CN101827932A - 制备发泡剂的方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种制备发泡剂的方法,该方法包括在发酵培养基中培养宿主细胞,其中所述宿主细胞在细胞外分泌发泡剂,且其中所述发酵培养基含有具有浊点的消泡剂;然后,当发酵培养基的温度高于浊点时去除消泡剂。
Description
发明领域
本发明涉及工业发酵方法。具体地,本发明涉及发泡剂的细胞外发酵制备。
发明背景
发泡是需氧深层发酵中的常见问题。发泡由于将气体鼓入(sparging)发酵培养基而引起,将气体鼓入发酵培养基的目的是为正在培养的需氧有机体(例如细菌、酵母、真菌、藻类、细胞培养物)的生长提供氧气。若发酵培养基含有诸如蛋白质、多糖或脂肪酸之类的表面活性组分,则当鼓入的气泡脱离液体时,可在培养基的表面上形成泡沫。发泡引起许多问题,包括不合需要地将产品、营养素和细胞带(stripping)入泡沫,并且可能使工艺控制变得困难。控制发泡的一种已知方法是使用消泡剂,其中的几类是常用的:基于硅氧烷的消泡剂(例如聚二甲基硅氧烷)、聚亚烷基二醇(例如聚丙二醇)、脂肪酸、聚酯和天然油(例如亚麻籽油、大豆油)。消泡剂代替气泡表面上的发泡组分,导致泡沫因气泡聚结而破灭。在发酵开始和/或期间加入消泡剂。
当发酵产品有意用于食品、个人用品或药品时,非常希望通过生产有机体(producing organism)将所述产品分泌到发酵培养基中(即,细胞外而非细胞内制备)。这样不需要通过物理或化学方法破坏细胞,以便释放供回收的产品。通过保持细胞完整,可容易地将细胞材料与产品分离,以致产品不含细胞内材料和遗传材料,所述材料通常被视为不合需要的污染物。若生产有机体已经过基因修饰,这样做可能尤其重要。然而,细胞外制备可加强发酵罐中的发泡程度,若产品(例如生物表面活性剂或疏水蛋白)促进泡沫形成或增强泡沫稳定性,尤其如此。使用消泡剂在此类发泡剂的细胞外制备中产生特殊问题,其原因有二:第一,由于发泡剂本身促进了发酵罐中的发泡,因此所需消泡剂的量增加。第二,由于消泡剂的存在浓度低,不影响产品的功能(functionality),因此非必需从大多数发酵产品中去除消泡剂。然而,当发酵产品是发泡剂时,必须基本上去除消泡剂,因为消泡剂存在于产品中将削弱该产品的功能。
Bailey等,Appl.Microbiol.Biotechnol.58(2002)pp.721-727公开了通过里氏木霉(Trichoderma reesei)转化株的发酵来制备疏水蛋白HFB I和HFB II。使用消泡剂(Struktol J633)来防止发泡,并使用双水相萃取提纯疏水蛋白。然而,诸如双水相萃取或色谱方法之类的分离方法昂贵,且可能需要与食品不相容的化学品。
Davis等,Enzyme and Microbial Technology 28(2001)pp.346-354公开了一种另选(alternative)方法,该方法不需要消泡剂。在该方法中,收集发酵期间产生的泡沫,并从中回收产品。该方法已成功应用于回收和浓缩表面活性肽(surfactin)(一种脂肽生物表面活性剂)。然而,该方法存在许多缺陷:第一,持续去除泡沫会损害发酵的无菌性质;第二,去除泡沫会影响发酵罐中活细胞计数(因为有些细胞可能会随泡沫带出)、液体体积和营养素水平,使发酵更难控制;第三,从泡沫中提取产品可能是困难的,尤其是当产品形成非常稳定的泡沫时。因此,对用于细胞外制备发泡剂的改进的发酵方法仍然存在需求。
发明概述
我们现已发现,通过使用一组特定的消泡剂在发泡剂的细胞外发酵制备中抑制发泡,可以容易地从产品中去除该消泡剂。因此,在第一方面中,本发明提供制备发泡剂的方法,其包括:
i)在发酵培养基中培养宿主细胞,其中:
所述宿主细胞在细胞外分泌发泡剂;并且
所述发酵培养基含有具有浊点的消泡剂(antifoam);
ii)当所述发酵培养基的温度高于所述浊点时去除消泡剂。
在发酵期间使用消泡剂使发泡达到最小。选择具有浊点的消泡剂,并确保发酵培养基的温度高于此浊点,这样导致消泡剂以微粒形式“析出(cloud out)”(沉淀)。这提供了简单途径,通过该途径能够在发酵完成之后去除消泡剂,例如通过过滤、离心或吸附来去除。相反,没有浊点的消泡剂需要更复杂和/或更昂贵的分离方法,例如双水相萃取或色谱。
优选地,在步骤i)中,通过向其中鼓入空气或富氧空气对发酵培养基进行充气。
优选地,在步骤i)中,发酵培养基的温度高于消泡剂的浊点。
优选地,在步骤ii)中,通过过滤、离心或吸附去除消泡剂。更优选地,通过膜(交叉流)过滤去除消泡剂。
优选地,在步骤ii)中,去除至少75%(更优选至少85%、最优选至少90%)的消泡剂。
优选地,在步骤ii)中,发酵培养基的温度高于浊点至少10℃,更优选高于浊点至少20℃,最优选高于浊点至少30℃。
优选地,在步骤ii)中,还从发酵培养基中去除宿主细胞。
优选地,在步骤ii)之后,例如通过超滤从发酵培养基中提纯和/或浓缩发泡剂。
优选地,消泡剂为食品级。
优选地,消泡剂包含至少一种非离子型表面活性剂/聚合物,例如聚醚、聚亚烷基二醇、环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物、基于环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物的多元醇、基于聚丙二醇的聚醚分散体(polypropyleneglycol-based polyether dispersion)或烷氧基化脂肪酸酯。
优选地,发泡剂为食品级。
优选地,发泡剂是疏水蛋白,更优选为II类疏水蛋白,最优选为来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的HFB I或HFB II。
优选地,宿主细胞是基因修饰真菌,更优选为酵母,最优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
优选地,在步骤ii)之后,消泡剂与发泡剂的重量比小于0.2,更优选小于0.15,最优选小于0.1。
发明详述
除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域(例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学领域)普通技术人员通常所理解的相同含义。用于分子和生物化学方法的标准技术可见于Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,以及Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版本,JohnWiley & Sons.Inc.(完整版的名称为Current Protocols in MolecularBiology)中。
发泡剂
在本发明的上下文中,术语“发泡剂”是指生物来源的表面活性剂,它促进泡沫形成和/或通过抑制气泡聚结来增强泡沫的稳定性。
优选地,发泡剂是这样的:根据以下测试,所述发泡剂在水溶液中产生气相体积至少占20%的泡沫,在5℃下贮存1小时之后(更优选2小时之后,最优选4小时之后),保留所述气相体积的至少50%。
制备80mL发泡剂水溶液(0.5重量%)。在垂直安装、带夹套、经过冷却(2℃)的圆筒形不锈钢容器中,通过剪切该溶液对该溶液进行充气,所述容器的内部大小(internal proportions)为高度105mm、直径72mm。所述容器的盖占其内部容积的54%,留下46%(180mL)给样品。用于剪切样品的转子(rotor)由矩形叶轮组成,所述叶轮具有恰当的大小(72mmx41.5mm),以便当其转动时刮擦容器的内表面。所述转子还连有两个半圆形(直径为60mm)高剪切刀片,所述刀片与矩形连接件(attachment)成45°角放置。将80mL溶液倾入容器中,盖紧盖子。然后以1250rpm剪切溶液10分钟。将充气溶液立即倾入量筒中。立即从量筒上读取泡沫体积,在5℃下贮存之后再次读数。如下所示,从测量的泡沫体积和已知的水相体积(即80mL)来确定气相体积:
气相体积=[(泡沫体积-80mL)/泡沫体积]x100
泡沫中的液体随时间排出,产生两个分开且截然不同的层:顶部的泡沫和下部的水溶液。然而,这里的关注点是泡沫相的稳定性。对于计算气相体积,将泡沫体积视为该体系(即,气相和液相两者)的总体积,而不管它们是否已分为两个截然不同的层。因此,气相体积的值给出了泡沫对于气体损失的稳定性(the stability of the foam to loss of gas)的量化指示。因此,若泡沫的初始气相体积为50%,则贮存之后,气相体积应为至少25%;若初始气相体积为20%,则贮存之后,气相体积必须为至少10%。
发泡剂包括疏水蛋白和生物表面活性剂,例如糖脂(例如鼠李糖脂、海藻糖脂、纤维二糖脂、槐糖脂);脂肽和脂蛋白(例如肽-脂质、沙雷湿润素(serrawettin)、黏质、表面活性肽、枯草杆菌蛋白酶、短杆菌肽、多黏菌素);脂肪酸、中性脂质和磷脂;高分子生物表面活性剂(例如乳化胶(emulsan)、biodispersan、甘露聚糖-脂质-蛋白质、脂乳化剂(liposan)、碳水化合物-蛋白质-脂质、蛋白质PA)、粒状生物表面活性剂(囊泡(vesicles)和伞毛(fimbriae)、全细胞)、糖苷(例如皂苷)和纤维状蛋白质(例如丝心蛋白)。乳及大豆蛋白/蛋白水解物也是发泡剂,虽然它们通常不是通过发酵方法来制备。优选地,发泡剂不是乳或大豆的蛋白或蛋白水解物。在一个特别优选的实施方式中,发泡剂是疏水蛋白。
可通过培养宿主有机体获得发泡剂,所述宿主有机体将发泡剂自然分泌至发酵培养基中。例如,可通过培养丝状真菌获得疏水蛋白,所述丝状真菌例如为丝孢纲(hyphomycetes)(例如木霉属(Trichoderma))、担子菌纲(basidiomycetes)和子囊菌纲(ascomycetes)。特别优选的宿主是食品级有机体,例如栗疫病菌(Cryphonectria parasitica),它分泌一种称作cryparin的疏水蛋白(MacCabe和Van Alfen,1999,App.Environ.Microbiol 65:5431-5435)。类似地,可从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)获得表面活性肽,可从例如铜绿假单胞菌(Pseudomanasaeruginosa)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、分枝杆菌属(Mycobacterium species)和球拟酵母(Torulopsis bombicola)获得糖脂(Desai和Banat,Microbiology and Molecular Biology Reviews,1997年3月,pp 47-64)。
或者,可通过使用重组技术制备发泡剂。例如,可对宿主细胞(典型为微生物)进行修饰,以表达发泡剂。用于将编码发泡剂的核酸构建物(其中发泡剂是多肽)或者制备发泡剂所必需的酶(其中发泡剂是非肽物质(non-peptide),例如生物表面活性剂)引入宿主细胞的技术是本领域熟知的。重组技术也可用于修饰发泡剂序列,或者合成具有所需/改进性质的新颖发泡剂。
典型地,通过编码所需多肽发泡剂的核酸构建物对适当的宿主细胞或有机体进行转化。可将编码多肽的核苷酸序列插入合适的表达载体中,所述载体编码用于转录和翻译的必需元件(elements),插入的方式使得所述核苷酸序列将在适当的条件(例如,在恰当的方向和正确的阅读框架中,具有恰当的靶向和表达序列)下表达。构建这些表达载体所需的方法是本领域技术人员熟知的。
许多表达体系可用于表达多肽编码序列。这些表达体系包括但不限于用适当的表达载体转化过的细菌、真菌(包括酵母)以及昆虫细胞体系和植物细胞培养体系。优选的宿主是视为食品级——“一般认为安全”(GRAS)的那些宿主。
合适的真菌属包括酵母菌和丝状菌属(filamentous species),前者例如但不限于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等属的那些,后者例如但不限于曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、镰孢霉属(Fusarium)等属的那些。
编码多肽发泡剂的序列优选与自然界中鉴定的发泡剂在氨基酸水平上具有至少80%的同一性,更优选具有至少95%或100%的同一性。然而,本领域技术人员可作出不降低发泡剂的生物活性的保守置换或其他的氨基酸变化。
疏水蛋白是一类特别优选的发泡剂。我们以前曾在EP 1623631中发现,疏水蛋白允许产生具有优异的抗歧化(disproportionation)和抗聚结稳定性的水性泡沫。由于疏水蛋白是非常有效的发泡剂,因此它们在发酵培养基中的存在对泡沫控制形成一个特别挑战。
疏水蛋白是一类充分定义的蛋白质(Wessels,1997,Adv.Microb.Physio.38:1-45;Wosten,2001,Annu Rev.Microbiol.55:625-646),其能够在疏水/亲水界面处自组装,并具有以下保守序列:
Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm(SEQ ID No.1)其中X代表任何氨基酸,n和m独立地代表整数。典型地,疏水蛋白具有至多125个氨基酸的长度。该保守序列中的半胱氨酸残基(C)是二硫桥键(bridge)的一部分。在本发明的上下文中,术语“疏水蛋白”具有更宽的含义,包括仍然显示在疏水-亲水界面自组装产生蛋白质膜的特性的功能上等价的蛋白质,例如包含以下序列或其部分,仍然显示在疏水-亲水界面自组装产生蛋白质膜的特性的蛋白质:
Xn-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-100-C-X1-100-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-50-C-Xm(SEQ IDNo.2)。根据本发明的定义,可通过将蛋白质吸附到特氟隆上,并使用圆二色性,以确定二级结构(一般是α-螺旋)的存在来检测自组装(DeVocht等,1998,Biophys.J.74:2059-68)。
可以通过在蛋白质溶液中孵育特氟隆片,然后用水或缓冲液洗涤至少3次来确定膜的形成(Wosten等,1994,Embo.J.13:5848-54)。可通过如本领域充分建立的任何合适的方法(例如用荧光标记物标记,或者通过使用荧光抗体)来显现蛋白质膜。m和n的值典型为0-2000,但更通常地,m和n的总和小于100或200。在本发明的上下文中,疏水蛋白的定义包括疏水蛋白与另一种多肽的融合蛋白,以及疏水蛋白与其他分子(如多糖)的缀合物。
至今所鉴定的疏水蛋白一般归类为I类或II类。这两种类型已在真菌中鉴定为分泌性蛋白质,它们在疏水界面处自组装成两亲膜。I类疏水蛋白的组装体(Assemblages)一般相对不可溶解,而II类疏水蛋白的那些组装体容易溶解在各种溶剂中。优选地,所述疏水蛋白溶于水,这意味着,其至少0.1%(优选至少0.5%)可溶于水。至少0.1%可溶于水是指使99.9mL水中的0.1g疏水蛋白在20℃下经受30000g离心30分钟时,不发生疏水蛋白沉淀。
在丝状细菌(如放线菌(Actinomycete sp.)和链霉菌(Streptomycessp.))中也鉴定了疏水蛋白样蛋白质(例如“chaplins”)(WO 01/74864;Talbot,2003,Curr.Biol.13:R696-698)。与真菌疏水蛋白形成对照,这些细菌蛋白可能只形成至多一个二硫桥键,因为它们可能只有两个半胱氨酸残基。此类蛋白质是功能上等效于具有SEQ ID Nos.1和2中所示共有序列的疏水蛋白的实例,并包括在本发明的范围内。
已经从超过16个真菌物种中克隆了多于34种编码疏水蛋白的基因(参见例如WO96/41882,其给出了双孢蘑菇(Agaricus bisporus)中鉴定的疏水蛋白的序列;以及Wosten,2001,Annu Rev.Microbiol.55:625-646)。就本发明而言,与天然存在的疏水蛋白在氨基酸水平上具有至少80%的同一性的疏水蛋白也包括在术语“疏水蛋白”内。
消泡剂
术语“消泡剂”既包括通常在发生发泡前加入的消泡剂,也包括通常在一旦形成泡沫就加入的那些消泡剂(有时称作“消泡剂(defoamers)”)。适用于本发明的一组特定消泡剂是显示浊点的那些消泡剂。浊点是在其下消泡剂水溶液当发生相分离(即,消泡剂分子形成散射光的聚集体)时变得明显浑浊的温度,如J.Eastoe在T.Cosgrove编著的Colloid Science:Principles,Methods and Applications(Blackwell Publishing,2005)中Surfactant Aggregation and Adsorption at Interfaces第63页所述。
显示浊点的消泡剂的例子包括基于聚亚烷基二醇(PAG)的化合物,例如环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物、基于环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物的多元醇、以及环氧乙烷和环氧丙烷的聚醚;以及基于脂肪酸酯的化合物。
浊点取决于表面活性剂的组成和化学结构。例如,对于聚氧乙烯(PEO)非离子型表面活性剂,对于给定的疏水基团,浊点随着EO含量的增加而升高。优选地,消泡剂的浊点在0℃与9℃之间,更优选在5℃与60℃之间。
优选地,消泡剂包含至少一种非离子型表面活性剂/聚合物,如聚醚、聚亚烷基二醇、环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物、基于环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物的多元醇、基于聚丙二醇的聚醚分散体或烷氧基化脂肪酸酯。基于PAG的消泡剂(例如可得自希伦赛勒赫公司(Schill and Seilacher)的Struktol J647)、基于EP/PO嵌段共聚物的多元醇(例如可得自希伦赛勒赫公司的Struktol J647)及其他非离子型表面活性剂消泡剂在消灭泡沫方面特别有效,即使存在强有力的发泡剂(如疏水蛋白)时也是如此。
可以使用消泡剂的混合物,在该情况下,这种混合物的浊点定义为单独组分中的最高浊点。
显示浊点的一些常见的市售消泡剂示于表1中。
表1
消泡剂 | 浊点/℃ |
聚亚烷基二醇Struktol J647,希伦赛勒赫公司Struktol SB2121UCON LB 65,陶氏化学公司(Dow Chemical Company)UCON LB 285UCON LB 625UCON LB 1715KFO673,路博润公司(Lubrizol)ST934,彭怀特有限公司(Pennwhite Ltd) | 24约30251510825约20 |
环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物Pluronic PE3100,巴斯夫公司(BASF)Pluronic PE6100Pluronic PE6200Pluronic PE8100Pluronic PE10100Mazu DF204,巴斯夫公司 | 412333363518-21 |
基于EP/PO嵌段共聚物的多元醇Struktol J650,希伦赛勒赫公司 | 13 |
基于聚丙二醇的聚醚分散体消泡剂204,西格玛公司(Sigma) | 15 |
烷氧基化脂肪酸酯Struktol J673,希伦赛勒赫公司 | 30 |
发酵方法与消泡剂的去除
通过以下方式进行发酵,以制备发泡剂:在生物反应器(例如工业发酵罐)内,在液体发酵培养基中培养宿主细胞。选择培养基的组成(例如营养素、碳源等)、温度和pH,为培养物的生长和/或发泡剂的制备提供适当的条件。将空气或富氧空气正常鼓入培养基中,为培养物的呼吸提供氧气。
可将消泡剂包括在初始培养基组合物中且/或在发酵期间按需加入。通常的实践是采用泡沫检测方法,例如电导探针,其自动启动消泡剂的加入。在本发明中,消泡剂的存在浓度优选为0.1-20g/L,更优选为1-10g/L。
在步骤i)期间,即,在发酵期间,发酵罐温度可高于或低于消泡剂的浊点。优选地,发酵罐温度高于消泡剂的浊点,因为消泡剂在高于其浊点的温度下对引起气泡聚结和泡沫崩塌最有效。一般对发酵罐温度进行选择,以达到用于宿主细胞生长和/或发泡剂制备的最适宜条件。
在发酵结束时,必须基本上去除消泡剂,以确保发泡剂的功能不受削弱。优选去除至少75%(更优选至少85%、最优选至少90%)的消泡剂。例如,在步骤ii)之后,消泡剂与发泡剂的重量比优选小于0.2,更优选小于0.15,最优选小于0.1。
通过确保发酵培养基的温度高于消泡剂的浊点,以使消泡剂相分离,实现消泡剂的去除。可通过任何合适的方法将相分离的消泡剂从发酵培养基中去除,所述方法例如:
-过滤,例如死端过滤或压滤器
-膜(交叉流)过滤,例如微滤或超滤
-离心
-吸附,使用例如活性炭、二氧化硅或硅藻土作为吸附剂。
可通过例如这些方法之一经单一步骤进行消泡剂的去除。或者,这些方法可重复或组合进行。例如,在第一过滤步骤之后,可重新加热(若有必要)滤液,然后再次过滤。
我们发现,若发酵培养基的温度高于所述浊点至少10℃,优选高于所述浊点至少20℃,最优选高于所述浊点至少30℃,则去除更多消泡剂。
发酵培养基的温度不可高到使发泡剂变性。为此,优选发泡剂具有热稳定性,例如疏水蛋白。发酵培养基的温度优选低于90℃,更优选低于75℃。在优选实施方式中,消泡剂的浊点为20-30℃,步骤ii)中发酵培养基的温度为40-60℃。相反,在常规方法中,刻意避免将发酵培养基保持在如此的高温下,以便使发生降解反应(其可引起颜色和风味变化)、酶失活、蛋白质变性和损失功能的可能性达到最小(参见例如Grandison,A.S.;Lewis,M.J.编著的“Separation Processes in the Food andBiotechnology Industries”第7页)。
用于分离消泡剂的优选方法是膜过滤。一般认为,在高于消泡剂的浊点的温度下对含消泡剂的发酵液进行膜过滤,导致由沉淀的消泡剂引起的膜污垢,导致低的渗透通量以及后续的处理困难:参见例如Yamagiwa等,J.Chem.Eng.Japan,26(1993)pp 13-18和WO 01/014521。因此,先前认为膜过滤应在低于浊点的温度下进行。然而,我们现在发现,在高于消泡剂的浊点约25℃的温度下进行超滤和微滤操作时,获得可接受的通量。
为了确保发泡剂产品不含细胞内材料和基因材料(其通常视为不合需要的污染物),必须从发酵培养基中去除细胞。在一个优选实施方式中,在去除沉淀的消泡剂的同时,将细胞从培养基中分离,例如在高于浊点的温度下所进行的微滤步骤中分离。
在另选的实施方式中,可在去除消泡剂之前,在单独的步骤中,在低于浊点的温度下从培养基中去除细胞——例如通过过滤(例如死端过滤或压滤器)、膜/交叉流过滤(例如微滤或超滤)或离心。在该实施方式中,提纯和/或浓缩步骤(例如通过超滤)可在去除细胞之后但在分离消泡剂之前进行(再次在低于浊点的温度下)。然后将培养基加热至高于浊点的温度,以致可如已经描述的那样将消泡剂去除。
一旦已从发酵培养基中去除消泡剂和细胞,就可根据需要,例如通过超滤进一步提纯和浓缩发泡剂产品。若发泡剂是疏水蛋白,可通过例如WO 01/57076中所描述的程序将其从发酵培养基中提纯,所述程序涉及将疏水蛋白吸附到一表面上,然后使该表面与表面活性剂(如Tween 20)接触,以将疏水蛋白从表面上洗脱。还参见Collen等,2002,BiochimBiophys Acta.1569:139-50;Calonje等,2002,Can.J.Microbiol.48:1030-4;Askolin等,2001,Appl Microbiol Biotechnol.57:124-30;和DeVries等,1999,Eur J Biochem.262:377-85。
现将参考以下实施例和附图进一步描述本发明,所述实施例仅仅是说明性的而非限制性的,在所述附图中:
图1显示了Struktol J647和J633的0.2重量%水溶液的作为温度的函数的%透射(transmission)。
图2显示了实施例2中测定的校准图。
实施例
实施例1:消泡剂的浊点测定
通过以下方法测量消泡剂的浊点,这里说明两种市售消泡剂,其中一种具有浊点(Struktol J647),而另一种没有浊点(Struktol J633)。
在室温下以水溶液的形式制备每种消泡剂的0.2重量%溶液。将20mL样品倾入圆筒形玻璃小瓶(Turbiscan)中。在测量温度下,在水浴中使样品平衡1小时。使用Turbiscan Lab Expert(弗穆拉克申(Formulaction),法国)测定样品的浊度。该仪器具有波长λ为880nm的光源以及与入射光成180°的光学传感器,所述光学传感器测量在离容纳样品溶液的小瓶底部25mm处的透射通过样品的入射光百分比。随着溶液变得更浑浊,透射光减少。将样品小瓶转移到同样设定在所需测量温度下的Turbiscan Lab Expert中。从5℃开始,按5℃的间隔测量作为温度的函数的%透射,结果示于图1中。对于J647,在20℃与25℃之间,透射从75%急剧降低到0%,表明在该温度范围内已经达到浊点。这与制造商所报的24℃温度值相一致。(若需要更精确的浊点值,可采用更小的温度间隔(例如1℃或2℃)进行测量。)相反,J633显示很小的浊度变化,因为它没有浊点。因此,J647是本发明中使用的合适消泡剂,而J633不是。
实施例2:从典型(model)溶液中去除消泡剂
进行实验,以说明可通过将溶液的温度升高至高于浊点,并通过过滤去除沉淀来将消泡剂从典型溶液中去除。取3.00g Struktol J647的等分试样,用MilliQ水稀释至1L,由此制备0.3%(w/v)Struktol J647溶液。通过将该溶液的样品在设定于所需温度的水浴中放置1小时,将其加热到高于浊点。然后,通过回荡轻轻混合样品,并立即过滤。
进行两个不同的实验。首先,在固定的溶液温度(50℃)下,使用带有2ml注射器,孔径为0.45μm(购自颇尔生命科学公司(Pall Life ScienceAcrodisc))、0.2μm、1.20μm和5.00μm(均购自SM公司(SartoriusMinisart))的过滤器研究过滤器孔径的影响。其次,将溶液温度从30℃变化到70℃(即,高于浊点6-46℃),同时使用固定孔径(0.2μm)。
通过使用用于非离子型表面活性剂的Lange LCK 433水测试试剂盒来测定滤液中的消泡剂浓度。其利用这样的原理:非离子型表面活性剂(如J647)与指示剂TBPE(四溴酚酞乙酯(tetrabromophenolphthalein ethylester))形成络合物,可将所述络合物萃取于二氯甲烷中,并经光度计测量,以确定浓度。首先构建校准曲线。取3.00g Struktol J647等分试样,在15℃下用MilliQ水稀释至1L,由此制备0.3%(w/v)Struktol J647溶液。从该溶液中取出等分试样,用MilliQ水稀释,以给出下列浓度:6、15、30、60、150和300mg/L。使用MilliQ作为空白样品。将每种浓度的0.2ml样品加入到容纳TBPE和二氯甲烷的试剂盒测试试管中。将试管轻轻混合2分钟,允许静置30分钟。然后,按照测试试剂盒的说明书,在Lang DR2800分光光度计中于605nm处对它们进行测量。图2显示了所得的校准曲线图。
然后用MilliQ水将各滤液稀释1/10。如前所述在分光光度计中对0.2ml样品进行测量,并从校准曲线图读取每个滤液中的消泡剂浓度。根据下式计算滤液中剩余的消泡剂的量(%):
(滤液中的测量浓度)/(已知的起始浓度)x100%
低至0.2mg/L(2x10-5%w/v)的消泡剂浓度可通过类似技术,使用Lange LCK 333水测试试剂盒来测量,并在适当的浓度范围内构建校准曲线。在此情况下,将待测量样品的2ml等分试样而非0.2ml等分试样加入测试试剂盒中。
表2中给出结果。使用0.2μm过滤器在50℃下的两次测量的消泡剂剩余量之间的差异(即6%)显示与该方法有关的误差棒(error bar)。
表2
过滤器孔径(μm) | 溶液温度(℃) | 高于浊点的温度(℃) | 剩余消泡剂(%) |
0.2 | 50 | 26 | 6 |
0.45 | 50 | 26 | 17 |
1.2 | 50 | 26 | 28 |
5.0 | 50 | 26 | 79 |
0.2 | 30 | 6 | 26 |
0.2 | 50 | 26 | 12 |
0.2 | 70 | 46 | 9 |
数据显示,过滤器孔径越小,去除的消泡剂的量越多,即,溶液中剩余的量如预期的那样减少。对于J647,5.0μm的孔径不够小,不足以去除大部分消泡剂,而0.2μm的孔径导致去除约90%的消泡剂。数据还显示,对于给定孔径,升高溶液温度导致更加有效地去除消泡剂。
实施例3:从典型发酵培养基中去除消泡剂
为说明从典型发酵培养基中去除消泡剂,制备典型发酵培养基。首先,制备组成如表3所示的两种溶液。在典型的流加式发酵中,批料1是原来培养基,批料2在进料期间逐渐送入。
表3
成分 | 批料1(g/L) | 批料2(g/L) |
葡萄糖 | 22 | 440 |
半乳糖 | 0 | 10 |
酵母提取物 | 10 | 25 |
正磷酸二氢钾 | 2.1 | 12 |
硫酸镁 | 0.6 | 2.5 |
消泡剂——Struktol J647 | 0.4 | 0.8 |
MilliQ水 | 至1L | 至1L |
在121℃下,将每种批料(体积1L)高压灭菌(autoclaved)20分钟。然后将这两种批料混合(50∶50),得到消泡剂浓度为0.6g/L的典型发酵培养基。不对该培养基进行接种或发酵,而是以其原初形式进行测试。加热样品,过滤去除消泡剂,测量消泡剂的剩余量,所有操作如实施例2中所描述。表4中给出了每种情况下剩余消泡剂的比例。
表4
过滤器孔径(μm) | 溶液温度(℃) | 高于浊点的温度(℃) | 剩余消泡剂(%) |
0.2 | 30 | 6 | 16 |
0.2 | 50 | 26 | 10 |
0.2 | 70 | 46 | 6 |
0.45 | 50 | 26 | 8 |
1.2 | 50 | 26 | 10 |
重复该实验,但在典型发酵培养基中加入额外的消泡剂,以使起始浓度为3g/L。结果示于表5中。
表5
过滤器孔径(μm) | 溶液温度(℃) | 高于浊点的温度(℃) | 剩余消泡剂(%) |
0.2 | 50 | 26 | 8 |
0.45 | 50 | 26 | 8 |
1.2 | 50 | 26 | 15 |
这说明,通过选择具有浊点的消泡剂,可用简单且便利的方式从典型发酵培养基中基本上去除消泡剂。
实施例4:从含有发泡剂的发酵液中去除消泡剂
对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因修饰菌株进行流加式发酵。通过掺入编码来自真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的疏水蛋白HFB II(一种发泡剂)的基因,将所述菌株修饰,以致在发酵过程中实现疏水蛋白的细胞外表达。基本如van de Laar T等在Biotechnol Bioeng.96(3):483-94(1997)中所述进行发酵,使用葡萄糖作为碳源,并在300L发酵容器中将该工艺过程按比例放大(scaling)到总体积为150L。使用消泡剂Struktol J647来控制发酵过程中的发泡(而非van de Laar T等所使用的Struktol J673)。
发酵结束时,在15℃(即,低于消泡剂J647的浊点)下微滤发酵液,以去除酵母细胞。在具有孔径为0.1μm的Kerasep陶瓷膜的中试装置(pilot scale plant)上进行微滤,使用去离子水进行两体积渗滤(twovolumes of diafiltration)。然后,再次在15℃下,对液体进行超滤,以部分提纯HFB II。通过1kD Synder缠绕式(spiral wound)聚合物膜,在0.9巴的跨膜压力下进行超滤,进行四体积渗滤。
超滤步骤之后,发酵液中消泡剂的浓度经测量(如实施例2中所述)为0.196g/L。HFB II的浓度通过如下所述的高效液相色谱(HPLC)测量为0.320g/L。分析之前,用60%乙醇水溶液稀释样品,使其浓度约为200μg/ml。在30℃下,在Vydac Protein C4柱(250x4.6mm)上进行HPLC分离。通过214nm处的UV检测测量疏水蛋白,通过与得自VTT生物技术公司(VTT Biotechnology)(埃斯普(Espoo),芬兰)的已知HFB II浓度的样品作比较,计算其浓度。
然后如实施例2中所述,将不含细胞的发酵液加热至50℃,在该温度下保持30分钟,然后过滤(0.2μm孔径),以去除消泡剂。如前所述测量滤液中消泡剂和HFB II的剩余量,表6中给出结果(标题为“阶段1”栏)。然后将来自该第一阶段的滤液再加热至50℃,在该温度下保持额外30分钟,并如前所述过滤。测量所得滤液中HFB II和消泡剂的浓度,表6中给出结果(“阶段2”)。
表6
阶段1 | 阶段2 | |
滤液中HFB II的量(g/L) | 0.32 | 0.30 |
剩余的HFB II% | 100 | 93.75 |
滤液中消泡剂的量(g/L) | 0.05 | 0.028 |
剩余的消泡剂% | 25.5 | 14.3 |
消泡剂:HFB II的质量比 | 0.156 | 0.093 |
这说明,通过选择具有浊点的消泡剂,可用简单且便利的方式从含有宿主细胞和发泡剂的发酵液中基本上去除消泡剂。
适当时,以上各单独部分中提到的本发明各种特征和实施方式经过必要的修改后,应用于其他部分。因此,适当时,一个部分中指明的特征可与其他部分中指明的特征相组合。
在以上说明书中提到的所有出版物均通过引用并入本文。不背离本发明范围的本发明所述方法的各种修改和变化对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方式描述了本发明,但应理解,所要求保护的本发明不应不适当地受限于此类具体的实施方式。实际上,对于相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述方式的各种修改有意包括在所附权利要求书的范围之内。
Claims (16)
1.制备发泡剂的方法,其包括:
i)在发酵培养基中培养宿主细胞,其中:
所述宿主细胞在细胞外分泌发泡剂;并且
所述发酵培养基含有具有浊点的消泡剂;
ii)当所述发酵培养基的温度高于所述浊点时去除消泡剂。
2.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤i)中,通过向其中鼓入空气或富氧空气对所述发酵培养基进行充气。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中在步骤i)中,所述发酵培养基的温度高于所述消泡剂的浊点。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中在步骤ii)中,通过过滤、离心或吸附去除所述消泡剂。
5.根据权利要求4所述的方法,其中通过膜过滤去除所述消泡剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中在步骤ii)中,去除至少75%的所述消泡剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中在步骤ii)中,所述发酵培养基的温度高于所述浊点至少10℃。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中在步骤ii)中,从所述发酵培养基中去除所述宿主细胞。
9.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中在步骤ii)之后,从所述发酵培养基中提纯和/或浓缩所述发泡剂。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述消泡剂为食品级。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述消泡剂包含至少一种非离子型表面活性剂/聚合物。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述消泡剂是聚醚、聚亚烷基二醇、环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物、基于EO/PO嵌段共聚物的多元醇、基于聚丙二醇的聚醚分散体或烷氧基化脂肪酸酯。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述发泡剂为食品级。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述发泡剂是疏水蛋白。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是基因修饰真菌。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中在步骤ii)之后,消泡剂与发泡剂的重量比小于0.2。
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