TW200949249A

TW200949249A - Methods, agents and kits for the detection of cancer

Info

Publication number: TW200949249A
Application number: TW098111785A
Authority: TW
Inventors: Kuo-Jang Kao; Ta-Yuan Chen; To-Yu Huang; Andrew T Huang
Original assignee: China Synthetic Rubber Corp
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2009-12-01
Also published as: US20110159498A1; EP2268838A1; AU2009234444A1; CA2720563A1; JP2011516077A; WO2009126271A1

Description

200949249 v 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於診斷個體中癌症之方法，及對患有癌症之個體提供預後的方法。本發明亦係關於癌症之診斷及預 k 後套組。

W 【先前技術】 . 癌症（一組特徵在於惡性細胞不受控之生長及擴散之 Ο 疾病）為全世界人類死亡及發病的重要原因，且為美國之國家經濟負擔。如同所有活細胞一樣，癌細胞之行為由大量不同基因之表現控制。差異地表現於癌細胞與正常細胞之間或兩種 . 不同癌細胞類型之間的基因共同構成基因表現譜，其可用於檢測個體中癌症之存在、分類腫瘤亞型及/或預測患者之臨床結果。此外’該等基因之產物（例如mRNA、蛋白質）提供治療之潛在標靶。成功地治療癌症部分取決於個體中癌症之早期檢測及诊斷。因此’需要鑑別基因表現譜，可依賴於該等基因表現β普在早期精確檢測及診斷各種癌症。此外，另外需要包括為許多不同癌症類型通用之基因且因此可用於篩檢大量心者群體存在癌症的基因表現譜。亦需要更有效之鑑別癌症之有用基因表現譜之方法。【發明内容】 3 200949249 本發明在一具體實例中涵蓋一種診斷個體是否患有癌症之方法。該方法包含在個體之樣本中檢測過度表現於癌症中之基因之亞群的表現量。根據本發明，亞群中之基因係選自此項技術中稱為以下各者之基因之群：MELK、 PLVAP、TOP2A、NEK2、CDKN3、PRC1、ESM1、PTTG1、 TTK、CENPF、RDBP、CCHCIU、DEPDC卜 TP5313、CCNB2、 CAD、CDC2、HMMR、STMm、HCAP-G、MDK、RAD54B、 ASPM、HMGA卜 SNRPC、IGF2BP3、SERPINm、COL4A1、 LARP1 ' LRRC1 ' FOXM1 ' CDC20' UBE2M' DNAJC6' FEN1 > ASNS、CHEK卜 KIF2C、AURKB、NPEPPS、KIF4A、E2F8、 EZH2、ZNF193、ILF3、EHMT2、SF3A2、NPAS2、PSME3、 INPPL1、BIRC5、SULT1C1、NSUN5B、HN1 及 NUSAP1。基因亞群在個體之樣本中相對於對照組表現量增加表明該個體患有癌症。在另一具體實例中，本發明係關於一種對患有癌症之個體提供預後的方法，其包含在個體之樣本中檢測一或多個選自由 PRC1、CENPF、RDBP、CCNB2 及 RAD54B 組成之群之基因的表現量，及將樣本中該基因之表現量與對照組進行比較。PRCn、CENPF、RDBP、CCNB2 及/或 RAD54B 在個體之樣本中相對於對照組表現量增加表明不良預後 (例如轉移風險增加）。在一特定具體實例中，癌症為肝細胞癌、鼻咽癌或乳癌。在另一具體實例中，本發明係關於一種對患有癌症之個體提供預後的方法，其包含在個體之樣本中檢測一或多 200949249 個選自由CDC2、CCHCR1及HMGA1組成之群之基因的表現量，及將樣本中該基因之表現量與對照組進行比較。 CDC2、CCHCR1及/或HMGA1在個體之樣本中相對於對照組表現量增加表明不良預後（例如較短之存活）。在一特定 k 具體實例中，癌症為肝細胞癌、鼻咽癌或乳癌。 ' 在一具體實例中，本發明亦提供一種用於診斷個體是否患有癌症之套組，其包含一組能夠檢測至少約二十個選 . 自由此項技術中稱為以下各者之基因組成之群之基因的表〇現量的探針：MELK、PLVAP、TOP2A、NEK2、CDKN3、 PRC1、ESM1、PTTG1、TTK、CENPF、RDBP、CCHCR1、 DEPDCM、TP5313、CCNB2、CAD、CDC2、HMMR、STMN1、 HCAP-G、MDK、RAD54B、ASPM、HMGA1、SNRPC、 IGF2BP3 ' SERPINH1 ' COL4A1 ' LARP1 > LRRC1 ' FOXM1 ' CDC20、UBE2M、DNAJC6、FEm、ASNS、CHEIU、KIF2C、 AURKB、NPEPPS、KIF4A、E2F8、EZH2、ZNF193、ILF3、 EHMT2、SF3A2、NPAS2、PSME3、INPPL1、BIRC5、 © SULT1C1、NSUN5B、HN1 及 NUSAP1。在一特定具體實例中，探針為與該等基因之RNA (例如mRNA )產物雜交之核酸探針。在另一具體實例中，探針為與由該等基因所編碼之蛋白質結合之抗體。在另一具體實例中，本發明亦提供一種用於對患有癌症之個體判定預後（例如轉移風險）的套組，其包含能夠檢測一或多個選自由PRC1、CENPF、RDBP、CCNB2及 RAD5 4B組成之群之基因之表現量的探針。 5 200949249 在另一具體實例中，本發明另外提供一種用於對患有癌症之個體判定預後（例如存活）之套組，其包含能夠檢測一或多個選自由PRC1、CDC2、CCHCR1及HMGA1組成之群之基因之表現量的探針。在另一具體實例中，本發明係關於一種確定癌症基因表現譜之方法。該方法包含檢測基因在同一個體 (individual，subject )之癌性與非癌性樣本中之表現，及鑑別在癌性與非癌性樣本之間差異表現之基因。根據該方法，在癌性樣本與非癌性之間差異表現之基因包括於該癌症之基因表現譜中。在一另一具體實例中，本發明係關於一種診斷個體是否患有癌症之方法。該方法包含在個體之樣本中檢測於癌症中表現不足之基因之亞群的表現量。根據本發明，亞群中之基因係選自此項技術中稱為以下各者之基因之群： NAT2、CD5L、CXCL14、VIPR卜 CCL14/15、FCN3、CRHBP、 GPD 卜 KCNN2、HGFAC、FOSB、LCAT、MARCO、CYP1A2、 FCN2及DPT。基因亞群在個體之樣本中相對於對照組之表現量減少或無表現表明該個體患有癌症。在另一具體實例中，本發明提供一種用於診斷個體是否患有癌症之套組，其包含一組能夠檢測至少約五個選自由此項技術中稱為以下各者之基因組成之群之基因的表現量的探針：NAT2、CD5L、CXCL14、VIPR1、CCL14/15、 FCN3、CRHBP、GPD1、KCNN2、HGFAC、FOSB、LCAT、 MARCO、CYP1A2、FCN2及DPT。在一特定具體實例中， 200949249 探針為與該等基因之RNA(例如mRNA)產物雜交之核酸探針。在另一具體實例中，探針為與由該等基因所編碼之蛋白質結合之抗體。 ‘ 本發明所提供之癌症之診斷及預後方法及套組部分基、於通用基因表現講或共同贅生性特徵之發現，該通用基因表現譜或共同贅生性特徵能夠冑具有許多$同癌症類型及亞型的組織樣本與相應正常組織樣本區別，及對多種癌症鲁 _型預測臨床存活結果。不同於先前已報導之藉由棄集來自文獻中各種報導之資訊加以判定且通常基於單一癌症且/ 或限於癌症之特定特徵（例如增造、賛生性轉型）之許多癌症基因表現谱（Whitfield ml等人，_請c 心99-106 (2006); Rhodes DR 等人，Pr〇c jdu 、；0/:9309-9314 (2004广參見圖33)，本文所述之共同贅生 &特徵已經貫驗確定且已使用系統性研究展示對於癌症通用0 【實施方式】定義如本文所用之「基因表現（gene expression)」係指將土因中所編碼之資訊轉譯為基因產物（例如rnA、蛋白質）所表現之基因包括轉錄為隨後轉譯為蛋白質之RNA (例如mRNA )的基因，以及轉錄為不轉譯為蛋白質之非編碼功能RNA分子（例如轉移RNA (⑽八）、核糖體rna (rRNA )、微RNA、核糖核酸酶）的基因。 7 200949249 表現量（Level of expression，expressi〇nlevei)」或「表現強度（expression intensity )」係指樣本或參考標準中給定基因所編碼之一或多種產物（例如mRNA、蛋白質）之含量（例如量）。如本文所用之「差異表現（differentially叫⑽㈣或 differenual expressi〇n )」係指兩個樣本（例如兩個生物樣本）之間或樣本與參考標準之間的基因表現量之任何統計顯著之差異（ρ<0·05)。可使用適當t_檢驗（例如單樣本卜檢驗、雙樣本t-檢驗、韋爾奇氏t_檢驗（Welch，s t )) 或熟習此項技術者已知之其他統計檢驗來判定兩個樣本之間的表現差異是否為統計顯著的。如本文所用之短語「過度表現於癌症中之基因的亞群 (subset of genes 〇verexpressed比⑽…）」係指兩個或兩個以上基因之組合，該等基因中之每—者在癌症樣本中相對於合適對照組（例如非癌性組織或細胞樣本參考標準）呈現提高或增加之表現量，其中基因表現量之提高或增加為統計顯著的（p<0.05)〇可使用適當卜檢驗（例如單樣本 (檢驗、雙樣本t-檢驗、韋爾奇氏t-檢驗）或熟習此項技術者已知之其他統計檢驗判定基因在癌症樣本中相對於對照組之表現增加是否為統計顯著的。過度表現於癌症中之基因可為（例如）已知或已先前確定過度表現於癌症中的基因。如本文所用之短語「於癌症中表現不足之基因的亞群 (subset of genes underexpressed in cancer)」係指兩個或兩 200949249 ❹

個以上基因之紐合’該等基因令之每一者在癌症樣本中相對於合適對照組（例如非純組織或細胞樣本，參考標呈現降低或減j之表現量中基因表現量之降低或減少為統計顯著的。在—些具體實例中，降低或減少之基因表現量可能為完全無基因表現或表現量為零。可使用適當t-檢驗（例如單樣本t_檢驗、雙樣本檢驗、韋爾奇氏t-檢驗）或熟習此項技術者已知之其他統計檢驗判定基因在癌症樣本中相對於對照組之表現減少是否為統計顯著的。於癌症中表現不足之基因可物如）已知或已先前確定於癌症中表現不足的基因。基因表現譜（gene expressi〇n pr〇fUe)」或「表現譜 (expression profile )」係指具有與特定生物學活性（例如細胞增殖、細胞週期調節、轉移）、細胞類型、疾病狀態（例如癌症）、細胞分化或病狀之狀態相關之表現量的一組基因。共同贅生性特徵（commonneopusticsignawe)」或「C N S」係指與許多不同常見癌症相關（例如診斷許多不同常見癌症）之基因表現譜。如本文所用之「腫瘤特異性基因（Tum〇r specific gene)」為具有由Affymetrix微陣列分析組（mas) $ 〇與 DNA晶片分析器（dChip)軟體應用特性化為「存在」於癌症（例如肝細胞癌）組織樣本中且「不存在」或「少量存在（marginal)」於鄰近非腫瘤組織（例如正常肝組織）樣本中之表現量的基因。 200949249 如本文所用之「非腫瘤組織特異性基因（non-tumor tissue-speciflc gene)」為具有由MAS 5 〇與dchip軟體應用特性化為「不存在」或「少量存在」於癌症（例如肝細胞 :σ )、.且織樣本中且「存在」於鄰近非腫瘤組織（例如正常肝組織）樣本中之表現量的基因。如本文所用之術語「嚴格度（stringency )」、「嚴格度過濾 ^ (Stringencyfilter)」或「嚴格程度（Stdngency ievel)」 ''曰在/、1 8個成對jjcC；與鄰近非腫瘤肝組織樣本中，直接對應於呈現藉由微陣列表現譜分析，如由Affyme⑴X微陣列分析組（MAS) 5.〇與DNA晶片分析器（dchip)軟體應用使用#在」與「不存在」或「少量存在」狀態確定之特定基因或基因群之顯著差異表現的成對Hcc與鄰近非腫瘤肝組織樣本之數目的數目。因此，本文所用之「嚴格度」、「嚴格度過濾器」或「嚴格程度」之值介於十八之高嚴格度至一之低嚴格度之範圍内。術語「探針組（probe Set)」係指陣列（例如微陣列）上與相同標靶基因或基因產物互補之探針。探針組可由一或多個探針組成。如本文所用之術語「樣本（sample)」係指表現對於給定癌症類型而言呈現癌細胞存在於樣本中時與癌細胞不= 在於樣本中時之差異表現量之基因的生物樣本（例如組織樣本、細胞樣本、流體樣本）。如本文所用之「鄰近樣本（adjacent Sampl〇」、「鄰近組織樣本（adjacent tissue sample)」、「成對樣本（㈣㈣ 200949249 amples)」或成對組織樣本（paired tissue samples )」係才曰兩個或兩個以上存在於個體之相同組織或器官中或自個體之相同組織或器官分離之生物樣本。如本文所用之術g吾「寡核普酸（〇lig〇nucle〇tide )」係才曰長度為約5個至約1 50個核苷酸之核酸分子（例如RNA、 DNA )。寡核苷酸可為天然存在之募核苷酸或合成之募核苷酸券核普酸可藉由胺基磷酸醋法（Beaucage及Carruthers,

Tetrahedron Lett. 22:1859-62，1981 )或藉由三酯法 (Matteucci 等人，j_ Am chem. Soc_ 103:3185, 1981 )或藉由此項技術中已知之其他化學方法來製備。如本文所用之「探針寡核苦酸（pr〇be oligonucleotide )」或^木針寡去氧核苦酸（probe oligodeoxynucleotide )」係指能夠與標靶寡核苷酸雜交之募核苷酸。「標乾募核苷酸（Target oligonucleotide )」或「標靶募去氧核苦酸（target oligodeoxynucleotide)」係指欲檢測之分子（例如經由雜交檢測）。「遠處轉移（Distant metastasis )」係指自初始（亦即原發性）腫瘤擴散至遠處器官或遠處淋巴結之癌細胞。如本文所用之「可檢測標記（Detectable label)」係指月夠直接或間接特異性檢測且因此可用於區別包含該可债測標記之分子與不包含該可偵測標記之分子的任何部分。短6吾「特異性雜交（specifically hybridize)」係指在嚴格條件下雙鏈體中兩個互補核苷酸序列（例如Dna、RNA 或其組合）之特異性締合。雙鏈體中兩個核酸分子之締合 11 200949249 由於互補鹼基對之間的氫鍵結而發生。 · 「嚴格條件（Stringent condition)」或「嚴格度條件 (stringency condition )」係指兩個互補核酸分子可雜交之條件組。然而’嚴格條件不允許兩個不互補之核酸分子（兩個具有小於70%之序列互補性的核酸分子）雜交。 - 如本文所用之「低嚴格度條件（l〇w stringenCy . condition)」包括（例如）在約45t：下在6χ氯化鈉/擰檬酸鈉（SSC )中雜交，繼而至少在5〇。〇(對於低嚴格度條件洗滌溫度可升高至55°C )下在〇.2xSSC，0_1% SDS中洗滌兩 ❹ 次0 中等嚴格度條件（Medium stringency condition)」包括（例如）在約45°C下在6xSSC中雜交，繼而在60°C下在 0.2xSSC，0.1% SDS中洗滌一或多次。如本文所用之「局嚴格度條件（high stringency condition)」包括（例如）在約45。〇下在6xSSC中雜交，繼 · 而在65°C下在0.2xSSC，〇.i〇/0 SDS中洗滌一或多次。極南嚴格度條件（Very high stringency condition )」 Ο 包括（但不限於）在65。〇下在〇·5Μ填酸鈉，7% SDS中雜交’繼而在65°C下在〇.2xsSC，1% SDS中洗滌一或多次。如本文所用之術語「多肽（p〇lypeptide)」係指具有任何長度之胺基酸之聚合物且涵蓋蛋白質、肽及寡肽。如本文所用之術語「抗體（antib〇dy )」係指對標把、抗原或抗原決定基具有親和力之多肽，且包括天然存在及工程化之抗體。術語「抗體」涵蓋多株抗體、單株抗體、 12 200949249 人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、靈長化抗體、鑲邊 (veneered )抗體及單鏈抗體以及抗體片段（例如Fv、fc、 Fd、Fab、Fab’、F(ab')、scFv、scFab、dAb )。（參見（例如） Harlow 等人，心"办0山·j 少 Cold Spring

Harbor Laboratory, 1988 ) 0 如本文所疋義之術s吾「抗原結合片段（antigen binding fragment )」係指抗體之含有一或多個cdr且自身對抗原決疋子具有親和力的一部分。非限制性實例包括Fab片段、 Ο

F(ab)'2片段、重鏈_輕鏈二聚物及單鏈結構，諸如完整輕鏈或完整重鏈。如本文所用之「特異性結合（specifically bind)」係指以大於探針結合非標靶蛋白之親和力，至少約5倍、較佳至少約10倍之親和力（例如結合親和力）與標靶蛋白（例如CNS基因之蛋白質產物）結合的探針（例如抗體、適體「標靶蛋白（Target protein )」係指欲檢測之蛋白質（例如使用包含可檢測標記之探針檢測）。如本文所用之「個體（subject)」係指哺乳動物。術語「個體」因此包括（例如）靈長類（例如人類）、母牛、綿羊、山羊、馬、犬、猫、兔、天竺鼠、大鼠、小鼠或其他牛類、羊類、‘馬類、犬類、貓類、齧齒動物或鼠類物種。在-較佳具體實例中，個體為人類。合適個體之實例包括 (但不限於）患有癌症（例* HCC)或具有產生癌症（例如HCC)之風險的人類患者。除非另作定義，否則本文所用之所有技術及科學術語 13 200949249 具有一般熟％此項技術（例如細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術及生物化學）者通常所瞭解之相同意義。使用分子、遺傳及生物化學方法（通常參見Sambrook等人，

Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版（1989)

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ' N.Y.及 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology -(1999)第4版，John Wiley & Sons，Inc.，該等文獻以引用的方式併入本文中）及化學方法中之標準技術。如本文所述，包括在成對肝細胞癌（HCC )與正常肝組 0 織之間差異表現之基因的基因表現譜可充當能夠區分數種不同癌症類型與相應正常組織之共同贅生性特徵 (CNS」）。如本文所述，具有55個基因之共同贅生性特徵能夠區別代表六種主要癌症類型及2〇種癌症亞型中之19 種的組織樣本與相應正常組織樣本。此外，CNs中之基因亞群與三種不同癌症類型（HCC、鼻咽癌及乳癌）之不良預 - 後相關’ 1¾等預後包括較短之存活或增加之遠處轉移風險。診斷及預後方法 ❹ 本發明在一具體實例中涵蓋一種診斷個體是否患有癌症之方法。該方法包含在個體之樣本中檢測過度表現於癌症（例如腫瘤）中之基因之亞群的表現量。亞群基因在個體之樣本中相對於對照組表現量增加表明該個體患有癌症0 來自過度表現於癌症中之基因亞群可包括包括以下55個基因之共同贅生性特徵兩個或兩個以上之基因的任何組 14 200949249 合：MELK、PLVAP、TOP2A、NEK2、CDKN3、PRC卜 ESMl、 PTTG1 > TTK> CENPF' RDBP' CCHCR1 ' DEPDC1 ' TP5313 ' CCNB2、CAD、CDC2、HMMR、STMN1、HCAP-G、MDK、 RAD54B、ASPM、HMGA 卜 SNRPC、IGF2BP3、SERPINH1、 ' COL4A1、LARP1、LRRC1、FOXM1、CDC20、UBE2M、 * DNAJC6、FEN卜 ASNS、CHEK卜 KIF2C、AURKB、NPEPPS、 KIF4A、E2F8、EZH2、ZNF193、ILF3、EHMT2、SF3A2、 NPAS2、PSME3、INPPL1、BIRC5、SULT1C1、NSUN5B、〇 HN1及NUSAPI。此項技術中稱為HCAP-G之基因在此項技術中亦稱為NCAPG，且此等兩個基因名稱在本文中可互換使用。 CNS之不同基因亞群可能會過度表現於不同癌症（例 . 如肝細胞癌、鼻咽癌、乳癌、肺癌、腎細胞癌、結腸癌）中。因此，CNS中過度表現於給定癌症類型或亞型中之特定基因及/或基因數目可能不同於CNS中過度表現於另一癌症類型或亞型中之基因及/或基因數目。過度表現於癌症中 ❹ 之基因亞群可包括CNS中之兩個或兩個以上基因，至多且包括本文所述之CNS中之所有55個基因。在一具體實例中，過度表現於癌症中之基因亞群包括共同贅生性特徵中之所有55個基因。在另一具體實例中，過度表現於癌症中之基因亞群包括CNS中之約20個基因。已分別報導（參見表1 )且可易於由熟習此項技術者確定共同贅生性特徵之基因的核苷酸序列及其RNA及蛋白質產物之核苷酸及胺基酸序列。 15 200949249 表1 :共同贅生性特徵中之基因的基因符號及GenBank®寄存編號基因符號 GenBank®寄存編號基因符號 GenBank®寄存編號 MELK NM一014791 CHEK1 NM—001274 PLVAP NM_031310 KIF2C NM_006845 TOP2A NM—001067 AURKB NM 一004217 NEK2 NM_002497 NPEPPS NM 一006310 CDKN3 NM—005192 KIF4A NM—012310 PRC1 NM_199413, NM_003981, NM_199414 E2F8 NM—024680 ESM1 NM_007036 EZH2 NM_004456S NM_152998 PTTG1 NM_004219 ZNF193 NM_006299 TTK NM—003318 ILF3 NM 004516， NM 153464, NM 012218 ~ CENPF NM_016343 EHMT2 NM_025256, NM_006709 RDBP NM 一002904 SF3A2 NM—007165 CCHCR1 NM_019052 ^PAS2 NM_002518 DEPDC1 NM_017779 PSME3 NM_005789, NM_176863 ΤΡ53Ϊ3 NM_004881，NM_147184 INPPL1 NM—001567 CCNB2 NM 一004701 BIRC5 NM 一001012271，NM _001168 CAD NM 一004341 SULT1C2 NM_001056 s NM_176825 CDC2 NM一001786, NM—033379 NSUN5B NM 145645， NM 001039575 HMMR NM_012484S NM_012485 HN1 NM 017617, NM 001002033, NM 001002032 STMN1 NM_005563, NM_203401, NM_203399 NUSAPl NM_018454, NM_016359 NCAPG NM 一022346 NAT2 NM一000015 MDK NM_002391，NM—001012333, NM_001012334 CD5L NM—005894 RAD54B NM_012415 CXCL14 NM—004887 ASPM NM_018136 VIPR1 NM—004624 HMGA1 ΝΜ_145902, NM_145903 CCL14，CC115 NM 032963, NM 004166, NM 032964, NM 032965 SNRPC NM_003093 FCN3 NM_003665 , NM_173452 IGF2BP3 NM—006547 CRHBP NM—001882 SERPINH1 NM_001235 GPD1 NM—005276 COL4A1 NM_001845 KCNN2 NM_021614, NM_170775 LARP1 NM_015315, NM_033551 HGFAC NM—001528· LRRC1 NM一018214 FOSB NM一006732 FOXM1 NM_021953, NM_202003, NM_202002 LCAT NM_000229 CDC20 NM_001255 MARCO NM—006770 UBE2M NM_003969 CYP1A2 NM—000761 DNAJC6 NM—014787 FCN2 NMJJ04108，NM一015837 FEN1 NM一004111 DPT NM_001937 ASNS NM_183356, NM—133436, NM__001673 16 200949249 本文所述之方法可用於診斷許多不同癌症類型。在一特定具體實例中’本發明之方法可用於診斷選自由以下癌症組成之群之癌症：乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎細胞癌、肝癌、肺癌、_巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌及甲狀腺癌。㈣本發明之方法亦可診斷各種癌症亞型。該等癌症亞型包括（但不限於）_ 3中所列之癌症亞型。在-較佳具體實例中，癌症為肝細胞癌。本 ❻

文鑑別之共同贅生性特徵中並非所有基因均具有與本文所述之每一癌症類型或亞型相關（診斷本文所述之每一癌症類型或亞型）的表現量。因此，使用本文所鑑別之㈤基因之各種亞群可診斷不同癌症類型或亞型。在另一具體實例中，本發明係關於一種對患有癌症之個體提供預後之方法’其包含檢測CNS中之一或多個基因之表現量。根據本發明，CNS中特定基因之表現（例如過度表現）預示不良預後。該預後可為（但不限於）對患者存活、轉移風險或治療後復發之風險的預後。在一特定具體實例中，對患有肝細胞癌、鼻咽癌或乳癌之患者進行預後。如本文所述，CNS中之特定基因在癌症樣本中之表現 (例如過度表現）與不良患者預後（例如較短之存活、增加之轉移風險）之間存在較大關聯（參見（例如）實施^

4-7)。特定言之，prc1、cENPF、RdBP、ccNB2 及/或 RAD54B 在患有肝細胞癌、鼻咽癌或乳癌之個體之樣本中的表現（例如提向之表現）與增加之遠處轉移風險相關。此外，CDC2、 17 200949249 CCHCR1及/或HMGA1在患有肝細胞癌、鼻咽癌或乳癌之個體之樣本中的表現（例如提高之表現）與較短之存活相關。 ❹ 對於本發明之診斷及預後方法，可在個體之合適樣本中評疋基因表現。合適樣本可為組織樣本生物流體樣本、細胞（例如腫瘤細胞）樣本及其類似物。可使用自個體取樣之任何方法（例如藉由抽血、脊椎抽液、組織塗片或刮取或組織生檢）獲得樣本。因此，樣本可為生檢標本（例如腫瘤、息肉、腫塊（實體、細胞））、抽吸物、塗片或血液樣本。在一較佳具體實例中，樣本為血液樣本（例如企清樣本）。樣本可為來自具有腫瘤（瘤細胞或懷疑具有腫痼乃^# 玍食）及/或腫有腫廇及/或腫瘤細胞之器官的組織。。，可在開放式生檢（一種將整個（切除式分（切取式生檢）脯； ^ P 生檢。^去糕靶區移出之程序）中獲得腫瘤生檢或者，可經由經皮生檢（―種 ❹ 口或小孔執行(藉助於或不藉助於成像裝置細胞或細胞團簇（例如細針裝置）以獲得個體段（核心生檢）的））或組織核心或片 (例如塗片)、組織學方^ 任何其他合適方法广列如冷;東或石壤切片）或使用亦可藉由試管内採# 子斷方法）檢查生檢樣本。來獲得腫瘤樣本。若養之來源於個體組織之人類細胞將樣本之蛋白質# Τ將腫瘤樣本在分析之前藉由方法（諸如迅迷:::，持在可分析條件下之合適儲存東或受控冷滚方案）鍺存。若需要，可 18 200949249 在冷凍保護劑（例如二甲亞颯（DMS0)、甘油或丙二醇-蔗糖）存在下執行冷凍。適當時，可將腫瘤樣本在儲存之前或之後彙集以用於分析目的。 • 在一具體實例中，藉由檢測CNS之基因亞群或其基因產物（例如mRNA、蛋白質）在患者樣本中之表現可診=癌 1 症或可對個體提供預後。因此，該方法無需將該於患者樣本中之表現與對照組進行比較。可藉由本文所述之方法或熟習此項技術者已知之其他合適檢定確定基因表現之 ® 或不存在。可藉由將個體之樣本中基因之表現量與合適對照組之基因表現量進行比較而確定基因表現之差異（例如增加、減夕）合適對照組包括（例如）非贅生性組織樣本（例如 '來自已獲得癌症樣本之相同個體之非贅生性組織樣本）、非 .癌性細胞樣本、非轉移性癌細胞樣本、非惡性（良性）細胞：本或其類似物，或合適已知或已確定之參考標準。參 ❹考才:準可為蛋白質或RNA之表現的典型、正常或標準化含量範圍或特定含量（例如表現標準）。該等標準可包含（例二1=表現量、標準細胞系中之基因表現量或先前關 :常人類對照組之群體所獲得之平均基因表現量。因此’該方法無需在對照組樣本中評定基因/基因產物之表現或將基因/基因產物之表現與對照組樣本相比。量或個體之樣本（例如生物樣本）中基因表現 / 物（例如抓财、蛋白質）之含量（例如量）之 …此項技術者已知。舉例而言，可使用適合 19 200949249 , 於檢測生物樣本中之RNA表現量的任何技術量測樣本中 · RNA (例如mRNA )基因產物之含量。用於測定生物樣本之細胞中之RNA表現量的數種合適技術（例如北方墨點分析、RT-PCR、原位雜交）為熟習此項技術者所熟知。在一特定具體實例中，使用北方墨點分析檢測至少一種基因產 - 物之含量。舉例而言，可藉由在核酸提取緩衝液存在下均 ‘ 質化繼而離心將總細胞RNA自細胞純化。將核酸沈澱，且將DNA藉由用DNase處理且沈澱移出。隨後將rNa分子藉由根據標準技術在瓊脂糖凝膠上凝膠電泳而分離，且轉 ❹ 移至硝化纖維素濾紙。隨後藉由加熱將RNA固定於濾紙上。使用與所討論之RNA互補之經適當標記之DNA或RNA 探針完成特定RNA之檢測及定量。參見（例如）M〇lecular Cloning： A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人編，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，第 7 章，該文獻之全部揭示内容以引用的方式併入。 ’ 用於北方墨點法雜交之合適探針包括與CNS中基因之 RNA (例如mRNA )之核苷酸序列及/或cdna序列互補之 Ο 核酸探針。製備經標記DNA及RNA探針之方法及其與標乾核皆酸序列雜交之條件描述於Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J· Sambrook 等人編，第 2 版，c〇ld Spring Harbor Laboratory Press，1989，第 l〇章及第 η 章中’該文獻之揭示内容以引用的方式併入本文中。舉例而言’可用以下各物標記核酸探針：例如放射性核種（諸如、32P、33P、14C或35S);重金屬；或能夠充 20 200949249 w 當經標記配位體（例如生物素、抗生物素蛋白或抗體）之特定結合對成員之配位體；螢光分子；化學發光分子；酶或其類似物。可藉由 Rigby 等人，（1977W 制線 ii3:237 25i 之缺口移位（nick translati〇n)法或藉由等人， ^ (1983)，‘厂 5l’〇cW 132:6_13 之隨機引導（random priming)法將探針標記至高比放射性，該等文獻之全部揭

不内容以引用的方式併入本文中。後者為用於自單鍵DNA © 或自RNA模板合成具有高比放射性之經32p標記探針所選之方法。舉例而言，藉由根據缺口移位法用高放射性核苷酸$置換先前存在之核苷酸，有可能製備比放射性大大超過 1 0 cpm/gg之經P標記之核酸探針。隨後可藉由將雜交之 ' 濾紙暴露於感光膠片執行雜交之放射自顯影檢測 . (Autoradi〇graphiC detection )。由雜交濾紙所暴露之感光膠片的光密度掃描提供基因轉錄物含量之精確量測。使用另 @ 一方法可藉由電腦化成像系統（諸如購自Amersham

Biosciences，Piscataway，NJ 之 M〇lecular Dynamics 4〇〇_B 2D磷光計）將基因轉錄物含量定量。若放射性核種標記DNA或RNA探針不實用，則可使用隨機引子法將類似物（例如dTTP類似物5-(N-(N-生物素基-e-胺基己酿基）-3-胺基烯丙基）去氧尿苷三碳酸）併入探針分子中。可藉由與偶合至螢光染料或產生顏色反應之酶之生物素結合蛋白（諸如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素及抗體（例如抗生物素抗體））的反應檢測該經生物素標記 21 200949249 探針寡核苷酸。除北方法及其他RNA雜交技術以外，可使用原位雜交技術敎隱轉錄物之含量。與北方墨點技術相比，該技術需要較J之細胞’且包括將全細胞沈積於顯微鏡蓋玻片上且用含有放射性標記核酸或經其他方式標記㈣（例如 NA或RNA )冑針之溶液探測細胞之核酸含量。該技術尤其適用於分析個體之組織生檢樣本。原位雜交技術之實務 - 更詳細描料美國專 5,427,916號中，該專狀全部揭不内谷以引用的方式併入本文中。用於原位雜交給定基因產物之合適探針可（例如）由本文所述⑽基因之rna產 ^ 物的核酸序列產生。個體樣本中核酸（例如mRNA轉錄物）之含量亦可使用任何標準核酸擴增技術評定，該標準核酸擴增技術諸如聚合酶鏈反應（PCR )(例如直接pCR、定量即時pcR (qRT-PCR)、反轉錄酶pcR (RT_pCR))、連接酶鏈反應、，自主序列複製、轉錄擴增系統、Q-iS複製酶或其類似技術，且（例如）藉由在擴增期間標記核酸，暴露於插入化合物/ ❹ 杂料、探針等來觀察。在一特定具體實例中，藉由反轉錄基因轉錄物（例如mRNA )，繼而藉由聚合酶鏈反應（例如 RT-PCR )擴增經反轉錄產物來測定樣本中基因轉錄物之相對數目。可將基因轉錄物之含量與内標（例如同一樣本中所存在之「管家」基因之mRNA之含量）進行比較而定量。適用作内標之合適「管家」基因包括（例如）肌凝蛋白或甘油經_3_磷酸去氫酶（G3PDH)。定量RT-PCR之方法及其 22 200949249 變化屬於本發明之技能範疇内。在一些情況下，可能需要同時測定樣本中數種不同基因產物之表現量。舉例而言，可能需要在個體樣本令測定 .本文所述之CNS中所有基因之轉錄物的表現量。個別地評定多個基因之癌症特異性表現量費時且需要大量總題 ' (對於各北方墨點需要至少約及需要放射性同位素之放射自顯影技術。為克服該等侷限性，可建構微晶片形式（例如基因晶片、微陣列）之寡聚文庫（〇iig〇Hbrary) Ο 卩含有特異於__組基因之探針寡去氧核*酸組。使用該微陣列，可藉由將RNA反轉錄產生㈣寡去氧核芽酸組且將其與微陣列上之探針寡去氧核脊酸雜交產生雜交或表現譜來測定生物樣本中之多個RNA轉錄物之表現量。可隨後將 ' 測試樣本之雜交譜與對照組樣本之雜交譜進行比較以確定 • 在癌症樣本_具有改變之表現量的RNA。可使用此項技術中已知之技術製造微陣列。舉例而 0。’具有適當長度之探針募核皆酸可在位置C6處經5'胺修飾且使用市售微陣列系統（例如GeneMachine OmniGridTM 1 〇〇微陣列及Amersham CodeLinkTM活化載片）轉印。藉由用經標記引子反轉錄標靶RNA來製備對應於標靶rna之經標記cDNA募聚物。第一鏈合成之後，使RnA/Dna雜交物變性以降解RNA模板。隨後將由此製備之經標記標靶cI)NA 與微陣列晶片在雜交條件下雜交，該等雜交條件例如為在 25°C下6xSSPE/30o/〇甲醯胺中18小時，繼而在37。(：下在 0.75XTNT中洗滌40分鐘。在陣列上固定探針DNA識別樣 23 200949249 CDNA* NA之位置處發生雜交。、經標記標祀 “陣列上發生結合之精確位置，使得可自動檢測及 ❹ T °輪出由-系列雜交事件組成，表明特異性CDNA序 j之相對豐度’及因此患者樣本中相應基因產物之相對豐度。根據-具體實例，經標記CDNA s聚物為自生物素標 ^引子製備之生物素標$ eDNA。隨後將微陣列藉由使: :如）抗生蛋白鏈菌素―47結合物直接檢測含生物錄物來處理，且使用習知掃描方法掃描。陣列上各點之圖像強度與患者樣本中相應基因產物之豐度成正比。 ❹ =定樣本之「表現譜」《「雜交譜」基本上為樣本狀 ^ B紋（flngerPrint)，雖然' 兩種狀態可具有類似表現之 =定基因’但同時評估多個基因使得可產生細胞狀態之基因表現譜。亦即，可將正常組織與癌症組織區不卢：在癌症組織内，可確定不同預後狀態（例如良好或 i <期存活前景）。藉由比較不同狀態之癌症組織之表現 :其獲得關於在該等狀態中之每一者中何種基因重要（包織調與下調作用）<資訊。於癌症組織與正常組鑑別使：序列以及產生不同預後結果之差異表現的〜旅仵可U多種方法使用該f訊。舉例而言，可評估特 tΓ帛（例如以判定化學治療藥物是否發揮改良特定 ==預後之作用)。類似地，可藉由將患者樣本與已因矣規:、/丁比較來進行診斷或證實診斷。此外，該等基個別基因）使得可筛選抑止乳癌表現譜或將 ^ Y "曰轉化為良好預後譜之藥物候選者。 24 200949249 « 在-特定具體實例中，將來自患有癌症或懷疑患有癌症或懷疑具有產生癌症之風險的個體的樣本的總定量反轉錄以提供與樣本中之RNA互補之經標記標靶寡去氧核苷酸組。隨後將標靶寡去氧核苷酸與包含基因特異性探^ 寡核普酸之微陣列雜交以提供樣本之雜交譜。結果為代表樣本中之基因表現類型（expression pattern)的樣本之雜交譜。雜交譜包含因樣本之標靶寡去氧核苷酸與微陣列中之基因特異性探針寡核普酸結合產生之信號。該譜可以結合 ❹存在或不存在（信號與零信號）之形式記錄。所記錄^ 更佳包括各雜交之信號強度。將該譜與自正常（亦即非癌性）對i组樣本產生之雜交譜進行崎。信冑之變化㈠列如增加）表明個體中存在癌症。彳使用適當算法（例如統計算法）評定陣列或基因晶片上之基因表現。使肖微陣列或基因晶片評定基因表現量之合適軟體應用為此項技術中已知。在一特定具體實例巾，使用Affymetrix微陣列分析组（MAS) 5 〇軟體及蜮 DNA晶片分析器（dChip)軟體（如本文實施例i中所述者）評定微陣列上之基因表現。在特疋具體實例中，本文所述之55個腫瘤特異性基因（參見圖4)中之任一者的RNA轉錄物之片段可在個體

液（例如血漿）或其他體液（例如血液或含有癌細胞之-他體液）中鑑別且“列如）藉由執行由patios G等人， ~ J.制· m 99U998 (2〇〇8)所述之反轉錄、pcR 及平行測序來定量。任何㈣片段之一致性可藉由將其序 25 200949249 列與55個腫瘤特異性基因之副A序列中之—者匹配來測定。55個腫瘤特異性基因之RNA片段亦可根據在樣本所有經測序PCR>|段中檢測具有55個腫瘤特異性基因之特定 DNA序列的片段之井看產中& 、士、丄量。這方法可用於篩檢及鑑別對於癌細胞為陽性之個體。或者，個體血液或生物流體樣本中55個腫瘤特異性基因中之任一者之舰轉錄物之片段

的一致性可（例如）藉由執行RNA片段之反轉錄，繼而PCR © 擴增且將PCR產物與陣列（例如微陣列、基因晶片）雜交來測定及定量。用於量Jj樣本中之基因表現的其他技術亦屬於此項技術之技能範鳴内，且包括量測RNA轉錄及降解速率之各種技術。 CNS之基因的表現量亦可藉由評定個體樣本中由基因編碼之蛋白質之含量加以測定。檢測CNS基因之蛋白質產物的方法包括（例如）免疫學及免疫化學方法，諸如流式-胞十里術（例如FACS分析）、酶聯免疫吸附檢定 (ELISA )化學發光檢定、放射免疫檢定、免疫印跡法（例❹ 如西方墨點法）、免疫組織化學（IHC)，及質譜。舉例而言，可使用CNS基因之蛋白質產物之抗體來直接或間接（例如）使用免疫組織化學（脚）確定樣本中該蛋白質之存在及/ 或表現量。舉例而言，彳自生檢組織獲取石蠟切片，固定於載片且藉由合適方法將其與-或多種抗體組合。可使用適當算法（其中數種為熟習此項技術者已知）碟疋兩個樣本之間或樣本與參考標準之間的基因表現量的 26 200949249 差異（例如增加、減少）。舉例而言，可使用本文在實施例 1及圖1種所述之算法鑑別在癌症（例如HCC )與鄰近非腫瘤組織之間呈現差異表現（例如顯著差異表現）的基因。可使用適當統計檢驗（S)(其中數種為熟習此項技術 ' 者已知）判定兩個樣本之間或樣本與參考標準之間的基因 * 表現量的統計顯著性差異（例如增加、減少）。在一特定具體實例中，採用t-檢驗（例如單樣本t-檢驗、雙樣本t-檢驗）來判定基因表現之差異是否為統計顯著的。舉例而言，可 Ο 使用雙樣本t-檢驗（例如雙樣本韋爾奇氏t-檢驗）判定兩個樣本之間的基因表現量之統計顯著性差異。使用單樣本t-檢驗可判定樣本與參考標準之間的基因表現量之統計顯著性差異。用於評定基因表現差異之其他有用之統計分析包括卡方檢驗（Chi-square test )、費雪精確檢驗（Fisher's exact test)及對數秩檢驗及威爾科克斯檢驗（Wilcoxon test)(參見實施例1-7)。套組 ® 本發明亦涵蓋診斷個體是否患有癌症之套組。本發明之診斷套組包括一組能夠檢測本文所述之CNS中多個基因 (亦即 MELK、PLVAP、TOP2A、NEK2、CDKN3、PRC1、 ESM 卜 PTTG卜 TTK、CENPF、RDBP、CCHCIU、DEPDC1、 TP5313、CCNB2、CAD、CDC2、HMMR、STM1SH、HCAP-G、 MDK、RAD54B、ASPM、HMGA1、SNRPC、IGF2BP3、 SERPINH1、COL4A1、LARP1、LRRC1、FOXM1、CDC20、 UBE2M、DNAJC6、FE>H、ASNS、CHEiH、KIF2C、AURKB、 27 200949249 NPEPPS、KIF4A、E2F8、EZH2、ZNF193、ILF3、EHMT2、 · SF3A2、NPAS2、PSME3、INPPL1、BIRC5、SULT1C1、 NSUN5B、HN1、NUSAP1 )之表現量的探針。舉例而言，該等套組可包括一組能夠檢測CNS中至少約兩個基因例如共同贅生性特徵中約2個、3個、4個、5個、6個、7個、 · 8個、9個、1〇個、u個、12個、13個、14個、15個、16 ^ 個、17個、18個、19個、2〇個、21個、22個、23個、24 個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32 個、33 個、34 個、35 個、36 個、37 個、38 個、39 個、40 〇個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48 個、49個、50個、51個、52個、53個、54個或55個基因之表現量的探針。在一具體實例中，#組涵蓋一組能夠檢測共同贅生性特徵中所有55個基因之表現量的探針。在特疋具體實例中，套組涵蓋一組能夠檢測本文所述之Cns 中至少約1〇個基因，較佳約15個基因，且更佳約20個基 . 因之表現量的探針。本發明亦提供用於判定患有癌症之個體之預後（例如 ❹ 轉移風險，存活）的套組。在一具體實例中，該等套組包含能夠檢測至少-個選自由pRC卜CENpF、RDBp、ccnb2 及RAD54B $其任何組合組成之群之基因&表現量的探針。在另一具體實例中，本發明係關於用於判定患有癌症之個體之預後的套組，#包含能夠檢測至少一個選自由 PRC1 CDC2 CCHCR1及HMGA14其任何組合組成之群之基因的表現量的探針。 28 200949249 本發明之診斷及預後套組包括用於檢測樣本（例如乳動物個體之生物樣本）中CNS基因之表現的探核酸探針、抗體）。因此，在一具體實例中，該套組包含與CNS基因之rna 轉錄物（例如mRNA、hnRNA)特異性雜交的核酸探針（例如寡核普酸探針、聚核苦酸探針）。該等探針能夠與具有互補序列之標歡核酸經由-或多個類型之化學鍵，通常經由 ❹ 互補驗基對經由形成氫鍵而結合（亦即雜交）。如本文所用探針可包括天然（亦即A、G、U、C或T)或經修飾驗基（7_去氮烏芽、肌料）。此外，核酸探針中之驗基可藉由料酸二賴之鍵接合，只要㈣不干擾雜交即 ^因此’探針可為肽核酸’其中組份絲藉由肽鍵磷酸二酯鍵接合。執行雜交反應之指導可見於h

Bi_gy，John WUey & s刪，ν γ (1989)， . i 6 · 3 · 6 ’其相關教示以这丨田』荻不以引用的方式全部併入本文中。產 :特異性雜交之合適雜交條件視具有同源性之區域的長 =»亥區域之GC含量及雜交物之溶融溫度（「τ〜）而改變=此，雜交條件可在鹽含量、酸度及雜交溶液及洗務面不同冑針核酸與標乾核酸之間的包括少量錯雜交可藉由降低雜交介質之嚴格度調節以達成標靶核酸之所需檢測。^ J在一特定具體實例中，本發明套組中

，核酸探針能夠在高嚴格度之條件下肖CNS基因之RNA (例如mRNA)轉錄物雜交。 29 200949249 在另一具體實例中，套組包括能夠與

J基因之rNA 轉錄物或相應麟特異性雜交之募核替酸引子對。該等引子可用於任何標準核酸擴增程序（例如聚合酶鏈反應 (PCR ) ’例如RT-PCR、^量即時PCR )以測定樣本中潰轉錄物之含量。如本文所用之術語Γ弓丨工,· 71于C primer )」係指 ❹ ❹ 與模板聚核苦酸序列互補且能夠充當合成引子延伸產物之起始點的寡核#酸。在-具體實例中，？丨子與聚核芽酸序列之有義鏈互補且充當合成正向延伸產物之起始點。在另一具體實例中’引子與聚核苷酸序列之反義鏈互補且充當合成反向延伸產物之起始點。引子可天然存在（如以經：化限制性消化物之形式存在）或合成產生。引子之適當長度取決於引子之所欲用途，但通常介於約5個至約2〇〇個；約5個至約1〇〇個；約5個至約75個；約5個至約5〇個；約10個至約35個；約18個至約22個核苦酸之範圍内。引子無需反映模板之精確序列但必須充分互補以與模板雜交而進行引子延長，亦即，引子與模板聚核苷酸序列充分互補以使引子在允許引子延伸之條件下與模板進行黏接。在另一具體實例中，本發明之套組包括特異性結合由本文所述之CNS之基因編碼之蛋白質的抗體。該等抗體探針可為多株抗體、單株抗體、人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、靈長化抗體、鑲邊抗體或單鏈抗體以及抗體片段 (例如 Fv、Fc、Fd、Fab、Fab'、F(ab·)、scFv、scFab、dAb )。 (參見（例如）Harl〇w等人，

Cold Spring Harbor Laboratory，1988 )。可藉由習知方法或 30 200949249 其他合適技術（參見（例如）Kohler等人，TVaiMre，25(5: 495-497 (1975)及五Mr· ·/· /mmM”0/_ 5U-519 (1976);

Milstein ^ A, Nature 266: 550-552 (^iP77；； Koprowski # A, 美國專利第 4,172,124 號；Harlow, E.及 D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor * Laboratory: Cold Spring Harbor, NY) ； Current Protocols In

Mo/ecwMr Bio/og;;,第 2 卷（增刊 27，94 年夏），Ausubel， F.M.等人編，（John Wiley & Sons: New York，NY),第 11 章，〇 (1991) ; Chuntharapai 等人，*/. 152:1783-1789 (1994) ; Chuntharapai 等人，美國專利第 5,440，021 號）產生、建構、工程化及/或分離特異性結合至由本文所述之CNS 之基因編碼之蛋白質的抗體。可使用產生或分離具有必要特異性之抗體的其他合適方法，包括（包括）自文庫（例如噬菌體呈現文庫）選擇重組抗體或抗體結合片段（例如 dAb )或依賴於將轉殖基因動物（例如小鼠）免疫的方法。能夠產生人類抗體之譜系的轉殖基因動物為此項技術中所 ^ 熟知（例如 Xenomouse® ( Abgenix，Fremont，CA ))且可使用合適方法（參見（例如）Jakobovits等人，iVoc. Λ/αί/.

Sci. USA, 90: 2551 -2555 (1993) ； Jakobovits ^ A, Nature 3心：255-258 (1 993) ; Lonberg 等人，美國專利第 5,545,8〇6 號；Surani等人，美國專利第5,545,807號；Lonberg等人， WO 97/13852 )產生。產生之後，特異於由本文所述之CNS基因編碼之蛋白質的抗體可易於使用此項技術中熟知之篩選及分離特異性 31 200949249 抗體之方法鑑別。參見（例如）Pau〗（編輯），Fundameniai Immunology, Raven Press, 1993 ； Getzoff 等人，Adv. in Immunol. 43:1-98, 1988 ; Goding (編輯），Monoclonal

Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Ltd., 1996 ; Benjamin 等人，Ann. Rev· Immunol. 2:67-101, 1984。

可使用多種檢定來檢測與由本文所述之CNS基因編碼之蛋白質特異性結合之抗體。例示性檢定詳細描述於A

Laboratory Manual，Harlow and Lane (編輯），Cold Spring

Harbor Laboratory Press, 1988中。該等檢定之代表性實例包括.並行免疫電泳、放射免疫檢定、放射免疫沈澱、酶聯免疫吸附檢定（ELISA)、點潰墨法或西方墨點檢定、抑制或競爭檢定及三明治試驗（sandwich assay )。本發明之診斷及預後套組中之探針 (例如可檢測標記）結合。診斷探針之許多合適標記為項技術中已知且包括本文所述標記中之任一者。適用於發明之方法的合適可檢測標記包括（但不限於）發色團勞光團、半抗原、放射性核種（例如3jj、125j、l31l 32p 33p、35s、- 、

c 丨Cr

Cl ' 57Co 58,

Co、59Fe 及 75Se)、光抑止劑、酶、酶受質、親和力標籤（例如生物素、抗物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素等）、質量標籤、電泳標籤及抗體識別之抗原決定基標籤（例如地高辛（dig〇xigen DIG )、血球凝集素（HA )、mye、FLAG )。在某些具體實中，標記存在於核酸探針之嘧啶鹼基之5 於核酸探針之嗓呤驗基之3碳去氣位置上。置上或存 32 200949249 在一特定具體實例中，與探針結合之標記為螢光團。可提供螢光染料形式之合適螢光團，該等螢光染料包括（但不限於）亞歷山大氟（Alexa Fluor)染料（亞歷山大氟350、亞歷山大氟48 8、亞歷山大氟5 32、亞歷山大氟546、亞歷 • 山大氟568、亞歷山大氟5 94、亞歷山大氟63 3、亞歷山大 ' 氟 660 及亞歷山大氟 680 )、AMCA、AMCA-S、BODIPY 染料（BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、 ❹ BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、 BODIPY 650/665 )、CAL 染料，羧基若丹明（rhodamine) 6G、叛基-X-若丹明（ROX )、級聯藍（Cascade Blue )、級聯黃（Cascade Yellow )、花青染料（Cy3、Cy5、Cy3.5、 Cy5.5 )、1-二甲胺基蔡-5-績酿基（Dansyl )、達泊西 (Dapoxyl )、二炫基胺基香豆素、4'，5'-二氣-2’,7'-二甲氧基 -螢光素、DM-NERF、伊紅（Eosin )、赤藻紅（Erythrosin )、螢光素、羧基-螢光素（FAM)、羥基香豆素、IR染料（IRD40、 ❿ IRD 700、IRD 800 )、JOE、麗絲胺若丹明（Lissamine rhodamine ) B、瑪麗娜藍（Marina Blue )、甲氧基香豆素、萘幷螢光素、俄勒岡綠（Oregon Green ) 488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、玉色（Oyster)染料、太平洋藍（pacific Blue)、PyMPO、芘、若丹明 6G、若丹明綠（Rhodamine Green )、若丹明紅（Rhodamine Red )、對甲胺基酚綠（Rhodol Green)、2’，4’，5·，7’-四-溴礙-螢光素、四甲基-若丹明（TMR)、羧基四曱基若丹明（TAMRA )、得克薩斯紅（Texas Red ) 33 200949249 及得克薩斯紅-χ。亦可使用榮光發射金屬（諸如〗52Eu或鑭系之其他者）標記探針。該等金屬可使用諸如二伸乙基三胺五乙酸 (DTPA)、四I雜-環十二烧，乙酸（D〇TA)或伸乙基二胺四乙酸（EDTA)之金屬螯合基附著於抗體分子。除上述各種可檢測部分以外，本發明套組中之探針亦可與其他標記類型結纟，該等其他標記類型料可光谱解析量子點、金屬奈米粒子或奈米團料，其可直接附著於核酸探針。如上所述，可檢測部分無需自身可直接檢測。舉例而言，其可作用於得以檢測之受質或其可能需要修飾以變得可檢測。為進行活體内檢須|J，可直接或藉由❹t帛冑能美將探針與放射性核種結合。通常用於將以金屬陽離子形：存在之玫射性同位素與抗體結合之中間基團為二伸乙基三胺五乙酸（dtpa)或四氮雜-環十二^四乙酸（D〇T^y以此方式結合之金屬陽離子之典型實例為"u " 67. 'Ru

Cu、67Ga 及 68Ga 131 τ 〇-7 1 ' In、 ❹ 此外’可將探針用包括順磁原子之NMR成像劑標記。使用nmr成像劑使得可使用NMR技術活體内診斷串者中 5 癌症之存在及程度。尤其用於此方式中之 Mn、162Dy、2Cr 及 56Fe。檢測經標記探針可藉由（例如）閃蝶計數器（若可檢測標記為放射性γ發射體）或藉由（例如）螢光為螢光物質）實現。在酶標記的情右不°己凡下，檢測可藉由使用 34 200949249 質之酶促反應程酶又質之比色法實現。檢測亦可藉由將受度與類似製備之標準視覺比較來實現。確定癌症基因表現譜之方法

^另-具體實例中，本發明係㈣—種確㈣症基因 s之方法。3亥方法包含檢測同一個體之癌性與非癌性樣本（例如組織樣本”之基因表現（參見下文之實施例。。在-特定具體實例中，同一個體之癌性及非癌性樣本為鄰近或成對樣本（例如鄰近或成對之肝細胞癌與正常肝組織樣本）。可使用本文所述之任何合適基因表現檢測方法檢測樣本中之基因表現。此外，肖定兩個樣本（例如鄰近 1成對癌症及正常組織樣本）之間的基因表現量之差異的 =適方法為熟習此項技術者已知且包括（例如）本文所述 /等方法。根據本發明，將鑑別為在癌性樣本與非癌性之間差異表現之基因包括於該癌症之基因表現譜中。以下為本發明之例示性具體實例之描述。實施例 #袍匈/ :在成對HCc與鄰近非腫瘤肝組織之間展示顯著之差異表現的基因的鑑別材料及方法： &織樣本自由人類患者手術移出之用於治療目的之新鮮試樣收、HCC及鄰近非腫瘤肝組織。在巡診病理學家之直接監督下收集該等試樣。將所收集之組織立即儲存於辜公亮基金孫逸仙'台癌中心醫院（Koo Foundation Sun Yat-Sen 35 200949249

Cancer Center，KF-SYSCC )腫瘤庫之液氮中。來自十八位 HCC患者之成對組織樣本可用於該研究。該研究經倫理審查委員（Institutional Review Board)批准且由所有患者獲得書面知情同意書。表2中概括該研究之十八位HCC患者之臨床特徵。表2 :獲得成對HCC與鄰近非腫瘤肝組織樣本之十八位HCC患者之臨床資料病例號性別年齡 HBsAg HBsAb HCVIgG TNM 期 AFP ( ng/ml) 分化 1 Μ 70 + - 2 2 中等 2 Μ 75 - + + 4A 5 高度 3 Μ 59 + - 4A 1232 中等 4 F 53 + + 1 261 中等 5 Μ 45 + - 2 103 中等 6 Μ 57 + + - 2 5 中等 7 Μ 53 + + - 3 A 19647 中等 8 Μ 54 - - + 3A 7 中等 9 Μ 44 + - 4A 306 中等 10 Μ 76 - - + 3A 371 中等 11 F 62 + - - 3A 302 中等 12 F 73 - - + 2 42 中等 13 m 46 + - 4A 563 中等 14 Μ 45 - - 3A 64435 中等 15 Μ 41 + 2 33.9 高度 16 Μ 44 + + * 2 350 中等 17 Μ 67 + - 3A 51073 中等 18 Μ 34 + 4A 2331 中等 36 200949249 mRNA轉錄物譜使用 Trizol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA)自冷束於液氮中之組織分離總RNA。使用RNAEasy Mini套組（Qiagen Valencia，CA)將所分離之RNA進一步純化，且使用rnA 6000奈米檢定在 Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)中評定其品質。用於該研究之所有RNA樣本均具有大於5.7(8.2±1.0，平均值±8〇) 之 RNA 完整性指數（RNA Integrity Number，RIN )。自 8 pg ® 總RNA根據Affymetrix方案製備雜交標靶且將其與含有約 13,000個人類基因之22,238個探針組之Affymetrix U1 33A 基因晶片（GeneChip )雜交。雜交之後，立即使用Affymetrix 基因晶片射流站400及EukGE WS2v4方案將雜交陣列進行自動洗滌及染色。之後，將U133A基因晶片在Affymetrix 基因陣列掃描儀2500中掃描。微陣列資料之存在及不存在判讀的判定使用 Affymetrix 微陣列分析組（MiCr〇array Analysis ® Suite，MAS) 5.0軟體對所有18對HCc與鄰近非腫瘤肝組織之微陣列資料產生存在判讀（present caU )。存在判讀判定之所有參數為缺省值。各探針組由MAS 5 〇判定為「存在」、不存在」或「少量存在」。類似地，使用dChip 2〇〇4 版軟體處理相同微陣列資料以對微陣列上各探針組判定「存在」、「不存在」或「少量存在」狀態。具有顯著差異表現之探針组的鑑別為鑑別在HCC與鄰近非腫瘤肝組織之間具有顯著差異 37 200949249 表現之基因（亦即在—樣本（例如HCC樣本）中穩固存在但在鄰近樣本（例如正常肝樣本）中不存在或少量存在之基因表現），根據以下規則使用利用實用摘錄（Practicai

Extraction)及報告語言（Rep〇rt Language)(pERL)之軟體書寫：「腫瘤特異性基因（Tum〇r_specificgene)」係定義為藉由MAS 5.0與dChip判讀為「存在」於Hcc中且「不存在」或「少量存在」於鄰近非腫瘤肝組織中的探針組。「非腫瘤肝組織特異性基因

Non-tumor liver tissue-specific

gene)」係定義為藉由MAS 5 〇與dchip判讀為「不存在」或夕量存在」於HCC中且「存在」於成對鄰近非腫瘤肝組織中的探針組。圖1展示描述該鑑別算法之流程圖。微陣列資料集除自18對HCC與鄰近非腫瘤肝組織收集之微陣列資料以外，由以類似方式收集之82個Hcc組織樣本及168個鼻咽癌（NPC )組織樣本獲得其他微陣列資料。將各種正常及腫瘤組織之SCIANTIsTM System Pr〇市售微陣列資料庫

(Gene Logic Inc·，Gaithersburg，MD)用於驗證目的。市售 SCI ANTIS基因表現資料集係基於Affymetrix HG-U133 A 基因晶片技術。對於給定癌症或正常組織類型，將各探針組之表現強度在藉由MAS 5 〇將各微陣列之基因表現資料標準化至100之總截尾平均數之後以群組之平均信號強度加上標準差之形式提供。此外，亦將公共來源之微陣列資料集用於該等研究中（表3 )。 38 200949249 表3 :公共領域微陣列資料集之來源组織來源微陣列 GEO編號* 乳癌荷蘭癌症學會/斯坦福 (Netherlands Cancer Institute/Stanford) cDNA - 乳癌國際基因組協會 (International Genomic Consortium) U133plus2 GSE2109 肺癌國際基因組協會 U133 plus2 GSE2109 肺癌杜克大學（Duke University) U133 plus2 GSE3141 腎細胞癌波士頓大學（Boston University ) U133 A & B U133 plus2 GSE781 結腸癌國際基因組協會 GSE2109 成人生殖細胞紀念斯隆凱特靈醫院腫瘤中心 U133 A & GSE3218 腫瘤 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) B 正常器官/組織 Novartis U133A GSE1133 *:基因表現資料庫（Gene Expression Omnibus，GEO ) 編號命名分級聚類分析藉由使用聚類（2.11版）軟體進行單向或雙向分級聚類分析’且以（TreeView 1.60版）軟體觀察結果，該等兩個軟體均由Michael B. Eisen (勞倫斯伯克力國家實驗室 (Lawrence Berkeley National Lab )及伯克力加利福尼亞大學（Univerisity of California at Berkeley )分子及細胞生物系的Ph.D.)之實驗室提供以用於公共用途。

區分癌症與正常組織之探針組！基因之選擇為確定選擇可區分癌性與非癌性組織之探針組的最佳嚴格度’以介於1至16之不同選擇嚴格度鑑別在成對HCC 39 200949249 與鄰近非腫瘤肝組織之間具有極其差異表現之探針組。不考慮17或18之嚴格度’由於對於17之嚴格度僅存在^固探針組’且對於18之嚴格度存在”探針組。將該等探針組應用於SCIANTISw System Pr〇㈣列資料庫中可獲得之各種正常及腫瘤組織之基因表現資料。只有當不同人类員原發性癌症亞型及其相應正常組織之資料集對於正常與♦ 染群組包括最少八個樣本時才選擇該等資料集以進行進一步統計比較。鏗別出滿足該等標準之總共2G種不同癌症亞型及相應正常組織之資料集。對於不同選擇嚴格度，確$ ^ 根據SCIANTIStm System Pro資料庫中所提供之資料，總探針組（n=22,283 )中展現癌症類型與正常對應物之間的統計顯著表現差異（ρ<0·05,藉由韋爾奇氏t_檢驗）之分率⑷ 及高度差異表現之探針組之數目⑴。隨後確定來自 SCIANTIStm System Pr〇資料庫之展示特定癌症類型與相應正常組織之間的顯著表現差異的隨機選擇探針組的密度分布[項（怂]。使用基於隨機選擇探針組之所得密度分布曲線’判定出區分癌症與相應正常組織之女個探針組之統 ❹ 。十顯著。圖2屐示該密度分布之一實施例，其係使用41 (灸）個探針組建構，其中由SCIANTIStm System Pro，總探針、之5 2.1 % (分）呈現乳房浸潤性腺管癌與正常乳房組織之間的統5十顯著表現差異。在該實施例中，若藉由比較 HCC與鄰近正常組織所鑑別之41個非隨機探針組中有34 個扭針組基於sciantistm System p⑺資料庫之資料展示浸潤性腺管癌與正常乳房組織之間的統計顯著表現差異， 40 200949249 則41個隨機選擇基因中超過34個基因展示乳癌與正常乳房組織之^的統計顯著之差異表現的概率極小 (P-8.27X1G 6)。㈣該方法，對於以不同嚴格度選自成對 HCC與非腫瘤肝组織之研究的探針組確冑ρ i以與隨機選擇之探針組相比區分不同癌症類型與正常組織。冑3中概括所有20種不同癌症類型之Ρ值。「〇」之Ρ值意謂ρ值小於 1 X 1〇-16 〇普遍贅生性特徵基因之驗證對於20種選自用於該研究之sciantisTM Pm Ο 市售微陣列資料庫之癌症亞型令之每一者的υπ3Α基因晶片上可獲得之所有22,238個人類探針組進行假定正常與惡性群體之間不等變異的雙樣本韋爾奇t-檢驗。計算相關t 統计量及P值且將其用於建立分布曲線以評定與該研究中斤鑑別之75個普遍特徵探針組相比任何75個隨機選擇探 :將產生較小p值的可能性。為此目的’產生75個隨機選擇探針組之10,000個列表，且將各列表應用於2〇種不同癌症亞型中之每-者。將與2〇種癌症亞型之各隨機列表相關之1，5 0 〇個d補公龜〆、㈣p值刀類（_)且對其秩作圖。亦採用自t 、…量產生之t值的分級聚類分析以用於驗證目的。執行使 :J5個探針組及2〇種不同癌症亞型及其正常組織之兩個 :並^於Μ種癌症亞組織評估在該研究中鑑別 t曰遍贅生性特徵之75個探針組。獲得测们值。藉由分級聚類分析進一步分缸#堃，值糟田 -個隨機選擇探針1= 個1值(圖23A)。對於、’ 同20種不同癌症亞型及正常組織 41 200949249 重複該分析（圖23B)。統計分析使用SAS軟體（9.1.3版）進行統計分析，包括卡方檢驗、費雪精確檢驗、t-檢驗及存活分析（對數秩及威爾科克斯檢驗）。即時定量反轉錄酶聚合酶鏈反應（RT_PCR ) . 使用TaqManTM即時定量反轉錄酶_pcR ( qRT pCR )來定量mRNA。對於各樣本根據製造商之說明使用invitr〇gen (Carlsbad，CA)之1500 ng寡聚（dT)引子及6〇〇單位 ❹

SuperScriptTM II反轉錄酶以60 μ1之最終體積自8 gg總 RNA合成cDNA。對於各rT_PCr反應，根據製造商之說明 (ABI及Roche)以25 μΐ之最終體積將0 5 y cDNA用作模板。使用Applied Biosystems 7900HT即時PCR系統進行 PCR 反應。由 Applied Biosystems ( ABI) ( Foster City, CA) 獲得實驗所需之探針及試劑。表4中列出用於即時定量 RT-P C R之引子及探針之序列。將次黃嗓吟_鳥π票吟填酸核糖基轉移酶（HPRT )管家基因用作標準化之内源參考。對於 ❹ 相同標靶mRNA及内源參考HPRT mRNA，將所有樣本在相同PCR板上進行兩次實驗。藉由比較性Ct法根據製造商之說明（User Bulletin #2, ABI Prism 7700 Sequence Detection

System)計算標靶mRNA之相對數量。將非腫瘤肝樣本選用作計算之相對校準物。 42 200949249 瓦处銮-v-f 雄 Θ 屮一rvr»w 'aud-lel^iBclmi^阳艏毖回f αι-ff 球 οοοδΝαΙ aws )vh3vyvoh1310wh130o1cj ai (SON a3s )ο118νυυοο1υ01νυ1 (εοοΌΝ alaHS ) lllwoHvouoolvaHlo (寸oooNal bws ) VUHloHVOOOVWUHaw。 (s°°OM albpqs ) 3HvvwoH3130vvy3 (900dNaI a3s ) vuvlwoowuHvuuvovo UOOON ai bws ) 11IU11HVOOVOHUOI3 SON ai b£ts)ouWIValvoloolooll (SONa&s) 3CJ310HVHWU1H11VOOV3U1 06dNQIaws) IvllvlovluIVVYOYVVoovolHu 060N alaHS )uJLLluvooHwuIuoxo (fs6 ON albws )uuVVWODuu3vow 〇寸oNal cyHS ) vuolHoovHwoHllvoavolvool (tN寸dN ai bws) IlouvoVDOVOVOOOoVYlall

(e 寸dN ai bws )UV1V301H001001H10V00VU (寸寸 ON aiaws) oxolloovovoovovcooo (s 寸dN alcyws) oollvllvolluvovuuoolullu (9 寸oNal bws) oHvuluvvyoouololIlwluovu (卜寸ON alawsuuHHVHouHolovwovuuHuovu (8寸 ON ai b3s)H3uvlo818volu3130 (6 寸dN ai bws )1v33iovhyw30voovvyu001 (0SNQI a3s) lluCJvwyolHIOHVavulcOOHVu (ISN ai bws ) 3131X10XUW30VU11VU80 SON QI bas ) 01011DVOOH811331I1001 (ION ai bws ) W0VUCJV00WH0133V3VYV0V3 (tNoN aibws) wowHvooavaVOVHUovoovua (SN QI awsHVYVHOWYoloololvvayyouoo

(寸dN alaHS) OIW8H00010CJV0V0WOI (sdzalaas) I10V8YYVOVV10VVUOV1UW0130 9 (96N bws ) ovovvluuvovouoluuovu (z-dN ai cys) ilovulluloolwvlouvovooo (00 ONQI 03S )Hvovvovoov801uva8

(6 on alaws) H3V01H3HV3VYVW0O10V3D13V OIONPIbws ) 1ΙΥΙνυ8ν1υ81131νυ10νν30 (11 :ON aia3s ) OVUV5U80111800 (Π ON ai bHS) VUOVV00OVWCJUV830 £寸 sv mv

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¾/ S6Z0ZZ ¾X 176s0(n ts90ζ.π(ν

tss t^090CN ο20 CAACTCAAATCGGAAGTATC ( ID NO: 93 ) ^s〇 CAACTCAAATCGGAAGTATC ( ^ ID NO: 93) 〇 ω u u a H H H H a o u < u H 〇 H ^ CAAAGACCCAGAACATCA (SEQ ID NO: 95 ) CAGTTGGCCAGCTTCA ( SEQ ID NO: 96) aatgagacgagaacacttc ( SEQ ID NO: 97 ) TTTGGAGCCGACTGCAAG ( SEQ ID NO: 98 ) CCAGAAGACTAAAGCTTCAC ( SEQ ID NO: 99) CTGGCCAAAGGGATCA ( SEQ ID NO: 100) ATTGGAGCAGAAAGAACA ( SEQ ID NO: 101) CCCCATCCAGTGGCTG( SEQ ID NO: 102) CTTCAGCGAGAACTTT( SEQ ID NO: 103) CTTCAATCCTCTAGACTTTG (SEQ ID NO: 104) CCGGACAGGCCTCTAC ( SEQ ID i NO: 105) I TTTGCGAGAGAAGGATAAG ( SEQ | ID NO: 106) a a < u u H U δ u O < u CAAGCTGACAGCGGAGTTTT ( SEQ ID NO: 53) CAAGCTGACAGCGGAGTTTT ( SEQ ID NO: 53) GACAACAACTTCTGCACTTGACAAA( SEQ ID NO: 54) GTCTTCACTCCTTTCGTTTAAGTCAGA (SEQ ID NO: 55) CCAGAACTTCTCCAGCCCATA ( SEQ ID NO: 56) gtggagtggctcgcctta ( SEQ ID NO: 57 ) CGCACCCCAGTTCTCAAAC (SEQ ID NO: I 58) TCTGGATTCACTAATCTAGTTGTAGTCACA (SEQ ID NO: 59) GCCAATTCTTTCAAAATATGCTTCAATGTC (SEQ ID NO: 60) CTAGTCTCTCACGAACACAAAGCT ( SEQ ID NO: 61) CGGGCCATCCCTTGGT ( SEQ ID NO: 62 ) GTAGCATCAGATTTGGAAGCCTTTG ( SEQ ID NO: 63 ) CTCTTCAGGCAGGTCAAAACTCT (SEQ ID NO: 64) TCCTTCTCGTCGTCGTAGTAGTT (SEQ ID NO: 65 ) GTTCTTCCGCACTTCTTCAATGTG ( SEQ ID NO: 66) a a 〇 δ < 0 1 o o o CAAGCATGTTGTGAAGTTGAAAGATGA (SE〇 ID NO: 13) CAAGCATGTTGTGAAGTTGAAAGATGA (SEQ ID NO: 13) GCTGGCAGAGTTATTGGAAAAGGA ( SEQ ID NO: 14) GAAACTGAATGACCAAGCAAACACT (SEQ ID NO: 15) (91 ON QI03S ) V13V00VV0I093VVV00V00V CCGATTTGTGGAGGATGAGAAAGAT (SEQ ID NO: 17) CCCTGCAACTGGAAGAAGGA ( SEQ ID NO: 18) AGGAAGGGTTCTGCCAGAGA ( SEQ ID NO: 19) GCATTCAGCCTAGTTCCTGGTT ( SEQ ID NO: 20) AGCGAGCTCTCAAAGCAAGA ( SEQ ID NO: 21) CCTGCAGGCATCCCTGTA ( SEQ ID NO: 22) CCGTCCCTCTCTGACAGTTC ( SEQ ID NO: 23) CCTCAGATGATGCCTATCCAGAAAT ( SEQ ID NO: 24) CGTGGGTGTCATGATGATGCA ( SEQ ID NO: 25) CAAATGGCTGCCAAACTGGAA ( SEQ ID NO: 26) CGCCTTCCAGCTGTTACATCTT ( SEQ ID S < OQ < S < 3 < S c 3 s < s < s < 3 < § s s c § § % s X P£h S m cL s 1 ϊ 二1 Q h-l w S pj § Pu, 1 T-H u Pi P-. ί—H o H & SERPINH1 INRLS TP5313 207165_at 209709 s at — 203819 s at " 1 220116 at , 212193丄沿 218816 at | ! 209035__at 204825一at 206797—at 204641一at 221529—s_at 218009_s_at 203554„x_at 207714_s_at 217714 一x 一 at 210609 s at 寸寸' ' NO: 107) Ό 24i CCGCCTGCACCTCAC (SEQ ID 108) CCAGGCTG (SEQ ID NO: 109) CTTCCTCC (SEQ ID NO: 110) GGCAGCAG ( SEQ ID NO: 111) GAAGGCAG ( SEQ ID NO: 112 ) CTGGGCAA ( SEQ ID NO: 113 ) TCTGGAGC ( SEQ ID NO: 114 ) CAGGAGAA ( SEQ ID NO: 115 ) CTGGGGCT ( SEQ ID NO: 116 ) CTCCTCCT ( SEQ ID NO: 117 ) GGAGGCTG (SEQIDNO: 118) GGAGGCTG ( SEQ ID NO: 118 ) TGGTGGAG (SEQ ID NO: 119) NO: 67) CCAGTTAACCAAATGGCC( SEQ ID NO: 68 ) CAGCGCCGCCACTTC ( SEQ ID NO: 69 ) CAGAGCCATGCGGATGTA( SEQ ID NO: 70 ) GTGGTAAGGTCCCCGTGAG (SEQ ID NO: 71) TCCGCTGAGCAACTTTGAC (SEQ ID NO: 72) TCAGGCTTCATTATGTTCTTCTCA ( SEQ ID NO: 73 ) Q 〇 o o a c u H u a a < a o H g - AGCTCTCAGACATGTCCTATCTTT ( SEQ ID NO: 75 ) TTTTTCCAACGAATCACCTGT( SEQ ID NO: 76) CCCTTAGGGCTGTTCTGGA ( SEQ ID NO: 77) ATACCAGGGCGAGGAGGA (SEQ ID NO: 1 78) ! CATCTTGTTTTTCCTTGGCTTC ( SEQ ID NO: 79) 1 CATCTTGTTTTTCCTTGGCTTC ( SEQ ID NO: 79) AAGACATTCTTTCCAGTTAAAGTTGAG (SEQ ID NO: 80) NO: 27) TGGCTCATCCCTATGTTCAAATTCA ( SEQ ID NO: 28 ) GCTATCCTCTACTGCTTCCTCAATG ( SEQ ID NO: 29 ) 製造商未提供 CCCGTGTCAACGAGATAAGC( SEQ ID NO: 30) AGCTTCCCACAGCATGAAGA ( SEQ ID NO: 31) GAGTCCTCCAAACCAACAGC ( SEQ ID NO: 32 ) AGAGGAGCGAGATGTTCAAGA (SEQ ID NO: 33 ) CCTCGGTGAGGTAGACCACT( SEQ ID NO: 34) TTTAGAACTCAGTAGCCATCTTGC ( SEQ | ID NO: 35) TCATGATCTGCTTGACTGTGAG (SEQ ID NO: 36) ATGCTGGATGCCGCTACT( SEQ ID NO: 37 ) AGGAAAGATACCTCCTACTCCATTC ( SEQ ID NO: 38) TTGTGGAAAGAAGACTTGGCTA ( SEQ ID NO: 39) TTGTGGAAAGAAGACTTGGCTA ( SEQ ID NO: 39) TGATAGATCCATTCCTATGACTGTAGA (SEQ ID NO: 40) ABI ABI ABI Roche Roche Roche 1 Roche Roche Roche Roche Roche Roche Roche Roche Roche TTK VIPR1 HPRT1 CAD CCL14///CCL15 CENPF 1 ______ COL4A1 FCN3 HCAP-G | RAD54B RDBP SNRPC TOP2A TOP2A HPRT 1 204822_at 205019一s一at HPRT1 202715—at 205392_s_at 207828 s at | _HI 211981_at 205866_at 218663_at 219494_at 209219一at 201342一at 201291_s_at 201292_at HPRT 1 200949249 結果為鑑別特異性表現於肝細胞癌組織中之腫瘤特異性基因，對於18對上述HCC與鄰近非腫瘤肝組織樣本產生基因表現譜。為確保該等譜包括具有穩固表現之基因，僅選擇藉由mas 5.0肖dChip軟體展示顯著差異表現之彼等基因。表5中展示對應於在18個成對樣本令展示肝細胞癌二鄰近非腫瘤肝組織之間的顯著差異表現之基因的探針組之數目展不顯者差異表現之探針組數目隨嚴格度放寬而掸加（亦即由在所有18個樣本曰

對中在HCC與正常組織之間差八表現的基因（18之高谐埋辟上〜之同選擇戚格度）至在18個樣本對個樣本對中在HCC與正當細她 l興止常組織之間差異表現的基低選擇嚴格度））。 1之 Ο 46 200949249 表5:不同嚴格度下高度差異表現之基因數目 „ ^ 「判气今「#在「」,气《^細胞癌& 判斷為「存在」於非腫瘤肝組織中且選擇嚴格度* 織ί+if4 f成「不存在」4「少量存在」於成對肝細對非針目義組織巾之探針組之數目 MAS 5.0 007%%%%%%%%%%%%%%%%7070 0(49382 71604938271 198877 665543322116 /IV iv /tv /V /IV xi\ /IV /V /V /IV ίν /IV /V /V /V /IV /IV /IV 876543210987654321 dChip 兩者 MAS 5.0 dChip 兩者 4 1 0 0 0 0 10 4 1 0 1 0 14 12 2 2 2 1 40 22 8 7 6 3 75 50 15 13 13 3 130 95 32 28 22 9 232 160 59 43 33 16 392 269 94 65 58 29 587 458 142 119 95 44 919 733 253 201 174 71 1358 1184 439 310 290 110 1918 1747 725 490 492 175 2589 2522 1135 756 879 298 3444 3501 1705 1149 1500 499 4432 4717 2520 1771 2436 882 5623 6167 3633 2743 3729 1474 7059 7924 5105 4194 5628 2595 9309 10291 7558 6676 8609 4855 22283 22283 22283 22283 22283 22283 *:選擇嚴格度定義於第13頁，第16-24行。為確定選擇可區分癌性組織與非癌性組織之探針組的最佳嚴格度，將不同選擇嚴格度應用於SCIANTIStm System Pro微陣列資料庫中可獲得之各種正常及腫瘤組織之基因表現資料集。若不同人類原發性癌症亞型及其相應正常組織之資料集對於正常與感染群組包括最少八個樣本，則選擇該等資料集。鑑別出滿足該等標準之總共20種不同癌症亞型及相應正常組織之資料集（表6 )。 47 200949249 表6 :用於本研究中之20種不同癌症類型及相應正常組織之樣本在SCIANTIS™ System Pro資料庫中的編號癌症類型樣本編號正常組織樣本編號乳房，浸潤性腺管癌，原發性 169 乳房，正常 68 乳房，浸潤性小葉癌，原發性 17 乳房，正常 68 結腸，腺癌（除黏液型以外），原發性 77 結腸，正常 180 結腸，腺癌，黏液型，原發性 7 結腸，正常 180 子宮内膜，腺癌，子宮内膜樣型，原發性 50 子宮内膜，正常 23 腎，腎細胞癌，透明細胞型，原發性 45 腎，正常 81 腎，腎細胞癌，非透明細胞型，原發性 15 腎，正常 81 肝，肝細胞癌 16 肝，正常 42 肺，腺癌，原發性 46 肺，正常 42 肺，鱗狀細胞癌，原發性 39 肺，正常 126 卵巢，腺癌，子宮内膜樣型，原發性 22 卵巢，正常 89 卵巢，腺癌，乳突狀漿液型，原發性 36 卵巢，正常 89 胰腺，腺癌，原發性 23 胰腺，正常 46 前列腺，腺癌，原發性 86 前列腺，正常 57 直腸，腺癌（除黏液型以外），原發性 29 直腸，正常 44 皮膚，惡性黑色素瘤，原發性 7 皮膚，正常 61 胃，腺癌（除印戒細胞型以外），原發性 27 胃，正常 52 胃，腺癌，印戒細胞型，原發性 9 胃，正常 52 胃，胃腸基質腫瘤（GIST)，原發性 9 胃，正常 52 曱狀腺，乳突狀癌，原發性；所有變體 29 曱狀腺，正常 24 以表5所示之 18個不同選擇嚴格度，測定根據 SCIANTIStm System Pro資料庫中所提供之資料，全部探針組（n=22,2 83 )中展現癌症類型與正常對應物之間的統計顯 200949249 m 著㈣差異（P<〇.〇5,藉由韋爾奇氏t檢驗）之分率⑺ 及兩度差異表現之探針組數目⑴。該系統統計分析揭示對於20種不同癌症亞型中之19種，對於以p值<〇〇〇5區分癌症組織與其各別正常組織之7 5個探針組選擇1 $對中12 對之嚴格度（圖3 )。以該嚴格度選擇之75個探針組包括特異性表現於HCC組織中之59個探針組及特異性表現於非腫瘤肝組織中之i 6個探針組。7 5個探針組表示總共7丨個不同基因’因為4個基因（Top2A、CCHCIU、CDC2及HMMR) © 各自由兩個探針組表示。圖4及圖5中列出該等71個基因及其功能。將由75個探針組表示之基因的表現強度在由hcc及鄰近非腫瘤肝組織獲得之微陣列資料中進行比較。該等基因在成對HCC與鄰近非腫瘤肝組織樣本之間的表現強度存在極小疊加（圖6 -10 )。為證實此研究中所用之18個成對HCC樣本充分代表此癌症類型，在無成對鄰近非腫瘤肝組織的情況下，在82個 ® 額外HCC樣本中評定該等75個探針組之基因表現強度。如圖6-10所示’ 18個成對HCC樣本及82個非成對HCC樣本之間75個探針組之基因表現強度類似。成對HCC樣本及額外非成對樣本之統計比較展示7 5個探針組中任一基因之表現無顯著差異，且對於75個探針組中之每一者，兩個群體均展現類似平均表現強度（圖11)。為驗證該等75個探針組表示呈現HCC與非腫瘤肝組織之間的顯著差異表現之基因的發現，對來自此研究中所用 49 200949249 之18個成對HCC與非腫瘤肝組織之RNA樣本進行一系列即時定量反轉錄酶聚合酶鏈反應（RT_qPCR )實驗。可獲得之RNA樣本足以研究CNS中所表示基因中之39個。所有 39個基因均具有穿過内含子之適當3’端dna序列以進行可靠RT-qPCR研究。圖12-14證實之該等39個基因高度差異表現之結果與微陣列研究之結果（圖6_1〇) 一致。實施夕/ 2 *呈現癌症與正常組織之間的顯著差異表現之基因的功能特徵材料及方法 0 使用卡爾斯魯厄理工學院（Karlsruhe⑷…阶 Technology)之 Bioinformatic Harvester 資料庫及 Ingenuity Pathway Analysis 資料庫（ingenuity® Systems )獲得由實施例1中所述之75個探針組所表示之顯著差異表現基因的功能註解。結果在Bioinformatic Harvester資料庫中，指明由59個腫瘤特異性探針組表示之55個基因具有以下生物學功能：細 ❹ 胞週期/增殖（27個基因）、調節基因轉錄/表現個基因）、細胞分化（2個基因）、血管生成（3個基因）、信號轉導（2 個基因）、細胞凋亡（2個基因）、其他（5個基因）或未知功能（5個基因）（圖4 )。在該等55個基因中’發現47個存在於Ingenuity Pathway Analysis資料庫中，其中指明32個涉及細胞週期， 14個涉及調節基因表現且丄個涉及脂質代謝（圖15卜在 50 200949249 涉及細胞週期之32個基因中，17個與癌症相關χ ΐ5個與 DNA複製、修復及/或重組相關（圖15)。分析之結果揭示該資料庫中47個差異表現之基因高度富含與細胞週期及DNA複製/修復功能（使用右尾費雪精確檢驗 (right-taUed Fisher’s exact test) p 值為 1〇-ι〇)相關之基因乂及用於細胞運動、細胞生長及癌症之基因（圖16)。在非腫瘤、正常肝組織中展示特異性表現之16個探針組經測定以包括具有多種功能之基因：該等功能包括與免疫反應（3個基因）、糖結合（2個基因）、藥物代謝（2個基因）、促腎上腺皮質素釋放激素之結合（1個基因）、肌肉收縮/消化（1個基因）、碳水化合物代謝（丨個基因）、脂質 /膽固醇代謝（1個基因）' 鉀離子輸送（1個基因）、清道夫受體活性（1個基因）、細胞運動（1個基因）、細胞週期（i 個基因）及細胞黏著（i個基因）相關之功能（圖5)。實施勿5 ··呈現顯著差異表現之基因可區分贅生性組織與正常組織

材料及方法如實施例1所述執行分級聚類分析。結果由實施例1中所鑑別之75個探針組表示之大多數基因 (55個）具有腫瘤特異性且鑑別為涉及細胞週期及/或細胞曰殖（圖4、5及15)，其中兩者均為贅瘤之特點。為判定該等75個探針組能否區分不同癌症類型與正常組織，對六不同類型之主要癌症（其包括肝細胞癌、鼻咽癌、乳癌、 51 200949249 肺癌腎細胞癌及結腸癌）及其相應正常組織的基因表％ · 譜資料執行分級聚類分析。該等結果展示對於該研究中所乎估之所有六種類型癌症該等75個探針組易於區分贅生性組織與相應非贅生性正常組織（圖17-22 )。為證實該發現，使用選擇用於該研究之二十種不同癌症亞i之SCIANTIStm System Pro資料庫中的資料集對75 個探針組中之每一者進行癌症與正常組織中基因表現之統 -十比較m之，對所有2G種癌症類型之各基因執行雙樣本羊爾奇氏t•檢驗。隨後使用由該等比較獲得之t值進行 ❹ 刀級聚類分析（圖23A、B)。對於所有腫瘤特異性探針組计算出间正t值，而對於所有正常組織特異性探針組計算出負t值。對於任何給定癌症，展示腫瘤與正常組織之間的顯著差異表現之大量基因為吾所期望。與該期望一致，該資料集中探針組（n=22,283 )之52%展示㈣性腺管癌與正常乳房組織之間的統計顯著（亦即p值<〇〇5 )基因表現差異。因此隨機選擇任一組基因可能包括一些在腫瘤與正常組 ◎ 織之間差異表現之基因。因此，確保鑑別為差異表現於成對HCC與鄰近非腫瘤組織樣本之間的探針組在數目上顯著多於任何隨機選擇之75個探針組很關鍵。因此’執行對照組研究，其中隨機選擇七十五個（75 個）探針組1〇,〇〇〇次。如實施例1所述，使用選擇用於該研究之20種不同癌症亞型與相應正常組織的SCIANTIStm 基因表現f料集對於隨機選擇探針組中所表示之各基因比 52 200949249 較癌症與正常組織中的基因表現強度。該等結果展示由吾等研究中鑑別為差異表現於HCC與相應正常組織之間的75 個探針組表示之基因數目上顯著超過隨機選擇之差異表現於HCC與相應正常組織之間的75個探針組之數目（圖24 )。該等結果支持以下結論：由該研究中所鑑別之75個探針組表示之基因（參見實施例1)構成共同贅生性特徵 (CNS )，及該等基因及其產物（例如蛋白質、肽、mRNA ) 之表現可用作癌症之普遍標記。 ® 應分/ 4.·7 5個探針組之表現與細胞增殖之相關性材料及方法分敗聚類如實施例1所述執行分級聚類分析。統計分析使用SAS軟體（9· 1.3版）進行統計分析，包括卡方檢驗、費雪精確檢驗、t-檢驗及存活分析（對數秩及威爾科克斯檢驗）。為評定各腫瘤特異性基因在共同贅生性特徵中之〇表現如何與時間依賴性總存活或無遠處轉移存活相關，使用S-plus軟體（第6版）對HCC、NPC或乳癌之資料集執行基於比例危險模型之C〇x回歸分析。結果若共同贅生性特徵中之基因的表現與細胞增殖相關，則分級聚類分析應揭示具有高增殖活性之不同類型之正常組織及器官中該等基因之表現提高。分級聚類分析之熱圖揭不由59個腫瘤特異性探針組表示之基因在高度增殖正常 53 200949249 組織及器官（包括骨髓（生血器官）、胸腺、子宮及睾丸）中具有提高之表現（圖25)。已知為增殖靜止之中樞神經系統的器官及組織展示顯著減少之大多數腫瘤特異性探針組之表現（圖25)。基於該等結果，假設具有59個腫瘤特異性探針組基因之尚得多之表現的癌症將較具增殖性且與較大腫瘤尺寸及/ 或患者之更晚TNM期相關。為檢驗該假設，對乳癌 (n=295 )、HCC ( n=l〇〇 )及鼻咽癌（n=260 )進行分級聚類分析’因為對於該等癌症類型可獲得關於腫瘤尺寸及 TNM期之資料。根據75個探針組之基因表現，將各癌症類型分成兩組（圖2 6 - 2 8 )。一組具有5 5個腫瘤特異性探針組基因之尚表現且另一組具有55個腫瘤特異性探針組基因之較低表現（圖26-28 )。隨後將各癌症類型之兩個組與腫瘤尺寸或TNM期關聯。結果展示59個腫瘤特異性探針組之增加之表現與大塊HCC腫瘤（腫瘤直徑20 cm，與結節型 40 cm) ( ρ=〇·009 )、較大乳癌腫瘤（直徑>2 cm，與4 cm) (ρ=0·0005 )及鼻咽癌之較晚tnm期（ΙΠ+ΐν期，與Ι+π 期）（p=0.027)相關（表7)。所有該等發現支持以下結論：共同贅生性特徵中之59個腫瘤特異性探針組之表現反映贊生性組織與正常組織之細胞增殖活性。 54 200949249 表7:藉由費雪精確檢驗獲得之HCC、NPC及乳癌之分級聚類與不同臨床參數之相關性

肝細胞癌（n= 10 0 ) 臨床變數 P值分化等級（I與II與III) 0.0069 腫瘤尺寸（>1〇 cm與<10 cm) 0.0093 死亡 0.0297 鼻咽癌（n= 1 68 ) 臨床變數 P值遠處轉移 0.00098 期（1與2與3與4) 0.1075 死亡 0.1244 乳癌（n=295 ) 臨床變數 p值分化等級（I與II與III) <.0001 腫瘤尺寸（<2 cm與>2 cm ) 0.0005 死亡 <.0001

實施卸5 :共同贅生性特徵基因之表現與存活相關材料及方法分級聚類 55 200949249 如實施例1所述執行分級聚類分析。統計分析如實施例4所述執行統計分析。結果

為判定呈現由59個腫瘤特異性探針組表示之55個基因之增加之表現及由16個正常組織特異性探針組表示之16 個基因之減少之表現的腫瘤是否與相對於其他腫瘤之不良存活結果相關，藉由分級聚類分析將實施例4中所述之相同HCC、乳癌及鼻咽癌樣本就無遠處轉移存活及總存活進灯分類（圖26-28 )。該分析之結果展示具有59個腫瘤特異性探針組之增加之表現的HCC及乳癌患者具有顯著減少之總存活，其中p值分別為0.037及6 9χ1〇-8(圖29及3〇)。具有59個腫瘤特異性探針組之增加之表現的鼻咽癌及乳癌患者展現較短之無遠處轉移存活，其中對數秩檢驗之p值分別為講38及仏1。、圖及3〇。該等結果表明75

個探針組基因特徵及（尤其）59個腫瘤特異性探針組具有不同癌症亞型之預後價值。值得庄意的是，由藉由肝細胞癌與非腫瘤肝組織之的基因表現差異鑑別之該等75個探針組所表*之基因的現可成功地用於根據存活及遠處轉移風險（圖28及30) 於使用不同、非Affymetdx微陣列平台產生之乳癌資料將乳癌分類。該交又平台應用進—步表明該等基因表示有臨床相關性之共同贅生性特徵基因。共同贅生性特徵基因之表現與腫瘤分化相 56 200949249 材料及方法分級聚類如實施例1所述執行分級聚類分析。統計分析如實施例4所述執行統計分析。結果已熟知具有不良臨床結果之腫瘤通常分化較弱。為判定由59個腫瘤特異性探針組表示之55個基因之增加的表 © 現是否與弱腫瘤分化相關，對具有不同分化度之成人雄性生殖細胞腫瘤進行分級聚類分析。結果展示已知含有高度分化之成熟組織的「畸胎瘤」聚類在一起，其具有59個腫瘤特異性探針組之減少之表現及1 6個正常組織特異性探針組之增加之表現（圖32)。相比之下，分化少得多的胚舱癌、卵黃囊腫瘤及精原細胞瘤聚類在一起，其具有59個腫瘤特異性探針組之增加之表現及16個正常組織特異性探針組之減少之表現（圖32)。因為正常睾丸組織含有高增殖性生殖細胞，所以其與分化較少之生殖細胞腫瘤聚類在一起。為判定HCC及乳癌腫瘤之分化等級是否根據實施例j 中所鑑別之75個探針組之基因表覌強度聚類，進行統計相關研究（圖26及27)。選擇該等兩種癌症類型，因為可獲得腫瘤分化等級資料。對於HCC及乳癌，如由使用75個探針組之分級聚類分析所確定，分化等級（亦即高度、中等及弱）與腫瘤亞群之間的相關性的p值分別為〇⑻7及 <0.0001 (表7)。該等結果表明59個腫瘤特異性探針組之 57 200949249 增加之表現與減少之腫瘤分化相關。 f施勿7 :與遠處轉移或存活相關之基因的鑑別如實施例5所述’在三種極其不同之癌症類型中，由 59個腫瘤特異性探針組表示之55個不同基因與存活及/或遠處轉移密切相關（圖2 9 - 3 1 )。為鐘別5 5個腫瘤特異性基因中何者涉及該等三種癌症類型之存活及轉移，將55個基因之表現強度與產生第一遠處轉移之時間及Hcc、NPC及乳癌患者之死亡時間相關。表8A及8B中列出在該等三種癌症類型中之每一者中展示與無遠處轉移存活或總存活顯 ❹ 著關聯（Ρ<〇·〇5)的基因。特定言之，在所有三種不同癌症類型中 ’ PRC1、CENPF、RDBP、CCNB2 及 RAD54B 之增加之表現與遠處轉移之增加之風險相關（表8A)，而CD。、 CCHCR1及HMGA1之增加之表現在所有三種不同癌症類型中與較短之存活相關（表8Β)β該等結果表明該等特定基因在多種不同癌症中在遠處轉移及/或存活之碟定中發揮關鍵作用，且可充當控制遠處轉移及/或改良存活之治療標靶。因此，上述基因之產物及功能性路徑亦可充當產生新藥以 ❹ 控制癌症生長及癌轉移之標乾，、 58 200949249 表8A:與肝細胞癌（HCC)、鼻咽癌（NPC)及乳癌（BRC) 中之無遠處轉移存活相關的基因。與遠處轉移相關之基因癌症類型 PRC1 CENPF RDBP CCNB2 RAD54B HCC + + + + + NPC + + + + + BRC + + + + +

表8B:與肝細胞癌（HCC )、鼻咽癌（NPC)及乳癌（BRC ) 中之總存活相關的基因。

與存活相關之基因癌症類型 CDC2 CCHCR1 HMGA1 HCC + + + NPC + + + BRC + * * HCC:肝細胞癌（n=100) NPC:鼻咽癌（n=168) BRC:乳癌（n=295) *: CCHCR1及HMGA1基因不存在於用於研究BRC之微陣列中本文所引用之所有專利、公開之申請案及參考文獻之相關教示全部以引用的方式併入本文中。雖然本發明已參考其例示性具體實例尤其展示且描述，但熟習此項技術者應瞭解在不背離本發明之由隨附申請專利範圍涵蓋之範疇的情況下，其中可對形式及細節進行各種改變。 59 200949249 【圖式簡單說明】本案或申請文彳丰人 , 牛3有至少一個以彩色製作之圖式。言具有衫色圖式之專利哎〜a專利申請公開案之複本將在要求』支付必需費用之後由知M u 田曰慧財產局提供。圖1為描述用於雄^，丨^ _

'鑑別展示腫瘤與鄰近非腫瘤組織之严E 的顯著差異表現之基因之算法的流程圖。圖2為也述當41個探針組係隨機選擇時陣列上展示腫瘤與正常組織之問& 、的顯著表現差異（Ρ<〇·〇5 )之探針組之密度刀布之f施例的圖。隨機選擇重複10,000次。沿y軸之值表明P值小於〇〇5之基因之密度。〇圖3為展示探針組數目（第二列，題為「所選探針組之數目、 + 」 p值的圖表，該等探針組係以不同嚴格度（第歹J題為「探針選擇之嚴格度」）選擇，對於所列癌症（左欄）中之每一去，甘Γ_ \ h 有其區分癌症與相應正常組織。底端列中 J出展示P值小於〇〇〇5之不同癌症之總數。12之選擇嚴

格度區分最多數目之癌症與相應正常組織（20種不同癌症類型中之19種使用二項檢驗計算P值，且該等p值表月與隨機選擇之探針組相比，為區分腫瘤與相應正常組織，所選探針組所富含之程度。圖4為肝細胞癌（HCC )腫瘤特異性基因之列表，該等基因在1 8個成對Hcc與鄰近非癌性肝組織樣本之至少12 個中展示顯著差異表現（12之嚴格程度）。所列基因在HCc 組織樣本中展示顯著表現，但在鄰近非癌性肝組織樣本中 60 200949249 未展示顯著表現。對於各基因展示Affymetrix晶片上相應探針組之affymetrix iD號（AFFY—ID ) '基因符號基因之已知或推定功能及選擇該（該等）基因之嚴格程度。總共 55個基因由59個探針組表示，因為T〇p2A、cCHCRl、 HMMR及CDC2各自由兩個探針組表示。如所示，對廣泛 ' 類別之基因功能賦予陰影。圖5為特異於非癌性肝組織之基因的列表，該等基因在1 8個成對HCC與鄰近非癌性肝組織樣本之至少丨2個中〇展示顯著差異表現。所列基因在非癌性肝組織樣本中展示顯著表現，但在鄰近HCC組織樣本中未展示顯著表現。對於各基因展示Affymetrix晶片上相應探針組之affymetrix ID號（AFFY_ID)、基因符號、基因之功能及18個成對hcc 與鄰近非癌性肝組織樣本令以大於或等於12之嚴格程度展示基因差異表現之數目（選擇之嚴格度）。如所示，對廣泛類別之基因功能賦予陰影。圖6-1 0為描述展示成對肝細胞癌與鄰近非腫瘤肝組織之間的顯著差異表現之7 5個探針組中所表示之基因的表現強度的一系列圖。表明表現強度之基因展示於各圖之左上角。圖6-丨0中之每一者含有展示75個探針組中所表示之個別基因之表現強度的15個圖。對於18個成對鄰近組織樣本之非癌性肝組織（PN)與HCC(PHCC)組織樣本以及未與相應鄰近非癌性肝組織樣本成對之82個額外Hcc樣本 (HCC)展示表現強度。圖U為展示75個探針組中之每一者之基因表現【統計 61 200949249 量之圖表’該等75個探針組展示成對肝細胞癌與鄰近非腫瘤肝組織之間的顯著差異表現。對於各基因’展示 Affymetdx晶片上相應探針組之affymetrix m號 (Affymetrix探針組ID )、丨8個成對HCc與鄰近非癌性肝組織樣本中以12之嚴格程度展示基因差異表現之數目及百分比（所包括之樣本對（％))、基因符號、如使用mas 5 〇軟體測定之18個成對鄰近組織樣本之非癌性肝组織（pN) 及HCC( PHCC )組織樣本中以及82個額外HCC樣本（Hcc ) 中基因表現之平均信號強度（MAS 5 〇信號強度），及基於❹ PN 與 PHCC (( A)與（B))及 PHCC 與 HCC (( B)與（C)) 之配對t檢驗之p值。圖12-14為描述如由即時定量RT pcR所測定之展示成對肝細胞癌與鄰近非腫瘤肝組織之間的顯著差異表現之75 個探針組中所表示之39個基因的表現強度的一系列圖。表明表現強度之基因展示於各圖之左上角。對於18個成對鄰近組織樣本之正常（PN)及HCC(PHCC)組織樣本展示表

現強度° Q 圖15列出展示成對hcc與非腫瘤肝組織之間的顯著差異表現之75個探針組中所表示之55個HCC特異性基因的

Ingenuity Pathway分析結果。「焦點基因（F0CUS Gene)」表不包括於表明最佳功能之鑑別網路中之所提交基因之數目。分值」由Ingenuity Pathway軟體產生，其不具有重要意義。、〃圖16為描述由Ingenuity pathway分析賦予由59個腫 62 200949249 瘤特異性探針組表示之基因的生物學功能（x軸）的圖。顯著水準沿y軸表示為-i〇g(p值）。臨限線設為 1.301=-l〇g(〇,〇5)。

圖17描述HCC ( n=100 )及非腫瘤肝組織（η=ι 8 )之微陣列資料集的分級聚類分析。在圖頂部以灰色突出之樣本為非腫瘤肝組織。在左邊以灰色突出之探針組為特異於 1 8對HCC與非腫瘤肝組織之12對中之鄰近非腫瘤肝組織的探針組（參見圖5)。圖18描述鼻咽癌（n=168)及正常鼻咽組織（n=i5) 之微陣列資料集的分級聚類分析。在圖頂部以灰色突出之樣本為非腫瘤肝組織。在左邊以灰色突出之探針組為特異於18對HCC與非腫瘤肝組織之12對中之鄰近非腫瘤肝組織的探針組（參見圖5 )。圖19描述乳癌（n=232)及正常乳房組織（n=25)之微陣列資料集的分級聚類分析。利f料集包括國際基因組協會之207個乳癌樣本（參見表3)。在圖頂部以灰色突 .出之樣本為正常乳房組織。在左邊以灰色突出之探針組為特異於18對HCC與非腫瘤肝組織之12對中之鄰近非腫瘤肝組織的探針組（參見圖5)。圖20描述肺癌（n=2〇〇)及正常肺組織之微陣列資料集的分級聚類分析。所用資料集表示國際基因组協會之74個肺癌樣本（參見表3)、杜克大學之ιη個肺癌樣本（參見表3)、辜公亮基金會孫逸仙治癌中心醫院（τ^ Taiwan)i 15個肺癌樣本及15個正常肺組織樣本。在頂部 63 200949249 以灰色突出之樣本為正常肺組織。在左邊以灰色突出之探針組為特異於18對HCC與非腔瘤肝組織之η對中之鄰近非腫瘤肝組織的探針組（參見圖5)。圖21描述結腸癌（n=161)及正常結腸組織（η=ι5) 之微陣列資料集的分級聚類分析。該等資料集表示國際基因組協會之U6個結腸癌樣本（表3)及辜公亮基金會孫逸仙癌中〜醫院之15個結腸癌& 15個正常結腸組織樣本在頂°卩以灰色突出之樣本為正常結腸組織樣本。在左邊以灰色突出之探針組為特異於18對歌與非腫瘤肝組織之12對中之鄰近非腫瘤肝組織的探針組（參見圖$ )。圖22描述腎細胞癌（n=9)及正常腎組織（n = 8)之微陣列資料集的分級聚類分析。該資料集由波士頓大學獲得 (表）在頂°卩以灰色突出之樣本為正常腎組織樣本。在左邊以灰色突出之探針組為特異於18對HCC與非腫瘤肝組織之12對中之鄰近非腫瘤肝組織的探針組（參見圖$ )。圖23 A描述比較75個所選探針組（參見圖4及$ )在 SCIANTIStm ΡΓΟ System資料庫之2〇種不同癌症類型及其相應正常組織之間的基因表現強度的t統計量結果的分級聚類分析。該等20種不同癌症類型列於圖頂部。該等結果揭不對於所測試之所有癌症類型，除圖右端之胃腸基質腫瘤（GIST )以外，59個腫瘤特異性探針組之類群具有高正 t值且16個正常組織特異性探針組之類群具有負丨值。灰色表示+9之t值，白色表示〇2t值且黑色表示_9it值因此中間值為彩色的。 200949249 圖23B描述如圖23A所述，使用來自SCIANTISTM Pro

System之相同20種不同癌症類型及其相應正常組織之基因表現資料的75個隨機選擇探針組之t統計量結果的分級聚類分析。對於該等隨機選擇之探針觀察到混亂的聚類圖案。圖24為描述使用由2〇種不同癌症樣本類型及其相應正常組織之SCIANTISM Pr〇 System資料庫獲得之基因表現資料使用圖4及5中所列之75個探針組執行的t檢驗的

分類p值的圖。所有75個探針組及2〇種癌症類型之分類p 值由圖左邊最低至圖極右端最高之線描述。對於對照組， 75個探針組隨機選擇10,〇〇〇次且對1〇,〇〇〇個隨機選擇之結果進行統計分析且作圖為10,000條線（展示於極右端線之左邊）。圖25描述使用展示成對肝細胞癌與鄰近非腫瘤肝組織之間的顯著差異表現之列於圖4及5中之75個探針組的來自不同正常器官及組織之基因表現資料庫（GE〇)資料集的基因表現資料的分級聚類分析。12個淋巴瘤/白血病細胞系及兩個結腸腺癌亦包括於該資料集中。該資料集以ge〇寄存編號：GSE1133歹,】出。項部正f組織/細胞為f趙細胞、睾丸細胞、扁桃體及胎兒肝。剩餘正常組織/細胞包括以下各者之各部分：腦、脊趙、腎上腺、闌尾、心臟、姨島細胞、腎、肝、肺、淋巴結、印巢、胰腺、垂體、前列腺、唾液腺、骨絡肌、皮膚、胸腺、甲狀腺、舌、氣管、子宮、全血及不同白企球亞群（未突出）。圖26描述使用展示成對肝細胞癌與鄰近非腫瘤肝組織 65 200949249 · 之間的顯著差異表現之75個探針組的100個HCC樣本之基因表現資料的分級聚類分析的熱圖。在辜公亮基金會孫逸仙治癌中心醫院產生100個HCC樣本之基因表現譜資料。組1表不HCC樣本中展示59個腫瘤特異性探針組（參見圖 4)之減少之表現的類群，且組2展示增加之表現。特異於正常組織之16個探針組使用淡陰影表示。圖27描述使用展示成對肝細胞癌與鄰近非腫瘤肝組織之間的顯著差異表現之75個探針組的168個Npc樣本之基因表現資料的分級聚類分析的熱圖。在辜公亮基金會孫逸 ❹ 仙治癌中心醫院產生168個Npc樣本之基因表現譜資料。組1表不NPC樣本中展示59個腫瘤特異性探針組（參見圖 4)之減少之表現的類群，且組2展示增加之表現。特異於正常組織之1 6個探針組使用淡陰影表示。圖28描述使用可與荷蘭癌症學會（NKI )乳癌資料集匹配之75個探針組之基因的來自NKI之295個乳癌樣本之基因表現資料的分級聚類分析的熱圖。特異於正常組織之探針組使用淡陰影表示。75個探針組中一些基因不存在於 ❹ NKI之基因表現譜f料集巾，且@此*包括於分級聚類分析中。組1表示展示腫瘤特異性探針組之減少之表現的乳癌樣本，且組2表不展不相同探針組之增加之表現的乳癌樣本。樣本號展示於圖頂部。與75個探針組匹配之基因展示於左邊。特異於正常組織之基因使用淡陰影表示。圓29A為描述如由分級聚類分析（參見圖％ )確定之兩組HCC患者之無轉移存活曲線之圖。括號中之數字表示 66 200949249 轉移事件。圖29B為描述如由分級聚類分析（參見圖26)確定之兩組HCC患者之總存活曲線之圖。括號中之數字表示死亡事件。圖30A為描述如由分級聚類分析（參見圖28)確定之兩組乳癌患者之無轉移存活曲線之圖。括號中之數字表示轉移事件。圖30B為描述如由分級聚類分析（參見圖28)確定之兩組乳癌患者之總存活曲線之圖。括號中之數字表示死亡事件。圖31A為描述如由分級聚類分析（參見圖27)確定之兩組鼻咽癌（NPC )患者之無轉移存活曲線之圖。括號中之數字表示轉移事件。圖31B為描述如由分級聚類分析（參見圖27)確定之兩組鼻咽癌（NPC)患者之總存活曲線之圖。括號中之數字表示死亡事件。圖32描述使用展示成對肝細胞癌與鄰近非腫瘤肝組織之間的顯著差異表現之75個探針組的正常睾丸及具有不同刀化度（參見圖例（key ))之成人生殖細胞腫瘤的分級聚類分析。右邊之淡背景陰影表明16個正常組織特異性探針板之類群。與高度分化之腫瘤（例如畸胎瘤）才“匕，分化較少之腫瘤（胚胎癌、印黃囊腫瘤及精原細胞瘤）展示腫瘤特異性探針組之較高表現及特異於正常組織之㈣探針組之較少表現。 67 200949249 圖33為癌症之三種不同先前報導之共同特禮丈〈第 ~~~. 欄：Whitfield ML 等人，iWziwre Cawcer 6:99_ ι 〇6 (2006)，第二及第二爛.Rhodes DR 等人，/Voc. dcac?. •ScZ. t/以/07:9309-9314 (2004))與本文所述之共同贅生性特徵（第四欄）（參見實施例i及圖4及5)的比較。【主要元件符號說明】無

68 200949249 序列表 <110>中國合成橡膠股份有限公司高國彰陳大元黃拓宇黃達夫 <12〇>用於檢測癌症之方法、藥劑及套組 <130> 4261.1000002 <150> US 61/123,761 <151> 2008-04-11 <160> 119

<17〇> 適用於 Windows 4.0 版的 FastSEQ

<21〇> 1 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <4〇〇> 1 24 cagaaacacc tgtaaggacc agaa <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220>

<223>寡核苷酸引子 <400> 2 24 gcaggagcta gagagggata agaa <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <4〇〇> 3 ggccaagaat gtggtgaaag taaat <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> 25 200949249 <223>寡核苷酸引子 <400> 4 tgaagacacg tgggtcgaat g <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 5 gctgaactag caactaagaa accac <210> 6 <211> 20 <2X2> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 6 cagcctgcga gacctaagag <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 7 gggacacgta aatggtcttc agtt <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 8 cgcactgcga ggagaagat <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213 >人工序列 <220> 寡核苷酸引子 <400> 9 actgcagtgg aaaaacatct tgact 25200949249

<210> 10 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 10 gcaagtcatc ttccctaccc atatt <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <22〇> <223>寡核苷酸引子 <400> 11 ggcctttgcg cgtacag <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 12 gccgaccaaa gggaagca <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 13 caagcatgtt gtgaagttga aagatga <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213 >人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 14 gctggc在gag ttiattggaaia agga <210> 15 <211> 25 <212> DNA<213>人工序列 17 18 27 3 24 200949249 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 15 gaaactgaat gaccaagcaa acact <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213 >人工序列 <22〇> <223>寡核苷酸引子 <400> 16 aggaggaaac ggtgaaggac ta <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 17 ccgatttgtg gaggatgaga aagat <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 18 ccctgcaact ggaagaagga <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 19 aggaagggtt ctgccagaga <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 20 gcattcagcc tagttcctgg tt 20200949249

<210> 21 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 21 agcgagctct caaagcaaga <210> 22 <21X> 18 <2X2> DNA <213>人工序列 <220>寡核苷酸引子 <400> 22 cctgcaggca tccctgta <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 23 ccgtccctct ctgacagttc <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213 >人工序列 <220>寡核苷酸引子 <400> 24 cctcagatga tgcctatcca gaaat <210> 25 <211> 21 <212> DNA C213>A工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 25 cgtgggtgtc atgatgatgc a <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 18 20 25 5 21 21200949249 <220><223>寡核苷酸引子 <4〇〇> 26 caaatggctg ccaaactgga a <210> 27 <2ll> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 27 cgccttccag ctgttacatc tt 22 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 28 tggctcatcc ctatgttcaa attca 25 <210> 29 <21X> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 29 gctatcctct actgcttcct caatg 25 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 30 cccgtgtcaa cgagataagc <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 20 <400> 31 6 200949249 agcttcccac agcatgaaga 20 <210> 32 <2X1> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> 寡核苷酸引子

<400> 32 gagtcctcca aaccaacagc <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 33 agaggagcga gatgttcaag a <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 34 cctcggtgag gtagaccact <210> 35 <211> 24 <212> DNA 人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 35 tttagaactc agtagccatc ttgc <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 36 tcatgatctg cttgactgtg ag <210> 37 <211> 18 <212> DNA 20 21 20 24 7 22 18 200949249 <213 >人工序列 <220> 寡核苷酸引子 <400> 37 atgctggatg ccgctact <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 寡核苷酸引子 <400> 38 aggaaagata cctcctactc cattc 25 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213 >人工序列 <22Q><223>寡核苷酸引子 <400> 39 ttgtggaaag aagacttggc ta 22 <2Z0> 40 <211> 27 <212> <213> DNA人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 40 tgatagatcc attcctatga ctgtaga 27 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 41 tccatcacca tttgaatagc ttgca 25 <210> 42 <211> 22 <212> DNA 人工序列 <22Q><223>寡核苷酸引子 8 22200949249 <400> 42 ttgtaacggg agaggagacc tt <210> 43 <211> 22 <212> DKA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 43 caggagtttg ctgcttgcat ac 22 <210> 44 <211> 19 <212> <213> DNA 人工序列

<22〇> c223>寡核苷酸引子 <400> 44 gcccagagca gaggttgtc <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 19

<400> 45 cttctggcca cacttcatta ttgg <2X0> 46 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 46 cagctaattt gtcccgaaac tcatg <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 24 25 <400> 47 cagctccaca aagtctccta ttcc <210> 48 <211> 19 9 24 200949249

<212> DNA <213>人工序列 <220> 寡核苷酸引子 <400> 48 gctcctgacc tcggtacct 19 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 49 tggcaaagga gcaaatagtc cat 23

<210> 50 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 50 catgcctcag atgtttgaaa acctt 25 <210> 51 <2X1> 22 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 51 gcccattcag caactctttc tc 22

<210> 52 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 52 tggtttcctt cctggagttg tg 22

<210> 53 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 10 20200949249

<400> 53 caagctgaca gcggagtttt <2X0> 54 <211> 25 <212> DNA c213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 54 gacaacaact tctgcacttg acaaa <210> 55 <211> 27 <212> DNA人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 55 gtcttcactc ctttcgttta agtcaga <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 56 ccagaacttc tccagcccat a <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 57 gtggagtggc tcgcctta <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220>寡核苷酸引子 <400> 58 cgcaccccag ttctcaaac <210> 59 25 27 21 18 11 19 200949249

<211> 30 <212> DWA 人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 59 tctggattca ctaatctagt tgtagtcaca 30 <210> 60 <211> 30 <212> vm <213>人工序列 <220> 寡核苷酸引子 <400> 60 gccaattctt tcaaaatatg cttcaatgtc 30 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 61 ctagtctctc acgaacacaa agct 24 <210> 62 <211> 16 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 62 cgggccatcc cttggt 16 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> 寡核苷酸引子 <400> 63 gtagcatcag atttggaagc ctttg 25 <210> 64 <21X> 23 <212> mA <213>人工序列 12 <220> 23200949249

<223>寡核苷酸引子 <400> 64 ctcttcaggc aggtcaaaac tct <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 65 tccttctcgt cgtcgtagta gtt <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <4〇0> 66 gttcttccgc acttcttcaa tgtg <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 67 cctgcatgga ttagcacata gtct <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 68 ccagttaacc aaatggcc <210> 69 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 69 cagcgccgcc acttc 23 24 24 18 13 15 18200949249 <210> 70 <211> 18 <212> DNA 人工序列 <220>寡核苷酸引子 <400> 70 cagagccatg cggatgta <210> 71 <21X> 19 <212> DNA <213 >人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 71 gtggtaaggt ccccgtgag <210> 72 <211> 19 <212> DKA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 72 tccgctgagc aactttgac <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213 >人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 73 tcaggcttca ttatgttctt ctca <210> 74 <211> 19 <212> DNA 人工序列 <220><223>寡核苷酸引子 <400> 74 ctgtggaggc tcagggaat <210> 75 <21X> 24 DNA <213 >人工序列 19 19 24 14 19 24 200949249 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 75 agctctcaga catgtcctat cttt

<210> 76 <211> 21 <212> DNA <2X3> 人工序列 <220> <223> 寡核苷酸引子 <400> 76 tttttccaac gaatcacctg <210> 77 <21X> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 寡核苷酸引子 <400> 77 cccttagggc tgttctgga <210> 78 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 21 19 <220> <223>寡核苷酸引子 <AOO> 78 18 ataccagggc gaggagga

<210> 79 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 79 22 catcttgttt ttccttggct tc <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> 寡核苷酸引子 <400> 80 aagacattct ttccagttaa agttgag 15 27 21200949249 <21〇> 81 <211> 21 <212> Dm 人工序列 <220><D3>寡核苷酸探針 <400> 81 ctggcttaag tcttgaaact a <210> 82 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>寡核苷酸探針 <400> 82 tcatgctggc caccttg <210> 83 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220><223 >寡核苷酸探針 <40〇> 83 cttgatggcg atgaattt <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220><223 >寡核苷酸探針 17 18 <400> 84 caagtcaaag ggatcttca <210> 85 <211> 16 <212> DNA <213 >人工序列 <220><223 3寡核苷酸探針 19 <400> 85 caaagctctg aaaatc <210> 86 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 16 16 200949249 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 86 cagaccatca agcaataca 19 <210> 87 <211> 17 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 87 17 ctgctgagga tttcttt

<210> 88 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針

<400> 88 ttggtggtga tgataacc <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>寡核苷酸探針 <400> 89 tccaggattt tcaatatgtc cc <210> 90 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 90 cttgaggaaa gaaatctagt attat <210> 91 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>寡核苷酸探針 <400> 91 18 22 25 17 200949249 ctgctcaatg gactttc 17 <210> 92 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223 >寡核苷酸探針 <400> 92 aagacccgga aaacc 15 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 93 caactcaaat cggaagtatc 20 <210> 94 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 94 ttcattcacc gttttgcc 18

<210> 95 <211> 18 <212> DNA 人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 95 caaagaccca gaacatca 18 <210> 96 <211> 16 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 96 cagttggcca gcttca 16

<210> 97 <211> 19 <212> DNA 18 19 200949249 <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 97 aatgagacga gaacacttc

<210> 98 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 寡核苷酸探針 <400> 98 tttggagccg actgcaag <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 寡核苷酸探針 <400> 99 ccagaagact aaagcttcac <2X0> 100 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 寡核苷酸探針 <400> 100 ctggccaaag ggatca <210> 101 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 寡核苷酸探針 <400> 101 attggagcag aaagaaca <210> 102 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 18 20 16 <22〇> <223>寡核苷酸探針 19 18 200949249 <400> 102 ccccatccag tggctg <210> 103 <211> 16 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <4〇〇> 103 cttcagcgag aacttt <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213 >人工序列 <22Q> <223>寡核苷酸探針 <400> 104 cttcaatcct ctagactttg <210> 105 <2XX> 16 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223 >寡核苷酸探針 <400> 105 ccggacaggc ctctac

<210> 106 <211> 19 <212> DNA 人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 106 tttgcgagag aaggataag <210> 107 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 107 cagcctgaac atttcccac <210> 108 <211> 15 200949249 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 108 ccgcctgcac ctcac <210> 109 <211> 8 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 109 ccaggctg

<210> 110 <211> 8 <212> DNA <213>人工序列 c220> 寡核苷酸探針 c4QO> 110 cttcctcc <2J.0> 111 <211> 8 <212> DNA <213 >人工序列 <220> 寡核苷酸探針 <400> 111 ggcagcag <210> 112 <211> 8 <212> DNA <213>人工序列 <220> 寡核苷酸探針 <4〇〇> 112 gaaggcag

<210> 113 <211> S <212> DNA 人工序列 <22〇> <223>寡核苷酸探針 200949249 <4〇〇> 113 ctgggcaa <210> 114 <211> 8 <212> DNA <213>人工序列 <220> 寡核苷酸探針 <400> 114 tctggagc <210> <211> <212> <213> 115 8

DNA 人工序列 <220> 寡核苷酸探針 <400> 115 caggagaa <210> 116 <211> 8 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針

<400> 116 ctggggct <210> 117 <211> 8 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 117 ctcctcct <210> 118 <211> 8 <212> DNA <213>人工序列 <220> 寡核苷酸探針 <400> 118 ggaggctg <210> 119 200949249 <211> 8 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>寡核苷酸探針 <400> 119 tggtggag

Claims

200949249 七、申請專利範圍： 1. 一種診斷個體是否患有癌症之方法，其包含檢測基因亞群在來自該個體之樣本中之表現量，其中該亞群中之基因· a) 選自由以下各者組成之群：MELK、PLVAP、TOP2 A、 NEK2、CDKN3、PRC1、ESM1、PTTG1、TTK、CENPF、 RDBP、CCHCIU、DEPDC卜 TP5313、CCNB2、CAD、CDC2、 HMMR、STMm、HCAP-G、MDK、RAD54B、ASPM、HMGA卜 0 SNRPC ' IGF2BP3 ' SERPINH1 ' COL4A1 > LARP1 ' LRRC1 ' FOXM1 ' CDC20' UBE2M> DNAJC6' FEN1 ' ASNS' CHEK1 > KIF2C、AURKB、NPEPPS、KIF4A、E2F8、EZH2、ZNF193、 ILF3、EHMT2、SF3A2、NPAS2、PSME3、INPPL1、BIRC5、 SULT1C1、NSUN5B、HN1 及 NUSAP1 ;且 b) 過度表現於該癌症中， ' 其中該亞群之基因在來自該個體之樣本中相對於對照組表現量增加表明該個體患有該癌症。 ❹ 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該亞群由該群之至少約二十個基因組成。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該癌症選自由以下癌症組成之群：乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎細胞癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌及甲狀腺癌。 4.如申請專利範圍第1項之方法，其中該癌症選自由以下癌症組成之群：肝細胞癌、鼻咽癌、乳癌、肺癌、腎細 200949249 胞癌及結腸癌。癌本 5.如申請專利範圍第 6_如申請專利範圍第 4項之方法，其中該癌症為肝細胞 1項之方法，其中該樣本為血液樣其中該對照組為非癌其中該非癌性樣本由其中該對照組為參考 7.如申請專利範圍第1項之方法性樣本。 8·如申請專利範圍第7項之方法，該個體獲得。 9.如申請專利範圍第1項之方法標準。 10.如申請專利範圍第丨項之方法，其中藉由測定由該亞群中之基因所編碼之mRNA分子之含量在該樣本中檢測該等基因的表現量。 11·如申請專利範圍第10項之方法，其中使用反轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR )測定該等mRNA分子之含量。 12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該個體為人類。 13. —種向患有癌症之個體提供轉移風險之預後的方法’其包含： a)檢測一或多個選自由PRC1、CENPF、RDBP、CCNB2 及RAD54B組成之群之基因在來自該個體之樣本中的表現量，及 b)將該表現量與對照組進行比較，其中該一或多個基因在來自該個體之樣本中相對於該 200949249 對照組表現量增加表明該癌症之轉移風險增加的預後。如申請專利範圍第13項之方法，其中該個體患有選自由肝細胞癌、鼻咽癌及乳癌組成之群之癌症。 .如申請專利範圍第13項之方法，其^轉遠處轉移風險。 & 16. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該樣本樣本。 ❹

17. 如申請專利範圍帛13帛之方法，其中該對照組為非癌性樣本。 18·如申請專利範圍第17項之方法’其中該非癌性樣本由該個體獲得。 19. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該對照組為參考標準。 20. 如申請專利範圍第13項之方法，其中藉由測定由該一或多個基因所編碼之mRNA分子之含量檢測該一或多個基因之表現量。 21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中使用反轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR )測定該mRNA分子之含量。 22. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該個體為人類。 23.—種對患有癌症之個體提供存活預後之方法，其包含： a)檢測一或多個選自由CDC2、CCHCR1及HMGA1 組成之群之基因在來自該個體之樣本中的表現量，及 200949249 b)將該表現量與對照組進行比較，其中該一或多個基因在來自該個體之樣本中相對於該對照組表現量增加表明較短存活之預後。 24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該個體患有選自由肝細胞癌、鼻咽癌及乳癌組成之群之癌症。 25. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該樣本為血液樣本。 26. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該對照組為非癌性樣本。 27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該非癌性樣本由該個體獲得。 28. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該對照組為參考標準。 29. 如申請專利範圍第23項之方法，其中藉由測定由該一或多個基因所編碼之mRNA分子之含量檢測該一或多個基因之表現量。 30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中使用反轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR)測定該mRNA分子之含量。 31. —種用於診斷個體是否患有癌症之套組，其包含一組能夠檢測至少約十個選自由以下各者組成之群之基因的表現量的探針：MELK、PLVAP、TOP2A、NEK2、CDKN3、 PRC1、ESM1、PTTG1 ' TTK、CENPF、RDBP、CCHCR1、 DEPDC卜 TP5313、CCNB2、CAD、CDC2、HMMR、STMN1、 HCAP-G、MDK、RAD54B、ASPM、HMGA1 ' SNRPC、 200949249 IGF2BP3 > SERPINH1 ' COL4A1 ' LARP1 ' LRRC1 ' FOXM1 ' CDC20、UBE2M、DNAJC6、FEm、ASNS、CHEK 卜 KIF2C、 AURKB、NPEPPS、KIF4A、E2F8、EZH2、ZNF193、ILF3、 EHMT2、SF3A2、NPAS2、PSME3、INPPL1、BIRC5、 SULT1C1、NSUN5B、HN1 及 NUSAP1。 32.如申請專利範圍第3 1項之套組，其中該等探針包括核酸探針。 33.如申請專利範圍第32項之套組，其中該等核酸探針〇能夠與該等基因之mRNA轉錄物特異性雜交。 34_如申請專利範圍第31項之套組，其中該等探針包括與該等基因之蛋白質產物特異性結合之抗體探針。 3 5 ·如申請專利範圍第3 1項之套組，其中該等探針包括可檢測標記。 3 6.如申請專利範圍第3 1項之套組，其中該一組探針能夠檢測該群中之所有基因之表現量。 37.—種用於對患有癌症之個體提供該癌症之轉移風險 ® 之預後的套組，其包含能夠檢測一或多個選自由PRC 1、 CENPF、RDBP、CCNB2及RAD54B組成之群之基因之表現量的探針。 3 8.如申請專利範圍第37項之套組，其中該探針為與由該一或多個基因所編碼之mRNA特異性雜交之核酸探針。 3 9.如申請專利範圍第37項之套組，其中該探針為與由該一或多個基因所編碼之蛋白質特異性結合之抗體探針。 40.如申請專利範圍第37項之套組，其中該探針包括可 200949249 檢測標記。 41 · 一種用於對患有癌症之個體判定存活預後之套組，其包含能夠檢測一或多個選自由CDC2、CCHCR1及HMGA1 組成之群之基因之表現量的探針。 42·如申請專利範圍第41項之套組，其中該探針為與由該一或多個基因所編碼之mRNA特異性雜交之核酸探針。 43·如申請專利範圍第41項之套組，其中該探針為與由該一或多個基因所編碼之蛋白質特異性結合之抗體探針。 44. 如申請專利範圍第41項之套組，其中該探針包括可檢測標記。 45. —種確定癌症基因表現譜之方法，其包含： a )檢測基因在患有癌症之個體之癌性樣本中之表現， b )檢測該等基因在來自該個體之非癌性樣本中之表現， c)鑑別差異表現於該患有該癌症之個體之該癌性樣本與該非癌性樣本之間的基因，從而確定該癌症之基因表現譜。 46. —種診斷個體是否患有癌症之方法，其包含檢測基因亞群在來自該個體之樣本中之表現量，其中該亞群中之基因： a) 選自由以下各者組成之群：NAT2、CD5L、CXCL14、 VIPIU、CCL14/15、FCN3、CRHBP、GPD 卜 KCNN2、HGFAC、 FOSB、LCAT、MARCO、CYP1A2、FCN2 及 DPT ;且 b) 在該癌症中表現不足， 200949249 其中該亞群之基因在來自該個體之樣本中相對於對照組表現量減少表明該個體患有該癌症。 47_如申請專利範圍第46項之方法，其中該癌症選自由以下癌症組成之群：乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎細胞癌、肝癌、肺癌、印巢癌、姨腺癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌及曱狀腺癌。 48. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該癌症選自由以下癌症組成之群：肝細胞癌、鼻咽癌、乳癌、肺癌、腎 ❹ 細胞癌及結腸癌。 49. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該癌症為肝細胞癌。 5 0.如申請專利範圍第46項之方法，其中該樣本為血液樣本。 5 1.如申請專利範圍第46項之方法，其中該對照組為非癌性樣本。 5 2 _如申請專利範圍第5 1項之方法，其中該非癌性樣本 ® 由該個體獲得。 53·如申請專利範圍第46項之方法，其中該對照組為參考標準。 54. 如申請專利範圍第46項之方法，其中藉由測定由該亞群中之基因所編碼之mRNA分子之含量在該樣本中檢測該等基因的表現量。 55. 如申請專利範圍第54項之方法，其中使用反轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR )測定該等mRNA分子之含量。 200949249 56. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該個體為人類。 57. —種用於診斷個體是否患有癌症之套組，其包含一組能夠檢測至少約五個選自由以下基因組成之群之基因的表現量的探針：NAT2、CD5L、CXCL14、VIPIU、CCL1 4/15、 FCN3、CRHBP、GPD1、KCNN2、HGFAC、FOSB、LCAT、 MARCO、CYP1A2、FCN2 及 DPT。 58. 如申請專利範圍第57項之套組，其中該等探針包括核酸探針。 59. 如申請專利範圍第58項之套組，其中該等核酸探針能夠與該等基因之mRNA轉錄物特異性雜交。 60. 如申請專利範圍第57項之套組，其中該等探針包括與該等基因之蛋白質產物特異性結合之抗體探針。 6 1.如申請專利範圍第57項之套組，其中該等探針包括可檢測標記。 62.如申請專利範圍第57項之套組，其中該一組探針能夠檢測該群中之所有基因之表現量。八、圖式： (如次頁） 8