TW201006483A - Plant extract and its therapeutic use - Google Patents

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201006483 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於植物萃取物及其治療用途。 - 【先前技術】 WO 03/101479 A1描述包含不同成分（其通常係藉由 肌肉內注射一起投服）之組成物的重要治療性質。其實例 D 所使用之組成物包含洋甘菊萃取物，但是該洋甘菊萃取物 並無直接治療活性；更明確地，該洋甘菊萃取物爲抗刺激 劑，且其存在可緩和注射本身之令人不適的作用。 WO 2007/05765 1 A1揭示用於去除具有脂質基團之水 溶性污染物（尤其是來自洋甘菊水性組成物之內毒素）的 方法。 WO 01/13929 A1 描述自洋蓍草（jc/u7/efl wi/ie/o/iMw )所分離之實質上純質的生物活性萃取物。此萃取物（宜 φ 爲甲醇萃取物）具有抗腫瘤活性且係作爲抗癌劑。 WO 2008/ 1 46009 A1描述洋甘菊精油或黑草種籽油或 此二種油之混合物對人顆粒細胞株HL 60中之5-脂肪氧化 酶活性及人類膠質母細胞瘤細胞株U8 7MG中之DNA合成 的功效。此文獻亦描述該等油對人巨噬細胞株THP1釋出 IL-6及人攝護腺癌細胞株DU145之DNA合成的功效。 US 6 3 00 370 B1描述用於製造洋甘菊精油之方法。 此方法係將洋甘菊萃取殘質進行蒸汽蒸餾或水溶液蒸餾。 該洋甘菊萃取殘質係經由利用水性或有機溶劑或其混合物 -5- 201006483 處理洋甘菊花及莖並將起始物質進行或不進行蒸汽蒸飽之 方式取得。 P.Vilagines, P.Delaveau and R. Vilagin^s "Inhibition de la replication du poliovirus par un extrait de Matricaria chamomilla (L.)", Comptes Rendus de I'Academie des Sciences, Serie III, Tome 3 01, No.6, 1 9 8 5, pages 289 to 294 描述德國洋甘菊（Mairicarifl Z··)之水 醇萃取物對第1型小兒麻痺病毒生長之效果。當在小兒麻 痺病毒發展早期加入此洋甘菊萃取物時，則該萃取物可抑 制細胞及病毒RN A之合成。此抑制作用爲部分不可逆的 發明目的 本發明之目的係提供用於治療異常增殖及/或病毒病 症之組成物。 本發明之另一目的係提供使人體或動物體內異常增生 ❹ 之哺乳動物細胞（尤其是癌細胞）同步化及S相遏止的組 成物》 此同步化應包含誘導鳥胺酸脫羧酶及/或抑制第Π型拓 撲異構酶。 本發明之目的亦爲提供用於治療異常增生之病症的組 成物，其中該治療包含同時或依序投服此組成物及至少一 種抗腫瘤劑。 這些目的可藉由本發明達成。 -6 - 201006483 【發明內容】 本發明藉由申請專利範圍獨立項中所定義之特徵說明 其特點。 . 較佳體系係定義於申請專利範圍獨立項中。 - 此組成物亦可由至少一種洋甘菊植物及/或至少一種 蓍草植物之水性及/或有機萃取物和至少一種抗腫瘤劑， 以及偶爾地至少一種藥學上及/或皮膚學上可接受之佐劑 所組成。 令人驚訝地，現已發現自花頭取得之洋甘菊萃取物（ 諸如WO 2007/0 5765 1 A1中所描述者）具有珍貴之治療性 質。尤其是，現已發現其可減少DNA及RNA合成，但不 會實質影響蛋白質合成，由此可演繹出其於癌症治療中之 用途。 更令人驚訝地，現已發現德國洋甘菊之管形花（ Flores tubiformis)的有機萃取物適合用於異常增生之哺 φ 乳動物細胞（尤其是癌細胞）同步化及S相遏止。 此同步化係因鳥胺酸脫羧酶被誘導出（從G〇相轉移 至G!相）及第Π型拓撲異構酶受抑制（累積及遏止於早 期S相）而發生。 亦發現，以有機萃取物抑制第Π型拓撲異構酶之效果 較水性萃取物強超過1〇〇倍（在完全抑制該酶之濃度方面 由於抑制第Π型拓撲異構酶對細胞同步化具關鍵性， 本發明之德國洋甘菊的管形花有機萃取物較對應之水性萃 201006483 取物更有效力。 發明說明 本發明係以利用洋甘菊之水性萃取物所取得之數據及 利用德國洋甘菊之管形花的有機萃取物（尤其是醇類萃取 物，例如：乙醇萃取物）所取得之數據爲基礎。 可取得之證據顯示出依下述取得之水性洋甘菊萃取物 可維持蛋白質生物合成作用，而DNA-及RNA之生物合成 作用則減少。此爲測量本萃取物之所需性質的良好方法。 該水性及/或有機萃取物可藉由任何本技藝之一般技 術人士所已知之合適程序來取得。該萃取物可利用水性及 /或有機介質（尤其是醇類介質，諸如：乙醇介質）取得 並與其他成分分開。 用於製備水性萃取物之較佳程序描述於 WO 2007/057651 A1 中 ° 較佳地，根據本發明之組成物額外包含至少一種選自 藥用輔料類之成分，宜選自藥劑及製藥賦形劑之群體。 可將水性萃取物進行純化處理。這類萃取物包含水溶 性成分之多成分混合物。其可經由將水加入合適之植物部 分中來取得懸浮液，然後通常加熱至低於水之沸點（如： 90-94°C)的溫度，再冷卻至室溫來取得。 然後，將水性萃取物進行二次過濾步驟。僅爲了用於 說明，這些將分別記述於下文中之微過濾及超濾作用部分 。亦可使用其他技術（諸如使用親脂性屏障）。若需要時 -8- 201006483 ，各過濾步驟可分成一、二或多個階段進行。 應用微過濾以去除可能危及超濾步驟之效力的物質。 下列部分記述本發明可能之佳體系中。 下列實例說明本發明。 藉Cambrex PyroGene分析，利用稀釋因子1:10.000 進行實例中所取得之樣本的細菌內毒素之分析。 g 【實施方式】 實例1及2 將 45克黃洋甘菊管形花recwi/ia)與 900 克水（Aqua purificata，Ph. Hel v.)混合。將此混合 物在20至30分鐘內加熱至90°C至94t之溫度間。然後 ，將混合物貯存在室溫（15°C至25°C )下，直至溫度達到 介於3 0 °C至3 5 °C。 藉由深層過濾去除藥物殘質。將所得之粗濾液通過 φ 0.22微米膜過濾以使之澄清。 將0 · 3 % (實例1 )或0.1 % (實例2 )(相關於萃取物 之質量）之蓖麻油（Ph.Eur.)加入澄清之濾液中。將所得 之混合物均化5分鐘。將如此製得之萃取物通過〇·22微 米膜過濾（以切向流（Tangential Flow)模式過濾）並回 收保留物。 將所得之滲透液通過ο.1微米膜過濾（以切向流模式 過濾）並回收保留物。最後’將所得之滲透液通過 1 OOOkDa膜過濾（以切向流模式過濾）並回收保留物。 201006483 各最終濾液中之細菌內毒素殘質：<100 EU/毫升。 實例3至5 重複實例1，但以〇 · 3 % (實例3 ) 、1.0 % (實例4 ; VIP-E_Mar’0 6_l 003)及3.0% (實例5)(相關於萃取物 之質量）之mygliol(Ph· Eur.)取代蓖麻油加入澄清之濾 液中。 各最終濾液中之細菌內毒素殘質：<1 00EU/毫升。 實例6 此實例使用校定後之草案，其中加熱及冷卻步驟不是 在高壓滅菌鍋內進行而是在10升雙層容器中，在攪拌下 進行（加熱裝置之最高溫爲140°C )。 以二辛酸/癸酸丙二醇酯（mygliol )取代蔑麻油加入 其中。該mygliol爲來自Hanseler之“供腸胃道外使用之

Mygliol 812” 。將混合物在室溫下攪拌1 0分鐘而不均化 〇 根據上述方法之微過濾作用均係以Millipore Pellicon 2系統進行。爲了取得更好之操作性並避免耗時之清潔程 序，以下列儀器進行此實例中之超過濾： 過濾 濾器系統 漩渦形廓 0.2微米過濾 Millipore Pellicon 2 Durapore 0·2μ，C-濾飾 0.1微米過濾 單向濾器 Millipack 200，0.1 微米 1000kDa 過濾 Millipore Pellicon 2 Biomax 1000 kDa，V-爐飾 0.2微米過濾 單向濾器 Millipack 200，0.2 微米 -10- 201006483 另外，加入酚以安定該萃取物。加入之酚量爲6.0· 8.0毫克/毫升。其係在100okDa過濾後加入。加入後’將 懸浮液攪拌約10分鐘，直到所有酚均溶解。 各情況中之內毒素量均低。 實例7 (液態萃取物ViP-E_Matr'0 8_1102之製備方法） 在40°C至60°C之溫度間，以500克之80% (莫耳/莫

耳）乙醇在2小時內一邊攪拌一邊萃取100克來自德國洋 甘菊花序之管形花（相當於藥物對溶劑比爲1/5)。接著 ，利用纖維素濾器（AF 6 Filtrox®)將製品進行深層過濾 。可取得3 85克清澈深棕色液態萃取物，其固體含量爲 4.43% (莫耳/莫耳）。 實例8 (液態萃取物ViP-E_Matr'08_1106之製備方法） 在40°C至60°C之溫度間，以500克之90% (莫耳/莫 φ 耳）乙醇在2小時內一邊攪拌一邊萃取100克來自德國洋 甘菊花序之管形花（相當於藥物對溶劑比爲1/5)。接著 ’利用纖維素濾器（AF 6 Filtrox®)將製品進行深層過濾 。可取得3 98克清澈深棕色液態萃取物，其固體含量爲 1 · 8 9 % (莫耳/莫耳）。 實例9 (液態萃取物ViP-E_Matr，08_1105之製備方法） 在40 °C至60。(：之溫度間，以500克之99.9% (莫耳/ 莫耳）乙醇在2小時內一邊攪拌一邊萃取1〇〇克來自德國 -11 - 201006483 洋甘菊花序之管形花（相當於藥物對溶劑比爲1/5)。接 著’利用纖維素濾器（AF 6 Filtrox® )將製品進行深層過 濾"可取得412克清澈深棕色液態萃取物，其固體含量爲 1 · 5 4 % (莫耳/莫耳）。 下列實例說明實例4、7、8及9之萃取物的藥學活性 變化形廓。 實例1〇 (對鳥胺酸脫羧酶表現之誘導） 藉根據實例4製備之液態萃取物ViP-E_Matr’06_1003 進行鳥胺酸脫羧酶表現實驗。 爲了測量對鳥胺酸脫羧酶表現之誘導作用，將此萃取 物以150、100或30微克/毫升之濃度加入HePG2細胞中 。將如此處理過之細胞在10 % FBS培養介質中培養6小時 、2 4小時或4 8小時。 然後，藉西方點墨分析測定鳥胺酸脫羧酶量之變化。 從第9圖中所示之數據清楚得知該根據本發明之萃取 物以濃度倚賴方式誘導鳥胺酸脫羧酶表現。 實例11 (比較性實例；對第I型拓撲異構酶活性之抑 制作用） 藉由根據實例7製備之液態萃取物ViP-E_Matr’08_1102 ，以0.3、1、3、1〇或30微克/毫升之萃取物濃度進行第 I型拓撲異構酶之活性實驗°同時進行陽性對照組喜樹鹼 (camptothecin)之實驗。 -12- 201006483 爲了測量對第I型拓撲異構酶活性之抑制作用，將此 萃取物加入純化之人類DNA第I型拓撲異構酶及來自 TopoGEN之“第I型拓撲異構酶藥物篩選套組”中。然後 ，根據製造者之議定計劃進行。藉由電泳在瓊脂糖凝膠上 將DNA分開，以溴化乙錠染色後在UV光下目視檢査之。 藉此方法可偵測由第I型拓撲異構酶產生之解旋的DNA ( 拓撲異構體）並與超螺旋型DNA受質清楚分開。 從第10圖中所示之數據清楚得知該根據本發明之萃 取物僅能微弱地，但以濃度倚賴方式抑制第I型拓撲異構 酶之活性。 實例12 (對第Π型拓撲異構酶活性之抑制作用） 藉由根據實例7製備之液態萃取物ViP-E_Matr'0 8_1102 、根據實例8製備之液態萃取物ViP-E_Matr'08_l 106或根 據實例9製備之液態萃取物ViP-E_Matr’08_1105，以0.3 、1或3微克/毫升之萃取物濃度進行第Π型拓撲異構酶之 活性實驗。同時進行陽性對照組依托泊苷（etopo side)之 實驗。 利用純化之人類DNA第Πα型拓撲異構酶及來自 TopoGEN之“第Π型拓撲異構酶藥物篩選套組”測定對第 Π型拓撲異構酶之抑制作用。然後，根據製造者之議定計 劃進行。藉由電泳在瓊脂糖凝膠上將DNA分開，以溴化 乙錠染色後在UV光下目視檢查之。藉此方法可偵測由第 Π型拓撲異構酶產生之解旋的DNA (拓撲異構體）並與超 -13- 201006483 螺旋型DNA受質清楚分開》 從第11圖中所示之數據清楚得知該根據本發明之萃 取物可以濃度倚賴方式強烈抑制第Π型拓撲異構酶之活性 。抑制程度明顯隨著作爲萃取溶劑之乙醇％莫耳/莫耳的濃 度增加而增加（99%>90%>80% )。以99%莫耳/莫耳乙醇 製備之萃取物顯示出即使濃度低至300奈克/毫升亦可幾 乎完全抑制該酶之活性。 此抑制作用較以實例4之水性萃取物所取得之抑制作 用強過1〇〇倍。完全抑制需要差不多150微克/毫升（未 顯示數據）。 實例13 (誘導細胞週期遏止於S-相） 以根據實例4製備之液態萃取物ViP-E_Matr'06_1003 進行細胞週期分析實驗。同時進行細胞週期遏止於S-相之 陽性對照組喜樹鹼之實驗。 爲了測量誘導細胞週期停止之作用，將此萃取物以10 、50、100或150微克/毫升之濃度加入HepG2細胞中。 將如此處理過之細胞在10%FBS培養介質中培養48小時 〇 然後，藉細胞儀分析測定細胞週期之G1-、S-或G2-相中細胞量之變化。 從第12圖中所示之數據清楚得知該根據本發明之萃 取物在低至10微克/毫升之濃度下溫育48小時後可強烈 誘導細胞週期遏止於S-相。 •14- 201006483 實例14 (樹脂萃取物之製備方法） 在減低之壓力（300至10毫巴）及稍微提高之溫度（ 35 °C至45 °C)下將在類似於實例9之方法中所得的液態萃 取物之溶劑蒸發。可取得6.4克深棕色樹脂萃取物，其乾 燥物質含量>99% (莫耳/莫耳）。 結果發現所得之樹脂萃取物不含或幾乎不含精油（ <0.01 %莫耳/莫耳）。結果發現乙醇含量<0.05% (莫耳/莫

D 耳），水含量<0.01% (莫耳/莫耳）。 實例1 5 (不含水之液態萃取物的製備方法） 將 6.4克之油酸（Ph.Eur·)及19.2克之Macrogol 400 ( Ph.Eur.)加入在類似於實例9之方法中所得的6.4 克液態萃取物中。 在減低之壓力（3 00至10毫巴）及稍微提高之溫度（ φ 35 °C至45 °C)下將乙醇蒸發。可取得3 1.8克深棕色不流 動之液態萃取物，其非揮發性成分之含量>99% (莫耳/莫 耳）。 所得之不含水的液態萃取物不含或幾乎不含精油（ <0.01°/。莫耳/莫耳）。結果發現乙醇含量<〇〇5% (莫耳/莫 耳）且水含量<0.01% (莫耳/莫耳）。 實例16 (不含水之液態萃取物的製備方法） 將 10 克之油酸（Ph.Eur.)及 20 克之 Macrogol 400 ( -15- 201006483

Ph.Eur.)加入在類似於實例14之方法中所得的10克樹脂 萃取物中。 將混合物均化。 如此取得之不含水的液態萃取物所具有之非揮發性成 分>99% (莫耳/莫耳）。 實例17 將20克黃色洋甘菊管形花（白花春黃菊（ no bilis L.))與 380 克水(Aqua purifi cata > Ph. H e 1 v.) 混合。將此混合物在20至30分鐘內加熱至9 0 °C至94 °C 之溫度間。然後，將混合物貯存在室溫（22 °C)下，直至 溫度達到介於3 0 °C至3 5 °C。 藉由深層過濾去除藥物殘質。將所得之粗濾液通過 0.22微米膜過爐以使之澄清。 將0.3% mygliol ( Ph. Eur.)(相關於萃取物之質量 )加入澄清之濾液中。將所得之混合物均化5分鐘。將如 此製得之萃取物通過0.22微米膜過濾（以切向流模式過 濾）並回收保留物。 將所得之滲透液通過0.1微米膜過濾（以切向流模式 過濾）並回收保留物。最後，將所得之滲透液通過 lOOOkDa膜過濾（以切向流模式過濾）並回收保留物。 如此可取得309克透明之水性萃取物，其乾燥物質含 量爲1 .1% (莫耳/莫耳）。 -16- 201006483 實例18 依實例17中之相同程序進行，但使用20克白花春黃 菊之全花頭。 如此可取得295克之透明水性萃取物，其乾燥物質含 量爲1.6% (莫耳/莫耳）。 實例19

^ 將40克黃色管形花（洋蕃草/wn/e/oZ/MW L_))與 760 克水（Aqua purificata，Ph. Helv.)混合。 將此混合物在20至30分鐘內加熱至9 (TC至94 °C之溫度 間。然後，將混合物貯存在室溫（22 °C )下，直至溫度達 到介於30°C至35°C。 藉由深層過濾去除藥物殘質。將所得之粗濾液通過 0.22微米膜過濾以使之澄清。 將0.3% mygliol ( Ph. Eur.)(相關於萃取物之質量 φ )加入澄清之濾液中。將所得之混合物均化5分鐘。將如 此製得之萃取物通過0.22微米膜過濾（以切向流模式過 濾）並回收保留物。 將所得之滲透液通過0.1微米膜過濾（以切向流模式 過濾）並回收保留物。最後，將所得之滲透液通過 lOOOkDa膜過濾（以切向流模式過濾）並回收保留物。 如此可取得667克之透明水性萃取物，其乾燥物質含 量爲1.3% (莫耳/莫耳）。 -17- 201006483 實例20 依實例19中之相同程序進行，但使用40克洋蓍草之 全花頭。 如此可取得634克之透明水性萃取物，其乾燥物質含 量爲1 · 4 % (莫耳/莫耳）。 實例21 在4 0 °C至6 0 °C之溫度間，以1 〇 〇克之9 9.9 % (莫耳/ 莫耳）乙醇在2小時內一邊攪拌一邊萃取20克來自白花 春黃菊花序之管形花（相當於藥物對溶劑比爲1/5)。接 著’利用纖維素濾器（AF 6 Filtrox®)將製品進行深層過 濾》可取得71克清澈深棕色液態萃取物，其固體含量爲 1.62% (莫耳/莫耳）。 實例22 在40°C至60°C之溫度間，以200克之99.9% (莫耳/ 莫耳）乙醇在2小時內一邊攪拌一邊萃取40克來自洋蓍 草花序之管形花（相當於藥物對溶劑比爲1/5)。接著， 利用纖維素濾器（AF 6 Filtrox® )將製品進行深層過濾。 可取得153克清澈深棕色液態萃取物，其固體含量爲 1.62% (莫耳/莫耳）。 實例23 ( DNA合成作用（BrdU倂入分析）） 在玻管內檢查根據實例2 i之液態萃取物抑制人類肝 -18 - 201006483 癌細胞（HepG2 )合成DNA的能力。 爲了測定細胞增生，使用5-溴-2’-去氧基-尿嘧啶核苷 (BrdU )標示及偵測套組m (羅氏應用科學；德國慕尼黑 )定量新合成之DNA。BrdU爲倂入新細胞DNA之胸腺嘧 症核苷類似物[見· Gratzner，H. G· ( 1982) Science 218, 474-475]。 簡單地說，藉胰蛋白酶處理來收成人類肝癌細胞（ HepG2)並以1 0000細胞/槽之濃度接種在96槽微量盤中 參 。在37°C，5%C02下預先培養24小時後以下列濃度之根 據實例21的液態萃取物處理細胞3 0小時：0、1、3、10 及100微克/毫升。 然後，將10微升之BrdU ( 100 μΜ)加入細胞中並進 一步培育18小時。培育後，以培養介質清洗細胞3次以 去除過多之BrdU，再以乙醇固定之。在與抗BrdU抗體一 起培育前，以過氧化酶（POD)標示之，以核酸酶將DNA φ 部分分解，以使抗體接近被倂入之BrdU。清洗過量之抗 體後，加入POD受質ABTS。POD催化ABTS之分裂，製 造發色反應產物。以Safire多功能微量盤讀計（瑞士， Mannedorf，Tecan)在 405nm (參考波長在 490nm)處測 量反應產物之吸收。每槽所測得之吸收與被倂入細胞DNA 之BrdU量呈直接相關。 複製三份測量樣本分數；誤差以標準差表示（未顯示 數據）。 樣本之數據係以溶劑對照値之百分比表示，利用 -19- 201006483

GraphPad軟體（Prism，第5版，美國加州聖地牙哥）計 算IC5Q値。 結果 結果顯示出根據實例21之液態萃取物的IC5D値約7 微克/毫升（6.228至7.881微克/毫升）。因此，該液態萃 取物以劑量倚賴方式抑制人類肝癌細胞（HepG2)生長。 根據本發明之組成物可藉熟習本技藝之人士所已知之 方法配製。應使用藥學上可接受之成分。 宜經由靜脈內途徑投服，或更佳地，經由肌肉內途徑 注射。 含該活性成分之醫藥組成物亦可爲適合口服之型式。 治療用途涉及治療（亦可能預防）癌症（例如：肺癌 、肝癌及胰臟之癌症）。其他用途包括局部病症，諸如牛 皮癬、硬皮症及天皰瘡、感染性支氣管炎、包括肉瘤（諸 如卡波西氏肉瘤）、血癌、皮膚癌之癌症和其治療具體說 明於下之癌症以及AIDS。更普遍地，該組成物可用於增 生和病毒病症（尤其是那些與DNA-或RNA病毒有關者） 之療法中。對RNA病毒之作用可能爲直接作用，而對 DNA病毒及癌症之作用至少可爲進行性的作用。該藥物亦 可用於其他遺傳病症（諸如運動神經元疾病及多發性硬化 症）之療法中。 該藥物亦可用於治療其他病毒病症。例如：在SARS (嚴重急性呼吸症候群）之病例中，該病毒可爲冠狀病毒 -20- 201006483 。再者，該藥物可用於獸醫用藥中，如：在家禽之疾病中 ，諸如新城病及禽痘。 下列硏究說明藉實例4之萃取物所得到之本發明的其 他面向。 1 )硏究目的 系統4 : RNA-、DNA-及蛋白質生物合成作用 在玻管中，利用三種不同之細胞株（HePG2 :肝癌細 胞：C33-A :子宮頸癌細胞及HT 1 3 76 :膀胱癌細胞）檢査 根據實例4之萃取物對RNA-、DNA-及蛋白質生物合成作 用之影響。 系統5:細胞凋亡及膜之完整性 另外，在HepG2細胞上測試根據實例4之萃取物對誘 導細胞凋亡之影響。同時，在HepG2細胞上檢查根據實例 4之萃取物的細胞毒性（膜之完整性）。 2)材料和方法 2.1)樣本及樣本之製備方法 萃取物 說明 來源 批號 萃取物類型 VIP-E Matr’06 1003 德國 洋甘菊 Pentapharm 578-01/End; 水溶性 管形花 7.20.2006 根據實例4之製備VIP-E_Matr'06_1 003。 -21 - 201006483 2.2)分析條件 分析 細胞株 培育時間 樣本 樣本濃度 RNA-合成作用 HepG2 C33-A HT1376 24小時 VIP- E_Matr'06_1003 150/500/ 1660微克/毫升 10/50/100/ 150微克/毫升 DNA-合成作用 HepG2 C33-A HT1376 24小時 VIP- E_Matr'06_1003 150/500/ 1660微克/毫升 蛋白質-生物合成作用 HepG2 C33-A HT1376 24小時 VIP- E_Matr’06_1003 150/500/ 1660微克/毫升 細胞凋亡 HepG2 24小時 VIP- E Matr'06 1003 10/50/100/150/ 3〇〇微克/毫升 細胞调亡 HepG2 48小時 VIP- E Matr'06 1003 10/50/100/150/ 300微克/毫升 細胞毒性 (膜之完整性） HepG2 24小時 VIP- E Matr'06 1003 10, 50, 100, 150, 300微克/毫升 2. 3 )分析 2·3·3) RNA-/DNA-合成作用 在RNA-及DNA-合成作用方面，藉胰蛋白酶處理來收 成分析之細胞（HepG2 :肝癌細胞，人類；C33-A :子宮 頸癌細胞，人類及 HT 1 3 76 :膀胱癌細胞，人類）並以 1 000 0細胞/槽之濃度接種在96槽微量盤中。以所需濃度 之樣本處理細胞後，將盤在37t，5%C02下培育2小時 。在進一步培育24小時之期間，在RNA合成作用方面， 以5-3H-尿嘧啶核苷（1微居里/毫升）（Perkin Elmer )脈 衝處理細胞，在DNA合成作用方面，以6-3Η-胸腺嘧啶核 -22- 201006483 苷（1微居里/毫升）（Perkin Elmer )脈衝處理細胞。以 PBS清洗細胞並以甲醇固定5分鐘2次。藉0.3N TCA將 蛋白質沈澱下來。清洗步驟後，加入150微升之0.3N NaOH共15分鐘，以溶解細胞。以不加入細胞之樣本進行 陰性對照組t ( 0 )實驗。 爲了偵測在RNA合成作用中所倂入之5-3H-尿嘧啶核 苷及在DNA合成作用中倂入之6-3H-胸腺嘧啶核苷，將樣 本轉移入含有閃燦體（scintillation cocktail)之閃爍計數 管中。在Tri-Carb 19 00 TR液體閃爍計數器（美國Packard 公司）中進行定量。 在分析條件下藉由測定放射標示（dpm )之量來測量 數種樣本濃度之效果。以陽性對照組數値之百分比表示劑 量相關數値。複製二份測量樣本分數；誤差係以與平均値 之差値表示。 考量來自DNA-合成分析之結果計算特殊細胞性5·3Η-φ 尿嘧啶核苷之倂入比例（％ )。以DNA-合成係數除相關 之合成作用數値（％ )。 2.3.4 )蛋白質生物合成作用 在蛋白質生物合成分析方面，藉胰蛋白酶處理來收成 分析之細胞（HepG2:肝癌細胞，人類；C33-A:子宮頸 癌細胞，人類及HT1 376:膀胱癌細胞，人類）並以1 0000 細胞/槽之濃度接種在96槽盤中。以所需濃度之樣本處理 細胞後，將盤在37°C，5%C02下培育2小時。在進一步 -23- 201006483 培育24小時之期間內，以L_[3,4,5-3H(N)]-白胺酸（1微 居里/毫升）（Perkin Elmer )脈衝處理細胞。以PBS清洗 細胞二次並以RIPA緩衝劑將細胞溶解，再在冰上培育15 分鐘。將溶胞化物轉移入一管中。加入250微升之冰冷 TC A ( 20% )並將樣本再在冰上進一步培育15分鐘。在 lOOOOxg，4°C下離心20分鐘後，去除上清液，將小九重 新懸浮在250微升TCA ( 5% )中並再度離心。將所收得 之各樣本的溶胞化物再懸浮於250微升NaOH(0,2N)中 並在50°C下加熱2分鐘。以不加入細胞之樣本進行陰性對 照組t ( 0 )。 爲了偵測所倂入之L-[3,4,5-3H(N)]-白胺酸，將樣本 轉移入含有閃爍體之閃爍計數管中。在Tri-Carb 1900 TR 液體閃爍計數器（美國Packard公司）中進行定量。 在分析條件下藉由測定放射標示（dpm )之量來測量 數種樣本濃度之效果。以陽性對照組數値之百分比表示劑 量相關數値。複製四份測量樣本分數，誤差係以標準差表 不° 考量來自 DNA-合成分析之結果計算特殊細胞性L-[3,4,5-3以^]-白胺酸之倂入比例（％)。以增生係數除相 關之合成作用數値（％)。 2-3.5 )細胞凋亡分析 藉胰蛋白酶處理來收成HepG2細胞（肝癌細胞，人類 )並以在100微升中之1 0000細胞/槽濃度接種在96槽微 201006483 量盤中。24小時後，加入20微升樣本及80微升新鮮介質 (總體積200微升）。將盤進一步培育24小時，且在另 外之實驗中培育48小時。將盤在200xg下離心10分鐘後 ，丟棄上清液，將小九在室溫下，200微升之溶解緩衝劑 中溶解30分鐘。最後，將溶胞化物在20 0xg下離心10分 鐘。以溶劑取代樣本進行溶劑對照組（=陰性對照組）實 驗。在37°C，5%C02下，在培育箱中進行接種及培育。 在玻管中藉細胞死亡偵測ELISAplus套組（羅氏，目 錄編號：1 1 774 425 001 )根據供應者之建議測定溶胞化 物上清液中與胞質性組織蛋白聯結之DNA片段（單-及寡 核體）。 藉微量盤讀計（TECAN Infinite M200 )測量在波長 λ = 405ηιη及參考波長λ =490nm處之吸收。釋入細胞質之 單-及寡核體的特殊增濃因子之計算方式如下： 增濃因子=樣本之吸收/對應之陰性對照組的吸收 複製二份以測量樣本分數，誤差係以與平均値之差値 表示。 2.3.6) LDH-細胞毒性分析（壞死作用之誘導） LDH-細胞毒性分析（膜之完整性/壞死作用之誘導） :在HepG2細胞（肝癌細胞，人類）上測試細胞毒性。將 細胞以每槽10000細胞之濃度接種在96槽盤中一整夜。 加入20微升爲指定濃度之相關樣本和溶劑對照組以及80 微升新鮮介質（總體積200微升）。在37°C及5%C02下 -25- 201006483 ，在培育箱中進行接種及培育。培育24小時後，藉LDH-細胞毒性分析套組（Bio Vision，#K3 1 1 -400，美國加州） 測量膜之完整性。 藉由測量在樣本之影響下釋入介質中之胞質性乳酸脫 氫酶（LDH )的活性來測定細胞之膜完整性。測定從四錯 鹽ΙΝΤ (作爲受質）所製造之甲臍來直接測量該酶之活性 。藉微量盤讀計（TECAN Infinite Μ200 )在測定波長λ = 49〇nm處之光學密度（OD)來測量甲臍之量。 在各測試濃度方面，將背景（帶有樣本但無細胞之分 析混合物）之OD値自以細胞測得之OD測量値減除。將 〇D49G値轉換成百分比値，100%之細胞毒性讀値相當於以 溶劑（三通（triton ) X-100)溶解之細胞的測量値，0%之 細胞毒性讀値相當於僅與溶劑一起培育之細胞的測量値。 複製二份來進行光學測量。誤差係以與平均値之差値表示 4)摘要 在DNA-、RNA-及蛋白質生物合成作用方面，根據實 例4之萃取物顯示出下列效果：DNA合成作用係以劑量倚 賴方式受到遏制，但在非常高之劑量下RNA合成作用仍 然完整且蛋白質生物合成作用僅些微受影響，或者，若套 用在增生細胞之量方面甚至是增加（第3圖）。此效果對 所有三種在非細胞毒性劑量範圍內之細胞株很明顯且可被 解釋爲細胞止息及可能之分化作用的徵兆。所有測試之癌 -26- 201006483 細胞，HepG2肝癌細胞、HT1376膀胱癌細胞及C33A子宮 頸癌細胞均顯示出此現象。 在接著開始之以HepG2細胞進行之區別細胞凋亡及壞 死（藉LDH滲漏及失去細胞膜之完整性指明）的實驗中 ，24小時後，吾人測得即使在最高之測試劑量中亦偵測不 到細胞凋亡被誘導出。根據實例4之萃取物未顯示出任何 作用，無細胞凋亡亦無細胞毒性。 因此，決定將細胞培育48小時以進行另外之實驗。 有趣的是，48小時後發現亦未誘導出細胞凋亡。 從第13圖中明顯得知根據實例7之萃取物顯示出從3 微克/毫升之濃度開始全面抑制第Π型拓撲異構酶。低於3 微克/毫升之濃度未偵測到抑制作用。 甜沒藥（α-Bisabolol)(此爲一種洋甘菊植物之精油 的主要成分）在所有測試濃度下均不會影響第Π型拓撲異 構酶活性。 德國洋甘菊之精油幾乎不會抑制第Π型拓撲異構酶活 性。在30微克/毫升此相當高的濃度下僅能觀察到不完全 之抑制作用。 在本發明之目的中，“含有（containing ) ”或“包 含（comprising) ”等詞應指亦可存有其他額外之化合物 或成分，然而“組成”應指除了明確提出者外無其他額外 之化合物或成分存在。 -27- 201006483 5)參考書目 1 Toshie H., Noriko N.M., Yoshiyuki A., Mittsuhiro N., Toshiro Y., Naohito 0. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) Regulates Cytokine Induction by 1,3-P-D-Glucan SCG in DBA/2 Mice in vitro. J. of IFN and Cytokine Research 24:478-489 (2004). 2 Golenbock D.T., Hampton R.Y., Qureshi N., Takayama K., Raetz C. R. H. (1991)

Lipid A-like molecules that antagonize the effect of endotoxins on human monocytes. J. Biol. Chem. 266 (29): 19490-498. 3 Garrelds I.M., van Hal P. Th. W., Haakmat R. C., Hoogsteden H. C., Saxena P. R.,

Zijlstra F. J.: Time dependent production of cytokines and eicosanoides by human 參 monocytic leukaemia U937 cells; effects of glucocorticosteroids. Mediators of Inflammation: 8, 229-235 (1999). 4 Lindl T. (2000) Zell- und Gewebekultur: Einfiihrung in die Grundlagen sowie ausgewdhlte Methoden und Anwendungen. 4.dberarb. und erw. Auflage - Heidelberg;

Berlin: Spectrum, Akad. Verlag (ISBN 3-8274-0803-2). 5 Decker T. & Lohmann-Matthes M.L. (1988) A quick and simple method for the quantification of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor activity. J. Immunol Methods 15 (1): 61-69. 下列部分係對圖形做簡單之描述： _ 【圖式簡單說明】 第1圖關於系統4並顯示根據實例4之萃取物對 HepG2細胞中DNA合成作用（A) 、RNA合成作用（B) 及蛋白質生物合成作用（C)之效果。所使用之萃取物濃 度爲150、500及166 0微克/毫升。 第2圖類似於第1圖，但使用之萃取物濃度爲10、50 、100及150微克/毫升。 -28- 201006483 第3圖關於系統4並顯示根據實例4之萃取物對RNA 合成作用（A)及蛋白質生物合成作用（b)之效果，考慮 第2(A)圖中所示之結果來進行計算。 第4圖關於系統4並顯示根據實例4之萃取物對

HT 1 3 76細胞中DNA合成作用（A) 、RNA合成作用（B )及蛋白質生物合成（C)之效果。所使用之萃取物濃度 爲150、500及1660微克/毫升。 _ 第5圖關於系統4並顯示根據實例4之萃取物對C3 3- p A細胞中DN A合成作用（A) 、RNA合成作用（B )及蛋 白質生物合成（C)之效果。所使用之萃取物濃度爲150 、500及1660微克/毫升。 第6圖關於系統5並顯示根據實例4之萃取物在 HePG2細胞中24小時後對誘導細胞凋亡之作用。所使用 之萃取物濃度爲10、50、100、150及300微克/毫升。 第7圖關於系統5並顯示根據實例4之萃取物在 @ HePG2細胞中24小時後對誘導細胞毒性（膜完整性）之 作用。所使用之萃取物濃度爲10、50、100、150及300 微克/毫升。 第 8圖關於系統5並顯示根據實例4之萃取物在 HePG2細胞中48小時後對誘導細胞凋亡之作用。所使用 之萃取物濃度爲10、50、100、150及3 00微克/毫升》 第9圖關於實例10並顯示根據實例4之萃取物在 HePG2細胞中6、24及48小時後對誘導鳥胺酸脫羧酶表 現之作用。所使用之萃取物濃度爲30、100及150微克/ -29- 201006483 毫升。 第10圖關於實例11並顯示根據實例7之萃取物在不 含細胞之分析中對抑制第I型拓撲異構酶之作用。所使用 之萃取物濃度爲0.3、1、3、10及30微克/毫升。使用喜 樹鹼作爲陽性對照組。 第11圖關於實例12並顯示根據實例7、8及9之萃 取物在不含細胞之分析中對抑制第Π型拓撲異構酶之作用 。所使用之萃取物濃度爲0.3、1及3微克/毫升》使用依 托泊苷作爲陽性對照組。 第12圖關於實例13並顯示根據實例4之萃取物在 HepG2細胞中對誘導細胞週期遏止於S-相的作用。所使用 之萃取物濃度爲10、50、1〇〇及150微克/毫升。使用喜 樹鹼作爲陽性對照組。 第13圖關於實例12並顯示根據實例7之萃取物在不 含細胞之分析中對抑制第11型拓撲異構酶之作用。所使用 之萃取物濃度爲0.3、1、3、10及30微克/毫升。使用依 托泊苷作爲陽性對照組。爲了比較，使用0.3、3及30微 克/毫升之α -沒藥帖醇或0.3、3及30微克/毫升之德國洋 甘菊的精油。 -30-

Claims (1)

1. 201006483 七、申請專利範圍： l 一種供治療異常增生及/或病毒病症之組成物，該 組成物包含至少一種洋甘菊植物及/或至 少一種蓍草植物之水性及/或有機萃取物，唯 其爲治療該異常增生病症，排除洋蓍草（ millefolium ) (L.)之單/單一萃取物，且唯其爲治療該病 毒病症，排除德國洋甘菊（Λ/α ir/caria cAcrwo/wi//fl) ( L. φ )之單/單一萃取物。 2_如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物 係由至少一種洋甘菊植物及/或至少一種蓍草植物之水性 及/或有機萃取物及偶爾地至少一種藥學上及/或皮虜學上 可接受之佐劑所組成。 3.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該異常增 生病症之治療包含異常增生之哺乳動物細胞（尤其是癌細 胞）同步化及S相遏止。 φ 4.如申請專利範圍第3項之組成物，其中該同步化 包含誘導鳥胺酸脫羧酶及/或抑制拓撲異構酶（尤其是第Π 型拓撲異構酶）。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， 其中該有機萃取物可藉由經醇（尤其是具有2至6個碳原 子之醇，其中乙醇爲特佳者）或酮（尤其是具有3至5個 碳原子之酮，其中丙酮爲特佳者）萃取而得。 6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， 其中該萃取物可得自洋甘菊植物（尤其是管形花（Flores -31 - 201006483 tubiformis))之不含芦菜素（apigenin)及芽菜素-糖甘 之花頭及/或可得自蓍草植物（尤其是管形花）之草及/或 花頭。 7.如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物’ 其中該洋甘菊植物係選自如下群體： -母菊屬（Mfliricaria )品種，尤其是 -德國洋甘菊（Mairicflrr/α recrwifia ) 同花母菊（Μαirz'carz’fl DC_ ) ❹ -春黃菊屬品種，尤其是 -白花春黃菊 C Anthemis nobilis L.) -田春黃菊（dwi/ie/wi's arvewifi ) _ 臭春黃菊（coiw/α Ζ·) -春黃菊（Anthemis tinctoria L.) -摩洛哥洋甘菊（7ΜΜ/ίί·£ΤίΖΜ//·5 5r.-5/.cfe Μα f r e ) •岬角甘菊(Erioc ephalus punctulatus DC.)， 其中德國洋甘菊爲特佳者。 _ 8 ·如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， 其中將被萃取之植物部分係先經水蒸汽蒸餾以移出精油。 9_如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， 其中初級液態水性及/或有機萃取物係經分子量過濾以收 集分子量小於1 0000道耳吞之成分並移除分子量超過 1 〇〇〇〇道耳吞之成分，使得所得之液態萃取物部分偶爾經 處理成乾燥粉末。 1 〇.如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， -32- 201006483 其中初級液態水性及/或有機萃取物係經分子量過濾以收 集分子量超過1 0000道耳吞之成分並移除分子量小於 1 0000道耳吞之成分’使得所得之液態萃取物部分偶爾經 處理成乾燥粉末。 1 1 ·如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， 其含有至少一種藥學上及/或皮膚學上可接受之佐劑。 1 2.如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， φ 其中該治療包含同時或依序投服該組成物及至少一種抗腫 瘤劑。 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之組成物，其中該治療 包含 -在至少2天（宜爲至少5天）期間投服該組成物以 使該異常增生之哺乳動物細胞（尤其是該癌細胞）同步化 並於S相中遏止，及然後 -在開始投服至少一種抗腫瘤劑前，停止該投藥至少 φ 6小時，宜爲至少2 4小時， 其中 -在投服該抗腫瘤劑期間，不投服該組成物，且 -在該抗腫瘤劑於隨後之洗出相期間，亦不投服該組 成物。 1 4.如申請專利範圍第1 3項之組成物，其中該治療 週期係重複進行至少2次，宜爲至少3次。 1 5 .如申請專利範圍第1 2項之組成物，其中該組成 物係由至少一種洋甘菊植物及/或至少一種蓍草植物之水 -33 - 201006483 性及/或有機萃取物和至少一種抗腫瘤劑及偶爾地至少一 種藥學上及/或皮膚學上可接受之佐劑所組成。 16. 如申請專利範圍第12項之組成物，其中該抗腫 瘤劑係天然、半合成或合成來源者。 17. 如申請專利範圍第12項之組成物，其中該抗腫 瘤劑係選自如下群體： - 抗代謝劑， - DNA烷基化劑， - 有絲分裂抑制劑，及 - DNA嵌入劑。 18. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， 其中該初級萃取物含有至少一種具有脂質基團之水溶性污 染物，該脂質基團係藉由下列步驟移除： (i) 令該組成物與親脂性成分接觸，該親脂性成分 係與污染物形成複合物； (ii) 移除具有大於步驟（i)中所形成之複合物的粒 子大小之物質的第一移除步驟；及 (iii) 移出步驟（i)中所形成之複合物的第二移除 步驟。 19. 如申請專利範圍第18項之組成物，其中該污染 物爲一種內毒素，其宜選自構成革蘭氏陰性細菌之細胞壁 的片段或構成革蘭氏陰性細菌之細胞壁的分子之片段，例 如選自具有蛋白質基團之脂多糖或碳水化合物，尤其是具 有至少一個脂鏈之糖蛋白。 -34- 201006483 2〇·如申請專利範圍第ι9項之組成物，其中該內毒 素之分子量超過10000道耳吞，宜爲超過5000道耳呑， 更宜爲超過1000道耳吞且最宜爲超過500道耳吞。 2 1.如申請專利範圍第1 §項之組成物，其中該親脂 性成分爲油，宜爲脂肪油。 22. 如申請專利範圍第18項之組成物，其中該步驟 (111)包含超濾作用，其宜使用濾孔大小介於〇 〇〇1至 & 0.02微米（更宜爲0.00 1至〇.01微米）之濾器。 23. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， 其中該萃取物不含或實質上不含內毒素，使得該萃取物含 有不超過100EU/毫升（宜爲不超過50EU/毫升，例如不超 過25EU/毫升）之內毒素量（根據歐洲藥典之內毒素單位/ 毫升）。 24. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物， 其中該治療係藉由注射該組成物或經口、直腸或局部投藥 實施。 25. —種包含至少一種洋甘菊植物及/或至少一種蓍 草植物之水性及/或有機萃取物之組成物於製備供治療異 常增生及/或病毒病症之藥物上之用途，唯其爲治療該異 常增生病症，排除洋蓍草之單/單一萃取物，且唯其爲治 療該病毒病症，排除德國洋甘菊之單/單一萃取物。 26. 如申請專利範圍第25項之用途，其中該組成物 爲如申請專利範圍第2至24項中任一項所定義之組成物 -35-