TW201026330A - Antibodies - Google Patents

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TW201026330A
TW201026330A TW098144133A TW98144133A TW201026330A TW 201026330 A TW201026330 A TW 201026330A TW 098144133 A TW098144133 A TW 098144133A TW 98144133 A TW98144133 A TW 98144133A TW 201026330 A TW201026330 A TW 201026330A
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Jes Thorn Clausen
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Description

201026330 -- 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種可特異性結合組織因子路徑抑制子 (TFPI)之抗體。 【先前技術】 在患有凝血障礙之個體中，諸如在患有A型及B型血 友病之人類中，凝血級聯之多個步驟由於例如凝血因子缺 乏或凝血因子存在不足而變得功能異常。凝血級聯中之一 G 部分之此功能異常引起凝血不足及可能危脅生命之出血， 或對内部器官（諸如關節）之損害。患有A型及B型血友 病之個體（諸如人類）可分別接受諸如外生Fvnia或Fixa • 之凝血因子置換療法。然而，此等患者處於產生針對此等 . 外生因子之「抑制子」（抗體）的風險中，致使先前有效之 療法無效。此外，外生凝血因子僅可靜脈内投予，此對患 者相當不便及不適。舉例而言，對嬰兒及學步童須以手術 方式將靜脈内導管插入胸部靜脈中以確保通入靜脈。此使 ® 付其處於產生細菌感染之巨大風險中。患有凝血障礙之個 體僅會在已開始出血之後接受治療，而非當作預防措施， 此往往影響其總體生活品質。 因此，尤其在血友病群體中，及一般在患有凝血障礙 之個體中仍存在許多未滿足之醫學需要。 田血s壁受損時，組織因子（TF)暴露於循環血液之 内含物且TF與因子V11/活化之因子VII ( FVII/FVIIa )在帶 有TF之細胞表面上形成複合物。此使得因子X ( )活化 為FXa ’ FXa與FVa —起產生有限量之凝血酶（FIIa卜少 201026330 量凝血酶活化血小板’引起磷脂暴露於表面，促進由 FVIIIa/FIXa組成之因子X酶複合物之結合。 因子X酶複合物產生大量FXa，隨後促進大量凝血酶 產生°大量凝血酶產生係形成機械穩固之血纖維蛋白結構 及止血栓穩定化所必需。血友病患者中缺乏或存在低含量 之FVIII或FIX，且由於缺乏因子X酶活性而產生FXa之 能力較低且不足以促進傳播期之凝血。相反，TF介導之初 始期並不依賴於因子X酶複合物之形成。然而，TF路徑在 初始FXa產生之後不久被血漿抑制子阻斷。 組織因子路徑抑制子（TFPI )藉由中和FXa之催化活 性且藉由在FXa存在下抑制TF_FVIIa複合物來下調正在進 行之凝血。TFPI抑制細胞表面上之TF/FVIIa/FXa複合物或 抑制FXa釋放，繼而抑制FVIIa/TF。 【發明内容】 本發明之發明人已鑑定出可特異性結合組織因子路徑 抑制子（「TFPI」，有時稱作「TFPn」）且從而調節其活性 之單株抗體。本發明係關於此等抗體及衍生自此等抗體或 與此等抗體具有類似結合特性之其他相關抗體。 因此，本發明係關於一種可特異性結合組織因子路徑 抑制子（TFPI)且減少例如人類FVIU不足血漿及/ 或（b)人類全血之凝結時間之抗體。 一種抗體包含SEQ ID NO: 4之輕鏈可變區及SEq ID N〇_8之重鏈可變區。另一種抗體包含SEQ ID Ν〇: Μ之輕 鍵可變區及SEQ ID NO: 18之重鏈可變區。 本發明亦提供編碼本發明之抗體的聚核苷酸，諸如編 201026330 碼本發明之抗體輕鏈及/或抗體重鍵之聚核普酸。 本發明亦提供醫藥組成物，其包含本發明之抗體或聚 核苷酸，及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。 本發明之抗體、聚核普酸及組成物亦可供（a)治療或 預防凝血障礙（出企病症）$ (b)刺激凝血使用。亦即， 本毛月提供-種（a)治療或預防凝血障礙（出血病症）或 (b )刺激凝血之方法’該方法包含向有需要之患者投予治 療或預防有效量之本發明之抗體、聚核苷酸或組成物。 此外，本發明提供本發明之該單株抗體的給藥攝生法。 序列表簡單說明 SEQIDNO: 1顯示人類TFpi之胺基酸序列（信號肽序 列省略）。 SEQ ID NO: 2顯示測定抗體之結合性抗原決定基所用 的構築體之胺基酸序列。該構築體包含人類TFpI的胺基酸 91至150及C端His6標記。 SEQ ID NO: 3、5 及 4 顯示 MuTFPI4F36 ( TFPI-4F36A1B2)單株抗體之輕鏈可變域（vL)之聚核苷酸（有 義及反義）及多肽序列。SEq ID NO: 6顯示MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)單株抗體之輕鏈的胺基酸序列。信號肽 序列省略。 SEQ ID NO: 7、9 及 8 顯示 MuTFPI4F36 ( TFPI-4F36A1B2)單株抗體之重鏈可變域（VH) 之聚核苷酸（有 義及反義）及多肽序列。SEq ID N〇: 顯示MutFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)單株抗體之重鏈的胺基酸序列。信號肽 201026330 序列省略。 SEQ ID NO: 11顯示用於重鏈可變域擴增之反向引子之 序列且SEQ ID NO: 12顯示用於輕鏈擴增之反向引子之序 列。 SEQ ID NO: 13-15 分別提供人類化單株抗體 HzTFPI4F36 ( mAbTFPI202 1 )之輕鏈可變域（VL )之有義 聚核苷酸、反義聚核苷酸及多肽序列。信號肽序列省略。 SEQ ID NO: 16-18 分別提供人類化單株抗體 HzTFPI4F36 ( mAbTFPI2021 )之重鏈可變域(VH )之有義 聚核苷酸、反義聚核苷酸及多肽序列。 SEQ ID NO: 19-21 分別提供人類化單株抗體 HzTFPI4F36 ( mAbTFPI2021 )之輕鏈（LC)之有義聚核苷 酸、反義聚核苷酸及多肽序列。 SEQ ID NO: 22-24 分別提供人類化單株抗體 HzTFPI4F36 ( mAbTFPI2021 )之重鏈（HC)之有義聚核苷 酸、反義聚核苷酸及多肽序列。信號肽序列省略。 SEQ ID NO: 25-26 分別提供 CDR 移植 HzTFPI4F36 之 輕鏈可變域的核酸及胺基酸序列。信號肽序列省略。 SEQ ID NO: 27-28 分別提供 CDR 移植 HzTFPI4F36 之 重鏈可變域的核酸及胺基酸序列。信號肽序列省略。 SEQ ID NO: 29 提供 CDR 移植 HzTFPI4F3 6(人類 /c 鏈） 之輕鏈的胺基酸序列。信號肽序列省略。 SEQ ID NO: 30 提供 CDR 移植 HzTFPI4F36 (為人類 IgG4 ( S241P))之重鏈的胺基酸序列。信號肽序列省略。 SEQ ID NO: 3 1提供用於MuTFPI4F36之輕鏈人類化的 201026330 -* 生殖系序列VKII_A18/JK4。信號肽序列省略。 SEQ ID NO·· 32提供用於MuTFPI4F36之重鏈人類化的 生殖系序列VH3_21/JH6。信號肽序列省略。 SEQ ID NO: 33 提供 MuTFPI4F36AlB2 重鏈 Fab 之胺基 酸序列。信號肽省略。 SEQ ID NO: 34提供HzTFPI4F36重鏈Fab之胺基酸序 列。信號肽省略。 【實施方式】 © 本發明係關於可結合TFPI之抗體。抗體較佳特異性結 合TFPI，亦即其可結合TFPI，但不結合其他分子或以較低 親和力結合其他分子。特定言之，本發明係關於可結合TFPI 且調節其活性之抗體。本發明之抗體因此可具有縮短凝血
. 時間之能力。舉例而言，本發明之抗體可具有縮短人類FVIII 不足血漿之凝結時間或減少人類全血之凝結時間（如在血 栓彈力圖（thromboelastography，TEG )分析中所量測的） 之能力。本發明亦關於此等抗體之用途，諸如洽療及醫藥 © 用途。 如本文中所用，術語TFPI涵蓋可來源於任何適合生物 體的任何天然存在形式之TFPI。舉例而言，用於如本文所 述之用途的TFPI可為哺乳動物TFPI，諸如人類、小鼠、大 鼠、靈長類動物、牛、羊或豬TFPI。TFPI較佳為人類TFPI。 TFPI可為成熟形式之TFPI，諸如已在適合細胞内經歷轉譯 後加工之TFPI蛋白質。此成熟TFPI蛋白質可例如經糖基 化。TFPI可為全長TFPI蛋白質。術語TFPI亦涵蓋此等TFPI 分子之變異體、同功異構物及其他同源物。變異體TFPI分 7 201026330 子一般特徵在於與天然存在之TFPI具有相同類型之活性， 諸如中和FXa之催化活性的能力，或抑制TF_FVIIa/FXa複 合物之能力。 本發明之抗體具有與TFpi結合之能力。本發明之抗體 較佳特異性結合TFPI。亦即，本發明之抗體結合TFpi的親 和力較佳大於其結合另一種分子之結合親和力。本發明之 抗體能夠結合或特異性結合如本文所述之TFpi分子，諸如 本文所述之任何標靶分子。 術語「結合親和力」在本文中用作兩種分子（例如抗 體或其片段與抗原）之間非共價相互作用力之度量。術語 「結合親和力」用以描述單價相互作用（固有活性）。 兩種分子（例如抗體或其片段與抗原）之間經由單價 相互作用的結合親和力可藉由測定解離常數來定量。 KD又可藉由量測複合物形成及解離之動力學（例如藉由 SPR方法（BiaeGre))來測定。對應於單價複合物之結合 及解離之速率f數分別稱作結合速率常數ka (或kc>n)及解 離速率常數kd (或k。"）。KD經由等式化认與匕及k 依據上述定義，可藉由比較個別抗體/抗原複合物之κ 值來比較與不同分子間相互作用相關之結合親和力，例如C 比較不同抗體對給定抗原之結合親和力。 例如抗體 相互作用 類似地，可藉由測定及比較相關相互作用（ 與抗原之間的特異性相互作用）之KD值與不相關 之KD值來評估相互作用之特異性。 非標靶分子（諸 典型地，抗體對於標靶之KD為對於其他 201026330 .* 如環境中之無關物質或隨附物質）之KD的1/2，較佳i/5， 更佳1/10。KD更佳為1/5〇，諸如1/1〇〇，或1/2〇〇 ;甚至更 佳 1/500，諸如 ιπ,οοο，或 1/1〇 〇〇〇。 此解離常數值可藉由熟知方法直接測定，且即使對於 複雜混合物’可藉由諸如Caceci等人（Byte 9:340-362, 1984 ) 中所述之方法計算。舉例而言，可使用雙濾膜硝化纖維素 遽膜結合檢定（諸如 Wong 及 Lohman( Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 542 8-5432，1993 )所揭示者）來確定Kd。評估諸 〇 如抗體之配位體對標把之結合能力的其他標準檢定在此項 技術中已知’包括例如ELISA、西方墨點法（Western blot)、 RIA及流式細胞量測分析。亦可藉由此項技術中已知之標準 • 檢疋（老如表面電漿共振（SPR )，例如使用Biacore™系統） . 評估抗體之結合動力學及結合親和力。 可進行競爭結合檢定’其中將抗體對標靶之結合與該 標靶之另一種配位體（諸如另一種抗體）對該標靶之結合 比較。發生50%抑制之濃度稱為Ki。在理想條件下，幻等 ® 於Kd。Ki值決不會小於KD，因此宜將Ki量測值代入以提 供KD上限。 本發明之抗體對其標靶可具有1 x 1 〇_7 Μ或1 x 10·7 M以 下、ΙχΙΟ·8 Μ 或 ΙχΙΟ·8 Μ 以下或 ιχ10-9 μ 或 lxl〇-9 M 以下 或 lxlO·1。M 或 lxltr1。M 以下或 ΐχ10-ιι μ 或 1χΐ0-丨丨 M 以 下或 lxl〇-12 Μ 或 ΙχΙΟ·12 Μ 以下之 kd (或 Ki)。
特異性結合其標靶之抗體可以高親和力（亦即，呈現 如上所述之低KD)結合其標靶’且可以較低親和力結合其 他非標靶分子。舉例而言，抗體可以1 x 1 〇·6 Μ或丨χ丨〇-6 M 9 201026330 以上，更佳lxl〇-5 Μ或ιχ10-5 M以上，更佳ΐχΐ〇-4 M或丄、 xlO·4 M以上，更佳lxl〇-3 M或1χ1〇-3 M以上甚至更佳丄 ΧΙΟ·2 Μ或lxlO·2 Μ以上之Kd (或Ki)結合非標靶分子。 本發明之抗體能夠結合其標靶的親和力較佳為結合其他非 標乾分子之親和力的至少2倍、10倍、5〇倍、1〇〇倍、2〇〇 倍、500倍、1000倍或1〇〇〇倍以上。 標靶分子可為如本文所述之任何TFPI分子，諸如天然 存在之TFPI分子、完全成熟TFPI分子或全長TFpi分子。 較佳TFPI分子為完全成熟、天然存在之全長哺乳動物 分子。舉例而言，TFPI分子可由如本文所述之seqidn〇: 1之胺基酸序列或其片段或其他變異體組成或可包含如本 文所述之SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或其片段或其他變異 體。 ' 標把分子可為TFPI分子之變異體，諸如tfpi分子之 片段。舉例而言，標靶分子可為保留適於抗體結合之抗原 決定基的TFPI片段或其他變異體。舉例而言，標靶分子可 為保留如本文所述之抗原決疋基的TFPI片段或其他變異 ❹ 體。標靶分子可包含此抗原決定基。 在一具體實例中’標乾分子為全長TFPI分子。全長TFPI 分子可包含如本文所述之第一、第二及第三Kunhz域。全 長TFPI分子可包含如本文所述之第一、第二及第三Kunitz 域以及如本文所述之叛基端區域。全長TFpi分子可為天然 存在之TFPI分子，諸如自TFPI基因表現或由TFPI表現細 胞分泌之全長TFPI多肽。全長TFPI分子可為發現呈自由 形式在血漿中循環或與細胞（諸如内皮細胞）結合的天然 10 201026330 存在之TFPI分子。全長TFPI分子不為截斷TFPI分子，諸 如本文所述之天然存在之截斷TFPI分子。 在一具體實例中，標靶分子為截斷TFPI分子。舉例而 言，截斷TFPI分子可包含羧基端截斷。舉例而言，已知許 多天然存在之截斷形式之TFPI。此等形式可包含TFPI之部 分或所有羧基端部分之截斷。其可進一步包含一或多個 Kunitz域之一部分或所有者之截斷。舉例而言，截斷形式 TFPI可包含羧基端部分及部分或所有第三Kunitz域之缺 ❿ 失。 舉例而言，一種天然存在之截斷形式之TFPI僅包含全 長TFPI分子之胺基酸1至161(本文中稱作TFPI( 1-161))。 . TFPI ( 1-161 )為活性形式之TFPI，其活性低於全長分子。 . TFPI( 1-161)在結構上不同於全長TFPI且針對TFPI( 1-161) 標靶分子產生之抗體因此可不同於針對全長TFPI產生之抗 體。 當需要抗體靶向全長TFPI之存在於TFPI ( 1-161 )中 φ 之區域時，截斷形式之TFPI可為適當標靶分子。然而，當 需要抗體靶向特定截斷形式之TFPI (諸如天然存在之載斷 TFPI )時，較佳將截斷TFPI用作標靶分子。 在一具體實例中，標靶分子為天然存在形式之TFPI。 其可以其活體内存在之形式使用。舉例而言，標靶分子可 為如上文所討論之全長天然存在之TFPI。標靶分子可為如 上文所討論的截斷之天然存在之TFPI。標靶分子可為其活 體内存在於血漿中之形式的TFPI。標靶分子可為結合脂蛋 白之方式與活體内存在於血漿中之TFPI相同的TFPI。標靶 11 201026330 分子可為結合細胞之方式與活體内存在之TFPi相同的 TFPI，諸如結合内皮細胞之TFpi。本發明之抗體可結合任 一種或多種此等天然存在形式之TFpi。本發明之抗體能夠 結合所有此等天然存在形式之TFPI，或能夠區分此等不同 形式’從而結合一些TFPI而非其他者。 在一具體實例中，標靶分子為或包含TFpi之第二 Kunitz域。此標靶分子可包含SEQ m N〇: 1之胺基酸π 至147或SEQ ID NO: 1之胺基酸91至15〇，或來自另一 TFPI多肽之荨效Kunitz域2區域。此標乾分子可包含seq IDN〇:2或SEQIDN〜2之胺基酸3至58或1〇至5〇標 乾分子可為或可包含TFPI之第二Kunitz域之片段。舉例： 言，標靶分子可包含五個或五個以上、八個或八個以上、 十個或十個以上、十二個或十二個以上，或十五個或十五 個以上來自第二Kunitz域之胺基酸。 標靶分子可包含打^或TFPI之特定區域（諸如tfpi 之特定Kunitz域或C端部分）的五個或五個以上八個或 八個以上、十個或十個以上、十二個或十二個以上或十 五個或十固以上纟面可達殘基。纟面可達殘㈣具有大 於40%相對可達性之殘基。舉例而言，對於丁吧之κ_ζ 2域（SEQ ID NO:1)，以下胺基酸具有大於犧相對可達 性：94-95、98、100-Uo、118_121、123 124、i3i、134、 138-142 Α 144·145 (參看圖5) 子可包含五個或五 個以上、八個或八個以上、十個或十個以上、十二個或十 二個以上’或十五個或十五個以上此等殘基諸如包括五 個或五個以上、八個或八個以上、十個或十個以上、 201026330
個或十二個以上，或十五個或十五個以上此等殘基的TFPI 片段。 標靶分子可包含來自TFPI之已知抗原決定基。 如本文中所用’術語「抗原決定基」係在「抗原結合 多肽」（Ab )與其相應「抗原」（Ag )之間之分子間相互作 用的情形下加以定義。如本文中所用，術語Ab包含特異性 結合相應Ag之抗體或其片段。抗原結合片段之實例包括 Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’）2、F(ab)S、Fv (典型地為抗體之 〇 單臂的VL及VH域）、單鏈Fv ( scFv ;參看例如Bird等人，
Science 1988; 242:42S-426;及 Huston 等人，PNAS 1988; 85:5879-5 883 )、dsFv、Fd(典型地為 VH 及 CHI 域），及 dAb * (典型地為VH域）片段；VH、VL、VhH，及V-NAR域； • 包含單VH鏈及單VL鏈之單價分子；微型抗體、雙功能抗 體、三功能抗體、四功能抗體，及/C體（參看例如ni等人，
Protein Eng 1997;10:949-57 );駱駝 igG ; IgNAR ;以及一或 多種分離之CDR或功能性互補位，其中分離之CDR或抗原 ® 結合殘基或多肽可結合或連接在一起以便形成功能性抗體 片段。各種類型之抗體片段已描述或評述於例如H〇lliger 及 Hudson，Nat Biotechnol 2005; 2S: 1 126-1 136 ; W02005 040219，及公開之美國專利申請案2〇〇5〇238646及2〇〇2 0161201 中。 可使用習知重組或蛋白質工程技術獲得抗體片段，且 可針對抗原結合或其他功能、以與完整抗體相同之方式篩 選片段。 術語抗原（Ag )係指用於使免疫力健全脊椎動物免疫 13 201026330 以產生識別Ag之抗體（Ab )的分子實體。在本文中，Ag 為泛稱且一般意欲包括由八!3特異性識別之標靶分子，因此 包括用於產生Ab之免疫方法中的分子之片段或模擬物。因 此’ Ab可結合的TFPI之第二kunitz域（K2 )、分離之κ2、 全長TFPI(包括截斷TFPI )與TFpi之其他變異體稱作Ag。 術语「抗原決定基」一般係指Ag上可供Ab特異性結 合之之區域或區，亦即與Ab實體接觸之區域或區。蛋白質 抗原決定基可包含Ag中直接涉及結合Ab之胺基酸殘基（亦 稱為抗原決定基之免疫顯性組份），及不直接涉及結合之其 他胺基酸殘基，諸如Ag中被Ab有效封阻之胺基酸殘基（換 吕之，胺基酸殘基位於Ab之「溶劑排斥表面」及/或「足 跡」内）。在本文中，除非另作說明（例如在有些情形下， 本發明係關於可直接結合特定胺基酸殘基之抗體），否則術 語抗原決定基包括可特異性結合抗TFpi抗體或本發明之另 種K2特疋藥劑之TFPI之K2之任何特定區域中的兩種類 型結合位點。K2可包含許多不同抗原決定基，其可包括（不 限於）（1 )線性肽抗原決定子、（2 )由一或多個以成熟Κ2 構形彼此靠近定位之非鄰接胺基酸組成的構形抗原決定 子；及（3)轉譯後抗原決定子，其完全或部分地由與κ2 共價連接之分子結構（諸如碳水化合物基團）組成。 給疋抗體（Ab ) /抗原（Ag )對之抗原決定基可使用多 ，實驗及計算性抗原決定基定位法、在不同細微層面加以 定義及特性化。實驗方法包括突變誘發' χ射線結晶學、核 磁共振（NMR)光譜學、氫氛交換質譜分析（hxms)及 各種競爭結合法。因為各種方法所依賴的原理獨特，所以 201026330 抗原決定基之描述與測定盆夕士、t j疋具之方法緊密關聯。因此，視所 採用之抗原決定基定位法而定，柃 給定Ab/Ag對之抗原決定 基將以不同方式加以定義。 在其最細微之層面上，用於Ag與Ab之間相互作用的 抗原決定基可依據定義Ag_Ab相互作用中存在之原子接觸 的f間座標以及有關其對結合熱力學之相對作用的資訊加 以定義。在較不細微之層而p 做炙層面上，抗原決定基可依據定義Ag 與Ab之間原子接觸的空間座標加以特性化。在更不細微之 ©㉟面上’抗原決定基可依據其所包含之胺基酸殘基加以特 性化，如依據特定標準（例如Ab與Ag中原子之間的距離） 加以定義。在更不細微之層面上，抗原決定基可經由功能 •(例如與其他^競爭結合）加以特性化。抗原決；t基亦可 .更一般性地定義為所包含的胺基酸殘基經另-胺基酸取代 將改變Ab與Ag之間的相互作用特徵。 在Ab (例如Fab片段）與其Ag之間之複合物的X射 、線衍生晶體結構依據空間座標定義的情形下，除非另有規 © 2或與上下文抵觸，否則術語抗原決定基在本文中特定地 定義為特徵在於其中重原子（亦即非氫原子）與Ab中重原 子之距離小於4 A的K2殘基。 、根據抗原決定基之說明及定義（視所用抗原決定基定 位法而疋）可在不同細微層面獲得之事實，可得出結論： 相同八8上針對不同Ab之抗原決定基可類似地在不同細微 層面加以比較。 X射線結 。若抗原 在胺基酸層面描述之抗原決定基（例如依據 構所測定）若含有同類胺基酸殘基則可稱為相同 15 201026330 決定基共有至少一個胺基酸，則稱抗原決定基可重叠。若 抗原決定基無共同的胺基酸殘基，則稱抗原決定基為獨: 的（唯一的）。 由競爭結合加以特性化之抗原決定基若相應^之社人 具互斥性（亦即，一種Ab之結合排斥另一種心同時社 :)則稱為重叠。若Ag能夠供兩種相應Ab同時結合，則 抗原決定基稱為獨立的（唯一的）。 「反過來看，可自上文「抗原決定基」之定義獲得術語 ❹ 互補位（para—)」之定義。因此，術語「互補位」係 指Ab上可供Ag特異性結合（亦即可與體接觸）之 區域或區。 在Ab (例如Fab片段）與其Ag之間之複合物之乂射 線何^晶體結構依據空間座標加以定義的情形下，除非另 有規定或與上下文有抵觸’否則術語互補位在本文中特定 ㈣義為特徵在於其中重原子（亦即非氫原子）與Μ中重 原子之距離小於4 A的Ag殘基。 給定抗體（Ab) /抗原（Ag)對之抗原決定基及互補位 可藉由常規方法鑑定。舉例而言，抗原決定基之一般位置 可藉由評估抗體與不同片段或變異體TFH多狀結合之能力 來測定。丽内可接觸抗體之特定胺基酸（抗原決定基） 及抗體内可接觸TFPI之特定胺基酸（互補位）亦可使用常 規方法（諸如實施例中所述者）來測定。舉例而言，可將 抗體與標乾分子組合且可使Ab/Ag複合物結晶。複合物之 晶體結構可加以測定且用以鑑定在抗體與其標乾之間相互 作用的特異性位點。 16 201026330 -» 本發明之發明人已對本文所述之鼠類MuTFPI4F36抗 體以及人類4匕HzTFPI4F36抗體與TFPI之Kunitz 2域（K2 ) 之間之相互作用執行過此分析。此分析詳述於實施例中。 本發明之抗體的互補位可如下加以定義：該抗體之輕 鏈包含 SEQ ID NO: 15 之殘基 E31、S32、D33、Y37、A96、 T97及F99，且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO 18之殘基 N31、S52、R53、S54、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、 Y102 、 D103 及 D106 。 〇 本發明之抗體的輕鏈因此可包含以下胺基酸殘基： •在對應於SEQ ID NO: 15之位置31的位置包含E， •在對應於SEQ ID NO: 15之位置32的位置包含S， • •在對應於SEQ ID NO·· 15之位置33的位置包含D， . .在對應於SEQ ID NO: 15之位置37的位置包含Y， •在對應於SEQ ID NO: 15之位置96的位置包含A， •在對應於SEQ ID NO: 15之位置97的位置包含T， 及 Q •在對應於SEQ ID NO: 15之位置99的位置包含F ; 且該抗體之重鏈可包含以下胺基酸殘基： •在對應於SEQ ID NO 1 8之位置3 1的位置包含N， •在對應於SEQ ID NO 18之位置53的位置包含R， •在對應於SEQ ID NO 1 8之位置54的位置包含S， •在對應於SEQ ID NO 18之位置57的位置包含Y， •在對應於SEQ ID NO 18之位置59的位置包含Y， •在對應於SEQ ID NO 1 8之位置60的位置包含F， •在對應於SEQ ID NO 1 8之位置6 1的位置包含P， 17 201026330 •在對應於SEQ ID NO 18之位置62的位置包含D， •在對應於SEQ ID NO 18之位置65的位置包含q， •在對應於SEQ ID NO 18之位置102的位置包含γ， •在對應於SEQ IDNO 18之位置103的位置包含D， 及 •在對應於SEQ ID NO 18之位置106的位置包含〇。 重鏈可進一步在對應於SEQ ID NO·· 18之位置52的位 置包含S。 本發明之抗體的輕鏈可進一步在對應於SEQ ID NO: 15 之位置98的位置包含Η，且重鏈可進一步在對應於§eq ID NO: 18之位置56的位置包含S。 針對MuTFPI4F3 6 (實施例4 )之抗原決定基經發現由 以下者構成：SEQ ID NO: 1之胺基酸E100、E101、P103、 R107 、 Y109 、 Till 、 Y113 、 Q118 、 Q121 、 E123 、 R124 、 F125、K126及L140’其對應於SEQIDNO: 2之胺基酸E10、 Ell、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、 F3 5、K3 6及L50。互補位經發現由以下者構成：SEQ ID NO: 4 之輕鏈胺基酸殘基 E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98 及F99 ’及SEQ IDN0 8之重鏈胺基酸殘基N3卜R5 3、S54、 S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103 及 D106。 針對HzTFPI4F36 (實施例5)之抗原決定基經發現由 以下者構成：SEQ ID NO: 1之胺基酸E100、E101、D102、 P103 、 R107 、 Y109 、 Till 、 Y113 、 F114 、 N116 、 Q118 、 Q121、C122、Εί23 ' R124、F125、K126 及 L140，其對應 18 201026330 於SEQIDNO:2之胺基酸E10、EH、D12、P13、R17、Y19、 T21 、 Y23 、 F24 、 N26 、 Q28 、 Q31 、 C32 、 E33 、 R34 、 K36 及L50。互補位經發現由以下者構成：SEQ ID NO: 15之輕 鏈胺基酸殘基 E31、S32、D33、Y37、A96、T97 及 F99， 及SEQ IDNO 18之重鏈胺基酸殘基N31、S52、R5 3、S54、 Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103 及 D106。 本發明之抗體可與本文具體揭示之本發明抗體結合 TFPI之相同抗原決定基或域。舉例而言，其他尚未鑑定之 g 本發明抗體可如下鑑定：比較其與TFPI之結合和單株抗 體、MuTFPI4F36及/或HzTFPI4F36與TFPI之結合；或比 較尚未鑑定之抗體的功能與MuTFPI4F36及/或HzTFPI4F36 之功能。可用於此鑑定目的的分析及檢定包括TFPI中和檢 定，諸如：實施例6中所述之FXa抑制檢定及實施例7中 所述之FVIIa/TF/FXa抑制檢定；結合相互作用分析，諸如 實施例8中所述之表面電漿共振分析；細胞檢定，諸如中 和人類臍血管内皮細胞（HUVEC )上TFPI (實施例9中所 〇 述），及中和TFPI對MDA-MB 23 1人類乳癌細胞上TF/FVIIa 活性之抑制（實施例10中所述）。 在一具體實例中，本發明之抗體可與本文所述之 MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗體結合相同抗原決定基或區 域。MuTFPI4F36及HzTFPI4F36與TFPI之結合詳述於本文 中。本發明之抗體可為與MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗體 結合TFPI中之相同抗原決定基的抗體。此可包括其與如上 所述之TFPI的特定胺基酸接觸。舉例而言，本發明之抗體 可以其與 SEQ IDNO:2 之胺基酸 E10、EU、P13、R17、Y19、 19 201026330 T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36 及 L50 接觸 之方式或以其與SEQ IDNO: 2之胺基酸E10、Ell、D12、 P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、 E3 3、R3 4、K36及L50接觸之方式結合TFPI。 本發明之抗體能夠結合包含一或多個殘基之抗原決定 基，該等殘基選自由SEQ IDNO:2之E10、En、D12、P13、 R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、 R3 4、F3 5、K3 6及L50所組成之群組。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基E10 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基E11 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基D12 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基P13 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基R17 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Y1 9 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基T21 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Y23 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基F24 20 201026330 -« 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基N26 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Q28 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基Q31 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基C32 的抗原.決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基E33 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基R34 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO·· 2之殘基F35 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基K36 〇 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基L50 的抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基 E10、Ell、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、 Q2 8、Q31、C3 2、E3 3、R3 4、K3 6 及 L50 之抗原決定基。 本發明之抗體能夠結合包含SEQ ID NO: 2之殘基 E10、Ell、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、 R34、F3 5、K3 6及L50之抗原決定基。 21 201026330 本發明之抗體可具有與本發明之另——種抗體競爭結合 TFPI或如本文所述之另一適當標靶之能力。舉例而言，本 發明之抗體可與本文所述之MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗 體交叉競爭結合TFPI，或結合與MuTFPI4F36或HzTFPI4F 36抗體結合之TFPI適合片段或變異體。此等交叉競爭抗體 可依據其在標準結合檢定中與本發明之已知抗體交叉競爭 之能力來鑑定。舉例而言，可使用SPR (例如使用Biacore ™系統）、ELIS A檢定或流式細胞量測術顯示交叉競爭。此 交叉競爭可表明兩種抗體可結合相同、重疊或相似之抗原 決定基。 因此，本發明之抗體能夠以高於任一或多種以下市售 單株抗體之親和力結合TFPI之K2域：mAb0281 ( Ab systems )及/ 或 mAb4904 ( American Diagnostica )及/ 或 mAb2974( R&D systems)及 / 或 mAb29741 ( R&D systems) ° 本發明之抗體因此可藉由包含結合檢定之方法鑑定， 該結合檢定評估測試抗體是否能夠與本發明之已知抗體競 爭標靶分子上之結合位點。進行競爭結合檢定之方法在此 項技術中已熟知。舉例而言，其可包括使用抗體可與標靶 分子結合之條件使本發明之已知抗體結合標靶分子。接著 可使抗體/標靶複合物暴露於測試抗體且可評估測試抗體能 夠自抗體/標靶複合物置換本發明抗體之程度。一種替代性 方法可包括使測試抗體與標靶分子在允許抗體結合之條件 下接觸，接著添加能夠結合該標靶分子之本發明抗體，且 評估本發明抗體能夠自抗體/標靶複合物置換測試抗體之程 度0 22 201026330 -· 測試抗體抑制本發明抗體與標靶結合之能力顯示該測 試化合物可與本發明抗體競爭結合標靶，且從而顯示測試 抗體與本發明之已知抗體結合TFPI蛋白質之相同抗原決定 基或區域。經此方法鑑定可與本發明之已知抗體競爭的測 試抗體亦為本發明之潛在抗體。測試抗體可與本發明之已 知抗體結合TFPI之相同區域且與本發明之已知抗體競爭的 事實表明，測試抗體可與已知抗體充當相同結合位點之配 位體且測試抗體因此可模擬已知抗體之作用。此可藉由評 φ 估TFPI在如本文所述之測試化合物存在下之活性來確定。 本發明之已知抗體可為如本文所述之抗體，諸如鼠類 TFPI-4F3 6A1B2 (亦稱作 4F36 及 MuTFPI4F36 )抗體，或如 - 本文所述之保留與TFPI結合之能力的其任何變異體或片 段，諸如人類化TFPI-4F3 6A1B2抗體，其中一者在本文中 稱作HzTFPI4F3 6 ( mAbTFPI 2021 )。本發明之抗體可與本 文所述之MuTFPI4F36抗體或與本文所述之保留與TFPI結 合之能力的其任何變異體或片段（諸如HzTFPI4F36 )結合 〇 相同抗原決定基。 本發明之抗體可結合與實施例中進一步描述之 MuTFPI4F36抗原決定基相同、重疊或相似的抗原決定基。 本發明之抗體可結合與實施例中進一步描述之HzTFPI4F36 抗原決定基相同、重疊或相似的抗原決定基。本發明之抗 體可結合（較佳特異性結合）一或多個屬於MuTFPI4F36 及/或HzTFPI4F36之抗原決定基的胺基酸殘基。舉例而言， 本發明之抗體可結合五個或五個以上、六個或六個以上、 七個或七個以上、八個或八個以上，或十個或十個上文針 23 201026330 對MuTFPI4F36或HzTFPI4F36之結合所述的胺基酸殘基。 舉例而言，本發明之抗體當接觸SEQ ID NO: 2之多肽時， 可結合該多肽且接觸胺基酸E10、E11、D12、P13、R17、 Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、 F3 5、K36及L50，或彼等胺基酸之亞群，諸如至少2個、 至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、 至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、 至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17 個或至少18個彼等胺基酸。 可參考抗體與非標靶分子的結合來評估特異性結合。 可藉由比較抗體結合標靶之能力與結合另一種分子之能力 進行此比較。此比較可如上所述依據Κ〇或Ki評估來進行。 用於此比較中之其他分子可為非標靶分子之任何分子。其 他分子較佳與標靶分子不相同。標靶分子較佳不為標靶分 子之片段。 本發明之抗體的KD可小於0.8nM，諸如小於〇 7nM， 諸如小於0.6nM’諸如小於〇.5nM’諸如小於〇4nM，諸 如小於〇·3 ΠΜ ’諸如小於0.2 nM，諸如小於〇丨nM，諸如 小於〇.〇5 nM，諸如小於0.025 nM，諸如小於〇 〇15 nM， 諸如在0.015 nM與0 nM之間。 π Μ測定特
—何双功能上 標把無關。舉例而言，其他分子可為環境中之無關物 隨附物質。 用以測定特異性結合之其他分子 路徑與標靶分子相同的另一種分子。 可為所涉及 舉例而言， 之活體内 當標耙為 24 201026330 TFPI或其片段或變異體時’用於比較之其他分子可為形成 凝血級聯之一部分的蛋白質。藉由確保本發明之抗體具有 針對TFPI (而非另一種此類分子）之特異性’可避免不期 望有之活體内交又反應性。
用於比較之其他分子可與標靶分子有關。舉例而言， ‘為要鑑定僅結合特異性抗原決定基之抗體時，供比較之 其他分子可為該抗原決定基缺乏或被破壞之TFp〗分子。用 於比較之其他分子因此可為不同於所討論之抗體結合之標 靶分子的另一種標靶分子。 本發明之抗體可保留結合一些與標靶分子有關之分子 的能力。舉例而言，可將全長成熟人類TFpi用作標靶，但 抗體亦能夠結合例如未成熟形式之人類TFpi、片段或截斷 形式之人類TFPI、與脂蛋白結合之TFpi，或來自其他物種 之細胞或TFPI (諸如其他哺乳動物tfpi )。 或者，本發明之抗體可對特定標靶分子具有特異性。 舉例而言，其可結合一種如本文所述之標靶分子，但可不 結合或可以顯著降低之親和力結合如本文所述之不同標靶 分子。舉例而言，可將全長成熟人類TFpi用作標靶，=結 合該標乾之抗體可不能結合或可以較小親和力結合例如： 成熟形式之人類TFPI、片段或截斷形式之人類Tm、與脂 蛋白結合之而或來自其他物種之細胞或Tm，諸如其： 哺乳動物TFPI。 ' 本發明之抗體可結合TFPI且因此可抑制τρρι 如上文所說明，TFPI下調凝血。此舉藉由抑制 性及藉由在FXa存在下抑制㈣術複合物 活性。 FXa活 。本發 25 201026330 月抗體抑制TFPI活性可為任何此等活性或其任何下游效 應。舉例而^，本發明之抗體可引起凝血增強，存在或 含量提高或TF-FV„d性提高。本發明之抗體當與⑴人 類FVIII不足血漿或（b)人類全血接觸時較佳減少凝血時 間。 TFPI活性量測可包含在抑制血液樣本之凝血或減少血 液樣本之凝結時間方面評估TFPI活性。舉例而纟，此方法 可包3使TFPI與也液樣本或血液產品（諸如包含凝血因子 之血漿或A清）在發生凝血之條件下接觸且測定是否因 存在TFPI❿凝血受抑制或凝金時間;咸少。接著可將此樣本 之凝血程度或凝血時間與亦存在測試抗體之同等樣本之凝 血程度或凝血時間相比較。若抗體樣本之凝血程度提高或 凝血時間減少’則此表明抗體抑制樣本中TFPI之活性。 可藉由檢查血液本身之凝結、血漿之凝結，或位於τ]ρρι 作用點下游之凝血級聯之一或多種特徵來偵測凝血。舉例 而。該方法可評估樣本中FXa含量或TF FViia活化。 評估凝血及凝血時間之各種其他方法在此項技術中已 熟知。舉例而t ’可使用如實施例中所述之稀釋凝血酶原 時間分析法（dPT分析法）評估抗體對凝血時間之任何影 響。簡言t ’使人類血漿與人類凝血活素接觸。在測試抗 體存在及不存在下量測血漿凝結所花費之時間。此分析中 可使用陽性對照物’諸如添加預計可減少凝血時間之FVIIa (N〇VoSeve_)。本發明之抗體應_此方法中減少凝血 時間。本發明之抗體較佳應能夠以劑量依賴性方式減少凝 jk時間。 26 201026330 本發明之抗體能夠在基於血漿之凝血檢定（諸如dpT 分析法）中抑制TFPI，顯著優於任一或多種以下市售單株 抗體：mAb0281 (Ab systems)及/或 mAb4904 (American
Diagnostica)及/或 mAb2974( R&D sywemsM/或 (R&D systems )。 企栓彈力圖可用以評估全血樣本中之凝血形成及纖維 蛋白溶解之動力學。因此抗體在全血樣本中減少凝血時間 或刺激凝血之能力可類似地藉由比較在抗體存在與不存在 © 下凝塊形成所花費之時間來評估。 評估本發明抗體之功能性作用的方法因此可在試管内 進行。此等方法較佳係對人類血液或血漿樣本進行。此等 . 樣本可為正常人類血液或血漿或可缺乏或補充有一或多種 • 涉及凝血之因子。舉例而言，此等方法可使用正常人類全 血、正常人類血漿或FVin不足血漿或全血來進行。FVIn 不足血液或血漿可藉由使適合血液或血漿樣本與中和性抗 fvhw體接觸來產生。此等試管内方法可為結合相互作用 ❾分析法或TFPI中和分析法，諸如實施例6_u中所述者。 本發明之抗體能夠抑制金小板相關TFp工。 本發明之抗體能夠抑制可溶性TFpi。 本發明之抗體能夠抑制結合脂蛋白之TFpi。 本發明之抗體能夠抑制結合細胞之TFpi，諸如與内皮 細胞結合之TFPI。 ' 本發明之抗體能夠結合而，使得他保留其活性之 至；91%、諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少9心、 諸如至少95。/。、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少 27 201026330 98%、諸如至少99%、諸如99·1〇〇%，如在FXa抑制檢定中 所量測的。 *本發明抗體使TFPI飽和時，該抗體能夠將TFpi對 結合膜之FVIIa/TF/FXa之抑制中和至少55%、諸如至少 60。/。、諸如至少65%、諸如至少7〇%、諸如至少75%、諸如 至少8〇%、諸如至少85%、諸如至少9〇%、諸如至少％%、 諸如多至1〇〇% ’諸如100% ’如在FVIIa/TF/FXa抑制子檢 定中所量測的。 本發明之抗體較佳能夠在（a)人類全血、（b)人類血 漿、（c) FVIII不足之人類全血、（d) Fvm不足之人類血 漿、（e ) FIX不足之人類全血或（f) FIX不足之人類血漿 的樣本中減少凝血時間及/或刺激凝血。 測定抗體刺激凝血或減少凝血時間之能力的方法亦可 ㈣㈣行’例而言’活體内研究可如實施例中所述在 暫時性血友病兔中進行。簡言之，可藉由投T抗FVIII抗體 使得兔患有暫時性血友病。接著可投予測試抗體且評估表 皮出血時間及/或血小板數目。在測試抗體存在下表皮出血 時間減少表明抗體能夠減少凝血時間且刺激凝血。因此， 具有此作用之抗體可為本發明之抗體。 本發明之抗體能夠結合TFPI之k2域，使得個體體内 自由TFPI之百分比減少至小於3()%，諸如小於所。、諸如 J於28/〇諸如小於27〇/()、諸如小於％%、諸如小於、 諸如j於24 /〇、諸如小於23%、諸如小》22%、諸如小於 21%'諸如小於20%、諸如小於19%、諸如小於18%、諸如 小於17%、諸如小於16%、諸如小於15%、諸如小於"％、 28 201026330 諸如小於13%、諸如小於i2%、諸如 ㈣、諸如小於m , m/。、諸如小於 ”/。、⑹ 8%、諸如小於7%、諸如小 於“、邊如小於5%、諸如 小於9。/ & 渚如小於3%、諸如 於2/°、诸如小於1%、諸如〇%。 體二I由結合TFPI^K2*，使得個 天期門咸I I之4在向該個體投Μ單株抗體後之頭28 咸少’諸如在頭27天期間、諸如在頭％天期間、 ❹ 期Η =在天期間、諸如在頭24天期間、諸如在頭23天 == 天期間、諸如在頭21天期間、諸如在 Γ在頭 如在頭19天期間、諸如在…期間、 -t如在頭17天期間、諸、+ 期門… 期間、諸如在頭15天 期間、諸如在頭14天如P卩 期間、諸如在頭η天期間、諸如在 頭12天期間、諸如在頭i 1 间渚如在碩10天期間、 在頭9天期間、諸如在頭8天期μ ^ 門^ 隹项8天期間、諸如在頭7天期 間、諸如在頭6天期間、諸如在頭5 第1天期間減少。_、諸如在頭2天期間、諸如在 本發明之抗體亦可不弓|起血小板數目顯著降低。詳古 之;本發明之抗體能夠在“)人類全血、⑴人類血衆、二 不足之人類全企、（d)F彻不足之人類血漿、⑺ 不足之人類全血或⑺Fix不足之人類血浆的樣本中， ::動物活體内減少凝止時間及/或刺激凝▲而不引起血小 t目之任何顯著降低。血小板數目可如上文討論之其他 作用在相同樣本或動物中輝^ 71 士 个兄勒物T孑估，或可分別評估。舉例而古， 可評估血液樣本（諸如獲自患者或實驗動物之企液樣二 29 201026330 中之血小板數目。血小板數目可在向如上所述之暫時性血 友病兔投予抗體之後評估。本發明之抗體能夠減少表皮出 血時間而不引起血小板數目同時降低，如對暫時性血友病 兔之活體内研究所例證。血小板數目之變化可藉由比較2 予抗體之前與之後的血小板數目或藉由比較經相關抗體處 理之樣本或動物與未經抗體處理之對照樣本或動物之間的 血小板數目來評估。本發明之抗體能夠結合TFpi之κ2域， 使得個體之活體内凝血時間》咸少而不使該個體之也小板數 顯著減少。舉例而言，該個體之血小板數可不降至初始血
小板數之約80%，諸如約75%、諸如約7〇%、諸如約65%、 諸如約60%、諸如約55%、諸如約5〇%、諸如約45%、諸 如約40%、諸如約35%、諸如約3G%、諸如約25%。當進 行此等比較時’血小板數目較佳不存在差異或不存在統計 學顯著差異。φ即，本發明之抗體不會導致血小板數目之 任.何減少。 如本文中所提及，術語「抗體」包括完整抗體及其任 :抗原結合片段（亦即「抗原結合部分」）或單鏈。抗體係 才曰匕3藉由雙硫鍵互連之至少兩條重鏈（)及兩條輕鏈 (LC)之醣蛋白，或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可 變區（在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區（ch)。各輕鏈 os輕鏈可變區（在本文中縮寫為vl)及輕鍵恆定區 ( CL)。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合 域。VH及Vl區域可進一步再分成高變區，稱為互補決定 區（CDR)，其間散置有較保守區域，稱為框架區（。 抗體之]·互疋區可介導免疫球蛋白結合宿主組織或因子，包 30 201026330 括免疫系統之各種細胞（例如效應細胞）及經典補體系統 之第一組份（Clq)。 術語「互補決定區」或「高變區（hypervariable region )」 當用於本文中時係指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。 互補決定區或「CDR」一般包含輕鍵可變域中之胺基酸殘基 24-34 ( L1 )、50-5 6 ( L2)及 89-97 (L3)，及重鏈可變域中 之 31-35 ( H1 )、50-65 ( H2)及 95-102 ( H3 );( Kabat 等人， (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 0 五版，美國衛生與人類服務部（U.S. Department of Health and Human Services)，NIH 公告第 91-3242 號）及/或來自 「高變環（hypervariable loop )」之彼等殘基（輕鏈可變域 - 中之殘基 26-32 ( L1 )、50-52 ( L2 )及 91-96 ( L3 )，及重鏈 可變域中之 26-32( HI)、53-55( H2)及 96-101( H3); Chothia 及 Lesk，J. Mol. Biol 1987;196:901-917)。典型地，此區域 中之胺基酸殘基係依據Kabat等人（見上）所述之方法編 號。諸如「Kabat位置」、「Kabat殘基」及「根據Kabat」 ❹ 等詞在本文中係指重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系 統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有 減少或添加之胺基酸（與可變域之FR或CDR縮短或插入 對應）。舉例而言，重鏈可變域可在CDR H2之殘基52之後 包括胺基酸插入（殘基52a、52b及52c，根據Kabat),且 在重鏈FR殘基82之後包括插入之殘基（例如殘基82a、82b 及82c等，根據Kabat )。給定抗體之殘基的Kabat編號可 藉由在抗體序列之同源區與Kabat編號之「基準」序列排比 來確定。 31 201026330 術語「框架區（framework region)」或「fr」殘基係 才曰不位於如本文所定義之CDR内的彼等VH或VL胺基酸 殘基。 本發明之抗體可為單株抗體或多株抗體。在一具體實 例中’本發明之抗體為單株抗體。本發明之抗體可為嵌合 抗體' CDR移植抗體、人類抗體或人類化抗體或其任一者 之抗原結合部分。用於產生單株抗體與多株抗體的實驗動 物為適合哺乳動物’諸如（但不限於）山羊、兔、大鼠或 小鼠。 多株抗體為源自不同B細胞系之抗體。多株抗體可包 含針對特異性抗原之不同免疫球蛋白分子之混合物。多株 抗體可包含可結合抗原分子内之一或多種不同抗原決定基 之不同免疫球蛋白分子的混合物。可藉由常規方法（諸如 以相關抗原使適合動物免疫）製得多株抗體。隨後可自動 物移除血液且純化免疫球蛋白部分。 單株抗體為彼此相同且對特定抗原決定基具有單一結 合特異性及親和力之免疫球蛋白分子。本發明之單株抗體 (mAb )可藉由多種技術製得’該等技術包括習知單株抗體 方法，例如 Kohler 及 Milstein (1975) iVaiwre 256: 495 之標 準體細胞雜交技術，或B淋巴細胞之病毒或致癌轉型法。 製備融合瘤之較佳動物系統為鼠類系統。在小鼠中產生融 合瘤為非常成熟之程序。分離供融合之免疫脾細胞之免疫 方案及技術在此項技術中已為人所知。融合搭配物（例如 鼠類骨髓瘤細胞）及融合程序亦已知。 為形成產生本發明之單株抗體的融合瘤，可自免疫小 32 201026330 鼠分離脾細胞及/或淋巴結細胞且使其與適當不朽化細胞系 (諸如小鼠骨髓瘤細胞系）齡。所得融合瘤可經篩選以 用於產生抗原特異性抗體。可再接種、再次篩選抗體分泌 融合瘤，且料於適合IgG μ陽性，則可藉由限制稀釋 法次選殖單株抗體至少兩次。接著可在試管内培養穩定次 純系以在組織培養基中產生少量抗體以便特性化。 ❹
術》。抗體之「抗原結合部分」係指抗體之一或多個片 段’該等片段保留與抗原（諸如本文所述之猜：或另一種 &乾蛋白質）肖異性結合之能力。已展示抗體之抗原結合 功能可藉由全長抗體之片段來進行。術語抗體之「抗原結 & 口Ρ刀」内所涵蓋之結合片段的實例包括Fab片段、F(汪b，）2 片段、Fab，片段、Fd片段、Fv片段、㈣片段及分離之互 補決定區（CDR)。諸如scFv之單鏈抗體及諸如VHH之重 鏈抗體及駱駝抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部 分」中。此等抗體片段可使用熟習此項技術者習知之技術 獲得，且可篩選使用方式與完整抗體相同的片段。 本發明之抗體可由重組方式製備、表現、產生或分離， 諸如（a)自相關免疫球蛋白基因轉殖基因或轉染色體之動 物（例如小鼠）或由其製備之融合瘤分離抗體，（b )自經 轉型以表現相關抗體之宿主細胞（例妒自轉染瘤）分離抗 (c )自重組、組合抗體文庫分離抗體，及（d )藉由包 括將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他 方式製備、表現、產生或分離抗體。 本發明之抗體可為人類抗體或人類化抗體。如本文中 所用’術語「人類抗體」意欲包括具有框架區與CDR區均 33 201026330 :^人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。此外，… ^體S有怪疋區’則該悝定區亦源自人類生殖系免疫球 蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫 f蛋白序列編碼之胺基酸殘基（例如藉由試管内隨機或特 定位點突變誘發或藉由活體内體細胞突變所引入之突 變）然'而’如本文中所用’術語「人類抗體」不意欲包 括源自另η甫乳動物物種（諸如小鼠）之生殖系的cDR序 列已移植於人類框架序列上之抗體。 此人類抗體可為人類單株抗體。此人類單株抗體可由
融合瘤產生，該融合瘤包含Β細胞與不朽化細胞之融合，I 該Β細胞獲自轉殖基因非人類動物（例如轉殖基因小鼠） 且具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組。 人類抗體可自序列文庫中分離’序列文庫係根據經各 種天然及合成序列進一步多樣化之人類生殖系序列之選擇 · 建構。 人類抗體可藉由在試管内使人類淋巴細胞免疫，接著 以艾普斯坦-巴爾病毒（Epstein_Barr virus)使淋巴細胞轉 型來製備。 術浯「人類抗體衍生物」係指任何修飾形式之人類抗 體，例如抗體與另一種試劑或抗體之結合物。 術語「人類化抗體」意欲指含有源自非人類免疫球蛋 白之最小序列（CDR區）的人類/非人類嵌合抗體。因此， 人類化抗體為人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中來自接 受者之高變區之殘基已置換為來自具有所需特異性、親和 力及能力之非人類物種（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈 34 201026330 長類動物）（供體抗體）之高變區的殘基。在一些情況下， 人類免疫球蛋白之FR殘基可置換為相應非人類殘基。此修 飾之實例為引入一或多種所謂回復突變（back mutati〇n )， 諸如實施例2中所述。
此外，人類化抗體可包含接受者抗體或供體抗體中不 存在之殘基。進行此等修飾可進一步改進抗體效能。一般 而言’人類化Μ包含實質上所# (至少一個且典型為兩 個）可變域，纟中所有或實質上所有高變環均對應於非人 類免疫球蛋白之彼等高變環且所有或冑質上所有抑殘基均 為人類免疫終白序列之彼等FR_e人類化抗體視情況 亦可包含免疫球蛋白，以區（Fe)(典型為人類免疫球蛋白 之恆定區）之至少一部分。 可藉由例如標準EUSA或西方墨點法測試本發明之抗 體對標把蛋白質之結合。亦可使用EUSA檢定篩選與標把 蛋白質展7F陽性反應性的融合瘤。亦可藉由監測抗體對表 現標靶蛋白質之細胞的結合（例如藉由流式細胞量測術） 來測定抗體之結合特異性。 可藉由測定抗體是否與其他蛋白質結合來進一步研究 本發明抗體對標靶蛋白質之特異性。舉例而言，當需要產 生特異性結合TFPI或TFPI之特定部分（例如^抗原W決定基） 的抗體時，抗體之特異性可藉由測定抗體是否亦結合其他 分子或缺乏相關部分之修飾形式之TFpi來評估。 如上文解释，本發明之抗體可調節TFPI活性。因此可 進一步測試具有所需結合特性之抗體以測定其對活性 之影響。因此’該等方法可用以鑑定能夠與TFpi結合且能 35 201026330 夠調節（特定而言’降低）其活性之適合抗體。 · 適合抗體一經鑑定及選擇，即可藉由此項技術中已知 之方法鑑定抗體之胺基酸序列。可使用特定及/或簡并性引 子選殖編碼抗體之基因。抗體可藉由常規方法以重組方式 產生。 「多肽」在本文中以其最廣泛之意義使用且係指具有 兩個或兩個亞單位以上胺基酸、胺基酸類似物或其他肽模 擬物之化合物。術語「多肽」因此包括短肽序列以及較長 多肽及蛋白質。如本文中所用，術語「胺基酸」可指天然 ◎ 及/或非天然或合成之胺基酸’ D及/或l光學異構體，及胺 基酸類似物及肽模擬物。 本發明之發明人已4監疋如實施例中所述之鼠類抗體。 此抗體在本文中稱作TFPI-4F36A1B2 (或者4F36或 MUTFPI4F36)。本發明涵蓋此抗體、其變異體及片段（包括 . 嵌合抗體及人類化抗體）’其保留鼠類抗體之一或多種活性 且亦描述於實施例中。此抗體之活性包括與TFpi結合之能 力、與TFPI分子中之特定位置結合之能力及抑制TFpi活 ❹ 性之能力。 此抗體之適合片段或變異體保留與TFpi結合之能力。 其較佳將保留與TFPI特異性結合之能力。其較佳將^留與 其所來源之抗體（MUTFPI4F36)特異性結合TFpi分子之相 同或相似抗原決定基或區域之能力。其較佳將保留其所來 源之抗體之一或多種額外功能，諸如抑制TFP〗活性之能力 或減少凝血時間之能力，視情況不引起血小板數目降低。 本發明之多肽或抗體「片段」可藉由截斷（例如藉由 36 201026330 自多肽之N端及/或C端移除一或多嗰胺基酸）來製得。可 以此方式自N端及/或C端移除多至10個、多至20個、多 至30個、多至40個或40個以上胺基酸。亦可藉由一或多 個内部缺失來產生片段。 本發明之抗體可為或可包含MuTFPI4F36抗體之片段 或其變異體。本發明之抗體可為或可包含如上文進一步討 論之此抗體之抗原結合部分或其變異體。舉例而言，本發 明之抗體可為此抗體之Fab片段或其變異體，或可為源自 Q 此抗體或其變異體之單鏈抗體。
MuTFPI4F36抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸序列分別以 SEQ ID NO: 6 及 10 顯示。MuTFPI4F36 抗體之 VL 及 VH 鏈 - 之胺基酸序列分別以SEQ ID NO: 4及8顯示。一種人類化 抗體HzTFPI4F36之輕鏈及重鏈之胺基酸序列分別以SEQ ID NO: 21及24顯示。HzTFPI4F36之VL及VH鏈之胺基 酸序列分別以SEQ ID NO: 1 5及1 8顯示。 本發明之抗體可包含 SEQ ID NO: 6 中所示之 Q MuTFPI4F36輕鏈胺基酸序列或其片段或變異體。或者或另 外，抗體可包含SEQ ID NO: 10中所示之MuTFPI4F36重鏈 胺基酸序列或如本文所述之其片段或變異體。 本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 4之VL胺基酸序 列，或其片段或變異體。本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 8 之VH胺基酸序列，或其片段或變異體。本發明之抗體可包 含（a) SEQ ID NO: 4之VL胺基酸序列，或其片段或變異 體，與（b) SEQ ID NO: 8之VH胺基酸序列，或其片段或 變異體。 37 201026330 本發明之抗體可包含圖2中所示之VL或VH胺基酸序 列之一的片段。舉例而言，本發明之抗體可包含至少7個、 至少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少15個、 至少18個、至少20個或至少25個來自SEQ ID NO: 4或8 之連續胺基酸的片段。此片段較佳將保留一或多種上述功 能，諸如與TFPI結合之能力。 任何此等VH或VL序列之適合片段或變異體保留與 TFPI結合之能力。其較佳將保留與TFPI特異性結合之能 力。其較佳將保留與其所來源之抗體（MuTFPI4F36)特異 性結合TFPI分子之相同或相似抗原決定基或區域之能力。 其較佳將保留其所來源之抗體之一或多種額外功能，諸如 抑制TFPI活性之能力或減少凝血時間之能力，視情況不引 起血小板數目降低。 適合片段或變異體VL序列較佳將保留SEQ ID NO: 4 之位置 E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98 及 F99 之胺 基酸。適合片段或變異體VH序列較佳將保留SEQ ID NO: 8 之位置 N31、R53、S54、S56、Y57、Y5 9、F60、P6 卜 D62、 Q65、Y102、D103及D106之胺基酸。適合片段或變異體抗 體較佳將保留SEQ ID NO: 4之位置E31、S3 2、D33、Y37、 A96、T97、H98及F99之胺基酸及SEQ ID NO: 8之位置 N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、 Y102、D103及D106之胺基酸。如圖 3中所鑑定， MuTFPI4F36輕鏈及重鏈序列中存在之殘基所具有之重原 子與當MuTFPI4F36與TFPI之K2域結合時之重原子的距 離小於4 A。 38 201026330 本發明之抗體可包含本文中所鑑定之特異性抗體之 CDR區，諸如SEQ ID NO: 4或8内之CDR區。此抗體較 佳將保留與如本文所述之TFPI結合之能力。舉例而言，如 圖3中所示，使用Kabat定義，MuTFPI4F36之輕鏈内之CDR 序列可經鑑定位於SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6之胺基酸 24至39、55至61及94至102。MuTFPI4F36之重鏈内之 CDR序列可經鑑定位於SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 10之 胺基酸31至35、50至66及99至110。本發明之抗體可包 φ 含一或多個如圖3中所示之CDR序列。舉例而言，本發明 之抗體可包含SEQ ID NO: 6之殘基24至69、55至61及 94至102處所示之一、二或所有三個胺基酸序列。本發明 . 之抗體或者或另外可包含SEQ ID NO: 10之殘基31至35、 50至66及99至110處所示之一、二或所有三個胺基酸序 列。本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 6之殘基24至109、 55 至 61 及 94 至 102 處及 SEQ ID NO: 1〇 之 31 至 35、50 至66及99至110處所示之所有六個胺基酸序列。 ® 本發明之抗體可為人類化抗體，諸如.本文中稱作
HzTFPI4F3 6 ( mAbTFPI 2021)之抗體。此抗體可包含一或 多個來自SEQ ID NO·· 15或18之CDR區。 本發明之抗體的重鏈可包含SEQ ID NO: 18之胺基酸 3 1至35 ( NYAMS )之CDR1序列，其中此等胺基酸之一可 經不同胺基酸取代。 本發明之抗體的重鏈可包含SEQ ID NO: 18之胺基酸 50 至 66( TISRSGSYSYFPDSVQG)之 CDR2 序列，其中一、 二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 39 201026330 本發明之抗體的重鏈可包含SEQ ID NO: 18之胺基酸 99 至 110 ( LGGYDEGDAMDS)之 CDR3 序列，其中一、二 或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 本發明之抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO: 15之胺基酸 24 至 39 ( KSSQSLLESDGKTYLN)之 CDR1 序歹ij ，其中一、 二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 本發明之抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO: 15之胺基酸 55至61 ( LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等胺 基酸可經不同胺基酸取代。 本發明之抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO: 15之CDR3 胺基酸序列94至102 ( LQATHFPQT)，其中一或兩個此等 胺基酸可經不同胺基酸取代。 更特定言之，本發明之抗體可具有包含以下者之重鏈·· • CDR1序列，其又包含SEQ ID NO: 18之胺基酸31 至 35 ( NYAMS );及 • CDR2序列，其又包含SEQ ID NO: 18之胺基酸50 至 66 ( TISRSGSYSYFPDSVQG);及 • CDR3序列，其又包含SEQ ID NO·· 18之胺基酸99 至 110 ( LGGYDEGDAMDS)。 本發明之抗體可具有包含以下者之輕鏈： • CDR1序列，其又包含SEQ ID NO: 15之胺基酸24 至 39 ( KSSQSLLESDGKTYLN);及 • CDR2序列，其又包含SEQ ID NO: 15之胺基酸55 至 61 ( LVSILDS);及 • CDR3序列，其又包含SEQ ID NO: 15之胺基酸94 40 201026330 至 102 ( LQATHFPQT)。 本發明之抗體可包含上述CDR區之任何組合。 更特定言之，本發明抗體之重鏈的框架區2( FR2 )可 包含以下者胺基酸： •在對應於SEQ ID NO: 18之位置40的位置包含T， .在對應於SEQ ID NO: 18之位置42的位置包含E， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置44的位置包含R， 及 p ·在對應於SEQ ID NO: 18之位置49的位置包含A。 或者，重鏈之該FR2可包含SEQ ID NO: 18之胺基酸 36 至 49 。 • 本發明之抗體可包含以下任一者： • SEQ ID NO: 15之VL胺基酸序列。 • SEQ ID NO: 18之VH胺基酸序列。 • SEQ ID NO: 15 及 18。 • SEQ ID NO: 21之輕鏈胺基酸序列。 Q . SEQ ID NO: 24之重鏈胺基酸序列。 • SEQ ID NO: 21 及 24。 本發明之抗體或者可為或可包含此等特定序列之一的 變異體，諸如MuTFPI4F36抗體之變異體或HzTFPI4F36之 變異體。舉例而言，變異體可為任一上述胺基酸序列之取 代、缺失或添加變異體。 本發明之變異體可為不包含以下者之抗體： •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR1區之位置31的位 置不包含N ; 41 201026330 •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置53的位 置不包含R ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置54的位 置不包含S ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置56的位 置不包含S ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置57的位 置不包含Y ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置59的位 置不包含Y ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置60的位 置不包含F ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置61的位 置不包含P ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置62的位 置不包含D ;及 .在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置65的位 置不包含Q ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR3區之位置102的位 置不包含Y ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR3區之位置103的位 置不包含D ;及 •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR3區之位置106的位 置不包含D。 •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置31的位 42 201026330 置不包含E ; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置32的位 置不包含S ; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置33的位 置不包含D ;及 •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置37的位 置不包含Y ; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置96的位 © 置不包含A ; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置97的位 置不包含T ; • •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置98的位 . 置不包含Η ;及 •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置99的位 置不包含F。 變異體抗體可包含上述特定序列及片段的1個、2個、 © 3個、4個、5個、多至1〇個、多至20個、多至30個或 30個以上的胺基酸取代及/或缺失及/或插入。「缺失 (Deletion )」變異體可包含缺失個別胺基酸、缺失小型胺 基酸群組（諸如2、3、 4或5個胺基酸），或缺失較大胺基 酸區域，諸如缺失特定胺基酸域或其他特徵。「插入」變異 、插入小型胺基酸群組（諸如2、
且產生保守性胺基酸取 體可包含插入個別胺基酸 3、4或5個胺基酸），或指 定胺基酸域或其他特徵。「 43 201026330 代。舉例而言’胺基酸可經具有類似特性之替代性胺基酸 取代’該替代性胺基酸例如為另—驗性胺基酸、另一酸性 胺基酸H性胺基酸、另—帶電胺基酸、另—親水性 土酸另疏水性胺基酸、另一極性胺基酸、另一芳族 胺基酸或另1旨族胺基酸。可用於選擇適合取代基的20種 主要胺基酸之一些特性係如下： 脂族、疏水性、中性 疏水性、中性
脂族、中性 見夸、極性、親水性、帶雷⑴ 極性、親水性、中性 極性、親水性、中
lie 脂族、疏水性、中性
Lys
Leu 極性、親水性、帶雷(+ )
Val脂族、疏水性、中
Trp芳族、疏水性、中 脂族、疏水性、中性
Tyr I芳族、極性、疏水性 較佳衍生物」或「變異體」包括代替天然存在之胺 ◎ 基酸出現於序列中之胺基酸為其結構類似物的彼等者。用 於序列中之胺基酸亦可經衍生化或修飾，例如經標記，限 制條件為抗體功能未受到顯著不利地影響。 取代可為（但不限於）保守性取代。 如上所述之衍生物及變異體可在合成抗體期間或藉由 產生後修飾來製備，或當抗體呈重組形式時使用定點誘變 發、隨機誘變或酶促裂解及/或核酸接合之已知技術製備。 在另一態樣中，本發明展示本發明之包含抗TFPI抗體 44 201026330 或其抗原片段> t μ a .. v 多特異性分子。此等多特異性分子包括雙 特異性分子，兑a a , 又 /、匕含至少一種針對TFPI之第一結合特異性 子第一標靶抗原決定基之第二結合特異性。一種類型 :雙特異性分子為此項技術中已知之雙特異性抗體。雙特 、體或實際多特異性抗體可以本文所述之全長抗體或 體片& (例如F(ab，)2雙特異性抗體）或任何其他抗原結 合片段之形式加以製備。 ❹
二樣中，本發明展示抗體衍生物（或免疫結合 物）諸如與第二藥劑結合或共價結合之抗TFPI抗體。可 使用ί、、1此項技術者已知之多種可用方法中之任一者使第 二藥劑與抗體直接或間接連接。舉例而言，藥劑可使用諸 丁一酿基S-(2-^t唆基二硫基）丙酸酯（spDp)之交聯 劑涇由雙硫鍵之形成、在被還原之抗體組份之鉸鏈區連 接，或經由抗體之以區中之碳水化合物部分連接。 在一態樣中’本發明之抗體經工程改造可在F c區内包 括修飾，以典型地改變抗體之一或多種功能特性，諸如血 清半衰期、補體結合、Fc受體結合、蛋白質穩定性及/或抗 原依賴性細胞的細胞毒性’或其之缺乏。此外，本發明之 抗體可經化學修飾（例如可使一或多個化學部分與抗體連 接）或經修—飾以改變其糖基化，以再次改變抗體之一或多 種功能特性。 必要時’可藉由已知技術「轉換（switched )」抗體種 類。舉例而言，最初以IgM分子形式產生之抗體可轉換為 IgG抗體種類。種類轉換技術亦可用以將一種IgG子類轉換 為另一種IgG子類，例如：igGl轉換為IgG2或IgG4 ; IgG2 45 201026330 轉換為IgGl或IgG4 ;或IgG4轉換為IgGl或IgG2。亦可 ·— 藉由將不同IgG子類之區域組合來對抗體進行工程改造以 產生怪定區嵌合分子。 在一具體實例中，CHI之鉸鏈區經修飾以改變（例如增 加或減少）鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數目。此方法進一步 描述於例如Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。 恆定區可進一步修飾以使抗體穩定，例如以降低二價 抗體分裂成兩個單價VH-VL片段之風險。舉例而言，在igG4 恆定區中，殘基S241可突變為脯胺酸（p)殘基以允許在 g 鉸鏈處形成完整二硫橋（參看例如Angal等人，Mol Immunol. 199S; 30:105-8 )。 本發明之變異體抗體可具有與SEQ ID NO: 4或8大於 60%，或大於65°/。’或大於70%，或大於75%，或大於80%， 較佳大於85%，諸如大於90%，諸如大於95%—致之胺基 酸序列或其片段。本發明之其他變異抗體可具有與SEQ ID NO: 15或18大於60% ’或大於65%，或大於70%，或大於 75%，或大於80% ’較佳大於85%，諸如大於90%，諸如大 ❹ 於95%—致之胺基酸序列或其片段。視全長多肽之尺寸而 定，胺基酸之此一致程度可存在於相關SEQ ID NO序列之 全長或存在於該序列之一部分中，諸如存在於20、30、40、 50、60、70、75、80、90、100、150、200 或 200 個以上胺 基酸中。 就胺基酸序列而言，「序列一致性」係指當使用ClustalW 法（Thompson等人，1994，見上）、用以下參數評估時具有 規定值之序列： 46 201026330 逐對排比參數·方法：精確，矩陣：PAM，間隙空缺罰 分（Gap open penahy ) : ! 〇 〇〇，間隙延長罰分（叫咖⑽⑽ penalty) : 0.10 ; 多重排比參數-矩陣：PAM，間隙空缺罰分：1〇〇〇,延 遲-致性％: 30,末端間隙受罰：％，間隙分隔距離：〇, 負矩陣：無，間隙延長罰分·· 0·20，特定殘基間隙罰分：開， 親水性間隙罰分：開，親水性殘基：GPSNDQEKR。特定殘 基處之序列一致性意欲包括已簡單衍生化之一致殘基。 〇 因此’本發明提供具有特定VH及VL胺基酸序列的抗 體及其保持此等VH及VL域之功能或活性之變異體及片 段。 因此，本發明之抗體可包含： - (a) SEQ ID NO: 4之輕鏈可變區胺基酸序列； (b)保留與TFPI特異性結合之能力的（a)之至少7 個胺基酸之片段；或 (c )與（a )之序列具有至少70%胺基酸序列一致性且 © 保留與TFPI特異性結合之能力的（a)之變異體。 本發明之抗體可包含： (a) SEQ ID NO: 8之重鏈可變區胺基酸序列； (b) 保留與TFPI特異性結合之能力的（a)之至少7 個胺基酸之片段；或 (c) 與（a)之序列具有至少70%胺基酸序列一致性且 保留與TFPI特異性結合之能力的（a)之變異體。 本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 4之輕鍵可變區及 SEQ ID NO: 8之重鏈可變區。 47 201026330 本發明之抗體可包含 (a) SEQ ID NO: 4之輕鏈可變區及seq ID N〇: 8之 重鏈可變區； (b) (a)之變異體，其中重鏈及輕鏈序列中之一或兩 者係經修飾，使得其包含⑴中指定之序列的至少7個胺 基酸之片段；或 (C) (a)或（b)之變異體，其中重鏈及輕鏈序列中之 一或兩者係經修飾，使得其與（a)或（b)之序列具有至少 7 0 %胺基酸序列一致性； 其中抗體保留與TFPI特異性結合之能力。抗體亦可保 留一或多種如本文所述之本發明抗體之額外功能或活性， 諸如抑制TFPI之能力或縮短凝血時間之能力（視情況不引 起血小板數目降低）。 SEQ ID NO: 4之較佳片段及變異體將包含〇) SEq ID NO: ό之胺基酸24至39 ;及/或（π ) SEQ ID NO: 6之胺基 酸55至61 ;及/或（iii) SEQ ID NO: 6之胺基酸94至102。 8£卩10 1^0:8之較佳片段及變異體將包含〇)^(^10]^0: 1〇之胺基酸31至35 ;及/或（ii) SEQ ID NO: 10之胺基酸 50 至 66 ;及/或（iii) SEQ ID NO: 10 之胺基酸 99 至 11〇。 SEQ ID NO: 4之其他較佳變異體將包含SEQ ID NO: 6 之胺基酸31至33、37及96至99。SEQ ID NO: 8之其他較 佳變異艎將包含SEQ ID NO: 10之胺基酸31、53、54、56、 57 、 59 、 60 、 61 、 62 、 65 、 102 、 103 及 106 ° 本發明之抗體可包含： (a) SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區胺基酸序列； 48 201026330 (b )保留與TFPI特異性結合之能力的（a )之至少7 個胺基酸之片段；或 (c )與（a )之序列具有至少70%胺基酸序列一致性且 保留與TFPI特異性結合之能力的（a)之變異體。 本發明之抗體可包含： (a) SEQ ID NO: 18之重鏈可變區胺基酸序列； (b) 保留與TFPI特異性結合之能力的（a)之至少7 個胺基酸之片段；或
❹ (c )與（a )之序列具有至少70%胺基酸序列一致性且 保留與TFPI特異性結合之能力的（a)之變異體。 本發明之抗體可包含SEQ ID NO: 15之輕鏈可變區及 SEQIDNO:18之重鏈可變區。 本發明之抗體可包含： U) SEQ ID NO: 15 之輕鏈可變區及 SEQ ID N〇: 18 之重鏈可變區； (b) (a)之變異體，其中重鏈及輕鏈序列中之一或兩 者係經修飾，使得其包含（a ) φ γ+ ^ t, 打六g 3 T才日疋之序列的至少7個胺 基酸之片段；或 一 —（C)(a)或⑴之變異體’其中重鏈及輕鏈序列中之 者係經修飾，使得其與⑴《（b)之序列具有至少 70%胺基酸序列—致性； 汴幻具有至v 。抗體亦可保 功能或活性， (視情況不引 其中抗體保留與TFPI特異性結合之能力 留一或多種如本文所述之本發明抗體之額外 諸如抑制而之能力或縮短凝血時間之能力 起血小板數目降低）。 ^ 49 201026330 如上文解釋，本發明之抗體可與本發明之另一種抗體 " 結合相同的抗原決定基或區域。因此，此抗體顯然可與本 文所述之任何特異性抗體、片段及變異體結合相同之TFPI 抗原決定基或區域。 本發明亦關於編碼本發明之抗體的聚核苷酸。因此， 本發明之聚核苷酸可編碼如本文所述之任何抗體。術語「核 酸分子」及「聚核苷酸」在本文中可互換使用且係指任何 長度之聚合型核苷酸（脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或 其類似物）。聚核苷酸之非限制性實例包括基因、基因片
上 G 段、信使RNA ( mRNA )、cDNA、重組聚核苷酸、質體、載 體、分離之任何序列之DNA、分離之任何序列之rNa、核 酸探針及引子。本發明之聚核苷酸可以分離形式或純化形 式提供。 「編碼」所選多肽之核酸序列為一種核酸分子，其在 適當調控序列控制下置放時可活體内轉錄（在dna之情況 下）及轉譯（在mRNA之情況下）成多肽。編碼序列之邊 界依據位於5’（胺基）端之起始密碼子及位於3，（羧基） 端之轉澤終止密碼子來確定。出於本發明之目的，此等核 酸序列可包括（但不限於）來自病毒之cDNA、原核或真核 mRNA、來自病毒之基因組序列，或原核dna或rna，及 甚至合成DNA序列。轉錄終止序列可定位於編碼序列之3，。 在一具體實例中，本發明之聚核苷酸包含編碼如上所 述之VH或VL胺基酸序列的序列。舉例而言，本發明之聚 核符酸可編碼包含SEQIDN0:U 8之序列的多肽或如上 所述之其變異體或片段。此聚核苷酸可由seq n〇: 3、5、 50 201026330 7及9中任一者之核酸序列組成，或包含SEQ ID NO: 3、5、 7及9中任一者之核酸序列。適合聚核苷酸序列或者可為此 等特定聚核苷酸序列之一的變異體。舉例而言，變異體可 為任一上述核酸序列之取代、缺失或添加變異體❶變異體 聚核苷酸可包含序列表中所示之序列的丨個、2個、3個、 4個、5個、多至1〇個、多至20個、多至30個、多至4〇 個、多至50個、多至75個或75個核酸取代及/或缺失。 適合變異體可與SEQ IDNO: 3、5、7及9中任一者之 φ 聚核苷酸至少70%同源，較佳至少80%或90%及更佳至少 95%、97%或99%同源。量測同源性之方法在此項技術中已 熟知，且熟習此項技術者將瞭解，在本上下文中，同源性 - 係依據核酸一致性計算。此同源性可存在於至少1 5個，較 佳至少30個，例如至少40、60、1〇〇、200個或200個以 上鄰接核苷酸之區域。此同源性可存在於未修飾之聚核苷 酸序列之整個長度。 量測聚核苷酸同源性或一致性之方法在此項技術中已 ❹ 為人所知。舉例而言，UWGCG套裝提供可用以計算同源性 (例如根據其預設設定使用）之BESTFIT程式（Devereux 等人 ’（1984) Nucleic Acids Research 12,第 387-395 頁）。
PILEUP及BLAST演算法亦可用以計算同源性或對準 序列（典型地根據其預設設定），例如Aitschui s.F. (1993) J
Mol Evol 36:290-300 ; Altschul，S，F 等人，（199〇) j Mol Biol 215:403-10 中所述。 執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心 (ational Center f〇r Biotechnology Information ) 51 201026330 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。此演算法包括 ，. 首先藉由鑑定查詢序列中長度W之短字來鑑定高分序列對 (HSP )，該等短字當與資料庫序列中相同長度之字排比時 匹配或滿足一些正值臨限分數T。T稱作鄰近字臨限分數 (Altschul等人，前述）。此等最先選中鄰近字充當開始搜 尋的種子以發現含有彼等之H SP。該等選中字沿各序列雙 向延伸，只要可提高累積排比分數。當出現以下情況時， 中止選中字沿各方向延伸：累積排比分數因一或多個負分 殘基排比之累積而歸零或零以下；或達到任一序列之末 端。BLAST演算法參數W、丁及χ決定排比之敏感性及速 〇 度。BLAST程式使用以下者作為預設值：字長（w)為"， BLOSUM62 評分矩陣（參看 Henikoff 及 Henikoff (1992) Proc.
NaU· Acad. Sci. USA 89:10915_1〇919)排比（B)為 5〇，期 望值（E)為1〇’ m=5 ’ N=4，及雙股對比。 blast演算法可對兩種序列之間相似性進行統計分 析；參看例如 Karlin 及 Altschul (1993) Proc.Natl.Acad Sci 說90:5873_5787。BLAST演算法所提供之一種相似性度 量為最小和概率（_)，其提供㈣㈣酸或胺基酸序列 之間偶然發生匹配之概率指標。舉例而言，若在第一序列 對第二序列之比較巾最小和概率小於約卜 ，更佳小於約。.以，且最佳小於約〇·〇〇1，則序㈣二 序列視為相似。 同源物與相關聚核苦酸序列不同之處在於可小於3、 5 ' 10、15、20個或20個以上突變（各突變可為取代、缺 失或插人）。此等突變可分配於同源物之至）3〇個，例如 52 201026330 y 4〇 60、loo個或100個以上鄰接核苷酸的區域。 在一具體實例中，變異體序列與序列表中所示之特定 序列不同之處為遺傳密碼冗餘，密碼具有“ 酸殘基（A、T、C月、核 _C及G)且使用此等殘基「拼成」三字母
密碼子，以表示生物體基因所編碼之蛋白質中之胺基酸。 沿舰分子之密碼子線性序列轉譯為由彼等基因所編碼之 蛋白質中之胺基酸線性序列。密碼具高度簡并性，其中Η 個密碼子編碼20種天然胺基酸且3個密碼子表示「中止」 信號。因此，大多數胺基酸係由一個以上密碼子編碼，實 際上多種胺基酸係由四個或四個以上不同密碼子編碼。本 發明之變異體聚核苷酸因此不僅可編碼與本發明之另—種 聚核苷酸相同的多肽序列，而且可因使用編碼相同胺基酸 之不同密碼子而具有不同核酸序列。 本發明之聚核苷酸「片段」可藉由截斷，例如藉由自 聚核苷酸之一端或兩端移除一或多個核苷酸來製得。可以 此方式自聚核苷酸之3,端及/或5,端移除多至個、多至 20個、多至30個、多至4〇個、多至50個、多至μ個、 多至100個、多至200個或200個以上胺基酸。亦可藉由 一或多個内部缺失來產生片段。此等片段可源自SEq ID N〇 3、5、7及9之序列或可源自如本文所述之變異體聚核脊酸。 此等片段長度較佳介於30與300個殘基之間，例如3〇至 300、30 至 200、30 至 1〇〇、100 至 200 或 200 至 3〇〇 個殘 基。或者，本發明之片段可為較長序列，例如包含本發明 之全長聚核苷酸的至少50%、至少60%、至少7〇%、至少 80%或至少90%。 53 201026330 本發明之抗體因此可自編碼其且能夠表現其之聚核苷 厂 酸產生，或以編碼其且能夠表現其之聚核苷酸的形式釋 放。當抗體包含兩條或兩條以上鏈時，本發明之聚核苷酸 可編碼一或多條抗體鍵。舉例而言，本發明之聚核芽酸可 编碼抗體輕鏈、抗體重鏈或兩者。可提供兩種聚核苷酸， 一者編碼抗體輕鏈且另一者編碼相應抗體重鏈。此聚核苷 酸或聚核苷酸對可一起表現，以便產生本發明之抗體。 本發明之聚核苷酸可根據此項技術中熟知之方法合 成，如 Sambrook 等人（1989, Molecular Cloning-a laboratory 爲 manual, Cold Spring Harbor Press )中舉例所述。 本發明之核酸分子可以表現卡匣之形式提供，該表現 卡匣包含控制序列、可操作地連接至插入序列之信號肽序 列，從而允許本發明之抗體活體内表現。此等表現卡匣又 典型地提供於載體（例如質體或重組病毒載體）内。可向 . 宿主個體直接投予此表現卡匣。或者，可向宿主個體投予 包含本發明聚核苷酸之載體。較佳使用遺傳載體製備及/或 投予聚核苷酸。適合載體可為能夠攜帶足量遺傳資訊且允 許本發明多肽表現之任何載體。 © 因此，本發明包括包含此等聚核苷酸序列之表現載 體。此等表現載體在分子生物學技術中以常規方式構築且 可例如包括使用質體DNA及適當引子、啟動子、強化子、 L號太序列及其他元件，諸如可能需要且以正確位向定位 的聚腺苷酸化信號，以允許本發明之肽表現。其他適合載 體對於熟習此項技術者而言顯而易知。與此相關之其他實 例可參考Sambrook等人。 54 201026330 本發明亦包括經修飾可表現本發明抗體之細胞。此等 細胞包括短暫性或較佳穩定性高等真核細胞系，諸如哺乳 動物細胞或昆蟲細胞’低等真核細胞，諸如酵母或原核細 胞，諸如細菌細胞。可藉由插入編碼本發明抗體之栽體或 表現卡ϋ加以修飾之細胞的特定實例包括哺乳動物 ΗΕΚ293Τ、CHO、ΒΗΚ、NSO及人類視網膜細胞。所選細 胞系較佳將為不僅穩定而且允許對多肽進行成熟糖基化及 細胞表面表現的細胞系。
本發明之此等細胞系可使用製備本發明抗體的常規方 法培養，或可治療或預防性使用以向個體傳遞本發明之抗 體。或者，可將本發明之聚核苷酸、表現卡匣或載體活體 外投予個體之細胞中，且接著將細胞返回個體之體内。 在另一態樣中，本發明提供包含本發明分子（諸如本 文所述之抗體、聚㈣酸、載體及細胞）《組成物及調配 物舉例而吕’本發明提供一種醫藥組成物，纟包含—戈 多種本發明分子（諸如—或多種本發明之抗體），該等本 明分子係與醫藥學上可接受之載劑一起調配。 如本文中所用’「醫藥學上可接受之載劑」包括生理 ::容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及 二菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及其類似物。載劑較佳 =經腸投予’例如靜脈内、肌…皮下投予（例如 藉由注射或輸注）。視投予途徑而^，抗體可以保護 以防酸作用及其他可使抗體 體 材料包覆包衣。 戍變性之天然條件作用的 醫藥學上可接受之較佳載劑包含水性載劑或稀釋劑。 55 201026330 可用於本發明醫藥組成物中之適合水性載劑的實例包括 水、緩衝性水及生理食鹽水。其他載劑之實例包括乙醇、 多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物），及其 適合混合物、植物油（諸如撖欖油），及可注射有機龜（諸 如油酸乙s旨）。可保持適當流動性，例如使用包衣材料（諸 如印碌& )、在分散液情況下保持所需粒度，及使用界面活 性劑來保持適當流動性。在許多情況下，組成物中較佳包 括等張劑’例如糖、多元醇（諸如甘露糖醇或山梨糖醇） 或氯化納。
本發明之醫藥組成物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧 化劑。此等組成物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、 乳化劑及分散劑。可藉由消毒程彳（前述）及藉由包括各 種抗細及抗真_ (例如龍基苯甲㈣、氣丁醇、 苯盼、山梨酸及其類似物）來確保預防微生物存在。在組 成物中亦可能需要包括等張劑’諸如糖、氣化鈉及其類似
:。另外’可藉由包括延遲吸收齊】（諸如單硬脂酸鋁及明 膠）來實現可注射醫藥形式之延長吸收。 、治療組成物典型地必須無菌且在製造及儲存條件下穩 =可將組成物調配為溶液、微乳液、脂質體，或其他適 於向藥物濃度之有序結構。 無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性劑（例如* 併入具有上列成份之_或組合的適當溶劑巾，視需要 進行無菌微濾來製備。— ^ 侑 般而言，分散液可藉由將活 併入含有驗性分散介皙 ♦ 質及來自上列樂劑之所需其他成 黑菌媒劑中來製備。Α μ 在供製備無菌可注射溶液之無菌 56 201026330 的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥（束乾）， 從而自其預先無菌過濾之溶液產生活性劑外加任何額外所 需成份之粉末。 本發明之醫藥組成物可包含額外活性成份以及本發明 之抗體。如上所述，本發明之組成物可包含一或多種本發 明抗體。其亦可包含額外治療劑或預防劑。舉例而言，者 田 本發明之醫藥組成物意欲用於治療出血病症時，其可另外 包含一或多種意欲減少出血病症之症狀的藥劑。舉例而 〇 言’組成物可包含一或多種凝血因子。組成物可包含—或 多種意欲改善患者病狀之其他組份。舉例而言，當組成物 意欲用於治療罹患不期望之出血的患者（諸如經歷手術之 • 患者或罹患外傷之患者）時，組成物可包含一或多種止痛 . 劑、麻醉劑、免疫抑制劑或消炎劑》包含本發明之抗體或 其他組成物及.使用說明書的套組亦屬於本發明之範疇内。 該套組可進一步含有一或多種額外試劑，諸如上文所討論 之額外治療劑或預防劑。 ® 本發明之抗體、其他分子及組成物具有眾多試管内及 活體内治療效用，包括治療及預防凝血相關病症。舉例而 言，可向培養中之㈣（試管内《活體外）Μ人類個體 (例如活體内）投予此等抗體及組成物以預防或治療多種 病症。 、詳言之，本發明提供治療出血病症或增強凝血之方 法，其包含向有需要之患者投予有效量的本發明之抗體或 -他刀子或組成物。舉例而言，此等方法可用於治療凝血 子、乏症諸如Α型血友病、Β型血友病、因子χΙ缺乏 57 201026330 症、因子VII缺乏症、血小板減少症或溫韋伯氏疾病（von Willebrand's disease )。此等方法可用於治療伴隨凝血因子 抑制子存在時發生之病狀。此等方法可用於治療過量出 血。本發明之抗體及組成物可用以在手術或抗凝血治療之 前、期間或之後或在外傷之後治療患者。本文所述之抗體 及組成物可用於任何此治療或可用於製造供任何此治療用 之藥物。 本發明之抗體及組成物可針對預防性及/或治療性處理 投予。 在治療應用中，抗體或組成物係以足以治癒、緩解或 部分抑制病狀或一或多種其症狀之量投予已患有如上所述 之病症或病狀的個體。此治療性處理可降低疾病症狀之嚴 重度，或增加無症狀期之頻率或持續時間。足以實現治療 之量係定義為「治療有效量」。舉例而言，當治療係針對不 期望之出血時，治療可定義為出血量降低或完全中止出血 的適當凝結。 隹預防性應用中
，，”"、〜…识Γ々叫 病狀或其一或多種症狀之隨後影響之量投予處於上述 或病狀之風險中的個體。足以實現預防之量係定義為 防有效量」。舉例而言，當處理係預防不期望之出血時 防性作用可定義為預防出血或出血時間或出血量減少 不存在調節劑時存在之出血時間或出血量相比）。 用於各種目的之有效量將視疾病或損傷之嚴重度 個體之體重及—般狀況而定。 如本文中所用’術語「個體“ubject)」包括任何 58 201026330 或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物， 例如哺乳動物及非哺乳動物’諸如非人類靈長類動物、羊、 狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。 本發明之抗體或組成物可經由一或多種投予途徑，使 用此項技術中已知之多種方法中之一或多者來投予。如熟 習此項技術者所瞭解，投予途徑及/或模式將視所需結果而 不同。本發明之抗體或組成物之較佳投予途徑包括靜脈 内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其他非經腸投 © 予途徑’例如注射或輸注。如本文中所用，「非經腸投予」 一詞意謂除腸内及局部投予外之投予模式，通常為注射。 或者，本發明之抗體或組成物可經由非經腸途徑（諸如局 ' 部、表皮或黏膜投予途徑）來投予。 • 類似地，本發明之抗體可用於製造適於非經腸投予之 藥物。 本發明之抗體可用於製造適於靜脈内投予之藥物。 本發明之抗體可用於製造適於肌肉内投予之藥物。 ® 本發明之抗體可用於製造適於皮下投予之藥物。 本發明抗體之適合劑量可由熟習醫務者判定。本發明 之醫藥組成物中活性成份之實際劑量可變化，以便獲得針 對特定患者、組成物及投予模式有效達成所需治療反應之 活性成份之量。所選劑量將視多種藥物動力學因素而定， 該等因素包括所用特定抗體之活性、投予途徑、投予時間、 抗體之排液速率、治療持續期間、與所用特定組成物組合 使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、 性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史，及醫學技 59 201026330 術中熟知之類似因素。
本發明抗體之適合劑量可例如在每公斤待治療患者體 重約0.1 yg至約100 mg之範圍内。舉例而言，適合劑量可 為每曰每公斤體重約1 gg至約丨〇 mg或每曰每公斤體重約 1 mg至約5 mg。本發明抗體之適合劑量的範圍可為2 mg/kg 至 200 mg/kg ’ 諸如約 150_200 mg/kg，諸如約 ι5〇17〇 mg/kg，諸如約 100-150 mg/kg’ 諸如約 50-100 mg/kg，諸如 約 70-90 mg/kg’ 諸如約 1〇_50 mg/kg，諸如約 10_30mg/kgD 其他適合劑量可為約0.1-10 mg/kg，諸如約〇 U mg/kg ’ 諸如約 1-2 mg/kg ’ 或約 2-3 mg/kg，或約 4-5 mg/kg， 或約 5-6 mg/kg，或約 6-7 mg/kg ’ 或約 7-8 mg/kg，或約 8-9 mg/kg，或約 9-10 mg/kg ;或約 10-21 mg/kg，諸如約 i〇_u mg/kg’ 或約 11-12 mg/kg，或約 12-13 mg/kg’ 或約 13-14 mg/kg ’ 或約 14-15 mg/kg，或約 15-16 mg/kg，或約 16-17 mg/kg’ 或約 17-18 mg/kg，或約 18-19 mg/kg，或約 19-20 mg/kg 或約 20-21 mg/kg。 投予個體之單株抗體之量可使得其投予所產生的個體 血漿濃度為約10 pg/ml至約40 pg/ml，諸如約15-35 pg/ml， 諸如約10-15 pg/ml，諸如約15-20 pg/ml ’諸如約20-25 pg/ml ’ 諸如約 25-30 pg/ml，諸如約 30-35 pg/ml，諸如約 35-40 pg/ml該單株抗體。可調整劑量攝生法以提供最佳所 需反應（例如治療反應）。舉例而言，可投予單次劑量， 可隨時間投予多個分次劑量，或可依據治療情況之迫切性 所指示按比例減小或增大劑量。將非經腸組成物調配成便 於投予及均一劑量之單位劑型尤其有利。如本文中所用之 201026330 單位劑型係指適用於均一給予欲治療之受體的實體不連續 單位；各單位劑型含有經計算可產生所需治療作用之預定 量之活性化合物，以及所需醫藥載劑。 抗體可以單次劑量或多次劑量投予。多次劑量可經由 相同或不同途徑投予相同或不同位置。或者，抗體可以持 續釋放型調配物形式投予，在該情況下很少需要頻繁投 藥。劑量及頻率可視抗體在患者中之半衰期及所需治療持 續時間而變化。投予劑量及頻率亦可視治療為預防性或治 療性而變化。在預防性應用中，可長期以相對不頻繁之間 隔辉予相對較低之劑量。在治療性應用中，可投予相對較 高劑量，例如直至患者顯示疾病症狀部分或完全改善為止。 因此，本發明之抗體可如下投予：約每天、約每隔一 天、約每隔兩天、約每隔三天、約每隔四天、約每隔五天； 約每週’諸如每5、6、7、8、9或1〇天；約每隔一週諸 每11 12 13、14、15、16或17天；約每隔兩週，諸如 每 18 、 19 、 20 、 每 25 、 26 、 27 、 應需投予》
21、22、23或24天；約每隔三週，諸如 28、29、30或31天。本發明之抗體亦可 ^如上所述，本發明之抗體可與一或多種其他治療劑共 投予。其他藥劑可為將增強調節劑作用之藥劑。其他藥劑 可為起增強凝血作用之藥劑，諸如凝血因+。特定而言， 本發明之調節劑可與因子VII⑷或FVm⑷共投予。其他藥 劑可旨在治療患者之其他症狀或隸1例而t，其他藥 劑可為止痛劑、麻醉劑、免疫抑制劑或消炎劑。 兩種或兩種以上藥劑可以多種不同方式組合投予。在 61 201026330 一具體實例中，抗體與其他藥劑可於單—組成物中一起投 予。在另-具體實例中，抗體及其他藥劑可於作為組合^ 法之-部分的不同組成物中投予。舉例而言，調節劑可在 其他藥劑之前、之後或同時投予。 如本文中所用，術語「治療」係指對任何有需要之人 類或其他動物個體之醫治。該個體估計已由醫務者或獸醫 醫務者進行過身體檢查’其已給出暫定性或明確性診斷， 診斷表明使用該特定治療有利於該人類個體或其他動物個 體之健康。根據個體健康現狀’該治療之時機選擇及目的 可因個體而異。因此’該治療可具預防性、緩解性、彳琴死 性及/或洽愈性。就本發明而§ ’預防性、緩解性、徵兆性 及/或洽愈性治療可代表本發明之不同態樣。 因此，本發明之抗體可非經腸投予。 本發明之抗體可靜脈内投予。 本發明之抗體可肌肉内投予。 本發明之抗體可皮下投予。 本發明之抗體可預防性投予， 本發明之抗體可治療性（應需）投予。 本發明之抗體能夠顯著減少失血。 本發明之抗體能夠顯著減少出血時間。 因此’本發明亦為一種以能夠結合TFPI之K2域之單 株抗體治療有需要之個體的方法，其中单株抗體之投予量 為使其標靶飽和之量。單株抗體之投予量可為使可溶性 TFPI飽和之量。單株抗體之投予量可為使結合内皮之TFpi 飽和之量。 201026330 如本文中所用，術語「凝血障礙」係指因正常凝血級 聯之任何促凝組份之任何定性或定量不足，或纖維蛋白溶 解之任何上調所引起的出血趨勢增強。此等凝血障礙可為 先天性及/或後天性及/或醫原性凝血障礙且可由熟習此項 技術者鑑定。 先天性低凝血病（congenital hypocoagulopathies )之非 限制性實例為A型血友病、B型血友病、因子νπ缺乏症、 因子XI缺乏症、溫韋伯氏疾病及血小板減少症，諸如格蘭 ❽ 灶乂血小板無力症（Glanzmann’s thombasthenia )及伯-蘇症 候群（Bernard-Soulier syndrome)。 後天性凝血障礙之非限制性實例為由維生素κ缺乏引 . 起之絲胺酸蛋白酶缺乏症；此維生素Κ缺乏症可由投予維 ' 生素Κ拮抗劑（諸如華法林（warfarin))引起。後天性凝 血障礙亦可在大範圍外傷之後發生。在此情況（或者稱為 「血液惡性循環（bloody Vici0us cycle)」）下，其特徵在於 血稀釋（haem〇diUlti〇n)(稀釋性血小板減少症及凝血因子 ©稀釋）、體溫過低、凝金因子耗盡及代謝棄亂（酸中毒）。 液體療法及提高之纖維蛋白溶解會使此情況惡化。該出血 可來自身體之任何部分。 具有「抑制子」（亦即，針對因子v】j 1之同種異體抗體） 之A型血友病及具有「抑制子」（亦即，針對因子κ之同
種異體抗體）之B项血古、由L & 友病為部分先天性及部分後天性凝 血障礙之非限制性實例。 醫原性凝血障礙之非限制性實例為經指定可治療血栓 栓塞性疾病之抗凝金劑藥物（諸如肝素（hepaHn)、阿司匹 63 201026330 ^ (aspirin)、華法林及其他血小板聚集抑制劑）之過度給· 藥。醫原性凝血障礙之第二非限制性實例為由過度及/或不 適當之液體療法誘發之凝血障礙，諸如可由輸血誘發之凝 血障礙。 在本發明之一具體實例中，出血係與八或8型血友病 相關。在另一具體實例中，出血係與具有獲得性抑制子之A 或B型血友病相關。在另一具體實例中，出血係與血小板 減少症相關。在另-具體實例中，出血係與溫韋伯氏疾病 相關。在另-具體實财，出血係與嚴重組織損害相關。 在另一具體實例中，出血係與嚴重外傷相關。在另一具體 1 實例中’出血係與手術相關。在另一具體實例中，出血係 與出血性胃炎及/或腸iU目關H具體實例中，出血為 子宮血崩（profuse uterine bleeding )，諸如胎盤早期剝離 時。在另一具鱧實例中，出血發生於機械止血可能性受到 - 限制的器官（諸如顱内、耳内或眼内）中。在另一具體實 例中，出血與抗凝療法相關。 本發明之仏體可用以治療患有凝血障礙之個體。因 ◎ 此’本發明亦為能夠結合TFpi < K2域的單株抗體用於冶 療有需要之個體的用途；以及該抗體用於製造供治療有需 要之個體之藥物的用途。此外，本發明為一種能夠結合TFpi 之K2域之單株抗體治療有需要之個體的方法。 使用本發明之該單株抗體可顯著減少失血。 使用本發明之該單株抗體可顯著減少出血時間。 此外，使用本發明之該單株抗體可減少活體内凝血時 間而不引起暫時性血小板減少症。 64 201026330 具體實例 以下為本發明具體實例之非限制性清單： 具體實例1 :能夠特異性結合TFPI之K2域的單株抗 體’其中該抗體能夠結合的抗原決定基包含一或多個選自 由以下者所組成之群組的殘基：SEQ ID NO: 2之E10、El 1、 D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、 C32、E33、R34、F35、K36 及 L50。 具體實例2:如具體實例1之單株抗體’其中該抗體能 〇 夠特異性結合的抗原決定基包含含有SEQ ID NO: 2之殘基 E10的抗原決定基。
具體實例3 :如上述具體實例中任一具體實例之單株抗 • 體’其中該抗體能夠特異性結合的抗原決定基包含含有SEQ ID NO: 2之殘基El 1的抗原決定基。 具體實例4 :如上述具體實例中任一具體實例之單株抗 體’其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基 D12的抗原決定基。 Ο 具體實例5:如上述具體實例中任一具體實例之單株抗 體’其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基 P13的抗原決定基。 具體實例ό :如上述具體實例中任一具體實例之單株抗 體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基 R17的抗原決定基。 具體實例7 :如上述具體實例中任一具體實例之單株浐 體’其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基 Y19的抗原決定基。 65 201026330 具體實例8 .如上述具體實例中任一具體實例之單株抗〆 體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID N〇: 2之殘基 T21的抗原決定基。 具體實例9 .如上述具體實例中任一具體實例之單株抗 體，其中s亥抗體能夠特異性結合包含SEQ m N〇: 2之殘基 Y23的抗原決定基。 具體實例10 :如上述具體實例中任一具體實例之單株 抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEq ID N〇: 2之殘 基F24的抗原決定基。 具體實例11 :如上述具體實例中任一具體實例之單株 G 抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEq m N〇: 2之殘 基N26的抗原決定基。 具體實例12 :如上述具體實例中任一具體實例之單株 · 抗體’其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ m N〇: 2之殘 基Q28的抗原決定基。 具體實例13.如上述具體實例中任一具體實例之單株 抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEq NQ: 2之殘 基Q31的抗原決定基。 ' ❹ 具體實例14:如上述具體實例中任一具體實例之單株 抗體，其中該抗體能夠特異性結合包含SEq ID N〇: 2之殘 基C32的抗原決定基。 具鱧實例1 5 .如上述具體實例中任一具體實例之單株 抗體，其中s玄抗體能夠特異性結合包含seqidNO· 成 乂 * ‘ < 殘 基E33的抗原決定基。 具體實例16:如上述具體實例中任一具體實例之單株 66 201026330 抗體其中該抗體能夠特異性結合包含seq⑴n〇: 2之殘 基R34的抗原決定基。 具體實例17:如上述具體實例中任-具體實例之單株 抗體其中該抗體能夠特異性結合包含seqidn〇:2之殘 基F35的抗原決定基。 具體實例1 8 .如上述具體實例中任一具體實例之單株 抗體，其申该抗體能夠特異性結合包含SEq ID Ν〇· 2之殘 基Κ36的抗原決定基。 Ο 具體實例19:如上述具體實例中任一具體實例之單株 抗體’其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID no: 2之殘 基L50的抗原決定基。 具體實例20:如具體實例1至16及18至19中任一具 體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異性結合的抗原決 定基包含 SEQ ID NO: 2 之殘基 E10、E11、D12、P13、R17、 Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、 K36 及 L50 〇 〇 具體實例21 :如具體實例1至3、5至9、12至13及 15至19中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體能夠特異 性結合的抗原決定基包含SEQ ID NO: 2之殘基E10、E11、 P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、 K36 及 L50。 具體實例22 :能夠結合TFPI之K2域的單株抗體，其 中該抗體之輕鏈包含以下胺基酸殘基： •在對應於SEQ ID NO: 15之位置31的位置包含E， •在對應於SEQ ID NO: 15之位置32的位置包含8， 67 201026330 •在對應於SEQ ID NO: 15之位置33的位置包含D， •在對應於SEQ ID NO: 15之位置37的位置包含γ， •在對應於SEQ ID NO: 15之位置96的位置包含Α， •在對應於SEQ ID NO: 15之位置97的位置包含τ， 及 •在對應於SEQ ID NO: 15之位置99的位置包含F ; 且其中該抗體之重鍵包含以下胺基酸殘基： •在對應於SEQ ID NO: 18之位置31的位置包含N， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置53的位置包含R， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置54的位置包含s， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置57的位置包含γ， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置59的位置包含γ， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置60的位置包含F， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置61的位置包含p， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置62的位置包含D， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置65的位置包含Q， •在對應於SEQ ID NO: 18之位置102的位置包含γ， •在對應於SEQIDN0: 18之位置1〇3的位置包含d， 及 •在對應於SEQIDN0:18之位置1〇6的位置包含D。 具體實例23:如具體實例丨至21中任—具體實例之單 株抗體，其中該抗體之輕鏈包含以下胺基酸殘基： •在對應於SEQIDN〇: 15之位置31的位置包含E， .在對應於seqIDN0: 15之位置32的位置包含s， •在對應於SEQIDNO: 15之位置33的位置包含d， 68 201026330 •在對應於SEQ ID NO: 15之位置37的位置包含γ， •在對應於SEQ ID NO: 15之位置96的位置包含Α， •在對應於SEQ ID NO: 15之位置97的位置包含τ， 及 •在對應於SEQ ID NO: 15之位置99的位置包含F ; 且其中該抗體之重鏈包含以下胺基酸殘基：
在對應於SEQ ID NO: 18之位置31的位置包含N， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置53的位置包含R， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置54的位置包含s， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置57的位置包含γ， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置59的位置包含γ， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置60的位置包含F， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置61的位置包含p， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置62的位置包含D， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置65的位置包含q， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置1〇2的位置包含γ， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置1〇3的位置包含D， 在對應於SEQ ID NO: 18之位置1〇6的位置包含D。 具體實例24 :如具體實例22或具體實例23之軍株抗 體’其中該重鏈進一步在對應於SEQ ID NO·· 18之位置52 的位置包含S。 具體實例25 :如具體實例22至 m Z 1 23中任一具體實例之 單株抗體’其中該輕鏈進一步在斜虛 也對應於SEQ ID NO: 15之位 置98的位置包含Η;且該重鏈谁一 ^步在對應於SEQ ID NO: 69 201026330 18之位置56的位置包含S。 具體實例26 : —種單株抗體，其能夠結合組織因子路 徑抑制子（TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重 鏈包含SEQ ID NO: 18之胺基酸31至35( NYAMS )之CDR1 序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代。 具體實例27 :如具體實例1至2 1中任一具體實例之單 株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子（TFPI )之Kunitz 2 (K2)域，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 18之胺基 酸31至35 ( NYAMS)之CDR1序列，其中此等胺基酸之一 可經不同胺基酸取代。 具體實例28 : —種單株抗體，其能夠結合組織因子路 徑抑制子（TFPI )之Kunitz 2 ( K2 )域，其中該抗體之重 鏈包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸 50 至 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)之 CDR2 序列，其中一、二或 三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例29 :如具體實例1至2 1中任一具體實例之單 株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子（TFPI )之Kunitz 2 (K2)域，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 18之胺基 酸 50 至 66 ( TISRSGSYSYFPDSVQG)之 CDR2 序列，其中 一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例30 : —種單株抗體，其能夠結合組織因子路 徑抑制子（TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重 鏈包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸 99 至 110 (LGGYDEGDAMDS )之CDR3序列，其中一、二或三個此 等胺基酸可經不同胺基酸取代。 70 201026330 具體實例3 1 :如具體實例1至2 1中任一具體實例之單 株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子（TFPI )之Kunitz 2 (K2)域，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 18之胺基 酸 99 至 110 ( LGGYDEGDAMDS )之 CDR3 序列，其中一、 二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例32 : —種單株抗體，其能夠結合組織因子路 徑抑制子（TFPI )之Kunitz 2 ( K2 )域，其中該抗體之輕 鏈包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 24 至 39 ❹ (KSSQSLLESDGKTYLN)之 CDR1 序列，其中一、二或三 個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例33 :如具體實例1至2 1中任一具體實例之單 . 株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子（TFPI )之Kunitz 2 ( K2)域，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO: 15之胺基 酸 24 至 39 ( KSSQSLLESDGKTYLN)之 CDR1 序列，其中 一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例34 : —種單株抗體，其能夠結合組織因子路 Q 徑抑制子（TFPI )之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕 鏈包含SEQ ID NO: 15之胺基酸55至61( LVSILDS)之CDR2 序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例35 :如具體實例1至21令任一具體實例之單 株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子（TFPI )之Kunitz 2 (K2)域，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO·· 15之胺基 酸55至61 ( LVSILDS)之CDR2序列，其中一或兩個此等 胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例36 : —種單株抗體，其能夠結合組織因子路 71 201026330 徑抑制子（TFPI)之Kunitz 2 ( Κ2 )域，其中該抗體之輕 鏈包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94 至 102 ( LQATHFPQT) 之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取 代。 具體實例37 :如具體實例1至21中任一具體實例之單 株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子（TFPI )之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO: 15之胺基 酸94至102 ( LQATHFPQT)之CDR3序列，其中一或兩個 此等胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例38 : —種單株抗體，其能夠結合組織因子路 徑抑制子（TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重 鍵包含： • SEQ ID NO: 18 之胺基酸 31 至 35 ( NYAMS)之 CDR1 序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ ID NO: 18 之胺基酸 50 至 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)之 CDR2 序列，其中一、二或 三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ ID NO: 18 之胺基酸 99 至 110 (LGGYDEGDAMDS )之CDR3序列，其中一、二或三個此 等胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例39 :如具體實例1至2 1中任一具體實例之單 株抗體，其中該抗體之重鏈包含： • SEQ IDNO: 18 之胺基酸 31 至 35( NYAMS)之 CDR1 序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ ID NO: 18 之胺基酸 50 至 66 72 201026330 (TISRSGSYSYFPDSVQG)之 CDR2 序列，其中一、二或 三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ ID NO: 18 之胺基酸 99 至 110 (LGGYDEGDAMDS )之CDR3序列，其中一、二或三個此 等胺基酸可經不同胺基酸取代。 具體實例40 : —種單株抗體，其能夠結合組織因子路 徑抑制子（TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之輕 鏈包含： 0 · SEQ ID NO: 15 之胺基酸 24 至 39 (KSSQSLLESDGKTYLN)之 CDR1 序列，其中一、二或三 個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或 . · SEQ IDNO:15 之胺基酸 55 至 61( LVSILDS )之 CDR2 序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/ 或 • SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94 至 102 ( LQATHFPQT) 之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取 ❿ 代。 具體實例41 :如具體實例1至21中任一具體實例之單 株抗體，其中該抗體之輕鏈包含： • SEQ ID NO: 15 之胺基酸 24 至 39 (KSSQSLLESDGKTYLN)之 CDR1 序列，其中一、二或三 個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ ID NO: 15 之胺基酸 55 至 61( LVSILDS )之 CDR2 序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/ 或 73 201026330 • SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94 至 102 ( LQATHFPQT) 之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取 代。 具體實例42 : —種單株抗體，其能夠結合組織因子路 徑抑制子（TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重 鏈包含： • SEQ ID NO: 18 之胺基酸 31 至 35 ( NYAMS )之 CDR1 序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ ID NO: 18 之胺基酸 50 至 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)之 CDR2 序列，其中一、二或 三個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ ID NO: 18 之胺基酸 99 至 110 (LGGYDEGDAMDS )之CDR3序列，其中一、二或三個此 等胺基酸可經不同胺基酸取代； 且其中該抗體之輕鏈包含： • SEQ ID NO: 15 之胺基酸 24 至 39 (KSSQSLLESDGKTYLN )之 CDR1 序列，其中一、二或三 個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ IDNO: 15 之胺基酸 55 至 61( LVSILDS )之 CDR2 序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/ 或 • SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94 至 102 ( LQATHFPQT) 之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取 代。 具體實例43 :如具體實例1至2 1中任一具體實例之單 201026330 株抗體，其中該抗體之重鏈包含： • SEQ ID NO: 18 之胺基酸 31 至 35( NYAMS)之 CDR1 序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ ID NO: 18 之胺 基 酸 50 至 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)之 CDR2 序·. 列， 其中 —— > 二或 三個此等胺基酸可經不同胺基 酸取代 :及/或 • SEQ ID NO: 18 之胺 基 酸 99 至 110 (LGGYDEGDAMDS)之 CDR3 序列， 其 中一 或三個此 等胺基酸可經不同胺基酸取代 1 且其中該抗體之輕鏈包含 ； • SEQ ID NO: 15 之胺 基 酸 24 至 39 (KSSQSLLESDGKTYLN)之 CDR1序列 ，其 中一 '二. 或三 個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/或 • SEQ IDNO: 15 之胺基酸 55 至 61( LVSILDS )之 CDR2 序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/ 或 〇 · SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94 至 102 ( LQATHFPQT) 之CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取 代。 具體實例44 :如具體實例26至43中任一具體實例之 單株抗體，其中該等胺基酸取代不包含以下胺基酸： •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR1區之位置31的位 置不包含N ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置53的位 置不包含R ; 75 201026330 •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置54的位 置不包含S ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置56的位 置不包含S ; •在對應於SEQ ID NO·· 18之CDR2區之位置57的位 置不包含Y ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置59的位 置不包含Y ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置60的位 置不包含F ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置61的位 置不包含P ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR2區之位置62的位 置不包含D ;及 •在對應於SEQ ID NO·· 18之CDR2區之位置65的位 置不包含Q ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR3區之位置102的位 置不包含Y ; •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR3區之位置103的位 置不包含D ;及 •在對應於SEQ ID NO: 18之CDR3區之位置106的位 置不包含D ; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置31的位 置不包含E ; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置32的位 76 201026330 置不包含s; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置33的位 置不包含D ;及 .在對應於SEQ ID NO: 15之CDR1區之位置37的位 置不包含Y ; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置96的位 置不包含A ; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置97的位 〇 置不包含T ; •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置98的位 置不包含Η ;及 • •在對應於SEQ ID NO: 15之CDR3區之位置99的位 置不包含F。 具體實例45 :如具體實例26至44中任一具體實例之 單株抗體，其中該胺基酸取代為保守性取代。 具體實例46 :如具體實例26至45中任一具體實例之 © 單株抗體，其中該抗體之重鏈包含： •包含SEQIDNO: 18之胺基酸31至35 (NYAMS)之 CDR1序列；及 •包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸 50 至 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)之 CDR2 序列；及 •包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸 99 至 110 (LGGYDEGDAMDS)的 CDR3 序列。 具體實例47 ·•如具體實例26至46中任一具體實例之 單株抗體，其中該抗體之輕鏈包含： 77 201026330 •包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 24 至 39 (KSSQSLLESDGKTYLN)之 CDR1 序列；及 •包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 55 至 61 ( LVSILDS) 之CDR2序列；及 •包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94 至 102( LQATHFPQT) 之CDR3序列。 具體實例48 :如具體實例46至47中任一具體實例之 單株抗體，其中該重鏈包含： •包含SEQ ID NO·· 18之胺基酸31至35 ( NYAMS )之 CDR1序列；及 •包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸 50 至 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)之 CDR2 序列；及 •包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸 99 至 110 (LGGYDEGDAMDS)的 CDR3 序列； 且其中該輕鏈包含： •包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 24 至 39 (KSSQSLLESDGKTYLN)之 CDR1 序列；及 •包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 55 至 61 ( LVSILDS) 之CDR2序列；及 •包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94 至 102( LQATHFPQT) 之CDR3序列。 具體實例49 :如前述具體實例中任一具體實例之單株 抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO: 15。 具體實例50 :如前述具體實例中任一具體實例之單株 抗體，其中該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 18。 78 201026330 具體實例51:如前述具體實例中任—具體實例之單株 抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 15乃τ 及 SEQ ID NO: 18。 具體實例52 :如前述具體實例中任— 具體實例之單株 抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 21之輕鍵。 具體實例53 :如前述具體實例中任— ^ 具體實例之單株 抗體’其中該抗體包含SEQ ID NO: 24之重鍵。 ❹ ❹ 具體實例54:如具體實例52至53中任—具體實例之 單株抗體，其中該抗體包含SEq ID n〇:2^seqidn〇: 24 〇 具體實例55:如前述具體實例中任_具體實例之單株 抗體，其為人類化抗體。 具體實例56 :如具體實例55之單株抗體，其中重键之 框架區2包含以下胺基酸： .在對應於SEQIDN0: 18之位置4〇的位置包含丁， •在對應於SEQHDNO: 18之位置42的位置包含£， •在對應於SEQIDNO: 18之位置44的位置包含R， 及 •在對應於SEQIDN〇: 18之位置49的位置包含A。 具體實例57:如具體實例55之單株抗體，其中重鍵之 框架區2包含對應於SEQ ID NO: 18之位置36至49 (WVRQTPEKRLEWVA)的胺基酸。 具體實例58:如具體實例}至54中任一具體實例之單 株抗體，其為人類抗體。 具體實例59:如具體實例1至54中任一具體實例之單 株抗體，其為嵌合抗體。 79 201026330 具體實例60 :如前述具體實例中任一具體實例之單株 抗體，其中該抗體之同型為IgG。 具體實例61 :如具體實例60之單株抗體，其中該同型 為 IgGl、IgG2 或 IgG4。 具體實例62 :如具體實例61之單株抗體，其中該抗體 之同型為IgG4。 具體實例63 :如具體實例60至62中任一具體實例之 單株抗體，其中該抗體之Fc區中之至少一個胺基酸已被另 一個胺基酸取代。 具體實例64 :如前述具體實例中任一具體實例之單株 抗體，其中該抗體之Fc區與SEQ ID NO: 24之胺基酸 122-448至少80%—致，諸如至少85%，諸如至少90%，諸 如至少95%，諸如95-100%—致。 具體實例65 : —種單株抗體，其能夠以高於mAb0281 之親和力結合TFPI之K2域。 具體實例66 :如具體實例1至64中任一具體實例之單 株抗體，其能夠以高於mAb0281之親和力結合TFPI之K2 域。 具體實例67 : —種單株抗體，其能夠以高於mAb4904 之親和力結合TFPI之K2域。 具體實例68 :如具體實例1至66中任一具體實例之單 株抗體，其能夠以高於mAb4904之親和力結合TFPI之K2 域。 具體實例69 : —種單株抗體，其能夠以高於mAb2974 之親和力結合TFPI之K2域。 80 201026330 具體實例70 :如具體實例1至68中任一具體實例之單 株抗體，其能夠以高於mAb2974之親和力結合TFPI之K2 域。 具體實例71: —種單株抗體，其能夠以高於mAb29741 之親和力結合TFPI之K2域》 具體實例72 :如具體實例1至70中任一具體實例之單 株抗體，其能夠以高於mab29741之親和力結合TFPI之K2 域0 〇 具體實例73 : —種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2 域，其中該抗體之Kd小於0.8 nM，諸如小於0.7 nM，諸如 小於0.6 nM，諸如小於0.5 nM，諸如小於0.4 nM，.諸如小 - 於〇.3 nM，諸如小於0.2 nM，諸如小於0·1 nM，諸如小於 . 〇·〇5 nM，諸如小於 0.025 nM。
具體實例74 :如具體實例1至73中任一具體實例之單 株抗體，其中該抗體之KD小於0.8 nM，諸如小於〇 7 諸如小於〇·6 nM ’諸如小於0.5 nM，諸如小於〇 4 nM，諸 如小於0.3 nM，諸如小於0.2 nM，諸如小於〇.1 nM， ’睹如 小於0·05 nM，諸如小於0.025 nM。具體實例75 :如 曰——* 上远 板 具體實例中任一具體實例之單株抗體，其能夠結合灰， 相關TFPI之K2域。 具體實例76:如上述具體實例中任一具體實例之單 抗體，其能夠抑制可溶性TFPI。 株 體，其中# 具體實例之單株 具體實例77 :如具體實例76之單株抗 性TFPI可完全受抑制。 具體實例78 :如上述具體實例中任一 81 201026330 抗體’其能夠抑制結合脂蛋白之TFPI。 具體實例79 :如上述具體實例中任一具體實例之單株 抗體’其能夠抑制結合内皮細胞之TFPI。 具體實例8〇: 一種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2 域’使得FXa保留其活性之至少91%，諸如至少92%、諸 如至少93%、諸如至少94%、諸如至少95%、諸如至少96%、 諸如至少97%、諸如至少98%、諸如至少99%、諸如 99-100 /〇，如在pXa抑制檢定中所量測的。 具體實例8 1 :如具體實例1至79中任一具體實例之單 株抗體，其能夠結合TFPI，使得FXa保留其活性之至少 91%，諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少94%、諸如 至少95%、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少、 諸如至少99%、諸如99_1()()% ’如在^抑制檢定中所量 測的。 、 例82 . 一種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2 域’使得個體中自由而之百分比減少至小於鳩，諸如 ❹ 小於29%、諸如小於28%、諸如小於27%、諸如小於％%、 諸如小於25%、諸如小於24。/ ^ , j於24/°堵如小於23%、諸如小於 22%、諸如小於21%、諸如小於鳩、諸如小於19%、諸如 小於18%'諸如小於17%、諸如小於16%、諸如小於15%、 諸如小於14 %、諸如小於丨^。/ ^ , 奇到R 13/。、堵如小於12%、諸如小於 11%、諸如小於10%、諸如小 、 y/0諸如小於8%、諸如心、 於7%、諸如小於6%、諸如^ ^ ^ ^ ^ j於5 /〇、啫如小於40/〇、諸如 小於3%、諸如小於2%、諸 冲即1/〇、褚如在1%與〇 間。 、 82 201026330 ❹ 具體實例83 :如具體實例丨至8丨中任一具體實例之單 株抗體，其能夠結合TFPI之K2域，使得個體中自由TFpi 之百分比減少至小於30%，諸如小於29%、諸如小於28%、 諸如小於27%、諸如小於26%、諸如小於25%、諸如小於 24/。、諸如小於23%、諸如小於22%、諸如小於η%、諸如 J於20 /〇、諸如小於丨9%、諸如小於丨、諸如小於1 7%、 諸❶如小於16%、諸如小於15%、諸如小於14%、諸如小於 13/。、諸如小於12% '諸如小於ιι%、諸如小於㈣、諸如 小於9%、諸如小於8%、諸如小於7%、諸如小於6%、諸 ^於外、諸如小於4%、諸如小於3%、諸如小於心、 =小於1% '諸如在1%與〇%之間。 具體實例84:如具时例83之單株抗體 個體投予該單株抗體二在向該 期間、諸如在…期間、諸如==頭27天 頭24天期間、諸如…， 期間、諸如在 諸如在頭21天期門 天期間、諸如在頭22天期間、 牧視d天期間、諸如在頭2〇 期間、諸如在頭U天期間、諸如在頭;在頭19天 頊16天期間、諸如在頭】… 天期間、諸如在 諸如在頭13天期門諾如月間 '諸如在頭14天期間、 期間 '諸如在頭〗〇天期間在::在天期間、諸如在頭天 8天期間、諸如在頭7天期間 ：9天期間、諸如在頭 頭5天期間、諸如 頭6天期間、諸如在 如在頭2天期間、諸如在二期間、諸如在頭3天期間、諸 量減少至該百分比。 天期間，個體中自由TFPI之 具體實例85 .· _ 車株抗體，其能夠結合咖之K2 83 201026330 域且當TFPI以該抗體飽和時，該抗體能夠將TFPI對結合 膜之FVIIa/TF/FXa之抑制中和至少55%，諸如至少60%、 諸如至少65%、諸如至少70%、諸如至少75%、諸如至少 80%、諸如至少85%、諸如至少90%、諸如至少95%、諸如 多至100%、諸如100%，如在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中 所量測的。 具體實例86 :如具體實例1至84中任一具體實例之單 株抗體，其中TFPI以該抗體飽和時，該抗體能夠將TFPI 對結合膜之FVIIa/TF/FXa之抑制中和至少55%，諸如至少 60%、諸如至少65%、諸如至少70%、諸如至少75%、諸如 至少80%、諸如至少85%、諸如至少90%、諸如至少95% ' 諸如多至100%、諸如100%，如在FVIIa/TF/FXa抑制子檢 定中所量測的。 具體實例87 : —種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2 域且減少活體内凝血時間而不顯著降低血小·板數。 具體實例88 :如具體實例1至86中任一具體實例之單 株抗體，其中該抗體減少活體内凝血時間而不顯著降低血 小板數。 具體實例89 :如具體實例88之單株抗體，其中該血小 板數未降至初始血小板數之約80%，諸如約75%、諸如約 70%、諸如約65%、諸如約60%、諸如約55%、諸如約50%、 諸如約45%、諸如約40%、諸如約35%、諸如約30%、諸 如約25%。 具體實例90 : —種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2 域且減少活體内凝血時間而未引起暫時性血小板減少症。 84 201026330 具體實例91 :如具體實例1至89中任一具體實例之單 株抗體，其中該抗體減少活體内凝血時間而未引起暫時性 血' 小板減少症。 具體實例92 : —種如前述具體實例中任一具體實例之 單株抗體的片段。 具體實例93 :如具體實例92之片段，其為Fab片段、 F(ab')2片段、Fab，片段、Fd片段、fv片段或dAb片段。 具體實例94 . 一種如具體實例中任一具體實例之單株 ❿ 抗體之變異體’其為缺失變異體或插入變異體。 具體實例95. —種醫藥調配物，其包含如具體實例1 至94中任一具體實例之單株抗體。 • 具體實例90 : 一種醫藥調配物，其包含如具體實例i . 至94中任一具體實例之單株抗體，其中該調配物適於非經 腸使用。 具體實例9 7 : —種醫藥調配物，其包含如具體實例1 至94中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體適於靜脈内 ❿ 使用》 具體實例9 8 : —種醫藥調配物，其包含如具體實例1 至94中任一具體實例之單株抗體，其中該抗體適於肌肉内 使用。 具體實例99 : 一種醫藥調配物’其包含如具體實例1 至94中任一具體實例之單株抗體’其中該抗體適於皮下使 用。 具體實例1 00 : —種如具體實例1至94中任一具體實 例之單株抗體的用途，其用於製造適於非經腸投予之藥物。 85 201026330 具體實例1〇1 : 一種如具體實例1至94中任一具體實 例之單株抗體的用途，其用於製造適於靜脈内投予之藥物。 具體實例102:—種如具體實例1至94中任一具體實 例之單株抗體的用途，其用於製造適於肌肉内投予之藥物。 具體實例103 : 一種如具體實例1至94中任一具體實 例之單株抗體的用途’其用於製造適於皮下投予之藥物。 具體實例104 : —種如具體實例丨至94中任一具體實 例之單株抗體的用途，其用於治療患有凝血障礙之個體。 具體實例105 :如具體實例1〇4之用途，其中該個體患 有任何先天性、後天性及/或醫原性凝血障礙，諸如可選自 由A型血友病（有或無抑制子）及3型血友病（有或無抑 制子）所組成之群組。 具體實例106 :如具體實例95至105中任一具體實例 之用途’其中該單株抗體顯著減少失血。 具體實例10 7 :如具體實例95至1 〇 6中任一具體實例 之用途’其中該單株抗體顯著減少出血時間。 具體實例1 08 :如具體實例95至1 〇7中任一具體實例 之用途，其中單株抗體之投予量使得該單株抗體之血漿濃 度為約10 pg/ml至約40 pg/ml ’諸如約15-35 pg/ml、諸如 約 10-15 pg/nU、諸如約 15-20 pg/m卜諸如約 20-25 pg/ml、 諸如約25-30 μg/mi、諸如約30-35 pg/ml、諸如約35-40
Pg/inl ° 具體實例109 : —種治療患有凝血障礙之個體的方法， 其包含向該個體投予如具體實例1至94中任一具體實例之 單株抗體。 86 201026330 具體實例11 〇 :如具贈眘右丨 丹骽實例109之方法，其中該凝血障 礙為任何先天性、後天性及/或醫原性凝血障礙，諸如可選 由Α尘血友病（有或無抑制子）及β型血友病（有或無 抑制子）所組成之群組。 、體實例111 .如具體實例！ 〇9至U 〇中任一具體實例 之方法，其中該單株抗體能夠顯著減少失血。 γ、體實例112，如具體實例1 〇9至1丨丨中任一具體實例 之方法，其中該單株抗體能夠顯著減少出血時間。 I -、體實例113 .如具體實例} 〇9至i丨丨中任一具體實例 方法其中單株抗體之投予量為使其標靶飽和之量。 具體實例114:如具體實例109至113 t任一具體實例 之方去’其中單株抗體之投予量為使可溶性TFPI飽和之量。 具體實例115 :如具體實例109至114中任一具體實例 ’其中所投予之該抗體能夠完全抑制可溶性TFPI <· 具體實例116:如具體實例109至115中任一具體實例 方法’其中該單株抗體之投予量足以使結合内皮之TFpi ίΡ 飽和。 具體實例117 :如具體實例109至116中任一具體實例 法r ’其中單株抗體之投予量使得該單株抗體之企漿濃 約 10 pg/inl 至約 4〇 pg/ml ’ 諸如約 15-35 pg/ml、諸如 約 10 _ 1 ς , ml、諸如約 15-20 pg/ml、諸如約 20-25 pg/ml、 绪如約 9 ς 1 Λ M pg/ml、諸如約30-35 pg/m卜諸如約35_40 ^g/mi 〇 具體實例118:如具體實例1〇9至117中任—具體實例 之方法，其中可投予單次劑量。 87 201026330 具體實例119:如具體實例109至118中任一具體實例 之方法’其中可投予多次劑量。 具體實例120:如具體實例1〇9至119中任—具體實例 之方法’其中可每日投予該抗體。 具體實例121 :如具體實例1〇9至120中任一具體實例 之方法，其中可每隔一天投予該抗體。 具體實例122 :如具體實例109至121中任一具體實例 之方法’其中可每隔兩天投予該抗體。 具體實例123 :如具體實例109至122中任-具體實例 之方法’其中可每隔三天投予該抗體。 具體實例124 :如具體實例109至123中任一具體實例 之方法’其中可每隔四天投予該抗體。 具體實例125 :如具體實例1〇9至124中任一具體實例 之方法’其中可每隔五天投予該抗體。 具體實例126 :如具體實例109至125中任一具體實例 之方法，其中可大約每週（諸如每5、6、7、8、9或10天） 投予該單株抗體。 具體實例127:如具體實例1〇9至126中任—具體實例 之方法，其中可大約每隔一週（諸如每11、12、13、14、 15、16或17天）投予該單株抗體。 具體實例128:如具體實例1〇9至127中任一具體實例 之方法’其中可大約每隔兩週（諸如每18、19、20、21、 22、23或24天）投予該單株抗體。 具體實例129 :如具體實例1〇9至128中任—具體實例 之方法’其中可大約每隔三週（諸如每25、26、27 n 88 201026330 29、30或31天）投予該單株抗體。
具體實例130:如具體實例109至129中任一具體實例 之方法，其中劑量可為約O.i-lO mg/kg，諸如約0.U mg/kg ’ 諸如約 1 -2 mg/kg，或約 2-3 mg/kg，或約 4-5 mg/kg， 或約 5-6 mg/kg ’ 或約 6-7 mg/kg，或約 7_8 mg/kg，或約 8 9 mg/kg，或約 9-10 mg/kg ;或約 10-21 mg/kg，諸如約 104 i mg/kg，或約 11-12 mg/kg，或約 12-13 mg/kg，或約 13-14 mg/kg，或約 14-15 mg/kg，或約 15-16 mg/kg，約 16-17 mg/kg ’ 或約 17-18 mg/kg，或約 1 8-19 mg/kg，或約 19-20 mg/kg 或約 20-21 mg/kg。 具體實例13 1 :如具體實例1 〇9至13〇中任一具體實例 - 之方法’其中劑量可為約2至200 mg/kg、諸如約150-200 mg/kg、諸如約 150-170 mg/kg、諸如約 100_15〇 mg/kg、諸 如約 50-100 mg/kg、諸如約 70_90 mg/kg、諸如約 1〇·5〇 mg/kg、諸如約 10-30 mg/kg。 具體實例132:如具體實例1〇9至13ι中任一具體實例 〇 之方法，其中可非經腸投予該單株抗體。 具體實例133:如具體實例132之方法’其中可靜脈内 投予該單株抗體。 具體實例U4:如具體實例133之方法’其中該單株抗 體之劑量可為約10-20 mg/kg。 具體實例135:如具體實例133至134中任一具體實例 之方法，其中可每隔一週投予該單株抗體。 具體實例136:如具體實例133至135令任一具體實例 之方法，其中可每隔兩週投予該單株抗體。 89 201026330 具體實例137:如具體實你丨^ & 菔貫例133至136中任一具體實例 之方法，其中可每隔三週投予該單株抗體。 具體實例138 :如具體實例⑶之方法，其中該單株抗 體之劑量可為約1G_2() mg/kg且可每隔—週投予該單株抗 體。 具體㈣139:如具體㈣133之方法，其中該單株抗 體之劑量可為、約10_20mg/kg且可每隔兩週投予該單株抗 體。 具體實例140 :如具體實例133之方法， 體之劑量可為…一kg且可每隔三週投予== 體。 具體實例141:如具體實例132之方法，其中可肌肉内 投予該單株抗體。 具體實例142 :如具體實例132之方法，其中可皮下投 予該單株抗體。 具體實例143:如具體實例U2之方法，其中該單株抗 體之劑量可為約1 mg/kg。 具體實例144 :如具體實例141至143中任—具體實例 之方法，其中可每日投予該單株抗體。 具體實例145:如具體實例141至144中任一具體實例 之方法’其中可每隔一天投予該單株抗體。 具體實例146:如具體實例141至145中任一具體實例 之方法’其中該單株抗體之劑量可為約1 mg/kg且可每曰投 予該單株抗體。 具體實例147:如具體實例141至146中任一具體實例 90 201026330 之方法，其中該單株抗體之劑量可為約1 mg/kg且可每隔一 天投予該單株抗體。 具體實例148:如具體實例1〇9至147中任一具體實例 之方法’其中可預防性地投予該抗體。 具體實例149 :如具體實例1〇9至148中任一具體實例 之方法’其中可治療性地（應需）投予該抗體。 具體實例150:如具體實例109至149中任一具體實例
之方法，其中所投予之該抗體能夠完全（100¼)抑制可溶 性 TFPI。 / 具體實例1 5 1 : 一種聚核苷酸，其編碼如具體實例1至 94中任一具體實例之單株抗體。 具體實例152:如具體實例151之聚核苷酸，其包含至 少-個選自由SEQ ID N。： 13、16、19及22所組成之群組 的序列。 具艎實例1 53 :如具體實例1 52 t聚核苷酸，其包含 SEQ ID NO: 19。 具體實例1 5 4 · k a λ* # / ., 4.如具體實例152之聚核苷酸，其包含 SEQ ID NO: 22 〇 具體實例 155 :如具體實例 SEQ ID NO: 19 及 22 152之聚核苷酸，其包含 具體實例 至155中任一 156: 一種真核細胞，其 具體實例之聚核苷酸。 包含如具體實例1 5 1 具體實例1 5 7 : 中任一具體實例 具體實例1 5 8 : 一種真核細胞’其表現如具體實例1至 之單株抗體或其片段。 如具體實例1 57之真核細胞，其為哺乳 91 94 201026330 動物細胞。 具體實例159:如具體實例157之真核細胞，其為酵母 細胞。 具體實例160:如具體實例158之哺乳動物細胞其係 選自由HEK293、CH〇、BHK、刪及人類視網媒細胞所組 成之群組。 實施例 本發明由以下實施例進一步說明，該等實施例不應視 為對本發明之進-步限制。整篇本申請案中所引用之所有 圖式及所有參考文獻、專利及已公開專利申請案之内容均 以引用的方式明確併入本文中。 實施例1:產生及特性化針對TFPI之單株抗體 產生針對組織因子路徑抑制子（TFPI)之單株抗體。 鐘定、選殖及定序具有所需結合特異性之單株抗體。發現 此抗體可在活體内顯著減少表皮出血時間且不引起血小板 數目顯著降低。 方法及結果 根據製造商說明書使用所有套組。縮寫：HC :重鏈； LC .輕鏈；VH :重鏈可變域；VL :輕鏈可變域；:聚 合酶鏈反應。 龙瘦Λ融合 以全長TFPI與僅含有前兩個Kunitz域之短型 TFPIB161B使小鼠免疫。將RBF小鼠用於免疫及產生小鼠 單株抗體。在小鼠背部進行皮下注射。將2〇肫蛋白質與完 全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant)混合用於首次注 92 201026330 射。在後續免疫中，在相同濃度之抗原存在下使用弗氏不 完全佐劑。在最後免疫之後十天，藉由ELIS A篩選來自小 鼠之眼睛血液的TFPI特異性抗體。以1 0 pg TFPI藉由靜脈 内注射來加強具有陽性血清效價之小鼠，且三天之後處 死。無菌移除脾臟且分散成單細胞懸浮液。藉由PEG法或 藉由電融合法將脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合。
結合檢定：ELISA 以抗小鼠IgG塗佈免疫培養盤。將融合瘤細胞之培養 0 上清液添加至培養盤中且在洗務之後，添加生物素標記之 可溶性人類TFPI或TFPIB161B以測試特異性結合。 中和檢定：FXa檢定及TF/FVIIa/FXa檢定 FXa抑制檢定：將引起FXa 90%抑制之固定濃度之TFPI 與含有抗TFPI單株抗體之融合瘤細胞之培養上清液一起預 培育，且添加至FXa加FXa特異性發色受質中。此檢定係 針對TFPI與FXa之結合（詳述於實施例6中）。 FVIIa/TF/FXa抑制檢定：1 )培育含有抗TFPI單株抗 〇 體之融合瘤細胞之培養上清液及固定TFPI ( FVIIa/TF之 90%抑制）；2)培育 TFPI+FVIIa+ TF+FXa ； 3 )添加 FX (FX»FXa)，接著與FXa發色受質一起培育（詳述於實施 例7中）。 稀釋凝血酶原時間（dPT) 稀釋凝血酶原（PT)分析：將人類血漿與稀釋之人類 凝血活素（來源於TF )合併。添加遞增濃度之蛋白質A純 化TFPI單株抗體之後量測血漿之凝結時間以檢查凝血時間 之劑量依賴性減少。FVIIa ( 25 nM )為陽性對照物且必須 93 201026330 縮短此凝血時間。 結合相互作用分析 在Biacore 3000中藉由表面電漿共振分析結合相互作 用。以固著之小鼠抗IgG捕捉固定濃度之相關單株抗體。 測試不同濃度之TFP卜假設TFPI與相關抗體1:1相互作用 來測定結合常數（kon、koff、KD )(詳述於實施例8中）。 血栓彈力圖 血栓彈力圖記錄全血中凝塊形成及纖維蛋白溶解之動 力學。藉由預培育血液與中和性抗FVIII IgG來誘發A型血 友病樣病狀。 抗體選殖及定序 自融合瘤：TFPI-4F36A1B2 (在本文中縮寫為4F36) 選殖抗TFPI抗體之鼠類重鏈及輕鏈序列。總RNA (使用 Qiagen之RNeasy-Mini套組自融合瘤細胞提取）用作cDNA 合成之模板。使用Clontech之SMART™ RACE cDNA擴增 套組、以5'-RACE反應來合成cDNA。隨後使用Phusion Hot Star聚合酶（Finnzymes )及通用引子混合物（UPM )(包括 於SMART™ RACE套組中）作為正向引子、藉由PCR對 HC及LC序列進行標靶擴增。具有以下序列之反向引子用 於 HC (VH 域）擴增：5’-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3· (129號引子）。具有以下序列之反向引子用於LC擴增： 5，-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3' (69號引子）。 藉由凝膠電泳分離PCR產物，使用GFX PCR DNA及 Gel Band 純化套組（來自 GE Healthcare Bio-Sciences)來 201026330 提取，且使用Zero Blunt TOPO PCR選殖套組及化學上勝任 之TOP 1 0大腸桿菌（五· co/〇 (來自Invitrogen )來選殖以 便定序。使用 Applied Biosystems 之 AmpliTaq Gold Mas-ter Mix，及M13\mi/M13rev引子對所選菌落進行菌落PCR。使 用ExoSAP-I酶混合物（usb )來進行菌落PCR純化。使用 M13uni(-21)/M13rev(-29)或 T3/T7 定序引子，在 MWG Biotech, Martinsried German 進行定序。使用 VectorNTI 程 式分析及評注序列。
〇 自融合瘤TFPI-4F36A1B2鑑定單一獨特鼠類/c型LC 及單一獨特鼠類HC、子類IgGhLC序列展示於SEQ ID NO: 6中且HC序列展示於SEQ ID ΝΟ_· 10中。VH及VL序列展 • 示於圖2中，不包括前導肽序列。 抗原決定基 TFPI1包括三個Kunitz域（參看圖4)。TFPI1之Kunitz 域之表面可達殘基係依據TFPI1-2之現有結構加以鑑定。詳 言之，相對可達性大於40%之殘基視為表面可達。對於 G TFPI1-2，表面可達殘基包含（參看圖5):胺基酸94-95、 98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142 及 144-145 。 實施例2 :小鼠TFPI4F36A1B2 mAb之選殖及定序 此實施例描述抗TFPI抗體：TFPI4F36A1B2之鼠類重 鍵及輕鍵序列之選殖及定序。 使用Qiagen之RNeasy-Mini套組自融合瘤細胞提取總 RNA且用作cDNA合成之模板。使用Clontech之SMART™ RACE cDNA擴增套組、以5'-RACE反應來合成cDNA。隨 95 201026330 後使用Phusion Hot Star聚合酶（Finnzymes )及通用引子 混合物（UPM )(包括於SMART™ RACE套組中）作為正向 引子、藉由PCR對HC及LC序列進行標靶擴增。鑑定為 SEQ ID NO: 11之反向引子用於HC ( VH域）擴增且鑑定為 SEQ ID NO: 12之反向引子用於LC擴增。藉由凝膠電泳分 離PCR產物，使用GFX PCR DNA及Gel Band純化套組（來 自 GE Healthcare Bio-Sciences )來提取，且使用 Zero Blunt TOPO PCR選殖套組及化學上勝任之TOP 10大腸桿菌 (E.coli ) ( Invitrogen )來選殖以便定序。來自 Applied Biosystems 之 AmpliTaq Gold Master Mix，及 M13uni/M13rev 引子對所選菌落進行菌落PCR。使用ExoSAP-IT酶混合物 (USB )進行菌落 PCR 純化。使用 M13uni(-21)/M13rev(-29) 或 T3/T7 定序引子，在 MWG Biotech，Martinsried German 進行定序。使用VectorNTI程式分析及評注序列。根據製造 商說明書使用所有套組及試劑。鑑定單一獨特鼠類/c型LC 及單一獨特鼠類HC、子類IgG 1。輕鏈可變域之核酸及胺基 酸序列分別展示於SEQ ID NO·· 3及5中。重鏈可變域之核 酸及胺基酸序列分別展示於SEQ ID NO: 7及9中。此等序 列中不包括前導肽序列。 BLAST搜尋 經轉譯之抗TFPI4F36A1B2 VL及VH胺基酸序列用作 查詢序列。使用BLASTp轉譯程式對Uniprot資料庫中之序 列進行BLAST搜尋。抗TFPI4F3 6A1B2 VH之輸出產生排 比，其中50個最高一致性分數中> 20個為鼠類Ig重鏈序 列。相對於小鼠Ig重鏈的最高一致性分數為8 1 %( 99/1 2 1 )。 201026330 抗TFPI4F3 6A1B2 VL之輸出產生排比，其中5〇個最高一致 性分數中> 30個為鼠類Ig &輕鏈序列。相對於小鼠^疋輕 鏈的最高一致性分數為 92% ( 1〇5/113 )。總之，抗 TFPI4F36A1B2之VH及VL序列代表新穎獨特序列。 產生小鼠抗TFPI4F36A1B2表現載艘 產生一系列基於CMV啟動子之表現載體（pTT載體） 以便在 Yves Durocher ( Durocher 等人，Nucleic Acid
Research，2002 )開發之基於HEK293-6E EBNA之表現系統 〇 中短暫表現小鼠TFPI4F36抗體。除CMV啟動子之外，載 體還含有 pMB 1 起點（pMBl origin )、EBV 起點（EBV origin ) 及Amp抗性基因。 • 使用對N端及C端序列具有特異性之引子，自初始 TOPO定序純系對對應於全長抗TFPI4F36A1B2 LC(包括初 始信號肽序列）之區域進行PCR擴增。有義引子含有用於 選殖目的之末端Hindlll限制位點序列，及ATG起始密碼子 上游最近的Kozak序列（5，-GCCGCCACC-3')。反義引子含 © 有終止密碼子，繼之為編碼序列下游最近的Xbal限制位點 序列。所產生之PCR片段經限制消化，選殖於基於線性化 pTT之載體的多重選殖位點（muitipie ci〇ning site，mCS ) 内，且於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗 最終構築體之序列。 使用對N端序列及VH/CH轉換序列（transiti〇n sequence )具有特異性之引子，自初始τορο定序純系對對 應於VH域（包括初始信號肽序列）之區域進行PCR擴增。 有義引子含有用於選殖目的之末端N〇tI限制位點序列，及 97 201026330 ATG 起始密碼子上游最近之 Kozak 序列 (5，-GCCGCCACC-3')。反義引子含有VH/CH轉換序列下 游之同框（in-frame ) Nhel限制位點。所產生之VH域PCR 片段經限制消化，選殖於含有針對鼠類IgGl之CH域序列 的線性化載體中，且於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA 定序來檢驗最終構築體之序列。 經選殖及重組表現之抗TFPI4F36A1B2抗體在所有之 所用檢定中、與自初始融合瘤產生之抗體具有相同特徵及 親和力。用於在HEK293-6E細胞中短暫表現之程序描述於 實施例3中。 實施例3:設計及建構人類化TFPI4F36 mAb 根據Kabat定義評注小鼠抗TFPI4F36A1B2 CDR序列 且所得如下： CDR-H1 : NYAMS ( SEQ ID NO: 8 之胺基酸 31-35)。 CDR-H2 : TISRSGSYSYFPDSVQG ( SEQ ID NO: 8 之胺 基酸 50-66 )。 CDR-H3 : LGGYDEGDAMDS ( SEQ ID NO: 8 之胺基酸 99-110)。 CDR-L1 : KSSQSLLESDGKTYLN ( SEQ ID NO: 4 之胺 基酸 24-39 )。 CDR-L2 : LVSILDS ( SEQ ID NO: 4 之胺基酸 55-61 )。 CDR-L3 ： LQATHFPQT ( SEQ ID NO: 4 之胺基酸 94-102)。 基於結構性模板2GJJ(針對Her2erbb2之mAB)及1X9Q (針對螢光素之 hAB )、以 Modeller ( www.salilab.org 201026330 /modeller/)中建立抗 TFPI4F3 6A1B2 之 3D 模型。 在具有抗TFPI4F36A1B2 VL及VH的人類生殖系V資 料庫中進行BLASTp搜尋獲得以下四種潛在生殖系序列： 重鏈：VH3 一 21 或 VH7183.9 (E-值 <le-45) 輕鏈：VKII_A18 或 VKII_A1 (E-值 <3e-45) 在人工檢查選中字及排比之後，分別選擇VH3_21及 VKII_A18生殖系序列作為HC及LC人類化框架。基於序 列排比選擇相應生殖系J片段作為JH6及JK4。聯合人類化 0 TFPI4F36之第一 CDR移植型展示抗TFPI4F36A1B2與所選 生殖系序列之間的排比。如序列下方之星號所說明，抗 TFPI4F36A1B2 與人類架構（HC : VH3—21/JH6 及 LC : . VKII_A18/JK4 )之間的序列一致性極高。各星號標記序列 一致之位置。根據最小CDR移植策略（其中CDR-H2以比 Kabat定義（殘基50-66 )更短之型式（殘基50-58 )移植） 設計初始人類化VH構築體。其餘5個CDR根據Kabat定 義移植。所移植之CDR ( Kabat定義）列舉如下；以粗體展 Q 示之CDR-H2之殘基為人類生殖系殘基。 CDR-H1 : NYAMS ( SEQ ID NO: 18 之胺基酸 31-35)。 CDR-H2 : TISRSGSYSYYADSVKG ( SEQ ID NO: 28 之 胺基酸50-66)。 CDR-H3 : LGGYDEGDAMDS (SEQ ID NO: 18 之胺基 酸 99-110)。 CDR-L1 : KSSQSLLESDGKTYLN ( SEQ ID NO: 15 之胺 基酸 24-39)。 CDR-L2 : LVSILDS ( SEQ ID NO: 15 之胺基酸 55-61 )。 99 201026330 CDR-L3 ： LQATHFPQT ( SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94-102 )。 最終人類化變異體HzTFPI4F36中之CDR-H2之組成列 舉如下且與針對小鼠抗體抗TFPI4F36A1B2所列之CDR-H2 匹配。 CDR-H2 : TISRSGSYSYFPDSVQG ( SEQ ID NO: 18 之 胺基酸50-66 )。 圖1展示小鼠抗TFPI4F36A1B2之VH ( A)及VL ( B) 域序列（分別為SEQ ID NO: 8及4 )與人類生殖系序列（分 別為SEQ ID NO: 32及31)及CDR移植人類化TFPI4F3 6 序列（分別為SEQ ID NO: 28及26)之排比。使用Kabat 編號系統（如圖中序列上方所示），及根據Kabat定義之CDR 係以粗體展示。小鼠抗TFPI4F36A1B2與生殖系序列之間的 框架區差異係在抗TFPI4F36A1B2序列中以灰色突出顯 示。星號表示小鼠TFPI4F36與人類生殖系序列之間之序列 一致位置。潛在回復突變係在HzTFPI4F36-CDR移植序列 (如hz4F36CDR移植序列所列）中以灰色突出顯示。 依據小鼠TFPI4F36與生殖系序列之框架區中存在之位 置差異來鑑定HzTFPI4F36-CDR移植構築體之潛在回復突 變。3D圖1展示TFPI4F36 Fab片段之序列模型亦用以鑑定 及優選潛在回復突變。人類化TFPI4F36 LC及HC中所產生 之回復突變之清單分別展示於表2及表3中。 產生人類化TFPI4F36之表現載體
根據上述抗體之人類化設計來合成（GENEART AG )人 類化TFPI4F36 VH及VL區之DNA序列。獲得基本最小CDR 201026330 移植且無額外回復突變之序列。構築體中包括各別LC及 HC生殖系前導肽序列以及ATG起始密碼子上游最近的 Kozak 序列（5'-GCCGCCACC-3')。 產生基於pTT之表現載體以便短暫表現作為人類/c /IgG4 ( S241P)同型之人類化TFPI4F36抗體。將位置241 (根據Kabat編號；按照EU編號系統（Edelman G.M.等人， Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85 (1969))對應於殘基 228 ) 之脯胺酸突變引入IgG4鉸鏈區中以免形成單體抗體片段， 亦即，包含一條LC及一條HC之「半抗體」。 自GENEART選殖載體切除VH片段且選殖於含有人類 IgG4 ( S241P) CH域之序列的基於線性化pTT之載體中， - 隨後於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗最 終構築體之序列。自GENEART選殖載體切除VL片段且選 殖於含有人類/c CL域之序列的基於線性化pTT之載體中， 且隨後於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗 最終構築體之序列。
❿ CDR移植HzTFPI4F36單株抗體之VL、VH、LC及HC 之核酸及胺基酸序列（信號肽序列省略）提供於序列表（SEQ ID NO: 26-30)中。 產生小鼠/人類嵌合TFPI4F36之表現載體 為使人類化TFPI4F36變異體能夠得到可能最佳之評 價，構築小鼠/人類嵌合型之抗 TFPI4F36 抗體 (ChimTFPI4F36 )以消除涉及恆定區來源及同型之任何差 異。產生基於pTT之表現載體以便短暫表現在人類/c /IgG4 (S241P)同型架構上具有鼠類可變域之嵌合抗TFPI4F36 101 201026330 抗體。 使用通用ρΤΤ特異性引子及對VH域C端具有特異性 之引子、經由抗TFPI4F36A1B2 HC表現質體對對應於VH 域之區域進行PCR擴增。有義引子對Hindlll限制位點及 ATG起始密碼子上游之序列段具有特異性。反義引子在 VH/CH轉換序列中含有同框Nhel P艮制位點。所產生之PCR 片段經限制消化，選殖於含有人類IgG4 ( S241P) CH域之 序列的基於線性化ρΤΤ之載體中，且隨後於大腸桿菌中轉 型以便選擇。藉由DNA定序來檢驗最終構築體之序列。 使用通用ρΤΤ特異性引子及對VL域C端具有特異性 之引子 '經由TFPI4F36A1B2 LC表現質體對對應於VL域 之區域進行PCR擴增。有義引子對Hindlll限制位點及ATG 起始密碼子上游之序列段具有特異性。反義引子在VL/CL 轉換序列中含有同框BsiWI限制位點。所產生之PCR片段 經限制消化，選殖於含有人類/c CL域之序列的基於線性化 ρΤΤ之載體中，且隨後於大腸桿菌中轉型以便選擇。藉由 DNA定序來檢驗最終構築體之序列。 mAb變異體之重組表現 依據通用抗體表現方案，使鼠類抗TFPI4F36A1B2、嵌 合抗TFPI4F36及人類化TFPI4F36抗體變異體短暫表現於 HEK293-6E細胞中。以下程序描述用於懸浮適應型 HEK293-6E細胞的通用轉染方案。 細胞維持 HEK293-6E 細胞於 FreeStyle™ 293 表現培養基（Gibco ) 中懸浮生長，該培養基補充有25 pg/ml遺傳黴素（Geneticin ) 102 201026330 (Gibco )、0_1% v/v 界面活性劑 piuronic f-68 ( Gibco)及 l%v/v 青徽素-键徽素（Penicillin· Streptomycin ) ( Gibco)。 細胞在37°C、8% C〇2及125 rpm下於震盪培育箱中、於 Erlenmeyer震盪燒瓶中培養且細胞密度保持在〇υ 5χ1〇6 個細胞/毫升之間。 DNA轉染 •用於轉染之培養物的細胞密度為Q、9-2.QX1Q6個細胞/ 毫升。 〇 •每毫升細胞培養物使用〇·5 pg LC載體DNA+0.5 pg HC載體DNA之混合物。 • DNA 於 Opti-MEM 培養基（Gibco)中（30 μΐ 培養 • 基DNA)稀釋，混合且在室溫（23-25。(：）下培育5分 鐘。 * 293Fectinn( Invitrogen )用作轉染試劑，濃度為 1 μΐ/^g DNA 〇 .29 3 Feet in™ 於 Opti-MEM 培養基（Gibco)中稀釋 30 ❹ 倍，混合且在室溫（23-25°C )下培育5分鐘。 •混合DNA與293Fectin溶液且在室溫（23-25。(：）下 培育2 5分鐘。 •接著將DNA-293Fectin混合物直接添加至細胞培養 物中。 •將經轉染之細胞培養物轉移至37°C、8% C02及125 rpm之震盪培育箱中。 •轉染後3-6天，藉由離心收集細胞培養物上清液，接 著經由0.22 μηι PES滤膜（Corning )過濾、。 103 201026330 •使用Fort6Bio Octet系統及蛋白質A生物感測器或定 量蛋白質 A HPLC，藉由生物層干涉術 （Biolayer Interferometry )直接對澄清之細胞培養物上清液之抗體產 生進行定量分析。 人類化抗TFPI4F36之CDR移植變異體之活性分析 最小CDR移植之人類化導致親和力顯著降低，其係由 對結合速率與解離速率之影響引起。初次移植型之人類化 TFPI4F36抗體（HzTFPI4F36-CDR移植抗體，在表1中列 為人類化TFPI4F36 )之TFPI結合親和力為初始小鼠 TFPI4F36抗體約30 pM之親和力的至多1/100(參看表1 )。 嵌合抗體親和力之保持證明人類/c /IgG4 ( S241P) FC對抗 體親和力無影響。使用如下所述之SRP進行親和力分析。 表1 mAb Ka ( 1/Ms) Kd ( 1/M) KD (M) 鼠類 TFPI4F36 4,70E+06 l,33E-04 2,82E-11 嵌合 TFPI4F36 8,88E+06 l,44E-04 1,62E-11 人類化TFPI4F36 1,07Ε+06 2,21E-03 2,06E-09 hzTFPI4F36-TFPI相互作用之表面電漿共振(Biacore) 分析 藉由Biacore之SPR分析，使用兩種不同方法測定重組 人類TFPI與初始鼠類抗TFPI4F3 6A1B2、嵌合抗TFPI4F3 6 及人類化TFPI4F36抗體之各種變異體的相互作用之動力學 參數。初始動力學分級研究係基於如實施例1中所述之純 104 201026330 化mAb的捕捉程序。之後為針對所選mAb構築體之直接結 合動力學程序，其中單株抗體經由自由胺基團與感測晶片 表面上之羧甲基化葡聚糖膜（CM5 )共價偶合。注射各種濃 度之重組人類TFPI，接著為解離階段，其中使緩衝液恆定 流過感測晶片表面，如實施例8中所述。 在人類化mAb中引入回復突變之定點突變誘發 依據CDR移植型之人類化抗TFPI4F36的低親和力， 在HzTFPI4F36-CDR移植抗體之輕鏈（LC)及重鏈（HC) Q 中產生一系列27個人類至小鼠回復突變（稱作回復突變）。 此等突變體呈單獨突變體之形式或呈LC/HC組合突變體之 形式加以表現、純化且藉由Biacore分析。所產生突變之清 . 單分別展示於表2及表3中。 _ 如人類化設計中所強調，進行定點突變誘發可在
HzTFPI4F36-CDR移植LC/HC構築體中之特定殘基處引入 人類至小鼠回復突變（下文稱作回復突變）。藉由兩種不同 方法引入突變： 〇 1 )使用Stratagene之QuickChange®定點或多定點突變 誘發套組引入點突變及組合突變。根據製造商方案使用套 組。 2 )亦使用標準2步重疊PCR法引入點突變及產生組合 突變。 使用HzTFPI4F36-CDR移植抗體之LC及HC表現質體 作為第一輪突變誘發之模板。在隨後數輪突變誘發中，亦 使用預先突變之質體作為模板來引入突變。藉由DNA定序 來檢驗所有最終構築體之序列。 105 201026330 表2 : HzTFPI4F3 6-CDR移植抗體輕鏈之突變變異體 LC突變艟 突變 KD (M) HzTFPI4F36 LC-S63T S63T 7.8E-9 HzTFPI4F36 LC-P15I P15I 17.0E-9 HzTFPI4F36 LC-FR2 Y36L、K39R、Q42E、Q45K 6.3E-10 HzTFPI4F36 LC-P15I、FR2 P151、Y36L、K39R、Q42E、Q45K 6.4E-10 HzTFPI4F36 LC-Y36L Y36L >3E-11 HzTFPI4F36 LC-K39R、Q42E、Q45K K39R ' Q42E > Q45K >3E-11 表3 : HzTFPI4F3 6-CDR移植抗體重鏈之突變變異體 HC突變 突變 Kn (M) HzTFPI4F36 HC-Q3E Q3E 5.8E-9 HzTFPI4F36 HC-G44R G44R 2.3E-9 HzTFPI4F36 HC-S49A S49A 3.0E-9 HzTFPI4F36 HC-Y59F Y59F 5.5E-9 HzTFPI4F36 HC-A60P A60P 2.2E-9 HzTFPI4F36 HC-K64Q K64Q 2.5E-9 HzTFPI4F36 HC-S77T S77T 1.5E-9 HzTFPI4F36 HC-A93T A93T 2.7E-9 HzTFPI4F36 HC-Y59F ' A60P Y59F,A6〇P 2.3E-9 HzTFPI4F36 HC-KABAT CDR2 Y59F > A60P ' K64Q 9.0E-10 HzTFPI4F36 HC-FR2 ' S49A A40T、G42E、G44R、S49A 1.3E-9 HzTFPI4F36 HC-FR3 N82aS、A84S、V89M 5.3E-9 HzTFPI4F36 HC-FR3 > S77T S77T、N82aS、A84S、V89M 7.7E-9 HzTFPI4F36 HC-FR3 ' A93T N82aS、A84S、V89M、A93T 4.1E-9 HzTFPI4F36 HC-FR2 A40T、G42E、G44R 8.8E-10 HzTFPI4F36 HC-FR2、S49A、CDR2 A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、 A60P ' K64Q 2.6E-11 HzTFPI4F36 HC-G42E' G44R' CDR2 G42E、G44R、Y59F、A60P、K64Q 3.9E-11 HzTFPI4F36 HC-FR2 ' CDR2 A40T、G42E、G44R、Y59F、A60P、K64Q >3E-11 HzTFPI4F36 HC-G42E ' G44R ' S49A CDR2 G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q >3E-11 HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、 A60P ' K64Q G42E、G44R、A60P、K64Q 9.3E-11 HzTFPI4F36 HC-G44R、A60P、K64Q G44R、A60P、K64Q 3.0E-11
根據如圖1中所示之Kabat編號系統對如表2及表3 中所列之LC與HC中之突變一貫地加以編號。 106 201026330 表2中所列之LC突變體僅以野生型HC HzTFPI4F36 CDR移植抗體之LC突變體加以表現。表3中所列之HC突 變體僅以野生型LC HzTFPI4F36 CDR移植抗體之HC突變 體加以表現。LC-HC組合突變體亦藉由組合不同LC與HC 突變體加以表現。突變體一貫地按照突變鏈命名，亦即， 最終人類化mAb變異體係以野生型HzTFPI4F36-CDR移植 LC 及突變之 HzTFPI4F36 FR2、S49A、CDR2 HC 加以表現。 短暫HEK293-6E表現如上所述進行。 φ 初始一組 9點突變體（HzTFPI4F36 LC-S63T及
HzTFPI4F36 HC-Q3E ； G44R ； S49A ； Y59F ； A60P ； K64Q ； S77T ; A93T)係基於人類化設計中所強調之一組主要回復 . 突變。點突變體皆不能補救抗體之親和力，然而在第二人 類重鏈框架區（FR2，介於CDR H1與CDR H2之間）中及 CDR H2之C端區域（在最小CDR移植系統中省略）中之 突變因對於TFPI結合具有重要作用而被強調。如上所述藉 由Biacore分析進行親和力量測。 Q 隨後數輪之突變誘發包括許多補丁突變體（patch mutant )，其中個別區域中之所有殘基全體突變。突變體 HzTFPI4F36 HC-Kabat CDR2 在 CDR H2 之 C 端區域具有 3 個突變Y59F、A60P、K64Q，該突變體根據Kabat定義而不 根據用於初始HzTFPI4F3 6-CDR移植變異體之最小CDR移 植系統係對應於移植CDR H2。此補丁化突變體（patched mutant)以及LC FR2及HC FR2中之補丁突變體顯著改良 人類化TFPI4F36抗體之親和力，但三種補丁突變體中無一 者能個別地恢復高TFPI4F36親和力。 107 201026330 HC FR2 及 CDR2 ( A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、 A60P、K64Q )中具有組合突變之HC突變體可完全恢復親 和力。此突變體將7個額外鼠類殘基引入抗體序列中。LC FR2突變體（FR2突變與Y36L )與HC FR2及/或CDR2突 變體之組合亦產生高親和力突變體。然而，此等LC/HC突 變體之組合一致地引起表現量低於單獨之HC突變體。此等 結果表明LC突變體之包涵對此等抗體變異體之穩定性具有 負面影響，因此說明在人類化TFPI4F36 LC與HC之間存在 脆弱之相互作用模式。 在最後一系列之突變體中，剖析HC FR2及CDR2 (A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)中之 7個突變以消除潛在不起作用的回復突變。產生一系列5個 突變體以尋定此點。 在3個突變體中，排除FR2中之以下回復突變： HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、CDR2 HzTFPI4F36 HC-FR2、CDR2 HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、S49A CDR2。 在2個突變體中，亦排除CDR2中之以下額外突變： HzTFPI4F36 HC-G44R ' A60P ' K64Q HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、A60P、K64Q。 然而，此等突變體皆無法與組合HC FR2 CDR2突變體 同等。HC FR2 CDR2突變體亞群之任何減小均影響親和力 或表現量（或兩者）。挑選兩種突變體HzTFPI4F36 HC G42E、G44R、Y59F、A60P、K64Q (具有 5 個殘餘回復突 變）及 HzTFPI4F36 HC G42E、G44R、A60P、K64Q (具有 201026330 4個殘餘回復突變）以便與HzTFPI4F36 HC-FR2、S49A、 CDR2全面比較。 〇 HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、A60P、K64Q 與
HzTFPI4F36 HC-FR2、S49A、CDR2以類似量加以表現，而 HzTFPI4F36 HC-G42E、G44R、CDR2 具有稍低之表現量。 快速生物物理穩定性研究展示三種變異體之穩定性無任何 差異。 〇藉由Biacore量測之親和力列於下文中。 @ 〇dPT檢定（如下所述）中所量測之所有三種變異體的 活體内功效均相當。 表4 : TFPI與人類化TFPI4F36變異體之間相互作用的動力 學參數。 突變艘 KD (pM) 表現量 (mg/L) 回復突變數 HzTFPI4F36 A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、 A60P、K64Q 26 54 7 HzTFPI4F36 G42E、G44R、Y59F、A60P、K64Q 39 24 5 HzTFPI4F36 G42E、G44R、A60P、K64Q 93 53 4 依據上述資料，所測試之初始HC FR2及具有7個HC 回復突變（A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q) 之CDR2突變體優於其他變異體；此變異體在本文中稱作 HzTFPI4F36 或 mAbTFPI2021。 CDR2突變Y59F、A60P、K64Q很可能藉由與抗原直接 相互作用來影響抗體親和力。突變A40T、G42E、G44R存 109 201026330 在於連接CDRH1與CDR H2之FR2轉角中（遠離抗原結合 面）且可保持平衡以穩定LC-HC相互作用。突變S49A包 埋於側鏈之高度疏水簇中間，其可解釋為何在此位置丙胺 酸優於絲胺酸。因此有趣的是，以突變組合之形式獲得 HzTFPI4F36之高親和力，該等突變改良遠離抗原結合區域 之直接抗原相互作用及突變，從而使抗體穩定。 總之，HzTFPI4F3 6具有約25 pM之親和力（KD)且含 有35個源自小鼠抗體序列之對應於抗體中殘基總數之5.2% 的胺基酸殘基。 所選人類化構築體HzTFPI4F36 ( mAbTFPI 2021 )之輕 鏈可變區（VL)、重鏈可變區（VH)、輕鏈及重鏈之胺基酸 序列分別展示於SEQ ID NO: 15、18、21及24中。 試管内功效檢定 抗TFPI4F36抗體能夠中和TFPI介導之對凝血因子Xa (FXa)及組織因子（TF)與因子Vila ( FVIIa)之複合物 的抑制。在稀釋凝血酶原時間（dPT )測試中量測鼠類及人 類化TFPI4F36抗體變異體之活性。使用dPT檢定量測抗 TFPI抗體之促凝血活性。提高抗TFPI抗體之血漿濃度可縮 短dPT凝血時間。 實施例4 ： MuTFPI4F36 ( Fab)之Fab片段及人類組 織因子路徑抑制子（TFPI )之第二Kunitz域（K2 )的純化、 結晶及結構 使包括第二kunitz域（K2 )及C端His6標記（SEQ ID NO: 2 )之 TFPI 片段與 MuTFPI4F36 Fab 片段（Fab)共結晶。 藉由X射線結晶學解析複合物之結構。發現K2結合性抗原 201026330 決定基由以下殘基構成：E10、E11、P13、R17、Y19、T21、 Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36 及 L50。發現 Fab 中之互補位由以下者構成：MuTFPI4F36輕鏈（SEQIDNO: 4 )之殘基 E31、S32、D33、Y37、A96、T97、H98 及 F99， 及 MuTFP14F36 重鏈（SEQ ID NO: 8)之殘基 N31、R53、 S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103 及 D1 0 6 〇 材料及方法 ❹ 分析性尺寸排阻層析法。 以 PBS 緩衝液（10 mM 磷酸鹽、150 mM NaCl、3 mM KC1，pH7,5)(流動速率為 0.8 ml/min)溶離、使用 Biosep S-3000 ( 3 00x7,8 0 mm )管柱（Phenomenex )進行分析性尺 寸排阻層析法（SEC)。 製備及純化Fab/K2複合物。 藉由以1:1.5莫耳比（5.4 mg Fab與1.4 mg K2)混合 Fab(0.27 mg/ml，含於 PBS 緩衝液中，pH7.4)與 K2 ( 0·29 ❹ mg/ml ’含於PBS中，pH 7.4 )來製備Fab/K2複合物。用 離心過濾裝置（Amicon ’ 10 kD截止分子量）將複合物濃縮 至約6.7 mg/mL之濃度。為移除過量K2 ’將濃縮樣本施加 於Superdex 75 (CV300 )凝膠過濾管柱上（以pBS緩衝液 (ρΗ7·4)溶離，流動速率為1 ml/min)。彙集含有Fab/K2 複合物之溶離份且濃縮至9.2 mg/ml之蛋白質濃度。將此溶 液用於結晶。
Fab/K2複合物之結晶。
使用含有0.2M檸檬酸二_ (pH8.0)及2〇%w/vpEG 111 201026330 3,350之沈澱劑溶液、囍 错由懸滴法使Fab/K2複合物結晶（呈 棒狀）。 晶體結構測定。 分別使用PDB妹椹 ，，。構1F8T及1TFX作為Fab及Κ2分子 之模板、藉由分子置拖、 丁置換法解析Fab/K2複合物之結構。 結果 藉由向F ab溶液φ、天θ 甲添加過量Κ2來製備Fab與Κ2之間 的複合物。圖6展示茲士八^ ,, 藉由刀析性尺寸排阻層析法（SEC )所 監測之複合物形成。此古
方去係根據分子量來分離分子，較 大物質早於較小物皙湓M _ 貞/合離。對應於K2及Fab之峰因分子量 差異大（分子量分別兔的01ΤΛ 引馬約8 kDa及48 kDa)而良好分離。 向Fab溶液中添加估π u , 2使侍峰位預期地稍微移向較短滞留時 間。複合物容易藉由使用制供开,】c c r八 尺用I備型SEC分離過量K2加以分離 且以純形式獲得。
使用右干商業結晶篩來篩選Fab/K2複合物之結晶 件。懸滴法得到適於單晶χ射線分析之棒狀晶體，且使 寄存於PDB中之結構作為模板、藉由分子置換法解析 構。圖7展示Fab/K2複合物之總體結構。所顯示之輕鍵 重鏈構成Fab分子，日& 人， 刀卞且展現抗體分子之預期免疫球蛋白 夾層摺疊特徵。亦展示接觸抗原且限定抗體之特異性及 和力的CDR環。 抗原K2展現限定Kuni_疊之特徵單一反平行万摺疊 (^ 1 ( I20-N26) ^β1{ Q31-Y37)) L50-I56)(@ 8)βΝ端附近亦存在可選&。·螺旋q〇, D5_F8)’繼之為環1⑴’㈣⑴，從而產生卜其係 112 201026330 經由短環（L冷，N27-K30 )與石2連接。在c端片段中， 環2 ( L2 ’ G38-T49)使連接。最終，三個特徵雙 硫鍵（C7-C57、C16-C40 及 C33_C53)分別使 α !與 α 〇 連 接、使L2與L1連接且使αι與泠2連接。 Κ2之兩種結構已寄存於全球蛋白質資料庫（
Protein DataBank，PDB )。一種結構 1ADZ 已藉由 nmr 光 譜學測定且代表自由解析結構（free s〇luti〇n价狀匕“），而 另一種結構1TFX已藉由X射線結晶學測定且代表K2與豬 〇 胰蛋白酶之複合物。圖9展示1ADZ、1TFX及Κ2分子與
Fab複合物所代表之Κ2的結構重疊。所有三種結構的骨架 跡線顯得非常類似’表明具有其三個穩定雙硫鍵之Kunitz - 摺疊具有相當剛性。 • MuTFPI4F36 K2結合性抗原決定基之描述 抗原K2上之結合性抗原決定基（定義為K2中之殘基， 其含有至少一個侧鏈重原子位於距Fab中重原子4 A或4 a 以下之距離内）包含殘基E10、E11、P13、R17、Y19、T21、 ❿ Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36 及 L50 (圖 10)。 K2中之接觸殘基係位於LI (E10、Ell、P13、R17、Y19)、 /5 摺疊結構（T21、Y23、Q31、E33、R34、F35、K36 )及 連接環L冷（Q28 )及最後〇；1中之單一環（L50 )中。圖 1 〇描繪Κ2之3D結構與一級胺基酸序列上所定位之結合性 抗原決定基。
MuTFPI4F36互補位之描述 依據MuTFPI4F36 Fab與TFPI K2域之間複合物之相同 X射線結構來測定MuTFPI4F36 Fab片段中之互補位。互補 113 201026330 位係定義為MuTFPI4F36 Fab中具有重原子距K2域中重原 子小於4 Α之距離内的彼等殘基。輕鏈中之接觸殘基係位 於 SEQ ID NO: 4 之殘基 E3 卜 S32、D33、Y37、A96、T97、 H98及F99。重鏈中之接觸殘基係位於SEQ ID NO: 8之殘 基 N3 卜 R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P6 卜 D62、Q65、 Y102、D103及D106。互補位之位置說明於圖3中。 實施例5 : K2/HzTFPI4F36 Fab複合物之結構 使用類似於針對測定與K2結合之MuTFPI4F36 Fab之 三維結構所述的方法，測定來自人類化抗體HzTFPI4F36之 Fab片段與K2之間複合物之結構。不出所料，發現 HzTFPI4F3 6之Fab與其所來源之鼠類Fab結合K2上之相 同區域。兩種複合物之結構之間的總體相似性在圖11中顯 而易見，其中 K2/TFPI4F36 Fab 與 K2/HzTFPI4F36 Fab 複合 物的骨架帶跡線重疊。對於HzTFPI4F36，發現K2上之抗 原決定基（使用4A截止距離定義）包含殘基E10、E11、 D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、 C32、E33、R34、K3 6 及 L50。與鼠類來源之 K2/MuTFPI4F36 Fab之結構相比，D12、F24、N26及C32位於人類化 K2/HzTFPI4F36複合物4 A截止距離内，而F35位於4 A 截止距離外。此反映 K2/MuTFPI4F36 Fab 與 K2/HzTFPI4F36 Fab複合物之結合介面内侧鏈位向之微小差異，儘管 MuTFPI4F36 與 HzTFPI4F36 中之 CDR 區相同。 實施例6至8 比較HzTFPI4F36 ( mAbTFPI 202 1 )之功能與所有（四 種）市售單株抗體之功能，其中一些據稱可結合TFPI之K2 201026330 域；其中一些尚未有關於結合之描述。 實施例6 : TFPI中和檢定：FXa抑制 檢定中所用之材料為BSA緩衝液（50 mM Hepes; 0_1 Μ NaCl、5 mM CaCl2、0.1 mg/ml BSA，pH 7.4 )及表 5 中所 不之試劑。 表5 :所用材料
試劑 公司/參考文獻 儲備液濃度 最终濃度（於BSA 緩衝液中稀釋） 人類FXa 酶研究實驗室（Enzyme Research Laboratory ) 21.7 μΜ 5nM 人類TFPI 參考文獻：Pedersen等人， 1990, J. Biol. Chem. 265, 第 16786-16793頁 於10 mM甘胺醢基甘胺酸、 100 mMNaa、165 mM甘露 糖醇緩衝液（pH 7·0)中冷 凍乾燥。於水中復原。 6nM mAbTFPI4F36 mAb0281 mAb4904 mAb2974 mAb29741 本發明 Ab systems AD R&D systems R&D systems 5-150 nM S2765 Chromogenix 20 mM 1 mM © 方法： 重組全長人類TFPI (最終濃度6 nM )與遞增濃度之相 關mAb (最終濃度：5-150 nM)於BSA緩衝液中混合30 分鐘。添加FXa且與混合物一起再培育30分鐘。添加發色 受質S2765且在Spectramax中量測405 nm下之吸光度15 分鐘。1 00%活性表示未添加TFPI時之FXa活性。 表6 :中和TFPI對FXa之抑制 公司 mAb ID IC5〇 nM 在150 uM下對TFPI之中和％ 本發明 HzTFPI4F36 12.6 100% 115 201026330 (mAbTFPI2021) Π —— AbNova mAb0281 未偵測rfi < 10% American Diagnotica mAb4904 未摘測出 < 10% R&D systems mAb2974 294 90% R&D systems mAb29741 未偵測屮 < 10% 結論 · 在 150 nM 下，HzTFPI4F36 ( mAbTFPI 2021 )完全中 和TFPI對FXa之抑制。對於mAb0281、mAb4904及 mab2974 1幾乎未偵測到活性。 實施例7 : TFPI中和檢定：FVIIa/TF/FXa抑制 所用材料為BSA緩衝液（50 mM Hepes ; 0.1 M NaCn、 5 mM CaCl2、0.1 mg/ml BSA，pH 7·4 )、50 mM EDTA 及表 7中所列之試劑。 表7
試劑 公司/參考文獻 儲備液濃度 最终濃度（於BSA 後衝液中稀鞸） MAB2974 mAbTFPI4F36 R&D systems 本發明 3330 nM 75300 nM 各種濃度（5-150 nM) NovoSeven Novo Nordisk 27 μΜ ΙρΜ 微脂粒 ΗΉ磷脂微脂粒，目錄號 PCPS-02 #W1115-75% PC-25 % PS 2.0 mM 10 μΜ S-2765 Chromogenix 35 mM 0.5 mM FX American Diagnostica 公司 牛因子X，產品編號510，批號 050920，溶於50%甘油/水中 165 μΜ 160 nM TFPI 參考文獻：Pedersen等人，1990, J. Biol. Chem. 265，第 16786-16793頁 18.6 μΜ InM TF (Innovin) Dade Behring#2010-01-ll#536975 小瓶裝，溶於10 ml Η,Ο中 2.8 nM (6nM) lpM 方法： 添加表中指定之最終濃度之所有組份。在微量滴定孔 116 201026330 中添加25 μΐ FX、25 μΐ TFPI mAb (不同濃度）、25 μΐ人類 TFPI、25 μΐ FVIIa-TF ( innovin)。在室溫下培育 40 分鐘。 依次添加 50 μΐ EDTA 及 50 μΐ S-2765。混合且在 Spectramax 中、在405 nm下讀盤15分鐘。100%活性為TFPI不存在時 所得之FVIIa/TF/FX活性。 表8 :中和TFPI對FVIIa/TF/FX之抑制 公司 mAb ID IC5〇 在150 nM下對TFPI之中和％ 本發明 HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021 ) 3.8 nM 100% AbNova mAb0281 未偵測出 未偵測出 American Diagnotica mAb4904 未偵測出 未偵測出 R&D systems mAb2974 45.6 nM 53% R&D systems mAb29741 未偵測出 未偵測出 結論· 在150 nM之mAb濃度下，TFPI被mAbTFPI2021完全 中和。mAb2974亦達到飽和，但並不能完全中和TFPI( 53% 實施例8:結合相互作用分析 所用材料係如表9中所列。 117 201026330 表9 試劑 公司 TFPI 於lOmM甘胺醯基甘胺酸、i〇〇mMNaCl ; 165mM甘露糖醇 緩衝液（pH7.0)中冷凍乾燥。於水中德原。 mAbTFPI2021 本發明 mAb0281 R&D systems mAb4904 AD mAb2974 R&D systems mAb29741 R&D systems 所有其他試劑 Biacore 方法·· 在Biacore T-1 00儀器中藉由表面電漿共振分析結合相 互作用。固定濃度之相關單株抗體係在1 0 mM乙酸鈉（pH' 4.5-5.0)中藉由直接固著於mAb之CM5晶片來捕捉直至 5 00-1000 RU之含量。測試四倍稀釋之200 nM至0_2 nM重 組人類全長TFPI或人類短型TFPI ( 1-161個胺基酸殘基） 與所固著之mAb之結合。操作及稀釋緩衝液：1〇 mM HEPES、150 mM、0.005% p20 ( pH 7·4)。藉由 10 mM 甘 胺酸（pH 1.7 )達成再生。假設TFPI與相關抗體1:1相互 作用，使用Biacore T100評估軟體測定動力學及結合常數 (kon、koff、K〇)。結果展示於表10中。不同mAb競爭結 合 TFPI (當與 mAbTFPI2021 (「mAb2021」、HzTFPI4F36) 結合時）係如下達成··將mAbTFPI2021固著於CM5晶片直 至5000 RU，接著結合50 nM TFPI，接著改變待針對競爭 所測試之mAb ( 2974、0281、4904、29741 )的濃度。結果 展示於表11中。藉由10 mM甘胺酸（pH 1·7)達成晶片再 生。 118 201026330 表10:表面電漿共振（SPR)分析。結合全長人類TFPI。 動力學及結合常數。 製造者 mAb ID Ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) KD nM 本發明 mAb2021 2.39E+06 3.58E-05 1.50E-11 0.015 AbNova mAb0281 3.99E+05 0.001436 3.60E-09 3.60 American Diagnotica mAb4904 1.42E+05 00.1294 9.14E-09 9.14 R&D systems mAb2974 1.39E+06 0.001202 8.64E-10 0.864 R&D systems mAb29741 9.51E+05 0.003165 3.33E-09 3.33 〇 表11 : SPR分析。結合全長人類TFPI及TFPI161 (K1及K2域） 的結合常數。與mABTFPI 2021競爭。 製造者 mAb ID kd(m)tfpi kd(m) tfpi161 舆mAB 4F36競爭 本發明 mAbTFPI2021 1.50E-11 4.55E-11 是 AbNova mAb0281 3.60E-09 7.28E-09 否 American Diagnotica mAb4904 9.14E-09 不結合 否 R&D systems mAb2974 8.64E-10 3.12E-09 是 R&D systems mAb29741 3.33E-09 不結合 否 結論 mAbTFPI2021結合TFPI的親和力（KD 15 pM)高於任 何其他所測試之mAb。僅mAb2974競爭結合與mAb TFPI4F36相同之位點。 實施例9:中和人類臍血管内皮細胞（HUVEC)上之
TFPI TFPI以經由糖基鱗脂醯肌醇（GPI)錄附著於細胞表面 之形式受到内皮細胞構成性表現。當TF與TFPI表現於相 119 201026330 同細胞上時，GPI錨定之TFPI特異性抑制TF介導之活性。 為顯示HzTFPI4F36( mAbTFPI2021 )中和與細胞結合之TFPI 所引起的抑制比mAb 2974更加有效，應用人類臍血管内皮 細胞HUVEC ;且為誘導TF表現，在測試FVIIa/TF催化之 FX 活化之前，以 TNF a ( Sigma RBI )及 IL1 /3 ( Roche ) 刺激此等細胞。 測試之前，HUVEC細胞於EBM-2培養基（Clonetics ) 中、於96孔培養盤中培養直至匯合且以20 ng/ml TNF α及 20 ng/ml IL1 泠刺激 2 小時。在 25 mM HEPES、137 mM NaCl、3.5 mM KC1、5 mM CaCl、1 mg/ml BSA ( 0.1%) ( pH 7.4)中進行測試，且在抗體（0-20 nM)存在下及隨添加 5 0 pM FVIIa及50 nM FX來追蹤FX活化。使用0.6 mM發 色受質、S-2765( Chromogenix)量測FXa之產生且針對FXa 標準曲線校正。 圖 12 展示 0-20 nM HzTFPI4F36 或 mAb 2974 消除細胞 結合TFPI之抑制時之結果。HzTFPI4F36在一半最大效應 濃度（EC5。〜nM)下可刺激TF/FVIIa介導FX活化，而對 2974 mAb在20 nM下幾乎未觀察到刺激FXa產生。 因此，此實施例說明HzTFPI4F36 (與mAb 2974相反） 有效中和細胞結合TFPI對TF/FVIIa介導FX活化之抑制。 實施例10 :中和TFPI對MDA-MB 231人類乳癌細胞 上之TF/FVIIa活性的抑制。 MDA-MB 23 1細胞構成性表現表面上高含量之TF及少 量之TFPI。細胞表面TF/FVIIa介導之FX活化可被外源添 加之TFPI抑制。為顯示HzTFPI4F36中和此類型TFPI抑制 120 201026330 比mAb 2974更加有效，應用MDA-MB 231細胞且測試各種 濃度之抗體消除TFPI對FVIIa/TF催化FX活化之抑制的能 力。 MDA-MB 231細胞於補充有10% FCS及1% P/S之 DMEM Gibco (目錄號31966-021 )中、於96孔培養盤中培 養直至匯合。在 25 mM HEPES、137 mM NaC 卜 3.5 mM KCM、 5 mM CaCM、1 mg/ml BSA ( 0.1%) ( pH 7.4)中進行測試， 且在抗體（0-20 nM)存在下及隨添加2.5 nM全長人類重組 0 TFPI、100 pM FVIIa 及 50 nM FX 來追蹤 FX 活化。使用 0.6 mM發色受質、S-2765 (Chromogenix)量測FXa之產生。 連續量測405 nm下之吸光度且在反應開始後1 5分鐘時， • 藉由量測進展曲線之斜率來測定FXa活性。 圖 13 展示 0-20 nM HzTFPI4F36 或 mAb 2974 消除 TFPI 抑制時的結果。HzTFPI4F36在一半最大效應濃度（EC50約 2 nM )下可刺激TF/FVIIa介導FX活化，而2974 mAb係在 實質更高之濃度（EC50 > 20 πΜ)下達成刺激FXa產生。 Q 實施例 11 :使用 ELISA對抗TFPI單株抗體
HzTFPI4F36及mAb2974之結合性抗原決定基進行定位。 已藉由解析TFPI-K2/HzTFPI4F36複合物之晶體結構來 對TFPI Kunitz域2 ( K2 )上針對HzTFPI4F36之結合性抗 原決定基進行定位。藉由ELISA分析TFPI内位於針對 HzTFPI4F36之結合性抗原決定基内部（E10、R1 7及Y19 ) 及外部（D5)之單個胺基酸殘基突變對HzTFPI4F36及 mAb2974 ( R&D systems )之結合親和力的影響。使TFPI 變異體表現於HEK293-F細胞中且使用來自細胞培養物之 121 201026330 條件培養基進行ELISA。 藉由ELISA估計TFPI-WT及TFPI突變體之濃度，其 結合 TFPI K1 (MAb4903，American Diagnostica)及 K3. (M Ab4F 11 0，内部製備（in-house ))且因此未受突變影響。 在ELISA中使用MAb4903及HzTFPI4F36分析突變對結合 HzTFPI4F36 之影響。使用 ELISA，在 MAb2974 及 MAb4F110 存在下測定對MAb2974結合之影響。 相對於TFPI-WT ( 100%結合）計算TFPI-Kunitz 2中突 變分別對結合HzTFPI4F36及MAb2974之影響且說明於圖 14中。表現量差異數已修正。 結論· 針對HzTFPI4F36之結合性抗原決定基内之三個胺基酸 殘基中之丙胺酸突變使得與HzTFPI4F36之結合降低，而位 於抗原決定基（TFPI-D5A)外之殘基的丙胺酸取代無影響。 四種丙胺酸突變體中僅一者TFPI-Y1 9A與MAb2974之結合 降低。 總之’ HzTFPHF36與MAb2974具有不同但重疊之位於 TFPI-Kunitz 2上之結合性抗原決定基。 實施例12 :活髏内研究 藉由靜脈内投予2000 RBU/kg單株抗FVIII抗體使得兔 產生暫時性血友病。10分鐘之後’使兔接受12000 U/kg抗 TFPI抗體（4F3 6 ; 1.93 mg/kg)。在抗FVIII抗體投予之後 45分鐘誘發表皮出血。 4F36抗體使得表皮出血時間顯著減少（圖丨5 )。投予 4F36抗體未引起血小板數目顯著降低（圖18)。 201026330
V 重複類似實驗，其中三組八隻暫時性血·友病兔在誘發 表皮出血後5分鐘接受同型對照抗體（陰性對照組）、2 mg/kg 抗 TFPI ( mAb 4F36 )或 9 mg/kg NovoSeven (陽性對 照組）。結果說明於圖16中：在所有接受者中，投予mAB 4F36均引起失血大量減少（約85%)，說明可「應需」使用 mAb4F36。 實施例13 :評估兔劑量效應關係 在兔血友病模型中檢驗人類化mAb HzTFPI4F36之劑 Q 量效應關係。藉由靜脈内投予單株抗FVIII抗體使得兔產生 暫時性血友病。10分鐘之後，使兔接受0.5、1、2 mg/kg HzTFPI4F36或同型對照抗體。再過35分鐘後誘發表皮出 . 血，接著為60分鐘觀測期。當劑量自0.5 mg/kg增至2 mg/kg 時，HzTFPI4F36以劑量依賴方式顯著減少出血時間以及失 血（圖 17)。因此，1 mg/kg HzTFPI4F36(對應於 18780 ng/ml HzTFPI4F36之血漿濃度）可達成出血時間與失血均顯著減 少。在 2 mg/kg (對應於 30980 ng/ml HzTFPI4F36 之血漿濃 〇 度）下達成出血之校正。 此等資料表明HZTFPI4F36之「有效濃度」（例如在本 發明模型中為校正所需之血漿濃度）係在18780 ng/ml與 30980 ng/ml之範圍内。 實施例14 :兔PK/PD-「作用持續時間」 對給予20 mg/kg HzTFPI4F36之兔進行藥物動力學研 究。在研究期間之預定時點，自兔抽取血液樣本以便藉由 量測自由HzTFPI4F36之ELISA進行藥物動力學特徵化 (profiling X下文圖3中所示）。在投予之後4天（96小時）、 123 201026330 7天（168小時）及10天（24〇小時）使用暫時性血友病兔 之表皮出血模型進行效應研究，效應時點於圖19中指示。 藥物動力學特徵為雙階段特徵，其指示標靶介導之清 除。因此，在曲線弯曲上方，存在過量自由mAb (mABfree>TFPItotal)，在彎曲下方：mAbfr“<TFpit〇w。與 樂物動力學特徵良好地一致’在靜脈内投+ 2〇 HZTFPI4F36之後4及7天時，出血時間與失血均顯著減少， 而在10天之後未觀察到顯著影響（圖2〇)。
此等資料證明HZTFPI4F36在血友病兔表皮出血模型中 之有效血漿濃度係在18780 ng/ml與3〇98〇 之間其 接近TFPI飽和極限（曲線彎曲）。因此，2〇 mg/kg HZTFPI4F36之單次靜脈内劑量在至少7天期間使表皮出血 減少，其對應於血漿濃度高於「有效濃度」之時段。 實施例15:基於猴PK資料之藥物動力學模型 基於對猴之藥物動力學研究進行藥物動力學評估，其 中投予單次與多次劑量（圖21 )。劑量範圍為2至2〇〇 mg/kg。
猴之PK特徵（20 mg/kg，上圖）類似於兔，表明可溶 性TFPI與内皮結合TFPI存在類似分布。因此，此等資料 表明可採用兔效應資料預測狼效應範圍。此外，hzTFPI4F36 對人類、猴及兔TFPI之親和力類似（相同抗原決定基）且 二個物種中之類似TFPI組織分布允許對猴及人類進行劑量 預測。 實施例16 :模擬 依據上述模型可進行一系列模擬。模擬之主要目的在 於描述多劑量配置中之最佳給藥攝生法。標靶（TFpi )濃 124 201026330 度未知，但上文兔效應資料允許假設若標靶接近飽和（在 3 0000 ng/ml之含量下），則達成出血模型中之完整效應。因 此，模擬之主要目的在於評估在一定期間何種劑量將產生 完全飽和。圖22顯示皮下投予1 mg/kg之模擬。圖23展示 每三週靜脈内投予 15 mg/kg HzTFPI4F3 6 ( mAbTFPI 2021 ) 之模擬。圖24展示每兩週靜脈内投予20 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021 )之模擬。 總而言之，依據上述模擬可預測針對人類之以下劑量 攝生法： 表12 :劑量攝生法 給藥類型 劑量 劑董攝生法 皮下投予 1 mg/kg 每兩天 靜脈内投予 10-20 mg/kg 每2~4週 【圖式簡單說明】 圖1展示小鼠抗TFPI4F36A1B2 (在本文中亦稱作 MuTFPI4F36 或 4F36 )之 VH ( A )及 VL ( B )域之序列與 人類生殖系及初始CDR務植型人類化TFPI4F36之序列的 排比。Kabat編號系統於序列上方指示。 圖 2 展示鼠類抗體 TFPI4F36AlB2(MuTFPI4F36)之 VH及VL序列之核苷酸序列及經轉譯之多肽序列。 圖3展示鼠類4F36抗體MuTFPI4F36之Fab片段之輕 鏈（A)及重鏈（B)的胺基酸序列。根據Kabat之編號展 示於序列上方。對應於CDR環之位置在Kabat編號中以粗 125 201026330 體加底線文字突出顯示。構成互補位之胺基酸殘基以粗體 加底線文字突出顯示。互補位係根據MuTFPI4F3 6 Fab與 TFPI K2域之間的複合物之X射線結構測定，且定義為其中 重原子與K2中之重原子之距離小於4 A的Fab中之殘基。 圖4展示TFPI之序列（信號肽序列省略）。Kunitz域 以粗體展示：TFPI Kunitz域1 =胺基酸26至76; TFPI Kunitz 域 2 =胺基酸 97-147; TFPI Kunitz 域 3 =胺基酸 188-238° TFPI 之C端部分以斜體字展示於胺基酸240至276。 圖5展示TFPI中之殘基的相對可達性。具有大於40% 可達性之殘基為胺基酸94-95、98、100-110、118-121、 123-124 、 131 、 134 、 138-142 及 144-145 。 圖 6 展示對 TFPI Kunitz 域 2 ( K2 )與 MuTFPI4F36 Fab 片段（Fab )之間的複合物之SEC HPLC分析。自由K2 (實 線，rt 13.1分鐘，峰值示於13.134)、自由Fab (虛線，rt 11.7 分鐘，峰值示於11.676 )及複合物（點線，rt 11.5分鐘，峰 值示於11.496 )在UV 280 nm下偵測之SEC-HPLC層析圖。 複合物之樣本含有約20%過量K2。 圖7展示MuTFPI4F36 Fab:K2複合物之總體結構。輕 鏈以淡灰色展示且重鏈以深灰色展示。根據Kabat系統定義 之CDR環標示為L1至L3及H1至H3。 圖8展示當與MuTFPI4F36 Fab (圖中未示Fab分子） 複合時TFPI之K2域的結構。N端及C端及二級結構元件 標示於圖中。 圖9展示K2結構之骨架重疊。展示K2溶液、與 MuTFPI4F36 Fab複合之K2和與豬胰蛋白酶複合之K2之間 201026330 的結構差異。 圖10展示K2上之MuTFPI4F36結合性抗原決定基。 (A ) TFPI之K2域的卡通代表圖，其中包括於結合性抗原 決定基中的殘基之側鏈係以球及棍表示之。（B )如同A， 但加有表面。（C)定位於一級序列上之結合性抗原決定基。 大寫粗體、斜體與加底線之字母分別對應於僅與
MuTFPI4F3 6 Fab 重鏈接觸（位置 1〇、η、13、28、31、33 及35)、僅與輕鏈接觸（位置21、23及5〇)、及與重鏈和 〇 輕鏈均接觸（17、19、34及36)之Κ2結合性抗原決定基 中之殘基。一級結構元件（h=螺旋，s =摺疊）於圖中指示 (螺旋位於位置5-8及50-56且摺疊位於位置20_26及 • 3 1-37 )。以灰色突出顯示之殘基（位置1-2及59-66 )存在 於所表現之蛋白質中，但由於N端及C端之柔性而在晶體 結構中未觀察到。 圖 11 展示 K2:MuTFPI4F36 Fab 與 K2:HzTFPI4F36 Fab 複合物之骨架跡線之比較，其顯示鼠類MuTFPI4F36與人類 ❹ 化HzTFPI4F36 Fab片段之結合模式相同。K2:MuTFPI4F36 Fab以灰色展示且K2:HzTFPI4F36 Fab以黑色展示。結構經 重疊以最優化F ab片段之可變區之間的匹配。 圖12展示抗TFPI單株抗體（mAb)對經TNFa/ILl 沒刺激之HUVEC表面上TF/FVIIa誘導FX活化的影響。在 0-20 nM mAB ( mAbTFPI 2021 或 mAb 2974)、50 pM FVIIa (NovoSeven®)及50 nM FX存在下量測含於緩衝液中之 FX之活化，該緩衝液具有25 mM HEPES、137 mM NaC卜 3.5 mM KC卜 5 mM CaCl2、1 mg/ml BSA ( 0.1〇/〇) ( pH 7.4)， 127 201026330 且上覆有HUVEC單層。所產生之FXa活性係在醯胺分解檢 定中、使用S-2765加以測定且依據405 nM下之吸光度增 幅加以度量。 圖13展示抗TFPI mAb對MDA-MB 231細胞表面上 TFPI抑制TF/FVIIa誘導FX活化的影響。在0-20 nM mAB (Hz mAbTFPI 2021 或 mAb 2974 )、2.5 nM fl-TFPI、100 pM FVIIa及50 nM FX存在下量測含於緩衝液中之FX之活化， 該緩衝液具有 25 mM HEPES、137 mM NaCn、3.5 mM KC1、 5 111]^€&(：1、111^/11113 8八（0.1%乂？117.4)且上覆有]^〇八-]^8 23 1細胞單層。所產生之FXa活性係在醯胺分解檢定中、使 用S-2765加以測定且依據405 nM下之吸光度增幅加以度 量。 圖14展示TFPI Kunitz 2域中所選殘基之單一胺基酸丙 胺酸取代對與 mAbTFPI 2021 (「mAb4F36」）及 mAb2974 (n=2)之結合的影響。所選殘基為mABTFPI 2021結合性 抗原決定基之一部分。胺基酸殘基之編號係如圖10C中所 指示。 圖1 5展示經對照物IgG (血友病）或鼠類抗TFPI抗體 TFPI-4F36A1B2 (「4F36」，MuTFPI4F36 )治療之後在暫時 性血友病兔中所量測之表皮出血時間及失血量。 圖16展示「應需（on demand)」治療（誘發出血之後 5 分鐘以 HzTFPI4F36(「抗 TFPI」，mAbTFPI 2021 X 2 mg/kg) 或NovoSeven ( 9 mg/kg)治療）患有抗體誘發性血友病之 兔中的表皮出血時間（單項觀測；平均值土SEM )及失血（平 均值土SEM )。觀測出血1小時（3600秒）。 201026330 * 圖17展示當誘發出血前35分鐘以HzTFPI4F36 (「抗 TFPI」，mAbTFPI 2021 )(劑量：0.5、1、2 mg/kg)或同型 對照抗體預治療時患有抗體誘發性血友病之兔中的表皮出 血時間（單項觀測；平均值±SEM)及失血（平均值±8丑厘）。 觀測出血1小時（3600秒）。 圖18展示在經抗FVIII抗體刺激、投予抗TFPI抗體 (「抗TFPI抗體」，MuTFPI4F36)且接著致使出血之後個別 動物中所量測到的血小板數目。此係在對照血友病模型中 0 且在如本文所述之鼠類抗TFPI抗體4F36 ( MuTFPI4F36 ) 存在下進行。 圖19展示在0小時給予20 mg/kg HzTFPI4F36之兔中 . 之自由HzTFPI4F36 ( mAbTFPI 2021 )的血漿濃度。在96 小時（4天）、168小時（7天）及240小時（10天）時進 行表皮出血實驗。點線表示如劑量-反應研究中所見之 HzTFPI4F36之「有效濃度」範圍（參看圖17)。 圖 20 :左圖：血漿 HzTFPI4F36 ( mAbTFPI 2021 )(左 〇 軸：〇）及表皮出血時間（平均值土SEM ; )。右圖：當誘 發出血前 4、7 或 10 天以 20 mg/kg HzTFPI4F36 ( n=8 )或 同型對照抗體（n=12 )預治療時患有抗體誘發性血友病之 兔中之血漿HzTFPI4F3 6 ( mAbTFPI 2021 )(左轴〇）及失 血量（平均值+SEM ; )。觀測出血1小時（3600秒）。 圖 21展示向猴靜脈内及皮下投予 HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021 )後之血漿濃度。在下邊三幅圖上，隔兩 週向兩隻猴投予三劑HzTFPI4F36。在左下圖上，投予2、 20及80 mg/kg三次劑量，在中下圖上，投予20、80及160 129 201026330 mg/kg三次劑量；在右下圖上，給予80、160及200 mg/kg 三次劑量。在左上圖上，向三隻猴投予20 mg/kg之單劑； 在右上圖上，向三隻猴投予單一靜脈内劑。圖上各點表示 個別觀測結果，而線表示所擬合的模型。 圖 22展示每曰皮下投予 1 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021 )之模擬。橫實線表示模擬血漿濃度且橫 點線表示依據效應資料所推導之上有效濃度。 圖23展示每三週靜脈内投予15 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021 )之模擬。橫實線表示模擬血漿濃度且橫 點線表示依據效應資料所推導之上有效濃度。 圖24展示每兩週靜脈内投予20 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021 )之模擬。橫實線表示模擬血漿濃度且橫 點線表示依據效應資料所推導之預計標靶飽和濃度。 【主要元件符號說明】 無 130 201026330 序列表 <110〉諾佛儂迪克 諾佛儂迪克股份有限公司 <120〉抗體 <130> 7788 <160> 34 <170> Patentln 3.5^® <210〉 1 <211> 276 <212> PRT <213>智慧人 <400> 1 ❹
Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr lie lie Thr Asp Thr Glu Leu 1 5 10 15
Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 2〇 25 30
Gly Pro Cys Lys Ala He Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn lie Phe Thr 35 40 45
Arg Gin Cys Glu Glu Phe He Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn 50 55 60
Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80
Ala Asn Arg lie lie Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Asp Phe 85 90 95
Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly lie Cys Arg Gly Tyr lie Thr Arg 100 105 110
Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly 115 120 125
Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys 130 135 140
Asn lie Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Val Asp Asn Tyr Gly 145 150 155 160
Thr Gin Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys 165 170 175
Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro 1 201026330 180 185 190
Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn 195 200
Arg Phe Tyr Tyr Asn 205
Ser Val lie Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr 210 215
Ser Gly Cys Gly Gly 220
Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gin Glu Cys 225 230 235
Leu Arg Ala Cys Lys 240
Lys Gly Phe lie Gin Arg lie Ser Lys Gly Gly 245 250
Leu lie Lys Thr Lys 255
Arg Lys Arg Lys Lys Gin Arg Val Lys lie Ala 260 265
Tyr Glu Glu lie Phe 270
Val Lys Asn Met 275 <210> 2 <211> 66 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>用於抗原決定基定位法的人工構築體 <400> 2 Gin Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu 15 10
Asp Pro Gly lie Cys 15
Arg Gly Tyr lie Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn 20 25
Gin Thr Lys Gin Cys 30
Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn 35 40
Met Asn Asn Phe Glu 45
Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn 工le Cys Glu Asp 50 55
Gly His His His His 60
His His 65 <210> 3 <211> 339 <212> DNA <213> 小鼠（Mus musculus) <400> 3 gatattgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcttcc 60 2 120 201026330 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gaaagtgatg gaaaaaccta tttaaattgg ttattacaga ggccaggcga gtctccaaag ctcctaatct atctggtgtc tatactggac tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac gctgaaaatc agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgtt tgcaagctac acattttcct cagacgttcg gtggcggcac caagctggaa atcaaacgg <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> 小鼠 <400> 4
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr 工le Gly 1 5 10 15
180 240 300 339
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser lie Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Gin 100
Thr Phe
Gly
Gly Gly 105
Thr
Lys Leu
Glu lie Lys 110 5 339 DNA 小鼠
Arg <210> <211> <212> <213> <400> 5 ccgtttgatt tccagcttgg tgccgccacc gaacgtctga ggaaaatgtg tagcttgcaa acaataataa actcccaaat cctcagcctc cactctgctg attttcagcg tgaaatctgt ccctgatcca ctgccagtga acctgtcagg gactccagag tccagtatag acaccagata gattaggagc tttggagact cgcctggcct ctgtaataac caatttaaat aggtttttcc atcactttct aagaggctct gacttgactt gcaagagatg gaagctggtt gtccaatggt 3 60 120 180 240 300 201026330 339 aaccgacaaa gtgagtggag tctgggtcat cacaatatc <210> 6 <211〉 219 <212> PRT <213> 小鼠 <400> 6
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr lie Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser lie Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys'Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125
Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140
Tyr Pro Arg Asp lie Asn Val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160
Gin Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205
Pro lie Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 4 60 201026330 <210> 7 <211> 363 <212> DNA <213> 小鼠 <400> 7 gaggtggagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtcgta gtggtagtta ctcctacttt ccagacagtg tgcagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatga gcagtctgcg gtctgaggac acggccatgt attattgtac aagacttggg ggttacgacg agggggatgc tatggactcc tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tea
<210> 8 <211> 121 <212> PRT <213>小鼠 <400> 8
Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr lie Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
9 363 DNA 120 180 240 300 360 363 <210> <211> <212> 5 201026330 <213> 小鼠 <400> 9 tgaggagacg gtgactgagg ttccttgacc ccaggagtcc atagcatccc cctcgtcgta 60 acccccaagt cttgtacaat aatacatggc cgtgtcctca gaccgcagac tgctcatttg 120 caggtacagg gtgttcttgg cattgtctct ggagatggtg aatcgaccct gcacactgtc 180 tggaaagtag gagtaactac cactacgact aatggttgcg acccactcca gcctcttctc 240 cggagtctgg cgaacccaag acatggcata gttactgaaa gtgaatccag aggctgcaca 300 ggagagtttc agggaccctc caggcttcac taagcctccc ccagactcca ccagctccac 360 etc 363 <210> 10 <211> 445 <212> PRT <213> 小鼠 <400> 10
Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly -15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr lie Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val 130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 6 201026330
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175
Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly 210 215 220
Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lie 225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys 245 250 255 〇
Val Thr Cys Val Val Val Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin 260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin 275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 290 · 295 300
Pro lie Met His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg 305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr lie Pro Pro Pro 340 345 350
Lys Glu Gin Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr 355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp lie Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin 370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro lie Met Asp Thr Asp Gly 385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu 405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 7 201026330 420 425 430 His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉引子 <400> 11 cccttgacca ggcatcccag 20 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> 引子 <400> 12 gctctagact aacactcatt cctgttgaag ctcttg 36 <210> 13 <211> 339 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 人類化可變輕鏈 <400> 13 gacatcgtga tgacccagac ccctctgtcc ctgtccgtga cccctggcca gcctgcctcc 60 atctcctgca agtcctccca gtccctgctg gaatccgacg gcaagaccta cctgaactgg 120 tatctgcaga agcctggcca gtcccctcag ctgctgatct acctggtgtc catcctggac 180 tccggcgtgc ctgaccggtt ctccggctcc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgcc tgcaggccac ccacttccct 300 cagacctttg gcggcggaac aaaggtggag atcaagcgt 339 <210> 14 <211> 339 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 人類化可變輕鏈 <400> 14 ctgtagcact actgggtctg gggagacagg gacaggcact ggggaccggt cggacggagg 60 tagaggacgt tcaggagggt cagggacgac cttaggctgc cgttctggat ggacttgacc 120 8 201026330 atagacgtct tcggaccggt caggggagtc gacgactaga tggaccacag gtaggacctg aggccgcacg gactggccaa gaggccgagg ccgtcgccgt ggctgaagtg ggacttctag ♦ agggcccacc tccggctcct gcacccgcac atgatgacgg acgtccggtg ggtgaaggga gtctggaaac cgccgccttg tttccacctc tagttcgca <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> 人工 <220> <223〉人類化可變輕鏈 <400> 15
Asp 工le Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15 ❹
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser lie Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95 ❹
Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210> 16 <211> 363 <212> DNA <213> 人工 <220> <223>人類化可變重鏈 <400> 16 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgaagc ctggcggctc cctgcggctg tcctgcgctg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcggcagacc 201026330 ccagaaaagc ggctggaatg ggtggccacc atctcccggt ccggctccta ctcctacttc 180 cctgactccg tgcagggccg gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagccgtgt actactgcgc caggctgggc 300 ggctacgacg agggcgacgc catggacagc tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtcc 360 tec 363 <210> 17 <211〉 363 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉人類化可變重鏈 <400> 17 ctccacgtcg accagctcag accgccgcct gaccacttcg gaccgccgag ggacgccgac 60 aggaegegae ggaggccgaa gtggaagagg ttgatgcggt acaggaccca cgccgtctgg 120 ggtcttttcg ccgaccttac ccaccggtgg tagagggcca ggeegaggat gaggatgaag 180 ggactgaggc acgtcccggc caagtggtag tcgtccctgt tgcggttctt gagggacatg 240 gacgtctact tgagggactc tcggctcctg tgtcggcaca tgatgacgcg gtccgacccg 300 ccgatgctgc tcccgctgcg gtacctgtcg accccggtcc cgtggtggca ctggcacagg 360 agg 363 <210> <211〉 <212> <213〉 <220> <223>人類化可變重鏈 <400> 18
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr lie Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 10 201026330
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 657 <212> DNA <213> 人工 <220> <223>人類化恆定輕鏈 <400> 19
gacatcgtga atctcctgca tatctgcaga tccggcgtgc tcccgggtgg cagacctttg ttcatcttcc ctgaataact tcgggtaact agcagcaccc gtcacccatc tgacccagac agtcctccca agcctggcca ctgaccggtt aggccgagga gcggcggaac cgccatctga tctatcccag cccaggagag tgacgctgag agggcctgag ccctctgtcc gtccctgctg gtcccctcag ctccggctcc cgtgggcgtg aaaggtggag tgagcagttg agaggccaaa tgtcacagag caaagcagac ctcgcccgtc ctgtccgtga gaatccgacg ctgctgatct ggcagcggca tactactgcc atcaagcgta aaatctggaa gtacagtgga caggacagca tacgagaaac acaaagagct cccctggcca gcaagaccta acctggtgtc ccgacttcac tgcaggccac cggtggctgc ctgcctctgt aggtggataa aggacagcac acaaagtcta tcaacagggg gcctgcctcc cctgaactgg catcctggac cctgaagatc ccacttccct accatctgtc tgtgtgcctg cgccctccaa ctacagcctc cgcctgcgaa agagtgt 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 657 ❹ <210> 20 <211> 657 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 人類化恆定輕鏈 <400> 20 ctgtagcact actgggtctg gggagacagg gacaggcact ggggaccggt cggacggagg tagaggacgt tcaggagggt cagggacgac cttaggctgc cgttctggat ggacttgacc atagacgtct tcggaccggt caggggagtc gacgactaga tggaccacag gtaggacctg aggccgcacg gactggccaa gaggccgagg ccgtcgccgt ggctgaagtg ggacttctag agggcccacc tccggctcct gcacccgcac atgatgacgg acgtccggtg ggtgaaggga gtctggaaac cgccgccttg tttccacctc tagttcgcat gccaccgacg tggtagacag 60 120 180 240 300 360 11 201026330 aagtagaagg gacttattga agcccattga tcgtcgtggg cagtgggtag gcggtagact agatagggtc gggtcctctc actgcgactc tcccggactc actcgtcaac tctccggttt acagtgtctc gtttcgtctg gagcgggcag tttagacctt catgtcacct gtcctgtcgt atgctctttg tgtttctcga gacggagaca tccacctatt tcctgtcgtg tgtttcagat agttgtcccc acacacggac gcgggaggtt gatgtcggag gcggacgctt tctcaca 420 480 540 600 657 <210> 21 <211> 219 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化恆定輕鏈 <400> 21
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser lie Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 12
201026330
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210〉 22 <211> 1344 <212> DNA <213> 人工 <220> <223>人類化恆定重鏈 <400> 22 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgaagc ctggcggctc cctgcggctg tcctgcgctg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcggcagacc ccagaaaagc ggctggaatg ggtggccacc atctcccggt ccggctccta ctcctacttc cctgactccg tgcagggccg gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagccgtgt actactgcgc caggctgggc ggctacgacg agggcgacgc catggacagc tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtcc tccgctagca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 13 201026330 agcctctccc tgtctctggg taaa <210> 23 <211> 1344 <212> DNA <213> 人工 <220> <223>人類化恆定重鏈 <400> 23 ctccacgtcg accagctcag accgccgcct gaccacttcg gaccgccgag ggacgccgac aggacgcgac ggaggccgaa gtggaagagg ttgatgcggt acaggaccca cgccgtctgg ggtcttttcg ccgaccttac ccaccggtgg tagagggcca ggccgaggat gaggatgaag ggactgaggc acgtcccggc caagtggtag tcgtccctgt tgcggttctt gagggacatg gacgtctact tgagggactc tcggctcctg tgtcggcaca tgatgacgcg gtccgacccg ccgatgctgc tcccgctgcg gtacctgtcg accccggtcc cgtggtggca ctggcacagg aggcgatcgt ggttcccggg taggcagaag ggggaccgcg ggacgaggtc ctcgtggagg ctctcgtgtc ggcgggaccc gacggaccag ttcctgatga aggggcttgg ccactgccac agcaccttga gtccgcggga ctggtcgccg cacgtgtgga agggccgaca ggatgtcagg agtcctgaga tgagggagtc gtcgcaccac tggcacggga ggtcgtcgaa cccgtgcttc tggatgtgga cgttgcatct agtgttcggg tcgttgtggt tccacctgtt ctctcaactc aggtttatac cagggggtac gggtggtacg ggtcgtggac tcaaggaccc ccctggtagt cagaaggaca aggggggttt tgggttcctg tgagagtact agagggcctg gggactccag tgcacgcacc accacctgca ctcggtcctt ctggggctcc aggtcaagtt gaccatgcac ctaccgcacc tccacgtatt acggttctgt ttcggcgccc tcctcgtcaa gttgtcgtgc atggcacacc agtcgcagga gtggcaggac gtggtcctga ccgacttgcc gttcctcatg ttcacgttcc agaggttgtt tccggagggc aggaggtagc tcttttggta gaggtttcgg tttcccgtcg gggctctcgg tgtccacatg tgggacgggg gtagggtcct cctctactgg ttcttggtcc agtcggactg gacggaccag tttccgaaga tggggtcgct gtagcggcac ctcaccctct cgttacccgt cggcctcttg ttgatgttct ggtgcggagg gcacgacctg aggctgccga ggaagaagga gatgtcgtcc gattggcacc tgttctcgtc caccgtcctc cccttacaga agagtacgag gcactacgta ctccgagacg tgttggtgat gtgtgtcttc tcggagaggg acagagaccc attt <210> 24 <211> 448 <212> PRT <213> 人工 1344 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1344 14 <220> 201026330 <223>人類化恆定重鏈 <400> 24
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr lie Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 〇
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 15 201026330 245 250 255 Thr Pro Glu Val 260 Thr Cys Val Val Val 265 Asp Val Ser Gin Glu 270 Asp Pro
Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr 325 330 335 · lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350
Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 工le Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415
Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 25 <211〉 339 <212> DNA <213> 人工 <220> <223〉 HZTFPI4F36-CDR 移植的 VL 核酸序歹 IJ (省略訊號肽序列） <400> 25 60 gacatcgtga tgacccagac ccctctgtcc ctgtccgtga cccctggcca gcctgcctcc atctcctgca agtcctccca gtccctgctg gaatccgacg gcaagaccta cctgaactgg 120 16 201026330 tatctgcaga agcctggcca gtcccctcag ctgctgatct acctggtgtc catcctggac 180 tccggcgtgc ctgaccggtt ctccggctcc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgcc tgcaggccac ccacttccct 300 cagacctttg gcggcggaac aaaggtggag atcaagcgt 339 <210> 26 <211> 113 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> HZTFPI4F36-CDR移植的VL胺基酸序列 (省略訊號狀序列） <400> 26
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
O
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser lie Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210> 27 <211> 363 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> HzTFPI4F36-CDR移植的VH核酸序列 (省略訊號肽序列） <400〉 27 60 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgaagc ctggcggctc cctgcggctg tcctgcgctg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcggcaggcc 17 120 201026330 ccagggaagg gactggaatg ggtgtccacc atctcccggt ccggctccta ctcctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagccgtgt actactgcgc caggctgggc 300 ggctacgacg agggcgacgc catggacagc tggggc'cagg gcaccaccgt gaccgtgtcc 360 tcc 363 <210> 28 <211> 121 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> HZTFPI4F36-CDR移植的VH胺基酸序歹[J (省略訊號肽序列） <400> 28
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 219 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> HZTFPI4F36-CDR移植的LC胺基酸序列，人類κ鏈 (省略訊號肽序列） <400> 29 18 201026330
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser He Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 〇 ❹
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Gin Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210〉 <211> <212> <213> <220〉 <223> HZTFPI4F36-CDR移植的HC胺基酸序列，人類IgG4(S241P> (省略訊號肽序列） 19 201026330 <400> 30
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 245 250 255 20 201026330
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro 260 265 270
Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr 325 330 335
lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350
Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415
Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 ❹
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 31 <211> 112 <212> PRT <213> 智慧人 <400> 31
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 21 201026330
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 Ί0 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 90 95 lie His Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 110 3211PR智
〇 <210> <211> <212〉 <213> <400> 32
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 33 <211> 224 <212> PRT <213>小鼠 <400〉 33
Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15 22 201026330
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr lie Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 ΊΌ 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val 130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175
Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly 210 215 220 <210> 34 <211> 222 <212> PRT <213>智慧人 <400> 34
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 23 201026330 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr lie Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val 50 55 60
Gin Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly 100 105 110 ❹
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220 24

Claims (1)

  1. 201026330 七、申請專利範圍： 1. 一種單株抗體，其能夠特異性結合TFPI之K2域， 其中該抗體能夠特異性結合包含SEQ ID NO: 2之殘基R17 的抗原決定基。 2. —種單株抗體，其能夠特異性結合TFPI之K2域， 其中該抗體能夠結合包含一或多個選自由以下者所組成之 群組的殘基之抗原決定基：SEQ IDNO:2之E10、EU、D12、 P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、 ◎ E33 、 R34 、 F35 、 K36 及 L50 。 3. —種單株抗體，其能夠結合TFPI之K2域，其中該 抗體之輕鏈包含以下胺基酸殘基： - 在對應於SEQ ID NO: 15之位置31的位置包含E， . 在對應於SEQ ID NO: 15之位置32的位置包含S， 在對應於SEQ ID NO: 15之位置33的位置包含D， 在對應於SEQ ID NO: 15之位置37的位置包含Y， 在對應於SEQ ID NO: 15之位置96的位置包含A， © 在對應於SEQ ID NO: 15之位置97的位置包含T，及 在對應於SEQ ID NO: 15之位置99的位置包含F ; 且其中該抗體之重鏈包含以下胺基酸殘基： 在對應於SEQ ID NO 1 8之位置3 1的位置包含N， 在對應於SEQ ID NO 18之位置53的位置包含R， 在對應於SEQ ID NO 18之位置54的位置包含S， 在對應於SEQ ID NO 18之位置57的位置包含Y， 在對應於SEQ ID NO 18之位置59的位置包含Y， 在對應於SEQ ID NO 1 8之位置60的位置包含F， 1 201026330 在對應於SEQ ID NO 18之位置61的位置包含P， 在對應於SEQ ID NO 1 8之位置62的位置包含D， 在對應於SEQ ID NO 18之位置65的位置包含Q， 在對應於SEQ ID NO 18之位置102的位置包含Y， 在對應於SEQ ID NO 18之位置103的位置包含D，及 在對應於SEQ ID NO 18之位置106的位置包含D。 4. 如申請專利範圍第3項之單株抗體，其中該重鏈進一 步在對應於SEQ ID NO: 18之位置52的位置包含S，且/或 其中該輕鏈進一步在對應於SEQ ID NO: 15之位置98的位 置包含Η，且該重鏈進一步在對應於SEQ ID NO: 18之位置 56的位置包含S。 5. —種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子 (TFPI)之Kunitz 2 (K2)域，其中該抗體之重鏈包含： SEQ ID NO: 18 之胺基酸 31 至 35 ( NYAMS)之 CDR1 序列，其中此等胺基酸之一可經不同胺基酸取代；及/或 SEQ ID NO·· 18 之胺基酸 50 至 66( TISRSGSYSYFPDSVQG) 之CDR2序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基 酸取代；及/或 SEQ ID NO: 18 之胺基酸 99 至 110( LGGYDEGDAMDS) 之CDR3序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基 酸取代。 6. —種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子 (TFPI)之Kunitz 2 ( K2 )域，其中該抗體之輕鏈包含： SEQ ID NO·· 15 之胺基酸 24 至 39 ( KSSQSLLESDGKTYLN) 之CDR1序列，其中一、二或三個此等胺基酸可經不同胺基 201026330 酸取代；及/或 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 55 至 61 ( LVSILDS)之 CDR2 序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取代；及/ 或 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94 至 102 ( LQATHFPQT)之 CDR3序列，其中一或兩個此等胺基酸可經不同胺基酸取 代。 7. —種單株抗體，其能夠結合組織因子路徑抑制子 0 ( TFPI)之Kunitz 2(K2)域，其中該抗體之重鏈包含： SEQ ID NO: 18 之胺基酸 31 至 35 ( NYAMS)之 CDR1 序列及 . SEQ ID NO: 18 之胺基酸 50 至 66( TISRSGSYSYFPDSVQG) 之CDR2序列及 SEQ ID NO: 18 之胺基酸 99 至 110( LGGYDEGDAMDS) 之CDR3序列 且其中該抗體之輕鏈包含： ◎ SEQIDNO: 15 之胺基酸 24 至 39(KSSQSLLESDGKTYLN) 之CDR1序列；及 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 55 至 61 ( LVSILDS )之 CDR2 序列；及 SEQ ID NO: 15 之胺基酸 94 至 102 ( LQATHFPQT)之 CDR3序列。 8. 如申請專利範圍前述任一項之單株抗體，其中該抗體 之輕鏈包含SEQ ID NO: 15且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO: 3 18。 201026330 9.如申請專利範圍前述任一項之單株抗體，其中該抗體 之輕鍵包含SEQ ID NO: 21且該抗體之重鏈包含seQ ID NO. 24 ° 10. 如申請專利範圍前述任一項之單株抗體，其能夠以 高於mAb2974之貌和力結合TFPI之K2域。 11. 如申請專利範圍前述任一項之單株抗體，其中當 TFPI以該抗體飽和時，該抗體能夠將TFpi對結合膜之 FVIIa/TF/FXa之抑制中和至少55%，諸如至少6〇%、諸如 至少65%、諸如至少70%、諸如至少75% '諸如至少、 諸如至少85%、諸如至少90%、諸如至少95%、諸如多至 100%、諸如100%，如在FVIIa/TF/FXa抑制子檢定中所量 測的。 12.—種真核細胞，其表現如申請專利範圍第}至仞項 中任一項之單株抗體或其片段。 、 13·-種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第^至⑺ 之抗體’或如申請專利範圍第u $之聚核* 酸，及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。 14.-種如申請專利範圍第u 1〇項中任 體用於治療患有凝血障礙之個體的用途。 種治療患有凝血障礙之個體的方法 人 個體投予如申請專利範圍第1至10項中任一項3… 體。 項甲任項之單株抗
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