JP5898617B2 - Ｂｔｌａに対する完全ヒト抗体 - Google Patents

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Description

本出願は、２００９年７月３１日に出願された米国仮特許出願番号６１／２３０，３３２および２００９年１１月３日に出願された米国仮特許出願番号６１／２５７，６１２の利益を主張する（それらの全体を出典明示により本明細書に包含させる）。
技術分野
本発明は、一般的に、ＢＴＬＡに結合する抗体または抗原結合フラグメントおよびそれらの使用に関する。さらに具体的には、本発明は、ヒトＢＴＬＡを認識し、特に炎症性疾患、自己免疫疾患および増殖性疾患におけるその活性を調節する完全ヒト抗体に関する。
発明の背景
免疫系は、感染因子、例えば、細菌、多細胞生物およびウイルス、ならびに癌から個体を保護するために機能する。この系は、リンパ球および骨髄細胞のいくつかの型、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および好中球を含む。これらのリンパ球および骨髄細胞は、しばしば、サイトカインとして知られているシグナル伝達タンパク質を生産する。免疫応答は、炎症、すなわち、全身的にまたは体の特定の位置に免疫細胞の蓄積を含む。感染体または外来物質に対する応答において、免疫細胞は、順に、免疫細胞の増殖、発達、分化または移動を調節するサイトカインを分泌する。免疫応答は、例えば、自己免疫疾患のような過剰炎症と関連するとき、病理学的帰結をもたらすことができる（例えば、Abbasら (eds.) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppenheim and Feldmann (eds.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian and Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson and Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350参照）。
陽性および陰性共刺激性シグナルは、ＢおよびＴ細胞活性の調整において重要な役割を果たし、これらのシグナルを介在する分子は免疫調節剤の有効な標的であることが証明されている。陽性共刺激は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）関与に加えて、未感作な(naive)Ｔ細胞の最適な活性化のために必要であるが、陰性共刺激は、自己免疫寛容の獲得ならびにエフェクターＴ細胞機能の終点のために必要であると考えられている。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＢ７．１またはＢ７．２と相互作用すると、原型Ｔ細胞共刺激分子であるＣＤ２８は、Ｔ細胞増殖およびＴＣＲ関与に応答する分化を促進するシグナルを発するが、ＣＤ２８ホモログ細胞毒性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）は、Ｔ細胞増殖およびエフェクター機能の阻害を介在する（Chambersら Ann. Rev. Immunol., 19:565-594, 2001; Egenら Nature Immunol, 3:611-618, 2002）。Ｂ７ファミリーと相同性を有するいくつかの新規分子は、発見されており（Abbasら Nat. Med., 5:1345-6,1999; Coyleら Nat. Immunol., 2: 203-9, 2001; Carrenoら Annu. Rev. Immunol., 20: 29-53, 2002; Liangら Curr. Opin. Immunol., 14: 384-90, 2002）、Ｔ細胞活性化におけるそれらの役割は解明され始めている。
これらの新規共刺激リガンドは、Ｂ７ｈ、ＰＤ−Ｌｌ、ＰＤ−Ｌ２およびＢ７−Ｈ３を含む。Ｂ７ＲＰ−１（Yoshinagaら Nature, 402: 827-32, 1999）としても知られているＢ７ｈ（Swallowら Immunity, 11: 423-32, 1999）、ＧＬ５０（Lingら J. Immunol., 164:1653- 7, 2000）、Ｂ７Ｈ２（Wangら Blood, 96: 2808-13, 2000）およびＬＩＣＯＳ（Brodieら Curr. Biol., 10: 333-6, 2000）は、活性化されたＴ細胞上の誘導性共刺激分子(inducible costimulator)（ＩＣＯＳ）に結合し、Ｔ細胞増殖ならびにサイトカイン、例えば、インターロイキン４（ＩＬ−４）およびＩＬ−１０の生産を共刺激する。
Ｂ７−Ｈ１としても知られている（Dongら Nat. Med., 5, 1365-9, 1999）ＰＤ−Ｌｌ（Freemanら J. Exp. Med., 192: 1027-34, 2000）およびＢ７−ＤＣとしても知られている（Tsengら J. Exp. Med., 193, 839-46, 2001）ＰＤ−Ｌ２（Latchmanら Nat. Immunol., 2:261-8, 2001）は、ＴおよびＢ細胞上のプログラム死１（ＰＤ−Ｉ）受容体に結合する。
最後に、Ｂ７−Ｈ３は、活性化されたＴ細胞上の未知のカウンター受容体に結合し、ＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞およびＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬまたはＴｃ）の増殖を向上させ、選択的にＩＦＮ−γ発現を向上させることが報告されている（Chapovalら Nat. Immunol, 2, 269-74, 2001; Sunら J. Immunol., 168, 6294-7, 2002）。
Ｔ細胞共刺激活性を有するさらなる分子の同定は、それらの基礎生物学的重要性およびそれらの活性に影響することができる治療剤の可能性によって大変興味深い。共刺激シグナルを調節することができ、それによりＣＤ８＋ＣＴＬおよびＣＤ４＋Ｔｈ細胞の活性化および／またはエフェクター機能を調節することができる薬剤が、免疫応答の調節における使用を見出し、非常に望ましい。
特に、多数の自己免疫疾患は、自己反応性Ｔ細胞および自己抗体に関与していることが知られている。病原体に対して防御する将来有望な免疫系の能力なしに、自己反応性リンパ球を阻害または除去することができる薬剤は非常に望ましい。
逆に、多数の癌免疫療法、例えば、養子免疫療法は、腫瘍特異的Ｔ細胞集団を拡大し、それらを指向し、腫瘍細胞を攻撃し、殺す（Dudleyら Science 298:850-854, 2002; Pardoll, Nature Biotech.,20: 1207-1208, 2002; Egenら Nature Immunol., 3:611-618, 2002）。腫瘍攻撃を増強させることができる薬剤は、また、非常に望ましい。
加えて、異なる抗原（例えば、微生物抗原または腫瘍抗原）に対する免疫応答は、検出可能であるが、頻繁に、これらの抗原を発現する薬剤が介在する疾患過程（例えば、感染性微生物または腫瘍細胞）に対する保護を提供するために不十分な大きさである。対象に、抗原と共に、対象における抗原に対する免疫応答を増強するために役立つアジュバントを投与することがしばしば望ましい。
特定の環境下で、抗原に対する通常の免疫応答を阻害することも望ましい。例えば、移植を受けている患者における通常の免疫応答の抑制が望ましく、このような免疫抑制活性を示す薬剤が非常に望ましい。
共刺激シグナル、特に陽性共刺激シグナルは、また、Ｂ細胞活性の調節において役割を果たす。例えば、Ｂ細胞活性化および胚中心Ｂ細胞の生存は、抗原による刺激に加えてＴ細胞誘導シグナルを必要とする。
ヘルパーＴ細胞の表面上に存在するＣＤ４０リガンドは、Ｂ細胞の表面上でＣＤ４０と相互作用し、Ｂ細胞における多数のこのようなＴ細胞依存効果を介在する。
タンパク質ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１をも含む受容体のＣＤ２８ファミリーメンバーである。最初のファミリーメンバーであるＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体の添加後のＴ細胞増殖の増強における機能的効果により発見された（Hutloffら (1999) Nature 397:263-266; Hansenら (1980) Immunogenics 10:247-260）。ＢＴＬＡは、ＴＨｌ細胞における差次的発現に関するスクリーニングを介して発見された。加えて、ＢＴＬＡは、ＣＴＬＡ−４に類似している陰性の阻害シグナルを提供すると言われている。アゴニスト抗ＢＴＬＡ Ｍａｂの存在下で、抗ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化されたＴ細胞はＩＬ−２生産および増殖の減少を示す（Kreigら J. Immunol., 175, 6420-6472, 2005）。無傷なＢＴＬＡ遺伝子を欠いているマウスは、免疫化後にＤＮＰ−ＫＬＨに対してより高い力価およびＥＡＥに対して高い感受性を示す（Watanabeら Nat. Immunol, 4, 670-679, 2003）。ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエーター）は、ＢＴＬＡに対するリガンドであることが示されている（Scullyら (2005) Nat. Immunol. 6:90-98; Gonzalezら (2005) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 102: 1116-1121）。
したがって、ＢＴＬＡを認識する薬剤、特にＢＴＬＡを認識する抗体およびそれらの結合剤、ならびにこのような薬剤を使用する方法が望ましい。
抗体は、治療剤として使用することができる。ある抗体は、治療剤としてインビボで使用されるとき、抗体の望ましくない免疫原性を引き起こし得る。多数のモノクローナル抗体は齧歯動物由来であるため、ヒトにおける反復使用は治療抗体に対する免疫応答の産生、例えば、マウス抗体に対するヒトまたはＨＡＭＡを引き起こす。このような免疫応答は、最小で治療効果の喪失および最大で可能性のある致死的なアナフィラキシー反応を引き起こす。齧歯動物抗体の免疫原性を減少させるための１つのアプローチは、マウス可変領域（Ｆｖ）がヒト定常領域と融合されているキメラ抗体の生産を含む（Liuら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43）。しかしながら、ヒト可変領域およびマウス定常領域のハイブリッドを注入されるマウスは、ヒト可変領域に対する強い抗抗体応答を発現し、このようなキメラ抗体中の全体の齧歯動物のＦＶ領域の保持が、なお、患者において望ましくない免疫原性をもたらし得ることを示唆する。
さらに、ヒトのフレームワーク上への可変ドメインの齧歯動物の相補性決定領域（ＣＤＲ）ループのグラフティング（すなわち、ヒト化）は、齧歯動物配列をさらに最小限にするために使用されている。Jonesら (1986) Nature 321:522; Verhoeyenら (1988) Science 239:1534。しかしながら、ＣＤＲループ交換は、常に、起源の抗体と同じ結合特性を有する抗体を一様にもたらさない。ヒト化抗体におけるＣＤＲループサポートに関与する残基であるフレームワーク残基（ＦＲ）の変化は、またしばしば、抗原結合親和性を保存するために必要とされる。Kabatら (1991) J. Immunol. 147:1709。多くのヒト化抗体構築物におけるＣＤＲグラフティングおよびフレームワーク残基保存の使用が報告されているが、特定の配列が所望の結合特性、ときどき生物学的特性を有する抗体をもたらすことを予測することは難しい。例えば、Queenら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029、Gormanら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181、およびHodgson (1991) Biotechnology (NY) 9:421-5参照。さらに、多数の以前の試験は、動物の軽鎖および重鎖可変配列に対して異なるヒト配列を使用して、疑問のあるこのような試験の予測性質を行った。既知の抗体の配列、または、さらに一般的に、既知のＸ線結晶構造を有する抗体、例えば、抗体ＮＥＷおよびＫＯＬが使用されている。例えば、Jonesら上記; Verhoeyenら上記;およびGormanら上記参照。正確な配列情報は、数個のヒト化構築物に対して報告されている。
ヒトの疾患、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患および増殖性疾患の処置における使用のための抗ＢＴＬＡ抗体、特に抗ＢＴＬＡモノクローナル抗体の必要性が存在する。このような抗体は、有害免疫応答なしに反復投与を可能にするヒト対象において低い免疫原性を示すことが好ましい。
発明の概要
本発明は、ヒト対象における高い結合親和性、中和活性、良好な薬物動態学および低い抗原性を含む１つまたはそれ以上の望ましい特性を有する抗ヒトＢＴＬＡ抗体に関する。本発明は、また、疾患の処置における本発明の抗体の使用に関する。
１つの態様において、本発明は、ａ）ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）へのＢＴＬＡの結合を遮断しない；ｂ）カニクイザルＢＴＬＡと交差反応する；ｃ）最大で約２．４×１０−９のヒトＢＴＬＡへの結合に対するＫＤを示す；およびｄ）ＢまたはＴ細胞活性化を測定するインビトロアッセイにおいて約１０−１００ｎＭのＥＣ５０を示すことからなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性を含む、ヒトＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）へ結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらなる態様において、本発明は、ａ）ＨＶＥＭへのＢＴＬＡの結合を遮断する；ｂ）カニクイザルＢＴＬＡと交差反応する；およびｃ）最大で約４．６×１０−９のヒトＢＴＬＡへの結合に対するＫＤを示すことからなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性を含む、ヒトＢＴＬＡへ結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらなる態様において、本発明は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５およびｈｕ Ｍａｂ８Ａ３からなる群から選択されるＢＴＬＡに結合する単離されたアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＢＴＬＡに特異的に結合し、ＨＶＥＭへの結合を遮断しない抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらなる態様において、本発明は、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６およびｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７からなる群から選択されるＢＴＬＡに結合する単離されたアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体 ＢＴＬＡに特異的に結合し、また、ＨＶＥＭへの結合を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：１２、１３および１４からなる群から選択される少なくとも１つのＶＬＣＤＲドメインならびに配列番号：５、６および７からなる群から選択される少なくとも１つのＶＨＣＤＲドメインを含む、ＢＴＬＡに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：２６、２７、２８からなる群から選択される少なくとも１つのＶＬＣＤＲドメインならびに配列番号：１９、２０および２１からなる群から選択される少なくとも１つのＶＨＣＤＲドメインを含む、ＢＴＬＡに結合する単離されたアンタゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、（ａ）該重鎖可変領域が配列番号：１１のアミノ酸配列（８Ｄ５重鎖）を含み；（ｂ）該軽鎖可変領域が配列番号：１８のアミノ酸配列（８Ｄ５軽鎖）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列（８Ｄ５ ＨＣＤＲ１）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列（８Ｄ５ ＨＣＤＲ２）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列（８Ｄ５ ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列（８Ｄ５ ＬＣＤＲ１）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号：１３のアミノ酸配列（８Ｄ５ ＬＣＤＲ２）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号：１４のアミノ酸配列（８Ｄ５ ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＢＴＬＡに特異的に結合し、ＨＶＥＭへの結合を遮断しない抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、（ａ）ヒトＶＨ遺伝子（配列番号：８）［８Ｄ５をコードする］の産物または該遺伝子由来の産物である重鎖可変領域；および（ｂ）ヒトＶＫ遺伝子（配列番号：１５）［８Ｄ５をコードする］の産物または該遺伝子由来の産物である軽鎖可変領域を含む単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＢＴＬＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、ＢＴＬＡへの結合に対して参照抗体と交差競合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、（ａ）配列番号：９または配列番号：１１のアミノ酸配列（８Ｄ５重鎖）を含む重鎖可変領域；（ｂ）配列番号：１６または配列番号：１８のアミノ酸配列（８Ｄ５軽鎖）を含む軽鎖可変領域を含み、ＢＴＬＡアゴニストである抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
１つの態様において、重鎖および軽鎖は、フレキシブルな(flexible)リンカーにより接続され、一本鎖抗体を形成する。
１つの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、一本鎖Ｆｖ抗体である。１つの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ抗体である。１つの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ’抗体である。１つの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、（Ｆａｂ’）２抗体である。
１つの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、完全ヒトモノクローナルまたは組換え抗体である。
１つの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、ＢＴＬＡ活性および／またはシグナル伝達を減少させる。
１つの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、ＢＴＬＡ活性および／またはシグナル伝達を増加させる。
さらにさらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されている抗体または抗原結合フラグメントのいずれかのＶＬドメインまたはＶＨドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されている抗体または抗原結合フラグメントのいずれかのＶＬドメインまたはＶＨドメインをコードする単離された核酸に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、１つまたはそれ以上の本明細書に記載されている抗体または抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、有効量の本明細書に記載されている医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＢＴＬＡの発現および／または活性の減少によって引き起こされる状態を処置する方法に関する。特に、ＴまたはＢ細胞の存在または活性を特徴とするあらゆる疾患または障害を、ＢＴＬＡアゴニスト抗体により処置することができる（すなわち、ＢＴＬＡ陽性免疫細胞の存在に関与する疾患または障害を、ＢＴＬＡ受容体機能を活性化することにより管理または処置することができる）。１つの態様において、１つまたはそれ以上の抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７またはｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７からなる群から選択される。
さらにさらなる態様において、本発明は、有効量の本明細書に記載されている抗体または抗原結合フラグメントを対象に投与することを含む、該対象における炎症性疾患または自己免疫疾患を処置する方法に関する。１つの態様において、炎症性疾患または自己免疫疾患は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患）、炎症性線維症（例えば、強皮症、肺線維症および肝硬変症）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、骨関節症、骨粗鬆症、喘息（アレルギー性喘息を含む）、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、乾癬、ブドウ膜炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、若年性早期型Ｉ型糖尿病、移植拒絶反応、ＳＬＥおよびシェーグレン症候群からなる群から選択される。このような処置する方法は、さらに、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤、例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤を投与することを含み得る。さらにさらなる態様において、疾患は、リウマチ性関節炎である。
さらにさらなる態様において、炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
さらにさらなる態様において、本発明は、移植拒絶反応および／または移植片対宿主病を処置する方法に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、Ｉ型糖尿病を処置する方法に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、対象における炎症性疾患または自己免疫疾患を処置するための医薬の製造のための本明細書に記載されている抗体または抗原結合フラグメントの使用に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、ＢＴＬＡの活性を減少させる医薬の製造のための本明細書に記載されている抗体または抗原結合フラグメントの使用に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む該対象における免疫応答を増加させる方法に関する。１つの態様において、１つまたはそれ以上の抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７である。
さらにさらなる態様において、本発明は、ＢＴＬＡの活性を増加させるための医薬の製造のための本明細書に記載されているアンタゴニスト抗体の使用に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、診断的使用のための本明細書に記載されている抗体または抗体フラグメントのいずれかの使用に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されている抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを含むキットに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、ＢＴＬＡおよび本明細書に記載されている抗体または抗原結合フラグメントのいずれか１つを含む複合体に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されているＶＨまたはＶＬ鎖のいずれかをコードするポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターに関する。さらにさらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されている発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、
（ａ）核酸配列を発現する条件下で培養培地中で本明細書に記載されている宿主細胞を培養し、それにより軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産すること；
（ｂ）該ポリペプチドを宿主細胞または培養培地から回収すること
を含む方法に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、ＢＴＬＡへの結合に対して参照抗体と交差競合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ａ）配列番号：２３のアミノ酸配列（４Ｃ７重鎖）を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号：３０のアミノ酸配列（４Ｃ７軽鎖）を含む軽鎖可変領域を含み、ＢＴＬＡアゴニストである抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：１８に記載されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域において見出されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：１８に記載されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域において見出されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む単離された免疫グロブリンポリペプチドに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：１１に記載されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域において見出されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む単離された免疫グロブリンポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：１１に記載されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域において見出されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む単離された免疫グロブリンポリペプチドに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：３２に記載されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域において見出されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：３２に記載されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域において見出されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む単離された免疫グロブリンポリペプチドに関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：２５に記載されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域において見出されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む単離された免疫グロブリンポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。
さらにさらなる態様において、本発明は、配列番号：２５に記載されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域において見出されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む単離された免疫グロブリンポリペプチドに関する。
１つの態様において、これらの核酸構築物および／またはポリペプチドは、抗体を製造する方法において有用である。
図１Ａ−Ｃは、ｈｕ Ｍａｂ ８Ｄ５の重鎖および軽鎖可変領域の配列を示す。図１Ａは、ＶＨ鎖の成熟アミノ酸配列およびコードする核酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列の上の波線で示される。 図１Ｂは、ＶＬ鎖の成熟アミノ酸配列およびコードする核酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列の上の波線で示される。 図１Ｃは、Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の重鎖および軽鎖可変領域の配列の特徴を示す。
図２Ａ−Ｃは、ｈｕ Ｍａｂ ４Ｃ７の重鎖および軽鎖可変領域の配列を示す。図２Ａは、ＶＨ鎖の成熟アミノ酸配列およびコードする核酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列の上の波線で示される。 図２Ｂは、ＶＫの成熟アミノ酸配列およびコードする核酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列の上の波線で示される。 図２Ｃは、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の重鎖および軽鎖可変領域の配列の特徴を示す。
図３Ａ−Ｄは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５およびｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の結合および交差反応特徴を示す。図３Ａは、ＣＨＯ細胞上で発現されるヒトＢＴＬＡに対するｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の結合プロフィールを示す。図３Ｂは、ＣＨＯ細胞上で発現されるｃｙｎｏ ＢＴＬＡに対するｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の結合プロフィールを示す。 図３Ｃは、ＣＨＯ細胞上で発現されるヒトＢＴＬＡに対するｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の結合プロフィールを示す。図３Ｄは、ＣＨＯ細胞上で発現されるｃｙｎｏ ＢＴＬＡに対するｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の結合プロフィールを示す。
図４Ａ−Ｂは、ヒトＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞へ結合するヒトＨＶＥＭを遮断する抗体の能力の試験結果を示す。図４Ａは、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７がヒトＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞へ結合するヒトＨＶＥＭを遮断することを示す。図４Ｂは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５がヒトＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞へ結合するヒトＨＶＥＭを遮断しないことを示す。
図５は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５ならびにｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５ Ｆａｂ’フラグメントが、ヒトＴ細胞芽(cell blast)の抗ＣＤ３誘導増殖を阻害することを示すグラフである。
図６Ａ−Ｄは、ＳＥＢ誘導ヒトおよびカニクイザルＴ−細胞応答におけるｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５およびｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の効果を示すグラフである。 図６Ａ−Ｄは、ＳＥＢ誘導ヒトおよびカニクイザルＴ−細胞応答におけるｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５およびｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の効果を示すグラフである。
図７Ａ−Ｂは、破傷風菌トキソイド攻撃に対するヒトのリコール(recall)Ｔ細胞応答がｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５により減少させられることを示すグラフである。
図８Ａ−Ｂは、破傷風菌トキソイド攻撃に対するヒトのリコールＴ細胞応答がｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７により増加させられることを示すグラフである。
図９は、ヒトＢ細胞機能がｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５により阻害されることを示すグラフである。
図１０Ａ−Ｂは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５による末梢血Ｂ細胞のケモカイン生産の阻害を示すグラフである。
図１１は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５が健常ドナー血液における免疫活性を自発的に刺激しないことを示すグラフである。
図１２Ａ−Ｂは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５およびｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７（図１２Ａ）のＢＴＬＡへの結合ならびにｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５がＴＣＲξ リン酸化を還元すること（図１２Ｂ）を示すウェスタンブロットである。
図１３Ａ−Ｂは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５が用量依存的にＳＥＢ応答およびＢ細胞増殖を抑制したことを示すグラフである。
図１４Ａ−Ｄは、ヒトＰＢＭＣ培養物中のＩＬ−２（図１４Ａ、Ｂ）、ＩＦＮγ（図１４Ｃ）およびＴＮＦα（図１４Ｄ）の生産の欠失により測定されるとおり、試験された抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体がヒトＰＢＭＣ培養物中のサイトカイン・ストームを誘導しないことを説明するグラフである。 図１４Ａ−Ｄは、ヒトＰＢＭＣ培養物中のＩＬ−２（図１４Ａ、Ｂ）、ＩＦＮγ（図１４Ｃ）およびＴＮＦα（図１４Ｄ）の生産の欠失により測定されるとおり、試験された抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体がヒトＰＢＭＣ培養物中のサイトカイン・ストームを誘導しないことを説明するグラフである。
図１５は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５がＳＣＩＤｈｕ ＳＰＬマウスにおけるヒト抗ＴＴリコールＩｇＧ応答を阻害したことを示す２８日目のＥＬＩＳＡ結果のグラフである。
図１６は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５がＳＣＩＤｈｕ ＳＰＬマウスにおけるヒト全ＩｇＧ応答を阻害したことを示す２８日目のＥＬＩＳＡ結果のグラフである。
図１７Ａ−Ｂは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５がＳＣＩＤｈｕ ＳＰＬマウスにおいて（図１７Ａ）、アイソタイプコントロールと比較して（図１７Ｂ）、ヒト抗ＴＴリコールＩｇＧ応答を阻害したことを説明する個々に処置されたマウス由来の力価を示すグラフである。
図１８Ａ−Ｂは、Ｍａｂ８Ｄ５がＳＣＩＤｈｕ ＳＰＬマウスにおいて（図１８Ａ）、アイソタイプコントロールと比較して（図１８Ｂ）、ヒト全ＩｇＧ応答を阻害したことを説明する個々に処置されたマウス由来の力価を示すグラフである。
発明の詳細な説明
哺乳動物免疫系は、ＴおよびＢリンパ球の可能性のある有害な活性を抑制するためのいくつかの経路が発達している。これらは、多種多様のサイトカイン受容体経路ならびにＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＢＴＬＡのような受容体と関連する共刺激経路を含む。ＣＤ２８−Ｂ７相互作用は、陽性共刺激経路の一例であるが（すなわち、ＣＤ２８誘発は、抗原特異的誘因に対するＴ細胞応答を増強する）、他の３つの受容体は、阻害性の共刺激経路の代表である。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＢＴＬＡは重複を示すが、別個の発現プロフィールを示し、非冗長様式におけるＴおよびＢリンパ球ならびに他の免疫細胞の活性を限定する（Deppongら J Immunol 2006, Taoら J Immunol 2005参照）。ＣＴＬＡ−４は、Ｂ７．１およびＢ７．２（ＣＤ８０およびＣＤ８６）の結合に対してＣＤ２８と競合し、リンパ節および脾臓における未感作なＴ細胞活性化に対する根本的な域値を定めるが、ＰＤ−１およびＢＴＬＡはそれぞれ、それら自身のユニーク(unique)なリガンド（それぞれＰＤ−Ｌ１／−Ｌ２およびＨＶＥＭ）を有し、末梢Ｔ細胞ホメオスタシスおよび再活性化をコントロールするようである（Kriegら Nat Immunol 2007参照）。
ＢＴＬＡはＢおよびＴ細胞活性化を下方調節する
その名前により示されるとおり、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）は、静止および活性化ＢおよびＴリンパ球の両方において発現される。ＢＴＬＡはＩ型膜貫通糖タンパク質であり、いくつかの阻害チロシンモチーフを含む細胞質尾部を有する（Watanabe, 2003）。ＢＴＬＡは、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーメンバーといくつかの構造的類似性を有するが、いくつかの因子がそれをユニークなメンバーにする。ヒトＢＴＬＡは、以下の特徴付けられるドメイン：Ｉｇ細胞外ドメイン：残基５１−１１７；膜貫通ドメイン：残基１５３−１７３；ＩＴＩＭドメイン：残基２５５−２６０；およびＩＴＳＭドメイン：残基２８０−２８５（ヒト配列番号：２を基準にして）を含む。ＩＴＩＭは免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフを示すが、ＩＴＳＭは免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフを示す。
配列番号：２の残基４３−１３４に対応するＢＴＬＡ Ｉｇ中間体型（Ｉセット型）細胞外ドメインは、リガンド結合に関与し、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーの他のメンバーにおいて見出されない。加えて、ＢＴＬＡに対するリガンドは、Ｂ７ファミリーメンバーではなく、むしろそれは、ＴＮＦＲスーパーファミリー受容体ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）である（Sedy, 2005）。ＨＶＥＭは末梢ＢおよびＴ細胞ならびに単球上に発現し、ＢＴＬＡに結合したＨＶＥＭの結晶構造は解明されている（Compaan, 2005）。
いくつかのインビボ試験は、リンパ球応答においてＢＴＬＡに対する阻害的役割を証明した。Ｍｕｒｐｈｙおよび共働者（Washington University St. Louis）により産生されたＢＴＬＡ欠損マウスは、Ｔ依存性抗原に対する応答におけるＩｇＧ生産において３倍の増加を示した。加えて、ＢＴＬＡ−／−マウスから単離されたＴおよびＢ細胞は、それぞれ−ＣＤ３および抗ＩｇＭを使用する抗原−受容体刺激に対してより良い増殖応答を示した（Watanabe, 2003）。過剰発現試験において、ＢＴＬＡは、Ｂ細胞受容体複合体およびＴ細胞受容体と関連することを見出した。この発見に従って、Ｃｏｎ Ａ（Ｔ細胞）またはＬＰＳ（Ｂ細胞）を使用する抗原−受容体に独立した刺激は、ＢＴＬＡ欠損リンパ球に影響を与えず、抗ＢＴＬＡ抗体を使用して調節することができない。
ＢＴＬＡノックアウトマウスは、時間とともに自発的自己免疫性疾患を発症することが示され、寿命を減少させた（Oya, 2008）。ＨＶＥＭによるＢＴＬＡのライゲーションは、Ｔ細胞活性化および増殖の下方調節を引き起こす（Sedy, 2005）。ＢＴＬＡノックアウトマウスは、自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）およびアレルギー性気道炎症モデル（これらは両方ともＴ細胞活性に依存する）における疾患重症度の増加を示す（Watanabe, 2005; Deppong, 2006）。ヒトＢＴＬＡ遺伝子におけるＳＮＰとＲＡに対する感受性間の関連も示されている（Lin, 2006）。しかしながら、病理学的状態におけるＢＴＬＡシグナル伝達の役割については、まだあまり知られていない。
したがって、自己免疫性および特定の増殖性疾患において、リンパ球応答におけるＢＴＬＡの阻害役割を活用して、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ結合を可能にする処置を開発する継続した必要性が存在する。
アゴニストＢＴＬＡ抗体は、この役割に特によく適している。Ｕｌｔｉｍａｂプラットフォームを使用して産生された２００個を越えるｍＡｂの選択の過程で、多くのアゴニスト抗体およびアンタゴニストＢＴＬＡ抗体を同定した。２００個を越えるｍＡｂの内、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６およびｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７を含むいくつかの抗体が、阻害性ＢＴＬＡ受容体機能を活性化することを同定した（すなわち、アゴニスト抗体）。Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５およびｈｕ Ｍａｂ８Ａ３は、ＢＴＬＡに対するＨＶＥＭリガンド結合を遮断しないＢＴＬＡアゴニストである。Ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６およびｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７は、阻害性ＢＴＬＡ受容体機能を活性化するが、また、ＢＴＬＡへのＨＶＥＭリガンド結合を遮断する。これらのアゴニスト抗体は、ＢＴＬＡに対して〜１２−１４ｎＭの結合親和性を示し、また、ヒトのドナー血液中でＴおよびＢ細胞応答を〜３０−１００ｎＭのＥＣ５０で阻害する。ＩｇＧ４ならびに一価のＦａｂ’フラグメントとして再発現されるとき、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５はその免疫阻害活性をインビトロで維持した。これらのアゴニストＢＴＬＡ抗体は、また、同様の親和性でカニクイザルＢＴＬＡに結合し、カニクイザルＴ細胞応答の同等の阻害を証明する。しかしながら、これらのアゴニスト抗体は、マウスＢＴＬＡと交差反応しない。マウスの薬理学的試験において、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、ヒトＩｇＧ４に対する予測と一致する〜１６日の半減期を示した。これらの受容体アゴニストｍＡｂは、ＴおよびＢリンパ球活性をインビトロで阻害および抑制し、また、このような活性をインビボモデル系において示す。本発明のアゴニスト抗体は、Ｂ細胞を枯渇させることなく、同種抗原によるＢ細胞活性化を阻害する能力を有することにより区別される。さらに、本発明のアゴニスト抗体は、また、ＢおよびＴ細胞活性化を同時に標的とする能力により区別される。
上記の４つのアゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体に加えて、選択は、また、アンタゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７を同定した。この抗体は、図６Ｃ−Ｄおよび図８Ａ−Ｂに示されるとおり免疫刺激効果を示し、したがって癌の処置として、またはある病原性感染の処置のために、およびワクチンに対するアジュバントとして有用であることが予期される。癌の文脈において、免疫応答を刺激するためのＢＴＬＡアンタゴニスト、例えば、Ｍａｂ４Ｃ７の使用は、これらの結果ならびに未感作なＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミング中のＢＴＬＡ−ＨＶＥＭライゲーションの遮断がＴ細胞増殖の増強に寄与することを説明する結果と相関することが予期される（Derreら J. Clin. Invest. 2010, 120: 157-167参照）。
ＢＴＬＡアゴニストにおいて、抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答の両方を抑制する能力は、関節炎、ＳＬＥ、シェーグレン病、潰瘍性大腸炎およびクローン病、ならびに固形臓器移植（すなわち、腎臓、肝臓および他の組織を含む臓器の移植）のような状態のために有効であることが予期されるＢＴＬＡ活性を調節するための方法を提供する。現行の処置は、Ｔ細胞のみの抑制が所望の効果を成し遂げるために十分でないため、部分的な不備を示す。本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、ＴおよびＢ細胞応答の両方を抑制する能力による関節炎、潰瘍性大腸炎およびクローン病、ならびに固形臓器移植（すなわち、腎臓、肝臓および他の臓器の移植）の処置のために有効であり得る。本発明のアゴニスト抗体のそれぞれの能力は、免疫阻害活性をインビトロおよびインビボモデルにおいて維持するためにＩｇＧ４ならびに一価のＦａｂ’フラグメントとして再発現されるとき、新規の処置のための望ましい特徴を提供する。
略語
詳細な説明および実施例中、以下の略語を使用する：
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定義
本願発明をさらによく理解できるように、特定の技術および科学用語を具体的に以下で定義する。本明細書において具体的に他で定義されていないとき、本明細書において使用される全ての他の技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味を有する。
特許請求の範囲を含む本明細書において使用される用語の単数形（ａ、ａｎ、ｔｈｅ）は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、それらの対応する複数形の言及を含む。
「活性化」、「刺激」および「処置」は、細胞または受容体に適用されるとき、文脈または明白に他を示さない限り、同じ意味、例えば、リガンドでの細胞または受容体の活性化、刺激または処置を有し得る。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えば、抗体に由来するサイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、変異タンパク質および結合化合物を含む。「リガンド」は、また、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模擬物および抗体のペプチド模擬物を含む。「活性化」は、内部メカニズムならびに外部または環境因子により調節されるような細胞活性化を示し得る。例えば、細胞、組織、臓器または生物体の「応答」は、生化学的または生理学的性質、例えば、生物学的区画内の濃度、密度、接着もしくは移動、遺伝子発現の速度、または分化の状態の変化を含み、ここで、該変化は活性化、刺激もしくは処置または内部メカニズム、例えば、遺伝的プログラミングと相関している。
分子の「活性」は、分子のリガンドまたは受容体への結合、触媒活性；遺伝子発現、または、細胞シグナル伝達、分化または成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性の調節などを記載してもよく、または示し得る。分子の「活性」は、また、細胞−細胞間相互作用、例えば、接着の調節もしくは維持における活性、または細胞の構造、例えば、細胞膜もしくは細胞骨格の維持における活性を示し得る。「活性」は、また、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画中の濃度などを意味することができる。「活性」は、自然または適応免疫系の成分の調節を示す。「増殖活性」は、例えば、正常な細胞分裂、ならびに癌、腫瘍、異形成、細胞の形質転換、転移および血管形成を促進する、上記のために必要である、または上記と特異的に関連する活性を含む。
「投与」および「処置」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器または生物学的液体に適用されるとき、外因性の医薬、治療薬、診断薬または組成物の動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器または生物学的液体への接触を示す。「投与」および「処置」は、例えば、治療、薬物動態学、診断、研究および実験方法を示すことができる。細胞の処置は、試薬の細胞への接触、ならびに液体が細胞と接触するとき被験者の液体への接触を含む。「投与」および「処置」は、また、例えば、試薬、診断、結合化合物、または別の細胞による細胞のインビトロおよびエキソビボ処置を含む。「対象」なる用語は、あらゆる生物体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）およびより好ましくはヒトを含む。
本明細書において使用されるＢＴＬＡアゴニスト抗体は、ＢＴＬＡに結合し、ＢおよびＴ細胞に対するその共阻害シグナルを増強する抗体を示す。
本明細書において使用されるＢＴＬＡアンタゴニスト抗体は、ＢＴＬＡに結合し、ＢおよびＴ細胞に対する共阻害シグナル送達を防止する抗体を示す。
本発明の態様において、可能であれば、本発明の組成物は、Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (November 1, 2002))にしたがって対象に投与される。
１つの態様において、抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、侵入経路、例えば、注射（上記参照）により投与することができる。非侵入経路（例えば、経口的に；例えば、丸剤、カプセルまたは錠剤）による投与は、本発明の範囲内である。本発明の態様において、抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメント、またはそれらの医薬組成物は、静脈内に、皮下的に、筋肉内に、経動脈的に、関節内に（例えば、関節炎の関節において）、吸入により、エアロゾル送達により、または腫瘍内に投与される。１つの態様において、抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、錠剤形態において経口的に投与される化学療法剤（例えば、ゲフィチニブ（例えば、イレッサＴＭ））と組み合わせて投与される。別の態様において、化学療法剤は、静脈内に投与されるパクリタキセル（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標））である。
さらに別の態様において、抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば、限定はしないが、ＣＴＬＡ−４に対する他のモノクローナル抗体（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（ゲムツズマブ）、ＢＥＸＸＡＲ（トシツモマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（トラスツマブ））、または同様の効果を有するタンパク質リガンド；抗原提示細胞（樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球）を活性化する薬剤、例えば、１型インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファおよびベータ）；インターフェロンガンマ；ＢＣＧ；あらゆる型および全ての型における腫瘍抗原、例えば、タンパク質抗原、ペプチド抗原、全細胞溶解物およびそれらの誘導体を提供する薬剤；遺伝的にコードされた抗原（例えば、アデノウイルスにコードされた抗原）；それらの免疫特性を増強するようにインビボまたはエキソビボのいずれかで改良された免疫系の細胞成分（例えば、自己樹状細胞、リンパ球、熱ショックタンパク質など）；化学療法剤、例えば、限定はしないが、シクロホスファミド、メトトレキサート、エトポシド、アドリアマイシン、タキサン類、フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、および白金含有薬剤、他の多数のものと組み合わせて投与される。抗原の例は、ＰＳＡ抗原（例えば、ＰＲＯＳＴＶＡＣ／ＴＲＩＣＯＭ）および黒色腫由来のｇｐ１００抗原を含む。また、該組合せは、サイトカインまたは増殖因子、例えば、限定はしないが、ＧＭ−ＣＳＦ、または免疫刺激ヌクレオチド、例えば、限定はしないが、ＣｐＧ ＯＤＮ ＰＦ３５１２６７６（ＰｒｏＭｕｎｅとしても知られている、ＷＯ２００７／００８４６３参照）と組み合わせて投与され得る。
さらに、１つの態様において、抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ１、例えば、米国特許第６，６８２，７３６号および米国特許第７，５６３，８６９号にそれぞれ記載されているものと組み合わせて投与することができる。
組成物は、当分野で知られている医療デバイスで投与することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、皮下注射器で注射により投与することができる。
本発明の医薬組成物は、また、無針の皮下注射デバイス；例えば、米国特許第６，６２０，１３５；６，０９６，００２；５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４または４，５９６，５５６号に記載されているデバイスで投与され得る。
医薬組成物を投与するためのよく知られているインプラントおよびモジュール(module)の例は、コントロールされた速度で薬物を分配するための移植可能な微小注入ポンプを記載している米国特許第４，４８７，６０３号；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを記載している米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬物送達のための変流量を移植可能な注入装置を記載している米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬送達系を記載している米国特許第４，４３９，１９６号を含む。多数の他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールは、当業者によく知られている。
「処置」または「処置する」は、治療剤、例えば、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物を、薬剤が既知の治療活性を有する１つ以上の疾患症状を有する患者に内部または外部に投与することを意味する。一般的に、薬剤は、何らかの臨床的に測定可能な程度によりこのような症状の逆転を誘導するか、またはこのような症状の進行を阻害するであろうとなかろうと、処置される患者または集団における１つ以上の疾患症状を緩和するために有効な量で投与される。何らかの特定の疾患症状を緩和するために有効である治療剤の量（「治療有効量」とも称する）は、因子、例えば、患者の疾患状態、年齢および体重、ならびに患者における所望の応答を引き起こすための薬物の能力にしたがって変化し得る。疾患症状が緩和されているか否かは、一般的に医師または他のヘルスケア提供者により症状の重症度または進行状態を評価するために使用されている何らかの臨床測定により評価することができる。本発明の態様（例えば、処置方法または製品）が、すべての患者における標的疾患症状の緩において有効でないかもしれないが、それは、当分野で知られている何らかの統計試験、例えば、ステューデントｔ検定、ｃｈｉ２検定、マン・ホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ−ｔｅｓｔ）、ヨンクヒール・タプストラ検定およびウィルコクソン検定により測定されるとき、統計的に有意な数の患者における標的疾患症状を緩和すべきである。
「処置」は、ヒト、獣医または研究対象に適用されるとき、治療的処置、予防または防止方法、研究および診断適用を示す。「処置」は、ヒト、獣医もしくは研究対象または細胞、組織もしくは臓器に適用されるとき、ＢＴＬＡアゴニストまたはアンタゴニストとヒトまたは動物対象、細胞、組織、生理学的区画または生理的液体との接触を含む。「細胞の処置」は、また、ＢＴＬＡアゴニストまたはアンタゴニストが、例えば、流体相またはコロイド相において、ＢＴＬＡ受容体と接触する状況を含むが、また、アゴニストまたはアンタゴニストが細胞または受容体と接触しない状況も含む。
１つの態様において、抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、このような処置または予防の必要のある対象における任意の疾患または状態を処置または予防するために、単独で、または組み合わせて使用することができる。
アンタゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体に対して、１つの態様において、状態は、例えば、ＢＴＬＡの発現もしくは活性を高めることにより、またはそのリガンド（例えば、ＨＶＥＭ）の発現を高めることにより介在され、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭリガンド結合、活性または発現の調節により処置または予防され得る。１つの態様において、疾患または状態は、ＢＴＬＡ、および／またはＨＶＥＭのレベルの増加により介在され、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭリガンド結合、活性または発現を減少させることにより処置または予防される。本明細書に記載されているアンタゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体は、負のシグナル伝達分子としてＢＴＬＡの活性を遮断し、ＴおよびＢ細胞による腫瘍に対する応答の上方調節をもたらす。
「ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター」および「ＢＴＬＡ」遺伝子／タンパク質なる用語は、互換的に使用され、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログおよびパラログを含む。例えば、ヒトＢＴＬＡに特異的な抗体は、１つの態様において、ヒト以外の種由来のＢＴＬＡと交差反応し得る。他の態様において、ヒトＢＴＬＡに特異的な抗体は、ヒトＢＴＬＡに完全に特異的であり得、交差反応性の種または他のタイプを示さないかもしれない。特記されない限り「ヒトＢＴＬＡ」なる用語は、ヒトＢＴＬＡ配列を示す。特記されない限り、ヒトＢＴＬＡ配列は、全てのヒトアイソタイプおよびＢＴＬＡ変異体、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＰ４４００３を有するヒトＢＴＬＡの完全なアミノ酸配列を含む。少なくとも２つのヒトＢＴＬＡ転写産物変異体も含む。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿８６１４４５で記載されている転写産物変異体１は、２８９アミノ酸長であり、受入番号ＡＡＰ４４００３のＢＴＬＡ配列と約９８％同一性を示す。この変異体は、より長い転写産物を示し、２８９個のアミノ酸のより長いアイソフォームをコードする。転写産物変異体２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０８５３５７）は、変異体１と比較して代替インフレームのエクソンを欠いており、アイソフォーム１と比較して２４１個のアミノ酸のより短いタンパク質（アイソフォーム２、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０７８８２６）をもたらす。
ヒトＢＴＬＡ配列は、例えば、保存された変異または非保存領域中の変異を有することにより異なり得、ＢＴＬＡは、配列番号：２、配列番号：３５または配列番号：３７のヒトＢＴＬＡと実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＢＴＬＡの生物学的機能は、免疫応答、例えば、Ｔ細胞応答を抑制することである。すなわち、ＢＴＬＡは負の調節因子であると考えられる。それは、ＩＬ−２生産およびＴ細胞拡大の縮小に関与するＣ末端阻害剤モチーフである（Watanabeら Nat. Immunol., 4, 670-679, 2003; Chemnitzら J. Immunol., 176, 6603-6614, 2006）。加えて、ヒトＢＴＬＡの生物学的機能は、例えば、本明細書の抗体により特異的に結合されるＢＴＬＡの細胞外ドメイン中のエピトープを有し得る。
特定のＢＴＬＡ配列は、一般的に、アミノ酸配列において配列番号：２、配列番号：３５もしくは配列番号：３７のヒトＢＴＬＡまたは他のアイソフォームと少なくとも９０％同一であり、他の種（例えばマウス）のＢＴＬＡアミノ酸配列と比較するとき、ヒトであるアミノ酸配列と同定するアミノ酸残基を含む。ある場合において、ヒトＢＴＬＡは、配列番号：２、配列番号：３５もしくは配列番号：３７または他のアイソフォームもしくは変異体のヒトＢＴＬＡと少なくとも９５％、またはより少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり得る。１つの態様において、ヒトＢＴＬＡ配列は、配列番号：２、配列番号：３５もしくは配列番号：３７のＢＴＬＡまたは他のアイソフォームもしくは変異体と最大で１０個のアミノ酸の違いを示す。１つの態様において、ヒトＢＴＬＡは、配列番号：２、配列番号：３５もしくは配列番号：３７のＢＴＬＡまたは他のアイソフォームもしくは変異体と最大で５個、またはより最大で４、３、２もしくは１個のアミノ酸の違いを示し得る。パーセント同一性は、本明細書に記載されているように決定することができる。「免疫応答」なる用語は、侵入病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌性細胞、または、自己免疫もしくは病理学的炎症の場合において、正常なヒト細胞または組織に対する選択的損傷、それらの破壊またはそれらの人体からの除去を引き起こす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および上記細胞または肝臓により産生される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用を示す。
場合によっては、マウスアナログ抗体に対する帰結(corollary)試験を行うために有用である。本明細書に記載されている適当な方法は、抗ＢＴＬＡマウス抗体を産生するため、ならびにマウス抗ＢＴＬＡ抗体を選択および特徴付けるために使用することができる。所望の特性および活性を有するあらゆるマウスＢＴＬＡペプチドを、マウスＢＴＬＡ抗体を産生するために使用することができるが、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ２９３２８５によりによりコードされるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＰ４４００２（３０６個のアミノ酸）を含むWatanabeら Nat. Immunol. 4 (7), 670-679 (2003)により記載されている配列が好ましい。
さらに、多くのマウスＢＴＬＡスプライス変異体は特徴付けられており、場合によっては、これらのいずれかを抗マウスＢＴＬＡ抗体を生産するために利用することができる。マウスＢＴＬＡスプライス変異体は、コード配列ＮＭ＿００１０３７７１９およびより長い転写産物変異体１（３０６アミノ酸長）に対する対応するアミノ酸配列ＮＰ＿００１０３２８０８を含み、より短い転写産物２変異体配列はＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿８０８２５２（３０５アミノ酸長）で記載されており；これは、変異体１と比較して３’コード領域において代替インフレームスプライス部位を使用し、より短いタンパク質（アイソフォーム２）となる。
本明細書において使用される「抗体」なる用語は、所望の生物学的活性を示す抗体のあらゆる形態を示す。したがって、それは、最も広い意味において使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体およびラクダ単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される「抗ＢＴＬＡ抗体」または抗体（「親抗体」）の「抗原結合フラグメント」なる用語は、少なくともいくつかの親抗体の結合特異性を維持している、一般的に親抗体の少なくとも１つの抗原結合のフラグメントまたは可変領域（例えば、１つ以上のＣＤＲ）を含む抗体のフラグメントまたは誘導体を含む。抗体結合フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃ−Ｆｖ；抗体フラグメントから形成されるナノボディおよび多特異的抗体を含むが、これらに限定されない。一般的に、結合フラグメントまたは誘導体は、活性がモル基準において表されるとき、そのＢＴＬＡ結合活性の少なくとも１０％を保持している。好ましくは、結合フラグメントまたは誘導体は、親抗体のＢＴＬＡ結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保持する。抗ＢＴＬＡ抗原結合フラグメントが実質的にその生物学的活性を変化しない保存または非保存アミノ酸置換（抗体の「保存変異体」または「機能的に保存された変異体」と称する）を含むことができることも意図する。「結合化合物」なる用語は、抗体およびその結合フラグメントの両方を示す。
「単離された抗体」は、結合化合物の精製状態を示し、かかる文脈において、分子が他の生物学的分子、例えば、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質、例えば、細胞残屑および増殖培地を実質的に含まないことを意味する。一般的に、「単離された」なる用語は、本明細書に記載されている結合化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在しない限り、このような物質の完全な非存在、または水、バッファーもしくは塩の非存在を意図しない。
「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖およびＣＨ１および１つの重鎖の可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含む。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結合している。
「Ｆａｂ’フラグメント」は、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖間で形成し、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、１つの軽鎖、ならびに、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の領域を含む１つの重鎖のフラグメントの一部を含む。
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間に形成されるように、ＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部を含む２つの軽鎖および２つの重鎖を含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの重鎖間のジスルフィド結合により結合している２つのＦａｂ’フラグメントからなる。
「ＦＶ領域」は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体なる用語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントであって、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在するフラグメントを示す。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨおよびＶＬドメイン間にさらに含む。ｓｃＦｖの概説のために、Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315参照。国際特許出願ＷＯ８８／０１６４９ならびに米国特許第４，９４６、７７８および５，２６０，２０３号も参照。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、２つ以上のＶＨ領域は、ペプチドリンカーと共有的に結合し、二価ドメイン抗体を創造する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は同じまたは異なる抗原を標的とし得る。
「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。場合によっては、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は、二重特異性であり得る（下記参照）。
他に記載のない限り、本明細書において使用される「抗ＢＴＬＡ」抗体は、ヒトＢＴＬＡまたはその変異体、またはあらゆるそれらの抗原フラグメントに対して増加する抗体を示す。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に同種の抗体から得られる抗体を示し、すなわち、集団を含む個々の抗体が少量で存在し得る可能性のある天然変異を除くと同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原エピトープに対して指示される。対照的に、慣用の（ポリクローナル）抗体調製物は、一般的に異なるエピトープに対して指示される（または特異的である）多数の抗体を含む。修飾句「モノクローナル」は、抗体の実質的に同種の集団から得られる抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の生産を必要とするものと解釈されない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohlerら (1975) Nature 256: 495に記載されているハイブリドーマ方法により作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）により作製され得る。「モノクローナル抗体」は、また、Clacksonら (1991) Nature 352: 624-628およびMarksら (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597（例えば、Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731も参照）に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
１つの態様において、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部がが、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに所望の生物学的活性を示す限りこのような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrisonら (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855）。
本明細書において使用される「キメラ抗体」は、第１の抗体由来の可変ドメインおよび第２の抗体由来の定常ドメインを有する抗体であって、第１および第２の抗体が異なる種由来である抗体である。一般的に、得られるキメラ抗体がヒト対象において親の齧歯動物抗体よりも有害な免疫応答が弱いように、可変ドメインは実験動物（「親抗体」）、例えば、齧歯動物由来の抗体から得られ、定常ドメイン配列はヒト抗体から得られる。
１つの態様において、本明細書におけるモノクローナル抗体は、また、ラクダ単一ドメイン抗体を含む。例えば、Muyldermansら (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmannら (1999) J. Immunol. Methods 231:25；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号参照）。１つの態様において、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような修飾を有する２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
本明細書において使用される「ダイアボディ」なる用語は２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントを示し、該フラグメントは同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合させるために非常に短いリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を創造する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHolligerら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448にさらに完全に記載されている。操作された抗体変異体の参考のために、一般的にHolliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136参照。
本明細書において使用される「ヒト化抗体」なる用語は、ヒトおよび非ヒト（例えば、マウス、ラット）抗体の両方からの配列を含む抗体の形態を示す。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および一般的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、所望によりヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る。
本発明の抗体は、また、改変されたエフェクター機能を提供するために修飾された（または遮断された）Ｆｃ領域を有する抗体を含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２参照。このような修飾は、診断および治療における可能性のある有益な効果で、免疫系の種々の反応を増強または抑制するために使用することができる。Ｆｃ領域の変更は、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化、および複数のＦｃの付加を含む。Ｆｃに対する変化は、また、治療抗体における抗体の半減期を改変させ、投与の頻度を少なくすることが可能であり、したがって利便性を増加させる、および材料の使用を減少させることができる。Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734-35参照。
「完全ヒト抗体」なる用語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を示す。完全ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生されるとき、マウス炭水化物鎖を含み得る。同様に、「マウス抗体」は、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体を示す。あるいは、完全ヒト抗体は、ラット、ラット細胞、またはラット細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生されるとき、ラット炭水化物鎖を含み得る。同様に、「ラット抗体」は、ラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体を示す。
抗体構造
一般的に、基本的な抗体構造単位はテトラマーを構成することが知られている。それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、それぞれの対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分またはフラグメントは、主に抗原認識に関与する約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み得る。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分またはフラグメントは、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義し得る。一般的に、ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、一般的にミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはエプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域と組み合わせられ、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的に、Fundamental Immunology Ch. 7（Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）参照。
それぞれの軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、一般的に、無傷なＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は、一般的に同じである。
通常、鎖は、すべて、３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとしても称される）により連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的な構造を示す。それぞれの対の２つの鎖からのＣＤＲは、通常、フレームワーク領域により並べられ、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般的に、Ｎ−末端からＣ−末端に、軽鎖および重鎖の両方はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。それぞれのドメインに対するアミノ酸の割り当ては、一般的に、Sequences of Proteins of Immunological Interest、Kabatら; National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabatら (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothiaら (1987) J Mol. Biol. 196:901-917またはChothiaら (1989) Nature 342:878-883の定義にしたがう。
本明細書において使用される「超可変領域」なる用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を示す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち軽鎖可変ドメインにおける残基２４−３４（ＣＤＲＬ１）、５０−５６（ＣＤＲＬ２）および８９−９７（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける残基３１−３５（ＣＤＲＨ１）、５０−６５（ＣＤＲＨ２）および９５−１０２（ＣＤＲＨ３）；Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.）ならびに／または「超可変ループ」からの残基（すなわち軽鎖可変ドメインにおける残基２６−３２（ＣＤＲＬ１）、５０−５２（ＣＤＲＬ２）および９１−９６（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける２６−３２（ＣＤＲＨ１）、５３−５５（ＣＤＲＨ２）および９６−１０１（ＣＤＲＨ３）；Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917）を含む。本明細書において使用される「フレームワーク」または「ＦＲ」残基なる用語は、ＣＤＲ残基として本明細書ににおいて定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を示す。
「結合物質」は、標的に結合することができる分子、小分子、高分子、抗体、それらのフラグメントもしくは類似体、または可溶性受容体を示す。「結合物質」は、また、標的に結合することができる分子の複合体、例えば、非共有複合体、イオン化分子、および共有的または非共有的に修飾された分子、例えば、リン酸化、アシル化、架橋、環化または限定開裂(limited cleavage)により修飾された分子を示す。「結合物質」は、また、安定剤、賦形剤、塩、バッファー、溶媒または添加剤と組み合わせて、標的に結合することができる分子を示し得る。「結合」は、結合物質と標的の関連として定義され得、該関連は、結合物質が溶液中に溶解または懸濁することができる場合において、結合物質の通常のブラウン運動の減少をもたらす。
「有効量」は、医学的状態の症状または徴候を改善または予防するために十分な量を含む。有効量は、また、診断を可能または容易にするために十分な量を意味する。特定の患者または獣医対象に対する有効量は、因子、例えば、処置される状態、患者の健康全般、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度に依存して変化し得る（例えば、Ｎｅｔｔｉらによる米国特許第５，８８８，５３０号参照）。有効量は、有意な副作用または毒性効果を回避する最大用量または投与プロトコールであり得る。該効果は、１００％を正常対象により示される診断パラメーターとして定義したとき、診断測定またはパラメーターの少なくとも５％、通常少なくとも１０％、さらに通常少なくとも２０％、より通常少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、理想的には少なくとも７０％、さらに理想的には少なくとも８０％、およびより理想的には少なくとも９０％の改善をもたらす（例えば、Maynardら (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK、参照）。
「外因性」は、文脈に依存して、生物体、細胞または人体の外部で生産される物質を示す。「内因性」は、文脈に依存して、細胞、生物体または人体の内部で生産される物質を示す。
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を示す。２つの比較される配列の両方における位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットにより占有されるとき、例えば、２つのＤＮＡ分子のぞれぞれにおける位置ががアデニンにより占有されるとき、分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列により共有される一致の数または相同の位置／比較される位置の数×１００の関数である。例えば、２つの配列において１０個の位置の６個が一致または相同であるとき、配列が最適に並べられているとき、２つの配列は６０％相同である。一般的に、２つの配列が最大の相同性パーセントを与えるように並べられるように比較される。
「免疫状態」または「免疫疾患」は、例えば、病理学的炎症、炎症性疾患、および自己免疫疾患または障害を含む。「免疫状態」は、また、免疫系による根絶に抵抗する感染症、腫瘍および癌を含む、感染症、持続感染および増殖性状態、例えば、癌、腫瘍および血管形成を示す。「癌性状態」は、例えば、癌、癌細胞、腫瘍、血管形成、および前癌状態、例えば、異形成を含む。
「炎症性疾患」は、病状が、全体または部分的に、例えば、免疫系の細胞の数の変化、移動の速度の変化または活性化の変化から生じる障害または病理学的状態を意味する。免疫系の細胞は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球またはマクロファージ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、ミクログリア、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、好酸球、肥満細胞、または免疫学と具体的に関連する他のあらゆる細胞、例えば、サイトカイン産生内皮もしくは上皮性細胞を含む。
「単離された結合化合物」は、結合化合物の精製状態を示し、かかる文脈において、他の生物学的分子、例えば、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質、例えば、細胞残屑および増殖培地を実質的に含まないことを意味する。一般的に、「単離」なる用語は、本明細書に記載されている結合化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在しない限り、このような物質の完全な非存在、または水、バッファーもしくは塩の非存在を意図しない。
「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連しないか、または天然に連結していないポリヌクレオチドに連結した、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのいくつかの組合せを意味する。この記載の目的のために、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」が無傷な染色体を含まないことを理解すべきである。特定の核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、特定の配列に加えて、最大１０または最大２０またはそれ以上の他のタンパク質またはそれらの部分もしくはフラグメントに対するコード配列を含み得、または、挙げられている核酸配列のコード領域の発現をコントロールする作動可能に連結された調節配列を含み得、そして／または、ベクター配列を含み得る
「コントロール配列」なるフレーズは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要であるＤＮＡ配列を示す。原核生物に適当であるコントロール配列は、例えば、プロモーター、所望によりオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるとき、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している。プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響するとき、コード配列に作動可能に連結している。または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置されるとき、コード配列に作動可能に連結している。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、リーディング相において隣接していることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。連結は、便利な制限酵素認識部位でライゲーションにより達成される。このような部位が存在しないとき、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは慣用の習慣にしたがって使用される。
本明細書において使用される「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」なる表現は互換的に使用され、すべてのこのような名称は子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」なる用語は、初代の対象細胞および移動の数には関係なくそれらに由来する培養物を含む。また、意図的または偶然の変異によって全ての子孫がＤＮＡ含有量において正確に同一はないかもしれないと理解される。最初の形質転換細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体の子孫を含む。別個の名称が意図されるとき、それは文脈から明らかである。
本明細書において使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の断片の、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているとおりに増幅される手順または技術を示す。一般的に、興味ある領域の末端からの配列情報またはそれ以降の配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように利用できる必要がある。これらのプライマーは、配列において増幅される鋳型の反対の鎖と同一または同様であり得る。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される材料の末端と一致し得る。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などを増幅するために使用することができる。一般的に、Mullisら (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR Technology (Stockton Press, N.Y.)参照。本明細書において使用されるＰＣＲは、核酸の特定の断片を増幅または産生するためにプライマーおよび核酸ポリメラーゼとして既知の核酸の使用を含む、核酸試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の１つの例として考えるが、唯一の例ではない。
本明細書において使用される「生殖細胞系列配列」なる用語は、再配列されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を示す。再配列されていない免疫グロブリンのあらゆる適当な供給源が使用され得る。
「阻害剤」および「アンタゴニスト」または「活性剤」および「アゴニスト」は、それぞれ、例えば、リガンド、受容体、補因子、遺伝子、細胞、組織または臓器の活性化のための阻害性または活性化分子を示す。例えば、遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞の調節因子は、遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞の活性を改変する分子であり、該活性はその制御特性において活性化、阻害、または改変され得る。調節因子は単独で作用してもよく、またはそれは、補因子、例えば、タンパク質、金属イオンまたは小分子を使用してもよい。阻害剤は、活性化を減少、遮断、防止、遅延する、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体または細胞を不活性化、脱感作または下方制御する化合物である。活性剤は、活性化を増加、活性化、容易に、増強する、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体または細胞を感作または上方制御する化合物である。阻害剤は、また、構成的(constititive)活性を減少、遮断または不活性化する化合物として定義され得る。「アゴニスト」は、標的と相互作用して、標的の活性化の増加を引き起こすか、または促進する化合物である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用に対抗する化合物である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を防止、減少、阻害または中和する。アンタゴニストは、また、アゴニストが同定されない場合でも、標的、例えば、標的受容体の構成的活性を防止、阻害または減少することができる。ＢＴＬＡの場合、ＢＴＬＡアゴニストは、ＢＴＬＡによりＢおよびＴ細胞に送達される負のシグナルを開始し、増強する。他方、ＢＴＬＡアンタゴニストは、ＢおよびＴ細胞にシグナル伝達を遮断し、したがってＢおよびＴ細胞活性化／増殖を増強させる。
阻害の程度を試験するために、例えば、所定のもの、例えば、タンパク質、遺伝子、細胞または生物体を含むサンプルまたはアッセイを可能性のある活性剤または阻害剤で処理し、阻害剤なしのコントロールサンプルと比較する。アンタゴニストで処理されていないコントロールサンプル、すなわちサンプルを、１００％の相対活性値に指定する。阻害は、コントロールと比較して活性値が約９０％以下、一般的に８５％以下、さらに一般的に８０％以下、より一般的に７５％以下、一般的に７０％以下、さらに一般的に６５％以下、より一般的に６０％以下、一般的に５５％以下、通常５０％以下、さらに通常４５％以下、さらに通常４０％以下、好ましくは３５％以下、さらに好ましくは３０％以下、なおさらに好ましくは２５％以下、およびより好ましくは２５％未満であるとき、達成される。活性化は、コントロールと比較して活性値が約１１０％、一般的に少なくとも１２０％、さらに一般的に少なくとも１４０％、さらに一般的に少なくとも１６０％、しばしば少なくとも１８０％、さらにしばしば少なくとも２倍、よりしばしば少なくとも２．５倍、通常少なくとも５倍、さらに通常少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、さらに好ましくは少なくとも４０倍、およびより好ましくは４０倍より高いとき、達成される。
活性化または阻害の終点は、以下のとおりにモニタリングすることができる。例えば、細胞、生理的液体、組織、臓器および動物またはヒト対象の処置に対する活性化、阻害および応答は、終点によりモニタリングすることができる。該終点は、所定の量またはパーセントの、例えば、炎症、発癌性または細胞脱顆粒または分泌の徴候、例えば、サイトカイン、毒性酸素またはプロテアーゼの放出を含み得る。該終点は、例えば、所定の量のイオン流動(ion flux)または輸送；細胞移動；細胞接着；細胞増殖；転移の可能性；細胞分化；および表現型の変化、例えば、炎症、アポトーシス、形質転換、細胞周期または転移に関する遺伝子の発現の変化を含み得る（例えば、Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood and Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timmeら (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins and Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady and Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauerら (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126、参照）。
阻害の終点は、一般的にコントロールの７５％以下、好ましくはコントロールの５０％以下、さらに好ましくはコントロールの２５％以下、およびより好ましくはコントロールの１０％以下である。一般的に、活性化の終点は、コントロールの少なくとも１５０％、好ましくはコントロールの少なくとも２倍、さらに好ましくはコントロールの少なくとも４倍、およびより好ましくはコントロールの少なくとも１０倍である。
「リガンド」は、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる、例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチドおよび膜関連または膜結合分子またはそれらの複合体を示す。「リガンド」は、また、アゴニストまたはアンタゴニストではないが、受容体に結合することができる作用物質を含む。さらに、「リガンド」は、例えば、化学的方法または組換え方法により、膜結合リガンドの可溶性型に変化させられている膜結合リガンドを含む。慣例により、リガンドが第１の細胞上に膜結合するとき、受容体は、通常、第２の細胞上に生じる。第２の細胞は、第１の細胞と同じまたは異なる同一性を有し得る。リガンドまたは受容体は、完全に細胞内であり得、すなわち、それは、サイトゾル、核、またはいくつかの他の細胞内区画に存在し得る。リガンドまたは受容体は、例えば、細胞内区画から細胞膜の外層へその位置を変化し得る。リガンドおよび受容体の複合体は、「リガンド受容体複合体」と称される。リガンドおよび受容体がシグナル伝達経路に関与するとき、リガンドはシグナル伝達経路の上流位置に生じ、受容体はシグナル伝達経路の下流位置に生じる。ＨＶＥＭは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである。ＢＴＬＡへの結合に加えて、それは、また、ＬＩＧＨＴ、ＬＴαおよびＣＤ１６０に結合することができる。
「小分子」は、１０ｋＤａ未満、一般的に２ｋＤａ未満、好ましくは１ｋＤａ未満、およびより好ましくは約５００Ｄａ未満である分子量を有する分子として定義される。小分子は、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模擬物および抗体模擬物を含むが、これらに限定されない。治療剤として、小分子は、大分子よりも細胞に対してより透過性があり、分解に対してより感受性が少なく、免疫応答を誘発する傾向がより少なくあり得る。小分子、例えば、抗体およびサイトカインのペプチド模擬物、ならびに小分子毒素は、記載されている（例えば、Cassetら (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulosら (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardiniら (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Dominguesら (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato and Sone (2003) Biochem. J. 371:603-608; Stewartらによる米国特許第６，３２６，４８２号、参照）。
「特異的に」または「選択的に」結合するは、リガンド／受容体、抗体／抗原、または他の結合対を示すとき、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中のタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。したがって、指定された条件下で、特定されたリガンドは、特定の受容体に結合し、有意な量においてサンプル中に存在する他のタンパク質に結合しない。考慮される方法の抗体または抗体の抗原結合部位由来の結合化合物は、何らかの他の抗原との親和性よりも少なくとも２倍以上、好ましくは少なくとも１０倍以上、さらに好ましくは少なくとも２０倍以上、より好ましくは少なくとも１００倍以上である親和性で、その抗原またはその変異体もしくは変異タンパク質に結合する。
本明細書において使用される「免疫調節剤」なる用語は、免疫応答を抑制または調整する天然または合成の薬剤を示す。該免疫応答は、体液性または細胞性応答であり得る。免疫調節剤は、免疫抑制剤または抗炎症剤を含む。
本明細書において使用される「免疫抑制剤(immunosuppressive agent、immunosuppressive drug、immunosuppressant)」は、免疫抑制療法において免疫系の活性を阻害または予防するために使用される治療剤である。臨床的に、それらは、移植された臓器および組織（例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓）の拒絶反応および／または自己免疫疾患または自己免疫性起源の可能性が高い疾患（例えば、リウマチ性関節炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症）の処置において予防するために使用される。免疫抑制剤は、グルココルチコイド；細胞増殖抑制；抗体；生物学的応答修飾因子、例えば、ＣＴＬＡ−４／Ｉｇ（ＡｂａｔａｃｅｐｔＴＭ）を含むＩｇ融合タンパク質；イムノフィリンに作用する薬剤；増殖性疾患の処置において使用される基地の化学療法剤、例えば、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を含む他の薬剤として分類することができる。多発性硬化症において、特に、本発明の抗体は、コパクソンとして知られているミエリン結合タンパク質様治療剤の新規クラスと共に投与することができる。
「抗炎症剤」または「抗炎症剤」は、ステロイド性および非ステロイド性治療剤の両方を示す。コルチコステロイドとしても知られているステロイドは、副腎により天然に生産されるホルモンであるコルチゾールに非常に似ている薬剤である。ステロイドは、特定の炎症状態、例えば、全身性脈管炎（血管の炎症）；および筋炎（筋肉の炎症）のための主な処置として使用される。ステロイドは、また、炎症状態、例えば、リウマチ性関節炎（体の両側の関節に生じる慢性炎症性関節炎）；全身性エリテマトーデス（異常な免疫系機能によって引き起こされる全身性疾患）；シェーグレン症候群（ドライアイおよびドライマウスを引き起こす慢性の障害）を処置するために選択的に使用され得る。
ＮＳＡＩＤと通常略される非ステロイド性抗炎症剤は、鎮痛、解熱および抗炎症効果を有する薬剤であり、それらは、疼痛、発熱および炎症を減少させる。「非ステロイド性」なる用語は、これらの薬剤とステロイドを区別するために使用され、これらは（広範囲の他の効果の中）同様のエイコサノイド抑制、抗炎症作用を有する。ＮＳＡＩＤは、以下の状態の症状軽減のために一般的に指示されている：リウマチ性関節炎；骨関節症；炎症性関節症（例えば、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ライター症候群）；急性痛風；月経困難症；転移部骨痛；頭痛および偏頭痛；術後疼痛；炎症および組織傷害による軽度から中程度の疼痛；発熱；ならびに腎疝痛。ＮＳＡＩＤは、サリチル酸塩、アリールアルカン酸、２−アリールプロピオン酸（プロフェン）、Ｎ−アリールアントラニル酸（フェナム酸）、オキシカム、コキシブおよびスルホンアニリドを含む。
疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）は、しばしばＮＳＡＩＤと組み合わせて、投与され得る。一般的に規定されているＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロキン／クロロキン、メトトレキサート、金療法、スルファサラジンおよびアザチオプリンを含む。
「シグナル変換経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル変換分子間の生化学的関連を示す。本明細書において使用される「細胞表面受容体」なるフレーズは、例えば、シグナルを受け取ること、および細胞の細胞膜を介してかかるシグナルを伝達することができる分子および分子の複合体を含む。本明細書の「細胞表面受容体」の例はＢＴＬＡ受容体である。
ヒトＢＴＬＡに特異的な抗体
本発明は、一般的に、ＢＴＬＡに結合する単離された抗体またはそれらの抗原結合フラグメントおよびこのような抗体またはそれらの抗原結合フラグメントの使用を提供する。さらに具体的には、本発明は、単離された完全ヒト抗ＢＴＬＡ抗体および疾患の処置における抗体またはそれらの抗原結合フラグメントの使用の方法を提供する。完全ヒト抗ＢＴＬＡ抗体の例は、Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７およびｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７を含むが、これらに限定されない。
本発明は、１つ以上の以下の特性：（１）ＨＶＥＭまたはＬＩＧＨＴのヒトＢＴＬＡへの結合を遮断しない；（２）カニクイザルＢＴＬＡと交差反応する；（３）タンパク質結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）において最大で約２．５×１０−９のヒトＢＴＬＡへの結合に対するＫＤ；および（４）ＴおよびＢ細胞活性化アッセイにおいて少なくとも約１０ｎＭのＥＣ５０を有することを示す単離された抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。１つの態様において、抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、タンパク質結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ；実施例２−３）において最大で約２．５×１０−９のヒトＢＴＬＡへの結合に対するＫＤおよびＴおよびＢ細胞活性化アッセイにおいて約１０−１００ｎＭのＥＣ５０を有する。
別の態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、ＨＶＥＭのＢＴＬＡへの結合を遮断する単離された完全ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである。さらに別の態様において、このような抗体の例は、完全ヒト抗ＢＴＬＡ抗体、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７を含むが、これらに限定されない。
ＢＴＬＡに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の記載されている抗体および抗原結合フラグメントの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲは、独立して、本発明の抗体およびそれらの抗原結合フラグメントの記載されているＣＤＲ配列（例えば、表１、表２）から選択され得る。あるいは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲは、本発明の単一の記載されている抗体または抗原結合フラグメントのＣＤＲ配列から選択され得る。１つの態様において、１つ、２つまたは３つのＣＤＲは、記載されているアゴニスト抗体のＶＬＣＤＲ（例えば、表１；配列番号：１２−１４）から選択され、そして／または、１つ、２つまたは３つのＣＤＲは、記載されている発明のＶＨＣＤＲ（例えば、表２；配列番号：５−７）から選択される。別の態様において、１つ、２つまたは３つのＣＤＲは、記載されているアンタゴニスト抗体のＶＬＣＤＲ（例えば、表１；配列番号：２６−２８）から選択され、そして／または、１つ、２つまたは３つのＣＤＲは、記載されている発明のＶＨＣＤＲ（例えば、表２；配列番号：１９−２１）から選択される。
ＢＴＬＡに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；（ｂ）抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３の可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；（ｃ）抗体ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６の可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；ならびに（ｄ）抗体ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７の可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２またはＣＤＲ−Ｌ３を含む少なくとも１つの抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含むことができる。
ＢＴＬＡに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；（ｂ）抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３の可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；（ｃ）抗体ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６の可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；ならびに（ｄ）抗体ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７の可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２またはＣＤＲ−Ｈ３を含む少なくとも１つの抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むことができる。
好ましい態様において、ＢＴＬＡに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；（ｂ）抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３の可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；（ｃ）抗体ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６の可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；ならびに（ｄ）抗体ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７の可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む少なくとも１つの抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、ならびに、（ａ）抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；（ｂ）抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３の可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；（ｃ）抗体ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６の可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；ならびに（ｄ）抗体ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７の可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む少なくとも１つの抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む。
本発明の抗体の軽鎖および重鎖ＣＤＲの配列は、表１および２にそれぞれ提供されている。限定はしないが一例として、アゴニスト抗体に対するＶＬドメインＣＤＲは配列番号：１２−１４から選択され、アンタゴニスト抗体に対するＶＬドメインＣＤＲは配列番号：２６−２８から選択される。同様に、アゴニスト抗体に対するＶＨドメインＣＤＲは配列番号：７−９から選択され、アンタゴニスト抗体に対するＶＨドメインＣＤＲは配列番号：１０−１２から選択される。
表１：軽鎖ＣＤＲ
Figure 0005898617
 表２：重鎖ＣＤＲ
Figure 0005898617
本発明は、ＢＴＬＡに結合し、アゴニスト抗体として機能し、抗体Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の成熟ＶＬドメイン（配列番号：１８）を含む単離された抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに提供する。好ましい態様において、該抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。好ましい完全ヒトアゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体の例は、Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７およびそれらの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
本発明は、ＢＴＬＡに結合し、アンタゴニストとして機能し、抗体Ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の成熟ＶＬドメイン（配列番号：３２）を含む単離された抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに提供する。好ましい態様において、該抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。好ましい完全ヒトアンタゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体の例は、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７およびそれらの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
本発明は、ＢＴＬＡに結合し、アゴニストとして機能し、（ａ）抗体Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の成熟ＶＨドメイン（配列番号：１１）からなる群から選択される少なくとも１つのＶＨドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに提供する。好ましい態様において、該抗体は、完全ヒトモノクローナルアゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体である。好ましい完全ヒトアゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体の例は、Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７およびそれらの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
本発明は、ＢＴＬＡに結合し、アンタゴニストとして機能し、（ａ）抗体ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の成熟ＶＨドメイン（配列番号：２５）からなる群から選択される少なくとも１つのＶＨドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに提供する。好ましい態様において、該抗体は、完全ヒトアンタゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体である。好ましい完全ヒトアンタゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体の例は、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７およびそれらの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
本発明は、ＢＴＬＡに結合し、配列番号：１２、１３および１４からなる群から選択される少なくとも１つのＶＬドメインならびに配列番号：５、６および７からなる群から選択される少なくとも１つのＶＨドメインを有する単離されたアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。好ましい態様において、該抗体は、完全ヒトアゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体である。好ましい完全ヒトアゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体の例は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７およびそれらの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
本発明は、ＢＴＬＡに結合し、配列番号：２６、２７、２８からなる群から選択される少なくとも１つのＶＬドメインならびに配列番号：１９、２０および２１からなる群から選択される少なくとも１つのＶＨドメインを有する単離されたアンタゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。好ましい態様において、該抗体は、完全ヒトアンタゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体である。好ましい完全ヒトアンタゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体の例は、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７およびそれらの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
１つの態様において、本発明の単離された抗体は、重鎖定常領域、好ましくはヒト定常領域、例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４ヒト重鎖定常領域またはそれらの変異体を含む。別の態様において、結合化合物は、軽鎖定常領域、好ましくはヒト軽鎖定常領域、例えば、ラムダまたはカッパヒト軽鎖領域またはそれらの変異体を含む。一例として、限定としてではなく、ヒト重鎖定常領域はγ１であり得、ヒト軽鎖定常領域はカッパであり得る。別の態様において、抗体のＦｃ領域はＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異を有するγ４である（Schuurman, Jら Mol. Immunol. 38: 1-8, 2001）。
１つの態様において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディからなる群から選択される。
本発明は、また、本発明の抗体のＶＬドメイン（例えば、配列番号：１６、１８、３０、３２、３７および３８）を含む単離されたポリペプチドならびにＶＨドメイン（例えば、配列番号：９、１１、２３および２５）を含む単離されたポリペプチドを提供する。１つの態様において、本発明は、ＢＴＬＡに結合し、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または５０％の配列相同性を有するＶＬドメイン、ＶＨドメインを有する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の態様において、本発明の結合化合物は、最大で０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の保存または非保存アミノ酸置換を有するＶＬおよびＶＨドメイン（シグナル配列を有するもの、およびそれを有さないもの）を含むが、まだ所望の結合特性を示す。
「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく変化が頻繁に起こり得るような、タンパク質中のアミノ酸と同様の特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格構造および剛性など）を有する他のアミノ酸との置換を示す。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)参照）。加えて、構造的に、または機能的に同様のアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。本発明の結合化合物の種々の態様は、本明細書に記載されている特定のアミノ酸配列、例えば、配列番号：５、６、７、９、１１、１２、１３、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２３、２５、３０、３２および３７と比較して、最大で０（変化なし）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０個またはそれ以上の保存アミノ酸置換を含む配列を有するポリペプチド鎖を含む。本明細書において使用される、「最大でＸ」個の保存アミノ酸置換なる句は、０個の置換および最大でＸ（Ｘを含む）個のあらゆる数の置換を含む。このような典型的な置換は、好ましくは、以下の表３に記載されているものにしたがって行われる。
表３
典型的な保存アミノ酸置換
Figure 0005898617
本発明の抗体の機能的保存変異体が、また、本発明により考慮される。「機能的保存変変異体」は、決してアミノ酸の同様の特性を有するアミノ酸での置換に限定はしないが、タンパク質または酵素における１つ以上のアミノ酸残基がポリペプチドの全体の構造および機能を改変することなく変化しているものである。
アミノ酸置換
本発明は、また、最大で０、１、２、３、４または５個またはそれ以上のアミノ酸置換を有するが、まだＢＴＬＡに結合する能力を示す、本発明のアゴニストＢＴＬＡ抗体のＶＬドメイン（例えば、配列番号：１６および１８）を含む単離されたポリペプチドおよびアゴニストＢＴＬＡ抗体のＶＨドメイン（例えば、配列番号：９および１１）を含む単離されたポリペプチドを提供する。
さらなる態様において、本発明は、最大で０、１、２、３、４または５個またはそれ以上のアミノ酸置換を有するが、まだＢＴＬＡに結合する能力を示す、本発明のアンタゴニストＢＴＬＡ抗体のＶＬドメイン（例えば、配列番号：３０または３２）を含む単離されたポリペプチドおよびアンタゴニストＢＴＬＡ抗体のＶＨドメイン（例えば、配列番号：２３または２５）を含む単離されたポリペプチドを提供する
別の態様において、本発明は、ヒトＢＴＬＡに結合し、本明細書に記載されている１つ以上のＶＬドメインまたはＶＨドメインと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または５０％の配列相同性を有するＶＬドメイン ＶＨドメインを有し、ヒトＢＴＬＡへの結合を示す抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の態様において、本発明の結合化合物は、最大で０、１、２、３、４または５個またはそれ以上のアミノ酸置換を有するＶＬおよびＶＨドメイン（シグナル配列を有するもの、およびそれを有さないもの）を含み、ヒトＢＴＬＡへの結合を示す。
１つの態様において、最終抗体のより良い化学安定性を提供するために、以下のとおり、暴露される側鎖を含む特定のアミノ酸を別のアミノ酸残基に変化させることが望ましい。例えば、アスパラギン（Ａｓｎ）残基は、ＣＤＲ内の任意のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列でイソアスパラギン酸塩の形成の可能性を減少させるために、ＧｌｎまたはＡｌａに変化され得る。同様の問題は、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列で起こり得る。Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281参照。イソアスパラギン酸塩の形成は、抗体のその標的抗原への結合を弱体化または完全に破棄し得る。Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734参照。１つの態様において、アスパラギンは、グルタミン（Ｇｌｎ）に変化される。また、小さいアミノ酸がアスパラギンまたはグルタミンに隣接して存在するとき、より高い割合で生じる脱アミドの可能性を減少させるために、アスパラギン（Ａｓｎ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基に隣接したアミノ酸を改変することが望ましいかもしれない。Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261参照。加えて、ＣＤＲにおける任意のメチオニン残基（一般的に溶解力のある露出したＭｅｔ）は、抗原結合親和性を減少させ、また、最終抗体調製物における分子不均一性に寄与し得るメチオニン硫黄が酸化する可能性を減少させるために、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＰｈｅに変化され得る。同上。１つの態様において、メチオニンは、アラニン（Ａｌａ）に変化される。さらに、潜在的に切れやすいＡｓｎ−Ｐｒｏペプチド結合を防止または最小限にするために、ＣＤＲにおいて見られる任意のＡｓｎ−Ｐｒｏ組合せを、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｓｎ−Ａｌａに改変することが望ましいかもしれない。このような置換を有する抗体は、次に、置換がＢＴＬＡ結合親和性または他の所望の生物学的活性を許容されないレベルに減少させないことを保証するためにスクリーニングされる。
表４ 典型的な安定化ＣＤＲ変異体
Figure 0005898617
８Ｄ５ ＶＨに対する典型的なＣＤＲ変異体は、以下を含む：
ＣＤＲ１：ＳＹＤＭＨ（配列番号：５）
ＣＤＲ１変異体ＳＹＤＸＨ＝ＸはＭ、Ｋ、Ｌ、ＡまたはＦである（配列番号：３８）
ＣＤＲ３：ＥＧＭＡＡＨＮＹＹＧＭＤＶ（配列番号：７）
ＣＤＲ３変異体ＥＧＸ１ＡＡＨＸ２ＹＹＧＸ１ＤＶ＝Ｘ１はＭ、Ｋ、Ｌ、ＡまたはＦであり；Ｘ２はＮ、ＱまたはＡである（配列番号：３９）
ＶＨ ＣＤＲに対するＸ変化は、あらゆる組合せにおいて独立して選択することができる。
８Ｄ５ ＶＬに対する典型的なＣＤＲ変異体は、以下を含む：
ＣＤＲ２：ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号：１３）
ＣＤＲ２変異体：ＤＡＳＸＲＡＴ＝ＸはＱまたはＡである（配列番号：４０）
ＣＤＲ３：ＱＱＲＳＮＷＰＰＩＴ（配列番号：１４）
ＣＤＲ３変異体：ＱＱＲＳＸＷＰＰＩＴ＝ＸはＱまたはＡである（配列番号：４１）
ＶＬ ＣＤＲに対するＸ変化は、あらゆる組合せにおいて独立して選択することができる。さらに、本明細書に記載されているあらゆるＸ変化は、所望の活性または結合能力が維持されている限り、あらゆる組合せにおいて独立して選択することができる。
４Ｃ７ ＶＨに対する典型的なＣＤＲ変異体は、以下を含む：
ＣＤＲ２：ＹＩＹＹＳＧＳＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：２０）
ＣＤＲ２変異体：ＹＩＹＹＳＧＳＴＫＹＸ１Ｘ２ＳＬＫＳ＝Ｘ１Ｘ２はＮ−Ｐ、Ｑ−Ｐ、Ａ−ＰまたはＮ−Ａである（配列番号：４２）
ＣＤＲ３：ＥＷＰＹＹＹＹＥＭＤＶ（配列番号：２１）
ＣＤＲ３変異体：ＥＷＰＹＹＹＹＥＸＤＶ＝ＸはＭ、Ｋ、Ｌ、ＡまたはＦである（配列番号：４３）
ＶＨ ＣＤＲに対するＸ変化は、あらゆる組合せにおいて独立して選択することができる。
本明細書および特許請求の範囲において使用される「本質的に〜からなる」、「本質的に〜からなり」または「本質的に〜からなっている」なる用語は、列挙されている要素のいずれかまたは要素の群の包含、ならびに、特定の投与レジメン、方法または組成物の基本的または新規特性を物質的に変化しない、列挙されている要素と同様の、または異なる性質の他の要素の任意の包含を示す。非限定的な例として、本質的に列挙されているアミノ酸配列からなる結合化合物は、また、結合化合物の特性に物質的に影響しない１個以上のアミノ酸を含み得る。
核酸ハイブリダイゼーション背景
本発明は、抗ＢＴＬＡ抗体およびそれらのフラグメント、例えば、表１−２に記載されている核酸または表４に記載されているアミノ酸残基をコードする核酸ならびにそれらにハイブリダイズする核酸によってコードされるものを含む。好ましくは、該核酸は、低ストリンジェンシー条件下で、さらに好ましくは中ストリンジェンシー条件下で、およびより好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、好ましくは、ＢＴＬＡ結合活性を示す。核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適当な条件下で他の核酸分子にアニール化することができるとき、別の核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡに「ハイブリダイズすることができる」（Sambrookら、上記）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳおよびホルムアミドなし；または４２℃、３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを含む。典型的な中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが４０％のホルムアミド中、５×または６×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳで４２℃で行われることを除いて、低ストリンジェンシー条件と同様である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション条件が５０％のホルムアミド中、５×または６×ＳＳＣで４２℃で、所望により、より高い温度で（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃）行われることを除いて、低ストリンジェンシー条件と同様である。一般的に、ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣ１および０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間の不一致が起こりうることを必要とする。核酸をハイブリダイズするために適当なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当分野でよく知られている変化に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、核酸がハイブリダイズし得るストリンジェンシーが高くなる。１００以上のヌクレオチド長のハイブリッドにおいて、融解温度を計算するための式はもたらされている（Sambrookら 上記 9.50-9.51参照）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいて、不一致の位置はさらに重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrookら 上記 11.7-11.8参照）。
また、本発明に含まれるものは、比較がアルゴリズムのパラメーターが、それぞれの参照配列の全長にわたって、それぞれの配列間で最大マッチングを与えるように選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムにより行われるとき、参照ヌクレオチドおよびアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、さらに好ましくは少なくとも約９０％同一、およびより好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるヌクレオチド配列を含む核酸およびアミノ酸配列を含むポリペプチドである。比較がアルゴリズムのパラメーターが、それぞれの参照配列の全長にわたって、それぞれの配列間で最大マッチングを与えるように選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムで行われるとき、参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約７０％類似、好ましくは少なくとも約８０％類似、さらに好ましくは少なくとも約９０％類似およびより好ましくは少なくとも約９５％類似（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、また、本発明に含まれる。
配列同一性は、比較される２つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸間の正確なマッチングを示す。配列類似性は、同一でない生化学的に関連したアミノ酸間のマッチングに加えて、比較される２つのポリペプチドのアミノ酸間の両方の正確なマッチングを示す。同様の特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連したアミノ酸は、上記されている。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の文献は有用である：BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.Fら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, Wら (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.Lら (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.Fら (1997) Nucleics Res. 25:3389-3402; Zhang, Jら (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.Cら (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.Mら (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.Oら "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.Mら "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.Jら (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, Sら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.Fら (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, Sら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, Sら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, Aら (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039;およびAltschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York。
別の態様において、本発明は、本発明の単離された抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸、例えば、ＤＮＡに関する。１つの態様において、単離された核酸は、少なくとも１つの成熟抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび少なくとも１つの成熟抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含むアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＶＬドメインが配列番号：１２−１４から選択される配列を有する少なくとも３つのＣＤＲを含み、ＶＨドメインが配列番号：５−７から選択される配列を有する少なくとも３つのＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。１つの態様において、単離された核酸は、配列番号：１８および配列番号：１１のそれぞれの成熟軽鎖および重鎖可変領域配列をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、単一の核酸分子上の軽鎖および重鎖の両方をコードし、他の態様において、軽鎖および重鎖は２つまたはそれ以上の別々の核酸分子上にコードされる。別の態様において、核酸は、シグナル配列をさらにコードする。
本発明は、また、本発明の単離された核酸を含む発現ベクターであって、該核酸は、宿主細胞がベクターでトランスフェクトされたとき、宿主細胞により認識されるコントロール配列に作動可能に連結している発現ベクターを提供する。また、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、さらに、結合化合物をコードする発現ベクターを有する宿主細胞を培養培地中で培養し、宿主細胞または培養培地から結合化合物を単離することを含む本発明の結合化合物を生産する方法に関する。
本発明は、また、ヒトＢＴＬＡ上の同じエピトープに結合する抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、例えば、抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６またはｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７（すなわち、アゴニスト抗体）またはｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７（すなわち、ＨＶＥＭとの結合を遮断するアンタゴニスト抗体）、例えば、本発明の抗体のいずれかの結合を交差遮断することができる抗体に関する。
一例として、限定はしないが、本発明の完全ヒト抗体は、最大で約１００ｎＭ（１×１０−７Ｍ）；好ましくは最大で約１０ｎＭ；さらに好ましくは最大で約１ｎＭのＫＤ値を有するヒトＢＴＬＡに結合する。さらにより好ましくは、抗体が最大で約２００ｐＭ（２×１０−１０Ｍ）、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭまたは２ｐＭのＫＤ値を有する態様である。
抗体を生産するためのあらゆる適当な方法が、本発明の抗体を生産するために使用され得る。ヒトＢＴＬＡのあらゆる適当な型が、抗体の生産のための免疫原（抗原）として使用することができる。一例として、限定はしないが、あらゆるヒトＢＴＬＡアイソフォームまたはそのフラグメントが免疫原として使用され得る。例は、本明細書に記載されているヒトＢＴＬＡのアイソフォームおよびスプライス変異体を含むが、これらに限定されない。別の態様において、アカゲザルＢＴＬＡは、該抗体の生産のための免疫原として使用することができる。
好ましい態様において、ＢＴＬＡに対する完全ヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックマウスを使用して生産される。本明細書において「ＨｕＭＡｂ」マウスとして称され得るこれらのトランスジェニックマウスは、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列を内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異と共にコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を含む（Lonberg, Nら (1994) Nature 368(6474): 856-859）。したがって、該マウスはマウスＩｇＭまたはκの発現の減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖の導入遺伝子は、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生産するためにクラススイッチング(switching)および体細胞変異を受ける（Lonberg, Nら (1994)上記; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, Nら (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93、およびHarding, Fら (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536-546に記載されている）。ＨｕＭａｂマウスの調製物は一般的に当分野で知られており、例えば、Taylor, Lら (1992) Nucleics Research 20:6287-6295; Chen, Jら (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillonら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choiら (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, Jら (1993)EMBO J. 12: 821- 830; Tuaillonら (1994) J Immunol. 152:2912-2920; Lonbergら (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, Lら (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, Nら (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, Fら (1995) Ann. N.Y Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, Dら (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびHardingら (1995) Annals NY Acad. Sci. 764:536-546に記載されている。米国特許第５，５４５，８０６；５、５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，８７７，３９７；５，６６１，０１６；５，８１４，３１８；５，８７４、２９９；５，７７０，４２９および５，５４５，８０７号；ならびに国際特許出願公開ＷＯ９８／２４８８４；ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９３／１２２２７；ＷＯ９２／２２６４５およびＷＯ９２／０３９１８も参照。
ＢＴＬＡに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生産するために、ＨｕＭａｂマウスは、Lonberg, Nら (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, Dら (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４に記載されているとおり、抗原ＢＴＬＡポリペプチド、好ましくは配列番号：３５の残基３１−１５２で免疫化されすることができる。好ましくは、該マウスは、第１の免疫化時に６−１６週齢である。例えば、ＢＴＬＡの精製された調製物は、腹腔内および／または皮下的にＨｕＭａｂマウスを免疫化するために使用することができる。該マウスは、また、ＢＴＬＡ遺伝子で安定にトランスフェクトされた全ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞で免疫化することができる。「抗原ＢＴＬＡポリペプチド」は、好ましくはＨｕＭａｂマウスにおいて、抗ＢＴＬＡ免疫応答を引き起こすＢＴＬＡポリペプチドまたはその任意のフラグメント、好ましくは任意のＢＴＬＡフラグメントを示し得る。
一般的に、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、最初に、腹腔内に（ＩＰ）および／または皮下にＭＰＬ（登録商標）＋ＴＤＭアジュバント（Sigma、Product No. M6536）中の抗原で免疫化され、次に、ＭＰＬ（登録商標）＋ＴＤＭアジュバント中の抗原で１週間毎にまたは２もしくは３週間毎にＩＰ免疫化（通常、最大で全６回）するとき良く応答する。マウスを、最初に、ＢＴＬＡを発現する細胞（例えば、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）で、次に、ＢＴＬＡの可溶性フラグメント（例えば、配列番号：３５の残基３１−１５２）で免疫化し、２つの抗原での交互免疫化を継続的に与えることができる。免疫応答は、眼窩後出血により得られる血漿サンプルでの免疫化プロトコールの進行にわたってモニタリングすることができる。血漿は、例えば、ＥＬＩＳＡにより抗ＢＴＬＡ抗体の存在をスクリーニングすることができ、免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用することができる。マウスを、犠牲および脾臓の除去４日前に静脈内に抗原でブーストすることができる。それぞれの抗原に対する２−３の融合を行う必要があり得ることが予期される。いくつかのマウスをそれぞれの抗原に対して免疫化することができる。
モノクローナル完全ヒト抗ＢＴＬＡ抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、当分野で一般的に知られている方法により生産され得る。これらの方法は、Kohlerら (1975) (Nature 256:495-497)により最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ(trioma)技術（Heringら (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:211-216およびHagiwaraら (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4:15）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら (1983) immunology Today 4:72およびCoteら (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80:2026-2030）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleら in Monoclomal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985）、およびサイトパルス大型チャンバー細胞融合エレクトロポレーターを使用する電場ベースの電気融合（Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、マウスの脾細胞を単離し、標準プロトコールに基づいてマウス骨髄腫細胞系とＰＥＧで、または電気融合により融合させる。次に、得られるハイブリドーマを、抗原特異的抗体の生産のためにスクリーニングされ得る。例えば、免疫化されたマウスからの脾臓のリンパ球の単一の細胞懸濁液は、６分の１の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３を分泌しないマウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８０）と５０％のＰＥＧで融合され得る。細胞を、平底マイクロタイタープレート中に約２×１０５細胞／ｍＬで置き、次に、２０％の胎児クローン血清、１８％の「６５３」馴化培地、５％のｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴが融合２４時間に加えられている）を含む選択培地中で２週間インキュベーションし得る。。２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと置き換わっている培地で培養してもよい。次に、個々のウェルをヒト抗ＢＴＬＡモノクローナルＩｇＧ抗体に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングし得る。大規模なハイブリドーマ増殖が起こると、培地は通常１０−１４日後に観察することができる。ハイブリドーマを分泌する抗体を置き換え、再び分泌させ、まだヒトＩｇＧに対して陽性であるとき、抗ＢＴＬＡモノクローナル抗体を希釈を限定することにより少なくとも２回サブクローニングすることができる。次に、安定なサブクローンを、特徴付けのための組織培養培地中で少量の抗体を生産するためにインビトロで培養してもよい。
本発明の抗ＢＴＬＡ抗体およびそれらの抗原結合フラグメントは、また、組換え的に生産され得る（例えば、上記大腸菌／Ｔ７発現系において）。この態様において、本発明の抗体分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸は、ｐＥＴベースのプラスミドに挿入され、大腸菌／Ｔ７系において発現され得る。当分野で知られている組換え抗体を生産するいくつかの方法がある。抗体の組換え生産のための方法の１つの例は。米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための既知の任意の方法により行うことができる。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入のための方法は、当分野でよく知られており、デキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームにおけるポリヌクレオチドのカプセル化、核へのＤＮＡの微粒子銃注射および直接微量注入を含む。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターにより哺乳動物細胞に導入され得る。細胞を形質転換する方法は、当分野でよく知られている。例えば、米国特許第４，３９９，２１６；４，９１２，０４０；４，７４０，４６１および４，９５９，４５５号参照。
抗ＢＴＬＡ抗体は、また、米国特許第６，３３１，４１５号に記載されているいずれかの方法により合成することができる。
発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞系は、当分野でよく知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から利用できる多数の不死化細胞系を含む。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、子ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞腺腫細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多くの他の細胞系を含む。哺乳動物宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞を含む。特に好ましい細胞系は、その細胞系が高い発現レベルを有するかを決定することを介して選択される。使用され得る他の細胞系は、昆虫細胞系、例えば、Ｓｆ９細胞、両生動物細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分もしくはフラグメント、軽鎖および／またはその抗原結合フラグメントをコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞中で抗体の発現、またはさらに好ましくは、宿主細胞が培養される培養培地への抗体の分泌のために十分な期間、宿主細胞を培養することにより生産される。
抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。さらに、生産細胞系からの本発明の抗体（または他のそれらの部分）の発現は、多くの既知の技術を使用して増強することができる。例えば、グルタミンシンターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０ ２１６ ８４６、０ ２５６ ０５５および０ ３２３ ９９７ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号の全体または一部においてき際されている。
異なる細胞系により、またはトランスジェニック動物において発現される抗体が互いに異なるグリコシル化を有することもある。しかしながら、本明細書において提供される核酸分子によってコードされる、または本明細書において提供されるアミノ酸配列を含む全ての抗体は、抗体のグリコシル化にかかわらず、本発明の一部である。同様に、１つの態様において、インビトロおよびインビボの両方でフコシル化対応物よりも一般的にさらに強い有効性を示すため、非フコシル化抗体は有利であり、それらの炭水化物構造が天然のヒト血清ＩｇＧの通常成分であるため、免疫原性である可能性がない。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を示し、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して高度に特異的である。モノクローナル抗体は、本質的に他の免疫グロブリンにより汚染されないハイブリドーマ培養により合成され得るという点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に同種の集団中である抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈するされない。上記のとおり、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら (1975) Nature 256: 495により最初に記載されたハイブリドーマ方法により作製され得る。
ポリクローナル抗体は、１つ以上の他の同一でない抗体中または該抗体の存在下で生産された抗体である。一般的に、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を生産したいくつかの他のＢリンパ球の存在下でＢリンパ球から生産される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化された動物から直接得られる。
二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法により生産することができる。例えば、Songsivilaiら (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321、Kostelnyら (1992) J Immunol. 148:1547-1553参照。加えて、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」（Holligerら (1993) PNAS USA 90:6444-6448)または「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」(Trauneckerら (1991) EMBO J. 10:3655-3659およびTrauneckerら (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52）として形成され得る。
本発明は、「キメラ抗体」−別の非ヒト種（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、トリ）由来の抗体領域（例えば、定常領域）で融合またはキメラ化された本発明の可変領域を含む抗体を含む。これらの抗体は、非ヒト種におけるＢＴＬＡの発現または活性を調節するために使用され得る。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを有し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することができるように、ＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖抗体の生産のために記載されている技術（米国特許第５，４７６，７８６；５，１３２，４０５および４，９４６，７７８号）を、抗ＢＴＬＡ特異的一本鎖抗体を生産するために適合させることができる。ｓＦｖの概要のために、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994)参照。
「ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント」および「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド架橋により連結されている可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含む抗体分子を示す。
本発明の範囲内の抗体フラグメントは、また、例えば、ペプシンによる、ＩｇＧの酵素的開裂により生産され得るＦ（ａｂ）２フラグメントを含む。Ｆａｂフラグメントは、例えば、ジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのＦ（ａｂ）２の還元により生産され得る。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によりＶＨ−ＣＨ１鎖に付加されたＶＬ−ＣＬ鎖である。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、順に、２つのジスルフィド架橋により付加された２つのＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）２分子のＦａｂ部分は、ジスルフィド架橋が位置する間のＦｃ領域の一部を含む。ＦＶフラグメントは、ＶＬまたはＶＨ領域である。
これらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの少なくとも５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２にさらに分割され得る。
抗体操作
本発明の操作された抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ内でフレームワーク残基に行われているものを含む。一般的に、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるように行われる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列に「復帰突然変異する」ことである。さらに具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体由来の生殖細胞系列配列と異なっているフレームワーク残基を含むことができる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を抗体由来の生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。
例えば、表Ａは、フレームワーク領域アミノ酸位置（Ｋａｂａｔ番号制を使用する）が生殖細胞系列と異なっている領域、この位置が示されている置換により生殖細胞系列に復帰突然変異され得る方法を示す：
表Ａ−典型的な復帰突然変異
Figure 0005898617
フレームワーク修飾の別の型は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の可能性のある免疫原性を減少させるために、フレームワーク領域内または１つ以上のＣＤＲ領域内でで１つ以上の残基を修飾することを含む。このアプローチは、また、「脱免疫化」として称され、米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、または代わりに、本発明の抗体は、一般的に、１つ以上の抗体の機能特性、例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存細胞毒性を改変するために、Ｆｃ領域内で修飾を含むを含むように操作することができる。さらに、本発明の抗体を、化学的に修飾するか（例えば、１つ以上の化学部分を抗体に結合させることができる）、または、そのグリコシル化を改変し、再び抗体の１つ以上の機能特性を改変するように修飾することができる。これらのそれぞれの態様は、以下にさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
好ましい態様において、抗体は、重鎖定常領域のヒンジ領域中の位置２２８（Ｓ２２８Ｐ；ＥＵインデックス）に対応する位置でセリンからプロリンへの変異を含むＩｇＧ４アイソタイプ抗体である。この変異は、ヒンジ領域中の重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性を破壊することが報告されている（Ａｎｇａｌら上記；位置２４１はＫａｂａｔ番号制に基づく）。例えば、種々の態様において、本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、Ａｎｇａｌら上記に記載されている位置２４１に対応する位置でのセリンプロリンに変異されているヒトＩｇＧ４定常領域に連結した８Ｄ５（配列番号：９または１１）または４Ｃ７（配列番号：２３または２５）の重鎖可変領域を含むことができる。したがって、ヒトＩｇＧ４定常領域に連結した８Ｄ５および４Ｃ７の重鎖可変領域において、この変異はＥＵインデックスによるＳ２２８Ｐ変異に対応する。
１つの態様において、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を改変する、例えば、増加または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５においてさらに記載されている。例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするか、または抗体の安定性を増加または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を改変する。
別の態様において、抗体のＦｃヒンジ領域体を、抗体の生物学的半減期を減少させるために変異させる。さらに具体的に、抗体が天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して損傷したブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、１つ以上のアミノ酸変異をＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。このアプローチは、米国特許第６，１６５，７４５にさらに詳細に記載されている。
別の態様において、抗体を、その生物学的半減期を増加させるために修飾する。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５に記載されているように、１つ以上の以下の変異を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、米国特許第５，８６９，０４６および６，１２１，０２２号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変することができる。
さらに他の態様において、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するために少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を維持するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
別の例において、抗体がＣ１ｑ結合を改変し、そして／または補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を減少させるか、または破壊するように、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
別の例において、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基を改変し、それにより補体を固定する抗体の能力を改変する。このアプローチは、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１においてさらに記載されている。
さらに別の例において、Ｆｃ領域を、以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９で１つ以上のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）を介在する抗体の能力を増加させる、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるために修飾する。このアプローチは、ＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２においてさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位はマッピングされており、改良された結合を有する変異体は記載されている（Shieldsら (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特異的な変異は、ＦｃγＲＩＩＩへの結合を改良することが示されている。さらに、以下の組合せ変異体、Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａは、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改良することが示されている。
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化(aglycoslated)抗体を作製することができる（すなわち、該抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために、改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変することにより、達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それにより該部分でのグリコシル化を除去する１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０，８６１号参照。
さらに、またはあるいは、グリコシル化の改変された型を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化(hypofucosylated)抗体または増加した分岐ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を作製することができる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって成し遂げることができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、それにより改変されたグリコシル化を有する抗体を生産するために、宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系で発現される抗体がそれらの炭水化物中のフコースを欠いているように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるＦＵＴ８（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ）を欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９のＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを使用してＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子の標的破壊により作製された（米国特許公開第２００４０１１０７０４号およびYamane-Ohnukiら (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22参照）。別の例として、ＥＰ１，１７６，１９５は、細胞系がα−１，６結合関連酵素を減少させるか、または除去することにより低フコシル化を示すように、機能的に破壊された、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系を記載している。ＥＰ１，１７６，１９５は、また、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加するための低い酵素活性を有するか、または該酵素活性を有さない細胞系、例えば、ラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合させる低い能力を有し、宿主細胞において発現した抗体の低フコシル化をもたらす変異体ＣＨＯ細胞系であるＬｅｃ１３細胞を記載している（Shieldsら (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。修飾されたグリコシル化プロフィールを有する抗体もまた、ＰＣＴ公開ＷＯ０６／０８９２３１に記載されているニワトリの卵において生産することができる。あるいは、修飾されたグリコシル化プロフィールを有する抗体は、植物細胞、例えば、アオウキクサ(Lemna)において生産することができる（ＵＳ特許７，６３２，９８３）。植物系における抗体の生産のための方法は、米国特許６，９９８，２６７および７，３８８，０８１に記載されている。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、操作された細胞系において発現された抗体が分岐ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらすように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載している（Umanaら (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を使用して開裂させることができる、例えば、フコシダーゼであるα−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Tarentinoら (1975) Biochem. 14:5516-23）。
本発明に考慮される本明細書における抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるために、ペグ化することができる。抗体をペグ化するために、抗体またはその断片を、一般的に、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合するようになる条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水可溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本明細書において使用される「ポリエチレングリコール」なる用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの任意の形態、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールもしくはポリエチレングリコール−マレイミドを含むことを意図する。１つの態様において、ペグ化されている抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当分野で知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰ ０ １５４ ３１６およびＥＰ ０ ４０１ ３８４参照。
抗体の物理的特性
本明細書の抗体は、異なるクラスを検出および／または区別するために、それらの種々の物理的特性により特徴付けることができる。
本明細書の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増加または改変された抗原結合による抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Marshallら (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallickら (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekhら (1985) Nature 316:452-7; Mimuraら (2000) Mol Immunol 37:697-706）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにて起こることが知られている。場合によっては、可変領域のグリコシル化を含まない抗ＢＴＬＡ抗体を有することが好ましい。これは、可変領域においてグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、またはリコシル化領域内の残基を変異することのいずれかにより達成することができる。
好ましい態様において、本明細書の抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミドは、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で起こり得、ポリペプチド鎖へねじれを導入し、その安定性を減少させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基の創造をもたらす。
それぞれの抗体は、一般的に６から９．５のｐＨ範囲内である特有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体におけるｐＩは、一般的に７−９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体におけるｐＩは、一般的に６−８のｐＨ範囲内である。正常範囲外のｐＩを有する抗体がインビボ条件下でアンフォールディングおよび不安定性を有し得ることが推測されている。したがって、正常範囲内であるｐＩ値を含む抗ＢＴＬＡ抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有する抗体を選択すること、または荷電表面残基を変異させることのいずれかにより達成することができる。
それぞれの抗体は、インビボにおいてより良い総合安定性を示すより高い融解温度を有する特徴的な融解温度を有する（Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71）。一般的に、ＴＭ１（最初のアンフォールディングの温度）が６０℃以上、好ましくは６５℃以上、さらに好ましくは７０℃以上であることが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Chenら (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlandoら (1999) Immunol Lett 68:47-52）または円偏光二色性（Murrayら (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9）を使用して測定することができる。
好ましい態様において、抗体は、迅速に分解されないものが選択される。抗体の分解は、毛細管電気泳動法（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定することができる（Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32）。
別の好ましい態様において、抗体は、望ましくない免疫応答、および／または、改変されたもしくは不利な薬物動態学的特性を引き起こし得る凝集効果が最小であるものを選択される。一般的に、抗体は、２５％以下、好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１５％以下、よりさらに好ましくは１０％以下およびよりさらに好ましくは５％以下の凝集で許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含むいくつかの技術により測定することができる。
抗体複合体
本発明の抗ＢＴＬＡ抗体分子は、また、化学部分と複合体化され得る。該化学部分は、とりわけ、ポリマー、放射性核種または細胞毒性因子であり得る。好ましくは、該化学部分は、対象の体中の抗体分子の半減期を増加させるポリマーである。適当なポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ）、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を含むが、これらに限定されない。Leeら (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981)は、ＰＥＧ複合体化一本鎖抗体を記載している。Wenら (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553)は、放射性金属キレート剤（ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））と結合しているＰＥＧと複合体化している抗体を記載している。
本発明の抗体および抗体フラグメントは、また、標識、例えば、９９Ｔｃ，９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈおよび４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒおよび５６Ｆｅと複合体化され得る。
本発明の抗体および抗体フラグメントは、また、フルオロフォア、例えば、レアアースキレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族性アクリジニウム(acridinium)エステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識ならびに安定なフリーラジカルを含む蛍光または化学発光標識と複合体化され得る。
抗体分子は、また、細胞毒性因子、例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サリシン、シナアブラギリタンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ、ツルレイシインヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウインヒビター、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシン(phenomycin)およびネオマイシンに複合体化し得る。
Hunterら (1962) Nature 144:945; Davidら (1974) Biochemistry 13:1014; Painら (1981) J. Immunol. Meth. 40:219;およびNygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407により記載されている方法を含む、本発明の抗体分子を種々の部分と複合体化するために当分野で知られているあらゆる方法が、適用され得る。抗体を複合体化するための方法は、慣用であり、当分野で非常によく知られている。
さらに他の態様において、異なる定常ドメインが、本明細書において提供されるＣＤＲ由来のヒト化ＶＬおよびＶＨ領域に付加され得る。例えば、本発明の抗体（またはフラグメント）の特定の意図される使用が、改変されたエフェクター機能を求めるとき、ＩｇＧ１以外の重鎖定常ドメインが使用され得るか、またはハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４が利用され得る。
ＩｇＧ１抗体は、長い半減期およびエフェクター機能、例えば、補体活性化および抗体依存性細胞毒性を提供するが、このような活性は抗体の全ての使用に望ましくないかもしれない。このような場合において、例えば、ＩｇＧ４定常ドメインが使用され得る。ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５において、ＩｇＧ４定常ドメインは、適当な鎖内ジスルフィド結合形成を妨げ得るＣｙｓ１０６およびＣｙｓ１０９間（ＥＵ系における位置Ｃｙｓ２２６およびＣｙｓ２２９ならびにＫＡＢＡＴ系における位置Ｃｙｓ２３９およびＣｙｓ２４２に対応する）の可能性のある鎖間ジスルフィド結合を防止するために、天然Ｓｅｒ１０８がＰｒｏで置換されており、天然のヒトＩｇＧ４定常ドメイン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１８６１．１）と位置１０８（ＥＵ系における位置２２８およびＫＡＢＡＴ系における位置２４１に対応する）で異なる。Angalら (1993) Mol. Imunol. 30:105参照。
ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ１５Ｃ５、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７およびｈｕ Ｍａｂ ２０Ｈ４において、表７に記載されている配列はヒト重鎖ＩｇＧ１に基づく。
疾患
本発明は、また、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、好ましくは完全ヒト抗体での処置を必要とするヒト対象を含む対象を処置する方法を提供する。このような対象は、炎症性疾患または自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患）、炎症性線維症（例えば、強皮症、肺線維症および肝硬変症）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、骨関節症、骨粗鬆症、喘息（アレルギー性喘息を含む）、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、乾癬、ブドウ膜炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、若年性早期型Ｉ型糖尿病、移植拒絶反応、ＳＬＥおよびシェーグレン症候群を有し得る。処置のこのような方法は、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤、例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤を投与することをさらに含み得る。限定はしないが一例として、炎症性腸疾患は、本明細書に記載されている方法により処置される。特に好ましい態様において、クローン病および潰瘍性大腸炎は、本明細書に記載されている方法により処置される。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
ＩＢＤは、腸が炎症を起こし、腹部痙攣および疼痛、下痢、体重減少および腸内出血を引き起こす障害の１つのグループの名前（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）である。ＩＢＤは、６００，０００人を越えるアメリカ人に影響を及ぼす。慣用の処置選択は、スルファサラジン、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、免疫抑制剤、例えば、アザチオプリンおよびメルカプトプリンまたはクローン病に対する抗生物質（例えば、メトロニダゾール）を含む。治療的モノクローナル抗体処置は、エタネルセプト、ナタリズマブおよびインフリキシマブを含む。
本発明の抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、このような処置を必要とする対象におけるＩＢＤを処置するために使用され得る。本発明の抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、また、ＩＢＤに対する他の処置、例えば、ＩＬ−１０（米国特許第５，３６８，８５４、７，０５２，６８６号参照）、ステロイドおよびスルファサラジンと組み合わされ得る。
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、移植された骨髄中の機能的な免疫細胞が「外来」としてレシピエントを認識し、免疫学的攻撃を開始する同種異系の骨髄移植の一般的な合併症である。特定の環境下で血液輸血でも起こる。３つの基準が、一般的にＧＶＨＤと関連する：
１）生存可能であり、機能的な免疫細胞を有する免疫応答性移植片の投与；
２）該レシピエントは、免疫学的に異種−組織不適合性である；および
３）該レシピエントは、免疫欠陥を有し、したがって移植された細胞を破壊または不活性化できない。
骨髄移植後、移植片に存在するＴ細胞は、宿主組織を抗原的に外来として認識した後、移植レシピエントの組織を攻撃する。Ｔ細胞は、ＴＮＦアルファおよびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮｇ）を含む過剰なサイトカインを産生する。広範な宿主抗原、その中でヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、移植片対宿主病を起こし得る。しかしながら、移植片対宿主病は、ドナーがＨＬＡ一致同胞であるときでさえ、起こり得る。ＨＬＡ一致同胞またはＨＬＡ不適合ドナーは、しばしば、これらの抗原を外来として見て、免疫応答を開始するレシピエントのＴ細胞に対するＭＨＣ分子により示すことができる遺伝的に異なるタンパク質（すなわち、主要でない組織適合性抗原）を有する。
ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、レシピエントまたは宿主の組織に存在する同種異系の抗原（主要でない、および主要な組織適合性抗原を含むが、これらに限定されない）に反応する移植されたＴおよびＢ細胞の活性化、増殖およびエフェクター機能を阻害することが予期される。細胞表面上のＢＴＬＡの発現の理由で、これらの移植片由来のＴおよびＢ細胞の阻害が起こることが予期される。理論によりとらわれることなく、ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、「強制的な関与」により病原の免疫応答を阻害することが予期される。ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、例えば、他の阻害細胞、例えば、制御性Ｔ細胞の活性化を介して、または抗原−提示細胞の調節を介して、間接的に病原の免疫応答を阻害し得る。ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、単独で、または移植片対宿主病の症状を予防または処置するために使用される他の免疫抑制剤と組み合わせて、移植片由来のリンパ球による抗宿主応答を抑制または阻害することが予期される。
さらなる態様において、本発明は、また、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて治療有効量の抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む処置の方法に関する。限定はしないが一例として、１つ以上の該治療剤は、抗−ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＣＴＬＡ４融合タンパク質、および小分子抗炎症剤、例えば、ミコフェノール酸モフェチルメトトレキサート（例えば、Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat. Rev. Immunol. 6(4):329-333参照）または組合せを含む。種々の態様において、１つ以上の他の治療剤は、抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントの前に、同時に、または後に投与される。
さらに、１つの態様において、抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上の以下のものの任意の組合せを含む移植拒絶反応を処置するために使用される免疫抑制剤と組み合わせて投与することができる：
カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）、
ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムスおよびエバロリムス）、
抗増殖性（例えば、アザチオプリンおよびミコフェノール酸）、
コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロンおよびヒドロコルチゾン）、
免疫抑制作用を有する抗体（例えば、バシリキシマブおよびダクリズマブを含むモノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体）、
およびポリクローナル抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）および抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ））。
本発明は、また、結合化合物および薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに所望により１つ以上の免疫抑制剤または抗炎症剤を含む、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの組成物および製剤に関する。
実験的および診断的使用
本発明の抗体およびフラグメントは、アフィニティー精製剤として使用され得る。このプロセスにおいて、該抗体またはフラグメントは、当分野でよく知られている方法を使用して、固相、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂またはろ紙上に固定される。該固定化された抗体またはフラグメントを、ＢＴＬＡタンパク質（またはそのフラグメント）を含むサンプルと接触させ、精製し、その後、支持体を固定化された抗体またはフラグメントに結合しているＢＴＬＡタンパク質以外のサンプル中の物質を実質的に全て除去するために適当な溶媒で洗浄する。最後に、支持体を、結合したＢＴＬＡをカラム（例えば、タンパク質Ａ）から溶離する溶媒で洗浄する。このような固定化された抗体は、本発明の一部を構成する。
本発明は、また、例えば、ウェスタンブロットおよび本明細書において記載されている他の免疫測定法を実施するために、有用である二次抗体を生産するための抗原を提供する。具体的には、本発明は、抗ＢＴＬＡまたは抗ＢＴＬＡ二次抗体を生産するために使用され得る可変領域および／またはＣＤＲ配列を含むポリペプチドを含む。検出可能に標識された抗−ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７または抗−Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７二次抗体は、本発明の範囲内である。
抗ＢＴＬＡ抗体またはそれらのフラグメントは、また、ＢＴＬＡタンパク質に対する、例えば、特定の細胞、組織または血清中のその発現を検出するための診断アッセイにおいて有用であり得る。このような診断方法は、種々の疾患診断において有用であり得る。
例えば、本発明の態様は、本発明の抗ＢＴＬＡ抗体またはそのフラグメントの使用を含むＥＬＩＳＡアッセイ（酵素免疫吸着法）を含む。例えば、本発明の態様において、このような方法は、以下の工程を含む：
（ａ）抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントで基質（例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えば、プラスチックプレートの表面）をコートする；
（ｂ）ＢＴＬＡの存在に関して試験されるサンプルを該基質に加える；
（ｃ）サンプル中の結合していない物質を除去するようにプレートを洗浄する；
（ｄ）ＢＴＬＡ抗原に特異的である検出可能に標識された抗体（例えば、酵素結合抗体）を加える；
（ｅ）結合していない標識された抗体を除去するように基質を洗浄する；
（ｆ）標識された抗体が酵素結合抗体である場合、該酵素により蛍光シグナルに変換される化学物質を加える；および
（ｇ）標識された抗体の存在を検出する。
本発明の態様において、標識された抗体は、ＡＢＴＳ（例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応し、検出可能である色の変化を生じるペルオキシダーゼで標識されている。あるいは、標識された抗体は、キラキラ光る存在においてシンチレーションカウンターにより検出することができる検出可能な放射性同位体（例えば、３Ｈ）で標識されている。本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、ウェスタンブロットまたは免疫タンパク質ブロット法において使用され得る。このような方法は、本発明の一部を構成し、例えば以下を含む：
（１）結合したＢＴＬＡまたはそのフラグメントの存在に関して試験される膜または他の固体基質を本発明の抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる。このような膜は、非変性のＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルにおいてＢＴＬＡの存在に関して試験されるタンパク質が移される（例えば、ゲルにおける電気泳動分離後）、ニトロセルロースまたはビニルベースの（例えば、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ））膜の形態をとり得る。膜と該抗ＢＴＬＡ抗体またはフラグメントとの接触前に、該膜を、膜上の非特異的なタンパク質結合部位に結合するように、例えば、脱脂粉乳などで、所望により遮断する。
（２）１回以上、膜を洗浄し、結合していない抗ＢＴＬＡ抗体またはフラグメントおよび他の結合していない物質を除去する；および
（３）結合した抗ＢＴＬＡ抗体またはフラグメントを検出する。
結合した抗体またはフラグメントの検出は、抗体またはフラグメントを検出可能に標識された二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）と結合させ、次に、二次抗体の存在を検出することにより行われ得る。
本発明の抗ＢＴＬＡ抗体およびそれらの抗原結合フラグメントは、また、免疫組織化学のために使用され得る。このような方法は、本発明の一部を構成し、例えば、（１）ＢＴＬＡの存在に関して試験される細胞を本発明の抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させ；（２）細胞上または細胞内の該抗体またはフラグメントを検出することを含む。
該抗体またはフラグメントそれ自体が検出可能に標識されているとき、それは直接検出することができる。あるいは、該抗体またはフラグメントは、検出可能に標識された検出される二次抗体により結合されていてもよい。
本発明のある抗ＢＴＬＡアンタゴニスト抗体およびそれらの抗原結合フラグメントは、また、インビボ腫瘍イメージングのために使用され得る。このような方法は、本発明の一部を構成し、ＢＴＬＡ発現と関連する腫瘍の存在に関して試験される患者の体への本発明の放射性標識された抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントの注射、次に、例えば、腫瘍に結合する高い濃度の抗体またはフラグメントを含む遺伝子座で、標識された抗体またはフラグメントの存在を検出するための患者の体の核イメージングを含み得る。
イメージング技術は、ＳＰＥＣＴイメージング（シングルフォトン核医学断層撮影法）またはＰＥＴイメージング（ポジトロン放出断層撮影）を含む。標識は、例えば、ＳＰＥＣＴイメージングと共に、例えば、ヨウ素−１２３（１２３Ｉ）およびテクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、または、例えば、ＰＥＴイメージングまたはインジウム−１１１と共に、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏまたは１８Ｆを含む（例えば、Gordonら(2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440参照）。
キット
本発明は、また、キット形態において本発明の組合せの成分を含むキットを提供する。本発明のキットは、ＢＴＬＡに特異的に結合する本明細書に記載されている結合組成物（例えば、アゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６またはｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７、またはアンタゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７）を含むがこれらに限定されない１つ以上の成分を、本明細書に記載されている薬学的に許容される担体および／または化学療法剤を含むがこれらに限定されない１つ以上のさらなる成分と共に含む。結合組成物および／または化学療法剤は、医薬組成物中で、純粋な組成物として、または薬学的に許容される担体と組み合わせて製剤化することができる。
１つの態様において、キットは、１つの容器中（例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル中）に、本発明の結合組成物（例えば、アゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６またはｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７、またはアンタゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７）またはその医薬組成物、ならびに、別の容器（例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル中）に、その医薬組成物および／または化学療法剤を含む。
本発明の別の態様において、該キットは、結合組成物成分（例えば、アゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６またはｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７、またはアンタゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７）を薬学的に許容される担体と共に含み、所望により、単一の一般的な容器中で医薬組成物中で、所望により、一緒に製剤化される１つ以上の化学療法成分と組み合わせられた本発明の組合せを含む。
該キットが対象への非経口投与のための医薬組成物を含むとき、該キットは、このような投与を行うためのデバイスを含むことができる。例えば、該キットは、１つ以上の皮下注射器または上記されている他の注射デバイスを含むことができる。
該キットは、キットにおける医薬組成物および投与形態に関する情報を含むパッケージに挿入されたものを含み得る。一般的に、このような情報は、含まれている医薬組成物および投与形態の有効かつ安全な使用において患者および医師を助ける。例えば、本発明の組合せに関する以下の情報は、挿入されたものにおいて、薬物動態学、薬物動力学、臨床試験、有効性パラメーター、適用および使用方法、禁忌、警告、予防措置、有害応答、過剰摂取、適当な用量および投与、提供の方法、適当な保存条件、参考、製造業者／販売業者情報および特許情報を提供し得る。
医薬組成物および投与
本発明の抗ｈｕＢＴＬＡ抗体の医薬または無菌組成物を製造するために、抗体は、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: NationalFormulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)参照。
治療および診断薬の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液または懸濁液の形態における許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより製造され得る（例えば、Hardmanら (2001) Goodman and Gilman's The Pharacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Liebermanら(eds.) (1990) Pharmaceutical Pharmaceutical Dosage Forms: Tablet, Marcel Dekker, NY; Liebermanら (eds.) (1990) Pharmaceutical Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxixity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY参照）。１つの態様において、本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５−６中で適当な濃度に希釈され、ＮａＣｌまたはスクロースが緊張力(tonicity)のために加えられる。さらなる薬剤、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０が、安定性を増強するために加えられ得る。
単独でまたは別の薬剤と組み合わせて投与される抗体組成物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において有効な治療用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準医薬的手順により決定することができる。毒性と治療効果間の用量比は、治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。高い治療指数を示す抗体が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量の範囲の製剤化において使用することができる。このような化合物の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用される投与形態および投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。
投与経路は変化し得る。適当な投与経路は、経口、経直腸、経粘膜または腸投与；非経口投与、例えば、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射を含む。投与は、種々の慣用の方法、例えば、経口吸入、吸入、吸入、局所適用または皮膚、経皮、皮下、腹腔内、非経口、動脈内または静脈内注射で実施することができる。患者への静脈内投与が好ましい。
あるいは、例えば、免疫病理学的により特徴付けられる関節炎の関節または病原体誘導障害に直接的に抗体の注射を介する全身的様式よりむしろ局所的において、しばしばデポーまたは持続放出製剤において抗体を投与され得る。さらに、標的薬物送達系、例えば、免疫病理学的により特徴付けられる関節炎の関節または病原体誘導障害を標的とする、例えば、組織特異的抗体で被覆されたリポソームにおいて抗体を投与され得る。リポソームは罹患組織を標的とし、罹患組織により選択的に取り入れられる。
投与レジメンは、治療抗体の血清または組織回転率、症状のレベル、治療抗体の免疫原性および生物学的マトリックスにおける標的細胞の接近性を含むいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、標的疾患状態における改善をもたらすために十分な治療抗体を送達するが、同時に望ましくない副作用を最小限にする。したがって、送達される生物学的製剤の量は、特定の治療抗体および処置される状態の重症度に部分的に依存する。治療抗体の適当な用量の選択における案内を利用できる（例えば、Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baertら (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgromら (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamonら (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitzら (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghoshら (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipskyら (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602参照）。
適当な用量の決定は、例えば、処置に影響することが当該分野で知られているか、または疑われているパラメーターまたは因子を使用して、臨床医により行われる。一般的に、用量は、やや最適用量未満の量で開始し、その後、所望または最適の効果が何らかの負の副作用と比較して達成されるまで少しずつ増加させる。重要な診断測定は、例えば、炎症の症状または生産される炎症性サイトカインのレベルの測定を含む。好ましくは、使用される生物学的製剤は、処置に標的とされる動物と同じ種に由来し、それにより薬物に対する炎症性、自己免疫性または増殖性応答を最小限にする。ヒト対象の場合、例えば、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体が好ましい。
抗体、抗体フラグメントおよびサイトカインは、連続的な注入により、または、例えば、１日毎、１週間に１−７回、１週間毎、２週間毎、毎月毎、隔月毎などに投与される用量により提供することができる。投与は、静脈内に、皮下的に、局所的に、経口的に、経鼻的に、経直腸的に、筋肉内に、脳内に、髄腔内に、または吸入により提供され得る。１週間の全用量は、一般的に少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、さらに一般的に少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である（例えば、Yangら (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Heroldら (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liuら (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portieljiら (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144参照）。用量は、また、対象の血清中の抗ＢＴＬＡ抗体の所定の標的濃度、例えば、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれ以上を達成するために提供され得る。他の態様において、本発明の完全ヒトＢＴＬＡ抗体は、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／対象で１週間毎、２週間毎または「４週間毎」基準で皮下的にまたは静脈内に投与される。
本明細書において使用される「阻害する」または「処置する」または「処置」は、障害と関連する症状の発症の遅延および／または、このような障害の症状の重症度の減少を含む。該用語は、コントロールされていないまたは望ましくない症状の存在を改善すること、さらなる症状を予防すること、およびこのような症状の根本的な原因を改善または予防することをさらに含む。したがって、該用語は、有益な結果が、障害、疾患または症状を有するか、またはこのような障害、疾患または症状を発症する可能性のある脊椎動物対象に与えられることを示す。
本明細書において使用される「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」なる用語は、単独でまたはさらなる治療剤と組み合わせて細胞、組織または対象に投与されたとき、疾患もしくは状態の１つ以上の症状またはこのような疾患もしくは状態の進行を予防または改善するために有効である本発明のＢＴＬＡ結合化合物の量を示す。治療有効用量は、症状の改善、例えば、関連医学的状態の処置、治癒、予防もしくは改善、またはこのような状態の処置、治癒、予防もしくは改善の速度における増加をもたらすために十分な結合化合物の量をさらに示す。単独で投与される個々の活性成分に適用されるとき、治療有効用量は、成分単独の量を示す。組み合わせて適用されるとき、治療有効用量は、組み合わせて、連続的に、または同時であろうと、投与される治療効果をもたらす活性成分の組み合わせた量を示す。治療剤の有効量は、少なくとも１０％；通常、少なくとも２０％；好ましくは少なくとも約３０％；さらに好ましくは少なくとも４０％、およびより好ましくは少なくとも５０％の診断測定またはパラメーターの改善をもたらす。
第２の治療剤、例えば、サイトカイン、別の治療抗体、ステロイド、化学療法剤または抗生物質との共投与のための方法は当分野でよく知られている、例えば、Hardmanら (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA参照。本発明の医薬組成物は、また、免疫抑制または免疫調節剤を含み得る。抗炎症剤、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス（すなわち、ＦＫ−５０６）、シロリムス、インターフェロン、可溶性サイトカイン受容体（例えば、ｓＴＮＲＦおよびｓＩＬ−１Ｒ）、サイトカイン活性を中和する薬剤（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト）、ミコフェノール酸モフェチル、１５−デオキシスパーガリン、サリドマイド、グラチラマー、アザチオプリン、レフルノミド、シクロホスファミド、メトトレキサートなどを含むが、これらに限定されないあらゆる適当な免疫抑制剤を使用することができる。医薬組成物は、また、他の治療方法、例えば、光線療法および放射線療法と共に使用することができる。
本発明のＢＴＬＡ結合化合物は、また、他のサイトカインの１つ以上のアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗体）（ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４／Ｉｇ融合物およびＴＧＦ−βを含むがこれらに限定されない）と組み合わせて使用することができる。例えば、Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat. Rev. Immunol. 6(4):329-333参照。種々の態様において、本発明のＢＴＬＡ結合化合物は、別のアゴニストまたはアンタゴニストの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に投与される。１つの態様において、本発明のＢＴＬＡ結合化合物は、有害な免疫応答（例えば、ＭＳ、クローン病、若年性早期型Ｉ型糖尿病）の初期急性期の処置において、単独で、またはＩＬ−２３アンタゴニストと組み合わせて使用される。後者の場合、該ＢＴＬＡ結合化合物を徐々に減少させてもよく、ＩＬ−２３のアンタゴニストでの処置単独を有害な応答の抑制を維持するために続ける。あるいは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６および／またはＴＧＦ−βに対するアンタゴニストは、本発明のＢＴＬＡ結合化合物と同時に、前にまたは後に投与され得る。Cua and Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato and O'Shea (2006) Nature 441:166-168; Iwakura and Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222参照。
典型的な獣医、実験または研究対象は、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ウマおよびヒトを含む。
使用
本発明は、炎症性疾患および状態、ならびに自己免疫疾患および増殖性疾患の処置および診断のために、操作された抗ＢＴＬＡ抗体を使用するための方法を提供する。方法は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、乾癬、全身性強皮症、ＧＶＨＤ、同種移植片拒絶反応、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、若年性早期型Ｉ型糖尿病 自己免疫性心筋炎および腹膜癒着（例えば、Chungら (2002) J. Exp. Med. 195:1471-78参照）の診断、予防または処置のために提供される。
１つの態様において、ヒトＢＴＬＡに特異的に結合する本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ＢＴＬＡ活性に関与する免疫応答を増加、増強、刺激または上方調節するために使用することができる。１つの態様において、ＢＴＬＡのＨＶＥＭへの結合を遮断しない本発明の抗体（例えば、アゴニスト抗体 Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕＭａｂ８Ａ３）は、長期ＢＴＬＡ活性の必要性のある対象においてＢＴＬＡを安定にさせるために治療的に使用される。抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体（例えば、Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕＭａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６およびｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７）は、ＢＴＬＡの阻害性受容体機能を活性化する。このような処置から利益を得る対象は、炎症性疾患または自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患）、炎症性線維症（例えば、強皮症、肺線維症および肝硬変症）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、骨関節症、骨粗鬆症、喘息（アレルギー性喘息を含む）、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、乾癬、ブドウ膜炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、若年性早期型Ｉ型糖尿病、移植拒絶反応、ＳＬＥおよびシェーグレン症候群を有する患者を含む。処置のこのような方法は、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤、例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤を投与することををさらに含み得る。
リウマチ性関節炎（ＲＡ）
ＲＡは、世界の人口の約０．５％に影響する滑膜関節炎により特徴付けられる進行性の全身性疾患である。Emery (2006) BMJ 332:152-155参照。関節炎は、変形、疼痛、凝りおよび腫れを引き起こし得、最終的に関節の不可逆性の悪化を引き起こし得る。影響される関節は、膝、肘、首ならびに手および足の関節を含む。慣用の処置は、症状を緩和するためのＮＳＡＩＤの使用、次に、疾患を調節する抗リウマチ性薬（ＤＭＡＲＤ）、例えば、金、ペニシラミン、スルファサラジンおよびメトトレキサートの投与を含む。最近の進歩は、モノクローナル抗体、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブおよびゴリムマブを含む、ならびに受容体融合タンパク質、例えば、エタネルセプトを含むＴＮＦ−β阻害剤での処置を含む。これらのＴＮＦ−β阻害剤での処置は、疾患由来の構造的な損傷を劇的に減少させる
本発明の抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、このような処置を必要とする対象におけるＲＡを処置するために使用され得る。本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、また、ＲＡに対する他の処置、例えば、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ＮＳＡＩＤまたはＴＮＦ−β阻害剤（抗体または受容体フラグメント）と組み合わされ得る。
１つの態様において、本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、ＤＭＡＲＤ単独での処置に以前に十分に応答しなかったヒト対象を処置するために使用される。別の態様において、本発明の抗ＢＴＬＡ抗体での処置は、ＤＭＡＲＤ治療の失敗を必要とせずに、疾患の過程において早期に始められる。このような早期介入は、例えば、抗体治療の安全性がしっかりと確立されると、適当であり得る。
臨床的改善は、実施例１８により詳細に記載されているＡＣＲスコアを決定するために測定される。種々の態様において、２０、５０および７０のＡＣＲスコアは所望の終点であり、これらの終点は、処置の過程の任意の適当な地点、例えば、５、１０、１５、２４、４０、５０またはそれ以上の週で評価され得る。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
ＩＢＤは、腸が炎症を起こし、腹部痙攣および疼痛、下痢、体重減少および腸内出血を引き起こす障害の１つのグループの名前（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）である。ＩＢＤは、６００，０００人を越えるアメリカ人に影響を及ぼす。慣用の処置選択は、スルファサラジン、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、免疫抑制剤、例えば、アザチオプリンおよびメルカプトプリンまたはクローン病に対する抗生物質（例えば、メトロニダゾール）を含む。治療的モノクローナル抗体処置は、エタネルセプト、ナタリズマブおよびインフリキシマブを含む。
本発明の抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、このような処置を必要とする対象におけるＩＢＤを処置するために使用され得る。本発明の抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、また、ＩＢＤに対する他の処置、例えば、ＩＬ−１０（米国特許第５，３６８，８５４、７，０５２，６８６号参照）、ステロイドおよびスルファサラジンと組み合わされ得る。
乾癬
皮膚は、有害な可能性のある抗原との接触を防止する内部環境と環境間の重要な境界として働く。抗原／病原体浸透の場合、炎症応答は、抗原を除去するために誘導される。この応答は、主にＴ細胞、多形核細胞およびマクロファージからなる真皮内浸潤を引き起こす（例えば、Williams and Kupper (1996) Life Sci., 58:1485-1507参照）。通常、病原体により引き起こされるこの炎症応答は、厳格な制御下にあり、病原体の除去後に停止する。
ある場合において、この炎症応答は、皮膚炎症を引き起こす外部刺激なしで、適当な制御なしで起こる。本発明は、皮膚炎症を処置および診断するための方法を提供する。皮膚炎症、上記細胞浸潤の結果、ならびに、これらの細胞から分泌されたサイトカインの結果は、いくつかの炎症性疾患、例えば、瘢痕性類天疱瘡、強皮症、汗腺膿瘍、中毒性表皮剥離症、アクネ、骨炎、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、壊疽性膿皮症およびベーチェット症候群（例えば、Williams and Griffiths (2002) Clin. Exp. Dermatol., 27:585-590参照）を含む。皮膚炎症の最も一般的な型は乾癬である。
乾癬は、炎症性浸潤と一緒にケラチン生成細胞のＴ細胞介在過剰増殖により特徴付けられる。該疾患は、慢性プラーク病変、皮膚発疹および膿疱性の病変を含む特定の異なる重複する臨床的表現型を有する（例えば、Gudjonssonら (2004) Clin Exp. Immunol. 135:1-8参照）。乾癬患者の約１０％は関節炎を発症する。該疾患は、一卵性双生児において６０％の一致で、強い複雑な遺伝的素因を有する。
典型的な乾癬病変は、厚い銀色の鱗屑により覆われた明確に定義された紅斑である。乾癬組織の炎症および過剰増殖は、正常な皮膚と異なる組織学的、抗原的、およびサイトカインプロフィールと関連する。乾癬と関連するサイトカインは、ＴＮＦβ、ＩＬ−１９、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２３である（Gudjonssonら上記、参照）。
本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、また、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、乾癬再発の予防、処置、診断および予測において使用され得る。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
エリテマトーデスは結合組織疾患である。狼瘡は、体の免疫系がそれ自身の組織および臓器を攻撃するときに起こる慢性炎症性疾患である。狼瘡によって引き起こされる炎症は、関節、皮膚、腎臓、血球、心臓および肺を含む多数の異なる体組織に影響し得る。狼瘡は、男性よりも女性においてより頻繁に起こるが、この理由は分かっていない。全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、薬物誘発エリテマトーデスおよび新生児ループスの４つの型の狼瘡が存在する。もちろん、全身性エリテマトーデスは、最も一般的であり、重篤な型の狼瘡である。１つの態様において、本発明の抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、このような処置を必要とする対象における狼瘡を処置するために使用され得る。該抗ＢＴＬＡ抗体は、ＮＳＡＩＤ、特定の抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキンおよびコルチコステロイド、免疫抑制剤（例えば、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）およびアザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）、およびミコフェノール酸モフェチル（ＣｅｌｌＣｅｐｔ））、リツキシマブ、ならびにデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を含む狼瘡に対する他の処置と組み合わされ得る。
シェーグレン症候群は、ドライアイおよびドライマウスを引き起こす別の慢性疾患である。１つの態様において、本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、シェーグレン症候群を有する個体を処置するために有用であり得る。本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、また、狼瘡に対して規定されている傾向と共にシェーグレン症候群に対する他の処置と組み合わされ得る。
多発性硬化症（ＭＳ）
ＭＳは、神経線維由来のミエリンの喪失に関与し、プラークまたは病変を引き起こす中枢神経系（ＣＮＳ）の自己免疫性疾患と考えられている。最も一般的な型は、明確に定義された対症的再発が起こり、次に部分的または完全寛解の期間である再発／緩和するＭＳである。慣用の処置選択は、インターフェロン−β−１ａおよび１ｂ、ミトキサントロン、テトラペプチドグラチラマーアセテート、治療的アルファ−４−インテグリン−特異的抗体（ナタリズマブ）、またはアルファ−４−インテグリンの小分子アンタゴニスト（例えば、ＷＯ２００３／０８４９８４に記載されているもの）を含む。
１つの態様において、本発明の抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、このような処置を必要とする対象におけるＭＳを処置するために使用され得る。該抗ＢＴＬＡ抗体は、また、ＭＳに対する他の処置、例えば、インターフェロン−β、インターフェロン−β、ステロイドまたはアルファ−４−インテグリン−特異的抗体と組み合わされ得る。
癌
本発明のアンタゴニスト抗体または抗原結合フラグメント（ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７により例示される）は、癌を処置するために（すなわち、腫瘍細胞の増殖または生存を阻害するために）使用することができる。増殖が本発明のアンタゴニスト抗体を使用して阻害され得る好ましい癌は、一般的に免疫療法に対して応答する癌を含むが、今まで免疫療法と関連していなかった癌も含む。処置に対して好ましい癌の非限定的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌（例えば、非小細胞性肺癌）、食道癌、頭頸部の扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、グリア芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および他の新生悪性腫瘍を含む。さらに、本発明は、増殖が本発明の抗体を使用して阻害され得る難治性または再発性悪性腫瘍を含む。
本発明のアンタゴニスト抗体または抗体フラグメントは、単独で、または他の抗腫瘍薬または免疫原（例えば、弱毒化した癌性細胞、腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、抗原提示細胞、例えば、腫瘍由来抗原または核酸でパルスされた樹状細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ）、ならびに免疫刺激サイトカイン、例えば、限定はしないがＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞）；標準的な癌処置（例えば、化学療法、放射線治療または外科的処置）；または他の抗体（ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−ＩＢＢ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、および負の調節経路における他の分子に対する抗体を含むが、これらに限定されない）と組み合わせて使用することができる。
感染症
本発明のアンタゴニスト抗体または抗原結合フラグメント（ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７により例示される）は、また、感染症および感染病を予防または処置するために使用することができる。該抗体または抗体フラグメントは、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために、単独で、またはワクチンと組み合わせて使用することができる。該抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、ヒトに対するウイルス、例えば、限定はしないが、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルスに対する感染に対する免疫応答を刺激するために使用することができる。該抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、細菌または真菌寄生生物、および他の病原体での感染に対する免疫応答を刺激するために使用することができる。
ワクチンアジュバント
本発明のアンタゴニスト抗体または抗原結合フラグメント（ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７により例示される）は、これらのタンパク質に対する免疫応答を増加させるために（すなわち、ワクチンプロトコールにおいて）、他の組換えタンパク質および／またはペプチド（例えば、腫瘍抗原または癌細胞）と共に使用することができる。
例えば、１つの態様において、抗ＢＴＬＡアンタゴニスト抗体およびそれらの抗体フラグメントは、抗ＢＴＬＡ抗体と興味ある抗原（例えば、ワクチン）の共投与により抗原特異的免疫応答を刺激するために使用され得る。したがって、別の局面において、本発明は、（ｉ）該抗原；および（ｉｉ）該対象における該抗原に対する免疫応答を増強させるような本発明の抗ＢＴＬＡ抗体またはその抗原結合フラグメントを該対象に投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。該抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原であり得る。このような抗原の非限定的な例は、腫瘍抗原、またはウイルス、細菌もしくは他の病原体由来の抗原を含むが、これらに限定されない。
Ｔｈ２介在疾患
１つの態様において、本発明の抗ＢＴＬＡアンタゴニスト抗体および抗体フラグメント（ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７により例示される）は、また、Ｔｈ２介在疾患、例えば、喘息およびアレルギーを処置するために使用することができる。これは、本発明の抗体がＴｈ１応答を誘導する手助けをすることができるという発見に基づく。したがって、本発明の抗体は、さらに均衡のとれた免疫応答を生産するためにＴｈ２介在疾患において使用することができる。
Ｔ細胞のエキソビボ活性化
１つの態様において、本発明の抗体および抗原フラグメント（ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７により例示される）は、また、腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を増加させるために、抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および拡大ならびにこれらの細胞のレシピエントへの適合移植のために使用することができる。これらの方法は、また、感染因子、例えば、ＣＭＶに対するＴ細胞応答を活性化するために使用され得る。抗ＢＴＬＡ抗体の存在下でのエキソビボ活性化は、適合移植Ｔ細胞の頻度および活性を増加させることが予期され得る。
他の組合せ治療
以前に記載されているとおり、本発明の抗ＢＴＬＡ抗体は、１つ以上の他の治療剤、例えば、細胞毒性剤、放射性毒物または免疫抑制剤と共投与することができる。該抗体は、該薬剤に連結することができ（免疫複合体として）、または該薬剤と別々に投与することができる。後者の場合（別々の投与）、該抗体は、該薬剤の前、後もしくは同時に投与することができ、または他の既知の治療と共投与することができる。
本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、また、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増加させるために使用することができる。
本発明の修飾および変化は、当業者に明らかであるため、その精神および範囲から逸脱することなく、行うことが可能である。本発明は、特許請求の範囲およびかかる特許請求の範囲の均等物の全範囲により定義される。以下の実施例を含む本明細書に記載されている特定の態様は、一例としてのみ提供し、これらの詳細により本発明の範囲を限定しない。
一般的な方法
分子生物学における標準方法は記載されている（Maniatisら (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA）。標準方法は、また、cloning in bacterial cells and DNA mutagenesis (Vol. 1)、cloning in mammalian cells and yeast (Vol. 2)、glycoconjugates and protein expression (Vol. 3)およびbioinformatics (Vol. 4)を記載しているAusbelら (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NYに記載されている。
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動法、遠心分離および結晶化を含むタンパク質精製のための方法は記載されている（Coliganら (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生産、タンパク質のグリコシル化は記載されている（例えば、Coliganら (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubelら (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391参照）。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生産、精製およびフラグメント化は記載されている（Coliganら (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane、上記）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けするための標準技術は利用可能である（例えば、Coliganら (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York参照）。
モノクローナル、ポリクローナルおよびヒト化抗体を製造することができる（例えば、Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenterら (2000) J. Immunol. 165:6205; Heら (1998) J. Immunol. 160:1029; Tangら (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Bacaら (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothiaら (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499;米国特許第６，３２９，５１１号参照）。
ヒト化のための別法は、ファージ上に提示されたヒト抗体ライブラリーまたはトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体ライブラリーを使用することである（Vaughanら (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendezら (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbasら (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kayら (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruinら (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399）。
一本鎖抗体およびダイアボディは記載されている（例えば、Maleckiら (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrathら (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyterら (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson and Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189；および米国特許第４，９４６，７７８号参照）。二機能性抗体は提供される（例えば、Mackら (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkelら (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segalら (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennanら (1985) Science 229:81-83; Rasoら (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Trauneckerら (1991) EMBO J. 10:3655-3659；および米国特許第５，９３２，４４８、５，５３２，２１０および６，１２９，９１４号参照）。
二重特異性抗体が、また、提供される（例えば、Azzoniら (1998) J. Immunol. 161:3493; Kitaら (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchantら (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandeyら (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zhengら (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propstら (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875参照）。
抗原の精製は、抗体の生産のために必要ではない。動物は、興味ある抗原を有する細胞で免疫化することができる。次に、脾細胞は、免疫化された動物から単離でき、該脾細胞はハイブリドーマを生産するための骨髄腫細胞系と融合することができる（例えば、Meyaardら (1997) Immunity 7:283-290; Wrightら (2000) Immunity 13:233-242; Prestonら 上記; Kaithamanaら (1999) J. Immunol. 163:5157-5164参照）。
抗体は、例えば、小分子薬物、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体化させることができる。抗体は、治療、診断、キットまたは他の目的のために有用であり、例えば、色素、放射性同位体、酵素または金属、例えば、コロイド金と共役される抗体を含む（例えば、Le Doussalら (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibelliniら (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Evertsら (2002) J. Immunol. 168:883-889参照）。
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法は利用可能である（例えば、Owensら (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ参照）。例えば、診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、ポリペプチドおよび抗体を修飾するために適当な蛍光試薬は利用可能である（Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO）。
免疫系の組織学の標準方法は記載されている（例えば、Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiattら (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louisら (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY参照）。
例えば、抗原フラグメント、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能性ドメイン、グリコシル化部位および配列アラインメントを決定するための、ソフトウェアパッケージおよびデータベースは利用可能である（例えば、GenBank, Vector NTI (登録商標) Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher (登録商標) (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menneら (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menneら (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wrenら (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690参照）。
実施例１
完全ヒトＢＴＬＡ抗体
ヒトＢＴＬＡに特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を、マウスをＭＰＬ（登録商標）＋ＴＤＭアジュバント中で膜結合ｈｕＢＴＬＡおよびｈｕＢＴＬＡ−Ｆｃ融合タンパク質を過剰発現するＣＨＯ細胞の組合せで免疫化することによるＭｅｄａｒｅｘ、Ｉｎｃ．のＵｌｔｉＭＡｂ抗体産生プラットホームを使用して産生した。マウスをＢＴＬＡ−Ｆｃ融合タンパク質または成熟細胞外ドメイン（配列番号：３５の残基３１−１５２）を発現する膜結合ＢＴＬＡを発現する細胞で免疫化した。この配列は、ＮＰ＿８６１４４５（配列番号：３７）と比較して位置２６７（（Ｐｒｏ２６７Ｌｅｕ、配列番号：３６によってコードされる配列番号：３５）で細胞内ドメインにおいて１つのアミノ酸の違いを有する、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿８６１４４５配列（ヒトＢＴＬＡ転写産物１変異体（ＮＰ＿８６１４４５）とマッチする）で記載されている転写産物１変異体の細胞外ドメインと対応する。複数回の免疫化および血清力価測定後、選択されたマウスを融合のために選択した。一方の融合物は４９個の抗ＢＴＬＡ Ｍａｂを生産し、これらの多数はＩｇＧ４アイソタイプであった。もう一方の融合物は１５４個のＭＡｂを生産し、これらの多数はＭａｂ８Ｄ５を含むＩｇＧ１アイソタイプであった。
ヒトガンマ／カッパスクリーニング後、抗ＢＴＬＡ Ｍａｂを、最初に、ＥＬＩＳＡによるＢＴＬＡ−Ｉｇへの結合、ＣＨＯ陽性Ｍａｂを除去するためにＣＨＯ／ｈｕＢＴＬＡおよびＣＨＯ親細胞におけるＦＡＣＳ／ＦＭＡＴスクリーニング、およびＣＨＯ細胞へのＢＴＬＡ ＣＨＯ細胞へのＨＶＥＭ結合を遮断するこれらの能力に基づいて特徴付けおよび選択した。相対的親和性測定をＢＩＡＣｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を使用して行った。ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、ヒトおよびカニクイザルＢＴＬＡの両方と等しく結合するが、活性の遮断は有さない。Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、また、本明細書に記載されているＢおよびＴ細胞の機能アッセイにおいてアゴニスト活性を証明した。
Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、約２ｎＭの親和性（ＢＩＡｃｏｒｅ）でヒトＢＴＬＡに結合するＩｇＧ４／カッパ アイソタイプ（安定化２２８プロリン変異を含む）の完全ヒトモノクローナル抗体である。Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５抗体は、ＨＶＥＭ結合を遮断せず、妨げない。３つのさらなる抗体、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７は同様であるが、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５と同一の機能特性ではない。ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３は、また、ＨＶＥＭ結合を妨げない非遮断アゴニスト抗体であるが、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６およびｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７は、ＢＴＬＡとＨＶＥＭの結合を遮断もするアゴニストである。
抗ＢＴＬＡ抗体アイソタイプ選択
ＩｇＧ４アイソタイプの抗体は、補体Ｃ１ｑにあまり結合せず、したがって補体を有意に活性化しない。ＩｇＧ４抗体は、また、非効率的な、または非存在の抗体依存性細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）によって、Ｆｃγ受容体に弱く結合する（Presta, 2002に記載）。最初に選択された８Ｄ５ ＩｇＧ１ Ｍａｂを安定化Ａｄａｉｒ Ｓ２２８Ｐ変異を含むヒトＩｇＧ４として再発現させ、エフェクター機能を欠く抗ＢＴＬＡ抗体を生産した。可変領域を、Ｓ２２８Ｐヒンジ変異でヒトカッパ定常領域およびヒトガンマ４定常領域を含むＵｂｉｑｕｉｔｏｕｓ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔ（UCOE; Millipore, Billerica, MA）ベクターにサブクローニングした（Angal, 1993）。重鎖および軽鎖発現ベクターを線状化し、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）に共トランスフェクトし、安定なクローンをＧ４１８およびピューロマイシンを含むＣＤ ＣＨＯ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）で選択した。クローンをヒトガンマ／カッパ サンドウィッチＥＬＩＳＡを使用して発現に対してスクリーニングし、最も良い生産系を生産および精製のために２Ｌにスケールアップした。元の８Ｄ５ ＭａｂのＩｇＧ４バージョンを本明細書においてｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５（またはｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５ Ｇ４）と称する。８Ｄ５のＩｇＧ１バージョンを本明細書においてｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５ Ｇ１と称する。
抗ＢＴＬＡ抗体配列
縮重プライマーＰＣＲベース方法を使用して、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５およびｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７配列の重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡ配列を決定した。全ＲＮＡを製造業者の指示にしたがってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Qiagen, Valencia, CA, USA）を使用して５×１０６個のハイブリドーマ細胞から製造した。ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を両方とも製造業者の指示にしたがって、５’−ＲＡＣＥプロトコールにより製造した。それぞれの抗体のＶ領域を、５’ＲＡＣＥ ユニバーサルプライマーミックスで対にした３’ヒト−特異的定常領域プライマー（ＶＨプライマーＨＬＢ０２（配列番号：３３）；ＶＫプライマーＬＹ４９（配列番号：３４））を使用して増幅した。Ｖ領域を含むＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）にクローニングし、大腸菌株ＴＯＰ１０（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）に形質転換した。ミニプレップＤＮＡまたはＴｅｍｐｌｉｐｈｉ（GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, USA）のいずれかを製造し、ＤＮＡシーケンシング（Sequetech, Mountain View, CA, USA）に付した。得られたＤＮＡ配列をインフレーム再配列および他の抗体特性のために分析した。ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の重鎖および軽鎖可変領域の配列は図１Ａ−Ｃに示されている。相補性決定領域（ＣＤＲ）は標識されている。配列の特徴は図１Ｃにおいて略図にされている。アンタゴニスト抗体Ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の重鎖および軽鎖可変領域の配列は図２Ａ−Ｃに示されている。
実施例２
抗ＢＴＬＡ抗体の結合親和性
細胞ベースフローサイトメトリーを使用して、ヒトおよびカニクイザルＢＴＬＡに対するｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５（図３Ａ−Ｂ）およびｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７（図３Ｃ−Ｄ）の明白な結合親和性を決定した。ヒトおよびカニクイザルＢＴＬＡの最大半量結合は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５のＩｇＧ１およびＩｇＧ４バージョンの両方に対して〜１２ｎＭで起こった。アゴニスト結合分析（図３Ａ−Ｂ）のために、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５を、受容体内在化を防止するために０．０２％のアジ化ナトリウムを含む４℃のバッファー中で、ヒトＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞において２０μｇ／ｍｌから３倍またはカニクイザルＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞において５０μｇ／ｍｌから２倍で滴定した。ＰＥ−抗−ｈｕＦｃを検出のために使用した。このデータは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５がヒトおよびカニクイザルＢＴＬＡに結合することを説明する。アゴニストｈｕＭａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６およびｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５と同様の結合親和性を示す。
表５：ＢＩＡｃｏｒｅ結果
Figure 0005898617
アンタゴニスト結合分析（図 ３Ｃ−Ｄ）のために、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７を、受容体内在化を防止するために０．０２％のアジ化ナトリウムを含む４℃のバッファー中で、ヒトＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞において２０μｇ／ｍｌから３倍またはカニクイザルＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞において５０μｇ／ｍｌから２倍で滴定した。ＰＥ−抗−ｈｕＦｃを検出のために使用した。ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７において、ヒトおよびカニクイザルＢＴＬＡの最大半量結合は、図３Ｃ−Ｄに示されているとおりｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７のＩｇＧ１およびＩｇＧ４バージョンの両方に対して〜１．６ｎＭで起こった。このデータは、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７がヒトおよびカニクイザルＢＴＬＡに結合することを説明する。
実施例３
ＢＩＡｃｏｒｅ
抗体を、結合動力学を解明し、平衡結合定数を計算するために、ファーストオン スローオフ(fast-on slow-off)動力学を証明するＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して、さらにプロファイリングした。ＢＩＡｃｏｒｅにおいて、試験抗体を抗−ＣＨ１チップ上に捕獲した。
Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５ Ｇ４は２．４ｎＭの明白なＫｄを示した。アンタゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７は４．６ｎＭの明白なＫｄを示した。
表６ ＢＩＡｃｏｒｅ結果
Figure 0005898617
実施例４
ＨＶＥＭ遮断能力
抗体を、ヒトＢＴＬＡへのＨＶＥＭの結合を遮断する能力を測定するために試験した。ヒトＢＴＬＡへのＨＶＥＭの結合を遮断する能力を、競合細胞ベースフローサイトメトリーアッセイを使用して測定した。連続希釈されたｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５を、１５分間、ヒトＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞（受容体内在化を防止するために０．０２％のアジ化ナトリウムを含むバッファー中）に適用し、４℃で３０分間、ビオチン化ヒトＨＶＥＭ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１μｇ／ｍＬ）を添加した。図４Ｂに示されている結果において、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５を５０μｇ／ｍｌから開始して３倍で滴定し、ＰＥ−ＳＡを検出のために使用した。
ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７におけるＨＶＥＭ遮断能力は、同じアッセイから図４Ａに示されている。連続希釈されたｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７を、１５分間、ヒトＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞（受容体内在化を防止するために０．０２％のアジ化ナトリウムを含むバッファー中）に適用した後、４℃で３０分間、ビオチン化ヒトＨＶＥＭ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１μｇ／ｍＬ）を添加した。図４Ａに示されている結果において、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７を５０μｇ／ｍｌから開始して３倍で滴定し、ＰＥ−ＳＡを検出のために使用した。洗浄された細胞を受容体内在化を防止するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）ならびに０．０２％のアジ化ナトリウムを含む４℃のバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。生細胞をＦＳＣ／ＳＳＣゲートからＰＩ陽性細胞の除外に基づいて分け、それらの幾何学的平均蛍光を測定した。図４Ａの結果は、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７がＨＢＴＬＡを発現するＣＨＯ細胞へのヒトＨＶＥＭ（ｈＨＶＥＭ）の結合を遮断することを示す。
図４Ｂに示されているとおり、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、ヒトＢＴＬＡへのＨＶＥＭの結合を阻害しないか、またはそれと競合しない。同様の結果が抗体ｈｕＭａｂ８Ａ３について得られた。図４Ａに示されているとおり、ｈｕＭＡｂ４Ｃ７は、ヒトＢＴＬＡへのＨＶＥＭの結合を阻害するか、またはそれと競合する。同様の遮断結果が、抗体ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７について得られた。
実施例５
ＣＤ３架橋に対するヒトＴ細胞応答はｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５により阻害される
抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体および抗体フラグメントを、種々の状況下で刺激された健常者由来の血球を使用して、インビトロでＴ細胞活性を減少させる能力に対して試験した。抗全てのコンピテントヒトＴ細胞の細胞表面上でＴ細胞受容体複合体と架橋するためにＣＤ３ Ｍａｂを使用する古典的Ｔ細胞刺激アッセイを、利用した。
Ｔ細胞芽を、ＰＨＡおよびＩＬ−２を使用してヒトＰＢＭＣから培養において産生した。細胞芽を、可溶性ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５ＦａｂフラグメントまたはＩｇＧ１アイソタイプコントロールの存在または非存在下で４８時間、固定された抗ＣＤ３Ａｂで刺激した。増殖を、図５に示されているとおりチミジン取込みにより測定した。
このアッセイにおいて、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は増殖を阻害することを証明され、Ｔ細胞上の抗原受容体およびＢＴＬＡの同時刺激の結果がＴ細胞応答の抑制であることを示唆した（図５）。一価のＦａｂフラグメントとしてこれらの培養物に加えられたｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５抗体は同様の活性を証明し、このことは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５が細胞表面上の多数のＢＴＬＡ分子の架橋ではなく機能性エピトープのヒッティング(hitting)によって、ＢＴＬＡ受容体機能を活性化することを強く示す。このデータは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５がヒトＴ細胞芽の抗ＣＤ３誘導性増殖を阻害することを説明する。
実施例６
ＳＥＢに対するヒトＴ細胞応答は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５により阻害され、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７により増加される
ＢＴＬＡ受容体を活性化する機能性結果を特徴付けるために使用される別のアッセイは、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を使用して、ＳＥＢの用量に依存して、Ｖβ３、Ｖβ１２、Ｖβ１４、Ｖβ１７およびいくつかの他のＴ細胞受容体鎖を発現する全てのヒトＴ細胞で行い、活性化する。ドナーに依存して、ＳＥＢは、ＩＬ−２生産により決定される全てのＴ細胞の最大２０％を活性化する。
本分析において、健常ヒト（図６Ａ）またはカニクイザルドナー血液（図６Ｂ）を１：１０希釈し、抗体と共に前インキュベートした後、スーパー抗原ＳＥＢ（１μｇ／ｍｌ）を培養物に加えた。ヒトＩｇＧ４（ＨｕＩｇＧ４）は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５に対するアイソタイプコントロールＭａｂである。単一の典型的なヒトおよびサルドナーが示されている。
２日後、ＩＬ−２生産をＥＬＩＳＡにより測定した。Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、ヒトおよびサルドナーの両方において対照ヒトＩｇＧ４と比較してＩＬ−２生産を減少させた。
共刺激受容体ＣＤ２８およびそのリガンドＣＤ８０／ＣＤ８６間の相互作用を遮断する可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質（ＣＴＬＡ−４／Ｉｇ）はＳＥＢ誘導ＩＬ−２生産を減少させ、共刺激経路の操作後にＴ細胞活性を定量する方法としてのＳＥＢ刺激アッセイをさらに立証した。試験されたアゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体によるＩＬ−２生産の減少は、用量依存的であることが見出された（図６Ａ−Ｂ）。抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ２１Ｈ６、ｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７は、また、ＩＬ−２生産における同様の効果を有し得る。
これらのアッセイは、また、上記の方法にしたがってｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７で行った。Ｈｕ ＭＡｂ４Ｃ７は、ＣＴＬＡ−４／Ｉｇおよびｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５と対照的に、ヒト（図６Ｃ）およびサルドナー（図６Ｄ）の両方において対照ヒトＩｇＧ４と比較してＩＬ−２生産を増加させた。
サルＢＴＬＡと交差反応する試験された抗ヒトＢＴＬＡ Ｍａｂの能力は、インビボで疾患調節を示す良く試験されたモデル、例えば、サル腎臓移植およびＥＡＥ系におけるＴ細胞応答を調節するＭａｂの能力に対する試験においてとりわけ有用である。ＳＥＢ刺激アッセイにおけるＩＬ−２生産を減少させる試験されたアゴニスト抗ＢＴＬＡ抗体の能力は、これらの抗体が状態、例えば、移植片対宿主病を調節または予防するために適当であることを示す。
実施例７
ＴＴ−ワクチン接種ドナー由来の血球におけるｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５による破傷風菌トキソイド（ＴＴ）依存性ＩＦＮγ生産および増殖の阻害
さらに、抗ＢＴＬＡ処置の能力が破傷風菌トキソイド（ＴＴ）リコール抗原を使用する抗原特異的応答を抑制するか否かを試験した。ＴＴを０．１μｇ／ｍｌでＰＢＭＣに加え、サイトカインおよび増殖を７日後に分析した。最近のＴＴワクチン接種個体由来のＰＢＭＣを、Ａｂａｔａｃｅｐｔ（ＣＴＬＡ−４／Ｉｇ）、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５または対照アイソタイプ抗体ＩｇＧ４の存在または非存在下でＴＴを使用して、インビトロで７日間再刺激した。インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）生産をＥＬＩＳＡにより測定し、増殖をトリチウムチミジン取込みにより測定した。
ＴＴ誘導ＩＦＮγ生産（図７Ａ）および増殖（図７Ｂ）は、抗原単独と比較して、ＣＴＬＡ−４／Ｉｇにより、およびｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５により著しく減少された。これらのデータは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５が（抗原特異的）Ｔ細胞受容体複合体を介して引き起こされるＴ細胞応答を阻害することができることを示す。一次および二次（リコール）応答の両方がｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の存在下で抑制される。
実施例８
ＴＴ−ワクチン接種ドナー由来の血球におけるｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７による破傷風菌トキソイド（ＴＴ）依存性ＩＦＮγ生産および増殖の増加
上記のとおり、ＩＦＮγ生産（図８Ａ）および増殖分析（図８Ｂ）を、また、アンタゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７を使用して行った。ＴＴ誘導ＩＦＮγ生産（図８Ａ）および増殖（図８Ｂ）は、抗原単独と比較してｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７により著しく増加した。これらの結果は、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７が抗原特異的Ｔ細胞受容体複合体を介して引き起こされるＴ細胞応答を増加させることができることを示す。一次および二次（リコール）応答の両方がｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７の存在下で増加される。
実施例９
ヒトＢ細胞機能はｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５により阻害される
ヒトＢ細胞を末梢血から単離し、抗ＢＴＬＡ Ｍａｂの存在または非存在下で抗−ＩｇＭで刺激した。具体的には、Ｂ細胞をヒト全血からの陰性選択により単離し、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ＣＴＬＡ−４／Ｉｇまたはアイソタイプコントロールの存在または非存在下で１０μｇ／ｍｌの抗−ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで刺激した。増殖を４８時間後にチミジン取込みにより測定した。図９に示されているとおり、Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、Ｂ細胞増殖における用量依存的減少をもたらすが、アイソタイプコントロールおよびＣＴＬＡ−４／Ｉｇは効果がなかった。同様の結果が抗体ｈｕＭａｂ８Ａ３について得られた。
実施例１０
ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５による末梢血Ｂ細胞のケモカイン生産の阻害
未感作なＢ細胞上の表面ＩｇＭの架橋は、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１βの生産の増強をもたらす。図１０Ａ−Ｂは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５による末梢血Ｂ細胞のケモカイン生産の阻害を示すグラフを示す。Ｂ細胞をヒト全血からの陰性選択により単離し、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５またはアイソタイプコントロールの存在または非存在下で１０μｇ／ｍｌの抗−ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで刺激した。ＭＩＰ１αおよびβ生産をＥＬＩＳＡにより測定した。
Ｂ細胞増殖の限定に加えて、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、用量依存的様式において抗−ＩｇＭ誘発細胞のＭＩＰ１α（図１０Ａ）およびＭＩＰ１β（図１０Ｂ）のケモカイン生産を減少させた。重要なことには、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５および対照抗体を、Ｂ細胞受容体の関与なしにＢ細胞増殖を強く誘導する非抗原特異的トリガー、例えば、ＣＤ４０Ｌ プラス ＩＬ−４を使用する実験において試験した。これらの条件下で、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の活性が検出されなかった。
実施例１１
Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は免疫活性を自発的に引き起こさない
図１１は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５が健常ドナー血液における免疫活性を自発的に刺激しないことを示すグラフである。ヒトからの希釈された全血を、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５またはＣＴＬＡ−４−Ｉｇの存在または非存在下でスーパー抗原ＳＥＢで刺激した。ＨｕＩｇＧ４は、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５に対するアイソタイプコントロールｍＡｂである。Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５を、また、ＳＥＢ刺激の非存在下で血液に加えた。４８時間（時）後、ＩＬ−２生産をＥＬＩＳＡにより測定した。
ＴＴリコール応答アッセイ、ならびにＳＥＢ刺激アッセイ（ヒト全血を使用する）において、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、Ｔ細胞受容体の同時特異的な刺激なしで検出可能な増殖またはサイトカイン応答を刺激しない。これは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５が患者における偶然のサイトカイン・ストーム様事象を誘導する可能性がないことを証明する。
実施例１２
Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５トリガーＢＴＬＡ阻害シグナル伝達活性
Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５およびｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７はＢ細胞由来のＢＴＬＡタンパク質を免疫沈殿し、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５での前処理はＴＣＲξリン酸化を誘導する。ヒト末梢血細胞からの溶解物を種々のＢＴＬＡ ＨｕＭＡｂで免疫沈殿した。ｈｕＩｇＧ４はアイソタイプコントロールであり、ｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７（アンタゴニスト抗体）および２Ｇ９は他のＢＴＬＡ ＨｕＭＡｂである。図１２Ｂにおいて、ＣＤ４ Ｔ細胞を末梢血から単離し、以下のとおりに試験した：レーン１＝非刺激細胞、レーン２＝抗ＣＤ３Ｔ細胞エキスパンダービーズで３０分間刺激された、レーン３＝エキスパンダービーズでの刺激の３０分前に２５μｇ／ｍｌのｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５−（クローン８Ｄ５として標識された）で処理された。上のブロットの全細胞溶解物を全ＣＤ３ξに対して調べ、下のブロットをリン酸特異的ＣＤ３ξＡｂで調べる。Ｍレーンは分子量マーカーであり、数字はｋＤを示す。
健常ドナー由来の末梢血細胞において、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５およびｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７は、免疫沈殿ＢＴＬＡに特異的に結合することを示した（図１２Ａ）。抗ＣＤ３ プラス 抗−ＣＤ２８で刺激された末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５でのプレインキュベーションによって、ＴＣＲ／ＣＤ３シグナル伝達の開始に重要であるＴＣＲξ鎖のリン酸化を減少させることを見出した（図１２Ｂ）。
実施例１３
Ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は一価のＦａｂ’として活性である
図１３Ａにおいて、ヒト由来の希釈された全血を、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５ Ｆａｂまたはｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５に対するアイソタイプコントロールＦａｂの存在または非存在下でスーパー抗原ＳＥＢで刺激した。４８時間後、ＩＬ−２生産をＥＬＩＳＡにより測定した。図１３Ｂにおいて、細胞を陰性選択によりヒト全血から単離し、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５ ＦａｂまたはアイソタイプコントロールＦａｂ存在または非存在下で１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで刺激した。増殖を、４８時間後にチミジン取込みにより測定した。図１３Ａ−Ｂは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５が用量依存的にＳＥＢ応答およびＢ細胞増殖を抑制したことを説明する。
本明細書に記載されているとおり、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、一価のＦａｂ’としてＴまたはＢ細胞培養に加えられたとき、ＢＴＬＡ活性を引き起こすことを見出した。Ｆａｂ’の相対的効力（相対的有効性ではないが）が、効力の喪失が単に親和性の喪失によるものであることを示唆する完全Ｍａｂの約１０倍未満であった。Ｆａｂ’フラグメントとしてのＨｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、用量依存的に、ヒト全血におけるＳＥＢ応答および抗ＩｇＭ誘導Ｂ細胞増殖の両方を抑制することができた（図１３Ａ−Ｂ）。他のＩｇフォールド細胞表面受容体のように、ＢＴＬＡ免疫抑制活性は、また、何らかのＢＴＬＡに結合する抗体がプラスチック上に被覆されているとき（多重受容体の架橋を介して）、引き起こすことができる。しかしながら、ＢＴＬＡへのｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の一価の結合が阻害機能を完全に活性化するらしいという事実は、ＢＴＬＡのユニークな特徴であるようである（例えば、陰性の共刺激タンパク質ファミリーメンバーＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４と共有しない）。ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５がＢＴＬＡの天然のリガンドであるＨＶＥＭの結合を妨げないため、理論にとらわれることを望まないが、これは、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５が構造変化および、次に細胞内シグナル伝達を誘導するＢＴＬＡの細胞外ドメイン上の（潜在的にアロステリックな）エピトープに当たることを示す。
実施例１４
サイトカイン・ストーム
ＢＴＬＡは、ＣＤ２８ファミリーの免疫調節受容体である。アゴニスト抗体を利用できる可能性のある合併症は、インビボでの「サイトカイン・ストーム」活性の誘導である。サイトカイン・ストームは、サイトカインおよび免疫細胞間の正のフィードバック・ループの妨害による炎症性サイトカインの迅速な誘導により特徴付けられる全身性炎症応答である。免疫調節治療の予測的前臨床安全性試験を改善する方法は、開発されている（例えば、National Institute for Biological Standards and Control, UK, See, Stebbings, 2007による）。ｆｏｒインビボでサイトカイン・ストームに対する可能性を予測するための現在のモデルおよび方法論を利用するｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５のインビトロ試験が行われている。サイトカイン・ストームアッセイは、陽性参照として精製された陽性のサイトカイン・ストーム対照アゴニスト抗体を使用して行った。これらのアッセイにおいて、固定化された陽性対照アゴニストｍＡｂは、さらなる刺激の非存在下で強力なＩＬ−２応答を産生した。同じ様式において固定されたとき、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５も対照ＩｇＧ４も、図１４Ａ−Ｂに示されているとおり、ＩＬ−２分泌を誘導しなかった。図１４Ｂ−Ｄは、アゴニスト抗体ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５、ｈｕ Ｍａｂ８Ａ３、ｈｕ Ｍａｂ１５Ｃ５、ｈｕ Ｍａｂ２０Ｈ４およびｈｕ Ｍａｂ１９Ａ７が、また、超架橋されている(supercrosslinked)とき、炎症性サイトカインインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の生産を引き起こさなかった（上記条件下で）ことを説明する。陽性の対照アゴニストｍＡｂは、対照的に、ＩＦＮγおよびＴＮＦα応答の両方を生産した。したがって、試験された抗ＢＴＬＡアゴニスト抗体はヒトＰＢＭＣ培養物においてサイトカイン・ストームを引き起こさず、同様に、それらは、このインビトロの参照モデルの結果に基づいて、インビボでサイトカイン・ストームを引き起こさないことが予期される。
実施例１１および図１１において証明されているとおり、ｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５は、使用される何らかの機能アッセイにおいて免疫機能を自発的に刺激しない。Ｔ細胞特異的トリガーの非存在下でのｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５の添加は、サイトカイン分泌または増殖の測定可能な変化をもたらさない。さらに、プラスチック上にｈｕ Ｍａｂ８Ｄ５を被覆することによりより高いレベルの架橋とする試験において、ｍＡｂはサイトカイン放出または増殖を誘導しなかった。これらのデータ、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ相互作用の阻害性質、およびトリガーＢＴＬＡが阻害性細胞内シグナル伝達を招くという事実に基づいて、サイトカイン・ストームの可能性のある危険性は、非常に起こりそうにないと考えられる。
実施例１５
動物モデルにおける許容性および副作用
Ｍａｂ８Ｄ５またはｈｕ Ｍａｂ４Ｃ７での動物試験において言及される許容性問題または副作用がなかった。
実施例１６
ＳＣＩＤｈｕ ＳＰＬ−Ａヒト免疫応答モデルにおける８Ｄ５の効果
ＨｕＭａｂ 抗ＢＴＬＡアゴニストＩｇＧ４クローン８Ｄ５がヒトＴ細胞依存性介在Ｂ細胞を阻害することができるか否かを決定するために、ヒト免疫応答のＳＣＩＤｈｕ ＳＰＬモデルにおけるＩｇＧ生産を、ＨｕＭａｂがインビボで免疫応答を調節する可能性を調べるために使用した。Ｔ細胞応答を誘導し、Ｂ細胞によるＴ細胞依存性抗体生産に影響することが知られている免疫抑制剤であるため、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇを対照として使用した。
簡潔には、ＳＣＩＤマウスにヒト脾臓細胞を腹腔内に移植し、１００μｇの破傷風菌トキソイドで免疫化し、２００μｇの標的特異的または対照抗体で０、５、９および１４日目に処理した。マウスを７日目にＴＴでブーストした。２８日目に、マウスを安楽死させ、血清を回収し、腹腔滲出液細胞（ＰＥＣ）を回収した。ＰＥＣをリンパ球サブセットマーカー発現に対してＦＡＣＳにより分析し、相対的細胞数に対するＡｂ処理効果を評価した。２８日目の血清中のＴＴ特異的および全ヒトＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡにより定量した。
２８日目の血清のＥＬＩＳＡは、ｈｕ ＭＡｂ８Ｄ５がアイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ４（図１７Ｂ＆１８Ｂ）と比較して、ＳＣＩＤｈｕ ＳＰＬマウス（図１５、１６、１７Ａ＆１８Ａ）におけるヒト抗ＴＴリコールおよび全ＩｇＧ応答を阻害することを示した。抗ＢＴＬＡ ｈｕ ＭＡｂ８Ｄ５は、アイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ４処理マウスと比較して、全およびＴＴ特異的ＩｇＧ力価を低下させることにおいて、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇと同様の有効性を示した。図１７Ａ、１７Ｂ、１８Ａおよび１８Ｂは、個々に処置されたマウス由来の力価のプロットを示す。要約すると、これらのデータは、ＢＴＬＡのアゴニストとして働くｈｕ ＭＡｂ８Ｄ５と一致し、ｈｕ ＭＡｂ８Ｄ５誘導ＢＴＬＡシグナル伝達は、ヒトＴ細胞活性化、拡大および次に、ヒトＢ細胞によるＴ細胞依存性リコールＡｇ特異的および全ＩｇＧ生産を阻害する。
実施例１７
ＳＣＩＤ−ＲＡ滑膜モデル
ＲＡのためのヒト化マウスモデルを作るために、ＳＣＩＤ−ＲＡ滑膜モデルは、ＲＡ−患者から免疫不全ＳＣＩＤマウスへの滑膜の移植を含む。ＲＡ滑液移植片はＳＣＩＤマウスに持続し、滑膜の過形成、炎症、免疫反応および血管形成を含むＲＡ関節の形態および特性を維持することができる。ＲＡ滑膜は、関節置換術から得られる（例えば、股、膝、肩）。ＳＣＩＤ免疫欠損マウスは、機能性ＴおよびＢ細胞を有さず、移植片拒絶を示さない。
滑膜を外科手術時に回収し、小片（６ｍｍの生検）に直接処理する。滑膜サンプルを、ＳＣＩＤマウスに背中側の皮下ポケットに新しく移植する。７日間の生着期間後、対照または処置／試験抗体のＩＰ注射を７および１０日目に与える。１４日目に、マウスを犠牲にし、血液および滑液を回収する。分析は、血清サイトカインＥＬＩＳＡ、Ｈ＋Ｅ染色および血清抗体定量化を含む。
配列指標
表７
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本発明は、本明細書に記載されている特定の態様による範囲に限定されない。確かに、本明細書に記載されている本発明に加えて本発明の種々の修飾物が、上記記載および図面から当業者に明白である。このような修飾は特許請求の範囲内であると意図される。
特許、特許出願、ジーンバンク受入番号および刊行物が本願中に引用されており、特に、全ての記載されている化学構造および抗体のアミノ酸配列を含むこれらの記載を出典明示により本明細書に包含させ得る。上記刊行物または文書の引用は、前記のいずれかが適切な先行技術であることが承認されていることを意図せず、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何らかの承認を構成しない。本明細書に引用されている全ての参考文献は、それぞれの個々の刊行物、特許出願または特許が、出典明示により包含することを具体的に、および個々に示すときと同程度に出典明示により包含させる。
明細書は、当業者が本願発明を実施することが十分に可能であると考えられる。本明細書に示されている、および記載されている本発明に加えて本発明の種々の修飾物が、明細書および特許請求の範囲から当業者に明らかである。

Claims (17)

  1. ＢＴＬＡに結合し、
    （ａ）配列番号：１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｂ）配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    （ｃ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｅ）配列番号：２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
    （ｆ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
    を含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. ＢＴＬＡに結合し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    （ａ）該重鎖可変領域が配列番号：２５のアミノ酸配列を含み；
    （ｂ）該軽鎖可変領域が配列番号：３２のアミノ酸配列を含む、
    抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントのＶＬドメインを含む単離されたポリペプチドおよびＶＨドメインを含む単離されたポリペプチドの組み合わせ。
  4. 請求項１または２に記載の１つまたはそれ以上の抗体または抗原結合フラグメント、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物。
  5. 請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントのＶＬドメインをコードする単離された核酸およびＶＨドメインをコードする単離された核酸の組み合わせ。
  6. 請求項５に記載の単離された核酸の組み合わせを含む発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
  8. 請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって：
    ａ．核酸配列を発現する条件下で培養培地中で請求項７に記載の宿主細胞を培養し、それにより軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産すること；
    ｂ．該ポリペプチドを宿主細胞または培養培地から回収すること
    を含む方法。
  9. 対象における感染症または感染病を処置するための医薬の製造における、有効量の請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントの使用。
  10. 感染病が、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルスおよびヘルペスウイルスからなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
  11. 感染症が細菌での感染である、請求項９に記載の使用。
  12. 感染症が真菌での感染である、請求項９に記載の使用。
  13. 対象における癌を処置するための医薬の製造における、有効量の請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントの使用。
  14. 癌が、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、膵臓腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、食道癌、頭頸部の扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、グリア芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫および新生悪性腫瘍からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
  15. 対象における免疫応答を増加させるための医薬の製造における、有効量の請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントの使用。
  16. 対象におけるＴｈ２介在疾患を処置するための医薬の製造における、有効量の請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントの使用。
  17. Ｔｈ２介在疾患が、喘息またはアレルギーである、請求項１６に記載の使用。
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