ml)至培養物中。人類IgG4(HuIgG4)為hu Mab8D5之同型對照Mab。顯示單一代表性人類及猴供體。 2天後’藉由ELISA量測IL-2產生。相較於對照人類 149758.doc •115· 201121564

IgG4，Hu Mab8D5使人類及狼中IL-2的產生減少。阻斷協同刺激受體CD28與其配位體CD80/CD86之間之相互作用的可溶性CTLA-4-Ig融令蛋白（CTLA-4/Ig)使SEB 誘導之IL-2產生減少，進一步證實SEB刺激檢定為一種在操作協同刺激路徑之後定量T細胞活性的方法。發現由所測試促效劑抗BTLA抗體導致之IL-2產生減少具有劑量依賴性（圖 6A-B)。抗體 hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mabl9A7對IL-2產生亦可具有類似作用。亦根據上述方法用hu Mab4C7進行此等檢定。與CTLA-4/Ig及hu Mab8D5不同，Hu MAb4C7相較於對照人類IgG4 使人類（圖6C)及猴供體（圖6D)中IL-2的產生增加。所測試抗人類BTLA Mab與猴BTLA交叉反應之能力尤其適用於在充分測試模型（諸如猴腎移植及EAE系統）中測試 Mab調節T細胞反應的能力，此指示活體内之疾病調節。所測試促效劑抗BTLA抗體在SEB刺激檢定中使IL-2產生減少之能力指示此等抗體將適於控制或預防病狀，諸如移植物抗宿主疾病。實例7 在經破傷風類毒素（TT)免疫接種之供體之血球中hu Mab8D5 抑制TT依賴性IFNY產生及增殖另外’使用破傷風類毒素（TT)回憶抗原檢驗抗BTLA治療是否能遏制抗原特異性反應^ TT以0.1 pg/ml添加至 PBMC中’在7天後分析細胞激素及增殖。使用TT在存在或不存在阿巴西普（Abatacept，CTLA-4/Ig)、hu Mab8D5 或 149758.doc -116· 201121564 對照同型抗體IgG4下活體外再刺激新近經TT免疫接種之個體的PBMC。藉由ELISA量測干擾素γ(πΝγ)產生且藉由3Η 胸_合併量測增殖^ 相較於單獨抗原，CTLA-4/Ig及hu Mab8D5使ΤΤ誘導之 IFNy產生（圖7A)及增殖（圖7B)顯著減少。此等資料指示hu Mab8D5能夠抑制經由（抗原特異性）T細胞受體複合物觸發之Τ細胞反應。初級及二級（回憶）反應兩者在hu Mab8D5存在下均受遏制。實例8 在經破傷風類毒素（TT)疫苗接種之供體之血球中hu Mab4C7 使TT依賴性ΐρΝγ產生及增殖增加亦使用拮抗劑抗體hu Mab4C7如上所述進行IFNy產生（圖 8A)及增殖分析（圖8B)。相較於單獨抗原，hu Mab4C7使 TT誘導之ΐΡΝγ產生（圖8A)及增殖（圖8B)顯著增加。此等結果指示hu Mab4C7能夠增強經由抗原特異性Τ細胞受體複合物觸發之T細胞反應。初級及二級（回憶）反應兩者在hu Mab4C7存在下均增強。實例9 人類B細胞功能受hu Mab8D5抑制自周邊血液分離人類B細胞且在存在或不存在抗BTLA Mab下用抗IgM：進行刺激。特定言之，藉由陰性選擇自人類全灰分離B細胞且在存在或不存在hu Mab8D5、CTLA-4/Ig或同型對照下用i〇片段進行刺激。 48小時後藉由胸苷合併來量測增殖。如圖9中所示，Hu 149758.doc -117- 201121564

Mab8D5以劑量依賴性方式使B細胞增殖減少，而同型對照及CTLA-4/Ig無作用。對於抗體huMab8A3，獲得類似結果。實例10 hu Mab8D5抑制周邊血液B細胞趨化因子之產生初級B細胞上之表面IgM之交聯導致趨化因子（諸如 ΜΙΡΙα及ΜΙΡΙβ)之產生增強。圖10A-B表示顯示hu Mab8D5抑制周邊血液B細胞趨化因子之產生的圖。藉由陰性選擇自人類全血分離B細胞且在存在或不存在hu Mab8D5或同型對照下用10 gg/ml抗IgM F(ab’）2片段進行刺激。藉由ELISA量測MIP1 α及MIP1 β之產生。除限制Β細胞增殖外，hu Mab8D5亦以劑量依賴性方式使抗IgM觸發之B細胞之ΜΙΡΙα(圖10A)及ΜΙΡΙβ(圖10B)的趨化因子產生減少。重要的是，在使用有效誘導Β細胞增殖而不接合Β細胞受體之非抗原特異性觸發物（諸如CD40L 加IL-4)之實驗中測試hu Mab8D5及對照抗體。在此等條件下，未债測到hu Mab8D5活性。實例11

Hu Mab8D5並不自發地引起免疫活性圖11為顯示hu Mab8D5並不自發地刺激健康供體血液中之免疫活性的圖。在存在或不存在hu Mab8D5或CTLA-4-Ig下用超級抗原SEB刺激經稀釋人類全血。HuIgG4為hu Mab8D5之同型對照mAb。Hu Mab8D5亦在不存在SEB刺激下添加至血液中。48小時後，藉由ELISA量測IL-2產生。 149758.doc -118- 201121564 在TT回憶反應檢定中以及在SEB刺激檢定（使用人類全血）中，hu Mab8D5在不並行特異性刺激T細胞受體下未刺激可偵測之增殖或細胞激素反應。此表明hu Mab8D5不可能在患者中誘發無意細胞激素風暴樣事件。實例12

Hu Mab8D5觸發BTLA抑制性信號傳導活性

Hu Mab8D5及hu Mab4C7使BTLA蛋白自B細胞免疫沈澱，且用hu Mab8D5進行預處理降低TCR$磷酸化。用各種 BTLA HuMAb對來自人類周邊血液B細胞之溶胞物進行免疫沈澱。huIgG4為同型對照，hu Mab4C7(拮抗劑抗體）及 2G9為其它BTLA HuMAb。對於圖12B，自周邊血液分離 CD4 T細胞且如下進行處理：泳道1 =未刺激細胞，泳道2= 用抗CD3 T細胞擴增珠粒（expander bead)刺激30 min，泳道 3 =用25 pg/ml hu Mab8D5(標記為純系8D5)處理，隨後用擴增珠粒刺激30 min。探測全細胞溶胞物之頂部墨點的總 CD3$，同時用磷酸特異性cD34Ab探測底部墨點。Μ泳道為分子量標記，數字指示kD。在來源於健康供體之周邊血液B細胞中，顯示hu Mab8D5及hu Mab4C7特異性結合於BTLA且使BTLA免疫沈澱（圖12A)。在用抗CD3加抗CD28刺激之周邊血液CD4+ T 細胞中’發現與hu Mab8D5 —起預培育降低了對啟始 TCR/CD3信號傳導甚為關鍵之TCR$鏈的磷酸化（圖12B)。實例13 呈單價Fab'形式之Hu Mab8D5具有活性 149758.doc •119- 201121564 對於圖13A，在存在或不存在hu Mab8D5 Fab或hu Mab8D5之同型對照Fab下用超級抗原SEB刺激經稀釋人類全血。48小時後，藉由ELISA量測IL-2產生。對於圖13B，藉由陰性選擇自人類全血分離B細胞且在存在或不存在hu Mab8D5 Fab或同型對照 Fab 下用 10 pg/ml 抗 IgM F(ab，）2 片段進行刺激。48小時後藉由胸苷合併來量測增殖。圖13 A-B說明hu Mab8D5以劑量依賴性方式遏制SEB反應及B細胞增殖。如本文所述，發現當hu Mab8D5以單價Fab'形式添加至T 細胞或B細胞培養物中時，其觸發BTLA活性。Fab'之相對效能（而非相對功敢）約為完全Mab之1/10，此表明效能損失僅歸因於親和力損失。呈Fab1片段形式之Hu Mab8D5能夠以劑量依賴性方式遏制人類全血中之SEB反應及抗IgM 誘導之B細胞增殖（圖13 A-B)。類似於其它Ig摺疊細胞表面受體，當任何BTLA結合抗體塗覆在塑膠（經由交聯多個受體）上時，BTLA免疫抑制活性亦可被觸發。然而，hu Mab8D5單價結合於BTLA似乎完全活化抑制性功能的事實似乎為BTLA之獨特特徵（例如該特徵不與負性協同刺激蛋白質家族成員PD-1或CTLA-4所共有）。因為hu Mab8D5不阻礙BTLA之天然配位體HVEM之結合，所以儘管不希望受理論束缚，但是此指示hu Mab8D5結合BTLA之細胞外域上的（潛在別位）抗原決定基，從而誘導構形變化及隨後之細胞内信號傳導。實例14 149758.doc • 120- 201121564 細胞激素風暴 BTLA為CD28家族之免疫調節受體。利用促效劑抗體之種β在併發症為在活體内誘導「細胞激素風暴」活性。細胞激素風暴為以歸因於細胞激素與免疫細胞間之正反饋環中斷而快速誘導促發炎性細胞激素為特徵的全身性發炎性反應。已開發改良免疫調節治療劑之預測性臨床前安全性測試的程序（例如由 the Nati〇nal Institute f〇r Bi〇1〇gical

Standards and Control，UK開發，參見 stebbings，2007)。已利用預測活體内細胞激素風暴之潛力之當前模型及方法進行hu Mab8D5的活體外測試。使用經純化陽性細胞激素風暴對照促效劑抗體作為陽性參考物來進行細胞激素風暴檢定。在此等檢定中’經固定陽性對照促效劑mAb在不存在額外刺激下產生穩健的IL-2反應。當以相同方式固定時， hu Mab8D5或對照IgG4均不誘導IL-2分泌，如圖14A-B中所示。圖14B-D說明促效劑抗體hu Mab8D5、hu Mab8A3、 hu Mabl5C5、hu Mab20H4及 hu Mabl9A7在經高度交聯（在如上所述條件下）時亦不引起發炎性細胞激素干擾素 γ(ΙΡΝγ)及腫瘤壞死因子a(TNFcx)之產生、相反，陽性對照促效劑mAb產生了 IFNy及TNFa反應兩者。因此，所測試抗BTLA促效劑抗體中無一者在人類PBMC培養物中引起細胞激素風暴，且基於此活體外參考模型中之結果，同樣預期其將不會在活體内引起細胞激素風暴。如實例11及圖11中所表明，hu Mab8D5在任何所用功能性檢定中皆不自發地刺激免疫功能。在不存在T細胞特異 149758.doc • 121 - 201121564 性觸發下添加hu Mab8D5不使細胞激素分泌或增殖產生可量測的變化。此外，在藉由將hu Mab8D5塗覆在塑膠上而強制獲得較高程度交聯的測試中，mAb不誘導細胞激素釋放或增殖。基於此等資料，BTLA-HVEM相互作用之抑制性質及觸發BTLA會招致抑制性細胞内信號傳導之事實，認為細胞激素風暴之潛在風險非常不可能。實例15 動物模型中之耐受性及副作用在用hu Mab8D5或hu Mab4C7之任何動物研究中皆未注意到耐受性問題或副作用。實例16 8D5在SCIDhu SPL(人類免疫反應模型）中之作用為了確定HuMab抗BTLA促效劑IgG4純系8D5是否可抑制人類T細胞依賴性介導之B細胞IgG產生，使用人類免疫反應之SCIDhu SPL模型來探測HuMabs調節活體内免疫反應之潛力。CTLA-4-Ig用作對照，因為其為降低T細胞反應且已知會影響B細胞之T細胞依賴性抗體產生的免疫抑制劑。簡言之，SCID小鼠用人類脾細胞進行腹膜内移植，用 100 破傷風類毒素免疫，及在第0、5、9及14天用200 目標特異性抗體或對照抗體處理。在第7天用ΤΤ對小鼠進行增強免疫。在第28天使小鼠安樂死，收集血清且收集腹膜滲出細胞（PEC)。藉由FACS分析PEC之淋巴細胞子集標記表現以評估Ab處理對相關細胞數的影響。藉由ELISA定量第28天血清中TT特異性及總人類IgG之濃度。 149758.doc •122- 201121564 第28天血清之ELISA顯示相較於同型對照huIgG4(圖17B 及18B)，hu MAb8D5抑制了 SCIDhu SPL小鼠中之人類抗 TT回憶及總IgG反應（圖15、16、17A及18A)。相較於同型對照huIgG4處理小鼠，抗BTLA hu MAb8D5顯示類似於 CTLA-4-Ig之降低總體及TT特異性IgG效價的功效。圖 1 7A、17B、1 8 A及1 8B顯示個別經處理小鼠之效價的圖。總而言之，此等資料與hu MAb8D5表現為BTLA之促效劑且hu MAb8D5誘導之BTLA信號傳導抑制人類T細胞活化、增殖及隨後人類B細胞之T細胞依賴性回憶Ag特異性及總 IgG產生一致。實例17 SCID-RA滑膜模型 SCID-RA滑膜模型涉及將來自RA患者之滑膜移植至免疫缺乏SCID小鼠中以產生RA之人類化小鼠模型。RA滑膜移植物可持久存留於SCID小鼠中且維持RA關節之形態及特徵，包括滑膜增生、發炎、免疫反應性及血管生成。RA 滑膜係自關節替換手術（例如臀、膝、肩）獲得。SCID免疫缺乏小鼠無功能性T細胞及B細胞且顯示無移植物排斥反應。在手術期間收集滑膜且直接加工成小片（6 mm之活組織切片）。將滑膜樣品新鮮移植至SCID小鼠背上的所謂皮下袋（subcutaneous pocket)中。在7天移植期後，在第7天及第10天腹膜内注射對照或治療/測試抗體。在第14天，處死小鼠，收集血液及滑膜。分析包括血清細胞激素 149758.doc -123 - 201121564 ELISA、H+E染色及血清抗體定量。序列索引表7 SEQID NO: 描述 ' 一~ 1 編碼人類BTLA同功異型物之cDNA序列；寄存編 2 人類BTLA之胺基酸序列，寄存編號AAP44003 3 小鼠BTLA核皆S支序列(寄存編號AY293285) 4 小鼠BTLA胺基酸序列(寄存編號AAP44002) 5 抗BTLA8D5 VHCDR1 6 抗BTLA 8D5 VH CDR2 7 抗BTLA8D5 VHCDR3 8 抗BTLA 8D5VH核苷酸序列，包括前導序列 9 抗BTLA 8D5 VH胺基酸序列，包括前導序列一 10 抗BTLA 8D5 VH核苷酸序列，無前導序列 11 抗BTLA 8D5 VH胺基酸序列’無前導序列 12 抗BTLA 8D5 Vk CDR1 __ 13 抗BTLA8D5 VkCDR2 14 抗BTLA 8D5 Vk CDR3 —一 15 抗BTLA 8D5 Vk核苷酸序列，包括前導序列 16 抗BTLA8D5Vk胺基酸序列，包括前導序列 17 抗BTLA 8D5 Vk核苷酸序列’無前導序列 18 抗BTLA8D5VK胺基酸序列’無前導序列 19 抗 BTLA4C7VHCDR1 20 抗 BTLA4C7VHCDR2 21 抗 BTLA4C7VHCDR3 22 抗BTLA 4C7VH核苷酸序列’包括前導序列 - 23 抗BTLA4C7VH胺基酸序列’包括前導序列 _ 24 抗BTLA4C7VH核苷酸序列’無前導序列 25 抗BTLA4C7VH胺基酸序列’無前導序列 26 抗 BTLA4C7VKCDR1 27 抗 BTLA4C7VkCDR2 28 抗 BTLA4C7VkCDR3 29 抗BTLA 4C7VK核苷酸序列’包括前導序列 30 抗BTLA4C7VK胺基酸序列’包括前導序列 31 抗BTLA 4C7 VH核苷酸序列，無前導序列 - 149758.doc -124- 201121564 32 抗BTLA4C7VH胺基酸序列，無前導序列 33 HLB02定序引子 34 LY49定序引子 35 人類BTLA胺基酸序列 36 人類BTLA核苷酸序列 37 人類BTLA胺基酸序列，寄存編號NP_861445 38 8D5 VHCDR1變異體 39 8D5CDR3變異體 40 8D5VKCDR2變異體 41 8D5 VkCDR3變異體 42 4C7 VHCDR2變異體 43 4C7 VHCDR3變異體 44 抗BTLA 21H6 VH核苷酸序列 45 抗BTLA 21H6 VH胺基酸序列 46 抗BTLA 21H6 Vk,核苷酸序列 47 抗BTL A 21H6 Vk!胺基酸序列 48 抗BTLA 21Η6 Vk2核苷酸序列 49 抗BTLA 21H6 Vk2胺基酸序列 50 抗BTLA 21H6 Vk3核苷酸序列 51 抗BTLA 21H6 Vk3胺基酸序列 52 抗BTLA 8A3 VH核苷酸序列 53 抗BTLA 8A3 VH胺基酸序列 54 抗BTLA 8A3 Vk核苷酸序列 55 抗BTLA 8A3 Vk胺基酸序列 56 抗BTLA 19A7 VH核苷酸序列 57 抗BTLA 19A7 VH胺基酸序列 58 抗BTLA 19A7 Vk核苷酸序列 59 抗BTLA 19A7 Vk胺基酸序列 60 抗BTLA 20H4 VH核苷酸序列 61 抗BTLA 20H4 VH胺基酸序列 62 抗BTLA 20H4 Vk核苷酸序列 63 抗BTLA20H4 Vk胺基酸序列 64 抗BTLA 15C5 VH核苷酸序列 65 抗BTLA 15C5 VH胺基酸序列 66 抗BTLA 15C5 Vk核苷酸序列 67 抗BTLA 15C5 Vk胺基酸序列 149758.doc -125 - 201121564 參考文獻

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Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly lvs Leu Phe Trp val 1 5 10 15 149758·序列表，doc 201121564

Phe Phe Leu lie pro Tyr Leu Asp lie Trp Asn lie His Gly lvs Glu 20 25 30 ser cys Asp val Gin Leu Tyr lie Lys Arg Gin ser Glu His ser lie 35 40 45

Leu Ala Gly Asp pro Phe Glu Leu Glu cys pro val Lys Tyr cys Ala 50 55 60

Asn Arg pro His val Thr Trp cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys val 65 70 75 80 95

Lys Leu Glu Asp Arg Gin Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn lie ser phe Phe lie Leu His Phe Glu pro Met Leu Pro Asn Asp Asn Gly ser 100 10S 110

Tyr Arg C^s Ser Ala Asn phe Gin ser Asn Leu lie Glu Ser His ser 120 125

Thr Thr Leu Tyr val Thr Asp val Lys Gly Ala ser Glu Arg Pro ser 130 135 140

Lys Asp Glu val Ala Ser Arg Pro 了rp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu 145 150 155 150

Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu lie Thr Thr Trp Phe Cys Leu phe Cys 165 170 175

Cys Leu Arg His Gin Gly Lys 金故 Asn Glu Leu ser 益g Thr Ala

Gly Arg Glu lie Asn Leu val Asp Ala His Leu Lys ser Glu Gin Thr 195 200 205

Glu Ala ser Thr Arg Gin Asn ser Gin val Leu Leu ser Glu Ala Gly 210 215 220 lie Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu cys Phe Arg Met Gin Glu Gly Ser 225 230 235 240

Glu val cys ser Asn pro cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly lie val 245 250 2S5

Tyr Ala ser Leu Asn His Ser Val lie Gly Leu Asn ser Arg Leu Ala 260 265 270

Arg Asn val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala ser lie Cys Val Arg 275 280 285 149758-序列表.doc -2- % 201121564 ser <210> 3 <211> 921 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 3 atgaagacag tgcctgccat gcttgggact cctcggttat ttagggaatt cttcatcctc 60 catctgggcc tctggagcat cctttgtgag aaagctacta agaggaatga tgaagagtgt 120 gaagtgcaac ttaatattaa gaggaattcc aaacactctg cctggacagg agagttattt 180 aaaattgaat gtcctgtgaa atactgtgtt catagaccta atgtgacttg gtgtaagcac 240 aatggaacaa tctgggtacc ccttgaagtt ggtcctcagc tatacactag ttgggaagaa 300 aatcgatcag ttccggtttt tgttctccat tttaaaccaa tacatctcag tgataacggg 360 tcgtatagct gttctacaaa cttcaattct caagttatta atagccattc agtaaccatc 420 catgtgagag aaaggactca aaactcttca gaacacccac taataacagt atctgacatc 480 ccagatgcca ccaatgcctc aggaccatcc accatggaag agaggccagg caggacttgg 540 ctgctttaca ccttgcttcc tttgggggca ttgcttctgc tccttgcctg tgtctgcctg 600 ctctgctttc tgaaaaggat ccaagggaaa gaaaagaagc cttctgactt ggcaggaagg 660 gacactaacc tggttgatat tccagccagt tccaggacaa atcaccaagc actgccatca 720 ggaactggaa tttatgataa tgatccctgg tctagcatgc aggatgaatc tgaattgaca 780 attagcttgc aatcagagag aaacaaccag ggcattgttt atgcttcttt gaaccattgt 840 gttattggaa ggaatccaag acaggaaaac aacatgcagg aggcacccac agaatatgca 900 tccatttgtg tgagaagtta a 921 <2lO> 4 <211> 306 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 4

Met Lys Thr val Pro Ala Met Leu Gly Thr Pro Arg Leu Phe Arg Glu 1 5 10 15 phe Phe lie Leu His Leu Gly Leu Trp ser lie Leu cys Glu Lys Ala 20 25 30

Thr Lys Arg A$n Asp Glu Glu Cys Glu val Gin Leu Asn lie Lys Arg 35 40 45

Asn ser Lys His ser Ala Trp Thr Gly Glu Leu Phe Lys He Glu cys 50 55 60 pro val Lys Tyr cys Val His Arq Pro Asn V5I Thr Trp Cys Lys 於s 65 70 75 80 149758·序列表.doc 201121564

Asn Gly *Thr lie Trp val Pro Leu Glu val Gly Pro Gin Leu Tyr Thr 85 90 9S

Ser Trp Glu Glu Asn Arg ser Val Pro val Phe Val Leu His Phe Lys 100 105 110 pro ne His Leu ser Asp Asn Gig Ser Tyr ser Cys ser Thr Asn Phe

Asn ser Gin val lie Asn ser His Ser val Thr lie His val Arq Glu 130 135 140

Arg Thr Gin Asn ser Ser Glu His pro Leu lie Thr val ser Asp He 145 150 155 160

Pro Asp Ala Thr Asn Ala ser Gly Pro Ser Thr Met Glu Glu Arg pro 165 170 175

Gly Arg Thr Trp Leu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Gly Ala Leu Leu 180 185 190

Leu Leu Leu Ala Cys Val Cys Leu Leu Cys Phe Leu Lys Arg lie Gin 195 200 205

Gly Lys Glu Lys Lys Pro ser Asp Leu Ala Gly Arg Asp Thr Asn Leu 210 215 220

Val Asp lie pro Ala ser ser Arg Thr Asn His Gin Ala Leu Pro ser 225 230 235 240

Gly Thr Gly lie Tyr Asp Asn Asp Pro Trp Ser Ser Met Gin Asp Glu 245 250 255

Ser Glu Leu Thr He Ser Leu Gin ser Glu Arg Asn Asn Gin Gly rle 260 265 270

Val Tyr Ala Ser Leu Asn His cys val lie Gly Arg Asn Pro Arg Gin 275 280 285

Glu Asn Asn Met Gin Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser lie Cys val 290 295 300

Ar| Ser <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213>智人 <400> 5 -4- 149758-序列表.doc 201121564

Ser Tyr Asp Met His

<210> 6 <211> 16 <212> PRT 智人

Lys Gly 15

<400> 6 L

Val lie Gly pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tgr Pro Gly Ser val <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213>智人 <400> 7 ,

Glu Gly Met Ala Ala His Asn Tyr Tyr Gly Met Asp val <210> 8 <211> 420 <212> DNA <213>智人 60 120 180 240 300 360 420 <400> 8 atggagttgg ggctgagctg ggttttcctt gttgctatat tagaaggtgt ccagtgtgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagccgg gggggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac catcagtagt tacgacatgc actgggtccg ccaagcaaca ggaaaaggtc tggagtgggt ctcagttatt ggtcctgctg gtgacacata ctatccaggc tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gaaaatgcca agaactcctt gtatcttcaa atgaacagcc tgagagccgg ggacacggct gtgtattact gtgcaagaga ggggatggct gcccacaact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca <210> 9 <211> 140 <212> PRT <213>智人 <4〇〇> 9

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp val Phe Leu Val Ala lie Leu Glu Gly 1 5 10 15 val Gin Cys Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin 20 25 30 pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr He 35 4〇 45 ser ser Tyr Asp Met His Trp val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp val ser val Gly Pro Al.a. Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly 149758-序列表.doc 201121564 65 70 75 80 ser val Uys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg 6lu Asn Ala Lys Asn Ser

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala val Tyr 100 105 no

Tyr Cys Ala Arg Ola Gly Met AU Ala His Asn Tyr Tyr cly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val Ser ser 130 135 140 <210> 10 <211> 363 <212> DNA <213:►智人 <400> 10 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccatcagt agttacgaca tgcactgggt ccgccaagca acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagtt attggtcctg ctggtgacac atactatcca ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt caaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agaggggatg gctgcccaca actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tea <210> 11 <211> 121 <212> PRT <213>智人 <400> 11 , n

Glu Val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 l〇 15 ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr lie ser Tyr 20 25 30

Asp Met His Trp val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly gu Glu Trp val 35 40 45 ser Val lie Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro 6ly ser val Lys 50 55 60 Ιψ Asn ser Leu Tyr Leu Ala val Tyr Tyr cys Ala

Gly Arg phe Thr lie ser Arg Glu Asn Ala

Girt Met Asn ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr 85 9〇 M9758-序列表.doc 201121564

Arg 6lu Gly Met Ala Ala His Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110

Cln Gly Tjr Thr Val Thr val Se. Ser <210> 12 <211> 11 <212> PRT <2i3>智人 <40〇> 12 , i

Arg Ala Ser Gin Ser val ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 l〇 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213>智人

<400> 13 L

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213>智人 <4〇〇> 14

Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro lie Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 384 <212> DNA <213>智人 <400> 15 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcccccgat caccttcggc 360 caagggacac gactggagat taaa 384 <210> 16 <211> 128 <Z12> PRT <213>智人 <4〇〇> 16

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 149758-序列表.doc 201121564 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin ser Pro Ala Thr Leu ser 20 25 30

Leu ser pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Val ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Glr» Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu lie Tyr Asp Ala ser Asn Arg Ala thr Gly He Pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110

Asn Trp Pro Pro He Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 115 120 125 <210> 17 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 17 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcccccgat caccttcggc 3〇〇 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 18

Glu lie val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu ser pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala Ser Gin Ser val Ser ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45 149758-序列表.doc 201121564

Tyr Asp Ala ser Asn Arg Ala Thr Gly He pro Ala Arg Phe Ser Gly 5S 60 S|r Gly ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr lie ser ser Leu Glu Pro

Glu Asp Phe Ala Val Typ Tyr cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 lie Thr Phe Gin Gly Thr Arg Leu Glu ile Lys <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213>智人 <400> 19

His Tyr Tyr Trp Ser <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213>智人 <400> 20

Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro ser Leu Lys ser 15 i〇 15 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213>智人 <400> 21

Glu Trp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Glu Met Asp val 1 5 10 <210> 22 <211> 414 <212> DNA <213>智人 <400> 22 atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct atccctcacc 120 tgcactgtcc atggtggctc catcaatcat tactactgga gctggatccg gcagccccca 180 gggaagggac tggaatggat tggatatatc tattacagtg ggagcaccaa gtacaatccc 240 tccctcaaga gtcgcgtcag catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag 300 ctgacctctg tgaccgctgc ggacacggcc gtgtattatt gtgcgagaga gtggccctac 360 tattactacg aaatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 414 <210> 23 149758-序列表.doc -9- 201121564 <211> 138 <212> PRT <213>智人 <400> 23

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15

Val Leu ser GTn val Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu val Lys 2〇 25 30

Pro S€r Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr vaT His Gly Gly Ser He

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Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr ser Gly ser Thr Lys Tyr Asn Pro 65 70 75 80

Ser Leu Lys Ser Arg val Ser He ser Val Asp Thr ser Lys Asn Gin 85 90 95

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Tyr Cys Ala Arg Glu Trp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Glu Met Asp val Trp 115 120 125

Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val ser ser 130 135 <210> 24 <2U> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 24 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctatccctc 60 acctgcactg tccatggtgg ctccatcaat cattactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggaatg gattggatat atctattaca gtgggagcac caagtacaat 180 ccctccctca agagtcgcgt cagcatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgacct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt attgtgcgag agagtggccc 300 tactattact acgaaatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 25 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 25

Gin val Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro Ser Glu 15 10 15 10- 149758-序列表.doc 5 201121564

Thr Leu ser Leu Thr Cys Thr val His Gly Gly serlle Asn His Tvr 20 25 BO

Tyr Trp ser Trp He Arg cln Pro Pro Gly Lys Gly clu Trp xle

Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 ser λγ9 val Ser He Ser val ASp Thr ser ,ys Asn Cln Phe ser Uu

Lys Leu Thr Ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Glu Trp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Glu Met Asp Val Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr val Ser ser 115 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213>智人 <400> 26

Arg Ala Ser Gin ser Val Ser ser Ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 27

Gly Ala ser ser Arg Ala Thr <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213>智人

<400> 28 L

Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Phe Arg Thr <210> 29 <211> 384 <212> DNA <213>智人 <400> 29 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga -π - 149758-序歹lj 表.doc 201121564 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcatttcg gacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaa 120 180 240 300 360 384 <210> 30 <211> 128 <212> PRT <213>智人 <400> 30 Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin ser pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu ser Pro Gly <5lu Arg Ala Thr Leu Ser cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 val ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala SO 55 60

Pro Arg Leu Leu lie T^r Gly Ala Ser ser Arg Ala Thr Gly He Pro

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95 ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110

Gly Ser Ser phe Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu lie Lys 115 120 125 <210> 31 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 31 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcatttcg gacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaa 60 120 180 240 300 324 149758-序列表.doc -12- 201121564 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 32

Glu lie val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala Ser Gin Ser val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser ser Arg Ala Thr Gly lie Pro A$p Arg Phe ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Gly Ser ser Phe 85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu lie Lys 100 105 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213;►人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成引子」 <400> 33 gcctgagttc cacgacaccg tc 22 <210> 34 <211> 32 <212> ONA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成引子」 <400> 34 gcaggcacac aacagaggca gttccagatt tc 32 <210> 35 <211> 289 <212> PRT <213>智人 -13- 149758-序列表.doc 201121564 <400> 35

Met Lys Thr Leu pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp val 1 5 10 15

Phe Phe Leu He Pro Tyr Leu Asp lie Trp Asn lie His Gly Lys Glu 20 25 30

Ser cys Asp val Gin Leu Tyr lie Lys Arg Gin ser Glu His ser lie 35 40 45

Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Olu Cys Pro val Lys Tyr cys Ala

Asn Arg Pro His va! Thr Trp cys Lys Leu ash cly Thr Thr Cys val

Lys Leu Clu Asp Arg Cln Thr ser Trp Lys Glu Glu Lys ash lie Ser

Phe Phe lie Leu His Phe Glu Pro val Leu Pro Asn Asp Asn Gly ser 100 105 110 ryr Arg Cys ser Ala Asn phe Gin ser Asn Leu He Glu ser His Ser 115 120 125

Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala ser Glu Arg Pro Ser 130 135 140

Lys ASP Clu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro

Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu lie Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys 165 170 175 cys Leu Arg Arg His Gin Gly Lys Gin Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala 180 185 190

Gly Arg Glu He Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys ser Glu Gin Thr 195 200 205

Glu Ala ser Thr Arg Gin Asn ser Gin val Leu Leu ser Glu Thr Gly 210 215 220 lie Tyr Asp Asn asd Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gin Glu Gly ser 225 230 235 240

Glu val Tyr ser Asn Pro cys Leu Glu Glu Asn Lys pro Gly lie val 245 2S0 255

Tyr Ala ser Leu Asn His ser val lie Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala 260 265 270 s 149758-序列表.d〇c -14- 201121564 λγ9 ash val Lys Glu Ala Pro Thr Clu Tyr Ala ser xle cys val Arg ser <210> 36 <211> 870 <212> ONA <213>智人 <400> 36 atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt cttcttaatc 60 ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat gtgatgtaca gctttatata 120 aagagacaat ctgaacactc catcttagca ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg 180 aaatactgtg ctaacaggcc tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta 240 aaacttgaag atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300 cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc aaattttcag 360 tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga cagatgtaaa aagtgcctca 420 gaacgaccct ccaaggacga aatggcaagc agaccctggc tcctgtatag tttacttcct 480 ttggggggat tgcctctact catcactacc tgtttctgcc tgttctgctg cctgagaagg 540 caccaaggaa agcaaaatga actctctgac acagcaggaa gggaaattaa cctggttgat 600 gctcacctta agagtgagca aacagaagca agcaccaggc aaaattccca agtactgcta 660 tcagaaactg gaatttatga taatgaccct gacctttgtt tcaggatgca ggaagggtct 720 gaagtttatt ctaatccatg cctggaagaa aacaaaccag gcattgttta tgcttccctg 780 aaccattctg tcattggact gaactcaaga ctggcaagaa atgtaaaaga agcaccaaca 840 gaatatgcat ccatatgtgt gaggagttaa 870 <210> 37 <211> 289 <212> prt <213>智人 <400> 37

Met Lys Thr Leu Pro ATa Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val 1 5 10 15

Phe Phe Leu lie Pro Tyr Leu Asp lie Trp Asn lie His Gly Lys Glu 20 25 30 ser Cys Asp val Gin Leu Tyr lie Lys Arg Gin Ser Glu His Ser lie 35 40 45

Leu Ala Gly Asp Pro phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr cys Ala 50 55 60 15- 149758-序列表.doc 201121564

Asn Arg pro His val Thr Trp cys Lys Leu Asn Gly Thr· Thr cys val 65 70 75 80

Lys Leu 6lu Asp Arg Gin Thr Ser Trp Lgs Glu Glu Lys Asn He ser

Phe phe lie Leu His Phe Gin Pro Val Leu pro Asn Asp Asn Gly ser 100 105 110

Tyr Arg cys ser Ala Asn Phe Gin Ser Asn Leu lie Glu ser His ser 115 120 125

Thr Thr Leu Tyr val Thr as^ Val Lys ser Ala Ser Glu Arg Pro ser 130 140

Lys Asp Glu Met Ala ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr ser Leu Leu pro 145 150 155 160

Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu lie thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe cys 165 170 175 cys Leu Arg Arg His Gin Gly Lys Gin Asn Glu Leu ser Asg Thr Ala

Gly Arg Glu lie Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gin Thr 195 200 205

Glu Ala Ser Thr Arg Gin Asn ser Gin val Leu Leu ser Glu Thr Gly 210 215 220 lie Tyr Asp Asn Asp p「o Asp Leu Cys Phe Arg Met Gin Glu Gly Ser 225 230 235 240

Glu val Tyr ser Asn Pro cys Leu Glu Glu Asn Lys pro Gly lie val 245 250 255

Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser val lie Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala

Arg Asn val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala ser lie Cys val Arg 275 280 285

Ser <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source -16· 149758-序列表.doc 201121564 <223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽j <220> <221> VARIANT <222> (4)"⑷ <223> /置換=「Lys」或「Leu」或「Ala」或「Phe」 <220> <221> misc^feature <222> (20)..(21) <223> /註釋=「序列中給出之殘基相對於該位置之註解中的殘基並不優選」 <400> 38

Ser Tyr Asp Met His 1 5 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽j <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /置換=「LyS」或「Leu」或「Ala」或「Phe」 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> /註釋：=「序列中給出之殘基相對於該位置之註解中的殘基並不優選」 <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /置換=「Gin」或「Ala」 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> /註釋二「序列中給出之殘基相對於該位置之註解中的殘基並不優選」 <220>

<221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> /置換=「Lys」或「Leu」或「Ala」或「Phe」 <220> <221> misc^feature <222> (U)..C11) <223> /註釋二「序列中給出之殘基相對於該位置之註解中的殘基並不優選」 <400> 39

Glu Gly Met Ala Ala His Asn Tyr Tyr Gly Met Asp val 1 5 10 -17- 149758·序列表.doc 201121564 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223>/置換=「Ala」 <220> <221> misc_feature <222> C4)..(4) <223>/註釋=「序列中給出之殘基相對於該位置之註解中的殘基並不優選」 <400> 40

Asp Ala Ser Gin Arg Ala Thr 1 5 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /置換=「Ala」 <220> <221> misc_feature <222> m. .m <223> /註釋=「序列中給出之殘基相對於該位置之註解中的殘基並不優選」 <400> 41 ， ,

Gin Gin Arg Ser Gin Trp Pro pro lie Thr 1 5 l〇 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <22I> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽」 <220>

<221> VARIANT 18- 149758-序列表.doc 201121564 <222> (11)..(11) <223> /置換=rGlnj或「版」 <220> <221> misc^feature <222> (11)..(11) <223> <220> <221> VARIANT <222> (12),.(12) <223> /置換=「Aiaj <221> misc_feature <222> (12).,(12) <223> /註釋=r序列中給出之殘基相對於該位置之註

J <220> <400> 42 Tyr lie Tyr Tyr ser Gly ser Thr l 5 解中的殘基並不優選

Lys Tyr Asn Pro $er Leu Lys ser 15 <210> 43 <21J> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成肽 j <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /置換=「Lys」或「Leu」或「Ala」或「Phe」 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> /往釋=「序列中給出之殘基相對於該位置之註解中的殘基並不優選」 <4〇〇> 43

Glu Trp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Glu Met Asp val 1 5 i〇 <210> 44 <211> 441 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 44 atggacatac tttgttccac gctcctgcta ctgactgtcc cgtcctgggt cttatcccag 60 gtcaccttga gggagtctgg tcctgcgctg gtgaaaccca cacagaccct cacactgacc 120 tgcaccttct ctgggttctc actcagcact agtggaatgg gtgtgagctg gatccgtcag 180 149758-序列表,doc 19- 201121564 cccccaggga aggccctgga gtggcttgca gtcattgatt gggatggtac taaagactac agcacatctc tgaagaccag gctcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acggatccgt attaatgtgg ttcggggagt tattatcaac tactatggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a <210> 4S <211> 147 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 45

Met Asp lie Leu Cys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr Val Pro Ser Trp IS 10 15

Val Leu Ser Gin val Thr Leu Arg Glu ser Gly Pro Ala Leu Val Lys 20 25 30

Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45

Ser Thr Ser cly Met cly val ser Trp He Arg cln Pro Pro c1y Lys

Ala Leu Glu xrp Leu Ala val He Asp Trp Asp Gly Thr Lys Asp Tyr ser Thr ser Leu Lys Thr Arg Leu Thr lie ser Lys Asp Thr ser Lys 85 90 95

Asn Gin val val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro val Asp Thr Ala 100 105 110

Thr Tyr Tyr cys Ala Arg lie Arg lie Asn Val val Arg Gly Val lie 115 120 125 ne Asn Tyr 〇ly Met Asp Val Trp cly Gin Gly Thr Thr Val Thr val Se「 Ser 145 <210> 46 <211> 387 <212> DNA <213>人工序列 -20· 149758-序列表.doc 201121564 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 46 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cccggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta ggtcacccgc gtacactttt B60 ggccagggga ccaagctgga gatcaaa 387 <210> 47 <211> 129 <212> PRT <2ϋ3>人工序列 <220> <221> source <223>/註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 47

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu pro 1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu ser Cys Arq Ala ser Gin Ser 35 40 45

Val ser Ser ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Gin Ala 50 55 60 pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 8〇

Asp Arg Phe ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95 ser Arg Leu Glu Pro Clu Asp Phe Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr

Gly Arg Ser Pro Ala Tyr Thr Phd Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 115 120 125

Lys •21· 149758-序列表.doc 201121564 <210> 48 <211> 381 <212> ONA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 48 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtqtttgt .ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccattcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa a 381 <210> 49 <211> 127 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 49

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu pro 1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie val Leu Thr Gin ser Pro Ala Thr Leu ser 20 25 30

Leu Ser pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin ser 35 40 45 val ser ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie pro Ala 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr cys Gin Gin Arg Ser 100 105 no

Asn Trp Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys val Asp He Lys 115 120 125 149758·序列表.doc -22- 201121564 <210> 50 <211> 384 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 50 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gatgcatcca acagggccac tggcatccca 240 gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctagag 300 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagcgtagca actggccatt cactttcggc 360 cctgggacca aagtggatat caaa 384 <2X〇> 51 <211> 128 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋；「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 51

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asd Thr Thr Gly Glu lie val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser μ 20 25 30

Leu Ser pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala Ser Gin ser 35 40 45 val Ser Se「Ser* Tyt* Leu Ala Trp Tyr G"ln Gin Lys Pro G*ly Gin Ala 50 55 60 pro Aro Leu Leu He Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser ser Leu Glu Pro Glu Asp phe Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Arg 100 105 110 ser Asn Trp pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys val Asp lie Lys 115 12〇 125 -23- 149758·序列表.doc 201121564 <210> 52 <211> 432 <212> ONA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 52 atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgctatgc actgggttcg ccaggctcca 180 ggaaaaggtc tggagtgggt ttcagttatt ggtactggtg ttgccacata ctatgcagac 240 tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtttcttcat 300 atgaacagcc tgagagccga ggacatggct gtgtattact gtgcaagagg cttttactat 360 ggttcgggga ctaattatta caaccgcggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcct ca 432 <210> 5B <211> 144 <212> PRT <213:►人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 53

Met Glu Phe val Leu Ser Trp Val Phe Leu val Ala He Leu Lys Glv 1 5 10 15 val Gin cys Glu val Gin Leu val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His 20 25 3〇

Pro Gly Gly ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 60 ser ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

Glu Trp val Ser val He Gly Thr Gly vai Ala Thr Tyr Tvr Ala asd 65 70 75 80

Ser val Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn ser 85 90 95

Leu Phe Leu His Met Asn ser Leu Ar^ Ala Glu Asp Met Ala val Tyr H9758-序列表.doc -24- 201121564

Tyr cys Ala Arg G1y Phe Tyr ^ Gly Ser Gly Thr Asn Tyr ryr Asn

Arg Gly〇 Met Asp val Trp cly Gln Gly Thr Thr val The val Sen ser <210> 54 <211> 384 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22l> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 54 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgta cacttttggc 360 caggggacca agctggagat caaa 384 <210> 55 <211> 128 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 55

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro IS 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie VaT Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arq Ala Thr Leu Ser cys Arg Ala ser Gin Ser 35 y 40 45 val Ser ser Ser Tyr Leu Ala T「p Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60 pro Arg Leu Leu ile jyr 〇\y Ala ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 7¾ 75 80

Asp Arg Phe ser cly Ser dy Ser Gly Thr Asp Phe Thr ueu Thr He 149758-序列表.doc 25- 201121564 ser Arg Leu Glu pro Glu Asp Phe Ala val Tyr jyr cys Gin Gin Tyr 100 105 up

Gly Ser Ser pro ryr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 115 120 125 <210> 56 <211> 441 <212> DNA <213;►人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 56 atggacatac tttgttccac gctcctgcta ctgactgtcc cgtcctgggt cttatcccag 60 gtcaccttga gggagtctgg tcctgcgctg gtgaaaccca cacagaccct cacactgacc 120 tgcaccttct ctggggtctc actcagcact agtggaatgt gtgtgagctg gatccgtcag 180 cccccaggga aggccctgga gtggcttgca gtcattgatt gggatgatga taaatactac 240 aacacatctc tgaagaccag gctcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 300 cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acggctacgt 360 attactgtgg ttcggggagt tattataacc tactacggtc tggacgtctg gggccaaggg 420 accacggtca ccgtctcctc a 441 <210> 57 <211> 147 <212> PRT c213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 57

Met Asp lie Leu Cys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr val Pro ser Trp IS 10 15 val Leu Ser Gin val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu val Lys 20 25 30 pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe ser Gly Val ser Leu 35 40 45 ser Thr Ser Gly Met Cys Val ser Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys

Ala Leu Glu rrp Leu Ala val He Asp Trp AfP Asp Asp Lys Tyr Tyr 26- U9758-序列表.doc 201121564

Asn Thr ser Leu Thr Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr ser t_ys 85 90 95

Asn Gin val val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro val Asg Thr Ala

Thr Tyr T^r cys Ala Arg teu Arg lie Thr val val αγ^ Gly val He 丁^ 丁y「Tyr Gly Leu AsP Va] TrP Gly Gin Gly Thr Thr val Thr !3〇 135 140 val ser ser 145 <210> 58 <211> 381 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /往釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 58 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta ggtcactcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa a 381 <210> 59 <211> 127 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 59

Met 61u Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly gIu Arg Ala Thr Leu ser Cys Arg Ala ser Gin ser 35 40 45 149758-序列表.doc 27- 201121564 val Ser See Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60 pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80

Asp Arg Phe ser Gly ser Gly Ser Gly Thr* Asp phe Thr Leu Thr lie 85 90 95

Ser Arg Leu Glu pro Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr 100 105 110

Gly Arg Ser Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys val Asp He Lys 115 120 125 <210> 60 <211> 432 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 60 atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg g卯Mtccct gagactctcc 120 tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatgctatgc actgggttcg ccaggctcca 180 ggaaaaggtc tggagt卯gt atcagttatt ggtcctggtg gtggcacata ctatgcagac 240 tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa 300 atgaacagcc tgagagccga ggacatggct gtgtatttct gtgcaagagg ctattactat 360 ggttcgggga atttttttaa gaattacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcct ca 432 <210> 61 <211> 144 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」

Met Glu Phe val Leu ser Trp val Phe Leu val Ala He Leu Lys Gly 1 5 10 15 val Gin cys Glu val Gin Leu val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His 20 25 30 -28- 149758-序列表.doc

I 201121564

Pro Gly Gly ser Leu Arg Leu ser cys Ala Gly ser 35 40

Phe Thr Phe

Ser ser Tyr Ala Met His 丁rp val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu

Glu Trp val Ser val lie Gly Pro Gly Gly Gly Thr Tyr ryr Ala Asp 65 70 75 80 ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95

Leu Tyr leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu asd Met Ala val Tvr 100 105 no 7

Phe cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Phe Phe Lys Asn 115 120 125

Tyr Gly Met A$p val Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val ser ser 130 135 140 <210> 62 <211> 384 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 62 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gccgggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggtg gctcaccgta cacttttggc caggggacca agctgcagat caaa 60 120 180 240 300 360 384 <210> 63 <211> 128 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223>/註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 63 Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 l〇 15 149758-序列表.doc -29- 201121564

Asp Thr Thr Gly Glu lie val Leu Thr Gin Ser pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30

Leu ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser cys Arg Ala Ser Gin ser 35 40 45 val ser ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin ,ln Lgs Pro Gly Cln Ala

Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110

Gly Gly Ser Pro Tyr Thr phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin lie Lys 115 120 125 <210> 64 <211> 438 <212> ONA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述··合成聚核苷酸」 <400> 64 atggagtttg ggctgaactg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgaagcgt ctggattcac cttcaataac tatgacatga actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggaatgatg gaagtaataa atactttgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agaggttttt actatggttc ggggaattat tataacctac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca <210> 65 <211> 146 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 30- 60 120 180 240 300 360 420 438 M9758·序列表.doc

I 201121564 <40〇> 65

Met Glu Phe Gly Leu Asn Trp val Phe Leu val Ala Leu Leu Arg Gly val Gl〇 cys fJn val oln Leu val Glu Ser G!y Gly Gly Val Val Gln

Pro Gly Arg ser Leu Arg ueu ser cys Glu Ala ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Asn Asn Tyr Asp Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Ala val lie Trp Asn Asp Gly ser Asn Lys Tyr phe Ala 65 70 75 80

Asp ser val Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val 100 10S HO

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Phe Thr Met val Arg Gly lie lie lie 115 120 125

Thr Tyr Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val 130 135 140

Ser ser 145 <210> 66 <211> 384 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成聚核苷酸」 <400> 66 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtt tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta ggtcaatcat caccttcggc 360 caagggacac gactggagat taaa 384 <210> 67 149758-序列表.doc -31 - 201121564 <211> 128 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> source <223> /註釋=「人工序列之描述：合成多肽」 <400> 67 yet Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu lie val Leu Thr Gin Phe Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala ser Gin Ser 35 40 45

Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60

Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser ser Arg Ala Thr Gly lie Pro

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 90 95 ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr

Gly Ar9 ser xle .le Thr Phe 0¾ cly Thr Arg Uu Clu xle Lys •32- M9758·序列表.doc 5

Claims

201121564 七、申請專利範圍： 1. 一種結合BTLA之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含至少一個選自由SEQ ID Νο·:12、13及14組成之群的 VL CDR域及至少一個選自由SEQ ID Νο·:5、6及7組成之群的VH CDR域。 2. 一種結合BTLA之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含至少一個選自由SEQ ID No.:26、27、28組成之群的 VL CDR域及至少一個選自由SEQ ID Νο·:19、20及21組成之群的VH CDR域。 3. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中： (a) 該重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO:l 1(8D5 重鏈;）；及 (b) 該輕鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO:18(8D5 輕鏈）。 4. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:5(8D5 HCDR1)之重鏈可變區CDR1 ; (b) 包含胺基酸序列SEQ ID NO‘.6(8D5 HCDR2)之重鏈可變區CDR2 ; (c) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:7(8D5 HCDR3)之重鏈可變區CDR3; (d) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:12(8D5 LCDR1)之輕鏈可變區CDR1 ; 149758.doc 201121564 (e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:13(8D5 LCDR2)之輕鏈可變區CDR2 ;及 (f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO:14(8D5 LCDR3)之輕鏈可變區CDR3 ; 其中該抗體特異性結合BTLA且不阻斷與HVEM之結合。 5. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含： ⑷人類VH基因（SEQ ID NO:8)[編碼8D5]之產物或衍生之重鏈可變區；及 (b)人類Vk基因（SEQ ID NO:15)[編碼8D5]之產物或衍生之輕鏈可變區；其中該抗體特異性結合BTLA。 6 _ —種經分離之多肽，其包含如請求項丨至5之任何抗體或抗原結合片段的VL域或vH域。 7. —種經分離之核酸，其編碼如請求項丨至5之任何抗體或抗原結合片段或如請求項6之經分離之多肽的Vl域或Vh 域。 8· —種組合物，其包含一或多種如請求項丨至5中任一項之抗體或抗原結合片段或如請求項6之經分離之多肽及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。 9. 一種治療個體由Β τ L A之表現及/或活性降低所引起之病狀的方法’其包含投與該個體有效量之包含一或多種如 °月求項1或3至5中任一項之抗體或抗原結合片段的組合物。 10. 種/α療個體發炎或自體免疫病症之方法，其包含投與 I49758.doc 201121564 δ亥個體有效量之如請求項丨或3至5中任一項之促效劑抗體或抗原結合片段。 11. 如請求項1 〇之方法，其中該發炎或自體免疫病症係選自由以下組成之群··克隆氏病（Cr〇hn，s disease)、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、發炎性纖維化、硬皮病、肺纖維化、及肝硬化症、類風濕性關節炎（RA)、骨關節炎、骨質疏鬆症、哮喘（包括過敏性哮喘）、過敏症、慢性阻塞性肺病（COPD)、多發性硬化症、牛皮癣、葡萄膜炎、移植物杬宿主疾病（GVHD) '青少年早發性丨型糖尿病、移植排斥SLE及修格連氏症候群（sj0_gren,s Syndr〇me)。 12. —種增強個體免疫反應之方法，其包含投與該個體有效量之包含如請求項2之抗體或抗原結合片段的組合物。 1 3 · —種表現載體，其包含如請求項7之經分離之核酸。 14. 一種宿主細胞，其包含如請求項13之表現載體。 15, 一種產生如請求項丨至5中任一項之抗體或其抗原結合片段之方法，其包含： a.如請求項14之宿主細胞在培養基中在該核酸序列可表現之條件下培養，由此產生包含該等輕鏈及重鍵4 變區之多肽；及 b，自該宿主細胞或培養基回收該等多肽。 149758.doc