TW200930814A - Method for producing a foaming agent - Google Patents

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TW200930814A
TW200930814A TW097139772A TW97139772A TW200930814A TW 200930814 A TW200930814 A TW 200930814A TW 097139772 A TW097139772 A TW 097139772A TW 97139772 A TW97139772 A TW 97139772A TW 200930814 A TW200930814 A TW 200930814A
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TW
Taiwan
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agent
fermentation medium
cloud point
antifoaming agent
fermentation
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TW097139772A
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English (en)
Inventor
Andrew Richard Cox
Andrew Baxter Russell
Christopher Mark Tier
Original Assignee
Unilever Nv
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Description

200930814 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於 本發明係關於工業發酵方法。具體而士 藉由發酵而於胞外製造發泡劑。 【先前技術】 發泡係需氧深層發酵中之常男門作也一 中兄問題。發泡係出於為所培 養之需氧生物體（例如細菌、酵|、古杜 ^ 口 晖母、真菌、藻類、細胞培
養物）生長提供氧氣之目的藉由將氣體通人發酵培養基而 引發。若發酵培養基中含有諸如蛋白f、多糖或脂肪酸等 表面活性組份，則在通入的氣泡離開液體時可在培養基表 面形成發泡體。發泡會引起很多問題，包含產物、營養 素、及細胞會不期望地夾帶入發泡體中，並可造成過程操 控困難"控制發泡的已知方法係運用消泡劑，其中常用的 幾個類型有：聚矽氧類（例如聚二甲基矽氧烷）、聚烷二醇 (例如聚丙二醇）、脂肪酸、聚酯及天然油（例如亞麻籽油、 大豆油）。消泡劑在氣泡表面替代發泡體形成組份，藉由 氣泡聚結引起發泡體破滅。消泡劑可在發酵開始時及/或 期間添加。 當意欲將發酵產物用於食品、個人產品或藥品中時，人 們非常期望生產性生物體將該產物分泌於發酵培養基中 €即胞外而非胞内製造）。此可避免為釋放產物用於回收而 需要藉由物理或化學方法來破壞細胞。藉由保持細胞完整 性’可很容易地將產物與細胞物質分離以使其不含有一般 被視為不期望污染物之胞内及基因物質。當生產性生物體 1353l6.doc 200930814 經基因改造時，此可能特別重要。然而，胞外製造可加劇 發酵罐中之發泡程度，特別是在產物會促進發泡體形成或 提高發泡體穩定性時，例如生物表面活性劑或疏水蛋白。 在胞外製造此等發泡劑時使用消泡劑由於以下兩點原因而 特別成問題：第一，所需消泡劑之量會由於發泡劑本身在 發酵罐中造成發泡而增加。第二，因消泡劑以低濃度存在 時不會影響產物之功能性，故無需自大多數發酵產物中除 去消泡劑。然而，當發酵產物係發泡劑時，因消泡劑存在 於產物中將損害其功能性，故必須基本上除去消泡劑。
Bailey等人，却p/. M/croftio/. 58 (2002),第 72 1-727頁揭示藉由裏氏木黴轉化體之 發酵來製造疏水蛋白HFB I及HFB II。使用消泡劑（Strukt〇1 J633)來預防發泡且使用雙水相萃取法純化疏水蛋白。然 而諸如雙水相萃取法或層析法等分離方法價格昂貴且可能 需要使用與食品不相容之化學品。
Davis 等人，Enzyme and Microbial Technology 2名 (2001) ’第346-354頁揭示避免對消泡劑之需要之替代方 法。在此方法中’收集在發酵過程中產生的發泡體，且自 其中回收產物》此方法已成功地用於表面活性素即脂肽生 物表面活性劑之回收及濃縮。然而，此方法具有諸多缺 點：第一，連續除去發泡體可影響到發酵之無菌性；第 二’除去發泡體可影響活細胞計數（因某些細胞可由發泡 體攜帶出去）、在發酵罐中之液體體積及營養素含量，此 使得對發酵之控制更加困難；及第三，自發泡體中提取產 135316.doc 200930814 物將很困難，尤其當產物形成非常穩定之發泡體時。因 此，仍需要用於胞外製造發泡劑之改良發酵方法。 【發明内容】 我們現已發現藉由使用特定類消泡劑來抑制在以發酵胞 外製造發泡劑過程中之發泡時，可容易地自產物中除去消 • 泡劑。因此，在第一態樣中，本發明提供用於製造發泡劑 • 之方法，其包括： i)在發酵培養基中培養宿主細胞，其中： ❺ 伯主細胞向胞外分泌發泡劑；及 發酵培養基含有具有濁點之消泡劑； π)當發酵培養基之溫度高於此濁點時除去消泡劑。 使用消泡劑可儘量減少發酵過程中之發泡。選擇具有濁 點之消泡劑並確保發酵培養基之溫度高於該濁點可使消泡 劑形成顆粒形式之"渾濁"（沈澱）。此提供可在發酵完成後 除去消泡劑之簡單途徑，例如藉由過濾、離心或吸附。相 φ 反地’不具有濁點之消泡劑需要更複雜及/或更昂貴之分 離方法，例如水性雙相萃取或層析。 較佳地’在步驟丨）中藉由將空氣或富氧空氣通入發酵培 養基中而為該培養基充氣。 較佳地’在步驟i)中，發酵培養基之溫度高於消泡劑之 濁點。 較佳地’在_非*既Ϊ ··、_!_ 7驟U)中消泡劑係藉由過濾、離心或吸附除 去。更佳地，消泡劑係藉由膜(橫流)過濾除去。 較佳地^在井《麻(；.、上 丁鄉11)中，除去至少75%消泡劑、更佳地除 135316.doc 200930814 去至少85%、最佳地除去至少90%。 在步驟ii)中，發酵培養基之溫度較佳地高於濁點至少ι 〇 t、更佳地高於濁點至少20°C、最佳地高於濁點至少3〇 〇C。 較佳地’在步驟ii)中，亦自發酵培養基中除去宿主細 . 胞。 ' 較佳地’藉由例如超濾在步驟ii)後自發酵培養基純化及/ 或濃縮發泡劑。 © 較佳地，消泡劑係.食品級。 較佳地，消泡劑包括至少一種非離子表面活性劑/聚合 物，例如聚醚、聚（烷二醇）、環氧乙烷/環氧丙烷嵌段共聚 物、基於環氧乙烷/環氧丙烷嵌段共聚物之多元醇、基於 聚丙二醇之聚醚分散液、或烷氧基化脂肪酸醋。 較佳地，發泡劑係食品級。 發泡劑較佳地係疏水蛋白、更佳地係Π類疏水蛋白、最 φ 佳地係來自裏氏木黴之HFBI或HFBII。 宿主細胞較佳地係經基因改造之真菌、更佳地係酵母、 最佳地係酿酒酵母（iSacc/zaromyces cereWi/ae)。 在步驟ii)之後，消泡劑與發泡劑的重量比較佳地少於 0·2、更佳地少於0.15、最佳地少於〇」。 【實施方式】 除非另有定義，否則本文所用所有技術及科學術語均具 有如熟悉此項技術者所共同理解之相同含義（例如，在細 胞培養、分子基因學、核酸化學、雜交技術及生物化學 135316.doc 200930814 中）。用於分子及生物化學方法的標準技術可參見 Sambrook 等人之 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第三版（2001)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)及 Ausubel 等人之 Short Protocols in Molecular Biology (1999)第四版（John Wiley & Sons公司） 及標 為 Current Protocols in Molecular Biology之全部内 容。 發泡劑 在本發明之上下文中，術語"發泡劑”意指生物來源之表 面活性劑，其藉由抑制氣泡聚結而促進發泡體形成及/或 提高發泡體穩定性。 較佳地，發泡劑當以水溶液形式存在時其應能夠產生含 至少20%氣相體積之發泡體，根據以下測試在5 下儲存工 小時後、更佳地在2小時後、最佳地在4小時後仍可保留其 中之至少50°/〇。 製備80 mL發泡劑之水溶液（〇5 wt %)<>藉由在具有1〇5 mm尚度及72 mm直徑之内部比例且冷卻（2t>c )的圓柱形垂 直安裝的帶夾套不銹鋼容器内剪切該溶液以對該溶液充 氣。該容器之蓋佔内部體積的54%而剩下的46% (18〇㈤） 用於樣。用於剪切試樣之轉子由具有正確比例之矩形葉 輪組成以便當其旋轉時可刮到容器内表面（72 mm><4i $ mm)。亦將兩個與該矩形附件成45。角定位之半圓形（60 _直徑)高剪切葉片附接至該轉子上。將8〇心容液倒入 今器並將蓋子蓋牢。然後於125q卿下將該溶液剪切⑺分 135316.doc 200930814 鐘。立即將此經充氣的溶液倒入量筒。立即自量筒讀取發 泡體體積，且在5°C下儲存後再次讀取其體積。自量測之 發泡體體積及已知水相體積（即80 mL)確定氣相體積如 下： 氣相體積=[(發泡體體積-80 mL)/發泡體體積）]xl〇〇 發泡體中之液體隨時間流逝而排出’此導致形成兩個單 • 獨且不同之層：上層為發泡體，且下層為水溶液。然而， 此處之興趣點係發泡體相之穩定性。計算氣相體積時將 ® 發泡體體積當作系統之整個體積，即包括氣相及液相兩者 而不論其是否已分離為兩個不同層。因此，氣相體積值給 出了發泡體穩定性對氣體損失的量化指示。因此，若發泡 體初始氣相體積為50%，則經儲存後，氣相體積應為至少 25% ;若初始氣相體積為2〇%，則經儲存後，其必須為至 少 10%。 發泡劑包含疏水蛋白及生物表面活性劑例如糖脂（例 φ 如鼠李糖脂、海藻糖脂、纖維二糖脂、槐糖脂脂肽及 月曰蛋白（例如肽脂、沙雷濕潤素（serrawettin)、黏液菌素、 表面/舌性素、枯草桿菌蛋白酶、短桿菌肽、多黏菌素” 知肪酸、中性脂質、及磷脂；聚合生物表面活性劑（例如 乳化劑（emulsan)、生物分散劑（bi〇dispersan)、甘露聚糖- 月曰質_蛋白質、利普生（Hposan)、糖類-蛋白質-脂質、蛋白 質PA)、顆粒生物表面活性劑（泡囊及菌毛、完整細胞）、 糖苷（例如皂苷）及纖維蛋白（例如蠶絲蛋白）。乳品及大豆 蛋白/蛋白水解產物亦為發泡劑，但其並非通常藉由發酵 135316.doc 200930814 方法製得。較佳地，發泡劑不係乳品或大豆蛋白或蛋白水 解產物。在尤佳實施例中，發泡劑係疏水蛋白。 可藉由培養能自然地將發泡劑分泌入發酵培養基之宿主 生物體來獲得發泡劑。舉例而言，可藉由培養絲狀真菌例 如絲孢綱（例如木黴屬（TWchi/erma))、擔子菌綱 (basidiomycetes)及子囊菌綱（ascomycetes)來獲得疏水蛋 白。尤佳宿主係食品級生物體，例如可分泌稱為cryparin 之疏水蛋白的板栗疫病菌（Ojvp/zowecihot ❹ （MacCabe及 Van Alfen，1999, App. Environ. Microbiol 65: 5431-5435)。類似地’可自枯草芽孢桿菌（心c///wj 獲得表面活性素且可自例如綠膿假單抱菌 {Pseudomonas aerwgiwosa)、紅平紅球菌（/^Oi^〇c〇cci^ 、分枝桿菌屬（MycroftacieWww)及球擬酵母 (Torulopsis bombicola)(OQsai A Banat, Microbiology and
Molecular Biology Reviews，1997年3月，第 47-64頁）獲得 _ 糖脂。 ❹ 另一選擇為，可藉由使用重組技術製造發泡劑。舉例而 言’可改造宿主細胞（通常為微生物）以表現發泡劑。將編 碼發泡劑（其中該發泡劑係多肽）之核酸構成物或用於製造 發泡劑（其中該發泡劑係非肽類，例如生物表面活性劑）之 必需酶引入宿主細胞之技術已為業内熟知。亦可使用重組 技術改造發泡劑序列或合成具有合意/改良性質之新穎發 泡劑。 通常，藉由可編碼期望多肽發泡劑之核酸構成物來轉化 135316.doc • 12- 200930814 適宜宿主細胞或生物體。可將編碼多狀之核㈣序列插入 編碼轉錄及轉譯必需元件之合適表現載體中且其將以此方 式於適宜條件下表規丨& + e + A a (J如在具有合適方向及正確閱讀框 且具有適且靶向及表現序列之條件下）。用於構建此等表 現載體所需之方法已為彼等熟悉此項技術者所熟知。
可使用諸多表現系統來表現多狀編瑪序列。此等包含 (但不限於）細菌、真菌（包含酵母）、昆蟲細胞系統、及已 用適宜表現載體轉化之植物細胞培養系統。較佳宿主係彼 等被視為食品級-，通常被視為安全，（GRAS)之宿主。 合適真菌種屬包含酵母，例如（但不限於）彼等酵母屬 (心、克魯維酵母屬（尺⑽ver〇町⑽）、畢赤酵 母屬（/^仏）、漢遜酵母屬、念珠菌屬 、裂殖酵母屬⑽）及諸如此 類，及絲狀滅種屬，例如（但不限於）彼等麵徽屬 (Aspergillus)、太黴餍（Trichoderma)、毛黴镊屬 QMucor)、 脈抱菌（/V'ewrospora)、鐮胞菌及諸如此類- 編碼多肽發泡劑的序列與在自然界中所鑑別的發泡劑之 胺基酸一致性較佳為至少80%、更佳為至少95%或100%。 然而，熟悉此項技術者可實施不會減低發泡劑生物活性之 保守取代或其它胺基酸改變》 疏水蛋白係尤佳類別之發泡劑。在歐洲專利第1 623 63 1 號中，先前已發現疏水蛋白允許產生對不均勻及聚結具有 優良穩定性之水性發泡體。由於疏水蛋白係高效發泡劑， 故其存在於發酵培養基中對於發泡體控制係一個特別挑 135316.doc .13- 200930814 戰。 疏水蛋白係能在疏水/親水介面自組裝並具有下述保守 序列之明碟定義類別之蛋白質（Wessels，1997，Adv Microb. Physio. 38: 1-45; Wosten, 2001, Annu Rev
Microbiol. 55: 625-646):
Xn-C-X5.9-C-C-X".39-C-X8.23-C-X5_9-C-C-X6-18-C-Xm (SEQ ID No. 1) 其中X代表任一胺基酸，且n及m分別代表整數。通常，疏 水蛋白具有多達125個胺基酸之長度。保守序列中之半耽 ® 胺酸殘基（C)係二硫橋之一部分。在本發明之上下文中， 術語疏水蛋白具有更廣泛含義’其包含功能上等效且亦具 有在疏水-親水介面自組裝以形成蛋白質膜之特徵之蛋白 質’例如包括以下序列之蛋白質：
Xn-C-X1.5〇-C-X〇.5-C-X1.1〇〇-C-Xi.i〇〇-C-Xi.5〇-C-X〇.5-C-Xi.5〇-C-Xm (SEQ ID No. 2) 或其部分亦具有在疏水-親水介面自組裝以形成蛋白質膜
之特徵。根據本發明之定義，可藉由將蛋白質吸附至特I 鲁隆（Teflon)並利用圓二色性確定二級結構（一般•螺旋）的 存在來檢測自組裝（De Vocht等人，1998, Biophys. J. 74: 2059-68)。 可藉由在蛋白質溶液中培養特氟隆板並繼而用水或緩衝 液洗務至少三次來確定膜的形成（W〇sten等人，1994,
Embo· J· 13: 5848-54)。可藉由任一合適方法將蛋白質膜 可視化’例如業内所確認之用螢光標記物或藉由使用螢光 抗體來標記。通常具有介於自0至2000之間之數值， 但更常見地，〇1及11之和小於1〇〇或2〇〇。在本發明之上下文 135316.doc 200930814 中對於疏水蛋白之定義既包含疏水蛋白與另一多肽之融合 蛋白亦包含疏水蛋白與其它分子（例如多糖）之偶聯體。 一般將目前所鑑別之疏水蛋白分為！類或π類。已在真菌 中將此兩種類型鑑別為可在疏水_親水介面自組裝為兩性 膜之分泌性蛋白質。I類疏水蛋白組裝體通常係相對不可 . 溶的而彼等11類疏水蛋白組裝體則易溶於多種溶劑中。較 佳地，疏水蛋白可溶於水，此意指其至少0.1%可溶於水、 較佳地至少0.5%可溶於水。至少0丨％可溶意指當在2〇〇c及 β 3〇,〇〇〇 g下對存於9 mL水中之0.1 g疏水蛋白離心3〇分鐘 時無疏水蛋白沈殿。 亦已在絲狀細菌（例如放線菌屬及鏈徽菌屬 sp.))中鑑別出類疏水蛋白蛋白質（例如 11chaplinstI)(WO01/74864; Talbot, 2003, Curr. Biol, 13： R696-R698)。由於此等細菌蛋白質僅可具有兩個半胱胺酸 殘基’故其與真菌疏水蛋白不同僅可形成至多一個二硫 馨橋。此等蛋白質係具有SEQIDN〇 中所示之一致序列 的疏水蛋白之功能等效物之實例，且皆納入本發明範圍 内。 已自16個真菌種屬中選殖出超過34個編碼疏水蛋白的基 因（參見例如W096M1882，其提供在雙孢磨菇㈠ Μ印orw)中鑑別之疏水蛋白序列；及w〇sten，2〇〇1, Annu
Rev· Microbiol. 55: 625-646)。就本發明之目的而言，術語 "疏水蛋白"亦涵蓋與天然疏水蛋白具有至少8〇%胺基酸一 致性之疏水蛋白。 135316.doc 200930814 消泡劑 術語”消泡劑"包含一般在發泡發生之前添加之消泡劑， 及一般在發泡體形成後才添加之消泡劑（有時稱為去泡 劑）。適用於本發明之特定消泡劑種類係具有濁點者。如 Surfactant Aggregation and Adsorption at Interfaces, J. Eastoe, Colloid Science: Principles, Methods and 却〆心"鍾，編輯 T. cosgrove，Blackwell publishing， 20D5中第63頁所述，濁點係當消泡劑之水溶液發生相分離 (即消泡劑分子形成可散射光的聚集物）時明顯可見其變得 混濁之溫度。 具有濁點之消泡劑之實例包含諸如環氧乙烷/環氧丙烷 欣段共聚物、以環氧乙烷/環氧丙烷嵌段共聚物為主之多 元醇及環氧乙烧與環氧丙烧之聚醚等以聚（烧二醇）（pAG) 為主之化合物；及以脂肪酸酿為主之化合物。 濁點取決於表面活性劑組成及化學結構。舉例來說，就 聚氧乙烯（PEO)非離子表面活性劑而言，對於給定的疏水 基其濁點會隨EO含量的增加而上升。較佳地，消泡劑的 濁點係介於0°C與90。(：之間、更佳地介於5。(：與6〇。(：之間。 較佳地，消泡劑包括至少一種非離子表面活性劑/聚合 物，例如聚醚、聚（烷二醇）、環氧乙烷/環氧丙烷嵌段共聚 物、以環氧乙烷/環氧丙烷嵌段共聚物為主之多元醇、以 聚丙二醇為主之聚醚分散液、或烷氧基化脂肪酸酯。即使 在存在強力發泡劑（例如疏水蛋白）時，以PAG為主之消泡 劑（例如可自 Schill and Seilacher獲得之 struktol J647)、以 135316.doc .16· 200930814 EO/PO嵌段共聚物為主之多元醇（例如可自Schill and Seilacher獲得之Struktol J647)及其它非離子表面活性劑消 泡劑在消除發泡體方面特別有效。 可使用消泡劑之混合物，在此情況下，將此混合物之濁 點定義為個別組份之最高濁點。 表1展示某些具有濁點之常見市售消泡劑。 表1 消泡劑 濁點/°c 聚(烷二酵） Struktol J647, Schill & Seilacher 24 Struktol SB2121 約30 UCON LB 65, Dow Chemical 公司 25 UCON LB 285 15 UCON LB 625 10 UCON LB 1715 8 KF0673, Lubrizol 25 ST934, Pemrwhite有限公司 約20 環氧乙烧/環氧丙烷嵌段共聚物 Pluronic PE3100, BASF 41 Pluronic PE6100 23 Pluronic PE6200 33 Pluronic PE8100 36 Pluronic PEI0100 35 Mazu DF204, BASF 18-21 以EO/PO嵌段共聚物為主之多元醇 Struktol J650, Schill & Seilacher 13 以聚丙二醇為主之聚醚分散液 消泡劑204, Sigma 15 烷氧基化脂肪酸酯 Struktol J673, Schill & Seilacher 30 135316.doc -17- 200930814 發酵過程及消泡劑之去除 可藉由在生物反應器（例如工業發酵罐）内之液態發酵培 養基中培養宿主細胞實施發酵來製造發泡劑。對培養美之 組成（例如營養素、碳源等）、溫度及pH加以選擇以便為培 養物之生長及/或發泡劑之製造提供適宜條件。通常將空 氣或富氧空氣通入培養基中來為培養物呼吸提供氧氣。 可將消泡齊1納入初始培養基、组成中及/或於發酵期間視 需要添加。慣常做法係使用發泡體檢測法，例如導電係數 探測器，其可自動觸發消泡劑之添加。在本發明中，消泡 劑較佳地係以自⑴丨至⑼g/L之濃度存在、更佳地係以自i 至10 g/L之濃度存在。 在步驟i)期間，即在發酵期間，發酵罐溫度可高於或低 於消泡劑之濁點。較佳地，發酵罐溫度高於消泡劑之濁 點，乃因消泡劑在高於其濁點時可最有效地引起氣泡聚結 及發泡體破滅。通常對發酵罐溫度加以選擇以達成宿主細 胞生長及/或製造之最佳條件。 在發酵結束時，必須基本上除去消泡劑以確保發泡劑之 功能性不受損害。較佳地，除去至少75%消泡劑、更佳地 除去至少85%、最佳地除去至少9〇%。舉例而言，在步驟 π)之後，消泡劑與發泡劑之重量比較佳地係小於〇·2、更 佳地小於0.15、最佳地小於。 可藉由確保發酵培養基之溫度高於消泡劑之濁點來達成 /肖泡劑之去除，以使消泡劑發生相分離。可藉由任一適合 方法自發酵培養基中除去已發生相分離之消泡劑，例如： 135316.doc _ 18· 200930814 -過濾，例如死端過濾或壓濾機 •膜（橫流）過濾，例如微過濾或超濾 - 離心 .吸附，使用例如活性碳、二氧化石夕或石夕㉟土作為吸 附劑。 可藉由例如此等方法之一以一個步驟實施對消泡劑之去 除。另一選擇為，可重複或組合該等方法。舉例而言，在 第一次過濾步驟後，可重新加熱（若需要）及再次過濾濾 液。 已發現’若發酵培養基溫度比濁點至少高丨〇(>c、較佳地 比濁點至少高20 C、最佳地比濁點至少高3〇。〇，可除去較 多消/包劑。發酵培養基溫度不得高至引起發泡劑變性。為 此原因’較佳地發泡劑係熱穩定性的，例如疏水蛋白。較 佳地發酵培養基溫度低於9〇。〇、更佳地低於75〇c。在較佳 實施例中，消泡劑具有介於20-3CTC之間之濁點且在步驟 ii)中之發酵培養基溫度介於40-60°C之間。相比之下，在 傳統製程中特意避免將發酵培養基保持在此高溫下以使降 解反應（其可引起顏色及味道改變）、酶失活、蛋白質變性 及功能性喪失之可能性降至最低（參見例如"Separati〇n Processes in the Food and Biotechnology Industries"，編輯 Grandison，A.S_; Lewis，M.J.第 7頁）。 分離消泡劑之較佳方法係膜過濾。通常認為在高於消泡 劑濁點之溫度下對含有該消泡劑之發酵液實施膜過濾會引 起由沈澱的消泡劑造成的膜積垢並從而弓丨起透過液通量降 135316.doc -19- 200930814 低及後續處理困難：參見例如Yamagiwa等人，《/. 五叹 26 (1993)第 13-18 頁，及 WO 01/014521。因 此’先前認為膜過濾應發生在低於濁點之溫度下。然而， 現已發現當在比消泡劑濁點高約25°C之溫度下實施超濾及 微過濾作業時可獲得可接受之通量。 為確保產物發泡劑不含胞内及基因物質（其通常被視為 不期望的污染物）’必須自發酵培養基中除去細胞。在較 佳實施例中，在自培養基中分離細胞之同時於例如高於濁 點之溫度發生之微過濾步驟中除去沈澱的消泡劑。 在另一實施例中，可在低於濁點之溫度下藉由例如過濾 (例如死端過濾或壓濾機）、膜/橫流過濾（例如微過濾或超 據）、或離心除去消泡劑之前以單獨步驟自培養基中除去 細胞。在此實施例中’可在除去細胞之後但分離消泡劑之 别實施純化及/或濃縮步驟（例如藉由超濾）（仍在低於濁點 溫度下）。然後如前所述將培養基加熱至高於濁點之溫度 以便可除去消泡劑。 自發酵培養基中除去消泡劑及細胞後，可根據需要藉由 (例如）超濾對產物發泡劑實施進一步純化及濃縮。若發泡 劑係疏水蛋白，則可藉由（例如）在W001/57076中所述之程 序（其包括將疏水蛋白吸附至表面且然後使該表面與表面 劑（例如Tween 20)接觸而自該表面洗脫疏水蛋白）自發 酵培養基中純化該發泡劑。亦可參見c〇Uen等人，2〇〇2,
Biochim Bi〇phyS Acta. 1569: 139-50 ; Calonje等人，2002,
Can. J. Microbio1. 48: 1030_4; Askolin等人，2〇〇1，Appl 135316.doc -20. 200930814
Microbiol Biotechnol. 57: 124-30 ;及 De Vries 等人，1999,
Eur J Biochem. 262: 377-85 o 實例 實例1 :消泡劑之濁點測定 隸由以下方法量測消泡劑之濁點，此處以兩種市售消泡 劑來說明’其中一種具有濁點（Struktol J647)而另一種 (Struktol J633)則不具有濁點。 在室溫下於水溶液中製備每一種消泡劑之0.2 wt%溶 液。將20 mL試樣倒入圓柱形玻璃瓶（Turbiscan)中。在水 浴中於量測溫度下對試樣平衡丨小時。使用Turbiscan Lab Expert (Formulaction，法國）測定試樣之濁度。此儀器具 有波長λ為880 nm之光源及與入射光成180。之光感測器， 其在距離含有試樣溶液之小瓶之底部25 mm之點處量測透 過試樣之入射光之百分比。隨著溶液變得更渾濁，透射過 的光會減少。將試樣瓶轉移至亦已經設置處於合意量測溫 度下之Turbiscan Lab Expert。自5。(：開始，以5°C之間隔量 測透射隨溫度之變化’且結果具有於圖1中。對於J647， 透射在溫度介於20與25。(：之間時會顯著地自75%降至〇〇/〇， 此具有在此溫度範圍内已達到濁點。此與製造商之引述值 24 C —致。（若需要更精確之濁點值，則可以更小溫度間 隔例如1或21來實施量測。）相比之下，因j633不具有濁 點’故其在濁度上具有出非常小之變化。因此，J647係適 用於本發明之消泡劑，而J633則不是。 實例2 :自模型溶液中除去消泡劑 135316.doc 21 200930814 實施實驗以證明可藉由將溶液之溫度提高至高於濁點之 溫度而自模型溶液中除去消泡劑並藉由過濾除去沈澱物。 藉由取3.00 g Struktol J647等份試樣並用將其稀 釋至1 L來製備〇_3% (w/v) Struktol J647溶液。藉由將此溶 液試樣放置於溫度設置在所需溫度下之水浴中處理丨小時 來將其加熱至濁點之上。然後藉由渦旋將試樣輕輕混合並 立即對其實施過濾。 實施兩個不同實驗。首先，在固定溶液溫度（5〇I>c )下用 2 ml注射器使用孔徑為0.45 μιη Life以“⑽
Acrodisc)、0.2 μη!、1·20 μιη及 5.00 μηι之過濾器（全部來自 Sartorius Minisart)研究過濾器孔徑的作用。其次，在使用 固定孔徑（0.2 μπι)的情況下對溶液溫度實施自川至川乞之 改變（即比濁點高6至46°C )。 藉由使用用於非離子表面活性劑之Lange LCK 433 Water測試套組來測定濾液中之消泡劑濃度。此運用的原 理疋’非離子表面活性劑（例如J647)可與指示劑TBPE(四 溴酚酞乙酯）形成複合物，而該複合物可用二氣甲烷實施 萃取並可實施光度量測以測定濃度。首先，構建校準曲 線。藉由取3.00 g Struktol J647等份試樣並於15°C下用
MilliQ水將其稀釋至！ L來製備ο」％ (w/v) Smikt〇i J647溶 液。自該溶液取等份試樣並用MiliiQ水稀釋以得到6、 15、30、60、150及3 00 mg/L之濃度。將MilliQ水用作空白 試樣。將0_2 ml每一濃度之試樣添加至含有TBPE及二氣甲 炫之套組試管中。將試管輕輕混合2分鐘並放置3 〇分鐘。 135316.doc •22- 200930814 然後參照測試套組說明書用Lange DR2800分光光度計在 605 nm下對其實施量測。圖2具有由此生成的校準曲線 圖。 然後用MilliQ水將濾液稀釋至1/1〇。如上文所述，用分 光光度计對0.2 ml試樣實施量測，並自校準曲線圖上讀取 每一濾液中之消泡劑濃度。可將殘存在濾液中之消泡劑量 (%)計算為 (在濾液中之量測濃度）/(已知起始濃度）x丨00〇/〇。
可藉由類似技術、使用Lange LCK 333 Water測試套組 並在適宜濃度範圍内構建校準曲線圖來量測直到〇.2 mg/L (2χ 1(T5 °/〇 w/v)之消泡劑濃度。在此情況下，將2 ml而非 0.2 ml欲量測等份試樣添加至測試套組中。 結果於表2中給出。於50°C下使用〇·2 μπι過濾器所實施 的兩次量測之間殘存消泡劑量之差異（即6%)具有與該方法 相關之誤差棒。
表2 過濾器孔徑(μπι) 溶液溫度(°C) 高於濁點之溫度 殘存消泡劑(％) 0.2 50 26 6 0.45 50 26 17 1.2 50 26 28 5.0 50 26 79 0.2 30 6 26 0.2 50 26 12 0.2 70 46 9 135316.doc -23- 200930814 數據具有過滤器孔徑越小，a丄^ 义彳’除去的消泡劑量越大，即如 預期的在溶液中之殘存量減小。對於胸而言，5_〇叫孔 徑尚未小収以除去大部分消泡劑，狀2μιη孔徑可除去 約90%消泡劑。數據亦具有斜 虿對於給疋孔徑，提高溶液溫度 可更有效地除去消泡劑。 實例3.自模型發酵培養基中除去消泡劑 製備模型發酵培養基以闡釋消泡劑自典型發酵培養基之
去除。首先，製備兩種具有如表3所示組成之溶液。在业 型的補料分批發酵中批料丨為起始培養基且批料2將在_ 期間逐步添加。 表3
135316.doc -24- 200930814 表4 過濾器孔徑(μπι) 溶液溫度(°C) ------ 高於濁點之溫度(。〇 殘存消泡劑(％) 0.2 30 6 16 0.2 50 26 10 0.2 70 46 6 0.45 50 26 8 1.2 50 26 10 重複該實驗，但將額外消泡劑添加至模型發酵培養基中 以使起始濃度為3 g/L。結果具有於表5中。 表5 Φ 過濾器孔徑(μπι) 溶液溫度(°C) 高於濁點之溫度(。〇 殘存消泡劑(％) 0.2 50 26 8 0.45 50 26 8 1.2 50 26 15 此表明藉由選擇具有濁點之消泡劑可以簡單且便捷的方 式自模型發酵培養基中基本上除去消泡劑。 實例4:自含有發泡劑之發酵液中除去消泡劑 ❹ 對釀酒酵母之基因改造菌株實施補料分批發酵β該菌株 係藉由納入編碼來自真函裏氏木徽之疏水蛋白Β11 (消泡 劑）之基因而受到改造’從而在發酵期間達成對疏水蛋白 的胞外表現。大體上依照van de Laar T等人在別 96(3):483-94 (1997)中所述、以葡萄糖作為碳源並 在300 L發酵容器中將此過程放大至總體積15〇 [來實施發 酵。使用消泡劑Struktol J647來控制發酵期間之發泡（替代 van de Laar T 等人所使用之 Struktol J673)。 135316.doc 25· 200930814 在發酵結束時，於15。(：（即低於消泡劑J647之濁點）下微 過濾發酵液以除去酵母細胞。使用兩體積去離子水滲濾藉 由具有〇_ 1 μιη孔徑Kerasep陶瓷膜之中試規模設備中實施微 過濾°然後仍在1 5 °C下對該液體實施超濾以部分純化 HFBII。 藉由1 kD Synder螺旋捲繞聚合物膜於0.9巴跨膜壓力及 • 四趙積渗濾來實施超濾。 在超濾步驟之後量測發酵液中之消泡劑濃度（如實例2中 所述）為0.196 g/L。藉由高效液相層析（HPLC)量測HFBII濃 度為0.320 g/L，如下所述。在分析之前用6〇%乙醇水溶液 稀釋試樣以得到約2〇〇 pg/mi之濃度。於30°c下在vydac蛋 白質C4管柱（250x4.6 mm)上實施HPLC分離。藉由在214 nm處之紫外檢測來量測疏水蛋白並藉由與具有已知hfbii /農度的獲取自VTT Biotechnology (Espoo，芬蘭）之試樣比 較來計算濃度。 ❿ 然後’如實例2所述，將無細胞液體加熱至5(TC、於該 溫度保持30分鐘並隨後過濾（〇2 μιη孔徑）以除去消泡劑。 依則文所述量測濾液中之消泡劑及HFBII之殘存量且量測 ' 結果在表6中給出（標題為”階段1"之行）。然後將來自該第 一階段之據液再次加熱至50。(：、於該溫度再保持30分鐘並 過濾’如前所述。量測所形成濾液中之HFBII及消泡劑之 濃度且量測結果亦在表6中給出（"階段2") 〇 135316.doc -26- 200930814 表6 階段1 階段2 一 在濾液中之HFBII量(g/L) 0.32 0.30 殘存 HFBII<% 100 93.75 在濾液中之消泡劑量(g/L) 0.05 0.028 殘存消泡劑之％ 25.5 14.3 消泡劑：HFBII之質量比 0.156 0.093 此表明藉由選擇具有濁點之消泡劑可以簡單且便捷之方 〇 式自含有宿主細胞及發泡劑之發酵液中基本上除去消泡 劑。 在上述個別部分中所提及之本發明的各種特徵及實施例 視情況經適當改變後亦適用於其它部分。因此，視需要， 可將在一部分t所說明之特徵與在其它部分中所說明之特 徵組合。 在上述說明書中所提及之所有出版物皆以引用方式併入 本文中。熟悉此項技術者將瞭解對所描述的本發明方法進 行的各種修改及改變，其並不脫離本發明之範圍。雖然已 結合具體較佳實施例闡述了本發明，但應瞭解不應不適當 地將所主張之本發明限定於此等具體實施例中。實際上， 彼等熟悉相關領域者所瞭解之為實施本發明而對所描述方 式之各種修改均意欲納入以下申請專利範圍之範疇内。 【圖式簡單說明】 上文參照上述僅作為例示性而非限定性的實例及附圖對 本發明予以進一步闡述，其中： 1353I6.doc •27- 200930814 圖1具有％透射隨Struktol J647及J633之0.2 wt%水溶液溫 度之變化。 圖2具有實例2中所測定之校準曲線圖。
135316.doc •28- 200930814 序列表 <11〇>荷蘭商聯合利華公司 <120>製造發泡劑的方法 <130> F3461 <140> 097139772 <141> 2008-10-16 <150> EP 07118762.9 <151> 2007-10-18 <160> 2 <170> Patentln version 3.3
<210> 1 <211> 15 <212> PRT <213>假設 <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223〉^個重複 <220> <221> REPEAT <222> (3)..(3) <223> 5至9個重複 <220> <221> REPEAT <222> (6)..(6) 11至39個重複 <220> <221> REPEAT <222> (8)..(8) 8_至23‘重複 <220> <221> REPEAT <222> (10)..(10) <223> 5_至9個重複 <220> <221〉 REPEAT <222> (13)..(13) <223> 6至18個重複 <220> <221> REPEAT <222> (15)..(15) <223> m個重複 <400> 1
Xaa Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Xaa 15 10 15 0123 <21<21<21<21 ,ST織 <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> η個重複 <220> <221> REPEAT 135316-序列表.doc 200930814 <222> (3)..(3) <223> 1至50個重複 <220〉 <221> REPEAT <222> (5)..(5) <223> 0至50個重複 <220> <221> REPEAT <222> (7)..(7) <223> 1至1〇〇個重複 <220>
<221〉 REPEAT <222> (9)..(9) ' <223> 1至1〇〇個重複 <220> <221〉 REPEAT <222> (11)..(11) <223> 1至50個重複 <220>
<221> REPEAT <222> (13)..(13) <223> 〇至5個重複 <220> <221> REPEAT <222〉 （15)..(15) <223>丨至50個重複 <220> <221> REPEAT <222> (17)..(17) <223> „1個重複 <400> 2
Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys 15 10 15
-2- 135316-序列表.doc

Claims (1)

  1. 200930814 、申請專利範圍： .一種用於製造發泡劍的方法，其包括： 〇在發料養基t料以細胞，其令·· 該宿主細胞向胞外分泌發泡劑；且 ，發酵培養基含有具有濁點之消 ⑴备該發酵培養基 劑。 /m度局於該濁點時除去該消泡 2. 3. 如請求項1之方法，其中在步驟 氣通入該發酵培養基中而對其充氣。，空氣或富氧空 如請求項1或2之方法，1 μ 溫度高於該消泡劑之濁點、。㈣^中該發酵培養基 之 4. 5.6. 如請求項1之方法 吸附除去該消泡劑 如請求項4之方法， 如請求項1之方法， 泡劑。 其中在步驟ii)中藉由過濾、離心或 ) 其中該消泡劑係藉由膜過濾除去。 其中在步驟U)中除去至少75〇/〇之該消
    如請求項1之方法，其中 度比該濁點高至少lot。 在步驟Π)中該發酵培養基之溫 8. 如請求項1 古 ^ ^ 4 万去，其中在步驟ii)中該等宿主細胞係自 ^發酵培養基中除去。 9. 如請求項1 $古、土 之方去’其中該發泡劑係在步驟ii)之後自該 酵培養基純化及/或濃縮。 如：求項1之方法’其中該消泡劑係食品級。 11 ·如請求項1 $古 ’其中該消泡劑包括至少一種非離子 135316.doc 200930814 表面活性劑/聚合物。 12_如請求項11之方法，其中該消泡劑係聚醚、聚（烷二 醇）、環氡乙烷/環氧丙烷嵌段共聚物、基於環氧乙烷/環 氧丙烷嵌段共聚物之多元醇、基於聚丙二醇之聚醚分散 液或貌氧基化脂肪酸酯。 13. 如凊求項1之方法，其中該發泡劑係食品級。 14. 如凊求項1之方法’其中該發泡劑係疏水蛋白。 15 _如叫求項1之方法’其中該宿主細胞係經基因改造的真 菌。 6如凊求項1之方法，其中在步驟⑴之後，消泡劑與發泡 劑之重量比小於〇.2。 Q 135316.doc
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