JP2016530298A - γδＴ細胞の調節 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＢＴＬＡ、ＩＬ−７及びＲＯＲγｔがγδＴ細胞の活性及び発現を調節するという発見に関連する。具体的には、本発明は、ＢＴＬＡの発現を調節することにより、γδＴ細胞の恒常性及び機能を調節する方法を提供する。本発明は、更に、ＢＴＬＡ、ＲＯＲγｔ及びＩＬ−７の活性及び発現を調節する薬剤、並びにそのような薬剤のスクリーニングのための方法を提供する。本発明はまた、ＢＴＬＡ、ＲＯＲｙｔ及びＩＬ−７のモジュレーターを使用して、自己免疫疾患または炎症性疾患を処置する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年９月５日に出願されたＵ．Ｓ.６１／８７４２６９の１１９条（ｅ）に基づく優先権の恩典を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部分とみなされ、且つその全体が参照により本出願の開示に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、Ｔ細胞媒介免疫応答の分野に関する。具体的には、ＲＯＲγｔ、ＩＬ−７及びＢＴＬＡによるγδＴ細胞のレベル及び活性の調節に関する。

配列表の組み込み
添付の配列表中の物質は、参照することにより本出願に組み込まれるものとする。添付の配列表のテキストファイル名は、ＢＵＲＮ１６５０＿１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇであり、２０１４年９月４日に作成され、９ｋｂである。ファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用するコンピュータ上で、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを用いて、評価され得る。

発明の背景
Ｔ細胞の特定サブセットの分化は、転写因子であるレチノイド関連オーファン受容体γアイソフォームｔ（ＲＯＲγｔ）（Ｒｏｒｃによってコードされる）の発現により促進される。ＲＯＲγｔは、そのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を通して、古典的ＲＯＲ ＤＮＡ結合部位へと活性化機能−２（ＡＦ２）ドメインを介してＬＸＸＬＬモチーフを含む核リプレッサーまたはアクチベーターを動員することにより、遺伝子発現をトランス活性化する転写因子のＲＯＲファミリーのメンバーである。Ｔ細胞において、ＲＯＲγｔは、Ｉｌ１７遺伝子のプロモーターに結合し、活性化させて、炎症性サイトカインＩＬ−１７を発現させ、通常のＣＤ４^＋Ｔ_Ｈ細胞（ＴＨ１７）の分化を駆動し、自然様（ｉｎｎａｔｅ−ｌｉｋｅ）ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞を維持する。γδＴ細胞の表現型プロファイリングは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであるＣＤ２７の発現に基づいて、２つの大きなサブグループを識別した。したがって、ＣＤ２７^＋サブセットは、ＩＦＮγを産生し、一方、ＣＤ２７⁻サブセットは、ＩＬ−１７を産生する。発達中に、γδＴ細胞は、初期の胸腺前駆細胞の生存を制御しかつＴＣＲ−γ遺伝子座におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えを誘導するＩＬ−７シグナル伝達に大きく依存する。更に、ＩＬ−７は、γδＴ細胞の恒常性を維持し、優先的にＣＤ２７⁻ＩＬ−１７^＋サブセットを増殖する。ＩＬ−１７を産生するγδＴ細胞の能力は、ＴＣＲシグナル伝達、その真実の生来の性質を指す機能とは独立して、胸腺分化の間に取得される。γδＴ細胞は、生来の受容体および抗原受容体（いずれも、感染に対する迅速な応答を開始する）を通して活性化され得る有効な炎症エフェクターとして現れる。

ＲＯＲγｔはまた、二次リンパ器官の発達に必要とされるリンパ組織誘導（ＬＴｉ）細胞及び腸の感染の防御のために重要であり、かつ活性化リンパ球の生存のためのシグナルを誘導する成人ＩＬ−２２分泌ＩＬＣ（ＣＤ１３４^＋ＩＬ−２２^＋ＩＬＣ）などの、グループ３のＩＬＣの分化に必須である。マウス及び霊長類におけるＩＬＣ系列の保存は、リンパ組織の迅速な自然防御機構におけるこれらの細胞の重要性を強調する。

抑制性受容体であるＢ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）の造血細胞における広範な発現プロファイルは、自然様Ｔ細胞及びＩＬＣの制御において潜在的な役割を示唆した。ＢＴＬＡは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、２つの免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、かつＳｒｃ相同性ドメイン２（ＳＨ２）含有タンパク質チロシンホスファターゼ（ＳＨＰ）−１及びＳＨＰ−２と会合する。ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ１４）との連結を介して、ＢＴＬＡは、樹状細胞及びメモリーＴ細胞の恒常性を維持し、Ｔ細胞活性化を制限するのに重要な役割を果たす。次の活性化を誘導する他の抑制性受容体とは対照的に、ＢＴＬＡは、ほとんどの免疫細胞で恒常的に発現される。しかし、ＢＴＬＡのレベルは、異なるリンパ系細胞型および骨髄性細胞型の間で実質的に変化し、これは、ＢＴＬＡ発現の制御が、リンパ組織における恒常性を制御する上で重要な因子であり得ることを示唆している。

本明細書において、ＲＯＲγｔ及びＩＬ−７が、ＢＴＬＡの発現を調節することによりγδＴ細胞の恒常性及び機能に影響を与えることを実証する。ＲＯＲγｔの活性化機能−２ドメインは、ＢＴＬＡの転写活性を抑制することが要求されるが、一方、ＩＬ−７は、ＢＴＬＡの表面レベルを増大させる。ＢＴＬＡは、γδＴ細胞の数を制限し、そして、ＩＬ−７応答及びＣＤ２７⁻ＲＯＲγｔ^＋集団の増殖を制限することにより、γδＴサブセットの正常な分布を維持する。重要なことは、ＢＴＬＡは、ＩＬ−１７及びＴＮＦ産生を制御することである。それ故に、ＢＴＬＡ欠損動物は、皮膚炎のγδＴ細胞依存モデルで疾患の亢進を呈する。したがって、ＲＯＲγｔ及びＩＬ−７は、ＢＴＬＡの発現を調節することによって、抑制刺激と活性化刺激のバランスを保ってγδＴ細胞の恒常性及び炎症応答を制御する。

本発明は、ＢＴＬＡ、ＩＬ−７及びＲＯＲγｔがγδＴ細胞の活性及びレベルを調節するという発見に関する。具体的には、本発明は、ＢＴＬＡの発現を調節することにより、γδＴ細胞の恒常性及び機能を調節する方法を提供する。更に、本発明は、ＢＴＬＡ、ＲＯＲγｔ及びＩＬ−７の活性及び発現を調節する薬剤、並びにそのような薬剤のスクリーニングのための方法を提供する。本発明はまた、ＢＴＬＡ、ＲＯＲγｔ及びＩＬ−７のモジュレーターを使用して、自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するための方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、γδＴ細胞のレベル及び／または活性を調節する１つまたは複数の薬剤を対象に投与し、それにより、炎症性疾患または自己免疫疾患を処置することを含む、その必要のある対象における炎症性疾患または自己免疫疾患を処置する方法を提供する。一態様において、薬剤は、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）の発現または活性を増大させる。別の態様では、薬剤は、レチノイド関連オーファン受容体γアイソフォームｔ（ＲＯＲγｔ）の発現または活性を阻害する。ある態様では、薬剤はＩＬ−７の発現または活性を増大させる。一態様では、薬剤は、γδＴ細胞によるＩＬ−１７またはＴＮＦの産生を調節する。ある態様では、薬剤はＲＯＲγｔ⁻γδＴ細胞またはＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞のレベルを調節する。別の態様では、一つの薬剤は、ＢＴＬＡの発現または活性を増大させ、そして、第二の薬剤は、ＲＯＲγｔの発現または活性を阻害する。さらなる態様では、薬剤は、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）−ＢＴＬＡ相互作用を阻害する。さらなる態様では、薬剤は、γδＴ細胞のレベルを低下させる。さらなる態様では、炎症または自己免疫疾患は、乾癬、多発性硬化症、糖尿病、皮膚炎、セリアック病、癌、硬化性胆管炎、または関節リウマチであってもよい。

さらなる実施形態において、本発明は、ＢＴＬＡの発現または活性を調節する薬剤を投与することを含む、γδＴ細胞のレベル及び活性を調節する方法を提供する。一態様では、薬剤は、ＢＴＬＡの発現または活性を増大させ、かつγδＴ細胞のレベル及び／または活性を増大させる。さらなる態様では、薬剤は、ＩＬ−７の発現もしくは活性を増大させるか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を阻害する。さらなる態様では、薬剤はＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用を阻害する。一態様では、薬剤はＢＴＬＡの発現または活性を低下させ、かつγδＴ細胞のレベル及び／または活性を低下させる。別の態様では、薬剤はＩＬ−７の発現もしくは活性を阻害するか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を増大させる。

一実施形態において、本発明は、ＢＴＬＡの発現または活性を調節する薬剤を投与することを含む、γδＴ細胞のＩＬ−１７またはＴＮＦ産生を調節する方法を提供する。ある態様では、薬剤は、ＢＴＬＡの発現または活性を増大させ、かつγδＴ細胞のＩＬ−１７またはＴＮＦ産生を低下させる。さらなる態様では、薬剤は、ＩＬ−７の発現もしくは活性を増大させるか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を阻害する。ある態様では、薬剤はＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用を阻害する。一態様では、薬剤は、ＢＴＬＡの発現または活性を阻害し、かつγδＴ細胞のＩＬ−１７またはＴＮＦ産生を増大させる。さらなる態様では、薬剤は、ＩＬ−７の発現もしくは活性を阻害するか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を増大させる。

さらなる実施形態において、本発明は、リンパ球培養物を薬剤と接触させること、培養物中のγδＴ細胞のレベルを決定すること、及びγδＴ細胞のレベルを、薬剤と接触していないリンパ球培養物中のγδＴ細胞のレベルと比較することを含む、ＢＴＬＡのアゴニストをスクリーニングする方法であって、薬剤と接触したリンパ球培養物中のγδＴ細胞の増大したレベルは、薬剤がＢＴＬＡアゴニストであることを示す、方法を提供する。一態様では、リンパ球培養物は、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、及びＣＤ２７⁻γδＴ細胞について濃縮されている。別の態様では、γδＴ細胞のレベルは、γδＴ細胞表面マーカーを有する細胞を同定することによって決定される。さらなる態様では、細胞表面マーカーは、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７またはＲＯＲγｔであってもよい。

γδＴ細胞におけるＢＴＬＡの発現を示す。（Ａ）ＲＯＲγｔ及びＴＣＲβの発現。（Ｂ）ＲＯＲγｔゲート細胞におけるＢＴＬＡ及びＴＣＲ−βの発現。（Ｃ）ＲＯＲγｔゲート細胞におけるＴＣＲγδ及びＴＣＲβの発現。（Ｄ）ＴＣＲγδ^＋細胞及びＴＣＲβ^＋細胞におけるＢＴＬＡ発現についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）。（Ｅ）γδＴ細胞におけるＢＴＬＡ及びＲＯＲγｔの発現。（Ｆ）ＲＯＲγｔ⁻γδＴ細胞及びＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞におけるＢＴＬＡ発現についてのＭＦＩ。 γδＴ細胞におけるＢＴＬＡの発現を示す。（Ｇ）γδＴ細胞におけるＣＤ２７及びＲＯＲγｔの発現。（Ｈ）ＲＯＲγｔ⁻（左側）及びＲＯＲγｔ^＋（右側）γδＴ細胞におけるＢＴＬＡ及びＣＤ２７の発現。（Ｉ）ＣＤ２７^＋ＲＯＲγｔ⁻、ＣＤ２７^＋ＲＯＲγｔ^＋、及びＣＤ２７⁻ＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞におけるＢＴＬＡ発現についてのＭＦＩ。 ＲＯＲγｔがＢｔｌａの転写リプレッサーであることを示す。（Ａ）Ｒｏｒｃ（ｔ）^{ｇｆｐ／＋}マウスのｉＬＮ（左側）由来及びパイエル板（ＰＰ）（右側）由来のリンパ球におけるＲＯＲγｔ及びＣＤ１２７の発現。（Ｂ）ｉＬＮγδＴ細胞及びＰＰ ＩＬＣにおけるＲＯＲγｔ−ＧＦＰ発現についてのＭＦＩ。（Ｃ）ＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞及びＩＬＣにおけるＢＴＬＡ発現についてのＭＦＩ。（Ｄ）ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＲＯＲγｔレトロウイルス（ＲＶ−ＲＯＲγｔ）、または空のレトロウイルス（ＲＶ）で形質導入した細胞におけるＢＴＬＡ及びＧＦＰの発現。（Ｅ）ＲＶ₋ＲＯＲγｔで形質導入された、ＦＡＣＳソートＲＯＲγｔ⁻ＧＦＰ⁻、ＲＯＲγｔ−ＧＦＰ^Ｌｏｗ、及びＲＯＲγｔ−ＧＦＰ^Ｈｉｇｈ細胞におけるＲｏｒｃ及びＢｔｌａのｍＲＮＡレベル(Ｌ３２に対する）。 ＲＯＲγｔがＢｔｌａの転写リプレッサーであることを示す。（Ｆ）ヒト及びマウスＢＴＬＡコード遺伝子のプロモーター領域間の配列類似性、並びに保存されたＲＯＲγｔ結合部位及び転写開始（矢印で指示）に対するその位置のグラフ表現。（Ｇ）ＲＶ−ＲＯＲγｔで形質導入された細胞における、抗ＲＯＲγまたは対照ＩｇＧを用いたＣｈＩＰアッセイの後の、ＲＯＲγｔ結合部位−４９および−３６９のＰＣＲ解析。（Ｈ）野生型または変異プロモーターを同時形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞における、マウスＢｔｌａプロモーターレポーター活性。（Ｉ）野生型（ｗｔ）または活性化機能ドメイン２（ＡＦ２）変異体またはＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）変異体のＲＯＲγｔの存在下または非存在下における、野生型プロモーターを同時形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるマウスＢｔｌａプロモーターレポーター活性。 ＢＴＬＡがリンパ節におけるγδＴ細胞の恒常性を負に制御することを示す。（Ａ）Ｂｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−マウスからのＴＣＲγδ^＋ＴＣＲβ⁻ゲート細胞におけるＣＤ２７及びＶγ２の発現。（Ｂ）Ｂｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−マウスにおける、ＣＤ２７⁻：ＣＤ２７^＋γδＴ細胞の比率。（Ｃ）ヒストグラムは、Ｂｔｌａ^−／−マウスにおけるＣＤ２７⁻Ｖγ２^＋細胞の増大を示す。（Ｄ〜Ｈ）γδＴ細胞の数。（Ｄ）総数、（Ｅ）ＣＤ２７⁻。 ＢＴＬＡがリンパ節におけるγδＴ細胞の恒常性を負に制御することを示す。（Ｄ〜Ｈ）γδＴ細胞の数。（Ｆ）ＣＤ２７^＋、（Ｇ）ＣＤ２７⁻Ｖγ２⁻、（Ｈ）ＣＤ２７⁻Ｖγ２^＋。（Ｉ）Ｂｔｌａ^＋／＋（上部）及びＢｔｌａ^−／−（底部）マウスにおけるＣＤ２７^＋、ＣＤ２７⁻Ｖγ２^＋及びＣＤ２７⁻Ｖγ２⁻γδＴ細胞の分布。 ＢＴＬＡがリンパ節におけるγδＴ細胞の恒常性を負に制御することを示す。（Ｊ）ＦＡＣＳプロットは、ＴＣＲγδ^＋ＴＣＲβ⁻ゲート細胞におけるγδＴ細胞サブセットの頻度を示す。（Ｋ）血液中のＣＤ４５．２^＋Ｂｔｌａ^−／−及びＣＤ４５．２⁻Ｂｔｌａ^＋／＋全γδＴ細胞の百分率。（Ｌ）血液中のＣＤ４５．２^＋Ｂｔｌａ^−／−及びＣＤ４５．２⁻Ｂｔｌａ^＋／＋γδＴ細胞サブセットの百分率。（Ｍ）ｉＬＮ中のＣＤ４５．２^＋Ｂｔｌａ^−／−及びＣＤ４５．２⁻Ｂｔｌａ^＋／＋ＣＤ２７^＋γδＴ細胞サブセットの頻度。（Ｎ）ｉＬＮ中のＣＤ４５．２^＋Ｂｔｌａ^−／−及びＣＤ４５．２⁻Ｂｔｌａ^＋／＋ＣＤ２７⁻γδＴ細胞サブセットの頻度。 ＩＬ−７及びＢＴＬＡがフィードバックループを形成しないことを示す。（Ａ）ＴＣＲγδ^＋ＴＣＲβ⁻ゲート細胞における、ＩＬ−７有りまたはなしでのＣＤ２７及びＶγ２の発現。（Ｂ）ＩＬ−７有りまたはなしでのＢｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−ＣＤ２７⁻γδＴ細胞の百分率。(Ｃ〜Ｆ)ＩＬ−７有りまたはなしでの、細胞数の比率で定義されるγδＴ細胞の細胞充実度の差（倍率）。（Ｃ）Ｖγ２⁻ＣＤ２７⁻γδＴ細胞、（Ｄ）Ｖγ２^＋ＣＤ２７⁻γδＴ細胞、（Ｅ）Ｖγ２⁻ＣＤ２７^＋γδＴ細胞、（Ｆ）Ｖγ２^＋ＣＤ２７^＋γδＴ細胞。 ＩＬ−７及びＢＴＬＡがフィードバックループを形成しないことを示す。（Ｇ）ＩＬ−７有りまたはなしでの、ｉＬＮγδＴ細胞（上部）及びＰＰ ＩＬＣ（底部）におけるＢＴＬＡ及びＲＯＲγｔの発現。（Ｈ）ＢＴＬＡ^＋ｉＬＮγδＴ細胞の数。（Ｉ）ｉＬＮγδＴ細胞におけるＢＴＬＡ発現についてのＭＦＩ。（Ｊ）ＢＴＬＡ^＋ＰＰ ＩＬＣの数、（Ｋ）ＰＰ ＩＬＣにおけるＢＴＬＡ発現についてのＭＦＩ。 ＢＴＬＡがγδＴ細胞のＩＬ−１７及びＴＮＦ産生を制御することを示す。（Ａ、Ｃ）ＩＬ−７有り（底部）またはなし（上部）でのＩＬ−１７（Ａ）またはＴＮＦ（Ｃ）及びＣＤ２７の発現。（Ｂ、Ｄ）ＩＬ−７有りまたはなしでの、ＩＬ−１７⁻（Ｂ）またはＴＮＦ⁻（Ｄ）発現ＣＤ２７⁻（上部）またはＣＤ２７^＋（底部）Ｂｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−γδＴ細胞の百分率。 Ｂｔｌａ^−／−動物が皮膚炎を起こしやすいことを示す。（Ａ）ＩＭＱ処置Ｂｔｌａ^−／−マウスにおける炎症を起こした皮膚の存在。（Ｂ）ＩＭＱ処置マウスの表皮の肥厚。（Ｃ）未処置またはＩＭＱ処置Ｂｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−マウスからの皮膚切片のＨ＆Ｅ染色。 Ｂｔｌａ^−／−動物が皮膚炎を起こしやすいことを示す。（Ｄ）未処置またはＩＭＱ処置マウスにおける表皮γδＴ細胞（ＴＣＲγδ^＋Ｖｇ３⁻）の百分率。（Ｅ）ＩＭＱ処置Ｂｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−マウスにおける表皮Ｌｙ６Ｇ^＋細胞の百分率。（Ｆ）ＩＭＱ処置Ｂｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−マウスにおけるリンパ節（ＬＮ）ＣＤ２７⁻γδＴ細胞の百分率。 アゴニスト抗ＢＴＬＡによる処置は、γδＴ細胞を阻害し、皮膚炎を制限することを示す。（Ａ）ナイーブ（−）、及びＩＭＱ処置、またはＩＭＱ＋６Ａ６処置動物におけるリンパ節Ｖγ２^＋ＣＤ２７⁻γδＴ細胞の百分率。（Ｂ）ナイーブ（−）、及びＩＭＱ処置、またはＩＭＱ＋６Ａ６処置動物におけるリンパ節Ｖγ２^＋ＩＬ−１７^＋ＣＤ２７⁻γδＴ細胞の百分率。（Ｃ）ナイーブ（−）、及びＩＭＱ処置、またはＩＭＱ＋６Ａ６処置動物における皮膚Ｖγ２^＋ＣＤ２７⁻γδＴ細胞の百分率。（Ｄ）ＩＭＱ処置またはＩＭＱ＋６Ａ６処置動物からの皮膚切片のＨ＆Ｅ染色。（Ｅ）ＩＭＱ処置またはＩＭＱ＋６Ａ６処置動物の表皮肥厚。 マウス及びヒトＲＯＲγｔ⁻ＩＬＣにおけるＢＴＬＡの発現を示す。（Ａ）ＲＯＲγｔ及びＴＣＲβの発現。（Ｂ）ＲＯＲγｔゲート細胞におけるＢＴＬＡ及びＴＣＲβの発現。（Ｃ）ＲＯＲγｔゲート細胞におけるＴＣＲγβ及びＴＣＲβの発現。（Ｄ）ＩＬＣ及びＴＣＲβ^＋細胞におけるＢＴＬＡ発現についてのＭＦＩ。（Ｅ）ＰＰ由来のＲＯＲγｔ^＋ＩＬＣまたはｉＬＮ由来のＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞におけるＢＴＬＡ。（Ｆ）ＰＰ中のＲＯＲγｔ^＋及びＲＯＲγｔ⁻Ｔｈｙ１．２^＋ＣＤ１２７^＋ＩＬＣにおけるＢＴＬＡの発現。（Ｇ）ＣＤ１２７^＋ＣＣＲ６^＋細胞についてゲートしたヒトＣＤ３^＋及びＣＤ３⁻末梢血リンパ球におけるＣＤ１１７及びＢＴＬＡの発現。（Ｈ〜Ｉ）ヒト扁桃リンパ球におけるＩＬ−２２及びＢＴＬＡ（Ｈ）またはＣＤ１１７及びＣＤ３（Ｉ）の発現。 異なるリンパ組織における、並びにＢｔｌａ^−／−及びＢｔｌａ^／1＋γδＴ細胞におけるＨＶＥＭの発現を示す。（Ａ）脾臓、ｉＬＮ、腸間膜ＬＮ（ｍＬＮ）、小腸のＰＰ及び固有層（ＬＰ）中のＲＯＲγｔ^＋ＴＣＲβ⁻及びＲＯＲγｔ^＋ＴＣＲβ^＋におけるＨＶＥＭの発現。（Ｂ）Ｂｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−γδＴ細胞におけるＨＶＥＭの発現。 ＴＨ１７及び二重陽性胸腺細胞におけるＢＴＬＡの発現を示す。（Ａ）非極性（ＴＨＯ）またはＴＨ１７分極条件下で活性化され、ＰＭＡ＋イオノマイシンで再刺激されたマウス脾臓ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＩＬ−１７染色。（Ｂ）ＴＨＯ及びＴＨ１７細胞におけるＢＴＬＡの発現。（Ｃ）ＴＨＯ及びＴＨ１７細胞におけるＢＴＬＡ発現についてのＭＦＩ。（Ｄ）Ｒｏｒｃ（ｔ）^{ｇｆｐ／＋}マウスから単離されたＤＰ（ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋二重陽性）、ＣＤ４^＋一重陽性及びＣＤ８^＋一重陽性胸腺細胞におけるＲＯＲγｔ及びＢＴＬＡの発現。 ＲＯＲγｔがＢＴＬＡを抑制することを実証する。（Ａ）ＲＯＲγｔノックダウンにおけるＢＴＬＡの発現。（Ｂ）ジゴキシン処置ＲＯＲγｔ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＢＴＬＡのｍＲＮＡ及び表面発現。（Ｃ）ＲＯＲγｔ結合部位−４９及び−３６９に特異的なプライマーを用いるｑＰＣＲ解析。（Ｄ）野生型または変異型プロモーターと１０ｎｇのＲＯＲγｔ発現プラスミドを同時形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるマウスＢｔｌａプロモーターレポーター活性。 保存されたＲＯＲγｔ結合部位及びマウスＢＴＬＡプロモーター変異体を示す、ヒト（配列番号：２０）及びマウス（配列番号：１９）ＢＴＬＡプロモーター領域の整列された配列を示す。 ＲＯＲγｔの変異を示す。３つの機能ドメインを示す、ＲＯＲγｔのアミノ酸配列（配列番号：２１）。 ＲＯＲγｔの変異を示す。ＲＯＲγｔの切断型変異体。 ＲＯＲγｔの変異を示す。２９３ＴにおけるＲＯＲγｔ−ＧＦＰ発現を染色する抗体によるＲＯＲγｔの発現。 ＢＴＬＡが胸腺γδＴ細胞を負に制御することを示す。（Ａ）胸腺細胞におけるγδＴ細胞サブセットを識別するためのゲーティング戦略。（Ｂ）ＣＤ２７^＋及びＣＤ２７⁻γδＴ細胞におけるＢＴＬＡの発現。（Ｃ）ＣＤ２７^＋及びＣＤ２ＴγδＴ細胞におけるＢＴＬＡ発現についてのＭＦＩ。（Ｄ〜Ｈ）γδＴ細胞の数。（Ｄ）総数、（Ｅ）ＣＤ２７^＋、（Ｆ）ＣＤ２Ｔ、（Ｇ）ＣＤ２７⁻Ｖγ２^＋、（Ｈ）ＣＤ２７⁻Ｖγ２⁻。（Ｉ）Ｂｔｌａ^＋／＋（上部）及びＢｔｌａ^−／−（底部）マウスにおける、胸腺ＣＤ２７^＋、ＣＤ２７⁻Ｖｙ２^＋、及びＣＤ２７⁻Ｖγ２⁻γδＴ細胞の分布。 ＢＴＬＡが、腸ＩＬＣではなく末梢ＩＬＣの恒常性に影響を与えることを示す。（Ａ）ＩＬＣについて濃縮したＢｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−マウスＰＰ由来リンパ球のＦＡＣｓ解析。（Ｂ）（Ｃ）のために用いた実験方法の概略。（Ｃ）Ｂｔｌａ^＋／＋（ＣＤ４５．１^＋）またはＢｔｌａ^−／−（ＣＤ４５．１⁻）で再構築したＲａｇ２^−／−Ｉｌｒｇ^−／−マウスの脾臓から単離されたリンパ球。 Ｂｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−γδＴ細胞におけるＣＤ１２７の発現を示す。 活性化サイトカインとともに培養した後の、ＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞上でのＢＴＬＡの発現を示す。（Ａ）サイトカインでまたは（Ｂ）ＳＴＡＴ−阻害剤（ＳＴＡＴ５ｉ）有りもしくはなしでのＩＬ−７で培養した、ＣＤ２７⁻γδＴ細胞について濃縮したＲｏｒｃ（ｔ）^{ｇｆＰ／＋}マウスｉＬＮ由来リンパ球。 ＦＡＣＳでの、Ｖγ２^＋及びＶγ２⁻ＣＤ２⁻γδＴ細胞によるＩＬ−１７の発現、及びその百分率を示す。 皮膚における非ＤＥＴＣγδＴ細胞の解析のためのゲーティング戦略を示す。 ＣＤ４^＋γδＴ細胞がＢｔｌａ^−／−動物のＩＭＱ誘発性炎症に関与していないことを実証する。ＩＭＱ処置前後のＢｔｌａ^＋／＋及びＢｔｌａ^−／−マウスの表皮におけるＴＣＲγ^＋細胞の百分率。 ＣＤ４^＋γδＴ細胞がＢｔｌａ^−／−動物のＩＭＱ誘発性炎症に関与していないことを実証する。抗ＧＫ１．５の単回注射後、ＩＭＱ処置Ｂｔｌａ^−／−マウスにおいて、ＣＤ４Ｔ細胞が枯渇した。 ＣＤ４^＋γδＴ細胞がＢｔｌａ^−／−動物のＩＭＱ誘発性炎症に関与していないことを実証する。ＣＤ４が十分である、またはＣＤ４が枯渇したＩＭＱ処置Ｂｔｌａ^−／−マウスにおいて差異がないことを示す皮膚組織のＨ＆Ｅ染色。 毎日のＩＭＱクリーム適用に対する野生型及びＢＴＬＡ欠損マウスの応答を示す。（Ａ）ＩＭＱ処置マウスにおけるリンパ節の重量。（Ｂ）ＩＭＱ処置マウスにおけるリンパ節（ＬＮ）ＣＤ２ＴγδＴ細胞の百分率。（Ｃ）未処置またはＩＭＱ処置マウスにおける表皮γδＴ細胞（ＴＣＲγδ^＋Ｖγ３⁻）の百分率。（Ｄ）ＩＭＱ処置マウスにおける表皮肥厚。

詳細な説明
本発明は、ＢＴＬＡ、ＩＬ−７及びＲＯＲγｔがγδＴ細胞の活性及びレベルを調節するという発見に関する。具体的には、本発明は、ＢＴＬＡの発現を調節することにより、γδＴ細胞の恒常性及び機能を調節する方法を提供する。本発明は、更に、ＢＴＬＡ、ＲＯＲγｔ及びＩＬ−７の活性及び発現を調節する薬剤、並びにそのような薬剤のスクリーニングのための方法を提供する。本発明はまた、ＢＴＬＡ、ＲＯＲγｔ及びＩＬ−７のモジュレーターを使用して、自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するための方法を提供する。

本発明の組成物及び方法を記載する前に、本発明は、特定の組成物、方法、及び記載される実験条件に限定されるものではなく、そのような組成物、方法、及び条件は変化してもよいことが理解されるべきであろう。また、本発明の範囲は添付の特許請求範囲においてのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を単に説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解すべきである。

本明細書及び添付の特許請求範囲で使用するとき、単数形態「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、特に断りのない限り、複数を言及することも包含する。それ故、例えば、「その方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つもしくは複数の方法、及び／または本明細書で記載したタイプの工程を含み、それは、本開示などを読むことにより当業者には明白になるであろう。

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者により理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び物質を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、及び物質は、ここで記載されるものである。

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。これらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球から区別することができる。Ｔ細胞は、（いくつかは扁桃でも成熟するが）胸腺で成熟する。Ｔ細胞のいくつかのサブセットが存在し、各々は別個の機能を有する。

Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）は、形質細胞及びメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟、並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスを支援する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原の提示を受けると、活性化する。これらの細胞は、免疫応答の異なるタイプを促進する異なるサイトカインを分泌する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプの１つに分化することができる。

細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、また、移植片拒絶に関与している。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子と会合した抗原に結合することにより、その標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシン、及び制御性Ｔ細胞により分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、自己免疫疾患を防ぐアネルギー状態に不活性化され得る。

メモリーＴ細胞は、感染が解消した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、その同種抗原への再曝露の際に、多数のエフェクターＴ細胞へと直ちに増殖し、したがって、過去の感染に対する「メモリー」を有する免疫システムを提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプを含む：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）及びエフェクターメモリーＴ細胞の２つのタイプ（ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）。

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持のために重要である。Ｔｒｅｇ細胞は、免疫反応の終わりに向けてＴ細胞媒介免疫をシャットダウンし、胸腺内で負の選択の処理を逃れる自己反応性Ｔ細胞を抑制する。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラスが記載されている：Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞、及びＦｏｘｐ３−Ｔｒｅｇ細胞。制御性Ｔ細胞は、胸腺内での正常な発達の間に発達することができ、それ故、胸腺Ｔｒｅｇ細胞として知られ、または、末梢で誘導することができ、末梢誘導性Ｔｒｅｇ細胞と呼ばれる。

ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、適応免疫系と自然免疫系をつなぐ。ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄにより提示された糖脂質抗原を認識する。一旦活性化されると、これらの細胞は、Ｔｈ及びＴｃの両細胞に起因する機能（すなわち、サイトカイン産生及び細胞溶解性／細胞殺傷分子の放出）を実行することができ、そして、いくつかの腫瘍細胞及びヘルペスウイルスに感染した細胞を認識し、除去することができる。

ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）は、それらの表面上に別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さいサブセットを表す。Ｔ細胞の大部分は、α−ＴＣＲ鎖及びβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの糖タンパク質鎖から構成されたＴＣＲを有する。しかし、γδＴ細胞では、ＴＣＲは１つのγ鎖及び１つδ鎖から構成されている。Ｔ細胞のこのグループは、ヒト及びマウスにおいては、あまり一般的ではなく（全Ｔ細胞の約２％）、そして、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）として知られるリンパ球の集団内の腸粘膜において最も多量に発見されている。γδＴ細胞を活性化する抗原分子は、まだ広く知られていない。しかし、γδＴ細胞は、ＭＨＣ拘束性ではなく、抗原提示細胞上のＭＨＣ分子により提示されるペプチドを必要とするよりも、むしろ全タンパク質を認識することができるように思われる。しかし、いくつかのマウスγδＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＢ分子を認識する。末梢血中の主要なγδＴ細胞集団を構成するヒトＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞は、総称してリン酸化抗原と命名されている非ペプチドリン酸化イソプレノイド前駆体のセットに特異的かつ迅速に応答するという点で独特である。リン酸化抗原は、事実上全ての生細胞により産生される。動物及びヒト細胞（癌細胞を含む）からの最も一般的なリン酸化抗原は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びその異性体であるピロリン酸ジメチルアリル（ＤＭＡＰＰ）である。多くの微生物は、高活性化合物であるヒドロキシＤＭＡＰＰ（ＨＭＢ−ＰＰ）を産生し、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに加えて、モノヌクレオチドコンジュゲートに対応している。

Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）は、ヒトにおけるＢＴＬＡ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＢＴＬＡの発現は、Ｔ細胞の活性化の間に誘導され、そして、ＢＴＬＡは、ＴＨ２細胞ではなく、ＴＨ１細胞上で発現され続ける。ＢＴＬＡは、ＰＤ１及びＣＴＬＡ４と同様に、Ｂ７ホモログであるＢ７Ｈ４と相互作用する。しかし、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４とは異なり、ＢＴＬＡは、細胞表面受容体のＢ７ファミリーだけでなく、腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦ−Ｒ）との相互作用を介したＴ細胞阻害を見せる。ＢＴＬＡは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）のリガンドである。ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答を負に調節する。ＢＴＬＡの発現はまた、γδＴ細胞のレベルを調節し、ＩＬ−７の発現とともに、γδＴ細胞についての負のフィードバックループを形成する。

レチノイド関連オーファン受容体（ＲＯＲ）は、細胞内転写因子の核内受容体ファミリーのメンバーである。ＲＯＲには、ＲＯＲ−α、ＲＯＲ−β、及びＲＯＲ−γの３つの形態があり、それぞれが別々の遺伝子（それぞれ、Ｒｏｒａ、Ｒｏｒｂ、及びＲｏｒｃ）によってコードされている。ＲＯＲは、二量体として結合する他の核内受容体の大部分とは対照的に、モノマーとしてホルモン応答エレメントに結合するように見えるという点で、やや異例である。ＲＯＲの３つの形態は、以下を含む多くの重要な役割を果たす：ＲＯＲ−α：小脳及びリンパ節の発達、脂質代謝、免疫応答、骨の維持；ＲＯＲ−β：正確な役割は未知であるが、脳及び網膜における高度な発現；並びにＲＯＲ−γ：リンパ節の発達、免疫応答、ＴＨ１７細胞の生存。ＲＯＲγｔはまた、ＢＴＬＡの発現を調節する。

ＩＬ−７は、骨髄及び胸腺におけるストローマ細胞により分泌される造血成長因子である。ＩＬ−７は、リンパ球前駆細胞への複能性（多能性）造血幹細胞の分化を刺激し、そしてリンパ球系列の全ての細胞の増殖を刺激する。これは、Ｂ細胞の成熟の特定の段階での増殖、Ｔ及びＮＫ細胞の生存、発達、恒常性のために重要である。このサイトカインは、初期のＴ細胞の発達におけるＴ細胞受容体ベータ（ＴＣＲβ）のＶ（Ｄ）Ｊ再編成のための補因子であることが見出されている。マウスにおけるノックアウト研究は、このサイトカインが、リンパ系細胞の生存において重要な役割を果たしていることを示唆した。ＩＬ−７はＩＬ−７受容体に結合し、胸腺でのＴ細胞の発達及び末梢での生存のための重要なシグナルのカスケードをもたらす。ＩＬ−７の発現はまた、ＢＴＬＡの発現を調節し、ＢＴＬＡの発現とともに、γδＴ細胞についての負のフィードバックループを形成する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、全身性炎症に関与するアディポカインである。これは、主に、活性化マクロファージにより産生される。ＴＮＦの主な役割は、免疫細胞の調節にある。ＴＮＦは、発熱、アポトーシス細胞死、悪液質、炎症を誘導し、腫瘍形成及びウイルス複製を阻害し、ＩＬ１＆ＩＬ６産生細胞を介して敗血症に応答することができる。ＴＮＦ産生の調節不全は、アルツハイマー病、癌、大うつ病及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む多様なヒト疾患に関与している。ＴＮＦはまた、ＣＤ２７⁻γδＴ細胞により産生される。

インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７）は、炎症部位への単球及び好中球を動員するために、様々な組織におけるケモカイン産生を増大させることにより、遅延型反応における有力なメディエーターとして作用する。ＩＬ−１７は、Ｔヘルパー細胞により産生され、そして遅延型反応において破壊的組織損傷をもたらすＩＬ−２３により誘導される。炎症性サイトカイン及びＩＬ１７などのファミリー機能としてのＩＬ１７は、腫瘍壊死因子及びＩＬ１と相乗的に作用する。多数の免疫調節機能は、サイトカインのＩＬ−１７ファミリーについて、最も顕著には炎症誘発性応答の誘導及び媒介へのその関与について報告されている。ＩＬ−１７の機能はまた、ＴＨ１７細胞に不可欠である。これらの役割の結果として、ＩＬ−１７ファミリーは、関節リウマチ、喘息、ループス、同種移植片拒絶、抗腫瘍免疫、及び最近では乾癬を含む多くの免疫／自己免疫関連疾患と関連付けられている。ＩＬ−１７はまた、ＣＤ２７^＋γδＴ細胞により産生される。

γδＴ細胞は、免疫系の炎症反応において重要な役割を果たし、様々な炎症性疾患及び自己免疫疾患に関与している。例えば、γδＴ細胞が、皮膚の炎症、乾癬、多発性硬化症及び糖尿病の確定に重要な役割を果たすことが示されている。ＢＴＬＡの発現は、γδＴ細胞のレベル及び活性を調節し、したがって、炎症性疾患及び自己免疫疾患を処置するための良好な標的である。ＢＴＬＡ発現の変化は、ＢＴＬＡと結合するリガンドの突然変異により発生する可能性があり、ＢＴＬＡのリガンドであるＨＶＥＭは、セリアック病、硬化性胆管炎及び関節リウマチを含むいくつかの自己免疫関連疾患に関連している。更に、特定の癌は、ＨＶＥＭの変異によって特徴付けられ、これはＨＶＥＭの欠失及びＢＴＬＡの増大した発現（癌の増殖を抑制するように抗体またはＢＴＬＡ活性の他のアゴニストでアゴナイズされ得る）をもたらす。したがって、ＢＴＬＡ発現のモジュレーターは、ＢＴＬＡアゴニストの能力を、単独でまたは癌の増殖及び致死性を制限する他の薬剤との組み合わせで高めることができる。そのような癌には、血液癌、すなわち、白血病及びリンパ腫、並びに乳癌、肺癌及び結腸癌を含むいくつかの固形腫瘍癌が含まれる。血液癌としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及びＢ細胞リンパ腫が挙げられる。

一実施形態において、本発明は、γδＴ細胞のレベル及び／または活性を調節する１つまたは複数の薬剤を対象に投与し、それにより、炎症性疾患または自己免疫疾患を処置することを含む、その必要のある対象における炎症性疾患または自己免疫疾患を処置する方法を提供する。一態様では、薬剤は、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）の発現または活性を増大させる。別の態様では、薬剤は、レチノイド関連オーファン受容体ガンマアイソフォームｔ（ＲＯＲγｔ）の発現または活性を阻害する。ある態様では、薬剤は、ＩＬ−７の発現または活性を増大させる。一態様では、薬剤は、γδＴ細胞によるＩＬ−１７またはＴＮＦの産生を調節する。ある態様では、薬剤は、ＲＯＲγｔ⁻γδＴ細胞またはＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞のレベルを調節する。別の態様では、一つの薬剤は、ＢＴＬＡの発現または活性を増大させ、第二の薬剤は、ＲＯＲγｔの発現または活性を阻害する。更なる態様では、薬剤は、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）−ＢＴＬＡ相互作用を阻害する。更なる態様では、薬剤は、γδＴ細胞のレベルを低下させる。更なる態様では、炎症または自己免疫疾患は、乾癬、多発性硬化症、糖尿病、皮膚炎、セリアック病、癌、硬化性胆管炎、または関節リウマチであってもよい。

本明細書で使用する用語「薬剤」は、γδＴ細胞のレベルを調節する任意の化合物または分子を意味する。このような薬剤は、ＢＴＬＡ、ＩＬ−７またはＲＯＲγｔの発現または活性を調節する。薬剤はＢＴＬＡもしくはＩＬ−７のアゴニスト、またはＲＯＲγｔのアンタゴニストであってもよい。薬剤は、ＢＴＬＡ、ＩＬ−７またはＲＯＲγｔの発現または活性に影響を与える転写因子のモジュレーターを含む。そのような転写因子としては、ＮＦＡＴ、ＡＰ−１、Ｆｏｓ、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、Ｂｃｌ６、Ｄｅｃ１、Ｎｆｉｌ３、Ｇｆｉｌ１、及びＰＺＬＦが含まれる。薬剤は、小分子を含む化合物、または、タンパク質、抗体、もしくはその断片、ペプチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス分子を含む生物学的分子であり得る。薬剤は、当該分野で公知の任意の方法により同定することができる。

本明細書で使用する用語「ポリペプチド／タンパク質」は、例えば、構造成分として酵素、化学伝達物質、受容体、リガンド、制御因子、ホルモンなどの、生物系で作用し得るアミノ酸の線状ポリマーを含む高分子を意味する。そのようなポリペプチド／タンパク質は、抗体などの機能性タンパク質複合体を含む。

本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリンまたはその一部分を意味し、そして起源、元来の種、製造方法、及び特徴に関係なく、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。用語は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多重特異性、非特異性、ヒト化、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異体、及びＣＤＲグラフト化抗体を含むがそれに限定されない。本発明の目的のために、それはまた、特に明記しない限り、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａb）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、及び抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントを含む。

本明細書で使用する用語「小分子」は、高分子ではない化合物を指す（例えば、Ｋａｒｐ（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ １６：２６９−８５；Ｖｅｒｋｍａｎ（２００４）ＡＪＰ−Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８６：４６５−７４を参照）。したがって、小分子は、しばしば、１０００ダルトン未満である化合物と考えられる（例えば、Ｖｏｅｔ ａｎｄ Ｖｏｅｔ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．， ｅｄ． Ｎ． Ｒｏｓｅ， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １４（１９９５））。例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２：５９８１−８６）は、小分子とのフレーズを、葉酸塩、メトトレキセート、及び神経ペプチドを示すために使用しているが、一方、Ｈａｌｐｉｎ及びＨａｒｂｕｒｙ（（２００４）ＰＬｏｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１０２２−３０）は、このフレーズを小分子遺伝子産物、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチドを示すために使用している。天然小分子の例としては、コレステロール、神経伝達物質、及びｓｉＲＮＡを含むが、それに限定されない。合成小分子は、多数の市販の小分子データベース、例えば、ＦＣＤ（Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄａｔａｂａｓｅ）、ＳＭＩＤ（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ）、ＣｈＥＢＩ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、及び ＣＳＤ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ）にリストアップされた様々な化学物質を含むがそれに限定されない（例えば、Ａｌｆａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３３：Ｄ４１６−２４を参照）。

本明細書で使用する用語「調節」または「調節する」は、分子または細胞のレベル、発現または活性の変化を指す。調節は、γδＴ細胞を含む細胞のレベルまたは活性を増大または低下させることを含む。調節はまた、ＢＴＬＡ、ＩＬ−７、ＲＯＲγｔ、ＴＮＦ及びＩＬ−１７の発現または活性を増大または低下させることを含む。

複数の薬剤の組み合わせは、炎症性疾患または自己免疫疾患を処置するために、またはγδＴ細胞のレベル及び活性を調節するために使用することができる。例えば、対象は、ＲＯＲγｔアンタゴニスト及びＢＴＬＡアゴニスト；ＲＯＲγｔアンタゴニスト及びＩＬ−７アゴニスト；またはＩＬ−７アゴニスト及びＢＴＬＡアゴニストの組み合わせを投与されてもよい。更なる例では、ジゴキシンなどの小分子ＲＯＲγｔアンタゴニストは、（６Ａ６）などのＢＴＬＡアゴニスト抗体と組み合わせて使用することができる。

本明細書で使用する用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがそれに限定されない、特定の処置のレシピエントとなる任意の動物（例えば、哺乳動物）を意味する。一般的に、用語「対象」及び「患者」は、ヒト対象への言及において本明細書で互換的に使用される。

自己免疫疾患は、身体に通常存在する物質及び組織に対する身体の異常な免疫応答（自己免疫）から発生する。自己免疫疾患の根底にある病態生理の主要な理解は、自己免疫疾患間の遺伝的共有の顕著な度合いを同定するゲノムワイド関連スキャンの応用である。

自己免疫疾患は、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症（別名：ルー・ゲーリック病）、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗シンターゼ症候群（Ａｎｔｉｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性膵炎、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病／バロー同心円性硬化症、ベーチェット病、ベルジェ病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、癌、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性閉塞性肺疾患、慢性再発性多病巣性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、接触性皮膚炎、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、ドゴー病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん性皮膚全身性硬化症、円板状エリテマトーデス、ドレスラー症候群、薬剤誘発性ループス、湿疹、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維形成異常症、線維化性肺胞炎（または特発性肺線維症）、胃炎、消化管類天疱瘡、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、別名：妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、ヒューズ・ストーヴィン症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄性疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、別名：若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病、ルポイド肝炎、別名：自己免疫性肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、斑状強皮症、ムッハ・ハーベルマン病、別名：急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、メニエール病、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、神経性筋強直症、眼瘢痕性類天疱瘡、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎（Ｏｒｄ'ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（溶連菌感染症関連小児自己免疫性精神神経疾患）、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、扁平部炎、パーソネージ・ターナー症候群、尋常性天疱瘡、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティッフパーソン症候群、スティル病、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、スウィート症候群、シドナム舞踏病、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少症、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化脊椎関節症、蕁麻疹様血管炎、血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症を含むが、それに限定されない。

炎症性疾患は、多種多様なヒト疾患の根底にある障害の大規模グループである。免疫システムは、しばしば、異常な炎症が生じる多くの免疫系障害とともに、アレルギー反応及び幾つかのミオパシーの両方において実証される炎症性疾患に関与している。炎症過程に病因の起源を有する非免疫疾患には、癌、アテローム性動脈硬化症、及び虚血性心疾患が含まれる。多種多様なタンパク質が炎症に関与しており、それらのいずれも、そのタンパク質の正常な機能及び発現を減じるか、またはそうでなければ調節不全にする遺伝子変異にさらされている。炎症に関連する障害の例としては、尋常性ざ瘡、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植片拒絶、血管炎、間質性膀胱炎、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、ミオパシー、白血球欠損、及び癌が挙げられる。

さらなる実施形態において、本発明は、ＢＴＬＡの発現または活性を調節する薬剤を投与することを含む、γδＴ細胞のレベルを調節する方法を提供する。一態様では、薬剤は、ＢＴＬＡの発現または活性を増大させ、かつγδＴ細胞のレベル及び／または活性を増大させる。更なる態様では、薬剤は、ＩＬ−７の発現もしくは活性を増大させるか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を阻害する。更なる態様では、薬剤は、ＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用を阻害する。一態様では、薬剤は、ＢＴＬＡの発現または活性を低下させ、かつγδＴ細胞のレベル及び／または活性を低下させる。別の態様では、薬剤は、ＩＬ−７の発現もしくは活性を阻害するか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を増大させる。

複数の薬剤の組み合わせは、ＢＴＬＡの発現または活性を調節するために使用することができる。例えば、ＲＯＲγｔアンタゴニスト及びＢＴＬＡアゴニスト；ＲＯＲγｔアンタゴニスト及びＩＬ−７アゴニスト；またはＩＬ−７アゴニスト及びＢＴＬＡアゴニストの組み合わせを投与することができる。更なる例では、ジゴキシンなどの小分子ＲＯＲγｔアンタゴニストは、（６Ａ６）などのＢＴＬＡアゴニスト抗体と組み合わせて使用することができる。

一実施形態において、本発明は、ＢＴＬＡの発現または活性を調節する薬剤を投与することを含む、γδＴ細胞のＩＬ−１７またはＴＮＦ産生を調節する方法を提供する。ある態様では、薬剤は、ＢＴＬＡの発現または活性を増大させ、かつγδＴ細胞のＩＬ−１７またはＴＮＦ産生を低下させる。更なる態様では、薬剤は、ＩＬ−７の発現もしくは活性を増大させるか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を阻害する。ある態様では、薬剤は、ＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用を阻害する。一態様では、薬剤は、ＢＴＬＡの発現または活性を阻害し、かつγδＴ細胞のＩＬ−１７またはＴＮＦ産生を増大させる。更なる態様では、薬剤は、ＩＬ−７の発現もしくは活性を阻害するか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を増大させる。

さらなる実施形態において、本発明は、リンパ球培養物を薬剤と接触させること、培養物中のγδＴ細胞のレベルを決定すること、及びγδＴ細胞のレベルを、薬剤と接触していないリンパ球培養物中のγδＴ細胞のレベルと比較することを含む、ＢＴＬＡのアゴニストをスクリーニングする方法であって、薬剤と接触したリンパ球培養物中のγδＴ細胞の増大したレベルは、薬剤がＢＴＬＡアゴニストであることを示す、方法を提供する。一態様では、リンパ球培養物は、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）及びＣＤ２７⁻γδＴ細胞について濃縮されている。別の態様では、γδＴ細胞のレベルは、γδＴ細胞の表面マーカーを有する細胞を同定することによって決定される。さらなる態様において、細胞表面マーカーは、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７またはＲＯＲγｔであってもよい。

以下の実施例では、ＢＴＬＡがリンパ組織におけるγδＴ細胞及びＩＬＣの恒常性を制御することが実証されている。ＲＯＲγｔは、本質的にＢＴＬＡのｍＲＮＡ転写を抑制し、ＢＴＬＡ翻訳及び膜発現を制限し、一方、ＩＬ−７は、ＲＯＲγｔを相殺するようにＢＴＬＡの膜発現を増大させる。本発明者らの観察は、二次リンパ組織における自然リンパ球の数を制御する恒常性の重要な構成成分としてＢＴＬＡを定義する。ＢＴＬＡはまた、成熟リンパ節γδＴ細胞におけるＩＬ−７依存性増殖及びＩＬ−１７及びＴＮＦの産生を制御する。したがって、炎症性刺激に応答して、ＢＴＬＡは、皮膚炎に対する感受性の増大と相関する調節不全の炎症性γδＴ細胞の割合を含むＢＴＬＡ欠損動物において明らかにされている自己免疫病理にブレーキを提供する。

以下の実施例は、本発明の実施形態を更に例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定するものではない。それらは、使用され得るものの典型例であるが、当業者に公知の他の手順、方法論、または技術を代わりに用いてもよい。

実施例１
ＲＯＲγｔ^＋リンパ球は、低下したレベルのＢＴＬＡを発現する
自然リンパ球集団におけるＢＴＬＡの発現を定義するために、ＧＦＰを発現するＲｏｒｃレポーターマウス（Ｒｏｒｃ（ｔ）^{ｇｆｐ／＋}マウス）を、細胞のサブセットを識別するために使用した。鼠径リンパ節（ｉＬＮ）のＲＯＲγｔ^＋集団内で、ＢＴＬＡ^＋ＴＣＲβ^＋細胞とＢＴＬＡ^ｌｏｗＴＣＲβ⁻細胞を区別した（図１Ａ〜Ｂ）。ＲＯＲγｔ^＋細胞間で、ＢＴＬＡ^ｌｏｗＴＣＲβ⁻集団は、γδＴ細胞を＞９５％含み（図１Ｃ）、全てのγδＴ細胞（ＲＯＲγｔ^＋及びＲＯＲγｔ⁻を問わず）は、概して、通常のＴ細胞よりも有意に低い（４分の１）レベルのＢＴＬＡを発現した（図１Ｄ）。しかし、ＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞とＲＯＲγｔ⁻γδＴ細胞の間で表面ＢＴＬＡに有意な差があった（図１Ｅ〜Ｆ）。さらに低いレベルのＢＴＬＡも、ＣＤ２７を欠くＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞において同定されたが、これは、ＢＴＬＡ発現に対する制御の更なるレベルを示す（図１Ｇ〜Ｉ）。リンパ節のＲＯＲγｔ^＋細胞間で、ＩＬ−１７産生及び自己免疫病態に関連するＣＤ２７⁻γδＴ細胞サブセットは、最低レベルのＢＴＬＡを発現した。

腸のパイエル板（ＰＰ）においてＢＴＬＡ^ｌｏｗＴＣＲβ⁻及びＢＴＬＡ^＋ＴＣＲβ^＋のＲＯＲγｔ^＋集団両方が観察された（図８Ａ〜Ｂ）。ｉＬＮと対照的に、ＢＴＬＡ^ｌｏｗＴＣＲβ⁻リンパ球の９０％超が、ＴＣＲγδ発現の欠如により定義されるＩＬＣであった（図８Ｃ）。ＩＬＣおけるＢＴＬＡレベルも通常のＴＣＲβ^＋Ｔ細胞と比較して有意に低下し（図８Ｄ）、そして、ｉＬＮのＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞と比較して約２分の１に低下した（図８Ｅ）。さらに、最も低い表面ＢＴＬＡの発現が、ＲＯＲγｔ⁻Ｔｈｙ１．２^＋ＣＤ１２７^＋細胞と比較して、ＲＯＲγｔ^＋ＩＬＣで観察された（図８Ｆ）。これとは対照的に、ＨＶＥＭレベルは、全てのリンパ器官のＴＣＲβ⁻とＴＣＲβ^＋細胞の間でほぼ同じであった（図９）。

また、血液中のヒト自然リンパ系細胞（ＣＤ３⁻ＣＤ１１７^＋）は、通常のＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ１１７⁻細胞）よりも実質的に低いＢＴＬＡレベルを発現することが見出されたが（図８Ｇ）、一方、ヒト扁桃由来のＩＬ−２２産生ＣＤ１１７^＋ＩＬＣは、検出不可能な表面ＢＴＬＡを有した（図８Ｈ〜Ｉ）。非極性細胞と比較してＲＯＲγｔ^＋分化ＴＨ１７において、及び一重陽性と比較して二重陽性胸腺細胞において、ＢＴＬＡの下方制御を見出した（図１０）。大体のところ、ＲＯＲγｔ^＋細胞におけるＢＴＬＡの少ない発現の傾向は、ヒトとマウスの間で調査した全てのリンパ区画において保存されている。

実施例２
ＲＯＲγｔは、Ｂｔｌａの転写リプレッサーである
マウス及びヒトにおけるＲＯＲγｔ^＋自然リンパ球でのＢＴＬＡの選択的下方調節は、潜在的な制御性相互作用を示唆した。ＰＰ由来のＩＬＣにおけるＲＯＲγｔの最大の発現が、ｉＬＮ由来のγδＴ細胞におけるよりも、５．５倍大きいことが観察された（図２Ａ〜Ｂ）。このデータは、ＩＬＣにおけるＢＴＬＡのレベル低下（図８Ｅ及び図２Ｃ）とあわせて、ＲＯＲγｔ発現レベルとＢＴＬＡ発現レベルとの間に逆相関があることを示唆している。ＲＯＲγｔがＢＴＬＡ発現をアンタゴナイズするかどうかをテストするために、発明者らはＢＴＬＡ^＋マウスＴ細胞株において、ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウイルスを使用して、ＲＯＲγｔを異所的に発現させた。興味深いことに、ＲＯＲγｔの高レベルの異所性発現がＢＴＬＡ発現の低下をもたらしたことが判明した（図２Ｄ〜Ｅ）。さらに、これらの細胞におけるＲＯＲγｔのノックダウンがＢＴＬＡ発現を回復させたが（図１１Ａ）、一方、ＲＯＲγｔ阻害剤ジゴキシンによるＲＯＲγｔ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の処置が、タンパク質及びｍＲＮＡレベルの両方でＢＴＬＡの発現を誘導した（図１１Ｂ）が、これは、ＢＴＬＡの、活性ＲＯＲγｔ依存性抑制を示す。

ＲＯＲγｔが、直接、ＢＴＬＡの転写を抑制するかどうかを決定するために、発明者らは、保存された制御領域のためのマウス及びヒトＢＴＬＡのプロモーターを解析した。２つの保存された標準的なＲＯＲγｔ結合部位は、ヒトＢＴＬＡ遺伝子において−２３２と＋１２４に位置し、マウスＢＴＬＡ遺伝子において、−３６９と−４９に位置することが判明した（図２Ｆ＆１２）。次に、ＲＯＲγｔ形質移入体から調製したクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）のＰＣＲ増幅により、ＲＯＲγｔがこれらの部位に結合するか否かを判断した（図２Ｄ）。重要なことは、−４９はより強いシグナルを増幅した（図１１Ｃ）（これは初代マウス胸腺細胞で検出可能であった（図１１Ｃ））が、マウスプロモーターの保存された部位が両方ともＲＯＲγｔによって沈降した（図２Ｇ）ことである。次に、ＲＯＲγｔがプロモーター活性をどのように制御するのかを決定するために、近位の０．５ｋｂのＢｔｌａプロモーターをルシフェラーゼレポーターにクローン化した。この点に関しては、位置−３６９及び−４９において変異を有するプロモーターでなく、野生型プロモーターのＲＯＲγｔ抑制活性の量のタイトレーション（図２Ｈ）が、直接、ＲＯＲγｔがＢＴＬＡのための転写リプレッサーとして機能できることを実証した（図２Ｈ）。興味深いことに、−３６９部位は、ＢＴＬＡ抑制に対してより寄与するが、両部位の変異は、最適なＢＴＬＡプロモーター活性のために必要とされる（図１１Ｄ）。次に、ＲＯＲγｔが抑制活性をどのように媒介するのかを、転写リプレッサーを動員し得るそのＤＢＤまたはそのＡＦ２ドメインのどちらかを切断することによって決定した（図１３）。特に、ＢＴＬＡプロモーター活性は、ＲＯＲγｔＡＦ２領域が切断された場合に部分的に回復し、そしてＤＢＤ領域が切断された場合に増強した（図２Ｉ）。したがって、Ｂｔｌａの制御は、プロモーターに対するＲＯＲγｔ結合、並びに、転写コリプレッサーとの相互作用を必要とする。

実施例３
ＢＴＬＡはリンパ節及び胸腺におけるγδＴ細胞の恒常性を負に制御する
ＲＯＲγｔによるＢＴＬＡの制御によってｉＬＮにおけるγδＴ細胞サブセットの分布に変化が生じるかどうかを決定した。γδＴ細胞間で、野生型と比較したＢＴＬＡ欠損ｉＬＮにおけるＣＤ２７⁻細胞の頻度の増大が観察され（図３Ａ〜Ｂ）、Ｖγ２発現細胞に対してより顕著な偏りを有し、おそらく、ＢＴＬＡの非存在下でこれらの細胞の無制限の胚発生を反映している（図３Ｃ）。さらに、ＢＴＬＡ欠損ｉＬＮにおいて、ＣＤ２７⁻γδＴ細胞サブセットの数の有意な増大が観察されたが、一方、ＣＤ２７^＋γδＴ細胞の数はより少なくなる傾向にあり、全γδＴ細胞数は、野性型とＢｔｌａ^−／−マウスとで違いがなかった(図３Ｄ〜Ｈ）。これらのデータは総合して、ＢＴＬＡが、γδＴ細胞ニッチ内でＣＤ２７⁻細胞の細胞固有の増殖を制御していることを示す。ＣＤ２７⁻の数のこの増大は、主要なγδＴ細胞サブセットの顕著な再分布をもたらした（図３Ｉ）。

ＢＴＬＡ欠損動物の末梢におけるＣＤ２７⁻γδＴ細胞の増殖が、発達の間に起因するか否かを決定するために、胸腺γδＴ細胞サブセットでＢＴＬＡのレベルを評価した。この点において、ＣＤ２７⁻サブセットは、リンパ節と同様の、ＣＤ２７^＋サブセットよりも低いＢＴＬＡ発現を示した（図１４Ａ〜Ｃ）。興味深いことに、胸腺ＴＣＲγδ^＋細胞の数は、ＣＤ２７を発現するかどうかに関係なく、有意にＢＴＬＡ欠損マウスで増大し、そしてγδＴ細胞サブセットの分布に変化はなかった（図１４Ｄ〜Ｉ）。したがって、ＢＴＬＡは、全ての胸腺γδＴ細胞の増殖を制限するが、これは末梢におけるＣＤ２７⁻γδＴ細胞の特定の増殖を説明していない。

照射された動物の骨髄の再構築に続いて恒常的な増殖を受けるγδＴ細胞に対して、ＢＴＬＡ欠損が競争上の優位性を付与するかどうかを決定するために、調査を行った。ＢＴＬＡ欠損γδＴ細胞の有意に増大した割合は、移入後５週間目の循環リンパ球の間で観察され、ＢＴＬＡ欠損前駆細胞が、これらのニッチ内でその野生型対応物を凌駕したことを実証した（図３Ｊ〜Ｌ）。更に、Ｂｔｌａ^−／−γδＴ細胞のサブセットは、再構築された動物のリンパ節内でそれらの野生型対応物を凌駕した（図３Ｍ〜Ｎ）。しかし、他のドナーからのＶγ２^＋ＣＤ２７⁻γδＴ細胞の、キメラ内での数の低下が観察され、これは胚環境の非存在下での最適以下の発達を反映している可能性がある。

また、腸管関連リンパ組織内のＩＬＣ存在数は、野生型及びＢＴＬＡ欠損マウスの間で差がなかった（図１５Ａ）。しかし、混合骨髄キメラマウスでは、レシピエントマウスの脾臓中のＢｔｌａ^−／−ＩＬＣの数が増大したことを観察した（Ｂｔｌａ^−／−：Ｂｔｌａ^＋／＋比＝１．８）（図１５Ｂ〜Ｃ）が、これは、ＢＴＬＡ欠損が、それらの野生型対応物と比較して、競争上の増殖有意性を提供することを示す。

実施例４
ＩＬ−７及びＢＴＬＡは、負のフィードバックループを形成する
ＢＴＬＡ欠損マウスにおけるＣＤ２７⁻γδＴ細胞の数の増大は、欠陥のある胸腺発達により、部分的に説明することができるが、しかし、ＣＤ２７⁻サブセットの頻度の増大は、所属リンパ節に特異的であった。末梢リンパ器官におけるＢＴＬＡ欠損マウスのＣＤ２７⁻γδＴ細胞の増殖が、無制限のＩＬ−７受容体シグナル伝達に起因し得ると論理づけられたが、それはＩＬ−７が、γδＴ細胞の恒常性に重要であり、そして優先的にＣＤ２７⁻サブセットに影響を与えているからである。この点で、ＩＬ−７で処置したγδＴ細胞の持続した生存率が、未処置の培養物と比較して、エクスビボで培養したリンパ節リンパ球で観察された（図４Ａ）。さらに、ＢＴＬＡ欠損γδＴ細胞は、野生型の対照と比較したＩＬ−７の刺激による頻度の増大（図４Ｂ）及び培養４日後も存続するそれらの能力の増強（図４Ｃ〜Ｆ）により測定した通り、ＩＬ−７の処置に対して、特に、ＣＤ２７⁻サブセット内で応答性が過度になったが、これは、ＣＤ１２７の発現レベルの差異によるものではなかった（図１６）。したがって、ＢＴＬＡは、ＩＬ−７に対するγδＴ細胞応答性を制限する。

活性化が、細胞特異的な様式でＢＴＬＡ発現の制御を誘導することが示された。ＩＬ−７刺激自体がγδＴ細胞またはＩＬＣにおけるＢＴＬＡレベルを変化させるかどうかを、Ｒｏｒｃ（ｔ）^{ｇｆｐ／＋}マウスからのｉＬＮ及びＰＰリンパ球をＩＬ−７の存在下で培養することにより決定すべく評価を行い、２日後にＢＴＬＡ発現を解析した。未処置の対照と比較して、ＩＬ−７は、γδＴ細胞及びＩＬＣの両方でＢＴＬＡ^＋細胞のより多い数、及び増大した表面ＢＴＬＡ発現を誘導した（図４Ｇ〜Ｋ）。更に、γδＴ細胞におけるＢＴＬＡの発現が、ＩＬ−２で誘導され、ＩＬ−７によるＢＴＬＡの上方制御がＳＴＡＴ５依存的であることを見出した（図１７Ａ〜Ｂ）。対照的に、ＩＬ−２３及びＩＬ−１βの二つの強力なγδＴ細胞アクチベーターは、ＢＴＬＡ誘導において、効果がないか、または最小限の効果しかないかのいずれかである（図１７Ａ）。したがって、ＩＬ−７シグナル伝達は、ＢＴＬＡの発現を誘導し、そして次にＩＬ−７依存性応答を制限する。

実施例５
ＢＴＬＡは、γδＴ細胞のＩＬ−１７及びＴＮＦ産生を制御する
成熟したγδＴ細胞は、サイトカインであるＩＬ−１７及びＴＮＦの分泌を介して炎症反応に寄与する。発明者らは、ＢＴＬＡが、ＩＬ−７で刺激したγδＴ細胞の機能を阻害するかどうかを、ＩＬ−１７及びＴＮＦ産生に対する影響を調べることにより決定しようとした。予想された通り、γδＴ細胞サブセット間で、より高い頻度のＣＤ２７⁻細胞がＩＬ−１７を発現し、一方、より多くのＣＤ２７^＋細胞がＴＮＦを発現した（図５）。注目すべきことに、ＩＬ−７処置は、全てのサブセットにおいて、ＩＬ−１７及びＴＮＦを発現する細胞の頻度を増強した（図５）。しかしながら、外因性ＩＬ−７とは関係なく、ＢＴＬＡ欠損マウス由来の有意に多くのＣＤ２７⁻γδＴ細胞が、ＣＤ２７⁻の野生型細胞と比較してＩＬ−１７（図５Ａ〜Ｂ）またはＴＮＦ（図５Ｃ〜Ｄ）を産生した。その上、Ｖγ２発現とは関係なく、より高い頻度のＩＬ−１７産生Ｂｔｌａ^−／−γδＴが存在した（図１８）。したがって、ＢＴＬＡは、ＩＬ−１７及びＴＮＦを産生するγδＴ細胞のＣＤ２７⁻サブセットの恒常的な事前にプログラムされた能力を、負に制御する。極めて対照的に、ＢＴＬＡ欠損γδＴ細胞のＣＤ２７^＋サブセット内で、ＩＬ−１７及びＴＮＦ発現細胞の頻度の全体的な低下を観察した（図５）。これらの結果は総合して、ＢＴＬＡが、恒常性に対する影響とは無関係な、細胞特異的な様式で、γδＴ細胞サブセットにおけるサイトカイン産生を制御することを示している。

実施例６
Ｂｔｌａ^−／−動物は、皮膚炎を起こしやすい
γδＴ細胞は、皮膚の炎症の確立に重要な役割を果たす。マウスにおいて、ＩＬ−１７産生γδＴ細胞は、イミキモド（ＩＭＱ）で活性化した乾癬の重要なイニシエーターであることが示され、そして、ＢＴＬＡ欠損が、疾患のこのモデルに感受性を与える可能性があると論理づけられた。急性皮膚炎誘発モデルを使用すると、ＩＭＱの単回皮膚適用後３日目に、最小限の影響を受けた野生型動物と比較して、実質的な炎症がＢＴＬＡ欠損動物の皮膚で観察された。ＩＭＱで処置したＢｔｌａ^−／−マウスの皮膚内で、広範な紅斑と有意に多くの表皮過形成があった（図６Ａ〜Ｃ）。更に、ＣＤ２７⁻Ｖγ３⁻（非ＤＥＴＣ）でありＶγ２を発現する浸潤性γδＴ細胞（図１９）及びＬｙ６Ｇ^＋顆粒球の数は、Ｂｔｌａ^−／−動物において一致して有意に増大した（図６Ｄ〜Ｅ）。興味深いことに、Ｂｔｌａ^−／−マウスは、定常状態で、増大した皮膚γδＴ細胞を示した（図６Ｄ〜Ｅ）が、これは、ＢＴＬＡの欠如によってマウスが皮膚の炎症にかかりやすくなることを示唆している。リンパ節においてＣＤ２７⁻γδＴ細胞の優先的な増殖はなかった（図６Ｆ）が、これは、全身性応答が無く、かつ局所的なＢＴＬＡ依存性γδＴ細胞応答があることを示唆している。先に示したように、ＩＭＱに対する応答は、ＣＤ４^＋γδＴ細胞とは無関係であった（図２０）。

しかし、ＩＭＱを繰り返し適用（５日間）すると、圧倒的な炎症が、野生型及びＢｔｌａ^−／−マウスの両方に発生し、γδＴ細胞は、Ｂｔｌａ^−／−マウスの皮膚では増大しなかったが、Ｌｙ６Ｇ発現の顆粒球の表皮肥厚や浸潤の有意な違いが分かりにくかった（図２１Ｃ〜Ｄ）。 また、ＢＴＬＡ欠損マウスにおいて、野生型マウスと比較して増殖したリンパ節腫（図２１Ａ）及びより高い頻度のＣＤ２７⁻細胞（図２１Ｂ）が観察され、ＣＤ２７⁻細胞は、いずれの遺伝的背景においても、γδＴ細胞集団の８０％以上を構成していた。この後者の結果は、より長い期間のＩＭＱ処置が、ＢＴＬＡ欠損γδＴ細胞のより大きな増殖を引き起こす全身性反応をもたらしたことを示している。

ＢＴＬＡが皮膚炎及び炎症性γδＴ細胞を阻害できるかどうかを直接試験するために、アゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体を、１日目、３日目、５日目にＩＭＱで処置した野生型動物で使用し（クローン６Ａ６）、そして、リンパ節及び皮膚内で、Ｖγ２^＋ＣＤ２７⁻γδＴ細胞の増殖及びＩＬ−１７産生を解析した。ＢＴＬＡの活性化が、リンパ節及び皮膚におけるγδＴ細胞のＩＭＱ依存性増大を阻害し、そしてＩＬ−１７を産生するその能力を有意に低下させることが見出された（図７Ａ〜Ｃ）。並行して、抗ＢＴＬＡで処置した動物において有意に低下した表皮の肥厚が、対照動物と比較して観察された（図７Ｄ〜Ｅ）。したがって、ＢＴＬＡは、直接、ＩＭＱ誘発性皮膚炎症を制限する。

実施例７
議論
ＢＴＬＡがリンパ組織におけるγδＴ細胞及びＩＬＣの恒常性を制御することが実証された。ＲＯＲγｔは、本質的にＢＴＬＡのｍＲＮＡの転写を抑制し、ＢＴＬＡの翻訳及び膜発現を制限し、一方、ＩＬ−７は、ＲＯＲγｔを相殺するようにＢＴＬＡの膜発現を増大させる。これらの観察は、二次リンパ組織における自然リンパ球の数を制御する恒常性の重要な構成成分としてＢＴＬＡを定義する。ＢＴＬＡはまた、成熟リンパ節γδＴ細胞におけるＩＬ−７依存性増殖及びＩＬ−１７及びＴＮＦの産生を制御する。したがって、炎症性刺激に応答して、ＢＴＬＡは、皮膚炎に対する感受性の増大と相関する調節不全の炎症性γδＴ細胞の割合を含むＢＴＬＡ欠損動物において明らかにされている自己免疫病理にブレーキを提供する。

データは、ＲＯＲγｔのＤＮＡ及び補因子結合ドメインの両方を、Ｂｔｌａの転写に対する抑制的な作用に関連付ける。ＲＯＲγｔはコリプレッサーと相互作用することが知られていないが、ＲＯＲγｔは、ＩＬ−１７の発現を駆動するコアクチベーターＲｕｎｘ１と相互作用する。しかし、様々な発生プロセス、サーカディアンプロセス、及び代謝プロセスを制御する、関連ＲＯＲファミリーであるＲＯＲα、ＲＯＲβ、及びＲＯＲγは、コリプレッサーＮＣＯＲ１、ＮＣＯＲ２、ＲＩＰ１４０、及びニューロン相互作用因子と、特定の遺伝子の発現を抑制するようにリガンド非依存的な様式で相互作用することが知られている。したがって、ＲＯＲγｔが、さらなるＲＯＲγｔ標的の発現を制限するように作用するコリプレッサーと相互作用し得ることを示唆することは不合理ではない。特定のプロモーター配列が、ＲＯＲγｔ結合により活性化されているか、または抑制されているかは、不明のままであるが、これはおそらく、プロモーター特異的な補因子の動員の結果であろう。したがって、ＣＤ２７⁻γδＴ細胞の恒常性を制御する機構の一つは、ＢＴＬＡのＲＯＲγｔ依存性転写ダウンモジュレーションを介するものである。

ＢＴＬＡがγδＴ細胞及びＩＬＣのＩＬ−７依存性恒常性を制御することを示す結果は、ＢＴＬＡがＣＤ８メモリーＴ細胞及び脾臓の樹状細胞サブセットの恒常性を制御するとの以前の報告と一致している。ＢＴＬＡが、サイトカイン誘導性シグナル伝達または細胞活性化を特異的に制御することは報告されていないが、ＢＴＬＡが、ＩＬ−２または他のサイトカインに対する応答を制御し得ることは以前に示唆された。ＢＴＬＡ結合ホスファターゼＳＨＰ−１は、ＩＬ−２及びＩＬ−４により開始されるシグナル伝達を阻害し、おそらくは、サイトカイン受容体自体に直接結合し、Ｊａｎｕｓキナーゼ／シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）複合体を不安定化することが見出されている。ＢＴＬＡが同様にＩＬ−７受容体のシグナル伝達を阻害するかどうかは不明であるが、しかし、経路の拡大する範囲は、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達を含む、ＢＴＬＡ関連チロシンホスファターゼ活性の影響を受けやすく見える。総合して、ＩＬ−７が細胞表面ＢＴＬＡを上方制御し、その後、γδＴ細胞におけるＩＬ−７受容体シグナル伝達を制限するという観察は、負のフィードバックループを例示している。

ＢＴＬＡの発現は、おそらく、分化環境内で活性化サイトカインを組み合わせることによって決定される。ＢＴＬＡ表面レベルは、極性化Ｔヘルパーサブセット間で大きく異なる。例えば、ＢＴＬＡはＴ_Ｈ２細胞と比較してＴＨ１細胞において高度に発現し、これは、極性転写因子であるＧＡＴＡ、ＳＴＡＴ及びＴ−ボックスが、ＢＴＬＡプロモーターの保存領域内のそれぞれの結合部位への係合に活性であり得ることを意味する。ＢＴＬＡ転写のＲＯＲγｔ依存性調節と一致して、ＴＨ１７細胞が、非極性のＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも、実質的に低い（２分の１よりも低い）表面ＢＴＬＡを発現することが見出された。γδＴ細胞運命の選択を駆動するＴＣＲシグナルに加えて、ＣＤ２７⁻ＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞は、おそらく、ＩＬ−１／ＩＬ−２３シグナル伝達に応答して発達していく。特定のリンパ球のサブセットがＢＴＬＡ活性に対して異なる応答を示す理由は明らかではないが、しかし、１つの機構は、ＢＴＬＡとＨＶＥＭまたは他の共シグナル伝達分子との間のサブセット特異的な固有の複合体を必要とし得る。

γδＴ細胞は、様々な炎症性疾患に関与し、乾癬、多発性硬化症、及び糖尿病のマウス自己免疫モデルを利用した実験的証拠でサポートされている。炎症性皮膚炎のγδＴ細胞依存性モデルを使用した発見は、野生型動物では無症状結果となる自己免疫疾患をＢＴＬＡ欠損動物は誘導する傾向があるという以前のデータに寄与する。また、初期の組織特異的γδＴ細胞関連病理のＢＴＬＡ制御は、自然様細胞の調節におけるＢＴＬＡの役割を強調している。これらの結果は、多発性硬化症、セリアック病、硬化性胆管炎、及び関節リウマチを含む自己免疫疾患へのＨＶＥＭの有意な連鎖を示す最近のヒトゲノムワイド関連解析において、追加の関連性を見出す。

抑制性シグナル伝達に対するγδＴ細胞の感受性は、ＢＴＬＡを、選択的生物製剤のための魅力的な標的にする。実際、いくつかの疾患モデルにおいて、ＢＴＬＡに特異的な抗体は、疾患の進行を変化させることができる。ＢＴＬＡがまた、ＣＤ２７^＋γδＴ細胞サブセットからの最適な炎症性サイトカインの産生のために必要とされることが決定されたが、通常のγδＴ細胞において、そして、おそらくは、ＣＤ２７または他の共刺激ＴＮＦ受容体メンバーと組み合わせて発生するとき、潜在的に、エフェクター及びメモリー細胞の分化の間に生存を維持するシグナルを統合するために役立つ。これらのデータは、ＢＴＬＡの選択的活性化が、自己免疫病因を制御するために、これらの予めプログラムされたγδＴ細胞サブセット、及び／またはγδＴ細胞の特異性のレパートリーのバランスを回復させることができることを示唆している。まとめると、本発明者らは、ＲＯＲγｔ及びＩＬ−７がＢＴＬＡの発現を調節し、その結果、抑制刺激と活性化刺激のバランスを保ってγδＴ細胞の恒常性及び炎症応答を制御する、新規な分子経路を示す。

ＣＤ２７⁻ＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞及びＩＬＣでのＢｔｌａの低レベルの発現を説明する、ＲＯＲγｔによるＢｔｌａの転写的抑制が、本明細書に示されている。これとは対照的に、ＩＬ−７は、γδＴ細胞及びＩＬＣにおいてＢＴＬＡの発現を誘導し、ＲＯＲγｔを逆制御するのに役立つ。また、ＢＴＬＡが胸腺においてγδＴ細胞の数を制限し、リンパ節におけるγδＴ細胞サブセットの恒常性の負の制御因子であることが実証されている。恒常性の欠陥は、ＩＬ−７に対するＢＴＬＡ欠損ＣＤ２７⁻γδＴ細胞の過敏反応性によって説明することができる。更に、ＢＴＬＡは、γδＴ細胞サブセット特異的な様式でＩＬ−１７及びＴＮＦの産生を制御する。さらに、ＢＴＬＡ欠損動物は、γδＴ細胞依存性皮膚炎を起こしやすく、一方、ＢＴＬＡアゴニズムは疾患を制限する。この結果は、ＲＯＲγｔ及びＩＬ−７が、ＢＴＬＡに影響を及ぼす新規な制御回路を形成し、自然様Ｔ細胞の恒常性及び炎症反応を制御することを示している。

実施例８
方法及び物質
マウス及びマウス細胞調製物：マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで交配し、ＳＢＭＲＩの動物施設で飼育した。Ｒｏｒｃ（ｔ）^{ｇｆｐ／＋}、Ｂｔｌａ^−／−、及びＢ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃ^ａＰｅｐ^３／ＢｏｙＪマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ社からのものであり、Ｒａｇ２^−／−Ｉｌ２ｒｇ^−／− マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ社からのものである。ＢＭ細胞（２×１０^６／マウス）の細胞移入は、眼窩内送達により実施した。ｉＬＮ、ＰＰまたは脾臓細胞は、７０μｍのストレーナーを通して粉砕することにより調製した。ＩＬＣ及びＣＤ２７⁻γδＴ細胞は、ＢＤＩＭａｇ（商標）システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、パロアルト、ＣＡ）を用いて濃縮した。ＢＭ細胞は、ＰＢＳにより大腿骨から洗い出した。以前に記載されているように小腸固有層リンパ球を調製した（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：１４６３）。

ヒト組織及びヒト細胞調製物：末梢血は、１８〜６５歳の健康なドナーから得た。扁桃は、ＮＤＲＩからのものであった。リンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、ヘパリン化血液から調製した。扁桃細胞は、コラゲナーゼＤ及びＤＮａｓｅＩで４５分間消化することにより単離した。

ＦＡＣＳ染色：表面染色は、２０〜３０分間、氷上で実施した。細胞内染色は、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、製造業者の指示に従って行った。染色した細胞は、４つのレーザを搭載したＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）使用して得た（４８８ｎｍでの青色；５６１ｎｍでの黄緑色；６４０ｎｍでの赤色；４０５ｎｍでの紫色）。ＳＩ中の抗体。

骨髄キメラ：野生型動物は、致死的に９００ラドで照射し、５×１０^６個のＢＴＬＡ欠損（ＣＤ４５．２^＋）骨髄細胞と１：１で混合した５×１０^６個の野生型（ＣＤ４５．２⁻）で再構築した。再構築後５週間で、γδＴ細胞の存在について血液リンパ球を解析した。

イミキモド処置及び組織学：市販のＡｌｄａｒａ（５％イミキモド）クリーム５０ｍｇを、１日おきに１回または３回、マウスの毛を剃った背中に塗布した。３日後、動物を屠殺し、組織を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液中で２時間インキュベートすることにより表皮リンパ球を調製した。または、マウスを、解析前に５日間連続で毎日処置した。ＩＭＱ処置の１日前に、その後、各ＩＭＱ適用の１日後に、抗ＢＴＬＡ（６Ａ６クローン、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）注射を、マウス１匹あたり１００μｇで腹腔内に実施した。組織片を組織学のためにホルマリン中で一晩固定した。パラフィン包埋切片は、Ｈ＆Ｅで染色し、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ（登録商標）ＸＴシステムで２０倍にてスキャンした。

ｑＲＴ−ＰＣＲ：ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のために、全ＲＮＡを、ＦＡＣＳソートした集団から、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）の指示に従って調製した。ＲＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造業者の指示に従って用い、ｃＤＮＡに逆転写した。標的遺伝子は、イントロン−スパニングプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて検出し、相対的な発現は、Ｐｏｗｅｒ（登録商標）ＳＹＢＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて測定した。反応は、ＡＢＩ（登録商標）７９００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して透明な３８４プレート中で実施した。相対的発現を次のように計算した： ２^−ＤＣｔ；Ｃｔ＝サイクル数、ＤＣｔ＝Ｃｔ（標的遺伝子）−Ｃｔ（ハウスキーピング遺伝子）。１の値は、標的とハウスキーピング遺伝子（Ｌ３２）が同等の発現をしたことを意味する。
オリゴ配列（５'−３'）：

ＲＯＲγｔの異所性レトロウイルス発現：感染性レトロウイルスを産生するために、リン酸カルシウム沈殿を使用し、プラスミドＨｉｔ−６０（ｇａｇ＆ｐｏｌ）及びＶＳＶＧ（ｅｎｖ）及びｐＭＩＧまたはｐＭＩＧ−ｍＲＯＲγｔ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２４０６９）のどちらかを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過性に同時形質移入した。上清液を回収し、ＢＴＬＡ^＋ＰＥ１６マウス細胞株を感染させるために使用した。ＰＥ１６Ｔ細胞ハイブリドーマ株は、ＯＸ４０^−／−マウスと交配されたＡＮＤトランスジェニックマウスからのＴ細胞と、ＢＷ５０Ｔ胸腺細胞との融合に由来した（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１８３：７２８６）。

プロモーター解析：ＶＩＳＴＡアライメントは、転写開始の１５ｋｂ上流、及び１ｋｂ下流の遺伝子をコードするヒト及びマウスＢＴＬＡのゲノム配列を使用して、共通のＲＯＲγ−のＲＯＲγｔ結合部位を使用して、オンライン（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／ｖｉｓｔａ）で実施した。クロマチン免疫沈降は、ＳｉｍｐｌｅＣｈｉｐ（登録商標）キット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を使用して、２μｇのαＲＯＲγ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）または２μｇの対照ラビットＩｇを用いて、ＲＯＲγｔ形質移入ＰＥ１６Ｔ細胞株から実施した。ＲＯＲγｔを結合したゲノムＤＮＡを増幅するために、以下のオリゴ（５'−３'）を使用した：

マウスＢｔｌａプロモーターをクローニングするために、ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液１．０（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、マウスの尾から抽出し、かつ３ｋｂ近位ＢＴＬＡプロモーターは、ＰｆｕＩＩ Ｕｌｔｒａ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）及び以下のオリゴ（５'−３'）を用いて増幅した：

生成物は、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてクローニングし、その後、ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社 Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて切り出し、ｐＧＬ４．１７ルシフェラーゼ構築物（Ｐｒｏｍｅｇａ社、 Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）に連結した。

ルシフェラーゼアッセイ：Ｊｕｒｋａｔ細胞は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で洗浄し、そして１０μｇまたは指示された濃度のプロモーター、ＲＯＲγｔ及びＣＤ２８ＤＮＡを用いて、Ｔ８２０矩形波エレクトロポレーター（ＢＴＸ（登録商標）、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて、２３０Ｖ、６５ｍｓで電気穿孔した。細胞は、培地中で終夜培養した後、可溶性αＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）及びαＣＤ２８（０．５μｇ／ｍｌ）で刺激し、１日後、これらを１×受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを製造業者の指示に従って用いて、Ｖｅｒｉｔａｓ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にてアッセイした。

ＲＯＲγｔ及びＢＴＬＡプロモーター変異体の作製：ＲＯＲγｔの切断型変異体は、ラウンド−ワールドＰＣＲ反応（ｒｏｕｎｄ−ｔｈｅ−ｗｏｒｌｄ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）において、以下のオリゴ（５'−３'）を用いて作製した：

ＡＦ２オリゴは、ヌクレオチド位置１４２９〜１４４９に及び、ＤＢＤオリゴは、ヌクレオチド位置８５〜２９３に及んだ。変異は配列決定で確認した。ＢＴＬＡプロモーター点突然変異は、ラウンド−ワールドＰＣＲ反応において、以下のオリゴ（５'−３'）を用いて作製した：

小文字での記載はＲＯＲγｔ部位を示す。Ｆプライマーにおいて、太字、下線付きの小文字の残基は、ヌクレオチド置換を示す（図１１及び図１２も参照）。

インビトロ培養：ＩＬ−７誘導性増殖のために、ｉＬＮリンパ球を４日間、１２ウェルプレート中、１０^７／ｍｌで、ＲＦ１０培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ、ｐ／ｓ、Ｌ−グルタミン）中で培養した。ＩＬ−７誘導ＢＴＬＡ発現のために、ｉＬＮまたはＰＰリンパ球を、ＩＬＣ及びＣＤ２７⁻γδＴ細胞について濃縮し、付着フィーダー細胞を含む２４ウェルプレート中のＲＦ１０培地で２日間培養した。濃縮に続いて、３匹の動物からの細胞を、単一のウェル中１ｍｌで培養した。ＩＬ−７（Ｒ＆Ｄシステムズ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）を１０ｎｇ／ｍｌ添加した。ＩＬ−１７及びＴＮＦの産生のために、全リンパ節細胞を、ＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌ加えてまたは加えずに１８時間培養し、その後、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（７５０ｎｇ／ｍｌ）、及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて３．５時間再刺激した。ＴＨ１７分化は、脾臓からＣＤ４^＋Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）コーティング２４ウェルプレート中、抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）、及びＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍｌ）を有する１．３５×１０^６／ｍｌで培養することによって行った。５日目に、細胞を洗浄し、そして、ＰＭＡ＋イオノマイシン及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で３．５時間再刺激した。ヒトＩＬ−２２の誘導のために、扁桃リンパ球を、４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄシステムズ社）の存在下で、２４ウェルプレート中、１．５×１０^６／ｍｌのＲＦ１０培地で６時間培養した。Ｇｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、最後の３時間の間添加した。

統計解析及びソフトウェア：全てのＦＡＣＳデータを、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａのｖ６．２ソフトウェアを使用して取得し、解析前に補正した。解析は、ＦｌｏｗＪｏ ｖ９．５．２を使用して行った。グラフは、プリズム５．０ｄを使用してプロットした。統計解析を行うために、Ｒでの二元配置分散分析モデルは、ＦＡＣＳ実験間の平均蛍光強度（ＭＦＩ）のばらつきを補正するために使用した。モデルは、分散分析の計算が線形回帰の場合と同じであるという事実を利用し、次の式を使用した：ｌｍ．Ｘ＝ｌｍ（レスポンス：〜ｙ１＋ｙ２、データ＝Ａ）、ここで、Ｘ＝所定のデータセット、レスポンス＝ＭＦＩ、ｙ１＝特定のサイトマー設定での所定のＦＡＣＳ実験で定義された変数１、ｙ２＝比較すべき（例えば、γδＴ対γδＴ細胞）２つの非数値処理グループとして定義された、変数２。他の全ての統計解析（細胞数または細胞増殖の比較）は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、または、Ｐｒｉｓｍのｔ検定を用いて行った。

ＩＬＣ及びＣＤ２７⁻γδＴ細胞についての濃縮のための抗体：
マウス：ビオチン−ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＤＸ５、Ｉ−Ａｂ、Ｇｒｌ、及びＴｅｒ１１９。
ヒト：ビオチン−ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ４１、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＴＣＲａｐ。

ＦＡＣＳ染色のために使用した抗体：以下の抗マウス抗体は、ＦＡＣＳ染色のために異なる組み合わせで使用した。
マウス：ＴＣＲαβ−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０、ＴＣＲαβ−ＰＥ、ＴＯＲＯ−ＰＥ、ＴＣＲＯ−ＡＰＣ、ＣＤ２７−ＰＥＣｙ７、ＴＣＲＶｙ２−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ（商標）７１０、ＣＤ１２７−ＰＥＣｙ７、ＣＤ１２７−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７、ＢＴＬＡ−ＰＥ、ＨＶＥＭ−ＡＰＣ、ＤＸ５−ＦＩＴＣ、ＣＤ９０．２−ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０、ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ、ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、Ｂ２２０−ＡＰＣ、ＣＤ４５．１−ＦＩＴＣ、ＩＬ−１７Ａ−ＰＥ、ＴＮＦ−ＦＩＴＣ、ＴＣＲＶγ３−ＡＰＣ、Ｌｙ６Ｇ−ＦＩＴＣ。
ヒト：ＢＴＬＡ−ＰＥ、ＣＤ３−ｅＦｌｕｏｒ（商標）４５０、ＣＤ１１７−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ（商標）７１０、ＩＬ−２２−ＡＰＣ、ＣＤ１２７−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０、ＣＣＲ６−ＦＩＴＣ、ＣＤ１１ｂ−ＰＥＣｙ７。全ての抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。抗ヒトＢＴＬＡ−ＰＥ及び抗マウスＩＬ−１７Ａは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。抗マウスＴＮＦ−ＦＩＴＣは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社からのものであった。

ＲＯＲγｔのｓｈＲＮＡノックダウン：ＲＯＲγｔ特異的ｓｉＲＮＡ５'−ｃｔｇｃｃａｇａａｔｇａｃｃａｇａｔｔ−３'及びその相補体は、ヘアピンループ配列５'−ｔｔｃａａｇａｇａ−３'とアニールさせ、内部の唯一のＭｌｕｌ制限部位とともに、５'ＢａｍＨｌ及び３'ＥｃｏＲＩ制限部位で操作した。陰性対照オリゴと一緒に、アニールされたオリゴを、製造業者の指示（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）に従い、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで線状化したｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱベクターにクローニングした。陽性クローンは、Ｍｌｕｌ消化後に識別した。実験手順（本文）で記載されている通り、ｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＲＯＲｙｔまたはｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＣｏｎｔｒｏｌのレトロウイルスを作製し、ＲＯＲγｔを発現するかまたは発現しないＰＥ１６細胞の安定な形質移入体を作成するために使用した。安定な形質移入体は、生細胞を回収するために、ピューロマイシンを中止した後、少なくとも３回継代し、続いて、ピューロマイシン処置の２ラウンド後に選択した。

ジゴキシン及びＳＴＡＴ阻害剤の処置：Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＤＭＳＯまたは指示された濃度のジゴキシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のいずれかとともに、Ｕ型ボトムのウェル中１０^５／１００μｌで２４〜４８時間培養した。ＩＬ−７誘導ＢＴＬＡ発現におけるＳＴＡＴ５の効果を試験するために、ＣＤ２７⁻ｇｄＴ細胞を、Ｒｏｒｃ（ｔ）^{ｇｆｐ／＋}マウスのリンパ節から濃縮し、示された濃度でのＳＴＡＴ阻害剤（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の存在下または非存在下、無刺激でまたはＩＬ−７を用いて、接着フィーダー細胞を含む２４ウェルプレート中、２日間培養した。

本明細書に開示された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

本発明は、上記の実施例を参照して説明してきたが、改変及び変形は、本発明の精神及び範囲内に包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によって限定される。

Claims (25)

1. γδＴ細胞のレベル及び／または活性を調節する１つまたは複数の薬剤を対象に投与し、それにより、炎症性疾患または自己免疫疾患を処置することを含む、その必要のある対象における炎症性疾患または自己免疫疾患を処置する方法。
2. 前記薬剤が、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）の発現または活性を増大させる、請求項１に記載の方法。
3. 前記薬剤が、レチノイド関連オーファン受容体ガンマアイソフォームｔ（ＲＯＲγｔ）の発現または活性を阻害する、請求項２に記載の方法。
4. 前記薬剤が、ＩＬ−７の発現または活性を増大させる、請求項２に記載の方法。
5. 前記薬剤が、γδＴ細胞によるＩＬ−１７またはＴＮＦの産生を調節する、請求項１に記載の方法。
6. 前記薬剤が、ＲＯＲγｔ⁻γδＴ細胞またはＲＯＲγｔ^＋γδＴ細胞のレベルを調節する、請求項１に記載の方法。
7. 一つの薬剤が、ＢＴＬＡの発現または活性を増大させ、かつ第二の薬剤が、ＲＯＲγｔの発現または活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
8. 前記薬剤が、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）−ＢＴＬＡ相互作用を阻害する、請求項１に記載の方法。
9. 炎症性疾患または自己免疫疾患が、乾癬、多発性硬化症、糖尿病、皮膚炎、セリアック病、癌、硬化性胆管炎、及び関節リウマチからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
10. ＢＴＬＡの発現または活性を調節する薬剤を投与することを含む、γδＴ細胞のレベル及び／または活性を調節する方法。
11. 前記薬剤が、ＢＴＬＡの発現または活性を増大させ、かつγδＴ細胞のレベル及び／または活性を増大させる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記薬剤が、ＩＬ−７の発現もしくは活性を増大させるか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を阻害する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記薬剤が、ＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用を阻害する、請求項１１に記載の方法。
14. 前記薬剤が、ＢＴＬＡの発現または活性を低下させ、かつγδＴ細胞のレベル及び／または活性を低下させる、請求項１０に記載の方法。
15. 前記薬剤が、ＩＬ−７の発現もしくは活性を阻害するか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を増大させる、請求項１４に記載の方法。
16. ＢＴＬＡの発現または活性を調節する薬剤を投与することを含む、γδＴ細胞のＩＬ−１７またはＴＮＦ産生を調節する方法。
17. 前記薬剤が、ＢＴＬＡの発現または活性を増大させ、かつγδＴ細胞のＩＬ−１７またはＴＮＦ産生を低下させる、請求項１６に記載の方法。
18. 前記薬剤が、ＩＬ−７の発現もしくは活性を増大させるか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を阻害する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記薬剤が、ＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用を阻害する、請求項１７に記載の方法。
20. 前記薬剤が、ＢＴＬＡの発現または活性を阻害し、かつγδＴ細胞のＩＬ−１７またはＴＮＦ産生を増大させる、請求項１６に記載の方法。
21. 前記薬剤が、ＩＬ−７の発現もしくは活性を阻害するか、またはＲＯＲγｔの発現もしくは活性を増大させる、請求項２０に記載の方法。
22. （ａ）リンパ球培養物を薬剤と接触させること；
    （ｂ）工程（ａ）からの培養物中のγδＴ細胞のレベルを決定すること；及び
    （ｃ）（ｂ）からのγδＴ細胞のレベルを、前記薬剤と接触していないリンパ球培養物中のγδＴ細胞のレベルと比較すること
    を含む、ＢＴＬＡアゴニストをスクリーニングする方法であって、
    前記薬剤と接触したリンパ球培養物中のγδＴ細胞の増大したレベルは、前記薬剤がＢＴＬＡアゴニストであることを示す、
    方法。
23. リンパ球培養物が、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）及びＣＤ２７⁻γδＴ細胞について濃縮されている、請求項２２に記載の方法。
24. γδＴ細胞のレベルが、γδＴ細胞表面マーカーを有する細胞を同定することによって決定される、請求項２２に記載の方法。
25. 細胞表面マーカーが、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、及びＲＯＲγｔからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。

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