TW201106967A - Composition for treating HBV infection - Google Patents

Composition for treating HBV infection Download PDF

Info

Publication number
TW201106967A
TW201106967A TW099126293A TW99126293A TW201106967A TW 201106967 A TW201106967 A TW 201106967A TW 099126293 A TW099126293 A TW 099126293A TW 99126293 A TW99126293 A TW 99126293A TW 201106967 A TW201106967 A TW 201106967A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
leu
hbv
ser
seq
amino acid
Prior art date
Application number
TW099126293A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI555531B (zh
Inventor
Perrine Martin
Genevieve Inchauspe
Nathalie Silvestre
Doris Schmitt
Original Assignee
Transgene Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transgene Sa filed Critical Transgene Sa
Publication of TW201106967A publication Critical patent/TW201106967A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI555531B publication Critical patent/TWI555531B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

201106967 六、發明說明： 【發明所屬技彳軒領域】 本發明係關於具有Β型肝炎病毒(η β ν)組分之免疫原 性組成物，及其可為以核酸為主或以多肽為主。該免疫原 性組成物可用於刺激或提升對HBV之免疫反應，而其目的 係提供對抗HBV感染或由HB V感染所引起#或相_的任 何病況或疾病之保護效果或治療效果。本發明也係關於用 於表達此等HBV組分之表達載體及其治療用途或預防用 途。本發明極為特別關注於免疫治療領域，更特別係用於 治療HBV感染病人’尤其慢性感染病人。 I：先前技術3 發明背景 B型肝炎是重大公共衛生問題，全球有超過35偉人慢 性感染B型肝炎’其中20%至4G%有發展成慢性肝病:肝硬 化及肝細胞癌的風險。儘管目前已有有效的預防性疫苗， 但B型肝炎病毒(HBV)感染仍在許多國家猖獗， 國家亦如此，估計全球每年出現約。 WHO推薦全球實施預防接種，但全程預防性疫苗 蓋率於亞洲為25%，歐洲為75-90%。目前B型肝炎為第十大 死因（每年約有！百萬個死亡病例），而_相關肝癌在癌症 排名中排名第5。請感㈣地域分布不均，西方國家盛行 率低於1% ’東南方國家、大部分非洲及赤道南美洲的感行 率高於1〇%。於HBV慢性帶原者高普及地區，自感染母親 至新生兒㈣直感染是最常見的傳染模^，幾乎皆導致慢 201106967 性肝炎(90%病例）。藉著出生後即刻對感染的嬰兒作預防性 疫苗接種，可將此種盛行率降至15%。於西方國家’感染 最常見係出現於成年透過水平途徑傳染’經由體液諸如血 液、精液、唾液傳染，結果導致85%病人發生急性可自行 痊癒的感染，但仍然導致15%的慢性感染病例。 B型肝炎病毒(HBV)屬於肝DNA病毒科(hepadnaviridae) 的成員，主要感染肝臟，在肝細胞複製。傳染性粒子乃所 謂的42-45奈米「丹氏粒(Dane particle)」，丹氏粒係由含有 三種不同表面蛋白質（HBs)的外部脂蛋白包膜（envelope)及 内部核衣殼(nucleocapsid)(HBcAg)組成，核衣殼的主要結構 蛋白質為核心蛋白（core protein)。核衣殼内部有單套HBV 基因體鏈接至病毒聚合酶蛋白質(P)。除了 42-45奈米病毒粒 (virion)之外’ HBV感染病人血液含有由HBsAg及宿主衍生 之脂質所組成的20奈米球體，該球體由感染細胞釋放。此 等球體數目超過病毒粒的數目達104-106倍因數。 ΗB V基因體為約有3，200核苷酸之鬆弛狀圓形之部分 雙股DNA ’該DNA係由全長的負股(negat；iVe strand)及較短 的正股(positive strand)所組成。HBV基因體含有4個重疊開 放讀取框(open reading frame(ORF))，亦即C、S、P、及X。 C ORF編碼核心蛋白（或稱作HBcAg)，此乃組成HBV核衣殼 的長度183胺基酸蛋白質；及於病毒複製期間出現於病人血 清的第二種蛋白質稱作為HBeAg’HBeAg含有前核N端延伸 部分及部分HBcAg。核心蛋白質之c端極為鹼性，含有4個 Arg豐富域，預測該Arg豐富域可結合核酸，以及含有多個 201106967 磷酸化位置（核心之磷酸化位置係與衣殼粒子（capsid particle)之構象變化（conformational change)有關，說明於Yu 及Sommers, 1994, J. Virol. 68:2965)。S ORF編碼三種表面 蛋白質，全部皆具有相同的C端，但差異在於其N端，N端 存在有三個同框ATG起始密碼子（in-frame ATG start codon) 將S ORF劃分成三區，分別為S(226胺基酸）、pre-S2(55胺基 酸)及pre-Sl(108胺基酸）。大型表面抗原蛋白質（L)係於第一 ATG起始密碼子之轉譯起始後製造，及包含389胺基酸殘基 (preSl-preS2-S)。中型表面抗原蛋白質（M)係來自於S區及 pre-S2區的轉譯始於第二起始ATG ;而226胺基酸所組成的 小型表面抗原蛋白質（S，也標示為HBsAg)，係來自於S區起 始於第三個起始ATG密碼子的轉譯。HBV表面蛋白質為糖 蛋白，碳水化合物支鏈（聚糖)藉N-糖苷鍵聯鏈接。PORF編 碼病毒聚合酶；及X ORF含有稱作為X蛋白質之蛋白質，相 信為轉錄活化因子。 藉由目前尚未知的受體，病毒粒進入肝細胞後，核衣 殼將基因體HBVDNA轉運至細胞核，此處鬆弛狀圓形DNA 轉成共價閉合圓形DNA(cccDNA)。cccDNA係作為四種病毒 RNA的轉錄樣板(template)，輸出至胞質（cytoplasm)且用作 為用於HBV蛋白質轉譯的mRNA。最長的（前-基因體）RNA 也用作為HBV複製樣板，HBV的複製係發生於胞質的核衣 殼。然後部分HBVDNA及含聚合酶的衣殼轉運回細胞核， 於細胞核釋放新產生的鬆弛狀圓形DNA來形成額外 cccDNA。cccdnA的半生期比肝細胞的半生期更長， 201106967 cccDNA負責HBV的持續生存。其它衣殼係經由出芽進入内 質網（endoplasmic reticulum)而包覆包膜，及於通過高爾基 複合體(Glogi complex)後被分泌。 多項臨床前期研究及臨床研究已經強調CD4+及CD8+ T細胞免疫反應對於有效抗病毒反應的重要性（femri等 人 ’ 1990, J Immul，145:3442; Penna等人，1996, J Clin Invest, 98:1185 ; Penna等人’肝臟學，25:1022)。換言之，病人天 然藉T助手（TH)及胞毒性T(CTL)淋巴細胞（方便於周邊血液 檢測）所媒介的B型肝炎造成的多重特異性及持續反應中復 原。當辨識到病毒胜肽時，胞毒性T淋巴細胞CTL具有能力 透過HBV複製之非細胞致病性細胞激素媒介的抑制作用來 治癒HBV感染細胞及/或透過perforin-Fas配體及TNFa-媒介 的死亡路徑而殺死HBV。兩項效應物功能（effector function) 係於急性B型肝炎緩解期間觀察到，此種第1型T細胞(Thl) 反應於臨床復原之後仍然持續。經常重合血清丙胺酸轉胺 酶(ALT ; SGPT)濃度升高，及重合HBcAg特異性igM&IgG 的出現。抗HBe抗體及抗HBs抗體稍後出現，且指示有利於 感染結果。HBsAg-特異性抗體經中和，媒介保護性免疫 力，且於臨床復原後持續終生。但慢性HBV感染只有極為 罕見地才能被免疫系統所緩解。當發生慢性HBV感染時， 病毒的清除係關聯著胞毒性T淋巴細胞CTL活性增高，以及 受感染的肝細胞被免疫系統摧毀，造成ALT濃度升高。但 大部分慢性感染病人顯示抗原能力有限的微弱及暫時性 CD4及CD8 T細胞免疫反應而無法有效清除病毒感染，但個 201106967 別HBV特異性T細胞純株已經自肝臟細胞切片檢查中分離 及擴增。此種慢性Β型肝炎的細胞免疫反應之效應物功能改 變的理由目前尚未知。但顯示有些病人於病毒載荷量（viral load)低於106國際單位/毫升(iu/mL)臨界值時，功能性τ細胞 反應部分恢復(Webster等人2004，J. Virol. 78:5707)。此等 資料明白鼓勵及強調需要有可誘導有效T細胞反應的免疫 調節策略。 理想上’慢性B型肝炎的治療首先須在肝臟遭到不可逆 損傷之前，允許遏止HBV的複製’因而清除病毒，防止疾 病進行至肝硬化或肝癌’且改善病人的存活率。習知慢性B 型肝炎的治療包括PEG化(pegylated)干擾素-a(iFNa)及核苷 /核苷酸類似物（nucleoside/nucleotide analogue(NUC))諸如 拉美夫定(lamivudine)，及更為晚近的安提卡芙(entecavir)、 特比夫定（telbivudine)、阿迪佛芙（adefovir)及特諾佛芙 (tenof〇vir)(EASL臨床實務指南：慢性β型肝炎的處置，2009 年）。IFNa為強力抗病毒分子，因此可抑制病毒複製，但於 25-30%病人引發嚴重副作用。Nuc係作為hbV聚合酶之競 爭性抑制劑，針對抑制前_基因體RNA之反錄成為 負DNA 股，及然後轉成雙股病毒DNA。其限制新的病毒粒的形成， 但對於清除隱藏在受感染的肝細胞核中之超螺旋cccDNA 無效，該種超螺旋cccDNA構成新的子代病毒的來源。如此 可解釋為何NUC效果為暫時，在治療停止後即刻出現病毒 的回彈(rebound) ’需要病人長期接受治療。此外，長期功 效也文限制，原因在於出現抗藥性HBV突變株(如。⑽呂等 201106967 人，2001 ’肝臟學33:1527討論，拉美夫定治療—年後，出 現抗藥性HBV突變株大於24%，及四年後大於66%)，但較 新的NUC(安提卡芙、特比夫定及特諾佛芙）顯示抗藥性 HBV突變株的發生遠較少，同時HBVDNA的遏止增加。但 使用此等新穎藥物的長期治療資料有限，及此種較高功效 尚未找出與Η B s -血清轉化的顯著較高比率間的相關性。 除了抗病毒治療之外，目前也致力於發展針對改良宿 主免疫反應’特別由胞毒性Τ淋巴細胞及助手Τ淋巴細胞所 媒介的免疫反應之輔助治療。大部分現行免疫治療辦法的 目光焦點皆集中在使用HBV表面蛋白、S preSl及/或 preS2(Smith等人，1983，自然 302:490 ; Lubeck等人，1989， Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:6763; Adkins等人，1998，生 物藥物 10:137 ; Loirat等人 ’ 2000，J_ Immunol. 165:4748 ; Funuy-Ren等人 ’ 2003，J. Med· Virol. 71:376 ; Kasaks等人， 2004’J. Gen. Virol. 85:2665 ;Xiangming Li等人’2005, Intern. Immunol. 17:1293 ; Mancini-Bourguine等人，2006，Vaccine 24:4482 ; Vandepapeliere等人，2007 ,疫苗25:8585)。至少 就免疫反應刺激獲得令人振奮的結果。例如， Mancini-Bourguine 等人（2006，疫苗 24:4482)報告於HBV慢 性感染病人使用preS2-S-編碼DNA疫苗注射來誘導及/或喚 起T細胞反應，此乃此等病人體内免疫系統仍然在運作的良 好指標。 HBcAg也用作為免疫原(Yi-Ping Xing等人，2005，World J. Gastro. 11:4583)及表面上載有外來抗原上突（epitope)之 201106967 嵌合體 HBcAg衣殼（W092/11368 ; WOOO/32625 ; Koletzki 等人，1997，J. Gen. Virol· 78:2049)。自免疫原性觀點，插 入抗原上突最有展望的位置似乎為預測位在HBcAg表面 上，位置80附近的外環位置（Argos等人，1988，EMBO J. 7:819)。Schodel等人（1992，J. Virol· 66:106)及Borisova等人 (1993，J. Virol. 67:3696)可將preSl及HBsAg抗原上突插入 此區，且報告成功地使用嵌合體粒子免疫接種。 針對同時靶定多個HBV抗原之候選名單多價疫苗也曾 進行研究。值得注意地，編碼存在於包膜蛋白質、核心蛋 白質及聚合酶蛋白質的多重胞毒性T淋巴細胞(CTL)及助手 T淋巴細胞（HTL)抗原上突之融合多肽的多抗原上突DNA 疫苗，顯示於臨床前期小鼠研究模型中可提引出多重CTL 及HTL反應（Depla等人，2008，J. Virol. 82:435)。已經發展 出數種基於編碼HBsAg、HBcAg及HBV聚合酶之DNA質體 混合物的數種疫苗調配物（W02005/056051 ; W02008/020656)，及於慢性B型肝炎之基因轉殖小鼠研究 模型顯示特異性抗HBV細胞反應及體液反應（Chae YQUng
Kim等人，2008，Exp. Mol· Medicine 40:669)。南韓對hbv 帶原者(carrier)使用拉美夫定的組合治療開始進行第i期臨 床試驗(Yang等人，2006，基因治療學，13:1110)。 如此，仍然需要有於有需要的個體諸如HBV慢性感染 病人體，以更強力更有效的方式誘生免疫反應，特別為細 胞媒介免疫反應之免疫治療辦法的替代之道。此外，需要 提供可以穩定持續方式表達HBV抗原之基於載體的組成 201106967 物。 欲藉實施例所解決的技術問題係定義於申請專利範 圍。 本發明之其它及進一步面相、特徵及優點由後文目前 本發明之較佳實施例之描述將更為彰顯。此等實施例係用 於揭示目的。 【發明内容】 發明概要 如此，於第一面相，本發明提供一種包含至少一個多 肽或編碼該至少一個多肽之核酸分子之免疫原性組成物， 其中該至少一個多肽係選自於由下列所組成之組群： (i) 包含源自於第一HBV病毒之聚合酶蛋白質至少 450胺基酸殘基的聚合酶部分； (ii) 包含源自於第二HBV病毒之核心蛋白質至少100 胺基酸殘基之核心部分；及 (iii) 源自於第三HBV病毒之HBsAg蛋白質15至100連 續胺基酸殘基之一個或多個免疫原性功能部位之env部 分；或 該聚合酶部分、核心部分、env部分、編碼該聚合酶部 分之該核酸分子、編碼該核心部分之該核酸分子及/或編碼 該env部分之該核酸分子的任一種組合。 定義 如此處於本案全文使用，除非上下文另行指示，否則 「一」一詞用來表示「至少一個」、「至少第一」、「一個或 10 201106967 多個」或「多伽、i. 」斤述化合物或步驟。例如「一細胞」一 絲4個細胞包括魏合物。 所連結的於此處包括「及」、「或」及「該術語 「約」或「約Γ"任何其它組合」之意義。 ln〇7」凋用於此處表示於一給定數值或 較物，，及更佳5%以内。 八&使用’當用來定義產物、組成物及方法時，「包 二广含之任何形式，諸如「包含有」）、「具有」（及具 可形式）、「包括」（及包括之任何形式）或「含有」（及 —種形式）等詞為開放性術語且未排除額外未引 :其-方法步驟。「主要包含」表示排除任何必要意義 的其匕、'且件或步驟。如此，主 ㈣斤引迷組件組成之組 '"未排除微量污染物及藥學上可接受之載媒劑。「由該 成分所組成」表示排除多於微量元素之其它組分或步驟。 例：多肽由胺基酸序列「所組成」表示該多肽除了所引述 的胺基酸相外*含任何聽酸。多肽「主要由」胺基酸 序列組成表示此種胺基酸序列之存在最終只有少數額外胺 基酸殘基。多肽「包含」胺基酸序列表示胺基酸序列為多 肽之最終胺基酸序列之至少一部分。此種多肽可有少數至 數百額外胺基酸殘基。 「胺基酸」、「殘基」及「胺基酸殘基」等詞為同義詞 及涵蓋天然胺基酸及胺基酸類似物（例如非天然、合成及改 性胺基酸，包括D或L光學異構物）。 「多肽」、「胜肽」及「蛋白質」等詞於此處互換使用 201106967 用來表示包含9個或更多個透過胜肽鍵而鍵結之胺基酸的 胺基酸殘基聚合物。該聚合物可為線性、分支或環狀及包 含天然胺基酸及/或胺基酸類似物，且可有非胺基酸所中 斷。概略指示，若胺基酸聚合物為長(例如多於50胺基酸殘 基）’則較佳係指多肽或蛋白質，而若其長度為5〇胺基酸或 以下，則係指「胜肽」。 於本發明之上下文，「核酸」、「核酸分子」、「多核苷酸」 及「核苷酸序列」等詞係互換使用及定義多去氧核糖核苷 酸(DNA)(例如cDNA、基因體DNA、質體、載體、病毒基 因體、單離DNA、探針、引子及其任一種混合物）或多核糖 核苷酸(RNA)分子（例如mRNA、反訊息RNA)或混合多核糖 -多去氧核糖核苷酸之任一種長度之聚合物。該術語涵蓋單 股或雙股、線性或環狀、天然或合成多核苷酸。此外，多 核苷酸可包含非天然核苷酸，諸如曱基化核苷酸及核苷酸 類似物（參考1^ 5,525,71卜1^4,711，955或£?入302 175作為 修改實例）且可由非核苷酸組分中斷。若存在有修改，則核 苷酸之修改可於聚合前或聚合後提供。 如此處使用’「免疫原性組成物」一詞表示一種調配物 包含後文說明之1、2、3、4或多個組分(例如聚合酶部分、 核心部分、env部分、編碼聚合酶部分之核酸分子、編碼核 心部分之核酸分子及/或編碼e n v部分之核酸分子)及選擇性 地其它組分(例如輔劑、載劑、稀釋劑等）。本發明之免疫原 性組成物典型係呈可投予宿主有機體之形式，該組成物可 誘發保護性或治療性免疫反應足夠誘導或刺激抗HBV免疫 12 201106967 力，結果導致治療效果諸如預防HBV感染，減少及/或改善 因HBV感染所引起或相關聯的至少一種病況（例如減低病 毒載荷量’減低或延遲肝臟病變風險，諸如肝硬化或肝癌， 改善肝史等）’及/或減低血清HBeAg或HBsAg濃度或二者及 /或誘生HBe血清轉化、HBs血清轉化或二者及/或提升其它 抗HBV治療或預防的功效。本發明之免疫原性組成物當導 入宿主有機體内時可激發免疫反應，包括但非限於抗體及/ 或細胞激素的製造及/或胞毒性T細胞、B淋巴細胞、T淋巴 細胞、抗原呈現細胞、助手T細胞、樹狀細胞、NK細胞的 活性’結果導致產生對至少一種HBV抗原/抗原上突之先天 免疫反應及/或特異性體液免疫反應及/或特異性細胞性免 疫反應。 「免疫原性功能部位」係指可被抗體或T細胞受體結合 之HBV蛋白質之結構部分。典型地，此種免疫原性功能部 位特別含有—個或多個B及/或T抗原上突。CTL或TH抗原上 犬或二者’且係涉及由特定抗體所辨識，或藉T細胞受體之 MHC(主要組織可相容性複合體）上下文。「抗原上突」係對 應於最小胜肽部分（通常為9-11個胺基酸殘基集合）其係共 同升V成由抗體、τ細胞受體或HLA分子所辨識的部位。該等 %基可為連續（線性抗原上突）或否（隨形抗原上突其包括非 皮此緊鄰的殘基）。藉Τ細胞辨識Τ細胞抗原上突一般相信係 透過—種機轉’其中Τ細胞辨識抗原之胜肽節段，其係結合 至在抗原呈現細胞表達的I類或II類MHC分子。 如此處使用，「HBV」及「Β型肝炎病毒」二詞係互換 13 201106967 使用且係指肝DNA病毒科之任—種成員（例如參考Ganem 及Schneider於肝病毒科(2001)「病毒及其複製」（2923 2969 頁），Knipe DM等人編輯，現場病毒學，第4版，費城， Lippincott Williams & Wilkin或隨後版本）。延伸種系發生分 析結果導致將B型肝炎病毒歸類為8大基因型（A至η),其顯 示至少8%系列發散。各種HBV基因型顯示獨特地理分布， 及可顯示異種疾病症狀及/或臨床結果。各種Hbv關聯 HBsAg相關的血清學而歸類為9種不同亞型（aywl、ayw2、 ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq+ 及 adqr-)(參考 Mamum-Al Mahtab 等人 ’ 2008，國際肝膽胰病 5:457 ; Schaeffer ’ 2007 ’ 世界胃腸學7:14; Norder等人，1993，J_ Gen Virol. 74:1341之綜論）。各基因型及血清型涵蓋不同hbv種 系及單離株。單離株係對應於自特定HBV來源(例如病人樣 本或其它生物HBV貯存所）單離的特定病毒，而一種系涵蓋 多個單離株，就基因體序列而言彼此極為接近。 適合用於本發明之上下文之多種HBV係說明於技藝界 特別於基因庫（Genbank)。A基因型HBV之實例包括但非限 於單離株HB-JI444AF及種系HB-JI444A(存取號碼 D00329)。B基因型HBV之實例包括但非限於純株 pJDW233(存取號碼D00329)、單離株HBV/14611(存取號碼 AF121243)、Hou等人於2001年識別之HBV-B1(基因庫存取 號碼AF2829H.l)、HBV種系Whutj-37(基因庫存取號碼 AY2933309.1)其係由Zhang等人識別（2005，Arch. Virol. 150, 721-741)、He等人識別之中國HBV種系GDH1(基因庫存取 14 201106967 號碼AY766463.1)，及由jiang等人識別之HBv單離株571亞 型adw(基因庫存取號碼ΑΥ518556·1)。C基因型HBV之實例 包括但非限於單離株ΑΗ-1-ΟΝ980424(存取號碼 ΑΒ113879)、種系 HCC-3-TT(存取號碼ΑΒ113877)、Fang等 人識別之HBV單離株SWT3.3(基因庫存取號碼 EU916241.1)、Zhu等人識別之HBV單離株H85(基因庫存取 號碼AY306136.1)、Tu等人識別之HBV種系C1248(基因庫存 取號碼DQ975272.1)、HBV單離株CHN-H155(基因庫存取號 碼DQ478901.1)其係由 Wang等人識別（2007，J. Viral Hepat 14, 426-434)，及Zhou等人識別之HBV單離株GZ28-1(基因 庫存取號碼EF688062)。D基因型HBV之實例包括但非限於 單離株 KAMCHATKA27(存取號碼 AB188243)、 ALTAY136(存取號碼AB188245)及Y07587說明於 Stoll-Becker等人（1997, J. Virol. 71:5399)及可於基因庫以存 取號碼Y07587取得，以及於存取號碼AB267090描述之HBV 單離株。E基因型HBV之實例包括但非限於單離株 HB-JI411F及種系HB-JI411(存取號碼AP007262)。F基因型 HBV之實例包括但非限於單離株HBV-BL597(存取號碼 AB214516)及HBV-BL592(存取號碼AB166850)。G基因型 HBV之實例包括但非限於單離株HB-JI444GF及種系 HB-JI444G(存取號碼AP007264)。Η基因型HBV之實例包括 但非限於單離株HBV ST0404(存取號碼ΑΒ298362)及單離 株HB-JI260F及種系HB-JI260(存取號碼ΑΡ007261)。但本發 明並非限於此等HBV實例。確實核苷酸序列及胺基酸序列 15 201106967 可於不同HBV單離株及基因型間改變，此種天然遺傳變化 係含括於本發明之範圍及非天然修改例如於後文描述者。 如此處使用，「天然HBV蛋白質」係指天然得自HBV 來源且可與人工改性或於實驗室中藉人為變更者區別之所 發現、單離的、所得蛋白質、多肽或胜肽(例如聚合酶蛋白 質、核心蛋白質或HBsAg等）。如此，除非另行規定，否則 本術語將包括天然HBV蛋白質、多肽或胜肽。此等天然來 源包括收集自已經感染HBV或曾經暴露於HBV之個體的樣 本(例如血液、血聚、血清、精液、唾液、組織切片、活組 織切片檢體等）、培養細胞（諸如HepG2.2.15、HuH6-C15 (Sureau等人，1986，Cell 47:37 ; Sells等人，1987，Proc. Natl. Acad· Sci. 84(4):1005); HuH7.TA61 或 HuH7.TA62(Sun 等 人，2006，J Hepatol. 45(5):636)、組織培養及重組材料。 重組材料包括但非限於HBV單離株(例如得自寄存機關）、 HBV基因體、基因體RNA或cDNA存庫、含HBV基因體或其 片段之質體或已知包括此等元體之任何先前技術載體。 編碼多種HBV蛋白質之核苷酸序列係出現於特化資料 庫（例如前述者）及出現於參考文獻（例如參考Valenzuela等 人’ 1980, B型肝炎病毒基因體之核苷酸序列及主病毒基因 之識別（57-70頁）於「動物病毒遺傳學」編者b. Fields等人； 學術出版社，紐約及Vaudin等人，1988，J. Gen. Virol. 69:1383)。天然聚合酶多肽、核心多肽及HBsAg多肽之實例 分別顯示於SEQ ID N〇:l-3(SEQ ID ΝΟ:1提供HBV單離株 Y07587之天然聚合酶蛋白質之胺基酸序列，SEQ ID NO:2 16 201106967 提供HBV單離株Y07587之天然核心蛋白質之胺基酸序列， 及SEQ ID ΝΟ··3提供HBV單離株Y07587之天然env(HBsAg) 之胺基酸序列）。編碼Y07587 HBV之天然聚合酶、核心及 HBsAg之核苷酸序列供舉例說明目的顯示於SEQ id NO:4、5及6。但如前文討論，HBV蛋白質並非限於此等序 列實例’基因變化係含括於本發明之範圍。 如此處使用，「部分」一詞（例如聚合酶部分、核心部 分及/或env部分）係指如本文所述，藉人工改性或於實驗室 中藉人力變更後源自於天然HBV蛋白質、多肽或胜肽之蛋 白質、多肽或胜肽。「改性」一詞涵蓋一個或多個核苷酸/ 胺基酸殘基之刪除、取代或添加、此等可能之任一種組合 (例如天然核苷酸序列之簡併來減低藉本發明組成物所編 碼之HBV序列間之同源性，導入適當限剪位置）及非天然排 列（例如兩個或多個HBV蛋白質、多肽或胜肽或部分間之融 合）。當預期若干改性時，可考慮連續殘基及/或非連續殘 基。改性可藉熟H技藝人士已知之多種方式產生，諸如位 置導向突變發生（例如使用阿默山公司（Amersham)，法國 Les Ullis之史卡普特(Sculpt〇r)試管内突變發生系統）、 突變發生、DNAf梭及藉化學合成技雜彳如導致合成核酸 分子）。本發明涵蓋之修改包括寂靜修改，其未改變所編碼 之HBV多肽之胺基酸序列，以及轉譯成所編碼多肽之修 改’結果導致與相對應之天然絲酸序氣較獲得已修改 之胺基酸序列。「源自」（或源自於)—詞係用來識別分子之 原先來源’但並非表示限於該分子之製造方法，該分子例 17 201106967 如可藉化學合成或藉重組手段製造。 較佳用於本發明之各個Η B V部分保有與相對應之天然 HBV蛋白質於全長蛋白質或其部分之高度胺基酸序列相同 性。兩種多肽間之相同性百分比為由二序列所共用之相同 位置數目之函數，考慮需要導入來獲得最佳排齊的間隙數 目及各個間隙的長度。多個電腦程式及數學演繹法則於技 藝界可用來決定胺基酸序列之相同度百分比，例如61狀(程 式（例如 Altschul 等人，1997，核酸研究25:3389 ; Altschul 等人，2005 , FEBS J. 272:5101)，該程式係得自NCBI。同 等可應用於核苷酸序列。測定核苷酸序列同源性的程式也 可知自特化資料庫（基因庫或威斯康辛序列分析套裝軟 體）’例如BESTFIT、FASTA及GAP程式。 例如，進一步有關後文修改(例如減低酶活性等），本發 明之組成物所包含或編碼之任一種或全部HBv部分可經修 改，因而表示特定基因體，如此包含與等位序列或近等位 序列相對應之胺基酸序列，其典型地係於特定基因型的多 種HBV多肽之序列排齊後決定。 「組合物j 一詞如此處使用係指由本發明之免疫原性 組成物所包含或所編碼之至少兩種組分之任一種組合物及 多個組分之任一種可能的排列，但特別偏好該等組分中之 二者或三者。如此涵蓋兩種或多種多肽之混合物、兩種或 多種核酸分子/載體之混合物、一種或多種多肽與一種或多 種核酸分子/載體之混合物、以及兩種或多種核酸分子之融 合’因而提供載有兩個或多個HBV部分之單一多肽鏈(例如 18 201106967 非自然排列）《= 於較佳實施例中，本發明之免疫原性組成物包含該聚 合酶部分、核心部分、env部分中之至少二者之組合，或編 碼該聚合酶部分之核酸分子、編碼該核心部分之核酸分子 及/或編碼env部分之核酸分子中之至少二者之組合。本發明 之特佳組成物係選自於由下列所組成之組群：⑴一種組成 物包含如此處定義之聚合酶部分與核心部分之組合或編碼 該聚合酶部分與該核心部分之核酸分子之組合；（U)一種組 成物包含如此處定義之核心部分與env部分之組合或編碼 該核心部分與該env部分之核酸分子之組合；及（Ui)—種組 成物包含如此處定義之聚合酶部分、核心部分與env部分之 組合或編碼該聚合酶部分、該核心部分與該env部分之核酸 分子之組合。 「融合」或「融合蛋白質」等詞用於此處係指於單— 多肽鏈中至少二多肽（或其片段)彼此之組合。較佳多個多肽 間之融合係利用遺傳手段執行，亦即經由於編碼各該多肽 之核酸序列之框架内藉融合執行。「於框架内融合」一詞表 示融合編碼序列之表達結果導致單一蛋白質，而各個融合 多肽間並無任何轉譯終結子。融合可為直接融合（亦即其間 不含任何額外胺基酸殘基）或透過鏈接基融合。鏈接基的存 在可協助融合蛋白質之正確形成、摺疊及/或發揮功能。本 發明並未受所㈣之鍵接基序狀形式、尺寸或數目所 限’於融合多肽間之接面可插人鍵接基序列之多個複本。 根據本發日狀適當鏈接基長3至纖基酸且係由胺基酸殘 201106967 基諸如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、丙胺酸及/ 或脯胺酸之重複組成（例如參考Wiederrecht等人，1988，細 月包54，841 ; Aumailly等人 ’ 1990 FEBS Lett. 262，82 ;及 Dekker 等人，1993，自然 362，852)，例如 Ser-Gly-Ser 或 Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 鏈接基。 如此處使用，「異源斥水性序列」一詞係指斥水性之多 肽（其含有多個斥水性胺基酸殘基諸如Val、Leu、lie、Met、 phe、Tyr及Trp殘基）。「異源性」係指對於該所選之HBV部 分之來源天然HBV蛋白質、多肽或胜肽為外來序列。可為 HBV病毒之外來胜肽（例如得自麻疹病毒或狂犬病病毒之 胜肽）或得自HBV病毒但並非位在該病毒基因體内尋常出 現的位置之胜肽。異源斥水性序列可於框架内稠合於N端、 於C端或稠合於HBV部分内部’且可於多肽通訊、協助多肽 氣造或純化、延長半生料方面扮演某種肖色。根據本發 明之適當異源斥水性序列長15至丨咖基酸及含有高度斥 水性功能部位。 載體」一詞用於此處係指表達載體及非表達載體， ^括病甘載體及非病毒載體，包括染色體外載體(例如多 體)及整合載體設計用來結合入宿 主染色體。於本發 之内田文中特別重要者為於病毒基因體傳遞核酸分子之載 八（斤月之移轉載體）、用於免疫治療之載體（亦即可將核酸 子遞送至但主有機體）及用於各種表達系統及用於宿主 有機體之表達栽體。 此處使用，「病毒載體」-詞涵蓋載體DNA及由該載 20 201106967 體DNA所產生的病毒粒子。病毒載體可為複製合格，或可 為基因上不能動作因而變成複製缺陷或複製受損。「複製合 格」一詞用於此處涵蓋複製選擇性及條件複製性病毒載 體，該等載體經過基因改造而於特定宿主細胞（例如腫瘤細 胞）可更佳地或選擇性地複製。 如此處使用，「調節序列」一詞係指允許、促成或調節 核酸分子於給定的宿主細胞或有機體表達之任何序列，包 括核酸分子或其衍生物之一（亦即mRNA)的增殖、複製、轉 錄、剪接、轉譯、安定性及/或轉運入宿主細胞或有機體。 如此處使用，「宿主細胞」一詞須了解廣義而言並未限 於任何有關組織、器官、或單離細胞的任何組織結構。此 等細胞可為獨特細胞類型或不同型細胞的組群，涵蓋細 菌、低等及高等真核細胞及培養細胞系、一次細胞及增生 細胞。本術語包括可為或已經成為本發明之組成物、核酸 分子、載體或傳染性病毒粒子之接受者的細胞及此等細胞 之子代。 「宿主有機體」一詞係指脊椎動物，特別為哺乳動物 種屬之成員，及尤其居家動物、農場動物、運動動物、及 靈長類包括人類。較佳宿主有機體為患有HBV感染之病 人。感染的HBV可來自於與用於本發明之第一、第二或第 三HBV中之至少一者相同基因型或血清型。 如此處使用，「經單離」一詞係指自其天然環境移開之 蛋白質、多肽、胜肽、核酸分子、宿主細胞或病毒（亦即與 其天然結合的至少另一種組分分離）。 21 201106967 如此處使用「治療上有效量」為足夠改善通#HBV 感染或由HBV感染所引起的或關聯的任何承病或病症相關 聯之一種或多種症狀之劑量。 當考慮預防性用途時，本術 語表示足夠預防或延遲HBV感染之建立之劑耋。治療性」 組成物係經設計及投予已經感染HBV之宿#有機體’其目 的係減輕或改善由該Η B V感染所引起的或關聯的至少一種 疾病或病況，最終組合一種或多種如此處所述之治療模型 (例如使用核苷或核苷酸類似物處理）。例如，用於誘導免疫 反應之治療上有效量可為造成免疫系統活化所需之數量 (例如導致抗HBV反應的出現）。「癌症」一詞涵蓋任一種癌 症病況包括瀰漫性或局部性腫瘤、轉移、癌性癔肉以及癌 前病灶(例如肝硬化）。 如此處使用，「藥學上可接受之載媒劑」意圖包括任何 及全部與藥物投予上可相容之任何及全部載劑、溶劑、稀 釋劑、賦形劑、輔劑、分散介質、塗覆劑、抗菌劑及抗黴 菌劑及吸收延遲劑等。 根據本發明，包含或藉本發明組成物編碼之該等聚合 酶、核心及/或env部分分別可源自目前識別的任何hBV基 因型、種系或單離株，諸如前文就「HBV」—詞所述者。 進一步，聚合酶、核心及env部分各自可源自於天然相對應 之HBV蛋白質或源自於改性HBV多肽（例如經修改因而表 不特定基因型）。如此，本發明組成物所包含或所編碼之聚 合酶、核心及env部分之來源第一、第二及第三病毒分 別可得自相同或相異基因型、血清型及/或單離株。例如使 22 201106967 用源自兩個或多㈣同_基因型之Ηβν部分允許保護對 抗更寬廣範園之HBV基因型。 於個實施例中，關注於經由使用得自於本區當地之 刪基因型㈣少—細Bv^，將树日狀免疫原性电 成物調整適合特定地理區。用於舉例說明目的，基„Α 及c於美國最普遍，而西歐病人大部分感染基因勤及d， 及地中海病人大部分感染基因型D。得自印度的有限資料指 示病毒最常見基因型。另—方面，基因如处於中國 最為普及。舉例言之，目的地為歐洲國家之本發明組成物 可包3源自於基因型a之聚合酶部分及源自於基因型〇之 核心及⑽部分或反之亦然'。另外，聚合酶及核心部分可得 自基因型A，及env部分得自基因型d。至於另—個實例， 目的地用於歐洲國家及美國之本發明組成物可包含分別係 源自於基因型A、C及D之聚合酶、核心及env部分。另一方 面，目的地為中國之本發明組成物可包含分別源自於基因 型B及/或C之聚合酶、核心及env部分。 也適合將本發明之免疫原性組成物調整適合欲治療的 病人族群。例如，基因型八於美國白人及非裔美人較為常 見，經過性行為感染HBV之病人無論屬於基因型B&c卻常 見來自於亞裔美人、亞洲出生者以及帶有母親對嬰兒垂直 傳染的HBV患者。HBV基因型也與不同的臨床結果有關 (Schaeffer專人，2005，J. Viral.肝炎12:111)，基因型D及F 係造成比基因型A更嚴重的疾病進程及更惡劣的預後 (Sanchez-Tapias等人，2002，胃腸學 123:1848)。熟諳技藝 23 201106967 人士之技巧範圍可根據欲治療的族群及/或地理區經由選 擇適當HBV基因型、血清型、種系及/或單離株而調整本發 明組成物。 根據優異實施例，第一、第二及第三HBV病毒中之至 少二者及較佳為全部係得自相同HBV基因型，特別係得自 基因型D。分別源自於相同單離株，特別偏好源自hbv單離 株Y07587之第一、第二及第三HBV病毒，較佳，用於本發 明之聚合酶部分包含與具有至少450個胺基酸殘基之SEQ ID ΝΟ:1或其部分所示胺基酸序列具有至少80%相同度，優 異地至少85%相同度，較佳至少90%相同度，更佳至少95% 相同度’及又更佳100%相同度之胺基酸序列。另外或此 外’用於本發明之核心部分包含與具有至少1〇〇個胺基酸殘 基之SEQ ID NO:2或其部分所示胺基酸序列具有至少80% 相同度，優異地至少85%相同度，較佳至少90%相同度，更 佳至少95%相同度，及又更佳100%相同度之胺基酸序列。 另外或此外，用於本發明之env部分之一個或多個免疫原性 功能部位包含與具有至少15-100個胺基酸殘基之SEQ ID NO:3或其部分所示胺基酸序列具有至少80%相同度，優異 地至少85%相同度，較佳至少90%相同度，更佳至少95%相 同度，及又更佳100%相同度之胺基酸序列。 聚合酶部分 根據一個實施例，由本發明組成物所包含或編碼之聚 合酶部分係比較相對應之天然HBV聚合酶經修改。適當修 改為至少20胺基酸殘基截頭及至多335胺基酸殘基正常存 24 201106967 在於天然HBV聚合酶N端。此項修改特別係與本發明組成物 相關，也包含第二多肽因而減少或刪除聚合酶部分與核、 部分間之重疊部分。熟諳技藝人士之技巧範圍内可將本發 明組成物於所引述的至少20胺基酸殘基及至多335胺基^e 殘基之範圍内截頭。至於天然HBV聚合酶，用於本發明上 下文之聚合酶部分較佳係截頭至少3 0胺基酸殘基至至乡 200胺基酸殘基，期望至少35胺基酸殘基至至多ι〇〇胺基酉复 殘基，較佳至少40胺基酸殘基至至多60胺基酸殘基，及更 佳至少45胺基酸殘基至至多50胺基酸殘基，特別偏好載頭 包括於位在天然HBV聚合酶N端之起始子Met殘基後方豆貝 47或46胺基酸殘基。較佳截頭係自SEQ ID ΝΟ:1之位置 1 (Met起始子）或2延伸至位置47。 較佳實施例係針對包含與自約位置48延伸至約位置 832之SEQ ID NO: 1所示胺基酸序列部分具有至少80%相同 度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至 少95%相同度、及又更佳1〇〇%相同度之胺基酸序列之聚合 酶部分；及甚至更佳係針對包含與SEQ ID NO:7所示胺基酸 序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至 少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同 度之胺基酸序列。 另外或此外，用於本發明之聚合酶部分經修改因而比 較天然HBV聚合酶具有減低的反錄酶(RTase)酶活性。較 佳，該RTase活性之減低係由負責RTase酶活性之功能部位 的一個或多個突變所提供。 25 201106967 幾乎20年前研究HBV聚合酶之結構及功能組織（例如 參考Radziwill等人，1990，J. Virol. 64:613)。其為多功能蛋 白質，具有三個功能部位催化HBV複製之主要步驟（引發、 DNA合成及RNA樣板之去除）及非必要的間隔基其係以下 列順序排列： 〇自位置1延伸至約位置177之第一功能部位係負責 HBV端末蛋白質活性， 〇間隔基係位在約位置178至約位置335， 0自約位置336延伸至位置679之DNA聚合酶功能部 位負責RTase活性，及 〇自約位置680至C端（約為位置832)之RNase Η功能部 位係涉及RNase Η活性。 四個殘基涉及RTase活性，形成存在於天然HBV聚合酶 自約位置538至約位置541(例如相當於SEQ ID N0:1之位置 538、539、540及541 及SEQ ID NO:7之位置492、493、494 及495)之「YMDD」部分（用於Tyr、Met、Asp及Asp殘基）； 及本發明涵蓋於此部分之任何突變或RTase功能部位它處 之任何突變而該功能部位係與RTa s e活性之顯著減低（亦即 約減低10倍）或消除相關而同時仍然保有免疫原性。適當 RTase缺陷聚合酶突變株之代表性實例係說明於參考文獻 例如Radziwill等人（1990 ’ J. Virol. 64:613)、Bartenschlager 等人（1990 ’ J. Virol. 64:5324)及Jeong等人（1996，Biochem
Bioph Res Commun· 223(2):264)。較佳，用於本發明之聚合 酶部分包含YMDD部分（相當於SEQ ID NO: 1位置540及 26 201106967 SEQ ID NO:7位置494)之第一Asp殘基之取代，或位在相當 於天然HBV聚合酶之Asp以外之任何胺基酸殘基位置的胺 基酸殘基之取代，特別偏好His殘基之取代(D540H突變）。 RTase活性的減少或消除可使用技藝界眾所周知之檢定分 析進行(例如Radziwill等人，1990，J Virol· 64:613所述内生 性聚合酶檢定分析）。 另外或此外，用於本發明之聚合酶部分可經修改，因 此比較天然HBV聚合酶具有減低的RNase Η酶活性。較佳該 RNase Η活性減低係由負責RNase fi酶活性之功能部位中之 一項或多項突變提供。如前文討論，涉及RNase Η活性之功 能部位已經映射於HBV聚合酶之C端部分内部，更特別自位 置680至C端位置832;及本發明涵蓋於此功能部位之任何突 變，該突變係與RNase Η活性顯著減低（亦即至少10倍減低) 或消除，及其對免疫原性無害。適當RNase Η缺陷聚合酶突 變株之代表例係說明於參考文獻，例如Radziwill等人（1990, J. Virol. 64:613)、Bartenschlager 等人（1990，J. Virol. 64:6324)。較佳，用於本發明之聚合酶包含對應於SEQ ID ΝΟ:1位置718及SEQ ID NO:7位置672之Glu殘基之取代，或 位在天然HBV聚合酶相當於Glu以外之任何胺基酸殘基的 相當位置之胺基酸殘基之取代，特別偏好His殘基之取代 (E718H突變）。RNase Η活性之減低或消除可使用技藝界眾 所周知之檢定分析執行(例如於試管内RNase Η活性檢定分 析或DNA-RNA串接分子分析，說明於Radziwill等人， 1990, J Virol. 64:613 或Lee 等人，1997, Biochem· Bioph. Res. 27 201106967
Commun. 233(2):401)。 較佳用於本發明之聚合酶部分係經突變因而減少或消 除RTase活性及RNase活性，及包含前文就此等酶功能所討 論之修改，特別偏好突變D540H及E718H。 本發明之較佳實施例係針對一種聚合酶部分其包含、 另外其主要組成為、或另外其組成為一種胺基酸序列，該 胺基酸序列與SEQ ID NO:8所示之胺基酸序列或SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少 85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、 及又更佳100%相同度，Asp殘基於位置494取代His殘基及 Glu殘基於位置672取代His殘基。 於另一且較佳實施例中，用於本發明之聚合酶部分係 於框架内融合之異源斥水性序列因而改良於表達性宿主細 胞表面之合成 '及/或安定性、及/或呈現，及/或對宿 I類及/或MHC II類抗原之呈現。適當異源性斥水序列包括 允許聚合酶部分靶定於分泌路徑之序列諸如信號胜肽及/ 或穿膜胜肽。此等胜肽為技藝界所已知。簡言之，信號胜 肽通常係存在於膜呈現或膜分泌多肽之N端，開始其進入内 質網(ER)。其包含15至35個主要為斥水性胺基酸，其然後 藉特疋位在ER之内狀辦去除獲得成熟多狀。穿膜胜狀通常 本質上為高度斥水性，用來將多肽錨定於細胞膜(例如參考 Branden及Tooze ’ 1991，蛋白質結構介紹，2〇2_214頁，Νγ
Garland ; WO99/03885)。可用於本發明之上下文之穿膜胜 肽及/或信號胜肽之選擇寬廣。其可得自任何膜定錨及/或獏 28 201106967 分泌多肽（例如細胞性多肽或病毒性多肽）諸如免疫球蛋
白、組織胞質素原活化劑、胰島素、狂犬病、糖蛋白、HIV 病督包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白質或可為合成。信號胜肽 之較佳插入位置為密碼子下游1^端用來引發轉譯，及穿膜胜 狀之較佳插入位置為C端，例如緊接於終止密碼子上游。此 外，鏈接基胜肽可用來將信號胜肽及/或穿膜胜肽連接至聚 合酶部分。 其它斥水性序列可用於本發明之上下文，諸如一般存 在於包膜或膜結合蛋白質包括只以八§ ◊本發明之上下文中 特別令人感興趣者為聚合酶部分與此處所述免疫原性功能 立（env卜env2、env3及/或env4)中之一者或多者之融合， °亥等功能部位為斥水性。一個或多個斥水性功能部位可於 樞架内於N端、於C端或於聚合酶部分内部融合。 車父佳於本發明之上下文，用於本發明之聚合酶部分於 樞架内融合至狂犬病糖蛋白之信號胜肽及穿膜胜肽。如隨 附之貫例章節所述’狂犬病信號序列係於該聚合酶部分之N 端於框架内融合’及該狂犬病穿膜序列係於聚合酶(：端於框 架内融合。最佳實施例係針對一種聚合酶部分其包含、另 外其主要組成為、或另外其組成為一種胺基酸序列，該胺 基酸序列與SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列具有至少8〇% 相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少9〇%相同度、更 佳至少95%相同度、及又更佳1〇〇%相同度。 核心部分 另外或與前述組成物組合，本發明也提供包含源自於 29 201106967 第二HBV之核心部分之組成物。如此處關聯HBV病毒所 述’用於本發明之核心部分係源自於HBV，該HBV係與聚 合酶部分來源的HBV病毒相同或相異。較佳核心部分及聚 合酶部分皆係源自於基因型D HBV，特別偏好Y〇7587 HBV 單離株，或另外得自中國流行的HBV基因型（例如基因型β 或C)。 根據一個實施例’本發明使用之核心部分可為天然 HBV核心（例如示於SEQIDNO:2)或改性核心，該改性核心 比較相對應之天然HBV核心保有至少核心蛋白質之至少 100胺基酸序列，特別偏好包含120至180胺基酸殘基，期望 125至148胺基酸殘基及較佳130至143胺基酸殘基（例如約 140胺基酸殘基)之核心部分。 適當改性為戴頭。期望地，截頭涵蓋正常存在於天然 HBV核心C端或存在於C端部分内部（亦即涵蓋最末40胺基 酸殘基部分)之至少10胺基酸殘基至至多40胺基酸殘基。此 種改性特別有關，原因在於本發明組成物也包含聚合酶部 分因而減少或刪除聚合酶部分與核心部分間之重疊部分。 也關係於此核心區内部刪除NLS(核定位信號）及/或抑制與 HBV聚合酶之交互作用。熟諳技藝人士之技巧範圍内可將 截頭調整於本發明組成物之所引述的至少1〇胺基酸殘基至 至多40胺基酸殘基之範圍。適當截頭包括10、u、12、13、 、15、16、17、18、19、20、2卜 22、23、24、25、26、 27、28、29、30、3卜 32、33、34、35、36、37、38、39 或40正常存在於天然HBV核心C端或其C端部分内部之連 30 201106967 續胺基酸殘基。至於天然HBV核心’用於本發明上下文之 核心部分較佳截頭達位在天然HBV c端或c端部分内部至 少20胺基酸殘基至至多40胺基酸殘基’較佳至少3〇胺基酸 殘基至至多38胺基酸殘基，及更佳至少34胺基酸殘基至至 多37胺基酸殘基；特別偏好包括天然HBV核心最末35胺基 酸殘基之截頭（換言之’截頭係自核心多肽位置149延伸至c 端）。 特別關注者為一種核心部分包含一胺基酸序列，其係 與自位置1延伸至約位置148之SEQ ID NO:2所示胺基酸序 列部分具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳 至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相 同度；及又更佳一種核心部分包含一胺基酸序列，其係與 SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列部分具有至少80%相同度、 優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同度、更佳至少 9.5%相同度、及又更佳1〇〇%相同度。 另外或此外’核心部分經修改因此比較天然HBV核 心，具有辨識HBV包膜蛋白質及/或與其交互作用減低。優 異地，該辨識/交互作用的減低係由位在殘基8〇附近内部該 區的一個或多個突變所提供，預測該區形成暴露於核心粒 子表面上的外環圈（Argos等人，1988，EMBO J. 7:819)。辨 識env蛋白質或與其交互作用的減少或消除可使用技藝界 眾所周知之檢定分析執行(諸如電子顯微術、細胞内核衣殼 形成之分析、於HuH7暫時性轉染後分泌的病毒粒，說明於 Seitz等人 ’ 2007，EMB0 j.，26:416或p〇nsel等人，2〇〇3， 31 201106967 J. Virol.77(l):416)。 較佳修改包含自約位置75至約位置85延伸的核心該區 (對應於SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:10之殘基75-85)刪除一 個或多個胺基酸殘基，特別偏好刪除自約位置77延伸至約 位置84之核心部分之該部分（對應於SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:10之殘基77-84)。另外，較佳核心部分包含，另外其主 要組成為或另外其組成為胺基酸殘基其與SEQ ID ΝΟ:11所 示胺基酸序列或與缺殘基77-84之SEQ ID NO:2所示胺基酸 序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至 少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳1〇〇%相同 度。
Env部分 另外或組合前述組成物，本發明也提供一種包含部 为之組成物。該env部分包含存在於源自於第三HBV病毒之 HBs蛋白質之至少15連續胺基酸殘基之一個或多個免疫原 性功能部位。較佳該等免疫原性魏部位各自係與存在於 天然的或改性的（例如經改性因而表示特定基因型）之 HBsAg中之至少2〇胺基酸至至多刚胺基酸部分相對應。免 疫原性功能部位各自可源自相同或相異HBv病毒，比較核 心部分及聚合酶部分來源的HBV蛋白質，可相 : 較佳’⑽免疫原性功能部位各自係源自於基因型叫心 及特別係源自於侧87 HBV單離株或另外，源自於 行的HBV基因型（例如基因型3或〇。 較佳一個或多個免疫原性功能部位各自包含τ助手(Th) 32 201106967 細胞及/或胞毒性T(CTL)細胞之特異性T細胞抗原上突，其 可限於各種MHC I類抗原及/或II類抗原（例如Α2、Α24、 DR、DP等）。此等抗原上突已經於技藝界描述 (WO94/03764 ; WO94/19011 ; Desombere等人，2000，Clin. Exp. Immunol 122:390 ; Loirat等人，2000，J. Immunol. 165:4748 ; Schirmbeck等人，2002，J. Immunol 168:6253 ; Depla等人，2008 ’ J. Virol. 82:432)及熟諳技藝人士之技巧 範圍内可設計此處所述之適當免疫原性功能部位落入於包 括得自天然env蛋白質（例如SEQ ID NO:3)所示之B、TH及/ 或CTL抗原上突所引述之15至100胺基酸殘基之範圍。較佳 包含於本發明組成物或藉本發明組成物所編碼之e n v部分 不包括任何源自於preSl及preS2區之免疫原性功能部位。 本發明涵蓋包含一個免疫原性功能部位之env部分以 及包含二、三或多個之env部分。 期望地，用於本發明之該一個或多個免疫原性功能部 位係選自於由下列所組成之組群： °自位置14-51延伸之env蛋白質（HBsAg)部分(env 1功 能部位）； 〇自位置165-194延伸之env蛋白質（HBsAg)部分(env 2 功能部位）； ◦自位置81-106延伸之env蛋白質（HBsAg)部分(env 3 功能部位）； 〇自位置202-226延伸之env蛋白質（HBsAg)部分(env 4 功能部位）；及 33 201106967 〇其任一種組合。 特別適合用於本發明之免疫原性功能部位包含，另外 其主要組成為或另外其組成為與SEQ ID ΝΟ:12-15所示胺 基酸序列具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較 佳至少90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳1〇〇% 相同度之胺基酸序列。 於本發明之上下文中，免疫原性功能部位之組合物可 呈於本發明之組成物中個別免疫原性功能部位之混合物形 式或呈任一種可能的排列兩個或多個免疫原性功能部位間 之同框架融合物形式（例如envl-env2、env2-envl、 envl-env3、env3-envl ' envl-env4、env4-envl、env2-env3、 env3-env2 ' env2-env4 ' env4-env2、env3-env4、env4-env3、 envl-env2-env3、env2-envl-env3、envl-env2-env4等之融合 物或混合物）。此外，組成物可包含單一複本或數個複本(例 如envl-env2-envl、envl-env4, envl 等）。各個免疫原性功能 部位間之融合物可直接或透過鏈接基。 本發明上下文中特別感興趣之env部分包含SEQ id NO:12-15所示兩個或三個免疫原性功能部位之融合物，特 別偏好envl-env2融合物包含，另外其主要組成為或另外其 組成為與SEQ ID NO:16所示胺基酸序列具有至少8〇%相同 度、優異地至少85%相同度、較佳至少9〇%相同度、更佳至 少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基酸序列；或 envl-env2-env4融合物包含，另外其主要組成為或另外其組 成為與SEQ ID NO:17所示胺基酸序列具有至少8〇%相同 34 201106967 度、優異地至少85%相同度、較佳至少9〇%相同度、更佳至 少95%相同度、及又更佳丨〇〇%相同度之胺基酸序列。 根據特定實施例，包含於本發明組成物或藉本發明組 成物編碼之聚合轉、核心及/或env部分可成對或全部一起同 框架融合。例如，涵蓋聚合酶部分及env部分於單一多肽鏈 之融合物。另外，core部分及env部分可於單一多肽鏈中同 框架融合。此處再度編碼核酸序列可直接或透過鏈接基融 合。優異地，env部分係同框架融合至核心部分或聚合酶部 分之C端。 核心部分與env部分之融合多肽之較佳實例係選自於 由下列所組成之組群： 0 —種多肽包含，或另外其主要組成為或另外其組成 為與SEQ ID NO:18(core*t-envl)所示胺基酸序列具有至少 80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少90%相同 度、更佳至少95%相同度、及又更佳1〇〇%相同度之胺基酸 序列； 〇—種多肽包含，或另外其主要組成為或另外其組成 為與SEQ ID NO:19(core*t-envl-env2)所示胺基酸序列具有 至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少9〇%相 同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度之胺基 酸序列；及 〇 —種多肽包含，或另外其主要組成為或另外其組成 為與SEQ ID NO:20(core-envl-env2-env4)所示胺基酸序列 具有至少80%相同度、優異地至少85%相同度、較佳至少 35 201106967 90%相同度、更佳至少95%相同度、及又更佳100%相同度 之胺基酸序列’或與始於殘基1及終於殘基251之SEQ ID NO:20所示胺基酸序列部分(core_envi_env2)，或與始於殘基 1及終於殘基221之SEQ ID NO:20所示胺基酸序列部分 (core-envl);或其core部分缺殘基77-84之已刪除版本。 於本發明之上下文中’本發明組成物所包含或編碼的 聚合酶部分、核心部分及/或env部分可進一步包含額外修 改。適當修改係有利於所得多肽之合成、處理、安定性及 溶解度(例如此處所示針對修改可能裂解位置、可能糖化位 置及/或膜錨定）以及有利於所得組成物之免疫原性（例如摻 混或融合一種或多種可提升免疫原性之化合物）。此等可提 升免疫原性之化合物已經敘述於參考文獻及包括但非限於 卡瑞提庫林(calreticulin)(Cheng等人，2001，J. Clin. Invest. 108:669)、結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)熱震蛋白 70(1^?70)((：1^11等人，2000，癌症研究60:1035)、泛素 (ubiquitin)(Rodriguez等人，1997，J· Virol. 71:8497)、細菌 性毒素諸如綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa)外毒素A之 轉位功能部位(ETA(dIII))(Hung等人，2001癌症研究61:3698) 以及T助手抗原上突諸如Pan-Dr胜肽(Sidney等人，1994，免 疫力 1:751)、pstSl GCG抗原上突（Vordermeier等人，1992， Eur· J. Immunol. 22:2631)，破傷風類毒素胜肽P2TT (Panina-Bordignon等人，1989，Eur. J. Immunol. 19:2237) 及P30TT(Demotz等人，1993，Eur· J. Immunol. 23:425)、流 行性感冒抗原上突（Lamb等人，1982，Nature 300:66)及血 36 201106967 1989 > Int. Immunol. 球凝集素抗原上突（Rothbard等人 1:479) 〇 核酸分子 編碼用於 此等核酸分子之 本發明也提供經單離之_分子獨立或組合 本發明之t合扭、核心及env部分以及包八 組成物。 其中特別關注者為： ^編碼如此處户斤述之聚合酶部分之㈣分子，特㈣ 好包3SEQIDN0:7、8、9中之任一者所示胺基酸序列或 SEQ m赚7所示胺基酸序列具有位置494以Asp殘基取代 His殘基及位置672以Glu殘基取代殘基者· 〇編碼如此處所述核㈣分之鋪分子，制偏好包 含SEQIDNO:1〇或π所示胺基酸序列者； 〇編碼如此處所述e n v部分之核酸分子，特別偏好包含 SEQIDNO:12-17中之任一者所示胺基酸序列者；及 〇編碼如此處所述已融合核心及env部分之核酸分 子’特別偏好包含SEQ ID NO:18、19或20中之任一者所示 胺基酸序列’或SEQ ID ΝΟ··20所示始於殘基1而終於殘基 251 之胺基酸序列部分(core_envi_env2)，或SEQ ID Ν〇·2〇 所示始於殘基1而終於殘基221之胺基酸序列部分 (core-envl)者；或缺SEQIDNO:20核心殘基77-84之其已刪 除部分。 較佳’本發明之核酸分子可經最佳化用來於特殊宿主 細胞或有機體例如哺乳動物、酵母（例如釀酒酵母 37 201106967 (Saccharomyces cerevisiae)、龐貝酵母（Sacchar〇myces pombe)或巴斯多比奇酵母（pichia past〇r.is))或細菌（例如大 腸和卤（E. coli)、枯草桿菌（Baciiius subtilis)或李斯特氏菌 (Listeria))提供高度表達。確實觀察到當多於一個密碼子可 供用來編碼給定胺基酸時，有機體之密碼子使用樣式為高 度非隨機(例如參考Wada等人，1992，核酸研究20:2111)， 及密碼子之利用於不同宿主間可有顯著差異（例如參考
Nakamura等人，1996，核酸研究24:214)。因本發明使用之 核苷酸序列大部分為病毒性來源(HBV)，其具有不適合於宿 主細胞諸如細菌細胞、低等或高等真核細胞有效表達的密 碼子使用樣式。典型地，藉編碼較常用的相同胺基酸之一 個或多個密碼子置換於關注的宿主細胞内部不常用的密碼 子相對應之一個或多個「天然」（例如Η B V)密碼子來執行密 碼子的最佳化。由於即使使用部分置換也可達成表達的增 高’故無需置換與不常用的密碼子相對應的全部天然密碼 子°此外，嚴格遵照最佳化密碼子使用之某些偏差可配合 將限剪位置導入所得核酸分子。 除了密碼子的使用最佳化之外，於宿主細胞或有機體 之表達可透過核苷酸序列之額外修改而進一步改良。例 如’本發明之核酸分子可經修改因而避免罕見的非最佳的 也碼子滅集而存在於集中區域及/或遏止或修改至少部分 負面序列元體’該等元體預期對表達程度造成負面影響。 此等負面序列元體包括但非限於具有極高（大於80%)或極 低(小於30%) GC含量之各區；AT-豐富或GC-豐富序列延伸 38 201106967 部；不安定之直接或顛倒重複序列；_匕次結構；及/或 内部加密調節元體諸如内部TATA_框、π位置、核糖體進入 位置、及/或剪接施體/受體位置。I發明之另—個實施例係 有關本發明之核酸分子片段，例如限剪核酸内切酶及PCR 產生之片段。此等片段可用作為編碼第—多肽及/或第二多 肽之免疫原性部分之探針、引子或片段。 根據本發明之較佳核酸分子係選自於由下列所組成之 組群·
〇 —種核酸分子包含與SEQ ID Ν0:21所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列（編瑪SEQ ID NO:7之 截頭Pol);
〇 —種核酸分子包含與SEQ ID N〇:22所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列（編碼SEQ ID NO:8之 突變Pol); 〇 —種核酸分子包含與SEQ ID N〇:21所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列，具有位置〖々go之〇取 代成C’位置2014之G核苷酸取代成c及位置2〇16之a核苷酸 取代成T(編碼SEQ ID NO:7之截頭ρ〇ι具有D54〇H及E718H 突變之取代）； 〇 —種核酸分子包含與SEQ ID Να23所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列（編碼SEq ID ν〇:9之 截頭及突變Pol-TMR); 〇 —種核酸分子包含與SEQ ID n〇:24所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列（編碼SEq id NO: 18 39 201106967 之core*t-envl); 〇 —種核酸分子包含與SEQ ID NO:25所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列（編碼SEQ ID NO: 19 之core*t-envl-env2);及
〇 —種核酸分子包含與SEQ ID NO:26所示核苦酸序 列（編碼SEQ ID NO:20之core-envl-env2-env4)，或與SEQ ID NO:26所示始於核苷酸1而終於核苷酸753之核苷酸序列部 分（編碼core-envl-env2)，或與SEQIDN0:26所示始於核苦 酸1而終於核苷酸663之核苷酸序列部分（編碼core_envi)具 有至少80%相同度之核苷酸序列；或缺乏SEQ ID NO:26自 位置229之G延伸至位置252之A該部分之已刪除版本（對應 於核心部分殘基77-84之刪除）。 本發明之核酸分子可使用技藝界可取得之序列資料及 此處提供之序列資訊生成。編碼各個HBV多肽之DNA序列 可藉習知分子生物學或PCR技術而直接單離自含HBV細 胞、cDNA及基因體存庫、病毒基因體或任何已知包括該等 DNA序列之先前技術載體；及該編碼DNA序列可經修改(例 如如此處所述）。另外，本發明之核酸分子也可於自動化程 序藉化學合成生成(例如自重疊寡核苷酸組裝，例如說明於
Edge ’ 1981，自然292，756 ; Nambair等人，1984，科學 223:1299 ; Jay等人，1984，J. Biol. Chem. 259:6311)。 本發明也提供包含一個或多個本發明之核酸分子之載 體及包含此等载體之組成物。 多種宿主-載體系統可用於本發明之上下文包括適用 40 201106967 於原核宿主有機體諸如細菌（例如大腸桿菌、枯草桿菌或李 斯特氏菌）表達之噬菌體、質體或黏端質體載體；適用於酵 母（例如釀酒酵母、龐貝酵母、巴斯多比奇酵母）表達的載 體；適用於昆蟲細胞系（例如Sf 9細胞）表達之病毒表達載體 (例如桿病毒）；適用於植物細胞系表達之病毒或質體表達載 體（例如Ti質體、花椰菜嵌紋病毒CaMV ;菸草嵌紋病毒 TMV);以及適用於高等真核細胞或有機體表達之質體及病 毒載體。此等載體大量敘述於參考文獻且為市面上可購得 (例如史翠吉（Stratagene)、阿默山生科（Amersham Biosciences)，波米加(Promega)等）。適當質體載體之代表 例包括但非限於pREP4、pCEP4(英維仇貞（Invitrogene))、 pCI(波米加）、pCDM8(Seed, 1987，自然 329，940)及 pMT2PC(Kaufman等人，1987 ’ EMBO J. 6:187)、pVAX及 pgWiz(基因治療系統公司（Gene Therapy System Inc); Himoudi等人，2002，J. Virol. 76:12735)。大量病毒載體也 可用於本發明上下文之多種病毒載體可衍生自多種不同病 毒(例如反錄病毒、腺病毒、AAV、疫病毒、范療病毒、麻 疹病毒、泡沫病毒、α病毒、水泡性口炎病毒等）。 特別關注有多項經文獻明確記載用於基因移轉或重組 株製造之優點的腺病毒載體(有關其综論請參考「基因治療 之腺病毒載體」，2002年，編輯D. Curiel及J. Douglas ’學術 出版社）。根據本發明使用之腺病毒載體可衍生自多個人類 來源或動物來源(例如犬、羊、猴腺病毒等）。任一種血清型 可用來特別偏好用於人腺病毒及特別偏好用於亞屬C諸如 41 201106967
Ad2(Ad2)、5(Ad5)、6(Ad6)、亞屬 B諸如 ll(Adll)、34(Ad34) 及35(Ad35)及亞屬 D諸如 19(Adl9)、24(Ad24)、48(Ad48)及 49(Ad49)。也可優異地使用動物Ad特別偏好用於chimP 八(1，諸如。11丨111卩八(13(?6〇^;1等人’2009’疫苗27:1293)及 chimp Ad63(Dudareva等人，2009 ’ 疫苗27:3501)。所引述 之腺病毒可得自美國種型培養收集會（American Type Culture Collection)(ATCC，馬里蘭州洛克維）或屬於多個公 開文獻之主題，描述其序列、組織及製法’允許技藝界人 士應用該等腺病毒(例如參考US 6,133,028 ; US 6，110,735 ; WO 02/40665 ; WO00/50573 ; EP 1016711 ; Vogels等人， 2003，J. Virol. 77:8263 ; WO00/70071 ; W002/40665 ; W02004/001032 ； W02004/083418 ； W02004/097016 ； W02005/010149)。 一個實施例中，本發明之腺病毒載體為複製缺陷。較 佳複製缺陷性腺病毒載體為E1-缺陷型（例如參考US 6,136,594及US 6,013,638)，具有自約位置459至3328或自約 位置459至3510延伸之E1刪除（參考揭示於基因存庫存取號 碼M73260及Chroboczek等人，1992，Virol. 186:280)之人腺 病毒5型序列）。選殖能力可進一步藉刪除腺病毒基因體之 額外部分改良（非必需E3區或其它必需E2、E4區之全部或部 分’敘述於W094/28152 ; Lusky等人，1998，J. Virol 72:2022)〇 本發明之核酸分子可插入腺病毒基因體之任何位置， 特別偏好插入置換E1區。相對於關注區之自然轉錄方向， 42 201106967 本發明之核酸分子可位在訊息方向或反訊息方向。 本發明之上下文中之其它適當病毒載體係衍生自痘病 毒（例如參考Cox等人，「人類基因治療之病毒」編輯j· M. Hos ’ Carolina學術出版社）。於本發明之上下文中，痘病毒 載體可得自痘病毒科之任何成員，特別為金絲雀痘病毒、 禽痘病毒及牛痘病毒，以後者為佳。適當牛疫病毒包括但 非限於哥本哈根(Copenhagen)種系（Goebel等人，1990，Virol 179:247及517 ; Johnson等人，1993，Virol. 196:381)、惠氏 (Wyeth)種系及改性女卡拉（Ankara)(MVA)種系（Antoine等 人，1998，Virol. 244:365)。組構重組痘病毒之一般條件為 技藝界眾所周知(例如參考EP 206 920 ; Mayr等人，1975， 感染3:6 ; Sutter及Moss，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847 ; US 6,440,422)。本發明之核酸分子較佳係插入於 痘病毒基因體的非必需位置。胸苷激酶基因特別適合插入 哥本哈根牛痘載體(Hruby等人，1983，Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:3411 ; Weir等人，1983，J. Virol. 46:530)及刪除II 或III適合插入MVA載體(Meyer等人，1991，J. Gen. Virol. 72:1031 ; Sutter等人，1994，疫苗 12:1032)。 本發明也涵蓋複合至脂質或聚合物之載體（例如質體 DNA)而形成粒狀結構諸如微脂粒、脂肪複體(lipoplexes)或 奈米粒子。此等技術為技藝界可得（例如參考Arangoa等 人，2003，基因治療，10:5 ; Eliaz等人，2002，基因治療 9:1230及Betageri等人，1993，「微脂粒藥物遞送系統」， Technomic出版公司）。 43 201106967 根據較佳實施例，本發明之載體包含呈適合於宿主細 胞或有機體表達之本發明之核酸分子，表示該核酸分子係 在適合該載體及/或宿主細胞之一種或多種調節序列的控 制之下。熟諳技藝人士了解調節序列之選擇可取決於宿主 細胞、期望表達程度等因素。 啟動子特別重要，可用於本發明上下文之適當啟動子 包括指導核酸分子於多種類型宿主細胞表達之組成性啟動 子，及指導核酸分子只有於某些宿主細胞(例如肝特異性調 節序列）或回應於特定事件或外生因素(例如溫度、營養物添 加、激素或其它配體）而表達之組成性啟動子。 適合用於哺乳動物細胞内組成性表達之啟動子包括但 非限於細胞巨病毒（CMV)緊接早期啟動子（Boshart等人， 1985，細胞41:521)、RSV啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、 磷酸甘油激酶(PGK)啟動子（Adra等人，1987，基因60:65)， 及疱疹病毒(HSV)-l之胸苷激酶(TK)啟動子。牛痘病毒啟動 子特別適合於痘病毒載體表達。代表性實例包括但非限於 牛痘7.5K、H5R、llK7.5(Erbs等人，2008，癌症基因研究 15:18)、TK、p28、pll及K1L啟動子，以及合成啟動子諸如 敘述於〇^1〇^531：1;丨等人（1997，生物技術23:1094，關聯卩5£/1^ 啟動子）、Hammond等人（1997，病毒學方法期刊66:135)及 Kumar及Boyle(1990，病毒學179:151)以及早期/晚期嵌合體 啟動子。肝特異性啟動子包括但非限於下列之啟動子： HMG-CoA還原酶(Luskey，1987, Mol. Cell· Biol. 7:1881);固 醇調節元體 1(SRE-1 ; Smith等人，1990，J. Biol. Chem. 44 201106967 265:2306);白蛋白（Pinkert等人，1987 ’ 基因 Dev. 1:268); 鱗酸烯醇丙S同酸叛基激酶（pEPCK)(Eisenberger等人， 1992，Mol. Cell Biol. 12:1396);人類C反應性蛋白（CRP)(Li 等人，1990’ J. Biol. Chem. 265:4136);人類糖激酶（Tanizawa 等人，1992,分子内分泌學6:1070);膽固醇7-α水解酶(CYP-7) (Lee等人，1994，J. Biol. Chem· 269:14681) ; oc-1抗腺蛋白 酶(Ciliberto等人，1985，細胞41:531);仿胰島素生長因子 結合蛋白（IGFBP-l)(Babajko等人，1993，BiochemBiophys. Res· Comm. 196:480);人類轉鐵蛋白（Mendelzon等人， 1990，核酸研究18:5717);膠原蛋等人， 1994 ’ J，ciin_ invest· 94:808)及FIX(US 5,814,716)基因。 熱諸技藝人士了解控制本發明之核酸分子表達的調節 兀體可進—步包含用於轉錄之適當起始、調節及/或終結（例 士 polyA轉錄終結序列）、mRNA轉運（例如核定位信號序 列）、處理(例如剪接信號）、及安定性(例如内含子及非編碼 5及3序列）、轉譯(例如起始子Met、三聯先導子序列、核 糖體° &位置、善恩-達佳莫（Shine-Dalgamo)序列等）至宿主 、田也及有機體及純化步驟(例如標籤)之額外元體。 根據本發明’編碼該聚合酶部分、該核心部分及/或該 env#刀之本發明之核酸分子可藉相同載體或至少二載體 (例如一或二個獨立載體)所攜載。如此本發明涵蓋一載體其 載有、爲馬忒聚合酶部分、該核心部分及該env部分之核酸分 子以及獨立載體，各自攜載編碼該聚合酶部分 、該核心部 刀及denv部分之核酸分子中之只有—者或二者。此等載體 45 201106967 也係由本發明以及包含此等載體之組成物提供。當使用不 同載體時，載體可得自不同來源或相同來源。例如，涵蓋 得自缺陷痘病毒（例如MVA)之一個HBV部分之表達及得自 另一種痘病毒載體（例如哥本哈根載體）之另二部分之表 達。舉例言之，可涵蓋一種組成物包含編碼聚合酶部分之 腺病毒載體及編碼核心及env部分之腺病毒載體。另外，自 不同病毒載體之表達（例如自腺病毒載體之聚合酶部分之 表達及自MVA之核心及/或env部分之表達，或反之亦然）也 適合用於本發明之上下文，以及自質體及病毒載體之HBV 部分之表達。 較佳本發明之實施例係針對選自於由下列所組成之組 群中之載體： (I) 一種MVA載體包含位在牛痘啟動子諸如7.5Κ啟動 子控制下之核酸分子，及編碼包含如SEQ ID ΝΟ:7、8或9 所不或SEQ ID ΝΟ:7具有位置494之Asp殘基取代成His殘基 及位置672之Glu殘基取代成His殘基所示之胺基酸部分之 聚合酶部分。較佳該核酸分子係插入MVA基因體刪除m。 (II) 一種MVA載體包含位在牛痘啟動子諸如pH5r$ 動子控制下之核酸分子，及編碼包含WSEqIDN〇:18419 所不胺基酸序列之核心部分及env部分。較佳該核酸分子係 插入MVA基因體之刪除m。 (in) —種E1-缺陷Ad載體包含在CMV啟動子控制之下 在E1區插入核酸分子，及編碼包含如SEq ID N〇:7、8或9 所不，或SEQ ID NO:7所示但有位置494之Asp殘基取代成 46 201106967
His殘基及位置672之Glu殘基取代成His殘基之胺基酸序列 之聚合酶部分。 (iv) —種E1-缺陷Ad載體包含在CMV啟動子控制下插 入核酸分子替代E1區，及編碼包含SEQ ID NO:18、19或20 所示或SEQ ID NO:20始於殘基1而終於殘基251之部分 (core-envl-env2)或SEQ ID NO:20始於殘基1而終於殘基221 之部分(core-en v 1)所示胺基酸部分之核心部分及env部分。 以及一種包含載體⑴及(ii)或(iii)及(i v)之組成物。 若有所需’本發明之載體或組成物可進一步包含一種 或多種轉移基因’例如欲連同本發明之核酸分子於宿主細 胞或有機體内表達的關注基因。期望地，轉移基因之表達 對HBV感染或由HBV感染所引發的或關聯的任何疾病或病 況具有治療活性或預防活性，或可提升本發明組成物之免 疫原性。適當轉移基因包括但非限於一種或多種額外 多肽/胜肽或編碼核酸分子諸如χ蛋白或其片段、免疫調節 因子諸如細胞激素（例如IL_2、IL_7、IL12、IL l5、il i8、 IL-21 IFNg)、細胞激素之融合物(諸如所述 者）或其編碼㈣分子⑽特财肖㈣統癌之自殺基 因產物或編碼核酸分子(諸如胞喊。定去胺酶(cd㈣、尿皆定 祕核糖基轉移酶(UPRTase)、Fcu_ i基因產物(敘述於w〇 "/誦)及欲祕㈣切fc)之其衍生物(敛述 於W02006/048768))。若使用轉移基因，則可以與本發明之 核酸分子中之任—者融合形式表達或在適當調節元體控制 之下獨立表達。又可插人本發日顿體之任何位置或插入獨 47 201106967 立載體其可組合本發明載體或本發明組成物使用。 於另一面相’本發明提供包含本發明之核酸分子或載 體之傳染性病毒粒子及包含此等傳染性病毒粒子之組成 物。 典型地’此等病毒粒子係藉一種方法製備，該方法包 含下列步驟： (a) 將本發明之病毒載體導入適當細胞系， (b) 於適當條件下培養該細胞系因而允許該傳染性病 毒粒子之製造， (c) 自該細胞系之培養回收所製造的傳染性病毒粒 子，及 (d) 選擇性地純化該已回收之傳染性病毒粒子。 當病毒載體為有缺陷時，傳染性粒子通常係用在互補 細胞系’或透過助手病毒的使用，其係與無功能病毒基因 呈反式供應。例如，用於補償E1_刪除之腺病毒載體之適當 細胞系包括293細胞(Graham等人，1997，J. Gen. Virol. 36, 59-72)及HER-96及PER-C6細胞（例如 Fallaux等人，1998，人 類基因治療學9，1909-1917 ; W097/00326)。適合繁殖痘病 毒載體之細胞為禽類細胞，及最佳為自受孕雞蛋所得雞胚 製備的一次雞胚纖維母細胞(CEF)。 傳染性病毒粒子可自培養上清液或溶解後的細胞回 收。其可根據標準技術進一步純化(層析術、於氣化铯梯度 超離心，例如敘述於W096/27677、W098/00524、 W098/22588、WO98/26048、WO00/40702、E1016700 及 48 201106967 WO00/50573)。 本發明也涵蓋已經修改來允許優先靶定於特定標靶細 胞之載體或病毒粒子（例如參考Wickam等人，1997，J. Virol. 71，8221-8229 ; Arnberg等人，1997，Virol. 227, 239-244 ; Michael等人，1995基因治療2，660-668 ; WO94/10323 ; WO02/96939及EP 1 146 125)。本發明之已靶定的載體及病 毒粒子之特性特徵為其表面存在有可辨識及結合至細胞及 表面暴露的組分諸如細胞特異性標記(HBV感染細胞）、組織 特異性標記(例如肝特異性標記）、及病毒(例如HBV)抗原之 配體。適當配體之實例包括針對HBV抗原功能部位之抗體 或其片段。細胞靶定可藉以基因方式將配體插入存在於病 毒表面上之多肽(例如腺病毒纖維、潘騰(pent〇n)、ρΙχ或牛 痘ρ14基因產物）進行。 本發明也係關於宿主細胞，其包含本發明之核酸分子 載體或傳染性病毒粒子以及包含此等宿主細胞之組成物。 於本發明之上下文中，宿主細胞包括原核細胞、低等真核 細胞諸如酵母、及其它真核細胞諸如昆蟲細胞、植物及哺 乳動物（例如人類或非人）細胞以及可互補本發明之複製缺 陷載體（例如腺病毒載體）的至少一項缺陷功能之互補細 胞’諸如293及PERC.6細胞。 根據本發明之特定實施例，宿主細胞可進一步經包 封。細胞包封技術先前曾經說明（Tresc〇等人，1992，ASΑΙ〇 J歐38，17-23 ; Aebischer等人，1996，人類基因治療7， 851-860)。 49 201106967 本發明之又另一面相為一種採用本發明之載體、傳染 性病毒粒子及/或宿主細胞製造重組聚合酶、核心及/或env 部分之方法。本發明方法包含(a)將本發明載體或傳染性病 毒粒子導入適當宿主細胞來製造已轉移感染或感染的宿主 細胞，（b)於適合宿主細胞生長之條件下，於試管内培養該 已轉移感染或已感染的宿主細胞，（c)自該細胞培養回收該 聚合酶、核心及/或env部分，及(d)選擇性地，純化已回收 之多肽。 預期熟諳技藝人士了解可供於適當宿主細胞製造HBV 部分之多個表達系統及將載體或傳染性病毒粒子導入宿主 細胞之方法。此等方法包括但非限於顯微注射（Capechi等 人，1980，細胞22:479)、CaP04媒介之轉移感染（Chen及 Okayama，1987，分子細胞生物學7:2745)、DEAE-葡聚糖 媒介之轉移感染、電穿孔（Chu等人，1987，核酸研究 15:1311)、脂質體轉染（lipofection)/微脂粒融合物（Feigner 等人，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:74113)、粒子撞 擊(Yang等人，1990，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 87:9568)、 基因搶、轉導、病毒感染以及透過多個手段直接投予宿主 有機體。 本發明載體可結合轉移感染試劑使用俾便協助載體導 入宿主細胞，諸如多陽離子性聚合物(例如曱殼聚糖、聚甲 基丙烯酸酯、PEI等）及陽離子性脂質（諸如DC-Chol/DOPE、 今曰得自波米加之轉移感染脂質體（transfectam lipofectin))。此外，如前文討論，重組DNA技術可用於改良 50 201106967 於宿主細胞或有機體之核酸分子表達，例如經由使用高複 本數目載體’取代或修改一個或多個轉錄調節序列（例如啟 動子、增強子等），最佳化核酸分子密碼子對宿主細胞的利 用率，及遏止可能使得轉錄本不穩定化之負面序列。 本發明之宿主細胞可於習知發酵生物反應器、燒瓶及 培養皿培養。培養可於適合給定宿主細胞之溫度、pH及氧 含量進行。未曾試圖詳細說明已知可用於原核細胞及真核 細胞製造蛋白質之多種方法之細節。 HBV部分可藉眾所周知之純化方法純化，包括硫酸敍 沈澱、酸萃取、凝膠電泳；過濾及層析方法（例如反相、尺 寸排除、離子交換、親和力、鱗酸纖維素'斥水性交互作 用、羥磷灰石、或高效能液相層析術。）使用之條件及技術 取決於多項因素諸如淨電荷、分子量、斥水性'親水性且 為熟諳技藝人士顯然易知。此外，純化度將取決於期望用 途。 於另-面相，本發明提供—種組成物包含本發明之聚 合酶、核心及/或env部分、編碼核酸分子、载體、料性病 毒粒子、或宿主細胞中之至少—者(此處也稱作「活性劑」） 或其任一種組合（例如編碼此處所述多種ΗΒν多肽之多肽 或載體/病毒粒子之組合物或不同基因型之組合物）。較佳該 組成物為藥學組錄，祕了治療上有效4之活性劑之外 也包含藥學上可接受之載媒劑。 本發明之組成物適合包含適合人類或動物使用之稀釋 劑。稀釋劑較佳為等張性、低張性或微弱 高張性及具有相 51 201106967 對低的離子強度。代表性實例包括無菌水、生理食鹽水(例 如氯化鈉）、林格氏溶液、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、漢 克氏溶液、及其它水性生理平衡鹽溶液(例如參考雷明頓·· 製為科學及貫務 ’ A· Gennaro，Lippincott，Williams & Wilkins之最新版本）。本發明組成物適合經緩衝俾適合以生 理pH或微驗性pH(例如自約pH 7至約pH 9)用於人體。適當 緩衝劑包括但非限於磷酸鹽緩衝劑(例如pB s )、碳酸氫鹽缓 衝劑及/或Tris緩衝劑。 組成物也含有其它用以提供適當藥學或藥效學性質之 藥學上可接受之賦形劑，包括例如修改或維持？]^、滲透度、 黏度、澄清度、色彩、無菌度、安定性、調配物之溶解速 率、修改或維持釋放或吸收入人體或動物體、促進跨血液 障壁的轉運或滲透入特定器官（例如肝臟）。適當賦形劑包括 胺基酸。 含括於本發明組成物之藥學上可接受之載媒劑必須也 允許於製造條件下及長期儲存（亦即至少丨個月）於冷凍（例 如-70°C、-2(TC)、冷藏(例如4。(：）或周圍溫度保有其安定性。 就此方面而言，特別適用於本發明組成物之調配物包括： 〇 1職糖，15〇 mM NaC1，i咖峋邙，％㈣吐溫 (Tw㈣8〇，K) mM Tris PH 8,5(特別活性劑為腺病毒載體 時），及
〇 10毫克/毫升甘露糖醇，1毫克/毫升HSA，20mM
Tris，pH 7.2，及 150 mM NaCl 〇生理食鹽水 52 201106967 此外，本發明組成物可包含適合於人體供系統性或黏 膜應用之輔劑。較佳，輔劑可刺激對本發明組成物之免疫 力，特別為例如透過類鐸受體(toll-like receptors)(TLR)諸如 TLR-7、TLR-8及TLR-9媒介之T細胞媒介的免疫力。有用的 輔劑之代表性實例包括但非限於礬土、礦油乳液諸如芙蘭 茲(Freunds)完全及不完全(IFA)、脂多醣或其衍生物(Ribi等 人’ 1986，細菌性内毒素之免疫原性及免疫藥理學，Plenum Publ. Corp·，NY, p407-419)、皂素類諸如 QS21(Sumino 等 人，1998，J. Virol. 72:4931 ; WO 98/56415)、咪唑-喹啉化 合物諸如咪喧莫特（Imiquimod)(Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43:S6)、S-27609(Smorlesi, 2005,基因治療 12:1324) 及相關化合物諸如WO2007/147529所述者、胞嘧啶磷酸鳥 苷寡去氧核苷酸類諸如CpG(Chu等人，1997，J. Exp. Med. 186:1623 ; Tritel等人，2003 ’ J. Immunol. 171:2358)及陽離 子性胜肽諸如 IC-31 (Kritsch等人 ’ 2005，J. Chromatogr Anal. Technol Biomed生命科學822:263)。 本發明組成物適合用於多項投藥模式包括系統性、局 部及侷限性投藥。注射可藉任一種手段進行例如皮下、皮 内、肌肉、靜脈、腹内、腫瘤内、血管内、動脈内注射， 或直接注射入動脈(例如藉肝動脈輸注）或靜脈進給肝臟(例 如注射肝門靜脈）。注射可使用習知針筒及針頭或或技藝界 可得之任何其它適當裝置進行。另外，本發明之組成物可 透過黏膜途徑諸如口服/營養、鼻内、氣管内、肺内、陰道 内或直腸内途徑投予。呼吸道投藥可透過小滴之霧化或喷 53 201106967 霧、噴霧劑或使用加壓容器之乾粉組成物(例如使用適當推 進劑諸如二氣二氟曱烷、丙烷、氮氣等）或於非加壓配送器 進行。局部投藥也可使用經皮裝置（例如貼片等）進行。於本 發明之上下文中’較佳組成物係調配供肌肉及皮下途#投 予。 本發明組成物可呈多種形式，例如固體、液體或冷凍。 固體(例如乾粉或凉·乾）組成物可藉一種涉及真空乾燥及束 乾之方法獲得。用於黏膜投藥，組成物調配成耐胃酸膠囊 劑及顆粒劑用於口服投予，栓劑用於直腸或陰道投予，最 終組合可用來增加黏膜孔隙大小之吸收促進劑。此等吸收 促進劑典塑為具有結構類似於黏膜之碟脂功能部位，諸如 去氧膽酸鈉、糖膽酸納、二甲基ϋ糊精、月桂基小溶鱗 月旨膽驗。 適當劑量可依各項參數之函數變化，特別投藥模式； 採用之組f宿主有基體之年齡、健康㈣、及重^症 狀之本質及程度；伴隨處理之類別；處理頻率；及/或預防 或治療需要。測定適當治療劑量所需計算之進—步微調例 行性可由執行業務人切於相關狀況決般原 則，包含病毒組成物之適當劑量依據所❹之載體及定量 技術而i自約_化物Ql3vp(財粒子(感 位)或㈣溶菌斑形成單位）。可用於評估存在於樣本切、 MPfu之數量技術為技藝界所習知。例如 目（vp)通常係經由測量A2 屈，位子數 量，免疫螢光測定，及pfu件 保由於δ午可細胞感染後經由 54 201106967 計數溶菌斑數目決r較佳根據FDA指導原則_比係低 於则。對以MVA為主之組成物以自約5χ丨〇5至約…_之 劑^佳，特佳為約Η)'約㈣7、約⑻或約知〇8_之 劑置。有關以Ad為主之Μ成物，較佳劑量含有自賴ό立約 ΙΟ、，特佳劑量為約1〇9,約如〇9、約1〇|〇、約5^〇1%? 或約W νρ。基於載體質體之組成物可克至減 克’較佳10G微克至2毫克之劑量投予。蛋白f組成物心 1〇微克至戰制之-劑❹予，特佳為自削成克 至約2毫克治療性蛋白質/千克體重。投予可以單劑進行或 於某個時間間隔後重複投予一次或數次。 本發明組成物可用於治療多種疾病及病理狀況，特別 為由HBV感染所引起的或相關的疾病及病况。如此處使用 處理」或「治療」專^涵盍預防及/或治療。特別可用於 治療HBV感染病人之HBV慢性感染及/或肝病灶，包括肝硬 化及肝癌。較佳當根據此處所述模型導入宿主有機體時， 本發明組成物對所治療的宿主比較治療前提供療效。療效 可藉多種方式證實，例如於感染個體之血液、血毅、血清 或肝臟檢測得HBV病毒負載量減少，及/或藉檢測抗HBV免 疫反應（例如抗HBV抗體的製造及/或Τ細胞媒介之免疫力） 或藉與HBV感染相關症狀之延遲（例如肝硬化或肝癌發展 延遲），或藉典型與HBV感染相關聯之肝發炎/脂肪變性/纖 維化病況的減少，或藉個體對習知療法之反應改善。 如此，本發明也涵蓋根據此處所述模型，本發明之HBV 部分、核酸分子、载體、傳染性病毒粒子、宿主細胞或組 55 201106967 成物中之至少一者用於製 染、Η B V相關疾病及病備圖用於治療或預防拙V感 理狀况之藥物之用途。 本發明也提供一種田# 染、贿相㈣疾病及感㈣別為慢性咖感 含對有需要之人類•物有^之治療或預防之方法，包 明之HBV部分、核酸分； ，、 量之本發 細胞或組成物中之至少1載體、傳染性病毒粒子、宿主 本發日狀紐Μ料H物则（1、2、3、4、 6 7、8、9、10等）治療上有效量之活性成分，投予彼 ^刀開適當係ΙΗ目同料祕或料同投藥途 如肌肉途徑結下途徑），於相同位置或於不陳置進行。 彼此刀隔3日至10日之三劑投藥（例如3劑每週投藥 合用於以MVA為主之組絲及載體。第-㈣投藥接著為 使用相同活性劑之-劑❹劑隨後投予，可進行—個月或 數月’因而喚起藉3劑連續投予所打底的抗hbv免疫反應。 至於以Ad駐之組成物及載體，較佳方法或㈣包括投予 一劑，最終接著於-個月及六個月後投予追加—劑或二劑。 若有所需，本發明之方法及用途可組合一種或多種習 知治療模型(放射線治療、化學治療及/或手術）。使用多種 治療辦法對病人提供更寬廣的介入。一個實施例中，本發 明方法之前或之後可接著手術介入。於另一個實施例中， 月j方或後方可藉著輕射治療(例如γ輻射）。熟諳技藝人士 容易調配有用之適當輻射治療方案及參數(例如參考 及Brady等人，1992，輻射腫瘤學之原理及實務，第2版， 56 201106967 JB Lippincott Co ;使用如熟諳技藝人士顯然易知之適當調 整及修改）。 又另一實施例中，本發明之方法及用途係關聯使用習 知用於治療或預防HBV感染、HBV相關疾病及病理狀況之 一種或多種HBV藥物之化學治療。其投藥可在用於本發明 之活性劑投予之前、同時或之後進行。HBV藥物之代表例 包括但非限於聚合酶抑制劑、RNase Η抑制劑、核苷類似 物、核苷酸類似物、TLR促效劑、Ν-糖化抑制劑、siRNA、 反訊息寡核苷酸、抗HBV抗體、免疫調節因子、治療性疫 苗及通常用於HBV相關肝癌治療之抗腫瘤劑（例如阿利亞 黴素（adriamycin)、帶有里匹歐朵（lipiodol)之阿利亞麥辛 (adriamicin)或索拉喜尼（sorasenib))。適當治療性疫苗之實 例包括但非限於重組抗原、VLP、特別適合用於觸發抗HBV 體液反應之基於或編碼HBV蛋白質之載體或合成胜肽 (Core、preSl、preS2、S及/或聚合酶）。此等HBV藥物可以 單劑提供’或另外根據標準方案 '劑量及計畫經歷數小時、 數曰及/或數週時間以多劑提供。根據本發明之特別適合之 方法及用途係組合標準照護，其可於本發明之方法或用途 之前、同時或之後進行。雖然此等照護標準係因病人而異， 但通常包含使用細胞激素(例如IFNa、pECHtJFNa2)及/或使 用核苦酸類似物或核苷類似物諸如拉美夫定、安提卡芙、 特比夫疋、阿迪佛芙、底匹佛席(dipiv〇xii)或特諾佛芙治療。 於另一個實施例中，本發明之方法或用途可根據打底 追加治療模型進行，包含循序投予一種或多種打底組成物 57 201106967 '種或夕種追加組成物。典型地，打底組成物及追加組 成物係^用不同載媒劑，其包含或編碼至少—種共通的抗 原吐功此指。❹卜，打底組㈣及追加組成物可藉相同 投予途位或藉不同投找徑於相同位置或不同位置投予。 舉〗0之以夕肽為主之組成物可藉黏膜途徑投予，而以 載體為主n成物較佳係藉注射投^，例如MVA載體藉皮 射NA質體藉肌肉注射及腺病毒載體藉皮下注射或 肌肉注射。 &本發明也提供-種於宿主有機體料或織抗HBV免 疫反應之;5τ,包含對該有機體投予本發明之HBV部分、 核^刀子、讀、傳染性赫粒子、宿主細胞或組成物中 之至少-者’因而誘導或刺激該免疫反應。免疫反應可為 特異性及/或非特異性’體液性及/或細胞性，於本上下文 中’可為CD4+媒介^CD8+媒介或二者，免疫反應較佳為 針對HBV抗原之τ細胞反應。 當投予動物或人類有機體時誘導或刺激抗HBv免疫反 應之本發明方法之能力可使用多種技藝界標準檢定分析於 忒官s式驗或活體試驗評估。有關評估免疫反應起點及活化 之技術之一般敘述例如參考C〇ligan等人（1992及1994，免疫 學之現行方案；編者約輪威利父子公司，美國國家衛生 院）。細胞性免疫力之測量可藉下述方式進行：藉測量由已 活化之效應物細胞所分泌之細胞激素側寫資料，包括衍生 自CD4+ T細胞及CD8+ T細胞者（例如藉ELIsp〇t定量IL-l〇 或IFNg-製造性細胞），藉測定免疫效應物細胞之活化狀況 58 201106967 (例如藉傳統[3 Η ]胸腺嘧啶之吸收進行τ細胞增殖檢定分 析）；藉檢定分析敏化個體之抗原特異性τ淋巴細胞（例如於 胞毒性檢定分析中之胜肽特異性溶解）。刺激體液反應之能 力可藉抗體結合及/或競爭而測定（例如參考Hari〇w，1989， 抗體，冷泉港出版杜）。本發明方法也可進一步於使用適當 傳染劑或腫瘤誘導劑（例如牛痘病毒或表達HBV基因產物 之李斯特氏菌單胞基因細菌）挑戰而於動物研究模型中進 一步證實來測定傳染劑或腫瘤誘導劑之中和，及最終對相 關聯症狀之部分抗性’反應抗HBV免疫反應之誘導或增 強。本發明組成物之測試及驗證也於隨附之實例章節舉例 說明。 於另一面相，本發明提供一種用於根據此處所述模型 治療或預防HBV感染包括慢性HBV感染、HBV相關疾病及 病理狀況特別係用於感染HBV個體誘導或產生免疫反應之 套件組，其中該套件組包含選自於由此處所述HBV部分、 核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞及組成物所 組成之組群之多種活性劑。期望多種活性劑係以分開多狀 或分開載體形式提供，及各種活性劑之投予可藉相同或^ 同投藥途徑及於相同位置（或緊密附近）或不同位置及使用 相同劑量或不同劑量同時(相同時間）或分開（於某個時間間 隔後循序）進行。 本發明特別關注一種套件組包含第一載體其包含編媽 如此處定義之聚合酶部分之核酸分子及第二載體其包含如 此處定義之編碼核心部分及/或env部分之核酸分子。 59 201106967 根據較佳實施例，該第一載體為一種MVA載體其包含 在牛痘啟動子諸如7.5K啟動子控制下之核酸分子，及編碼 包含如SEQ ID NO:7、8或9所示胺基酸序列或SEQ ID NO:7 帶有位置494之Asp殘基取代成His殘基及位置672之Glu殘 基取代成His殘基之胺基酸序列之聚合酶部分；及該第二載 體為一種MVA載體其包含位在牛痘啟動子諸如pH5r啟動子 控制之下之核酸分子及編碼包含如SEQ ID NO:18或19所示 之核心部分及env部分。 根據另一較佳實施例，該第一載體為腺病毒載體其包 含位在適當啟動子諸如CMV啟動子控制下之核酸分子及編 碼聚合酶部分其包含如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:7帶有位置494之Asp殘基取代成His殘基及位置672 之Glu殘基取代成His殘基所示胺基酸序列；及該第二載體 為一種腺病毒載體包含位在適當啟動子諸如cMV啟動子控 制之下之核酸分子，及編碼SEQ ID N〇:18、19或20或SEQ ID NO:20始於殘基i及終於殘基25丨部分(c〇re env i或 SEQ ID NO:20始於殘基丨而終於殘基221部分(c〇reenvl)所 示胺基酸序列。 本發明之套件組進-步包含表達如前文定義之免疫調 節因子之第三載體。用於舉例說明目的，包含於套件組之 各種活性齡讀㈣㈣料錢树明域物所述約 略相等’特佳對疫病毒載體或MVA载體為5_5至1〇9咖及 對各種腺病毒載體自約106至約10!2 Vp。 本發明也提供用於本發明選擇性結合至丽部分之抗 60 201106967 體或其胜肽片段。如此處使用，抗體當結合至標靶胜肽時 選擇性結合標靶胜肽而未顯著結合至不相關蛋白質。某些 情況下，須了解結合至胜肽之抗體儘管可能有某種程度之 交叉反應性但仍然具有選擇性。雖言如此，較佳本發明抗 體並未以高度親和力或高度選擇性結合至Η B V天然蛋白 質。 如此處使用，抗體係與技藝界認知者符合一致定義。 本發明抗體包括多株抗體及單株抗體，及此等抗體片段， 包括但非限於Fab或F(ab’）.sub.2及Fv片段。本發明抗體可使 用技藝界習知技術製造，例如對動物體投予有效量之此處 所述HBV部分中之任一者及/或其胜肽片段製造。抗體較佳 係製自包含獨特序列之HBV部分之各區或分開片段，諸如 針對導入天然HBV蛋白質之如此處所述改性序列。 本發明抗體具有落入於本發明範圍内之多項可能用 途。例如，此等抗體可使用（a)於檢定分析用作為檢測本發 明之第一或第二多肽之試劑，（b)於檢定分析用作為檢測生 物樣本中HBV病毒之存在之試劑，及/或(c)用作為自蛋白質 與其它污染物之混合物回收重組製造之Η B V部分之工具 (例如允許藉親和層析術或自培養的宿主細胞進行免疫沈 殿而純化）。 本發明亦係關於使用本發明之HBV部分、核酸分子、 載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞或組成物中之至少一者， 於取自於對由該HBV病毒所感染個體之生物樣本（例如血 漿、血清、組織）中檢測及/或定量HBV病毒或抗HBV抗體之 61 201106967 方法。 一個實施例中，該方法特別適合用於檢測及/或定量生 物樣本之HBV病毒，及包含下述步驟，於允許病毒與抗體 間之複體形成的條件下，將該生物樣本與本發明抗體中之 至少一者接觸，及藉適當手段檢測及/或定量該複體的形 成。 於另一個實施例中，該方法特別適合用於檢測及/或定 量生物樣本中之抗HBV抗體，及包含於允許該抗HBV抗體 與本發明之HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、 宿主細胞或組成物間之複體形成之條件下，將該生物樣本 接觸本發明之HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒 子、宿主細胞或組成物中之至少一者，及藉任一種適當手 段檢測及/或定量複體的形成。 熟諳技藝人士容易測定欲用於本發明方法之抗體、 HBV部分、核酸分子、載體、傳染性病毒粒子、宿主細胞、 組成物之數量。檢測及/或定量病毒之手段為例行性且為熟 諸技藝人士眾所周知舉例言之，值得—提者為墨點法、 ELISA、所謂之三明治技術、競爭技術、及pcR技術，特別 所謂之「即時」技術。本發明之抗體、HBv部分 子、載體、傳純病毒好、宿^胞、或組成物用^ 試劑:藉偶合(亦即物理性鏈接)可檢測物質協助。可檢測物 質之實例包括多種酶(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、卜 半乳糖《或乙_驗_)、假體群(例如鏈絲菌抗生物素 /生物素、或抗生物素/生物素）、螢光物質(例如繳_、螢 62 201106967 光素、或螢光素衍生物）、發光物質、生物發光物質（例如蟲 螢光素酶、蟲螢光素或水產螢光素(aequorin))，及放射性物 質（例如⑵卜⑶卜^、或3H)。 最後’本發明係關於本發明之HBV部分、核酸分子' 載體、傳染性病毒粒+、宿主細胞或組成物中之至少一者 用於試管内診斷生物樣本之HBV感染。 已經以舉例說明方式描述本發明，但須了解所使用之 術語意圖用作為字面描述性質而非限制性。顯然，鑑於前 文教示本發明之多項修改及變化為可能。因此須了解於隨 附之申請專利㈣内，本發明可以此祕別說明者不同之 方式實施。 刚文引述之專利案、公開文獻及資料庫登錄項目之揭 示全文係以引用方式併入此處至彷彿該等個別專利胺、公 開文獻或登錄項目係明確地且個別地指示以引用方式併入 此處。 圖式簡單說明 第1A-B圖顯示自腺病毒及MVA感染細胞之hbv多肽 表達。A549細胞或雞胚纖維母細胞以1〇或5〇感染腺病 毋或MOI 0.2或1感染MVA及感染後48小時細胞溶解。然後 使用彳于自感染各種Ad(第1A圖）及MVA(第1B圖）組構體之細 胞所得細胞溶解產物來檢測特異性HBV蛋白質。使用抗核 心抗體(C1-5或13A9’稀釋度1/200)及帶有抗p〇1抗體之含聚 合酶多狀(8D5 ’稀釋度1/200)作為一次抗體檢測含核心多 肽’及一次抗體係偶合至HRP。藉Ad TG17909及Ad 63 201106967 丁〇17910表達之蛋白質之期望大小分別為31.6)^〇3及88.5 kDa。藉 MVA TG17971、MVA TG17972、MVA TG17993及 MVA TG17994表達之蛋白質之期望大小分別為20.2 kDa、 15.8 kDa、20 kDa ' 及23.5 kDa。藉MVA TG17842及MVA TG17843表達之蛋白質之期望大小分別為88.5 kDa及98.2 kDa。 第2A-C圖顯示於Elispots IFNy檢定分析中藉腺病毒編 碼之HBV多肽之免疫原性。五頭小鼠(HLA-A2轉殖基因小 鼠)使用Ad TG17909單獨（黑柱）、Ad TG17910單獨（白柱）或 組合(Ad TG17909+Ad TG17910)(灰柱）免疫接種一次。第2八 圖顯示使用HLA-A2限剪胜肽SLY(SEQIDNO:55)或不相關 者（圖中未顯示）靶定於聚合酶蛋白質之特異性T細胞反 應。第2B圖顯示使用HLA-A2限剪胜肽FLP(SEQIDNO:56) 或ILC(SEQ ID NO:57)把定於核心蛋白質之特異性T細胞反 應。第2C圖顯示使用HLA-A2限剪胜肽VLQ(SEQ ID NO:58)、FLG(SEQ ID NO:59)或GLS(SEQ ID NO:60)靶定於 Env功能部位之特異性τ細胞反應。各柱表示個別免疫接種 小鼠，陰影柱表示各組之中值。結果顯示為得自三個重複 孔對1〇6脾細胞觀察得之點數平均值。若點數高於50點/1〇6 細胞，則反應視為陽性（此節點以粗黑線表示）。 第3A-C圖顯示於胞内細胞激素染色檢定分析中藉腺病 毒載體所編碼之HBV多肽之免疫原性。五頭個別小鼠 (HLA-A2轉殖基因小鼠）以AdTG17909(第3B圖）、 AdTG1791〇(第 3A圖）或 AdTG17909與 AdTG17910之組合物 64 201106967 (第3C圖）免疫接種一次。脾細胞與高爾基塞(G〇igi-PiUg)及 於各種HLA-A2限剪胜肽（SLY用於p〇i、FLP、ILC用於 Core，VLQ、FLG及GLS用於Env)或不相關者存在下培養5 小時。各種HLA-A2限剪抗原上突之特異性CD8+細胞製造 細胞激素（IFNg及/或TNFa)之百分比係藉ICS檢定分析評 估。各柱表示個別免疫接種小鼠，IFNg製造性細胞以黑柱 表示’ TNFa製造性細胞以白柱表示及iFNg+TNFa製造性細 胞以影線柱表示’及對各頭小鼠堆積全部此等細胞族群。 第4A-C圖顯示藉腺病毒載體編碼之HB V多肽誘導CD8 及CD4T細胞反應之能力，係藉胞内細胞激素染色檢定分析 檢測。五頭個別小鼠（HLA-A2轉殖基因小鼠）使用 AdTG17909與AdTG17910之混合物免疫接種一次。脾細胞 與高爾基塞及於各種HLA-A2限剪胜肽(SLY用於Po卜FLP、 ILC用於Core ’ VLQ、FLG及GLS用於Env)或涵蓋整個抗原 性功能部位之重疊胜肽匯集物（11個胺基酸重疊15aa，Core 有2胜肽匯集物及Env有2胜肽匯集物）或不相關胜肽存在下 培養5小時。感應的CD8 T細胞製造IFNy及/或TNFot(第4A圖） 及感應的特異性CD4 T細胞製造iFNy及/或TNFa(第4B圖） 或製造IFNy及/或IL2(第4C圖）係藉ICS檢定分析監視。各柱 表示個別免疫接種小鼠，IFNg製造性細胞以灰柱表示， TNFa或IL2製造性細胞以白柱表示及IFNg+TNFa或 IFNg+IL2製造性細胞以影線柱表示，各頭小鼠之全部此等 細胞族群堆積。也顯示各組之中值。 第5A-B圖顯示編碼HBV多肽之腺病毒載體誘導抗載荷 65 201106967 有HBV HLA-A2限剪抗原上突之標靶細胞的活體内功能性 細胞溶解。三頭小鼠（HLA-A2轉殖基因小鼠）各自以 AdTG 17909與AdTG 17910之組合物免疫接種一次(μ 1至M3) 及一頭小鼠以空白腺病毒載體免疫接種一次作為陰性對照 (M0)。得自同型基因小鼠載荷HBV HLA-A2抗原上突或否 (陰性對照）之經CFSE染色之脾細胞靜脈注射免疫接種小 鼠。染色細胞之活體内溶解係於流量細胞計量術後24小時 對各頭小鼠s平估’及如材料及方法章節之指示計算。對3頭 以AdHBV免疫接種之小鼠對各胜肽觀察得之特異性溶解平 均值經求出及顯示（平均M1-M3)。 第6A-B圖顯示藉Elispots IFNy檢定分析測定之由MVA 載體所編碼之HBV多肽之免疫原性。以1週間隔使用 MVATG17842 或 MVATG17843(第 6A 圖）或 MVATG17971(第 6B圖）或MVATG17972或陰性對照MVA TGN33.1 (資料未顯 示）免疫接種個別小鼠(HLA-A2轉殖基因小鼠）三次。第6A 圖顯示使用HLA-A2限剪胜肽SLY(SEQ ID NO:55)、涵蓋聚 合酶蛋白質C端部分之胜肽匯集物8(重疊u胺基酸/匯集物 之15胺基酸之25胜肽）、不相關胜肽或介質（陰性對照），以 MVA TG17842(深灰柱）或MVATG17843(淺灰柱）免疫接種 後靶定聚合酶蛋白質之特異性Τ細胞反應。第6Β圖顯示使用 HLA-A2 限剪胜肽 FLP(SEQ ID NO:56)、ILC(SEQ ID NO:57)、胜肽匯集物「核心1及核心2j (21至22個15胺基酸 胜肽重疊11胺基酸/匯集物）、不相關胜肽或介質（陰性對 照），以MVATG17971免疫接種後靶定於核心蛋白質之特異 66 201106967 性τ細胞反應。各柱表示個別免疫接種小鼠及影線柱表示各 組之平均。結果顯示為得自重複三個孔對1 〇6脾細胞觀察得 之點數平均值。若點數高於50點/1〇6細胞則反應視為陽性 (此截線以虛黑線表示）。 第7 A-C圖顯示於小鼠共同注射由μ VA載體所編碼之 HBV多肽之免疫原性，藉Elispots IFNy檢定分析測定。個別 小鼠（HLA-A2轉殖基因小鼠）使用MVATG17843與 MVATG17972 (第 7A 圖）或 MVATG17993(第 7B 圖）或 MVATGH994(第7C圖）之混合物或單獨使用MVA TG N33.1 作為陰性對照（資料未顯示）以一週間隔免疫接種三次。靶定 於聚合酶蛋白質之特異性T細胞反應係使用HLA-A2限剪胜 肽SLY(SEQIDNO:55)測定；及乾定於Env功能部位之特異 性T細胞反應係使用HLA-A2限剪胜肽GLS(SEQ ID NO:60) 或涵蓋Env2功能部位之胜肽匯集物（長15胺基酸之胜肽重 疊11胺基酸之匯集物）測定。不相關胜肽及介質用作為陰性 對照。各柱表示個別免疫接種小鼠及影線柱表示各組之平 均。結果顯示為自重複三孔對1〇6脾細胞所得點數之平均 值。若點數係高於92點/1〇6細胞則反應視為陽性（此截線以 虛黑線表示）。 C實施方式3 實例 1.材料及方法 後文描述之組構係根據詳細說明於Maniatis等人（1989 年’實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，紐約州冷泉港）之 67 201106967 一般經基因工程改造及分子選殖技術進行，或當使用商業 套件組時根據製造商之推薦進行。PCR擴增技術為熟諳技 藝人士已知（例如參考PCR方案-方法及應用指南，1990年， Innis、Gelfand、Sninsky及White公告，學術出版社）。載有 安比西林（ampicillin)抗藥性基因之重組質體係於補充1〇〇 微克/毫升抗生素之瓊脂或液體培養基上，於大腸桿菌 C600(史翠吉）複製。重組牛痘病毒之組構係根據前文引述 之參考文獻及Mackett等人（1982, Pn>c. Natl. Acad. Sci. USA 79，7415-7419)及Mackett等人（1984，J. Virol· 49，857-864) 該技術領域之習知技術進行。大腸桿菌（Falkner及Moss， 1988，J. Virol. 62，1849-1854)之選擇基因 gpt (黃嗓吟-鳥嗓 呤填酸核糖基轉移酶）用來協助重組牛痘病毒的選擇。 1·1·載體之組構及製造 1.1·1.所選擇之抗原及HBV序列種系 後文舉例說明之載體經過基因改造來表達包膜蛋白質 之聚合酶多肽、核心多肽及免疫原性功能部位。全部係源 自於ΗΒ V種系Υ07587 ’該序列係說明於國際資料庫（基因庫 Υ07587)及不同公開文獻。此乃血清型ayW之基因型d病毒。 核心多肽為野生型（aa 1-183)或刪除胺基酸77至84之核 心多肽（亦即含有標示為核心*之胺基酸丨至76及85至183之 核心）或C端截頭多肽（1_148)或進一步刪除胺基酸77至84之 C端截頭核心（1-148)(亦即含有標示為核心*t之胺基酸1至 76及85至148之核心）。 聚合酶多肽為野生型或缺頭47胺基酸(48-832)或N截頭 68 201106967 聚合酶(48-832)之N端截頭多肽，其進一步於位置540(D於 H)及718(E於H)突變（位置450及718分別係就野生型聚合酶 給定）或截頭(48-832)及突變聚合酶(D540H及E718H)，其係 融合至狂犬病病毒糖蛋白（P〇l*TMR)之胜肽信號及穿膜功 能部位。 所選Env功能部位為：S蛋白質之胺基酸14至51之功能 部位（Env 1)，及HBs蛋白質之胺基酸165至194之功能部位 (Env 2)，及HBs蛋白質之胺基酸202至226之功能部位（Env 4)。 1.1.2.表達截頭及突變HBV聚合酶(Pol*)之MVATG17842之 組構及製造 編碼已改性的HBV聚合酶多肽之核苷酸序列係由吉納 (Geneart)公司使用合成募核苷酸及PCR產物合成。已改性的 HB V聚合酶係與於位置540(D於H)及位置718(E於H)突變之 HBV Y07587(SEQIDNO : 1)之聚合酶蛋白質相對應，俾便 消除由天然HBV聚合酶所具有之Rnase Η及RTase活性（導 致SEQ ID NO : 8所示胺基酸序列及SEQ ID NO : 22所示核 苷酸序列）。然後重新組裝之Pol序列於質體載體選殖，獲得 PGA15-pol(SEQ ID NO : 27)。存在於天然HBV聚合酶N端 之頭47胺基酸刪除之截頭版本使用下列引子 OTG19037(GAGCGATATCCACCATGAATGTTAGTATTCC-TTGGAC)(SEQ ID NO ·· 28)及 OTG19038(GATCGCTAGC-TCACGGTGGTCTCCATGCGAC)(SEQ ID NO ： 29)自 pGA15-Pol質體藉PCR擴增。所得片段插入p7.5K啟動子下 69 201106967 游MVA轉移質體之Mie/及限剪位置（Cochran等人， 1985，J. Virol. 54 : 30)，結果獲得pTG17842。已突變且已 截頭的聚合酶於後文標示為P〇l*。 設計M VA轉移質體來允許將核苷酸序列插入於藉同源 組合刪除MVA基因體之III而轉移。MVA轉移質體係源自於 質體pTGlE(描述於Braun等人，2000,基因治療學7: 1447)， 其中選殖環繞MVA刪除III(Sutter及Moss，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. US A 89 : 10847)之旁出序列（BRG3及 BRD3)。轉 移質體也含在早期晚期牛痘病毒合成啟動子pllK7.5(由洛 桑大學，R. Wittek盛情提供）控制下，維多利亞水母 (A叫⑽rea Wcion‘a)加強的綠螢光蛋白質（eGFP基因，單離自 pEGP-Cl ’克隆泰(Clontech))及大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷 酸核糖基轉移酶(gpt基因）間之融合。黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核 糖基轉移酶之合成允許GPT+重組MVA於含有黴酚酸、黃嗓 呤及次黃嘌呤之選擇性培養基内形成溶菌斑（Falkner等
人 ’ 1988，J. Virol. 62，1849-54);及 eG/^允許重組MVA 溶菌斑變成可見。選擇標記系置於同向的二同源 序列間。當達成選殖純株選擇時，選擇標記容易藉未經選 擇之數代若干繼代培養去除’允許eGF尸-GPr重組MVA之生 長。 MVATG17842病毒之生成係經由於感染MVA且以 pTG 17 842轉感染（根據標準磷酸鈣DN a沉澱)之一次雞胚纖 維母細胞(C E F)進行同源重組而生成。病毒之選擇係藉於含 黴酚酸、黃嘌呤及次黃嘌呤之選擇性培養基存在下，藉三 70 201106967 回合溶菌斑純化執行。如前文說明，然後選擇標記經由於 非選擇性培養基繼代培養消除。藉PCR證實不存在有親代 MVA的污染。 HBV聚合酶之表達分析係藉西方墨點法進行。A549細 胞(ATCC (ΧΙ^185)於有或無蛋白體抑制劑MG-132(10pM) 添加至生長培養基存在下，於ΜΟΙ=1以MVATG17842(Pol*) 感染。經24小時後收穫細胞。西方墨點分析係使用市售單 株抗Pol抗體Hep B P〇l(8D5，聖塔克魯兹，# sc-81591)進行。 1·1·3·表達已截頭且已突變HBV聚合酶之MVATG17843融 合至狂犬病包膜糖蛋白之膜錨定功能部位之組構及製造 然後HBV Pol*序列之Ν端融合至胜肽信號(SS)，及C端 融合至衍生自狂犬病病毒糖蛋白（ERA單離株；描述於基因 庫號碼M38452)之膜錨定序列(TMR)。SS序列及TMR序列係 分別使用弓I子對OTG19045 (SEQ ID NO ： 30) (GAGTGATATCCACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG)/ OTG19047 (SEQ ID NO ： 31)(GTCCAAGGAATACTAACA-TTAATAGGGAATTTCCCAAAACACAATG)及 OTG19049 (SEQ ID NO ： 32) (GTCGCATGGAGACCACCGTATGTATT-ACTGAGTGCAGGG/OTG19050 (SEQ ID NO ： 33) (GAGTGCTAGCTCACAGTCTGGTCTCACCC) # PCR 自質 體pTG8042(說明於WO99/03885)擴增。Pol*序列係使用引子 對0丁019046 邮〇10!^0:34)(010'11^00八八八1'1^：0：丁-ATTAATGTTAGTATTCCTTGGACTA)/OTG 19048 (SEQ ID NO ： 35)(CTGCACTCAGTAATACATACGGTGGTCTCCAT- 71 201106967 GCGACGTGC)藉PCR自質體pGA15-Pol擴增。然後 SS-Pol*-TMR序列係使用下列引子〇tg19045 (SEQ ID NO : 30)及OTG19050 (SEQ ID NO : 33)藉三重PCR重新組 裝。所得片段插入ρ7·5Κ啟動子下游之牛痘轉移質體的； 及限剪位置（Cochran等人，1985，J. Virol. 54 : 30；)， 結果獲得PTG17843。 MVATG17843病毒之生成係經由前文說明之同源重組 於CEF進行。
Pol*-TMR表達之分析係藉西方墨點法進行。於有或無 蛋白體抑制劑MG-132(10pM)添加至生長培養基存在下， A549細胞使用MVATG17843於MOI 1感染。24小時後收穫細 胞。西方墨點分析係使用市售單株抗Pol抗體Hep B Pol(8D5，聖塔克魯茲，#sc-81591)進行。 1.1.4.表達已冊ij除核心多肽(Core*)之MVATG17971之組構 及製造
Core*係與已刪除胺基酸77至84之HBV Y07587(SEQ ID NO : 2)之Core序列相對應。
Core*編碼序列係藉雙重PCR自pGA4-Core質體重新組 成。此種質體係由吉納公司製造。該質體含有已改性的HBV Core基因之全長編碼序列，該序列係自合成寡核苷酸及/或 PCR產物組裝。編碼序列之末二密碼子CAA TGT係於CAG TGC改性來防止與p〇i(SEQ ID NO : 36)之序列同源。 自位置1至76之Core序列係使用下列引子 OTG19290(SEQ ID NO ： 37)(GACTGTTAACCACCATGG- 72 201106967 ACATTGATCCTTATAAAGAATTTG)及 OTG19292(SEQ ID NO ： 38)(GTTGACATAACTGACTACCAAATTACCACCCA-CCCAGGTAG)藉PCR擴增。自位置85至183之Core序列係使 用下列引子〇TG19291(SEQ ID NO : 39)(GTGGGTGGTAAT- TTGGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATG)及 OTG19080 (SEQ ID NO ： 61)(GACTCTCGAGTTAGCACTGAGATTCC-CGAGATTG)藉PCR擴增。雙重PCR係使用 OTG19290(SEQ ID NO : 37)及OTG19080(SEQ ID NO : 61)進行，二者後來 產生擴增子。所得片段插入pH5R啟動子下游牛痘轉移質體 之Xhol及Hpal限剪位置（Rosel等人，1986，J Virol. 60 : 436)，獲得pTG17971。 MVATG17971病毒之生成係如前文說明藉同源重組於 CEF進行。
Core*表達之分析係藉西方墨點法進行。雞胚纖維母細 胞於MOI 0.2感染MVATG17971。24小時後，收穫細胞。西 方墨點分析係使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg (13A9)(聖塔克魯茲，# sc-23946)。 1.1.5.表達已刪除且已截頭Core多肽(Core*t)之MVATG17972 之組構及製造
Core*t係與胺基酸148之後截頭及胺基酸77至84刪除之 HBVY07587(SEQIDNO : 2)之Core序列相對應。
Core*t編碼序列係藉雙重PCR自pGA4-Core質體重新 組成’該序列含有編碼全長HBVCore基因之編碼序列，該 基因係自合成募核苷酸及PCR產物組裝，但於CAG TGC之 73 201106967 編碼序列的末二密碼子CAA TGT經修改來避免與Pol(SEQ ID NO : 36)序列同源。 自位置至76之Core序列係使用下列引子 OTG19290(SEQ ID NO ： 37)(GACTGTTAACCACCATGGA-CATTGATCCTTATAAAGAATTTG)及 OTG19292(SEQ ID NO ： 38)(GTTGACATAACTGACTACCAAATTACCACCCA-CCCAGGTAG)藉PCR擴增。自位置85至148之Core序列係使 用下列引子OTG19291(SEQIDNO:39)(GTGGGTGGTAAT-TTGGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATG)及 OTG19299 (SEQ ID NO ： 40)(GACTCTCGAGTTAAACAGTAGTCTCC-GGAAGTG)自pGA4核心藉PCR擴增。雙重PCR係使用 OTG19290(SEQ ID NO : 37)及OTG19299(SEQ ID NO : 40) 進行。所得片段插入pH5R啟動子下游之牛痘轉移質體的 ATw/及Ηρα/限剪位置（Rosel等人，1986, JVirol. 60: 436)， 獲得PTG17972。 MVATG17972病毒之生成係如前文說明藉同源重組於 CEF進行。
Core*t表達之分析係藉西方墨點進行。雞胚纖維母細胞 於MOI0.2感染MVATG17972。24小時後，收穫細胞。使用 市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯茲，# sc-23946)進行西方墨點分析。 1.1.6.表達已刪除且已截頭core多肽融合至Envl免疫原性 功能部位(Core*t-envl)之MVATG17993之組構及製造
Core-t*部分融合至Envl功能部位自HBs蛋白質之胺基 74 201106967 酸14延伸至51。
Core*t-Envl序列係藉雙重PCR重新組構。Core*t序列 係使用下列引子OTG19317(SEQ ID NO ： 41) (GACGGGATCCACCATGGACATTGATCCTTATAAAGAA-TTTGG)及 OTG19319(SEQ ID NO : 42) (GCCTGCTTGC-AGGACAACAGTAGTCTCCGGAAGTGTTG)藉 PCR 自 pTG17972擴增。Envl序列係使用下列引子OTG19318(SEQ ID NO： 44)(CCGGAGACTACTGTTGTCCTGCAAGCAGGC-TTCTTC)及OTG19320(SEQ ID NOMSXGAGTCATTCTCGA-CTT-^^^^^TTACTGACCCAGGCAAACCGTGG) 藉 PCR 自質體pMK-C/E(SEQ ID NO : 43)擴增。使用 OTG19317 (SEQ ID NO : 41)及OTG19320(SEQ ID NO : 45)進行雙重 PCR。所得片段插入pH5R啟動子下游之牛痘轉移質體之 fiam///及限剪位置（Rosel等人，1986，J Virol. 60 : 436)， 獲得 pTG 17993。 用於舉例說明目的，藉吉納製造質體pMK-C/E，含有 由三個HBV env功能部位序列插入核心序列所組成之嵌合 體序列（SEQ ID NO : 43)。天然核心及env核苷酸序列經簡 併來避免與HBV Pol序列之序列同源性，也避免因p〇lyT或 polyGC拉伸之序列不安定。此外，核心序列係刪除胺基酸 77至84及於aal48截頭。所選的Env功能部位為：自S蛋白質 胺基酸14至51之功能部位(Env 1)，及自S蛋白質胺基酸165 至194之功能部位(Env 2)，及S蛋白質胺基酸202至226之功 能部位(Env 4)。三個功能部位分別插入核心序列之位置nt 75 201106967 127、nt 222及nt 416。此種序列插入MVA載體，結果導致 表達細胞之細胞毒性，強調env-core融合設計並非直捷。 MVATG17993病毒之生成係如前文說明藉同源重組於 CEF進行。
Core*t-envl表達之分析係藉西方墨點進行。雞胚纖維 母細胞於MOI 0.2感染MVATG17993。24小時後，收穫細 胞。使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯 茲’ #sc-23946)進行西方墨點分析。 1.1.7·表達已刪除且已截頭Core多肽融合至Envl及Env2免 疫原性功能部位（Core*t-envl-env2)之MVATG17994之組構 及製造 1.1.5說明之Coren多肽然後融合至自HBs蛋白質之胺 基酸14延伸至51(Envl)及自胺基酸165延伸至194(Env2)之 兩個免疫原性功能部位。 編碼Core*t-Env 1-Env2之核苷酸序列藉三重PCR重新 組裝。Core*t序列使用下列引子OTG19317(SEQ ID NO : 41) 及OTG19319(SEQ ID NO : 42)藉PCR 自 pTG17972擴增。 Envl使用下列引子OTG19318(SEQ ID NO:44)及OTG19322 (SEQ ID NO ： 46)(GCGTGCGCTTGCCCACTGACCCAGG-CAAACCGTGG)自pMK-C/E質體擴增。Env2使用下列引子 OTG19321(SEQ ID NO ： 47)(CGGTTTGCCTGGGTCAGTG-GGCAAGCGCACGCTTTAGC)及OTG19323(SEQ ID NO:48) (GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTTACACGCTCAGC-CACACGGTTGG)自pMK-C/E質體擴增。三重PCR係使用 76 201106967 OTG19317(SEQ ID NO : 41)及OTG19323(SEQ ID NO : 48) 進行。所得片段插入pH5R啟動子下游之牛痘轉移質體之 及iVai/限剪位置（R0Sel等人，1986，J Virol. 60 : 436)， 獲得pTG17994。 MVATG17994病毒之生成係如前文說明藉同源重組於 CEF進行。
Core*t-envl-env2表達之分析係藉西方墨點進行。雞胚 纖維母細胞於MOI 0.2感染MVATG17994。24小時後，收穫 細胞。使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9，聖塔克 魯茲，# sc-23946)進行西方墨點分析。 1 · 1 · 8 ·表達 CORE-Env 1 -Eiw2-Env4 之腺病毒載體 AdTG 17909 之組成及製造 編碼CORE-Env 1 -Env2-Env4融合之合成基因（831核苷 酸）係藉雙重PCR重新組成。CORE係使用下列引子 OTG19152(SEQ ID NO ： 49)(GGGGGGCTAGCAAGCTTCC-ACC ATGGAC ATTG ATCCTTATAA AGAATTTG)及 OTG19154 (SEQ ID NO： 50)(GAAAGAATCCAGCTTGCAGGACGCAC-TGAGATTCCCGAGATTGAG)藉 PCR 自 pGA4-Core(描述於 1.1.4.)擴增。Envl-Env2-Env4係使用下列引子OTG19153 (SEQ ID NO ： 51)(CTCAATCTCGGGAATCTCAGTGCGTC-CTGCAAGCTGGATTCTTTC)及OTG19159(SEQ ID NO: 52) (GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTTAGATATAAACCC-ACAAGC)藉PCR自pGA4-Env擴增。雙重PCR係使用 OTG19152(SEQ ID NO : 49)及OTG19159(SEQ ID NO : 52) 77 201106967 進行。所得片段插入含有由腺病毒序列（分別為腺病毒核苷 酸1-454及核苷酸3513-5781)環繞的CMV驅動表達卡匣之腺 病毒穿梭質體的W/ie/及iVoi/限剪位置來允許藉同源重組產 生載體基因體(Chartier等人，1996，J. Virol. 70 : 4805)。所 得腺病毒載體PTG17909為E3(核苷酸28593-30464)及E1(核 苷酸455-3512)經刪除，E1區係由表達卡匣置換，自5,至3,， 該表達卡匣含有CMV緊接早期增強子/啟動子、嵌合體人類 β-球蛋白/IgG插入序列（出現於得自波米加及pci載體）、編 碼〇〇1^-£1^1-£1^2七1^4之序列及3乂40晚期聚腺苷化信 號。重組腺病毒係經由PacI線性化病毒基因體轉染至E1互 補細胞系而生成。病毒繁殖、純化及滴定係如前文說明進 行(Erbs等人，2000，癌症Res. 60 : 3813)。 融合蛋白質之表達係藉西方墨點法評估。1〇ό A549細 胞(ATCC CLL-185)於 MOI=1〇 或 50 以 AdTG17909感染 48 小 時，或具有空白腺病毒作為陰性對照。細胞丸粒經收集及 使用抗CORE小鼠單株抗體(Cl-5，sc-23945，聖塔克魯茲） 探測。 1.1.9.表達Pol*之腺病毒載體AdTG17910之組構及製造： 編碼Pol*之基因乃截頭前47胺基酸之聚合酶蛋白質， 但Met起始子(48至832)除外及於位置540(D於H)及718(E於 H)突變(相對於野生型聚合酶），此種基因插入腺病毒載體。 Pol基因（2364核苷酸）係使用引子〇T19155(SEQ ID NO : 53)(GGGGGGCTAGCAAGCTTCCACCATGAATGTTAGTAT TCCTTGGACTCATAAG)及 OTG19156(SEQ ID NO : 54) 78 201106967 (GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTCACGGTGGTCTC-CATGCGACGTGC)藉 PCR 自 pGA15-Pol(說明於 ι·ι·2)擴 增。所得片段插入含有由腺病毒序列（腺病毒核苦酸1 -454 及核苷酸3513-5781分別）環繞的CMV驅動表達卡匣之腺病 毒穿梭質體的及yv〇i/限剪位置來允許藉同源重組產生 載體基因體(Chartier等人，1996，J. Virol. 70 : 4805)。所得 腺病毒載體PTG17910為E3(核苷酸28593-30464)及E1(核苷 酸455-3512)經刪除，E1區係由表達卡匣置換，該表達卡匣 自5’至3’，含有CMV緊接早期增強子/啟動子、嵌合體人類β_ 球蛋白/IgG插入序列（出現於得自波米加及pCI載體）、編碼 已截頭且已突變Pol之序列及V40晚期聚腺苷化信號。重組 腺病毒係經由尸ac/線性化病毒基因體轉染至E1互補細胞系 而生成。病毒繁殖、純化及滴定係如前文說明進行(Erbs等 人，2000，癌症Res. 60 : 3813)。 融合蛋白質之表達係藉西方墨點法於腺病毒感染細胞 評估。A549細胞（106細胞）(ATCC CLL-185)於MOI=10或50 以AdTG17910感染48小時，及具有空白腺病毒作為陰性對 照。細胞丸粒經收集及使用抗P〇1小鼠單株抗體（8D5， sc-81591，聖塔克魯茲)探測。 1 ·2.抗原免疫原性之評估 抗原之免疫原性係於HLA轉移基因小鼠免疫接種後藉 Elispot IFNy及胞内細胞激素染色（ICS)檢定分析於活體内 評估。 1.2.1.小鼠模型 79 201106967 用於研究的HLA-A2.1轉移基因小鼠係如pasc〇i〇等人 (1997，J. Exp· Med. 185 : 2043)說明。此等小鼠具有H-2Db 及小鼠β2-微球蛋白基因已經被剔除且表達轉移基因單鍵組 織相容性I類分子(HHD分子），其中人β2ηι之C端係共價鏈結 至嵌合體重鏈之Ν端（HLA-A*0201 ctl-a2、H-2Db、α3穿膜 及胞質内功能部位）。7週齡至10週齡小鼠（雄及雌)經免疫接 種。小鼠平均體重約為25克至30克。 1.2.2. 免疫接種方案 小鼠分成4組：第1組藉AdTG17909(編碼HBV Core融合 至envl、env2及env4免疫原性功能部位）、第2組免疫接種 AdTG17910(編碼已截頭且已突變之P〇l*)、第3組免疫接種 兩種載體，及第4組免疫接種空白腺病毒(AdTG15149)作為 陰性對照。全部動物皆係於尾巴基部藉皮下注射免疫接 種，第1組及第2組動物接受一針皮下注射1〇8 IU個別腺病毒 (TG17909或TG17910)，第3組接受一次皮下注射含l〇8IU各 種腺病毒之混合物（總計2.108 IU : 108 IU AdTG17909 + 1〇8 IU AdTG17910);及陰性對照組接受一次皮下注射2.108 IU AdTG15149。細胞免疫反應係於免疫接種後2週藉IFNg Elispot及胞内細胞激素染色(ICS)檢定分析評估。 1.2.3. 胜肽 於試管内用於細胞刺激之胜肽為描述為或預測為 HLA-A2限剪抗原上突之9至10胺基酸等短胜肽；或包括於 涵蓋全部關注抗原之胜肽存庫的15胺基酸長胜肽。 所述或所預測聚合酶蛋白質、核心蛋白質或Env功能部 80 201106967 位之HLA-A2限剪抗原上突之短胜肽係藉優洛吉尼 (Eurogentec)(比利時）合成，及1〇 濃度溶解於ι〇〇% DMSO(西格瑪（Sigma)，D2650)。 涵蓋全體聚合酶、核心及包膜蛋白質的胜肽存庫係藉 普洛艾沐(Prolmmune)(英國牛津）合成。P〇1、core及Env存 庫係由重疊11胺基酸之15元體胜肽所組成。各粗產物胜肽 係以50毫克/毫升濃度溶解於1〇〇% DMSO(西格瑪， D2650)。對各存庫，胜肽係匯集至2毫克/毫升/胜肽濃度： HBV Pol蛋白質係由得自ρ〇ι存庫之8個24至25胜肽匯集 物所涵蓋（匯集物1 : 24胜肽涵蓋殘基45至151 ;匯集物 2 : 24胜肽涵蓋殘基140至251 ;匯集物3 : 24胜肽涵蓋殘 基241至347 ;匯集物4 : 24胜肽涵蓋殘基337至447 ;匯 集物5 : 24胜肽涵蓋殘基437至543 ;匯集物6: 24胜肽涵 蓋殘基533至639 ;匯集物7 : 24胜肽涵蓋殘基629至735 ; 匯集物8 : 25胜肽涵蓋殘基725至832); HBV Core蛋白質係由得自c〇re存庫之2個21-22胜 肽匯集物所涵蓋（匯集物1 : 22胜肽涵蓋殘基1至 100 ;匯集物2 : 21胜肽涵蓋殘基89至183); HBV Env蛋白質係由得自Env存庫之3個6至10胜肽 匯集物所涵蓋（匯集物1 : 1〇胜肽涵蓋HBS殘基9至 59 ;匯集物2 : 9胜肽涵蓋HBS殘基157至194 ;匯集 物4 : 6胜肽涵蓋HBs殘基193至226)。 1.2.4. IFNg Elispot檢定分析 得自免疫接種小鼠之脾細胞經收集，紅血球經溶解（西 81 201106967 格瑪，R7757)。2.105細胞/孔於被覆以抗小鼠ΙΡΝγ單株抗體 (BD生科公司（BD Biosciences) ; 10微克/毫升，551216)之多 重篩檢（Multiscreen)孔板（密利波公司（Millipore)，MSHA S4510)，於MEM培養基（吉伯克(Gibco)，22571)重複三次培 養40小時，該培養基補充以10% FCS(西格瑪，F7524或 JRH，12003-100M) ’ 80單位/毫升青黴素(penicillin)/80微克 /毫升鏈黴素(streptomycin)(PAN，P06-07-100)，2 mM L-麵 胺（吉伯克，25030)，IX非必需胺基酸（吉伯克，11140)，1〇 mM Hepes(吉伯克，15630)，1 mM丙酮酸鈉（吉伯克，31350) 及50 μΜ β-髄乙醇（吉伯克，31350)及於10單位/毫升重組鼠 IL2(佩普洛泰(Peprotech)，212-12)存在下單獨用作為陰性對 照進行，或具有： _ ΙΟμΜ—種HAL-A2限剪胜肽存在於由Ad載體所編碼 之HBV抗原（SLY於P〇卜 FLP、ILC用於Core ; VLQ、 FLG及GLS用於Env)或不相干者； -胜肽匯集物，終濃度5微克/毫升胜肽 -5微克/毫升刀豆球蛋白a(西格瑪，C5275)用於陽性對 照。 如前文說明（Himoudi等人，2002, J. Virol. 76: 12735)， IFNg生產性T細胞係藉Elisp〇t(細胞激素特異性酶聯結免疫 墨點法)檢定分析定量。陰性對照孔之點數(與IFNg生產性τ 細胞相對應）係自含HBV雖之實驗孔中檢測得的點數扣 除。結果顯示騎三次重觀所得平均值^對觀察得之反 應（或截取值)之實驗陽㈣界值，其料算係與單獨使用培 82 201106967 養基所得點數平均值+2標準差相對應，報告為1〇6細胞。聯 結CTL Ehspot讀取器之技術截取值也定義為5〇點π〇6細胞 (其為高於該數值時讀取器2CV為系統性小於2〇%)。技術 截取值與對實驗計算得之實驗臨界值間之最高值取用來考 慮界定各實驗之截取值。使用Mann-Whitney測試進行 Elispot反應之統計分析。等於或劣於〇 〇5之!5值被視為顯著。 1.2.5.胞内細胞激素染色(ICS)檢定分析 對得自各組各頭動物的脾細胞進行ICS。使用溶解緩衝 液（西格瑪’ R7757)於紅血球溶解後，平底96孔孔板内每孔 2xl06細胞於完全α MEM培養基（吉伯克BRL，22571)於10 單位/毫升鼠重組IL-2(佩普洛泰，212-12)培養，該培養基可 單獨用作為陰性對照，或含有1〇μΜ特異性HBV胜肽或含有 終濃度5微克/毫升/胜肽之胜肽匯集物，或含有1〇μΜ不相關 胜肽。高爾基塞(BD生科公司，555029)以1微升/毫升終濃 度即刻添加經歷5小時。然後細胞收穫於V字形底96孔孔 板，及以1% FCS-PBS洗滌。於室溫使用抗CD3(倉鼠MAb anti-CD3e-PE，稀釋度 1/200)、CD8(大鼠MAb anti-CD8a-APC，稀釋度 1/600)及CD4(大鼠MAb anti-CD4-PerCP，稀釋 度1/600)之單株抗體（全部皆係得自BD生科公司，分別為 553063，553035及553052)於50微升 1% FCS-PBS進行染色 15分鐘。洗滌後，細胞經固定及使用赛托菲（Cytofix)/賽托 潘（Cytoperm)滲透，及使用潘/瓦汐（Perm/Wash)溶液(BD生 科公司，554714)洗滌。然後，抗小鼠1FNg-pE抗體(BD生科 公司，554412557724)及及抗小鼠TNFa-Alexa488抗體(BD生 83 201106967 科公司，557719)或抗小鼠IFNg-PE抗體（BD生科公司， 554412557724)及抗小鼠IL2-Alexa488抗體（BD生科公司， 557719)於室溫添加歷時15分鐘，使用潘/瓦汐洗滌後，細胞 再懸浮於1% FCS-PBS，及使用費克凱利伯（FacsCalibur)(貝 克敦狄金森公司（Becton Dickinson))藉細胞流量計分析。 CE3e+、CD8a+細胞或CD3e+、CD4+細胞經閘控來測定 IFNg+CD8+ 或 IFNg+CD4+T 或 TNFa+CD8+ 或 TNFa+CD4+T 或 IL2+CD8 或 IL2 CD4+T 或 IFNg+TNFa+CD8+ 或 IFNg+ TNFa+CD4 或 IFNg+IL2+CD8+ 或 IFNg+IL2+CD4+T 細胞族 群之百分比。只有培養基所得百分比視為背景值。 1.2.6.活體内CTL檢定分析 活體内CTL檢定分析係如所述進行(Fournillier等人， 2007)。脾細胞懸浮液係得自同基因型小鼠脾臟，於紅血球 溶解後調整至20xl06細胞/毫升。三分之一細胞係與HBV特 異性胜肽中之一者共同培養，三分之二細胞係與另一種 HBV胜肽共同培養，全部皆係於37°C於1〇μΜ終濃度培養1 小時，而最末選分保持未加脈衝。5(6)-羧螢光素二乙酸丁 二酿亞胺S旨（CFSE)(分子探針(Molecular probes)，C1157)係 以16pM(CFSE-高）添加至未加脈衝之細胞，於4pM(CFSE-中）添加至ILC或VLQ胜肽脈衝化細胞，及以ιμΜ (CFSE-低） 添加至SLY或FLP胜肽脈衝化細胞歷時10分鐘。使用pBs洗 滌後，混合三個族群（未加脈衝、ILC及SLY胜肽脈衝化細 胞；或未加脈衝、FPL及ILC胜肽脈衝化細胞）經混合，30.106 總細胞透過框後靜脈注射而麻醉小鼠（使用K他命 84 201106967 (ketamine)-西拉金(xylazin)-PB S 混合液(K 他命(Ketamine)維 巴克(Virbac)，仙查維(Centravet) KET204，終濃度25毫克/ 宅升；西拉金鹽酸鹽隆龐(Rompum)拜耳(Bayer)，仙查維， 終濃度5毫克/毫升)）。如此，CFSE-低及中族群表示提示為 可藉胞毒性T細胞溶解之特定標靶，CFSE-高族群為内部參 考，允許檢定分析標準化。得自接受之小鼠脾細胞於24小 時後藉細胞流量計分析來檢測CFSE標記的細胞。於淋巴細 胞(SSC-FSC)閘控後，基於事件/CFSE螢光(FL1)數目進行第 二閘控’顯示3峰，第一峰對應於CFSE-低細胞，第二峰對 應於CFSE-中細胞，及第三峰對應於CFSE-高細胞。各頭動 物計算CFSE+胜肽脈衝化標靶與CFSE+未加脈衝化標靶間 之比（R=CFSE-低細胞數目/CFSE-高細胞數目）。二頭本地小 鼠用來測定R參考。各頭動物之特異性溶解百分比係藉下式 測定.％溶解=(1-R,i、a_/R參考）X 1〇〇。若特異性溶解百分比高 於10%(截取值）則該反應被視為陽性。 2.結果 2.1.精病毒載體之抗原表達 2·1_1·自腺病毒組成體AdTG17909及AdTG17910之抗原表達 Core-env 1 -env2-env4融合蛋白質之表達係藉西方墨點 法評估。A549細胞（106細胞）係以MOI=10或50使用 AdTG17909感染48小時，或使用空白腺病毒作為陰性對 照。細胞丸粒經收集且使用抗核心小鼠單株抗體（C1-5， sc-23945 ’聖塔克魯兹）探測。如第1A圖所示，具有預期分 子量（31.6 kDa)之主帶顯示於自感染AdTG17909之細胞所 85 201106967 收集的樣本。
Pol*多肽之表達係於AdTG17910感染A549之細胞後藉 西方墨點法評估。然後收集細胞丸粒及使用抗Pol小鼠單株 抗體(8D5，sc-81591 ’聖塔克魯茲）探測》如第1A圖所示， 具有期望分子量（88.5 kDa)之帶顯示於自感染AdTG17910 連同若干次級產物（部分聚合酶蛋白質）之細胞收集得之樣 本。 2.1.2.自MVA組成體之抗原表達
Pol*' Pol*TMR' Core*t> Core*tEnvl' Core*t-Envl-Env2 之表達係藉西方墨點法進行。A549細胞或CEF係以MOI=l 或 0.2 分別使用 MVATG17842 、MVATG17843 、 MVATG17971 、 MVATG17972 、 MVATG17993 及 MVATG17994於有或無蛋白體抑制劑MG-132(10pM)添加 至MVATG17842及MVATG17843之生長培養基存在下感 染。24小時後，收穫細胞。 對MVATG17842，西方墨點分析係使用市售單株p〇i抗 體HepB Pol(8D5，聖塔克魯茲，#sc-81591)進行。如第1B 圖所示，具有88.5 kDa表觀分子量之蛋白質表達只於 MG-132存在下檢測。此帶具有Pol*蛋白質之期望分子量。 對MVATG17843 ’西方墨點分析係使用市售抗p〇l抗體 HepB Pol(8D5，聖塔克魯茲，#sc-81591)進行。如第1B圖 所示，於有或無MG-132存在下檢測具有98.2 kDa表觀分子 量之蛋白質表達。此帶具有P〇l*-TMR蛋白質之期望分子 量。須注意於MG132存在下，檢測得更多產物及超過2〇〇Kda 86 201106967 之高分子量額外產物。 對MVATG17971 ’使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯茲，# sc-23946)進行西方墨點分析。如 第1B圖所示，檢測得Core*之表達具有21 kDd表觀分子量其 係與期望分子量相對應。 對MVATG17972，使用市售單株抗核心抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯兹，# sc-23946)進行西方墨點分析。如 第1B圖所示，檢測得Core*t之表達具有15.8 kDd表觀分子量 其係與期望分子量相對應。 對MVATG17993及MVATG17994 ’使用市售單株抗核心 抗體Hep B cAg(13A9)(聖塔克魯兹’ # sc-23946)進行西方墨 點分析。如第1B圖所示，檢測得蛋白質表達分別具有199 kDd及23.4 kDd之表觀分子量。此帶具有Core+t-Envl蛋白質 及Core*t-Envl-Env2之期望分子量。 2.2.自腺病毒載體AdTG17909及AdTG17910表達之抗原之 免疫原性 藉腺病毒載體表達之HBV多肽之免疫原性係於單獨使 用AdTG 17909或AdTG 17910或使用兩種腺病毒混合物免疫 接種至HLA-A2轉移基因小鼠評估。一次皮下注射後誘導的 特異性T細胞反應係藉Elispot IFNg、ICS及活體内細胞溶解 檢定分析’使用存在於聚合酶、核心或包膜功能部位之已 知之(描述為病人體内特異性T細胞反應之標靶)HLA-A2抗 原上突或/及覆蓋所關注的HBV抗原之重疊胜肽匯集物進 行評估。 87 201106967 2.2.1. 藉Eli spot檢定分析評估HB V特異性IFNy生產性細胞 Elispot IFNg檢定分析顯示AdTG17910可誘導HLA-A2 限剪抗原上突(SLYADSPSV)(SEQ ID NO : 55位在HBV聚合 酶内部位置816-824)(第2A圖）之特異性IFNg製造性細胞。使 用AdTG17909免疫接種也導致對兩種核心HLA-A2限剪抗 原上突（FLPSDFFPSV 於位置 18-27(SEQ ID NO : 56)及 ILCWGELMTL於位置99-108(SEQ ID NO : 57)及對3種包膜 HLA-A2限剪抗原上突(VLQAGFFLL(SEQ ID NO : 58)於位 置 14-22及FLGGTTVCL(SEQ ID NO : 59)於位置41-49二者 皆存在於Envl，及GLSPTVWLSV(SEQ ID NO : 60)於位置 185-194存在於Env2之特異性IFNg生產性細胞的高頻率誘 導（第2B及第2C圖）。以AdTG17909及AdTG17910之混合物 免疫接種也誘導將相同抗原上突靶定於3種抗原之特異性 IFNg生成性細胞可相媲美的含量，亦即SLY抗原上突存在 於Po卜FLP及ILC抗原上突存在於核心蛋白質，及包膜功能 部位之3個抗原上突（VLQ、FLG及GLS)(第2A、B及C圖）。 於使用單一 A d或兩種A d之混合物免疫接種後檢測得之T細 胞反應頻率可相媲美，顯示自所述載體表達的3種抗原間並 無重大免疫顯性。 2.2.2. 藉胞内染色檢定分析評估HBV特異性IFNg/TNFa生 產性細胞 可單獨製造IFNg或製造IFNg+TNFa靶定存在於聚合酶 功能部位(SLY)、核心功能部位(FLP及ILC)及包膜功能部位 (VLQ、FLG及GLS)之HLA-A2限剪抗原上突之CD8 T細胞數 88 201106967 目係藉ICS檢定分析評估。全部此等抗原上突皆為雙重分泌 細胞及簡單分泌細胞的標靶。結果顯示於第3圖。以單獨 AdTG17909或組合AdTG17910免疫接種動物獲得粗略相等 的Core-及Env-特異性CD8 T細胞反應（於使用FLP、ILC、 VLQ、FLG及GLS胜肽再度刺激後製造iFNg或IFNg + TNFa 之特異性CD8 T細胞之百分比相等，如第3B圖及3C圖所 示）。另一方面，有關聚合酶特異性CD8 T細胞反應（SLY抗 原上突），於使用AdTG17910表達Pol*處理之小鼠（第3八圖） 以及使用AdTG 17909及AdTG 17909之混合物但於較低濃度 免疫接種之小鼠（第3C圖）檢測得製造IFNg或IFNg + TNFa 之CD8+細胞極高百分比。 2.2.3.於使用腺病毒載體混合物免疫接種後藉胞内染色檢 定分析評估可製造HBV特異性IFNg/TNFa之CD8及CD4 T 細胞 可單獨製造IFNg或IFNg + TNFa或IFNg + IL2靶定存在 於聚合酶功能部位(SLY)、核心功能部位(FLP及ILC)及包膜 功能部位(VLQ、FLG及GLS)之HLA-A2限剪抗原上突或覆 蓋Core蛋白質及Env功能部位之重疊胜肽匯集物之CD8及 CD4T細胞百分比係藉ICS檢定分析評估。全部接受試驗之 HLA-A2限剪抗原上突皆為單一及雙重分泌細胞之標靶 (IFNg及IFNg + TNFa)，某些重疊胜肽匯集物也是單一及雙 重生產性細胞的標靶(IFNg及IFNg + TNF及IFNg + IL2)。結 果顯示於第4圖。五頭HLA-A2轉移基因小鼠使用 AdTG17909及AdTG17910之混合物免疫接種；3頭HLA-A2 89 201106967 轉移基因小鼠使用AdTG15149免疫接種（陰性對照）。以 AdTG15149接種之動物並未顯示HBV特異性T細胞反應（資 料未顯示）。以AdTG17909組合AdTG17910免疫接種之動物 顯示HBV靶定抗原之強力特異性CD8 T細胞反應（第4A 圖）’ HLA-A2抗原上突之特異性單一(IFNg)及雙重(IFNg + TNFa)生產性細胞之高百分比存在於聚合酶、核心及Env功 能部位’且具有胜肽之「核心1」匯集物及涵蓋En v 1及Env2 功能部位之胜肽匯集物特異性。如第4B及4C圖所示，此等 免疫接種小鼠也顯示HBV抗原之特異性CD4 T細胞反應， 特別為胜肽之「核心2」匯集物及胜肽之Env2涵蓋匯集物之 特異性單一（IFNg)及雙重(IFNg + TNFa及IFNg + IL2)生產 性細胞。 2.2.4.藉活體内CTL檢定分析測量活體内細胞分解之誘導 腺病毒載體AdTG17910及AdTG17910對表達HBV HLA-A2抗原上突細胞誘導活體内細胞分解能力係藉活體 内CTL檢定分析評估。測試四種HLA-A2抗原上突，分別為 SLY(Pol)、FLP及ILC(Core)及VLQ(Envl功能部位）〇 六頭動 物使用AdTG17909 + AdTG17910之混合物免疫接種及2頭 動物使用AdTG15149免疫接種(陰性對照ρ各組有半數(三 頭以AdTG17909 + AdTG17910免疫接種小氣及一頭以 AdTG15149免疫接種小鼠）測試其於活體内分解以SLY胜肽 脈衝化細胞及以ILC胜肽脈衝化細胞。另外半數係測試免疫 接種動物於活體内分解以FLP胜肽脈衝化細胞及以vlQ胜 肽脈衝化細胞之能力。結果顯示於第5圖。如所預期，使用 90 201106967
AdTG 15149免疫接種小鼠無法檢測得HB V特異性活體内細 胞分解（資料未顯示）。於AdTG17909 + AdTG17910免疫接 種小鼠對2種核心抗原上突FLP及ILC之活體内細胞分解微 弱。相反地，使用AdTG17909及AdTG17910之混合物免疫 接種之動物顯示對聚合酶抗原上突SLY(第5A圖）及Env 1抗 原上突VLQ(第5B圖）之強力活體内細胞分解，於兩種情況 下達到高於50%特異性分解。 令人關注地，表達po卜core及env部分之Ad載體組合物 允許共同注射時，誘導靶定3種HBV抗原之特異性T細胞反 應。所誘導的T細胞也可製造一種或兩種細胞激素，及於活 體内分解載荷有部分HBV胜肽之細胞。全部此等資料證實 所述組成物之免疫原性活性及當藉Ad載體化時其誘導CD8 及CD4T細胞反應之能力。 2.3.自 MVA載體MVATG17842、MVATG17843、NVATG1797卜 MVATG17972、MVATG17993及MVATG17994表達的抗原之 免疫原性 以MVA為主之組成物之免疫原性活性係於實例1.1.2至 1.1.7所述MVA載體中之一者（MVATG17842、 MVATG17843、MVATG17971 或MVATG17972單獨）或以2種 MVA 之混合物（MVATG17843 + MVATG17972、 MVATG17843 + MVATG17993 或 MVATG17843+ 厘¥八丁017994)免疫接種至1^八-八2轉移基因小鼠評估。小鼠 係以一週間隔皮下注射3劑免疫接種，使用前述存在於聚合 酶、核心或包膜功能部位之HLA-A2抗原上突或/及涵蓋感 91 201106967 興趣之HBV抗原之重疊胜肽匯集物，藉Elispot IFNg及ICS 評估特異性T細胞反應。 2·3.1.於以聚合酶表達性MVA免疫接種後藉Elispot檢定分 析評估HBV特異性IFNy生產性細胞。 三頭小鼠以表達經截頭且經突變之聚合酶抗原之 MVATG17842或表達相同已截頭且已突變之聚合酶之膜靶 定版本之MVATG17843或MVA Ν33·1(陰性對照）免疫接 種。使用SLY HLA-A2限剪抗原上突及涵蓋聚合酶之胜肽匯 集物藉IFNg Elispot檢定分析評估聚合酶特異性τ細胞反 應。未以MVAN33.1及MVATG17842(資料未顯示）免疫接種 之小鼠未檢測得HBV特異性T細胞反應。但於第6A圖所 示’使用MVATG17843免疫接種後誘導IFNg生產性細胞， 其為HLA-A2限剪抗原上突SLY特異性及涵蓋聚合酶C端部 分之胜肽匯集物8特異性（於測試之實驗條件下並未檢測得 對抗其它胜肽匯集物1-7之特異性反應）。此等資料強調至少 於以MVA為主之組成物中，表達聚合酶作為膜錨定抗原的 效果。 2.3 · 2.於使用核心表達MVA免疫接種後藉Elispot檢定分析 評估HBV特異性IFNY生產性細胞。 八頭小鼠以表達核心部分但刪除殘基77-84之 MVATG17971或表達其截頭版本之MVATG17972(自殘基 149 C端截頭）或MVA Ν33·1(陰性對照）免疫接種。使用 HLA-Α2限剪抗原上突（FLp及ILC胜肽）及前述胜肽之核心1 及核心2匯集物’藉IFNg Elispot檢定分析測定核心特異性τ 92 201106967 細胞反應。如第6B圖所示，以MVATG17971免疫接種可誘 導對HLA-A2限剪FLP及ILC胜肽及涵蓋核心抗原之兩個胜 肽匯集物（第6B圖）之特異性偶發型T細胞反應。於使用測試 之胜肽且於測試之實驗條件（資料未顯示）以MVATG17972 免疫接種小鼠未檢測付核心特異性T細胞反應。 2.3.3.於使用MVA載體組成物免疫接種後藉Eiispot檢定分 析評估HBV特異性IFNY生產性細胞。 以 MVA TG17843及MVA TG17972、MVA TG17993及 MVATG17994之混合物免疫接種三頭小鼠，使用前述胜肽 藉Eiispot IFNg檢定分析評估HBV特異性T細胞反應。 -於大部分以組成物MVATG17843 + MVATG17972免疫 接種之動物檢測得聚合酶特異性T細胞反應（如第7A圖所示 2/3動物為陽性反應）、MVATG17843 + MVATG17993(如第 7B圖所示3/3動物為陽性反應）及MVATG17843 + MVATG17994(如第7C圖所示2/3動物為陽性反應）。IFNg生 產性細胞頻率似乎與單獨注射MVATG17843時觀察得之頻 率（第6A圖）可相媲美’驗證載體組合對誘導免疫反應無害。 -於使用HLA-A2或胜肽匯集物（資料未顯示）於任何免 疫接種動物體’於測試的實驗條件下皆未檢測得核心特異 性反應。 -任何以包含MVATG17993之組成物免疫接種之動物 體，於測試的實驗條件下，使用Envl HLA-A2或胜肽匯集 物（資料未顯示）皆未檢測得e n v特異性反應。 -如第7C圖所示，以包含MVATG17994之組合物免疫接 93 201106967 種之3頭動物中有2頭檢測得env 2特異性T細胞反應，其係 針對HLA-Α2限剪GLS抗原上突及Εην2-涵蓋胜肽匯集物（此 等實驗條件下並未觀察得對Envl功能部位之T細胞反應；資 料未顯示）。 於相同條件下進行ICS檢定分析證實於Elispot檢定分 析觀察得之結果（資料未顯示）。 令人關注地，表達pol、core及env部分之MVA載體組合 物當共同注射時允許誘導把定p〇l及env2抗原之特異性τ細 胞反應。 總而言之，此等資料證實所述組成物之免疫原活性及 其誘導對主要HBV抗原之T細胞反應之能力。 【圖式簡單說明】 第1A-B圖顯示自腺病毒及mva感染細胞之HBV多肽 表達。 第2A-C圖顯示於Elispots ΙΡΝγ檢定分析中藉腺病毒編 碼之HBV多肽之免疫原性。 第3A-C_示於胞内細胞激素染色檢定分析中藉腺病 毒載體所編碼之HBV多肽之免疫原性。 第4A-C ® _藉腺病純體編碼之HB v多肽誘導⑽ 及CD4T細胞反應之能力，係、藉胞内細胞激素染色檢定分析 檢測。 第5A-B圖顯示編碼贈多肽之腺病毒載體誘導抗載荷 有HBV HLA·A2限剪抗原上突之錄細胞的活體内功能性 細胞溶解。 94 201106967 第6A-B圖顯示藉Elispots IFNy檢定分析測定之由M VA 載體所編碼之HBV多肽之免疫原性。 第7A-C圖顯示於小鼠共同注射由MVA載體所編碼之 HBV多肽之免疫原性，藉Elispots Π^Νγ檢定分析測定。 【主要元件符號說明】 (無） 95 201106967 序列表 <110> TRANSGENE S.A. <120> 用以治療B型肝炎病毒(HBV)感染之組成物 <130> TG200 <160> 61 <170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <211> 832 <212〉 PRT <213〉B型肝炎病毒 <400〉 1
Met Pro Leu Ser Tyr Gin His Phe Arg Arg Leu Leu Leu Leu Asp Asp 15 10 15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly 20 25 30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val 35 40 45
Ser lie Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro His Trp Lys Thr Pro Ser Phe Pro 65 70 75 80 s
Le • 1i CIW H 8 s cy s Ly s yo L 9 va c h 5 p 9
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Gin Leu lie Met Pro 100 105 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly 115 120 125 lie Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe Gin Thr 130 135 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly lie Leu Tyr Lys Arg 145 150 155 160
Glu Thr Thr His Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu 165 170 175
Gin Lys Leu Gin His Gly Ala Glu Ser Phe His Gin Gin Ser Ser Gly 180 185 190 lie Leu Ser Arg Pro Pro Val Gly Ser Ser Leu Gin Ser Lys His Arg 195 200 205 1 jtk 201106967
Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gin Ser Gin Gin Gly His Leu Ala Arg Arg 210 215 220
Gin Gin Gly Arg Ser Trp Ser lie Arg Ala Gly lie His Pro Thr Ala 225 230 235 240
Arg Arg Ser Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Ser Thr Asn 245 250 255
Leu Ala Ser Lys Ser Ala Ser Cys Leu Tyr Gin Ser Pro Val Arg Lys 260 265 270
Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe Glu Lys His Ser Ser Ser Gly 275 280 285
His Ala Val Glu Leu His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gin 290 295 300
Ser Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp Trp Leu Gin Phe Arg Asn Ser 305 310 315 320
Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser His lie Val Asn Leu Leu Glu 325 330 335
Asp Trp Gly Pro Cys Ala Glu His Gly Glu His His lie Arg lie Pro 340 345 350
Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn 355 360 365
Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gin Phe 370 375 380
Ser Arg Gly Asn Tyr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn 385 390 395 400
Leu Gin Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser 405 410 415
Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala 420 425 430
Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala 435 440 445
Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg lie Phe Asn Tyr Gin His Gly Thr Met 450 455 460
Gin Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu 465 470 475 480
Leu Leu Tyr Gin Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro 485 490 495 2 201106967
He lie Leu Gly Phe Arg Lys lie Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro 500 505 510
Phe Leu Leu Ala Gin Phe Thr Ser Ala lie Cys Ser Val Val Arg Arg 515 520 525
Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu 530 535 540
Gly Ala Lys Ser Val Gin His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr 545 550 555 560
Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly lie His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys 565 570 575
Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val lie Gly Cys Tyr 580 585 590
Gly Ser Leu Pro Gin Asp His lie lie Gin Lys lie Lys Glu Cys Phe 595 600 605
Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro lie Asp Trp Lys Val Cys Gin Arg 610 615 620
He Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gin Cys Gly Tyr 625 630 635 640
Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys lie Gin Ser Lys Gin Ala Phe 645 650 655
Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gin Tyr Leu Asn 660 665 670
Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gin Arg Pro Gly Leu Cys Gin Val Phe Ala 675 680 685
Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Val Met Gly His Gin Arg Met 690 695 700
Arg Gly Thr Phe Leu Ala Pro Leu Pro lie His Thr Ala Glu Leu Leu 705 710 715 720
Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn lie Leu Gly Thr 725 730 735
Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu 740 745 750
Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp lie Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr 755 760 765
Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Thr Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu 770 775 780 3 201106967
Gly Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly 785 790 795 800
Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro 805 810 815
Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro 820 825 830 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213〉B型肝炎病毒 <400> 2
Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro lie 65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95
Phe Arg Gin Leu Leu Trp Phe His lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110
Glu Thr Val lie Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr 115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175
Gin Ser Arg Glu Ser Gin Cys 180 <210〉 3 <211> 226 201106967 <212> PRT <213> B型肝炎病毒 <400> 3
Met Glu Asn lie Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gin 15 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie Pro Gin Ser Leu 20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys 35 40 45
Leu Gly Gin Asn Ser Gin Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60
Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 lie lie Phe Leu Phe lie Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu Leu Val 85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gin Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu lie Pro Gly 100 105 110
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125
Gin Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys lie Pro lie Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys 145 150 155 160
Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175
Val Pro Phe Val Gin Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190
Ser Val lie Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser lie 195 200 205
Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro lie Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220
Tyr lie 225 <210〉 4 <211> 2499 <212> DNA <213〉B型肝炎病毒 <400〉 4 201106967 atgcccctat cttatcaaca cttccggaga ctactgttgt tagacgacga ggcaggtccc 60 ctagaagaag aactccctcg cctcgcagac gaaggtctca atcgccgcgt cgcagaagat 120 ctcaatctcg ggaatctcaa tgttagtatt ccttggactc ataaggtggg aaactttacg 180 gggctttatt cttctactgt acctgtcttt aaccctcatt ggaaaacacc ctcttttcct 240 aatatacatt tacaccaaga cattatcaaa aaatgtgaac aatttgtagg cccactcaca 300 gtcaatgaga aaagaagact gcaattgatt atgcctgcta ggttttatcc aaatgttacc 360 aaatatttgc cattggataa gggtattaaa ccttattatc cagaacatct agttaatcat 420 tacttccaaa ccagacatta tttacacact ctatggaagg cgggtatatt atataagaga 480 gaaacaacac atagtgcctc attttgtggg tcaccatatt cttgggaaca aaagctacag 540 catggggcag aatctttcca ccagcaatcc tctgggattc tttcccgacc accagttgga 600 tccagccttc agagcaaaca ccgcaaatcc agattgggac ttcaatccca acaaggacac 660 ctggccagac gccaacaagg taggagctgg agcattcggg ctgggattca ccccaccgca 720 cggaggtctt ttggggtgga gccctcaggc tcagggcatt ctacaaacct tgccagcaaa 780 tccgcctcct gcctctacca atcgccagtc aggaaggcag cctaccccgc tgtctccacc 840 tttgagaaac actcatcctc aggccatgca gtggaactcc acaaccttcc accaaactct 900 gcaagatccc agagtgagag gcctgtattt ccctgctggt ggctccagtt caggaacagt 960 aaaccctgtt ccgactactg tctctcccat atcgtcaatc ttctcgagga ttggggaccc 1020 tgcgctgaac atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc 1080 ggggtttttc ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac 1140 ttctctcaat tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac 1200 ctccaatcac tcaccaacct cctgtcctcc aacctgtcct ggttatcgct ggatgtgtct 1260 gcggcgtttt atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct 1320 tctggactat caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatctt caactaccag 1380 cacgggacca tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt atccctcctg 1440 ttgctgtacc aaaccttcgg acggaaattg cacctgtatt cccatcccat catcctgggc 1500 tttcggaaaa ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt 1560 gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat 1620 gatgtggtat tgggggccaa gtctgtacag catcttgagt ccctttttac cgctgttacc 1680 aattttcttt tgtctttggg tatacattta aaccctaaca aaacaaaaag atggggttac 1740 tctttacatt tcatgggcta tgtcattgga tgttatgggt cattgccaca agatcacatc 1800 atacaaaaaa tcaaagaatg ttttcgaaaa cttcctgtta acagacctat tgattggaaa 1860 gtctgtcaac gtattgtggg tcttttgggt tttgctgccc cttttacaca atgtggttat 1920 cctgctttaa tgcctttgta tgcatgtatt cagtcgaagc aggcttttac tttctcgcca 1980 acttacaagg cctttctgtg taaacaatac ctgaaccttt accccgttgc ccggcaacgg 2040 ccaggtctgt gccaagtgtt tgctgacgca acccccactg gctggggctt ggtcatgggc 2100 catcagcgca tgcgtggaac ctttctggct cctctgccga tccatactgc ggaactccta 2160 6 gccgcttgtt ttgctcgcag caggtctgga gcaaacattc tcgggacgga taactctgtt 2220 gttctctccc gcaaatatac atcgtttcca tggctgctag gctgtgctgc caactggatc 2280 ctgcgcggga cgtcctttgt ttacgtcccg tcggcgctga atcccacgga cgacccttct 2340 cggggtcgct tggggctctc tcgtcccctt ctccgtctac cgtttcgacc gaccacgggg 2400 cgcacctctc tttacgcgga ctccccgtct gtgccttctc atctgccgga ccgtgtgcac 2460 ttcgcttcac ctctgcacgt cgcatggaga ccaccgtga 2499 <210〉 5 <211> 552 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400> 5 atggacattg atccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc ttttttgcct 60 tctgacttct ttccttcagt acgtgatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg ctctcaggca agcaattctg 180 tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg gtaatttgga agatccaata 240 tccagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt ccggcaacta 300 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga atatttggtg 360 tctttcggag tgtggatteg cactcctcca gettatagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggagactac tgttgttaga egaegaggea ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatetea atctcgggaa 540 tctcaatgtt aa 552 <210> 6 <211〉 681 <212> DNA <213> B型肝炎病毒 <400〉 6 atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggt tt t tc 60 ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120 tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180 tcaccaacct cctgtcctcc aacctgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240 atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300 caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatctt caactaccag cacgggacca 360 tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt atccctcctg ttgctgtacc 420 aaaccttcgg acggaaattg cacctgtatt cccatcccat catcctgggc tttcggaaaa 480 ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt 540 cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600 ^gggggccaa gtctgtacag catcttgagt ccctttttac cgctgttacc aattttcttt 660 681 tgtctttggg tatacattta a 7 201106967 <210> 7 <211> 786 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> N端截頭HBV聚合酶(48-832) <400〉 7
Met Val Ser lie Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu 15 10 15
Tyr Ser Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro His Trp Lys Thr Pro Ser 20 25 30
Phe Pro Asn lie His Leu His Gin Asp lie lie Lys Lys Cys Glu Gin 35 40 45
Phe Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Gin Leu lie 50 55 60
Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp 65 70 75 80
Lys Gly lie Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe 85 90 95
Gin Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly lie Leu Tyr 100 105 110
Lys Arg Glu Thr Thr His Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser 115 120 125
Trp Glu Gin Lys Leu Gin His Gly Ala Glu Ser Phe His Gin Gin Ser 130 135 140
Ser Gly lie Leu Ser Arg Pro Pro Val Gly Ser Ser Leu Gin Ser Lys 145 150 155 160
His Arg Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gin Ser Gin Gin Gly His Leu Ala 165 170 175
Arg Arg Gin Gin Gly Arg Ser Trp Ser lie Arg Ala Gly lie His Pro 180 185 190
Thr Ala Arg Arg Ser Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Ser 195 200 205
Thr Asn Leu Ala Ser Lys Ser Ala Ser Cys Leu Tyr Gin Ser Pro Val 210 215 220
Arg Lys Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe Glu Lys His Ser Ser 225 230 235 240 8 201106967
Ser Gly His Ala Val Glu Leu His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg 245 250 255
Ser Gin Ser Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp Tip Leu Gin Phe Arg 260 265 270
Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser His lie Val Asn Leu 275 280 285
Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Ala Glu His Gly Glu His His lie Arg 290 295 300 lie Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp 305 310 315 320
Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser 325 330 335
Gin Phe Ser Arg Gly Asn Tyr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val 340 345 350
Pro Asn Leu Gin Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp 355 360 365
Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro 370 375 380
Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr 385 390 395 400
Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg lie Phe Asn Tyr Gin His Gly 405 410 415
Thr Met Gin Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser 420 425 430
Leu Leu Leu Leu Tyr Gin Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser 435 440 445
His Pro lie lie Leu Gly Phe Arg Lys lie Pro Met Gly Val Gly Leu 450 455 460
Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gin Phe Thr Ser Ala lie Cys Ser Val Val 465 470 475 480
Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val 485 490 495
Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gin His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala 500 505 510
Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly lie His Leu Asn Pro Asn Lys 515 520 525 9 201106967
Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val He Gly 530 535 540
Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Asp His lie He Gin Lys lie Lys Glu 545 550 555 560
Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro lie Asp Trp Lys Val Cys 565 570 575
Gin Arg lie Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gin Cys 580 585 590
Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys lie Gin Ser Lys Gin 595 600 605
Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gin Tyr 610 615 620
Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gin Arg Pro Gly Leu Cys Gin Val 625 630 635 640
Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Val Met Gly His Gin 645 650 655
Arg Met Arg Gly Thr Phe Leu Ala Pro Leu Pro lie His Thr Ala Glu 660 665 670
Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn lie Leu 675 680 685
Gly Thr Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro 690 695 700
Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp lie Leu Arg Gly Thr Ser Phe 705 710 715 720
Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Thr Asp Asp Pro Ser Arg Gly 725 730 735
Arg Leu Gly Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr 740 745 750
Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His 755 760 765
Leu Pro Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg 770 775 780
Pro Pro 785 <210> 8 <211> 832 10 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>帶有RTase及RNase H活性缺陷之突變聚合酶 <400> 8
Met Pro Leu Ser Tyr Gin His Phe Arg Arg Leu Leu Leu Leu Asp Asp 1 5 10 15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Glv 20 25 30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val 35 40 45
Ser lie Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro His Trp Lys Thr Pro Ser Phe Pro 65 70 75 80
Asn lie His Leu His Gin Asp lie lie Lys Lys Cys Glu Gin Phe Val 85 90 95
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Gin Leu lie Met Pro 100 105 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly 115 120 125 lie Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe Gin Thr 130 135 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly lie Leu Tyr Lys Arg 145 150 155 160
Glu Thr Thr His Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu 165 170 175
Gin Lys Leu Gin His Gly Ala Glu Ser Phe His Gin Gin Ser Ser Gly 180 185 190 lie Leu Ser Arg Pro Pro Val Gly Ser Ser Leu Gin Ser Lys His Arg 195 200 205
Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gin Ser Gin Gin Gly His Leu Ala Arg Arg 210 215 220
Gin Gin Gly Arg Ser Trp Ser lie Arg Ala Gly lie His Pro Thr Ala 225 230 235 240
Arg Arg Ser Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Ser Thr Asn 245 250 255 11 201106967
Leu Ala Ser Lys Ser Ala Ser Cys Leu Tyr Gin Ser Pro Val Arg Lys 260 265 270
Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe Glu Lys His Ser Ser Ser Gly 275 280 285
His Ala Val Glu Leu His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gin 290 295 300
Ser Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp Trp Leu Gin Phe Arg Asn Ser 305 310 315 320
Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser His lie Val Asn Leu Leu Glu 325 330 335
Asp Trp Gly Pro Cys Ala Glu His Gly Glu His His lie Arg lie Pro 340 345 350
Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn 355 360 365
Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gin Phe 370 375 380
Ser Arg Gly Asn Tyr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn 385 390 395 400
Leu Gin Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser 405 410 415
Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala 420 425 430
Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala 435 440 445
Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg lie Phe Asn Tyr Gin His Gly Thr Met 450 455 460
Gin Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu 465 470 475 480
Leu Leu Tyr Gin Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro 485 490 495 lie lie Leu Gly Phe Arg Lys lie Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro 500 505 510
Phe Leu Leu Ala Gin Phe Thr Ser Ala lie Cys Ser Val Val Arg Arg 515 520 525
Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met His Asp Val Val Leu 530 535 540 12 201106967
Gly Ala Lys Ser Val Gin His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr 545 550 555 560
Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly lie His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys 565 570 575
Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val lie Gly Cys Tyr 580 585 590
Gly Ser Leu Pro Gin Asp His lie lie Gin Lys lie Lys Glu Cys Phe 595 600 605
Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro lie Asp Trp Lys Val Cys Gin Arg 610 615 620 lie Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gin Cys Gly Tyr 625 630 635 640
Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys lie Gin Ser Lys Gin Ala Phe 645 650 655
Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gin Tyr Leu Asn 660 665 670
Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gin Arg Pro Gly Leu Cys Gin Val Phe Ala 675 680 685
Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Val Met Gly His Gin Arg Met 690 695 700
Arg Gly Thr Phe Leu Ala Pro Leu Pro lie His Thr Ala His Leu Leu 705 710 715 720
Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn lie Leu Gly Thr 725 730 735
Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu 740 745 750
Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp lie Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr 755 760 765
Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Thr Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu 770 775 780
Gly Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly 785 790 795 800
Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro 805 810 815
Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro 13 820 825 830 <210> 9 <211> 874 <212〉 PRT <213>人造序列 <220> <223〉截頭及突變HBV聚合酶融合至狂犬病糖蛋白之穿膜功能部位(TMR) <400〉 9
Met Val Pro Gin Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 15 10 15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro lie Val Ser lie Pro Trp Thr His Lys Val 20 25 30
Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro 35 40 45
His Trp Lys Thr Pro Ser Phe Pro Asn lie His Leu His Gin Asp lie 50 55 60 lie Lys Lys Cys Glu Gin Phe Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys 65 70 75 80
Arg Arg Leu Gin Leu lie Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr 85 90 95
Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly lie Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His 100 105 110
Leu Val Asn His Tyr Phe Gin Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp 115 120 125
Lys Ala Gly lie Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr His Ser Ala Ser Phe 130 135 140
Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu Gin Lys Leu Gin His Gly Ala Glu 145 150 155 160
Ser Phe His Gin Gin Ser Ser Gly lie Leu Ser Arg Pro Pro Val Gly 165 170 175
Ser Ser Leu Gin Ser Lys His Arg Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gin Ser 180 185 190
Gin Gin Gly His Leu Ala Arg Arg Gin Gin Gly Arg Ser Trp Ser lie 195 200 205
Arg Ala Gly lie His Pro Thr Ala Arg Arg Ser Phe Gly Val Glu Pro 210 215 220
Ser Gly Ser Gly His Ser Thr Asn Leu Ala Ser Lys Ser Ala Ser Cys 225 230 235 240 14 201106967
Leu Tyr Gin Ser Pro Val Arg Lys Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr 245 250 255
Phe Glu Lys His Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu His Asn Leu 260 265 270
Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gin Ser Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys 275 280 285
Trp Trp Leu Gin Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu 290 295 300
Ser His lie Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Ala Glu His 305 310 315 320
Gly Glu His His lie Arg lie Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly 325 330 335
Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg 340 345 350
Leu Val Val Asp Phe Ser Gin Phe Ser Arg Gly Asn Tyr Arg Val Ser 355 360 365
Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gin Ser Leu Thr Asn Leu Leu 370 375 380
Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr 385 390 395 400
His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser 405 410 415
Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg lie 420 425 430
Phe Asn Tyr Gin His Gly Thr Met Gin Asn Leu His Asp Ser Cys Ser 435 440 445
Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gin Thr Phe Gly Arg 450 455 460
Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro lie lie Leu Gly Phe Arg Lys lie 465 470 475 480
Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gin Phe Thr Ser 485 490 495
Ala lie Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe 500 505 510
Ser Tyr Met His Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gin His Leu 15 201106967 515 520 525
Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly lie 530 535 540
His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe 545 550 555 560
Met Gly Tyr Val lie Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Asp His lie 565 570 575 lie Gin Lys lie Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro 580 585 590 lie Asp Trp Lys Val Cys Gin Arg lie Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala 595 600 605
Ala Pro Phe Thr Gin Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala 610 615 620
Cys lie Gin Ser Lys Gin Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala 625 630 635 640
Phe Leu Cys Lys Gin Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gin Arg 645 650 655
Pro Gly Leu Cys Gin Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly 660 665 670
Leu Val Met Gly His Gin Arg Met Arg Gly Thr Phe Leu Ala Pro Leu 675 680 685
Pro lie His Thr Ala His Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg 690 695 700
Ser Gly Ala Asn He Leu Gly Thr Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg 705 710 715 720
Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp lie 725 730 735
Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Thr 740 745 750
Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg 755 760 765
Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser 770 775 780
Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro 785 790 795 800 16 201106967
Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala 805 810 815
Leu Thr Ala Leu Met Leu lie lie Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg 820 825 830
Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gin His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg 835 840 845
Glu Val Ser Val Thr Pro Gin Ser Gly Lys lie lie Ser Ser Trp Glu 850 855 860
Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 865 870 <210> 10 <211〉 148 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223〉截頭核心（1-148) <400> 10
Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro lie 65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95
Phe Arg Gin Leu Leu Trp Phe His lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110
Glu Thr Val lie Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr 115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140
Glu Thr Thr Val 145 <210> 11 s 17 201106967 <211〉 140 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>截頭及已刪除之1*1^核心（1-76及85-148) <400> 11
Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Val Val Ser Tyr 65 70 75 80
Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gin Leu Leu Trp Phe His 85 90 95 lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val lie Glu Tyr Leu Val 100 105 110
Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 115 120 125
Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val 130 135 140 <210〉 12 <211> 39 <212〉 PRT <213>人造序列 <220〉 <223〉HBV免疫原性功能部位Envl(14-51) <400〉 12
Met Val Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr He 15 10 15
Pro Gin Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly 20 25 30
Thr Thr Val Cys Leu Gly Gin 35 <210〉 13 <211> 30 <212> PRT <213>人造序列 18 201106967 <220〉 <223> HBV免疫原性功能部位Env2(165-194) <400> 13
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val 15 10 15
Gin Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val 20 25 30 <210〉 14 <211〉 26 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223〉HBV免疫原性功能部位Env3(8M06) <400> 14 lie lie Phe Leu Phe lie Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu Leu Val 15 10 15
Leu Leu Asp Tyr Gin Gly Met Leu Pro Val 20 25 <210> 15 <211〉 25 <212> PRT <213>人造序列 <220〉 <223〉HBV免疫原性功能部位Env4(202-226) <400〉 15
Gly Pro Ser Leu Tyr Ser lie Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro 15 10 15 lie Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr lie 20 25 <210> 16 <211> 69 <212> PRT <213>人造序列 <220〉 <223〉HBV免疫原性功能部位Envl-Env2之融合 <400〉 16
Met Val Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie 15 10 15
Pro Gin Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly 20 25 30
Thr Thr Val Cys Leu Gly Gin Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu 35 40 45 19 201106967
Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gin Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr 50 55 60
Val Trp Leu Ser Val 65 <210> 17 <211> 94 <212> PRT <213>人造序列 <220> <22〗> HBV免疫原性功能部位Envl-Env2-Env4之融合 <400> 17
Met Val Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie 15 10 15
Pro Gin Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly 20 25 30
Thr Thr Val Cys Leu Gly Gin Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu 35 40 45
Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gin Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr 50 55 60
Val Trp Leu Ser Val Gly Pro Ser Leu Tyr Ser lie Leu Ser Pro Phe 65 70 75 80
Leu Pro Leu Leu Pro lie Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr lie 85 90 <210〉 18 <211> 179 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>截頭及已刪除之HBV核心（1-76及85-148)與HBV免疫原性功能部位Envl 之融合 <400> 18
Met Asp He Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Val Val Ser Tyr 20 201106967 65 70 75 80
Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gin Leu Leu Trp Phe His 85 90 95 lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val lie Glu Tyr Leu Val 100 105 110
Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 115 120 125
Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Met Val Leu Gin 130 135 140
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie Pro Gin Ser Leu 145 150 155 160
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys 165 170 175
Leu Gly Gin <210〉 19 <211> 208 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223>截頭及已刪除之HBV核心（1-76及85-148)與HBV免疫原性功能部位Envl 及Env2之融合 <400> 19
Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Val Val Ser Tyr 65 70 75 80
Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gin Leu Leu Trp Phe His 85 90 95 lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val lie Glu Tyr Leu Val 100 105 110
Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 21 201106967 115 120 125
Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Leu Gin Ala 130 135 140
Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie Pro Gin Ser Leu Asp 145 150 155 160
Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu 165 170 175
Gly Gin Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro 180 185 190
Phe Val Gin Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val 195 200 205 <210> 20 <211> 276 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>核心與HBV免疫原性功能部位Envl、Env2及Env4之融合 <400> 20
Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro lie 65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95
Phe Arg Gin Leu Leu Trp Phe His lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110
Glu Thr Val He Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr 115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 22 201106967
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175
Gin Ser Arg Glu Ser Gin Cys Val Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu 180 185 190
Thr Arg lie Leu Thr lie Pro Gin Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser 195 200 205
Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gin Trp Ala Ser 210 215 220
Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gin Trp Phe 225 230 235 240
Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Gly Pro Ser Leu Tyr 245 250 255
Ser lie Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro lie Phe Phe Cys Leu 260 265 270
Trp Val Tyr lie 275 <210> 21 <211> 2361 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223>編碼HBV截頭聚合酶(48-832)之核苷酸序列 <400〉 21 atggttagta ttccttggac tcataaggtg ggaaacttta cggggcttta ttcttctact 60 gtacctgtct ttaaccctca ttggaaaaca ccctcttttc ctaatataca tttacaccaa 120 gacattatca aaaaatgtga acaatttgta ggcccactca cagtcaatga gaaaagaaga 180 ctgcaattga ttatgcctgc taggttttat ccaaatgtta ccaaatattt gccattggat 240 aagggtatta aaccttatta tccagaacat ctagttaatc attacttcca aaccagacat 300 tatttacaca ctctatggaa ggcgggtata ttatataaga gagaaacaac acatagtgcc 360 tcattttgtg ggtcaccata ttcttgggaa caaaagctac agcatggggc agaatctttc 420 caccagcaat cctctgggat tctttcccga ccaccagttg gatccagcct tcagagcaaa 480 caccgcaaat ccagattggg acttcaatcc caacaaggac acctggccag acgccaacaa 540 ggtaggagct ggagcattcg ggctgggatt caccccaccg cacggaggtc ttttggggtg 600 gagccctcag gctcagggca ttctacaaac cttgccagca aatccgcctc ctgcctctac 660 caatcgccag tcaggaaggc agcctacccc gctgtctcca cctttgagaa acactcatcc 720 tcaggccatg cagtggaact ccacaacctt ccaccaaact ctgcaagatc ccagagtgag 780 aggcctgtat ttccctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg ttccgactac 840 23 900 201106967 tgtctctccc atatcgtcaa tcttctcgag gattggggac cctgcgctga acatggagaa catcacatca ggattcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc acaataccgc agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaactacc gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcctgtcct ccaacctgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt tgtcctctaa ttccaggatc ttcaactacc agcacgggac catgcagaac ctgcacgact cctgctcaag gaacctctat gtatccctcc tgttgctgta ccaaaccttc ggacggaaat tgcacctgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcggaa aattcctatg ggagtgggcc tcagcccgtt tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac agcatcttga gtcccttttt accgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt taaaccctaa caaaacaaaa agatggggtt actctttaca tttcatgggc tatgtcattg gatgttatgg gtcattgcca caagatcaca tcatacaaaa aatcaaagaa tgttttcgaa aacttcctgt taacagacct attgattgga aagtctgtca acgtattgtg ggtcttttgg gttttgctgc cccttttaca caatgtggtt atcctgcttt aatgcctttg tatgcatgta ttcagtcgaa gcaggctttt actttctcgc caacttacaa ggcctttctg tgtaaacaat acctgaacct ttaccccgtt gcccggcaac ggccaggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac tggctggggc ttggtcatgg gccatcagcg catgcgtgga acctttctgg ctcctctgcc gatccatact gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agcaggtctg gagcaaacat tctcgggacg gataactctg ttgttctctc ccgcaaatat acatcgtttc catggctgct aggctgtgct gccaactgga tcctgcgcgg gacgtccttt gtttacgtcc cgtcggcgct gaatcccacg gacgaccctt ctcggg£tcg cttggggctc tctcgtcccc ttctccgtct accgtttcga ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg gactccccgt ctgtgccttc tcatctgccg gaccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac gtcgcatgga gaccaccgtg a <210> 22 <211> 2499 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>編碼帶有RTase及RNase活性缺陷之突變HBV聚合酶之核苷酸序列 <400〉 22 atgcccctat cttatcaaca cttccggaga ctactgttgt tagacgacga ggcaggtccc ctagaagaag aactccctcg cctcgcagac gaaggtctca atcgccgcgt cgcagaagat ctcaatctcg ggaatctcaa tgttagtatt ccttggactc ataaggtggg aaactttacg gggctttatt cttctactgt acctgtcttt aaccctcatt ggaaaacacc ctcttttcct aatatacatt tacaccaaga cattatcaaa aaatgtgaac aatttgtagg cccactcaca 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2361 60 120 180 240 300 24 360 201106967 gtcaatgaga aaagaagact gcaattgatt atgcctgcta ggttttatcc aaatgttacc aaatatttgc cattggataa gggtattaaa cct tattatc cagaacatct agttaatcat tacttccaaa ccagacatta tttacacact ctatggaagg cgggtatatt atataagaga gaaacaacac atagtgcctc attttgtggg tcaccatatt cttgggaaca aaagctacag catggggcag aatctttcca ccagcaatcc tctgggattc tttcccgacc accagttgga tccagccttc agagcaaaca ccgcaaatcc agattgggac ttcaatccca acaaggacac ctggccagac gccaacaagg taggagctgg agcattcggg ctgggattca ccccaccgca cggaggtctt ttggggtgga gccctcaggc tcagggcatt ctacaaacct tgccagcaaa tccgcctcct gcctctacca atcgccagtc aggaaggcag cctaccccgc tgtctccacc tttgagaaac actcatcctc aggccatgca gtggaactcc acaaccttcc accaaactct gcaagatccc agagtgagag gcctgtattt ccctgctggt ggctccagtt caggaacagt aaaccctgtt ccgactactg tctctcccat atcgtcaatc ttctcgagga ttggggaccc tgcgctgaac atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac tcaccaacct cctgtcctcc aacctgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatctt caactaccag cacgggacca tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt atccctcctg ttgctgtacc aaaccttcgg acggaaattg cacctgtatt cccatcccat catcctgggc tttcggaaaa ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatgcat gatgtggtat tgggggccaa gtctgtacag catcttgagt ccctttttac cgctgttacc aattttcttt tgtctttggg tatacattta aaccctaaca aaacaaaaag atggggttac tctttacatt tcatgggcta tgtcattgga tgttatgggt cattgccaca agatcacatc atacaaaaaa tcaaagaatg ttttcgaaaa cttcctgtta acagacctat tgattggaaa gtctgtcaac gtattgtggg tcttttgggt tttgctgccc cttttacaca atgtggttat cctgctttaa tgcctttgta tgcatgtatt cagtcgaagc aggcttttac tttctcgcca acttacaagg cctttctgtg taaacaatac ctgaaccttt accccgttgc ccggcaacgg ccaggtctgt gccaagtgtt tgctgacgca acccccactg gctggggctt ggtcatgggc catcagcgca tgcgtggaac ctttctggct cctctgccga tccatactgc gcatctccta gccgcttgtt ttgctcgcag caggtctgga gcaaacattc tcgggacgga taactctgtt gttctctccc gcaaatatac atcgtttcca tggctgctag gctgtgctgc caactggatc ctgcgcggga cgtcctttgt ttacgtcccg tcggcgctga atcccacgga cgacccttct cggggtcgct tggggctctc tcgtcccctt ctccgtctac cgtttcgacc gaccacgggg 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 25 201106967 cgcacctctc tttacgcgga ctccccgtct gtgccttctc atctgccgga ccgtgtgcac 2460 ttcgcttcac ctctgcacgt cgcatggaga ccaccgtga 2499 <210> 23 <211> 2628 <212> DNA ' <213>人造序列 <220> <223>編碼截頭及突變HBV聚合酶融合至狂犬病糖蛋白之穿膜功能部位(TOR)之 核苷酸序列 <400〉 23 atggttcctc aggctctcct gtttgtaccc cttctggttt ttccattgtg ttttgggaaa 60 ttccctattg ttagtattcc ttggactcat aaggtgggaa actttacggg gctttattct 120 tctactgtac ctgtctttaa ccctcattgg aaaacaccct cttttcctaa tatacattta 180 caccaagaca t tatcaaaaa atgtgaacaa tttgtaggcc cactcacagt caatgagaaa 240 agaagactgc aattgattat gcctgctagg ttttatccaa atgttaccaa atatttgcca 300 ttggataagg gtattaaacc ttattatcca gaacatctag ttaatcatta ct tccaaacc 360 agacattatt tacacactct atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat 420 agtgcctcat tttgtgggtc accatattct tgggaacaaa agctacagca tggggcagaa 480 tctttccacc agcaatcctc tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag 540 agcaaacacc gcaaatccag attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc 600 caacaaggta ggagctggag cattcgggct gggattcacc ccaccgcacg gaggtctttt 660 ggggtggagc cctcaggctc agggcattct acaaaccttg ccagcaaatc cgcctcctgc 720 ctctaccaat cgccagtcag gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac 780 tcatcctcag gccatgcagt ggaactccac aaccttccac caaactctgc aagatcccag 840 agtgagaggc ctgtatttcc ctgctggtgg ctccagttca ggaacagtaa accctgttcc 900 gactactgtc tctcccatat cgtcaatctt ctcgaggatt ggggaccctg cgctgaacat 960 ggagaacatc acatcaggat tcctaggacc cctgctcgtg ttacaggcgg ggtttttctt 1020 gttgacaaga atcctcacaa taccgcagag tctagactcg tggtggactt ctctcaattt 1080 tctaggggga actaccgtgt gtcttggcca aaattcgcag tccccaacct ccaatcactc 1140 accaacctcc tgtcctccaa cctgtcctgg ttatcgctgg atgtgtctgc ggcgttttat 1200 catcttcctc t tcatcctgc tgctatgcct catcttcttg ttggttcttc tggactatca 1260 aggtatgttg cccgtttgtc ctctaattcc aggatcttca actaccagca cgggaccatg 1320 cagaacctgc acgactcctg ctcaaggaac ctctatgtat ccctcctgtt gctgtaccaa 1380 accttcggac ggaaattgca cctgtattcc catcccatca tcctgggctt tcggaaaatt 1440 cctatgggag tgggcctcag cccgtttctc ctggctcagt ttactagtgc catttgttca 1500 gtggttcgta gggctttccc ccactgtttg gctttcagtt atatgcatga tgtggtattg 1560 ggggccaagt ctgtacagca tcttgagtcc ctttttaccg ctgttaccaa ttttcttttg 1620 tctttgggta tacat t taaa ccctaacaaa acaaaaagat ggggttactc tttacatttc 1680 26 201106967 atgggctatg tcattggatg ttatgggtca ttgccacaag atcacatcat acaaaaaatc 1740 aaagaatgtt ttcgaaaact tcctgttaac agacctattg attggaaagt ctgtcaacgt 1800 attgtgggtc ttttgggttt tgctgcccct tttacacaat gtggttatcc igctttaatg 1860 cctttgtatg catgtattca gtcgaagcag gcttttactt tctcgccaac ttacaaggcc 1920 tttctgtgta aacaatacct gaacctttac cccgttgccc ggcaacggcc aggtctgtgc 1980 caagtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcttgg tcatgggcca tcagcgcatg 2040 cgtggaacct ttctggctcc tctgccgatc catactgcgc atctcctagc cgcttgtttt 2100 gctcgcagca ggtctggagc aaacattctc gggacggata actctgttgt tctctcccgc 2160 aaatatacat cgtttccatg gctgctaggc tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg 2220 tcctttgttt acgtcccgtc ggcgctgaat cccacggacg acccttctcg gggtcgcttg 2280 gggctctctc gtccccttct ccgtctaccg tttcgaccga ccacggggcg cacctctctt 2340 tacgcggact ccccgtctgt gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct 2400 ctgcacgtcg catggagacc accgtatgta ttactgagtg caggggccct gactgccttg 2460 atgttgataa ttttcctgat gacatgttgt agaagagtca atcgatcaga acctacgcaa 2520 cacaatctca gagggacagg gagggaggtg tcagtcactc cccaaagcgg gaagatcata 2580 tcttcatggg aatcacacaa gagtgggggt gagaccagac tgtgatga 2628 <210> 24 <211> 537 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223〉編碼HBV截頭及已刪除之核心（1-76及85-148)融合至HBV免疫原性功能部位 Envl之核苷酸序列 <400〉 24 atggacattg atccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc ttttttgcct 60 tctgacttct ttccttcagt acgtgatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg ctctcaggca agcaattctg 180 tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg gtaatttgga agtcagttat 240 gtcaacacta atatgggcct aaagttccgg caactattgt ggtttcacat ttcttgtctc 300 acttttggaa gagaaacagt tatagaatat ttggtgtctt tcggagtgtg gattcgcact 360 cctccagctt atagaccacc aaatgcccct atcttatcaa cacttccgga gactactgtt 420 gtcctgcaag caggcttctt cctgctgacc cgtattctga ccattccaca aagcctggat 480 agctggtgga ccagcctgaa cttcctgggt ggcaccacgg tttgcctggg tcagtaa 537 <210> 25 <211> 627 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223>編碼HBV截頭及已刪除之核心（1-76及85-148)融合至1^免疫原性功能部位 En v 1及Env2之核苷酸序列 27 201106967 <400> 25 atggacattg atccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc ttttttgcct 60 tctgacttct ttccttcagt acgtgatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg ctctcaggca agcaattctg 180 tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg gtaatttgga agtcagttat 240 gtcaacacta atatgggcct aaagttccgg caactattgt ggtttcacat ttcttgtctc 300 acttttggaa gagaaacagt tatagaatat ttggtgtctt tcggagtgtg gattcgcact 360 cctccagctt atagaccacc aaatgcccct atcttatcaa cacttccgga gactactgtt 420 gtcctgcaag caggcttctt cctgctgacc cgtattctga ccattccaca aagcctggat 480 agctggtgga ccagcctgaa cttcctgggt ggcaccacgg tttgcctggg tcagtgggca 540 agcgcacgct ttagctggct gagcctgctg gttccgttcg tgcaatggtt tgtgggtctg 600 agcccaaccg tgtggctgag cgtgtaa 627 <210> 26 <211> 828 <212> DNA <213>人造序列 <223>編碼HBV核心（M83)融合至HBV免疫原性功能部位Envl-Env2及Env4之核苷酸 <220〉 序列 <400〉 26 atggacattg atccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc ttttttgcct 60 tctgacttct ttccttcagt acgtgatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg ctctcaggca agcaattctg 180 tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg gtaatttgga agatccaata 240 tccagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt ccggcaacta 300 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga atatttggtg 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcagtgcg tcctgcaagc tggattcttt cttctcacca ggattttgac cattccacaa 600 tctcttgata gctggtggac aagtttgaac ttccttggag gcacaactgt ctgcctcgga 660 cagtgggcaa gtgctcgctt ttcttggttg agcttgctcg ttcccttcgt gcaatggttt 720 gttggactct ctccaacagt ctggttgtcc gtcggaccta gcctttatag tattctcagc 780 ccattcttgc cactcttgcc tatcttcttc tgcttgtggg tttatatc 828 <210> 27 <211> 2499 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>存在於質體pGA-15pol之核苷酸序列 28 201106967 <400> 27 atgcccctat cttatcaaca ct tccggaga ctactgttgt tagacgacga ggcaggtccc 60 ctagaagaag aactccctcg cctcgcagac gaaggtctca atcgccgcgt cgcagaagat 120 ctcaatctcg ggaatctcaa tgttagtatt ccttggactc ataaggtggg aaact t tacg 180 gggctttatt cttctactgt acctgtct tt aaccctcat t ggaaaacacc ctct 11 tcct 240 aatatacat t tacaccaaga cat tatcaaa aaatgtgaac aatttgtagg cccactcaca 300 gtcaatgaga aaagaagact gcaattgatt atgcctgcta ggt 11 tatcc aaatgt tacc 360 aaatat t tgc cat tggataa gggtattaaa cct tat tatc cagaacatct agt taatcat 420 tacttccaaa ccagacatta tttacacact ctatggaagg cgggtatatt atataagaga 480 gaaacaacac atagtgcctc attttgtggg tcaccatat t cttgggaaca aaagctacag 540 catggggcag aatctttcca ccagcaatcc tctgggattc tttcccgacc accagttgga 600 tccagcct tc agagcaaaca ccgcaaatcc agattgggac t tcaatccca acaaggacac 660 ctggccagac gccaacaagg taggagctgg agcattcggg ctgggattca ccccaccgca 720 cggaggtctt ttggggtgga gccctcaggc tcagggcatt ctacaaacct tgccagcaaa 780 tccgcctcct gcctctacca atcgccagtc aggaaggcag cctaccccgc tgtctccacc 840 tttgagaaac actcatcctc aggccatgca gtggaactcc acaacct tcc accaaactct 900 gcaagatccc agagtgagag gcctgtattt ccctgctggt ggctccagt t caggaacagt 960 aaaccctgtt ccgactactg tctctcccat atcgtcaatc t tctcgagga ttggggaccc 1020 tgcgctgaac atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc 1080 ggggtttttc t tgt tgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac 1140 ttctctcaat tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac 1200 ctccaatcac tcaccaacct cctgtcctcc aacctgtcct ggttatcgct ggatgtgtct 1260 gcggcgtttt atcatcttcc tct tcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct 1320 tctggactat caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatctt caactaccag 1380 cacgggacca tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt atccctcctg 1440 ttgctgtacc aaacct tcgg acggaaattg cacctgtatt cccatcccat catcctgggc 1500 tttcggaaaa ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt 1560 gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc ccccactgt t tggctttcag ttatatgcat 1620 gatgtggtat tgggggccaa gtctgtacag catcttgagt ccctttttac cgctgttacc 1680 aattttcttt tgtctttggg tatacat t ta aaccctaaca aaacaaaaag atggggttac 1740 tctttacatt tcatgggcta tgtcattgga tgttatgggt cat tgccaca agatcacatc 1800 atacaaaaaa tcaaagaatg ttttcgaaaa cttcctgtta acagacctat tgattggaaa 1860 gtctgtcaac gtattgtggg tcttttgggt tttgctgccc cttttacaca atgtggttat 1920 cctgct t taa tgcctttgta tgcatgtatt cagtcgaagc aggctt ttac tttctcgcca 1980 acttacaagg cctttctgtg taaacaatac ctgaacct 11 accccgttgc ccggcaacgg 2040 ccaggtctgt gccaagtgtt tgctgacgca acccccactg gctggggctt ggtcatgggc 2100 29 201106967 catcagcgca tgcgtggaac ctttctggct cctctgccga tccatactgc gcatctccta 2160 gccgcttgtt ttgctcgcag caggtctgga gcaaacattc tcgggacgga taactctgtt 2220 gttctctccc gcaaatatac atcgtttcca tggctgctag gctgtgctgc caactggatc 2280 ctgcgcggga cgtcctttgt ttacgtcccg tcggcgctga atcccacgga cgacccttct 2340 cggggtcgct tggggctctc tcgtcccctt ctccgtctac cgtttcgacc gaccacgggg 2400 cgcacctctc tttacgcgga ctccccgtct gtgccttctc atctgccgga ccgtgtgcac 2460 ttcgcttcac ctctgcacgt cgcatggaga ccaccgtga 2499 <210> <211> <212> <213> 28 37 DNA 人造序列 <220〉 <223>引子 <400> 28 gagcgatatc caccatgaat gttagtattc cttggac 37 <210> <211> <212> <213> 29 31 DNA 人造序列 <220〉 <223>引子 <400> 29 gatcgctagc tcacggtggt ctccatgcga c 31 <210> <211> <212> <213> 30 35 DNA 人造序列 <220〉 <223>引子 <400> 30 gagtgatatc caccatggtt cctcaggctc tcctg 35 <210> 31 <211> 46 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400> 31 gtccaaggaa tactaacatt aatagggaat ttcccaaaac acaatg 46 列 序 A造 3239DN人 子 <210> <211〉 <212> <213〉 <220> <223> 30 201106967 <400> 32 gtcgcatgga gaccaccgta tgtattactg agtgcaggg <210〉 33 <211> 29 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>引子 <400〉 33 gagtgctagc tcacagtctg gtctcaccc <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>引子 <400> 34 gttttgggaa attccctatt aatgttagta ttccttggac tc <210〉 35 <211> 41 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223〉引子 <400〉 35 ctgcactcag taatacatac ggtggtctcc atgcgacgtg c <210〉 36 <211> 552 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>存在於pGA4·核心質體之核心編碼核苷酸序列 <400> 36 atggacattg atccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttcagt acgtgatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg ctctcaggca agcaattctg tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg gtaatttgga agatccaata tccagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt ccggcaacta ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga atatttggtg tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcagtgct aa <210〉 37 31 201106967 <211> 42 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400〉 37 gactgttaac caccatggac attgatcctt ataaagaatt tg <210〉 38 <211> 41 <212> DNA <213> 人造序列 <220〉 <223> 引子 <400> 38 gttgacataa ctgactacca aattaccacc cacccaggta g <210〉 39 <211> 42 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400〉 39 gtgggtggta atttggtagt cagttatgtc aacactaata tg <210〉 40 <211> 33 <212> DNA <213> 人造序列 <220〉 <223> 引子 <400〉 40 gactctcgag ttaaacagta gtctccggaa gtg <210> 41 <211> 42 <212> DNA <213> 人造序列 <220〉 <223> 引子 <400〉 41 gacgggatcc accatggaca ttgatcctta taaagaattt gg <210> 42 <211> 38 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400> 42 gcctgcttgc aggacaacag tagtctccgg aagtgttg <210> 43 <211> 702 <212〉 DNA <213>人造序列 <220〉 <223>存在於pMK-C/E質體之核心及env編碼核苷酸序列 <400> 43 atggacattg atccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc tttcttgcct 60 tctgacttct ttccttcagt acgtgatctt ctagatacag cctcagctct gtatcgggaa 120 gccttagtcc tgcaagcagg cttcttcctg ctgacccgta ttctgaccat tccacaaagc 180 ctggatagct ggtggaccag cctgaacttc ctgggtggca ccacggtttg cctgggtcag 240 gagtctcctg agcattgttc acctcaccat actgctctca ggcaagcaat tctgtgctgg 300 ggagaactaa tgactctagc tacctgggtg ggtggttggg caagcgcacg ctttagctgg 360 ctgagcctgc tggttccgtt cgtgcaatgg tttgtgggtc tgagcccaac cgtgtggctg 420 agcgtgaatt tggtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gactaaagtt ccgacaacta 480 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga atatttggtg 540 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaacgc accgatactg 600 agcaccctgc cagaaaccac cgtgggtccg agcttatatt ctatactgag cccattcctg 660 ccattactgc cgatctlctt ctgcctgtgg gtgtatatct ga 702 <210〉 44 <211> 36 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>引子 <400> 44 ccggagacta ctgttgtcct gcaagcaggc ttcttc 36 <210〉 45 <211〉 47 <212〉 DNA <213>人造序列 <220> <223>引子 <400> 45 gagtcattct cgacttgcgg ccgcttactg acccaggcaa accgtgg 47 <210〉 <211> <212> <213> 列 序 A造 4635s人 <220〉 <223>引子 <400> 46 gcgtgcgctt gcccactgac ccaggcaaac cgtgg 35 <210> 47 33 ft 201106967 <211> 38 <212〉 DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400〉 47 cggtttgcct gggtcagtgg gcaagcgcac gctttagc 38 <210〉 48 <211> 48 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400> 48 gagtcattct cgacttgcgg ccgcttacac gctcagccac acggttgg 48 <210〉 49 <211> 50 <212> DNA <213> 人造序列 <220〉 <223> 引子 <400> 49 ggggggctag caagcttcca ccatggacat tgatccttat aaagaatttg 50 <210> 50 <211> 45 <212〉 DNA <213> 人造序列 <220〉 <223> 引子 <400〉 50 gaaagaatcc agcttgcagg acgcactgag attcccgaga ttgag 45 <210〉 51 <211> 45 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400> 51 45 44 ctcaatctcg ggaatctcag tgcgtcctgc aagctggatt ctttc <210〉 52 <211> 44 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400〉 52 gagtcattct cgacttgcgg ccgcttagat ataaacccac aagc 34 201106967 <210> 53 <211> 52 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400> 53 ggggggctag caagcttcca ccatgaatgt tagtattcct tggactcata ag 52 <210〉 54 <211> 49 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400> 54 gagtcattct cgacttgcgg ccgctcacgg tggtctccat gcgacgtgc <210> 55 <211〉 9 <212> PRT <213〉人造序列 <220〉 <223>胜肽 <400〉 55
Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213>人造序列 <220〉 <223>胜肽 <400> 56
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210〉 57 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 胜肽 <400> 57 lie Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu 1 5 10 <210〉 58 <211〉 9 <212> PRT <213> 人造序列 35 49 s 201106967 <220〉 <223>胜肽 <400> 58
Val Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213>人造序列 <220〉 <223>胜肽 <400〉 59
Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu <210〉 60 <211> 10 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223>胜肽 <400〉 60
Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val 1 5 10 <210〉 61 <211> 34 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 引子 <400> 61 gactctcgag ttagcactga gattcccgag attg 34 36

Claims (1)

  1. 201106967 七、申請專利範圍： 1. 一種包含至少一個多肽或編碼該至少一個多肽之核酸 分子之免疫原性組成物，其中該至少一個多肽係選自於 由下列所組成之組群： (i) 包含源自於第一HBV病毒之聚合酶蛋白質至 少450胺基酸殘基的聚合酶部分； (ii) 包含源自於第二HBV病毒之核心蛋白質至少 100胺基酸殘基之核心部分；及 (iii) 源自於第三HBV病毒之HBsAg蛋白質15至100 連續胺基酸殘基之一個或多個免疫原性功能部位之env 部分；或 該聚合酶部分、核心部分、env部分、編碼該聚合 酶部分之該核酸分子、編碼該核心部分之該核酸分子及 /或編碼該env部分之該核酸分子的任一種組合。 2. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中該本發 明之免疫原性組成物包含該聚合酶部分、核心部分、env 部分中之至少二者之組合，或編碼該聚合酶部分之核酸 分子、編碼該核心部分之核酸分子及/或編碼env部分之 核酸分子中之至少二者之組合。 3. 如申請專利範圍第2項之免疫原性組成物，其中該組成 物係選自於由下列所組成之組群：⑴一種組成物包含該 聚合酶部分與該核心部分之組合或編碼該聚合酶部分 與該核心部分之核酸分子之組合；（ii) 一種組成物包含 該核心部分與該env部分之組合或編碼該核心部分與該 201106967 env部分之核酸分子之組合；及(iii)一種組成物包含該聚 合酶部分、該核心部分與該env部分之組合或編碼該聚 合酶部分、該核心部分與該env部分之核酸分子之組合。 4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之免疫原性組成 物，其中該第一、第二及第三HBV病毒係得自不同基因 型。 5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之免疫原性組成 物，其中έ玄第一、第一及第三HBV病毒中之至少二者係 得自相同HBV基因型及較佳第一、第二及第三HBV病毒 係得自相同基因型。 6·如申請專利範圍第5項之免疫原性組成物，其中該第 一、第二及第三HBV病毒係得自基因型D及較佳係得自 HBV單離株Y07587。 7. 如申請專利範圍第5項之免疫原性組成物，其中該第 一、第二及第三HBV病毒係得自基因型b或〇 8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之免疫原性組成 物，其中該聚合酶部份係藉正常存在於天然HBV聚合酶 N端之至少20胺基酸殘基至至多335胺基酸殘基截頭改 性。 9. 如申請專利範圍第8項之免疫原性組成物，其中該截頭 包括至少45胺基酸殘基至至多50胺基酸殘基，且較佳為 位在天然HBV聚合酶N端之起始子Met殘基後方頭47或 46胺基酸殘基。 10. 如申請專利範圍第9項之免疫原性組成物，其中該聚合 2 201106967 酶部分包含與SEQ ID NO:7所示胺基酸序列具有至少 80%相同度之胺基酸序列。 11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之免疫原性組成 物’其中該聚合酶部分經修改因此相較於天然HBV聚合 酶具有減低之反錄酶(RTase)酶催化活性。 12. 如申請專利範圍第〖丨項之免疫原性組成物，其中該聚合 酶部分包含與SEQ ID ΝΟ:1位置540及與SEQ ID NO:7位 置494相對應之Asp殘基取代成Asp以外之任一種胺基酸 殘基，及較佳取代成His殘基。 13. 如申請專利範圍第1至丨2項中任一項之免疫原性組成 物，其中該聚合酶部分經修改因此相較於天然HBV聚合 酶具有減低之RNaseH酶催化活性。 14. 如申請專利範圍第π項之免疫原性組成物，其中該聚合 酶部分包含與SEQ ID ΝΟ:1位置718及與SEQ ID NO:7位 置672相對應之Glu殘基取代成Glu以外之任一種胺基酸 殘基，及較佳取代成His殘基。 15. 如申請專利範圍第14項之免疫原性組成物，其中該聚合 酶部分包含與SEQ ID NO:8所述胺基酸序列或與SEQ ID NO:7所示胺基酸序列具有於位置494之Asp殘基取代成 His殘基及於位置672之Glu殘基取代成His殘基具有至 少80%相同度之胺基酸序列。 16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項之免疫原性組成 物，其中該聚合酶部分係同框架融合至異源斥水性序 201106967 17. 如申請專利範圍第16項之免疫原性組成物，其中該聚合 酶部分係同框架融合至狂犬病糖蛋白之信號胜肽及穿 膜胜肽，及其中該狂犬病信號序列係同框架融合於該聚 合酶部分之N端，及該狂犬病穿膜序列係同框架融合於 該聚合酶部分之C端。 18. 如申請專利範圍第π項之免疫原性組成物，其中該聚合 酶部分包含與SEQ ID NO:9所示胺基酸序列具有至少 80%相同度之胺基酸序列。 19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項之免疫原性組成 物，其中該核心部分係藉正常存在於天然HBV核心之C 端的至少10胺基酸殘基至至多40胺基酸殘基截頭改性。 20. 如申請專利範圍第19項之免疫原性組成物，其中該截頭 包括天然HBV核心之末35胺基酸殘基。 21. 如申請專利範圍第20項之免疫原性組成物，其中該聚合 酶部分包含與SEQ ID NO:10所示胺基酸序列具有至少 80%相同度之胺基酸序列。 22. 如申請專利範圍第1至21項中任一項之免疫原性組成 物，其中該核心部分經修改因此具有相較於天然HBV核 心對HBV包膜蛋白之辨識及/或與HBV包膜蛋白交互作 用減低。 23. 如申請專利範圍第22項之免疫原性組成物，其中該核心 部分包含與SEQ ID ΝΟ:11所示胺基酸序列具有至少 80%相同度之胺基酸序列。 24. 如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原性組成 201106967 '、中π亥用於本發明之一個或多個免疫原性功能部位 係選自於由下列所組成之組群： 〇自位置14'51延伸之env蛋白質（HBsAg)部分(env 1功能部位）； 〇自位置165-194延伸之env蛋白質（HBsAg)部分 (env 2功能部位）； 〇自位置81-106延伸之env蛋白質（HBsAg)部分 (env 3功能部位）； 0自位置202-226延伸之env蛋白質（HBsAg)部分 (env 4功能部位）；及 〇其任一種組合。 25,如申請專利範圍第24項之免疫原性組成物，其中該免疫 原性功能部位包含與SEQ ID NO:12-15所示胺基酸序列 之任一者具有至少80%相同度之胺基酸序列。 26·如申請專利範圍第25項之免疫原性組成物，其中該env 部分包含與SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示胺基酸 序列具有至少80%相同度之胺基酸序列。 27.如申請專利範圍第1至26項中任一項之免疫原性組成 物’其中該等聚合酶、核心及/或env部分係成詞·或全部 共同於同框架融合於單一多肽鏈。 28·如申請專利範圍第27項之免疫原性組成物，其中該env 部分係同框架融合於該核心部分之C端。 29·如申請專利範圍第28項之免疫原性組成物，其中該核心 部分與env部分之融合多肽係選自於由下列所組成之組 201106967 群： 〇 —多肽包含與SEQ ID NO:18所示胺基酸序列具 有至少80%相同度之胺基酸序列； 〇 —多肽包含與SEQ ID NO:19所示胺基酸序列具 有至少80%相同度之胺基酸序列；及 〇 —多肽包含與SEQIDNO:20所示胺基酸序列，或 與SEQ ID NO:20所示胺基酸序列始於殘基1而終於殘基 251之部分，或另外與SEQ ID NO:20所示胺基酸序列始 於殘基1而終於殘基221之部分；或SEQIDNO:20缺殘基 77-84之已刪除版本具有至少80%相同度之胺基酸序列。 30. —種核酸分子，編碼如申請專利範圍第1及8至18項中任 一項所定義之聚合酶部分、如申請專利範圍第1及19至 23項中任一項所定義之核心部分，及如申請專利範圍第 1及24至29項中任一項所定義之env部分或其任一種組 合0 31. 如申請專利範圍第30項之核酸分子，其中該核酸分子係 選自於由下列所組成之組群： 〇 —核酸分子包含與SEQ ID NO:21所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列； 〇 —核酸分子包含與SEQ ID NO:22所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列； 〇 —核酸分子包含與SEQ ID NO:21所示核苷酸序 列帶有位置1480之G核苷酸取代成C，位置2014之G核苷 酸取代成C及位置2016之A核苷酸取代成T具有至少80% 201106967 相同度之核苷酸序列； 〇 —核酸分子包含與SEQ ID NO:23所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列； 〇 —核酸分子包含與SEQ ID NO:24所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列； 〇 —核酸分子包含與SEQ ID NO:25所示核苷酸序 列具有至少80%相同度之核苷酸序列；及 〇 —核酸分子包含與SEQ ID NO:26所示核苷酸序 列、或與SEQ ID NO:26所示核苷酸序列始於核苷酸1而 終於核苷酸753之部分、或與SEQ ID NO:26所示核苷酸 序列始於核苷酸1而終於核苷酸663之部分、或與缺乏 SEQ ID NO:26自位置229之G延伸至位置252之A部分之 刪除版本具有至少80%相同度之核苷酸序列。 32. —種載體，包含一個或多個如申請專利範圍第30或31項 定義之核酸分子。 33. 如申請專利範圍第32項之載體，其中該載體為質體或病 毒載體。 34. 如申請專利範圍第33項之載體，其中該病毒載體為複製 缺陷腺病毒載體。 35. 如申請專利範圍第34項之載體，其中該核酸分子係插入 而置換E1區。 36. 如申請專利範圍第33項之載體，其中該病毒載體為痘病 毒載體及更特別係得自金絲雀痘病毒、禽痘病毒或牛痘 病毒。 7 201106967 37·如申凊專利範圍第36項之載體，其中該牛痘病毒為改性 安卡拉(Ankara)(MVA)種系。 38·如申a月專利範圍第32至37項中任一項之載體，其中該載 體攜載編碼該聚合酶部分、該核心部分及該env部分之 核酸分子。 39. 如申請專利範圍第32至37項中任一項之載體，其中該載 體只攜載編碼該聚合酶部分、該核心部分及該env部分 之核酸分子中只有一者或二者。 40. 如申請專利範圍第39項之載體，其中該載體係選自於由 下列所組成之組群： (1) 一 MVA載體包含位在牛痘啟動子諸如7.5K啟 動子控制下之核酸分子及編碼聚合酶部分其包含SEq ID NO:7、8或9所示胺基酸序列或SEQ ID NO:7所示胺基 酸序列帶有位置494之Asp殘基取代成His殘基及位置 672之Glu殘基取代成His殘基； (ii) 一 MVA載體包含位在牛痘啟動子諸如pH5r啟 動子控制下之核酸分子及編碼核心部分及env部分其包 含如SEQIDN〇:18或19所示胺基酸序列； (iii) E1-缺陷Ad載體包含經插入置換E1區位在 CMV啟動子控制下之核酸分子及編碼聚合酶部分其包 含SEQ ID N〇:7、8或9所示胺基酸序列或SEQ ID NO:7 所示胺基酸序列帶有位置494之Asp殘基取代成His殘基 及位置672之Glu殘基取代成His殘基；及 (iv) E1-缺陷Ad載體包含於經插入置換E1區位在 8 201106967 C Μ V啟動子控制下之核酸分子及編碼核心部分及e η v部 分，其包含如SEQroNO:18、19或20所示胺基酸序列或 SEQ ID NO:20始於殘基1而終於殘基251之該部分或 SEQ ID NO:20始於殘基1而終於殘基221之該部分。 41. 一種傳染性病毒粒子，包含如申請專利範圍第30至31項 中任一項之核酸分子或如申請專利範圍第32至40項中 任一項之載體。 42. 如申請專利範圍第41項之傳染性病毒粒子，其中該傳染 性病毒粒子係經由一種方法製造，該方法包含下列步 驟： (e) 將本發明之病毒載體導入適當細胞系， (f) 於適當條件下培養該細胞系因而允許該傳染性 病毒粒子之製造， (g) 自該細胞系之培養回收所製造的傳染性病毒粒 子，及 (h) 選擇性地純化該已回收之傳染性病毒粒子。 43. —種宿主細胞，包含如申請專利範圍第30至31項中任一 項之核酸分子、如申請專利範圍第32至40項中任一項之 載體或如申請專利範圍第4 2或4 3項之傳染性病毒粒子。 44. 一種組成物，包含如申請專利範圍第30至31項中任一項 之核酸分子、如申請專利範圍第32至40項中任一項之載 體或如申請專利範圍第42或43項之傳染性病毒粒子或 如申請專利範圍第43項之宿主細胞及藥學上可接受之 載媒劑。 201106967 45. 如申請專利範圍第44項之組成物，其進一步包含一種或 多種適合用於人類之系統性或黏膜施用之輔劑。 46. 如申請專利範圍第44或45項之組成物，其係調配供肌肉 或皮下投予。 47. 如申請專利範圍第44至46項中任一項之組成物，其包含 自約105至約1013病毒載體或傳染性病毒粒子之感染單 位。 48. —種如申請專利範圍第1及8至29項中任一項定義之 HBV部分、如申請專利範圍第1至29項中任一項之免疫 原性組成物、如申請專利範圍第30至31項中任一項之核 酸分子、如申請專利範圍第32至40項中任一項之載體、 如申請專利範圍第41或42項之傳染性病毒粒子、如申請 專利範圍第43項之宿主細胞或如申請專利範圍第44至 47項中任一項之組成物中之至少一者用於製備意圖用 於治療或預防HBV感染或HBV相關疾病或病理狀況之 藥物之用途。 49. 一種如申請專利範圍第1及7至29項中任一項定義之 HBV部分、如申請專利範圍第1至29項中任一項之免疫 原性組成物、如申請專利範圍第30至31項中任一項之核 酸分子、如申請專利範圍第32至40項中任一項之載體、 如申請專利範圍第41或42項之傳染性病毒粒子、如申請 專利範圍第43項之宿主細胞或如申請專利範圍第44至 47項中任一項之組成物中之至少一者用於製備意圖用 於治療或預防HBV感染或HBV相關疾病或病理狀況之 10 201106967 藥物之用途。 50·如申請專利範圍第48或49項之用途，其係用於治療患有 慢性B型肝炎病毒感染之病人。 51·如申請專利範圍第48至50項中任一項之用途，其中該用 途係組合照護標準使用。 52. 如申凊專利範圍第5 i項之用途，其中該照護標準包含細 胞激素及/或選自於由拉美夫定(〖amivudine)、安提卡芙 (entecavir)、特比夫定（telbivudine)、阿迪佛芙 (adefovir) ' 底匹佛席（dipivoxil)及特諾佛芙（tenofovir)所 組成之組群中之核苷酸或核苷類似物。 53. —種於宿主有機體誘導或刺激抗b型肝炎病毒hbV之免 疫反應之方法，包含對該有機體投予如申請專利範圍第 1及7至29項中任一項定義之HBV部分、如申請專利範圍 第1至29項中任一項之免疫原性組成物、如申請專利範 圍第30至31項中任一項之核酸分子、如申請專利範圍第 32至40項中任一項之載體、如申請專利範圍第4ι或幻項 之傳染性病毒粒子、如申請專利範圍第43項之宿主細胞 或如申請專利範圍第44至47項中任一項之組成物中2 至少一者’因而誘導或刺激該免疫反應。 54. 如申請專魏圍第53項之方法，其巾該免狀應為細胞 及CD4+及/或CD8+媒介之免疫反應。 55. —種用於HBV感染之治療之套件組，其中該套件組包含 多種選自於由如申請專利範圍第至29項中任—項 定義之HBV部分、如申請專利範圍第丄至29項中任—工 項 201106967 之免疫原性組成物、如申請專利範圍第30至31項中任一 項之核酸分子、如申請專利範圍第32至40項中任一項之 載體、如申請專利範圍第41或42項之傳染性病毒粒子、 如申請專利範圍第43項之宿主細胞或如申請專利範圍 第44至47項中任一項之組成物所組成之組群之活性劑。 56. 如申請專利範圍第55項之套件組，其包含一第一載體包 含如申請專利範圍第1及7至18項中任一項定義之編碼 聚合酶部分之核酸分子，及一第二載體其包含如申請專 利範圍第1及19至29項中任一項定義之編碼核心部分及 /或env部分之核酸分子。 57. 如申請專利範圍第56項之套件組，其中該第一載體為如 申請專利範圍第40(i)項定義之MVA載體及該第二載體 為如申請專利範圍第40(ii)項定義之MVA載體。 58. 如申請專利範圍第56項之套件組，其中該第一載體為如 申請專利範圍第40(iii)項定義之Ad載體及該第二載體 為如申請專利範圍第40(iv)項定義之Ad載體。 59. 如申請專利範圍第56至58項中任一項之套件組，其進一 步包含表達免疫調節因子之一第三載體。 12
TW099126293A 2009-08-07 2010-08-06 用以治療ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）感染之組成物 TWI555531B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09305742 2009-08-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201106967A true TW201106967A (en) 2011-03-01
TWI555531B TWI555531B (zh) 2016-11-01

Family

ID=43087099

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW099126293A TWI555531B (zh) 2009-08-07 2010-08-06 用以治療ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）感染之組成物

Country Status (16)

Country Link
US (2) US9393299B2 (zh)
EP (1) EP2461826A2 (zh)
JP (2) JP5897464B2 (zh)
KR (1) KR20120052352A (zh)
CN (2) CN105535960B (zh)
BR (1) BR112012002628B1 (zh)
CA (1) CA2770075C (zh)
HK (1) HK1223295A1 (zh)
IL (1) IL217926A (zh)
MX (1) MX2012001592A (zh)
NZ (1) NZ598000A (zh)
RU (1) RU2555346C2 (zh)
SG (1) SG178254A1 (zh)
TW (1) TWI555531B (zh)
WO (1) WO2011015656A2 (zh)
ZA (1) ZA201200899B (zh)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG178254A1 (en) * 2009-08-07 2012-03-29 Transgene Sa Composition for treating hbv infection
EP2720716B1 (en) 2011-06-14 2018-03-21 Globeimmune, Inc. Immunotherapeutic compositions for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
TWI623618B (zh) 2011-07-12 2018-05-11 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2014009433A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
TWI690322B (zh) 2012-10-02 2020-04-11 法商傳斯堅公司 含病毒的調配物及其使用
US9946495B2 (en) * 2013-04-25 2018-04-17 Microsoft Technology Licensing, Llc Dirty data management for hybrid drives
WO2016020538A1 (en) * 2014-08-08 2016-02-11 Transgene Sa Hbv vaccine and antibody combination therapy to treat hbv infections
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
CN114262380A (zh) 2015-03-18 2022-04-01 欧姆尼赛特有限公司 包含经修饰的α病毒表面糖蛋白与肿瘤相关抗原的融合蛋白及其方法
CN106148404B (zh) * 2015-03-25 2020-01-24 复旦大学 一种人乙型肝炎病毒重组载体及其应用
JP6566368B2 (ja) * 2015-04-16 2019-08-28 国立研究開発法人産業技術総合研究所 Ｂ型肝炎ウイルス分泌阻害剤
SI3371316T1 (sl) * 2015-11-04 2023-02-28 Hookipa Biotech Gmbh Cepivo proti virusu hepatitisa B
DK3373959T3 (da) 2015-11-12 2022-09-19 Hookipa Biotech Gmbh Arenaviruspartikler som cancervacciner
US9963751B2 (en) 2015-11-24 2018-05-08 The Penn State Research Foundation Compositions and methods for identifying agents to reduce hepatitis B virus covalently closed circular DNA
SG11201805229YA (en) * 2016-01-12 2018-07-30 Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh Means and methods for treating hbv
EP3443107A1 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Synthetic Genomics, Inc. Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof
CA3026054A1 (en) 2016-05-30 2017-12-07 Geovax Inc. Compositions and methods for generating an immune response to hepatitis b virus
JP2019523648A (ja) * 2016-06-15 2019-08-29 オックスフォード ユニバーシティ イノベーション リミテッドＯｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ａｂｃ４ａを発現させるためのデュアル重複アデノ随伴ウイルスベクターシステム
EP3276006A1 (en) * 2016-07-27 2018-01-31 Theravectys Lentiviral vectors for expression of hepatitis b virus (hbv) antigens
EP3522920A2 (en) 2016-10-10 2019-08-14 Transgene SA Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
CN110073002A (zh) 2016-10-17 2019-07-30 合成基因组公司 重组病毒复制子体系及其用途
AU2017372731B2 (en) 2016-12-05 2024-05-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing gene expression
GB201705765D0 (en) * 2017-04-10 2017-05-24 Univ Oxford Innovation Ltd HBV vaccine
EP3624851A1 (en) 2017-05-15 2020-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
EP3624845A1 (en) 2017-05-15 2020-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
GB201721069D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
US11389531B2 (en) 2017-12-19 2022-07-19 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines
US11020476B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Methods and compositions for inducing an immune response against Hepatitis B Virus (HBV)
US11021692B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof
KR20200100745A (ko) * 2017-12-19 2020-08-26 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 B형 간염 바이러스(hbv)에 대한 면역 반응 유도를 위한 방법 및 조성물
JP2021506431A (ja) * 2017-12-19 2021-02-22 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）ワクチンの送達のための方法および装置
EP3740245A4 (en) 2018-01-19 2022-01-05 Janssen Pharmaceuticals, Inc. INDUCTION AND ENHANCEMENT OF IMMUNE RESPONSES USING RECOMBINATION REPLICON SYSTEMS
US11608362B2 (en) * 2018-03-06 2023-03-21 Precigen, Inc. Hepatitis B vaccines and uses of the same
KR102234027B1 (ko) * 2018-05-09 2021-03-31 서울대학교산학협력단 B형 간염 바이러스 유래 폴리펩티드 및 이의 항바이러스 용도
CA3143680A1 (en) * 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and anti-pd-1 or anti-pd-l1 antibody
CN114340663A (zh) * 2019-06-18 2022-04-12 爱尔兰詹森科学公司 乙型肝炎病毒(HBV)疫苗和靶向HBV的RNAi的组合
KR20220090497A (ko) * 2019-08-29 2022-06-29 비르 바이오테크놀로지, 인코포레이티드 B형 간염 바이러스 백신
US11497808B2 (en) * 2019-09-30 2022-11-15 Gilead Sciences, Inc. HBV vaccines and methods treating HBV
JP2023505304A (ja) 2019-12-07 2023-02-08 アイエスエー ファーマシューティカルズ ビー．ヴイ． Ｂ型肝炎ウイルスに関連する疾患の治療

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
CA1223831A (en) 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
FR2583429B1 (fr) 1985-06-18 1989-11-03 Transgene Sa Vecteur d'expression de l'interferon u dans les cellules de mammifere, procede pour sa mise en oeuvre et produit obtenu et composition pharmaceutique contenant l'interferon u
FR2650838A1 (fr) 1989-08-09 1991-02-15 Transgene Sa Vecteurs d'expression du facteur ix dans une cellule eucaryote superieure, procede de preparation de facteur ix par des animaux transgeniques et facteur ix obtenu
NZ235315A (en) * 1989-09-19 1991-09-25 Wellcome Found Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins and their construction
EP0491077A1 (en) 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
NZ270605A (en) 1991-08-26 1997-07-27 Cytel Corp Cytotoxic t lymphocyte inducing peptides (6-19 amino acids) and pharmaceutical compositions thereof
US6013638A (en) 1991-10-02 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adenovirus comprising deletions on the E1A, E1B and E3 regions for transfer of genes to the lung
GB9223084D0 (en) 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
CN1118573A (zh) 1993-02-26 1996-03-13 斯克瑞普斯研究所 诱导细胞毒t淋巴细胞应答乙型肝炎病毒的肽类
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
US6133028A (en) 1993-05-28 2000-10-17 Transgene S.A. Defective adenoviruses and corresponding complementation lines
JP3626187B2 (ja) * 1993-06-07 2005-03-02 バイカル インコーポレイテッド 遺伝子治療に適するプラスミド
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
FR2727689A1 (fr) 1994-12-01 1996-06-07 Transgene Sa Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral
US5837520A (en) 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
ATE445705T1 (de) 1995-06-15 2009-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane rekombinante adenoviren zur gentherapie
CA2224477A1 (en) * 1995-06-20 1997-01-09 Margherita Melegari Inhibition of hepatitis b replication
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
CZ438398A3 (cs) 1996-07-01 1999-03-17 Rhone-Poulenc Rorer S. A. Způsob přípravy rekombinantních adenovirů
US5981274A (en) * 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
EP1760151B1 (en) 1996-11-20 2012-03-21 Crucell Holland B.V. Adenovirus compositions obtainable by an improved production and purification method
IL130198A (en) 1996-12-13 2005-09-25 Schering Corp Methods for purifying viruses
EP0988053A1 (en) 1997-06-11 2000-03-29 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Purified saponins as oral adjuvants
FR2766091A1 (fr) 1997-07-18 1999-01-22 Transgene Sa Composition antitumorale a base de polypeptide immunogene de localisation cellulaire modifiee
US6596501B2 (en) * 1998-02-23 2003-07-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of diagnosing autoimmune disease
FR2777570A1 (fr) 1998-04-17 1999-10-22 Transgene Sa Mutant ayant une activite phosphoribosyl transferase
JP3864610B2 (ja) 1998-05-21 2007-01-10 旭硝子株式会社 水分散型撥水撥油剤組成物およびその製造方法
IL143475A0 (en) 1998-12-04 2002-04-21 Biogen Inc Hepatitis b virus core antigen particles and vaccines and pharmaceutical compositions containing the same
FR2787465A1 (fr) 1998-12-21 2000-06-23 Transgene Sa Procede d'inactivation des virus enveloppes dans une preparation virale de virus non enveloppes
HUP0104794A3 (en) 1998-12-31 2006-03-28 Centelion Method for separating viral particles
DE60029195T2 (de) 1999-02-22 2007-06-28 Transgene S.A. Verfahren zur Gewinnung von purifizierter Virenzusammensetzung
DE60043126D1 (de) 1999-05-17 2009-11-19 Crucell Holland Bv Von Adenovirus abgeleitete Gentransfervehikel, die zumindest ein Element des Adenovirus Typ 35 enthalten
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
FR2803599B1 (fr) * 2000-01-06 2004-11-19 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau virus mute de l'hepatite b, ses constituants nucleiques et proteiques et leurs applications
CA2341356C (en) 2000-04-14 2011-10-11 Transgene S.A. Poxvirus with targeted infection specificity
WO2001085208A2 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays and vaccines
US6858590B2 (en) * 2000-08-17 2005-02-22 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
EP1390398A2 (en) 2001-05-30 2004-02-25 Transgene S.A. Adenovirus protein ix, its domains involved in capsid assembly, transcriptional activity and nuclear reorganization
JP4502642B2 (ja) * 2002-02-07 2010-07-14 メルボルン ヘルス ヌクレオシドアナログに対する感受性の変化を有するウイルス変種およびその使用
US7351413B2 (en) 2002-02-21 2008-04-01 Lorantis, Limited Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis
IL164802A0 (en) 2002-04-25 2005-12-18 Crucell Holland Bv Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof
EP1606397A1 (en) 2003-03-17 2005-12-21 Merck & Co., Inc. Adenovirus serotype 24 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
CA2519207A1 (en) 2003-03-28 2004-11-11 Merck & Co., Inc. Adenovirus serotype 34 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
FR2855758B1 (fr) * 2003-06-05 2005-07-22 Biomerieux Sa Composition comprenant la polyproteine ns3/ns4 et le polypeptide ns5b du vhc, vecteurs d'expression incluant les sequences nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapeutique
US7695960B2 (en) * 2003-06-05 2010-04-13 Transgene S.A. Composition comprising the polyprotein NS3/NS4 and the polypeptide NS5B of HCV, expression vectors including the corresponding nucleic sequences and their therapeutic use
CA2529997A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-29 Dade Behring Marburg Gmbh Novel surface protein (hbsag) variant of hepatitis b virus
WO2005010149A2 (en) 2003-07-18 2005-02-03 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Subgroup b adenoviral vectors for treating disease
US7534585B2 (en) 2003-07-21 2009-05-19 Transgene S.A. Multifunctional cytokines
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
DE10339927A1 (de) * 2003-08-29 2005-03-24 Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen
EP1692278B1 (en) * 2003-10-21 2013-07-03 Melbourne Health Hbv variants detection and application
GB0328753D0 (en) 2003-12-11 2004-01-14 Royal Veterinary College The Hepatitis B vaccines
HK1107360A1 (en) 2004-11-08 2008-04-03 Transgene Sa Kit of parts designed for implementing an antitumoral or antiviral treatment in a mammal
EP1764369A1 (de) * 2005-09-16 2007-03-21 Rhein Biotech Gesellschaft für neue biotechnologische Prozesse und Produkte mbH Vakzine enthaltend trunkiertes HBV core protein plus Saponin-basierendes Adjuvants
GB0522578D0 (en) 2005-11-04 2005-12-14 King S College London Ribozymal nucleic acid
MX2008011361A (es) * 2006-03-09 2008-09-15 Transgene Sa Proteina de fusion no-estructural del virus de hepatitis c.
MX2008016036A (es) * 2006-06-20 2009-04-07 Transgene Sa Vacuna viral recombinante.
CN101573449B (zh) * 2006-08-14 2013-09-18 浦项工大产学协力团 用于治疗慢性乙型肝炎的dna疫苗及其制备方法
WO2008138648A1 (en) * 2007-05-15 2008-11-20 Transgene S.A. Vectors for multiple gene expression
CN102015753A (zh) * 2008-01-25 2011-04-13 海德堡吕布莱希特-卡尔斯大学 乙肝病毒(HBV)的疏水性修饰的preS-衍生肽及其作为载体将化合物特异性递送到肝脏的用途
SG178254A1 (en) * 2009-08-07 2012-03-29 Transgene Sa Composition for treating hbv infection
US10076570B2 (en) * 2009-08-07 2018-09-18 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection

Also Published As

Publication number Publication date
IL217926A (en) 2016-07-31
CA2770075A1 (en) 2011-02-10
US9393299B2 (en) 2016-07-19
CN105535960B (zh) 2019-06-04
ZA201200899B (en) 2012-10-31
KR20120052352A (ko) 2012-05-23
AU2010280710A1 (en) 2012-03-01
JP2013501038A (ja) 2013-01-10
IL217926A0 (en) 2012-03-29
RU2555346C2 (ru) 2015-07-10
RU2012107671A (ru) 2013-09-20
WO2011015656A2 (en) 2011-02-10
CN105535960A (zh) 2016-05-04
JP2016074707A (ja) 2016-05-12
CN102573903A (zh) 2012-07-11
WO2011015656A3 (en) 2011-03-31
US20130011435A1 (en) 2013-01-10
US20170072047A1 (en) 2017-03-16
HK1223295A1 (zh) 2017-07-28
TWI555531B (zh) 2016-11-01
BR112012002628A2 (pt) 2016-11-08
NZ598000A (en) 2013-10-25
CA2770075C (en) 2021-08-24
JP5897464B2 (ja) 2016-03-30
CN102573903B (zh) 2015-12-02
BR112012002628B1 (pt) 2021-09-08
EP2461826A2 (en) 2012-06-13
MX2012001592A (es) 2012-05-22
JP6246778B2 (ja) 2017-12-13
SG178254A1 (en) 2012-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI555531B (zh) 用以治療ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）感染之組成物
US10662414B2 (en) Methods for treating or preventing HBV infection or HBV related diseases
US10857226B2 (en) Composition for treating HBV infection
AU2010280710B2 (en) Composition for treating HBV infection