TW200930402A

TW200930402A - Cancer vaccine composition

Info

Publication number: TW200930402A
Application number: TW97147299A
Authority: TW
Inventors: Haruo Sugiyama
Original assignee: Int Inst Cancer Immunology Inc
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2008-12-05
Publication date: 2009-07-16
Also published as: AU2008332278B2; MX2010006070A; CA2881594C; RU2013141923A; KR20100090710A; US8557779B2; CN105903006A; TWI504407B; TW201406390A; KR101610664B1; CA2940962C; CN103394079A; CA2940962A1; RU2682726C2; CN101888852A; US20110070251A1; JP5921494B2; KR101592855B1; TWI455721B; CA2706907A1

Description

200930402 . 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明為關於—種人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽生者用癌疫n成物’係含有病毒腫瘤的癌抑制基因訂1 的基因產物蛋白質（以下有時略稱為m蛋白質）或其部分胜肽（以下有時略稱為WT1胜肽）。本發明又有關於 HLA-A*0206陽性者用癌疫苗組成物、訂〗特異性π。的誘導方法、呈現（presenting)癌抗原的樹狀細胞的誘導方法、HLA-A*0206陽性者用的癌診斷方法、及癌治療或預防方法’係含有編碼上述WT1蛋白質或WT1胜肽的DNA或RNA。本發明還關於一種HLA-A*0206陽性者用癌疫苗組成物，係含有WT1胜肽的修飾胜肽。【先前技術】病毒腫瘤基因WT1被認為是與兒童腎臟腫瘤的病毒腫瘤的腫瘤形成有關的基因而單離出來（請參照非專利文獻 ❹ 1)。此基因是編碼鋅指（zinc finger)轉錄因子 (transcription factor)的基因，該鋅指轉錄因子係關速於細胞增瘦及細胞分化的調節機制，以及細胞洞亡 (apoptosis)及組織發育。 WT1基因起初被分類為腫瘤抑制基因。但近年來由於以下（i)至（iii)的證據： (i)於包含如白jk病及骨聽發育不良症候群（MDS)等造血性惡性腫瘤之各種的人類惡性腫瘤及實體癌中，野生裂 WT1 基因的高表現（high expression)， 320827 3 200930402 - (ii)以WT1抗反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide)處理的人類白血病細胞及實體癌細胞的增殖阻礙， (iii)由野生型WT1基因的組成性表現（constitutive expression)引起的小鼠骨髓性前驅細胞的增殖促進與分化抑制’暗示野生型WT1基因在各種類型的惡性疾患中，與其謂之為腫瘤抑制作用不如為進行發癌作用（參照專利文獻1) 〇 Ο 並且，已知WT1基因在胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列線癌、子宮癌、子宮 . 頸癌、卵巢癌等實體癌中也有高表現（參照專利文獻2)。用於排除異物的免疫機制中，一般而言有關於辨認抗原而作用為抗原呈現細胞的巨噬細胞、辨認該巨噬細胞的抗原呈現而使產生各種淋巴介質（lymphokine)的其他T細胞等活化的輔助T細胞（helper T cell)、由該淋巴介質的 Q 作用而分化為抗體產生細胞的B淋巴球等的體液免疫 (humoral immunity);及接受抗原的呈現而分化的細胞毒性（cytotox i c)T淋巴球（CTLs)攻擊破壞目標細胞之細胞性免疫。目前，癌的免疫被認為主要是CTLs參與的細胞性免疫。在CTLs參與的癌免疫中，辨認以第一型主要組織相容複合物（Major Histocompatibility Complex Class I ; MHC Class I)與癌抗原的複合體形態所呈現（presentation)的癌抗原的前驅體T細胞，經分化增殖所生成的CTLs攻擊破 4 320827 200930402 壞癌細胞。此際，癌細胞將mhc class丨抗原與癌抗原的複合體在其細胞表面呈現，，成為CTLs的目標（參照非專利文獻2至5)。人的MHC則被稱為人類白血球型抗原（HLA)。在目標細胞的癌細胞上由MHC class j抗原所呈現的則述癌抗原，被認為是在癌細胞内合成的抗原蛋白質藉由細胞内蛋白分解酶之處理所生成之由約8至12個胺基酸所成的胜肽（參照非專利文獻2至5)。目前，對各種癌的抗 ❾原蛋白質正進行檢索，但被證明為癌特異性抗原者不多。在wti基因表現產物的胺基酸序列中，與HLA_A>k24〇2 或與HLA_A*0201的結合上’確認有合成含有至少一個胺基 '酸作用為錨定胺基酸的連續7至30胺基酸所成的多胜肽，以及該等胜肽與HLA-A*2402或.與HLA-A*0201的結合 (HLA-A*2402限制性或HLA_A*〇2〇1限制性）；同時，在與 HLA-A*2402或與HLA-A*0201結合的情況，顯示誘導cTLs 且對目標細胞有殺細胞效果（以下簡稱為CTL反應）。並由〇此鑑定此等胜肽為源自WT1基因表現產物蛋白質的CTL抗原抗原.決定基（CTL epitope)。目前，WT1特異性的CTLs抗原決定基只對於 HLA-A*2402 或 HLA-A*0201(參照專利文獻 3)、HLA-A*3303 (參照專利文獻4)以及HLA-A*1101(專利文獻5)有鏗定，確認基於前述胜肽的CTL反應是只有由hla_A*2402限制性、HLA-A*0201 限制性、hla_a*33〇3 限制性及 HLA- A*ll〇i 限制性所引發的特異性反應。此事帶來癌抑制基因WT1的基因產物之蛋白質為有希 5 320827 200930402 . 望的腔瘤排斥抗原（tumor rejection antigen)(也稱為腫瘤相關抗原（tumor associated antigen, TAA))的可能性。事實上，高頻率的WT1特異性CTLs或高抗體力價的抗WT1 抗體’並不在健康供血者的末梢血中，而是在癌患者的末梢血中檢測的。然而’由於HLA也是規定個人的標諸（marker)，而為多樣的。HLA的情況’ MHC class I抗原有HLA-A、HLA-B 及 HLA-C，class II 抗原有 HLA-DP、HLA-DQ 及 HLA-DR 之, 各有複數者存在。又HLA的各個抗原結合部位富有多類型，例如已知HLA-A有27種以上，HLA-B有59種以上， HLA-C有10種以上的多類型（對偶基因（aiieie))。

因此，希望藉由結合於HLA-A*2402、HLA- A*0201、 HLA-A*3303或HLA- A*1101以外的類型的HLA且誘導CTL 反應的特定癌抗原，擴大能適用免疫療法的對象。另一方面’ WT1胜肽的修飾胜肽中，有2件文獻報告 ❾ 下列3種胜肽： WTlmPlY胜肽（YLGEQQYSV ;序列編號12)及 WTlmPlY胜肽（YMFPNAPYL ;序列編號35)(均參照專利文獻 6)，以及 WTlmPQM胜肽（RMFPNAPYM;序列編號52)(參照專利文獻7)。更有在歐洲專利1127068的審查意見書上，有下列2 種胜肽的報告： WTlmP2L 胜肽（RLFPNAPYL ;序列編號 39) WTlmP2L&P9V胜肽（RLFPNAPYV ;序列編號75)(參照非專利 6 320827 200930402 :文獻7)。 <旦7^’34些 WT1 修飾胜肽與 HLA-A*2402、HLA-A*0201、 HLA-A*3303或HLA- A*ll〇l以外的類型的HLA結合且誘導 CTL反應而為癌抗原，則完全沒有報告。 [專利文獻丨]日本特開平9-104629號公報 [專利文獻2]日本特開平u_〇35484號公報 [專利文獻3]國際公開第w〇〇〇/〇66〇2號小冊 ❹[專利文獻4]日本特願2006-045287號 [專利文獻5]日本特願2006-355356號 [專利文獻6]國際公開第机)2005/053618號小冊 '[專利文獻Ή國際公開第W02007/016466號小冊 [非專利文獻 l]Gessler，M.等，Nature，第 343 卷，774-778 頁，1990年 [非專利文獻 2]Cur. Opin. Immunol.，第 5 卷，709 頁， 1993 年 ❾ [非專利文獻3]Cur. Opin. Immunol.，第5卷，719頁， 1993 年 [非專利文獻4]Cell，第82卷，13頁，1995年 [非專利文獻 5]Immunol. Rev.，第 146 卷，167 頁，1995 年 [非專利文獻 6]Mol. Cell. Biol·，第 11 卷，1707 頁，1991 年 [非專利文獻7]歐洲專利1 127068的審查意見書【發明内容】 .[發明要解決的課題] 7 320827 200930402 η ' 本發明是將一種癌的治療法及/或預防法的適用範圍擴大於HLA-A*0206陽性者為目的，該治療法是對含白血病在内的惡性腫瘤患者以癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質 (WT1蛋白質）或其部分胜肽（WT1胜肽）為基礎。 [為解決課題的手段] 為了解決上述課題，本研究者進行精心研究。其結果發現：有關源自人類WT1蛋白質的WTlm胜肽（SLGEQQYSV) ❹ 及WTlm胜肽（RMFPNAPYL)，以往只知道誘導jjla-A*0201 限制性的CTLs，而驚奇地發現該胜肽也誘導hla_a*〇2〇6 限制性的CTLs。又’誘導HLA_A*0201限制性cTLs的WT1 胜肽，只知道國際公開第W000/06602號小冊所記載的胜肽而已，但也發現WTlm胜肽的修飾胜肽（又稱為WT1187修飾胜肽）及WTlm的修飾胜肽（又稱為WTlm修飾胜肽），也與 HLA-A*0201分子結合。本發明者基於這些知識再精心研究，而完成本發明。〇即，本發明與下列（1)至（17)有關。 (1) 一種人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者用癌疫苗組成物，係含有癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽為特徵。 (2) 上述（1)記載的組成物，其癌抑制基因wti的基因產物蛋白質係為以下之（3)或（1))中之一種蛋白質。 (a) 序列編號1的胺基酸序列 (b) 胺基酸序列（a)中，有1個或數個胺基酸欠缺、取代或附加的胺基酸序列所成’並對HLA-A*0206陽性者 320827 8 200930402 • 具有免疫原性的蛋白質。 (3) 上述（1)所記載的組成物，其部分胜肽為 WT1187胜肽：Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號2).. WTI126胜狀：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)， WTlmFlF 胜肽：Phe Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號11)， Ο WTlmP2M 胜狀：Ser Met Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號16)， WTli87P3M 胜肽：Ser Leu Met Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號20)， WTlmPlF 胜肽：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號34) ^ WTli2eP2L 胜肽：Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序 ❹ 列編號39)， WTlmP3M 胜肽：Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號46)，或 WTlmP9V 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(序列編號4 9 )。. (4) 上述（1)至（3)項任一項所記載的組成物，復含有佐劑 (adjuvant) ° (5) —種人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者用癌疫苗組成物，係以含有編碼癌抑制基因WT1的基因產物蛋 9 320827 200930402 . 白質或其部分胜肽的DM為特徵。 (6) 種人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者用癌疫苗組成物’係以含有編碼癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的RNA為特徵。 (7) 種^Tl特異性CTLs的誘導方法，係含有下述步驟為其特徵：將源自人類白血球型抗原（HLA)_A*〇2〇6陽性者的週邊血液單核細胞（peripheral blood ❹ mononuclear cell)，在癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的存在下培養，由該週邊血液單核球誘導WT1特異性CTLs。 (8) —種呈現癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的樹狀細胞的誘導方法，係含有下述步驟為其特徵：將源自人類白血球型抗原（HLA)_A>k〇2〇6陽性者未成熟樹狀細胞（dendritic cells)，在癌抑制基因WT1 的基因產物蛋白質或其部分胜肽的存在下培養，由該 © 未成熟樹狀細胞誘導呈現該蛋白質或其部分胜肽的樹狀細胞。 (9) 一種人類白血球型抗原（111^)-#〇2〇6陽性者用的癌的診斷方法，係含有下述步驟為其特徵：檢測或定量源自人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者的試樣中的癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽、其抗體或WT1特異性ctLs的步驟以及其次之將該蛋白質或其部分胜肽、其抗體或WT1特異性CTLs之量，與癌未發症的情況比較的步驟；或者，將上述（7)記載的方 320827 10 200930402 ' 法所誘導的WT1特異性CTLs或上述（8)記载的方法所誘導的樹狀細胞投藥於（HLA)-A*0206陽性對象以及其次之在（HLA)-A*0206陽性對象決定該CTLs或樹狀細胞的位置或部位的步驟。 (10) —種人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者用癌疫苗組成物’係含有下述胜肽為其特徵：癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質的部分胜肽wti187 ❹ 胜肽· Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val (序列編號 2)或 WTlm胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A*0206陽性者有免疫原性的胜肽 (11) 上述（10)項所記載的組成物，該胜肽為下述者： WTlmPlF 胜肽：Phe Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號11)、 WTli87P2M 胜肽：Ser Met Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val (序 ❾ 列編號16)、 WTli87P3M 胜肽：Ser Leu Met Glu Gin Gin Tyr Ser Val (序列編號20)、 WTlmPlF 胜肽：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號34)、 WTlmP2L 胜肽：Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號39)、 WTlmP3M 胜肽：Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號46)或 11 320827 200930402 » ’ WTli2eP9V 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(序列編號4 9)。 (12) —種癌的治療或預防方法，係將含有癌抑制基因wti 的基因產物蛋白質或其部分胜肽的組成物，給藥至 (HLA)-A*0206.陽性者。 (13) 癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽之用途，係用於人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者的癌之治療或預防。 Ο (14) 一種癌的治療或預防方法，係將含有下述胜肽的組成物’投藥至人類白血球型抗原（HLA)-A*0201陽性者：癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的 WTlm胜肽：Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號 2)或 WTIne胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的胜肽。 Q (15)下述胜肽之用途，係用於人類白血球型抗原 (HLA)-A*0201陽性者的癌的治療或預防：癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的 WTlm胜肽：Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號 2)或 WTli26胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的胜肽。 (16)—種癌的治療或預防方法，係將編碼癌抑制基因WT1 的基因產物蛋白質或其部分胜肽的RNA，導入至人類 320827 12 200930402 • 白血球型抗原（HL«-A*0206陽性者的樹狀細胞。 (17)—種編碼癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的RNA之用途，係用於人類白血球型抗原 (HLA)-A*0206陽性者的癌的治療或預防。本發明又關於癌抑制基因WT1的基因產物之蛋白質或其部分胜肽的使用，係用於製造Hu—A*〇2〇6陽性者的癌的治療或預防用的癌疫苗組成物。 Q 本發明又關於下述胜肽的使用，係用於製造 HLA-A*0201陽性者的癌的治療或預防用的癌疫苗組成物：癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的 WTlm胜肽：Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號 2)或 WT1126胜肽：Arg Met Phe Pr〇 Asn Ma Pr〇 Tyr

Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對hLA_a*〇2〇i陽性者有免疫原性的胜肽。又在本發明中所稱「癌疫苗組成物」，係指接種或投藥 © 至包含人類的動物，而用於癌的治療或預防用的醫藥而吕。「治療」是指完全治療病理狀態之外，雖不完全治癒但抑制症狀的進展及/或惡化’阻止病理狀態的進行，或改善病理狀態的一部分或全部而導向治癒；「預防」是指防止、抑制或延遲病理狀態之發症。又例如’源自HLA-A*0206陽性者或HLA-A*0201陽性者的週邊血液單核球、未成熟樹狀細胞、WT1特異性CTLs 及樣品等’係分別指由HLA-A*0206陽性者或HLA-A*0201 陽&者所分離或採取的週邊血液單核球，未成熟樹狀細 13 320827 200930402 -胞，WT1特異性CTLs及血液等生體樣品等。又，源自 HLA-A*020.6陽性者或HLA-A*0201陽性者的WT1特異性 CTLs ’也包含由HLA-A*0206陽性者或HLA-A*0201陽性者所分離或採取的週邊血液單核球、未成熟樹狀細胞，或血液等生體樣品等所誘導的CTLs。 [發明的效果] 由本發明可以在HLA-A*0206陽性者體内及體外誘導 WT1特異性CTLs。以往，使用包含WT1蛋白質或WT1胜肽 Ο 之疫苗的免疫療法的適用，只限定於HLA-A*0201陽性患者或HLA-A*2402陽性患者，但由於本發明，其對象可以擴大到HLA-A*0206陽性患者。HLA-A2為在白種人頻率最高的 HLA class I的血清型（約50%)，其大多數為HLA-A*0201，但約4%的白種人有HLA-A*0206。又在日本人中，HLA-A24 (其大多數為HLA-A*2402)為頻率最高的血清型（約58%)， HLA-A2在日本人顯示約42%。但有HLA-A2的日本人，只有〇約 43%有 HLA-A*0201，其餘有^^-八*0206 或111^4*0207。換言之’約18%的日本人有HLA-A*0201，約17%的日本人有HLA-A*0206。因此，與HLA-A*0201陽性限制性CTL抗原決定基同樣地，至少在日本人也發現HLA-A*0206陽性限制性CTL·抗原決定基的情況，可以將癌免疫療法的適用擴及HLA-A*0206陽性者，因而非常有用。並且，這個對偶基因（allele)可見於14%的中國人、9%的韓國人，所以可以擴大本發明的癌疫苗組成物的適用範圍ρ 本發明的癌疫苗組成物，是在HLA-A*0206陽性者表現 14 320827 200930402 WT1的癌，例如造血器官腫瘤、實體癌等的治療上有用。又，本發明的癌疫苗組成物，對於HLA-A*0206陽性者的癌發病預防有用。【貫施方式】 [實施發明的最佳形態] 以下說明本發明。本說明書及圖式中，以縮寫表示胺基酸殘基時，以下列編寫表示 0 ® Ala 或 A 丙胺酸殘基 Arg 或 R 精胺酸殘基 Asn 或 N 天門冬醯胺酸殘基 Asp 或 D 天門冬胺酸殘基 Cys 或 C 半胱胺酸殘基 Gin 或 Q 麵醯胺酸殘基 Glu 或 E 麩胺酸殘基 Q Gly 或 G His 或 H 甘胺酸殘基組胺酸殘基 lie 或 I 異白胺酸殘基 Leu 或 L 白胺酸殘基 Lys 或 K 離胺酸殘基 Met 或 M 曱硫胺酸殘基 Phe 或 F 苯丙胺酸殘基 Pro 或 P 脯胺酸殘基 Ser 或 S 絲胺酸殘基 15 320827 200930402 • Thr或τ :羥丁胺酸殘基

Trp或W :色胺酸殘基 Tyr或Y :酪胺酸殘基 Val或V:纈胺酸殘基本發明中的WT1蛋白質是以作為病毒腫瘤的致病基因 (responsible gene)所單離的鋅指型轉錄因子的基因產物，並可舉與HLA- A*0206分子結合而成為惡性腫瘤的目 ❹ 標抗原者。本發明中的WT1蛋白質，具體地可舉由449個胺基酸所成的人類WT1蛋白質（序列表：序列編號1)，或在此胺基酸序列中，有1個或數個（約2至6個為佳）的胺基酸為欠缺、取代或附加的胺基酸序列所成，且對HLA-A*0206陽性者有免疫原性的蛋白質為佳。插入的胺基酸或取代的胺基酸，也可以是由基因所編瑪的20種胺基酸以外的非天然胺基酸。， WT1蛋白質的部分胜肽（WT1胜肽）是指構成WT1蛋白質 ❹ 的胺基酸序列之一部分所成的胜肽。WT1胜肽，可舉與. ELA-A*0206分子結合而誘導細胞傷害性T細胞的源自WT1 蛋白質為8至12個胺基酸所成的胜肽，而可舉較佳為8至 9個胺基酸所成的胜肽。又，特別佳的是國際公開第 WO00/06602 號小冊記載的 WTli87胜肽（Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val ;序列編號 2)或 WTlm胜肽（Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu ;序列編號 3)。又，只要是對於HLA-A*0206陽性者有免疫原性的胜肽即可，在WT1胜肽中有1個或數個胺基酸為欠缺、取代或 16 320827 200930402 附加的修飾胜肽，也可以使用做為本發明的WT1胜肽。這種修飾胜肽可舉WT1⑻胜肽的修飾胜肽及WTh26胜肽的修飾 WTlrn胜肽的修飾胜肽’可舉合適為其由N末端起第^ 至第8個胺基酸殘基，與WTli87胜肽的由N末端起第4复第8個胺基酸殘基（EQQYS)相同的胜肽；較合適為其由n | 端起第4至第9個胺基酸殘基，與WTlm胜肽的由N束％起第4至第9個胺基酸殘基（EQQYSV)相同的胜肽。达蘇 © ^ WTlrn胜肽的修飾胜肽，以有下列序列編號4至26及54复 62之任一者所記載的胺基酸序列所成的胜肽為佳。 WTlmHG 胜肽（GLGEQQYSV ;序列編號 4) WTlmPlA 胜肽（ALGEQQYSV ;序列編號 5) WTlmPlV 胜肽（VLGEQQYSV ;序列編號 6) WTlmPlL 胜肽（LLGEQQYSV;序列編號 7) WTlmPlI 胜肽（ILGEQQYSV ;序列編號 8) 〇 WTlmPlM 胜肽（MLGEQQYSV ;序列編號 9) WTlmPlW 胜肽(WLGEQQYSV ;序列編號 10) WTlmPlF 胜肽（FLGEQQYSV ;序列編號 11) WTlmPlY 胜肽（YLGEQQYSV ;序列編號 12) WTlmP2V 胜肽（SVGEQQYSV ;序列編號 13) WTlmP2Q 胜肽（SQGEQQYSV ;序列編號 14) WTlmP2I 胜肽（SIGEQQYSV ;序列編號 15) WTlmP2M 胜肽（SMGEQQYSV ;序列編號 16) WTlmP3L 胜肽（SLLEQQYSV ;序列編號 Π) 17 320827 200930402 WTli8?P3A 胜肽（SLAEQQYSV ;序列編號 a) WTlmP3V 胜肽（SLVEQQYSV ;序列編號 19) WTli8?P3M 胜狀（SLMEQQYSV;序列編號 WTli87P3P 胜肽（SLPEQQYSV ;序列編號 21) WTlmP3W 胜肽（SLWEQQYSV ;序列編號 22) WT1i8?P3F 胜肽（SLFEQQYSV ;序列編號 23) WTlmP3Y 胜肽（SLYEQQYSV ;序列編號 24)

WTImPSS 胜狀（SLSEQQYSV ;序列編號· 25) WTli87P3I 胜肽（SLIEQQYSV ;序列編號 26) WTlmP9L 胜肽（SLGEQQYSL ;序歹I〗編號 53) WTlmPlD 胜肽（DLGEQQYSV ;序列編號 54) WTI187PIE 胜肽（ELGEQQYSV ;序列編號 η) WTlmPlH 胜肽（HLGEQQYSV ;序列編號 56) WTlmPlK 胜肽（KLGEQQYSV ;序列編號 57) WTlmPlN 胜肽（NLGEQQYSV ;序列編號 58) WTlmPlP 胜肽（PLGEQQYSV ;序列編號 5g) WTlmPlQ 胜肽（QLGEQQYSV ;序列編號 6〇) WT1 mPlR 胜狀（RLGEQQYSV，序列編辦· 61) WTlmPlT 胜肽（TLGEQQYSV ;序列編號 62) WTlm胜肽的修飾胜肽，可舉合適為其由N末端第4 -1*1^. 第8個胺基酸殘基，與WTlm胜肽的由N末端起第4至第8 個胺基酸殘基（PMPY)相同的胜肽。這種WTh26胜肽的修飾胜肽，有下列序列編號27至52及63至75之任一者所^ 載的胺基酸序列所成的胜舦為佳。 °

1R 320827 200930402

-WTlmPlG 胜肽（GMFPNAPYL WTlmHA 胜肽（AMFPNAPYL WTlmPlV 胜肽（VMFPNAPYL WTlmPlL 胜肽（LMFPNAPYL WTlmPlI 胜肽（IMFPNAPYL WTlmPlM 胜肽（MMFPNAPYL WTlmPlW 胜肽（WMFPMPYL WTlmPlF 胜肽（FMFPNAPYL ® WT1126P1Y 胜肽（YMFPNAPYL

WT1126P2V 胜肽（RVFPNAPYL WT1126P2Q 胜肽（RQFPNAPYL WT1126P2A 胜肽（RAFPNAPYL WTlmP2L 胜肽（RLFPMPYL WT1126P2I 胜肽（RIFPNAPYL WT1126P3I 胜肽（RMIPNAPYL Q WTlmP3L 胜肽（RMLPNAPYL

WT1126P3G 胜肽（RMGPNAPYL WT1126P3A 胜肽（RMAPNAPYL WTlmP3V 胜肽（RMVPNAPYL WT1126P3M 胜肽（RMMPNAPYL WT1126P3P 胜肽（RMPPNAPYL WT1126P3W 胜肽（RMWPNAPYL WT1126P9V 胜肽（RMFPNAPYV WTlmP9A 胜肽（RMFPNAPYA ;序列編號27) ;序列編號2 8) 序列編號29) 序列編號30) 序列編號31) 序列編號32) 序列編號33) 序列編號34) 序列編號35) 序列編號36) 序列編號37) _序列編號3 8 ) 序列編號39) 序列編號40) 序列編號41) 序列編號42) 序列編號43) 序列編號44) 序列編號4 5 ) 序列編號46) 序列編號47) 序列編號48) 序列編號49) 序列編號50) 19 320827 200930402 -WT1i26P9I 胜肽（RMFPNAPYI ;序列編號 51) WTlmP9M 胜肽（RMFPNAPYM ;序列編號 52) WTlmPlD 胜肽（DMFPNAPYL ;序列編號 63) WT1126P1E 胜肽（EMFPNAPYL ;序列編號 64) WTlmPlH 胜肽（HMFPNAPYL ;序列編號 65) WTlmPlK 胜肽（KMFPNAPYL ;序列編號 66) WTlmPlN 胜肽（NMFPNAPYL ;序列編號 67) WTlmPlP 胜肽（PMFPNAPYL;序列編號 68) ® WTlmPlQ 胜肽（QMFPNAPYL ;序列編號 69) WTlmPlS 胜肽（SMFPNAPYL ;序列編號 70) WTlmPlT 胜肽（TMFPNAPYL ;序列編號 71) WTlmP2I&P9I 胜肽（RIFPNAPYI ;序列編號 72) WTlmP2I&P9V 胜肽（RIFPNAPYV ;序列編號 73) WTlmP2L&P9I 胜肽（RLFPNAPYI ;序列編號 74) WTlmP2L&P9V.胜肽（RLFPNAPYV ;序列編號 75) 〇其中，WTl〗87胜肽的修飾胜肽’以WTlmPlF胜肽（序列編號ll)、WTlmP2M胜肽（序列編號16)或WT1]87P3M胜肽（序列編號20)為佳；以WTlmPlF胜肽或WTlmP2M胜肽為較佳；WTlu7P2M胜肽再較佳。WTli26胜肽的修飾胜肽則以 * » WTlmPIF胜肽（序列編號34)、WTlmPSL胜肽（序列編號 39)、WTlmP3M胜肽（序列編號46)或WTlmPgV胜肽（序列編號 49)為佳；以 WT1126P2L 胜肽、WTlmP3M 胜肽或 WTlmP9V 胜肽較佳；WTlmP9V胜肽再較佳。本發明的癌疫苗組成物的wti胜肽，以mm胜肽、 20 320827 200930402 -WTli26 胜肽、WTlrnPlF 胜肽、WTlmP2M 胜肽、WTlmP3M 胜肽、WTlmPlF 胜肽、WT1i26P2L 胜肽、WTlmP3M 胜肽或 WTli26P9V胜肽為佳。較佳的是WT1187胜肽、WTlm胜肽、 WTlmPlF 胜肽、WTlinP2M 胜肽、rrimP2L 胜肽、WT1i26P3M 胜肽或WTlmP9V胜肽；再較佳的是WT1187胜肽、WTli26胜肽、 WTli87P2M胜肽或WTh26P9V胜肽；特別佳的是WTlm胜肽或 WT1126 胜狀。又’ WT1胜肽的衍生物也可使用做為WT1胜肽。例如 ® WTli87胜肽及WTlrn胜肽的衍生物，可舉在上述由9個連續胺基酸所成的胺基酸序列的N末端及/或c末端，有種種物質結合者。例如有胺基酸、胜肽、及其類似物（&nal〇gUe) 等結合也可以。WTlm胜肽或WTlm胜肽，或其修飾胜肽有該等物質結合時，該等物質經例如生體内的酵素等，或細胞内處理等過程而被處理，最終生成由上述由9個胺基酸所成的胜肽，成為HLA-A*0206分子的複合體而呈現於細胞 ❾ 表面，而在有HLA-A*0206的患者中可以引發WT1特異性 CTL反應。 WT1胜肽，可藉由在該技術領域中通常使用的方法製造。例如可藉由 Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; 。千卜'合成，丸善（股），1975 ;彳 7° 千F合成Φ基礎ci:実驗，丸善（股），1985 ;医薬品0開発続第14卷、弋7。千卜、合成、広川書店，1991等所記載的胜肤合成方法而合成。 21 320827 200930402 • WT1胜肽及修飾胜肽的篩選方法，例如使用有 HLA-A*0206的患者幾人的PBMCs(週邊血液單核球）只以工次的胜肽刺激而進行1FNt分析，而選擇有良好反應的胜肽的方法，因簡便而為佳。在本發明中，編碼上述對HLA-A*0206陽性者有免疫原性的WT1蛋白質或WT1胜肽的DNA等多核苷酸，也可使用做為癌疫苗組成物的有效成分。亦即，將編碼WT1蛋白質或WT1胜肽的多核苷酸，插入至適當的載體（較佳為表現載體）後’經由投藥至包含人類的動物，而可在生體内產生癌免疫。多核苷酸可舉MA、RM等，DM或RNA為佳。多核苷酸的鹼基序列可根據對HLA-A*0206陽性者有免疫原性的WT1蛋白質或WT1胜肽的胺基酸序列而決定。該多核苷酸可以例如公知的DNA或RNA合成法、PCR法等而製造。此方式之含有編碼WT1蛋白質或WT1胜肽的DNA之 HLA_A*0206陽性者用癌疫苗組成物，也是本發明之一。訂工〇蛋白質與WT1胜肽，是以WT1胜肽為佳；WTlm胜肽或訂1126 胜狀或其修飾胜狀為較佳，而以WTI187胜肤或WTlm胜肽為最佳。上述要將DNA插入的表現載體則沒有特別的限制。又’ RNA則不需插入於載體，可將其直接做為組成物的有效成分使用。本發明的癌疫苗組成物可含有佐劑。作為佐劑，在將成為抗原的WT1蛋白質或WT1胜肽給藥時，與其一起，或與WT1蛋白質或WT1胜肽分開另行給藥，只要為能非特異性地提高對該抗原的免疫應答的物質，則無限定。佐劑可 22 320827 200930402

，-舉例如沉降性佐劑或油性佐劑。沉降性佐劑可舉例如氫氧化鈉、氫氧化鋁、磷酸鈣、磷酸鋁、明礬（alum)、HEpES 或羧乙烯聚合物等。油性佐劑以油會將抗原水溶液包起來形成微胞（micelle)者為佳，例如具體而言有液態石臘 (liquid paraffin)、羊毛脂、弗氏佐劑（Freund，s adjuvant)、montanide ISA763AVG、montanide ISA51、不完全弗氏佐劑或完全弗氏佐劑等。佐劑可混合2種以上使用。以油性佐劑為佳。 ❹ 本發明的癌疫苗組成物的佐劑調配量，只要能非特異性地提高對抗原的免疫應答的量即可，並無特別限制，依佐劑的種類等而適宜選擇即可。本發明的癌疫苗組成物可以經口給藥、或非經口給藥例如腹腔内給藥、皮下給藥、皮内給藥、肌肉内給藥、靜脈内給藥、鼻腔内給藥等而給藥。又，非經口給藥也可舉將疫苗組成物塗敷於皮膚，或將含有疫苗組成物之貼附劑 ❹貼附於皮膚，使有效成分的WT1蛋白質或WT1胜肽經皮吸收的給藥方法。又’本發明的疫苗組成物也可經由吸入等給藥。以非經口給藥為佳。較佳的是經由皮内給藥，或以皮下給藥而給藥。皮内給藥、皮下給藥的身體部位，則例如以上腕等為佳。本發明的癌疫苗組成物根據給藥路徑而可有種種的製劑形態，例如可成為固形製劑、液狀製劑等。例如可製成用於經口給藥的内服用固形劑或内服用液劑，或用於非經口給藥的注射劑等。 320827 23 200930402 用於經Q給藥的 Ο Ο 囊劑、散劑、顆粒劑〃、用固形劑，可舉錠劑、丸劑、膠 WT1胜肽可以其原狀，/内服用固形劑中’ wti蛋白質或粒法、流動層造粒法’、或與添加劑混合或造粒（例如攪拌造法等），以常=劊！、乾式造粒法、轉動攪拌流動層造粒則以打錠劑等而可製i膠囊劑，則以膠囊填充等；錠劑，上。添加劑可舉例如二添加劑可適宜調配1種或2種以維素、玉“粉等_、甘露糖醇、葡萄糖、微結晶纖偏石夕酸域等結合㈣基纖維素、聚⑽轉酮、 _等崩_ 粉等分散劑；纖維素二乙醇溶解輔助劑；安定Τ ^等潤滑劑；麩胺酸、天冬門酸等曱基纖維素等纖維;^素、甲基纖維素、、〒、顯，聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、聚乙 , 回刀子類等水溶性高分子；白糖、粉糖、藏糖、 =、心糖、乳糖、還原麥芽祕、粉末還原麥芽糖餘、葡萄糖果糖液糖、果糖葡萄糖液糖、蜂蜜、山梨醇、麥芽糖醇、甘露醇、木糖醇、丁四醇、阿斯巴甜（aspartame)、糖精、糖精納等甘味劑等。顆粒劑或鍵劑，視需要也可以包裹劑包裹’又該包裹劑也可以是2層以上。包裹劑有例如白糖、明膠、羥丙基纖維、教丙基甲基纖維素醜二甲酸酯等。製造膠囊劑時，則適宜選擇上述賦形劑，與普侖司特水合物（pranlUkaSt hydrate)混合均勻為粒狀，或做成粒狀後，以適當的包裹劑施加劑皮後，裝填於膠囊中，或在適當的膠囊底劑（明膠等）中添加甘油或山梨醇等增加塑性的膠囊底劑，以此包裹 320827 24 200930402 成形也可以。這祕囊底#1視需要可添加著色劑或 (二—氧化硫；對絲安息酸甲S旨、對絲安息酸乙s旨、對2 =息酸丙酯等對安息酸酯類)等。膠囊劑包含硬膠囊及‘ 〇〇用於經口給藥的内服用液劑，可舉水劑、懸液劑 d漿劑、乾裝劑等使用時溶解型製劑、酡劑等: :服液射’ WT1蛋白質或WT1胜肽，是以内服用液二般所用的稀釋劑溶解、_或乳化。稀關可舉例如精勢水^醇或其混液等。χ ’這個液劑也可以含有濕潤劑: =浮匕”]乳化劑、甘味劑、風味劑、芳香劑、保存緩衝劑等。又乾漿劑可舉例與普佘司特水合物及例如ς 糖粕糖、蔗糖、果糖、葡萄糖或乳糖等混合等而製又，乾漿劑也可依常法製成顆粒。。 Λ用於非經口給藥的劑型可舉注射劑、軟膏劑、凝膠劑、礼霜劑、_劑、喷霧劑、喷撒劑等，但以例如WT1蛋白哲屮WT1 BlL 月』与為佳。或胜肽與慣用的載體—起做為注射劑㈣二於麵口給藥的注射劑，可以是水性注射劑或油性、、主 =的種。做為水性注射劑時，可以公知的方法如眭/令媒（>主射用水、精製水等）經適宜加的添加劑的、、六、产山闽十工谷許器等過遽而滅f混合WT1蛋白質或WT1胜肽後，以過攄哞ΜΑ*",囷，繼而填充於無菌性容器而調製。醫藥上衮 =加劑:舉例如上述的佐劑;氣化納、氣化钟、二山4醇、硼酸、硼砂、葡萄糖、丙二醇等的等滲透 320827 25 200930402 ， - 壓劑；磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、硼酸緩衝液、碳酸缓衝液、檸檬酸媛衝液、TRIS缓衝液、麩胺酸緩衝液、ε _胺基已酸緩衝液等缓衝劑；對羥基安息酸甲酯、對羥基安息酸乙g旨、對教基安息酸丙醋、對經基安息酸丁醋、氯丁醇、节醇、氯化苯二甲煙銨（chlorobenzalkonium)、去水醋酸納、乙二胺四乙酸鈉（sodium edetate)、棚酸、硼砂等保存劑；經乙其纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇等增黏劑；亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、檸檬酸納、抗壞 0 血酸、二丁基經基甲苯等安定化劑；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、 6酸等pH調整劑等。又，注射劑也可以再調配適當的溶解輔助劑，例如乙醇等醇類；丙二醇、聚乙二醇等多元醇；聚山梨醇酯80、聚氧伸乙基硬化蓖麻油5〇、水解印構脂 (lysolecithin)、普路蘭尼克多元醇（Plur〇nicp〇ly〇ls)等井離子界面活性劑等。又，也可以含有例如牛血清白蛋白、匙孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin)等蛋白質；胺基聚葡糖（aminodextran)等多醣類等。做為油性注射劑時， P 町用胡麻油或大豆油，溶解辅助劑則可配合安息酸苄酯或苄醇等。經調製的注射液通常填充於適當的安瓿（amp〇ule)或小瓶（vial)。注射劑等液狀製劑也可冷凍保存或經由冷凍乾燁等除去水分而保存。冷凍乾燥製劑在使用時加入注射用蒸顧水等，再溶解後使用。又，本發明的癌疫苗組成物之其他形態，也可在微脂雜（liposome)中混合WT1蛋白質或WT1胜肽，再視需要而 β含有多糖及/或在癌疫苗組成物中調配的其他成分。 320827 26 200930402 - 本發明的癌疫苗組成物的給藥量，會因所使用的WTl 蛋白質或WT1胜肽，或患者的年齡體重，對象病症等而有不同’例如含有WTim胜肽或m126胜肽等wti胜肽的疫苗組成物時，WT1胜肽量以每日體重約0. 1 # g至img/kg為佳。又WT1胜肽的給藥量通常為〇. 〇〇〇lmg至i〇〇〇mg，而以0. Olmg至lOOOmg為佳，較佳的是〇. lmg至i〇mg，將此量在數日至數個月中給藥1次為佳》 ❺ 本發明的癌疫苗組成物，是HLA-A*0206陽性者用的癌疫苗組成物。用於選擇HLA-A*0206陽性者的HLA型，例如可由供血者的週邊血液決定。決定HLA型的方法可舉 SBT(Sequencing Based Typing)法或 SSP 法等 DNA 分型法 (DNA Typing)或HLA分型法等公知方法。SBT法是以pcR 法將ΜΑ擴增（amplify)，將擴增產物的鹼基序列，與既有的對偶基因（allele)的鹼基序列資訊對照，可精密地判定 HLA基因型。SSP法，是以HLA對偶基因特異性的多種引子〇 (primer)進行PCR後，進行電泳，由陽性條帶（p〇sitive band)的確認而可判定HLA基因型。將本發明的癌疫苗組成物給藥至HLA-a*0206陽性者，則該疫苗組成物所含的有HLA_A*〇2〇6限制性的WTi蛋白質或WT1胜肽，或由DNA4RNA所表現的wn蛋白質或訂1胜肽，與HLA肩挪陽性者的抗原呈現細胞（樹狀細胞）表面的HLA-A*0206分子結合^此，特異性抗腫瘤免疫，即wti特異性CTLs，受到誘導這種wn特異性ctLs 使對象（HLA-A*0206陽性者）中的癌細胞受到傷害。這種抗 320827 27 200930402 ’ ·腫瘤免疫，可由例如WT1特異性CTL反應，對癌細胞的細胞傷害性試驗（例如51Cr遊離細胞傷害性試驗）等得到確認。例如以HLA-A*0201限制性引發WT1特異性CTL反應之先前已報導之由9個胺基酸所成的源自WT1蛋白質之WT1187 胜肽及WTlm胜肽，可引發HLA-A*0206限制性反應。約π% 的日本人為JJLA-A*0206限制性，其限制性也幾乎與 HLA-A*0201限制性同樣地多。在下面的實施例丄至5中， ❹ WTlm特異性CTLs是由3位不同HLA-A*0206陽性供血者的 PBMCs生成的。所誘導的CTLs* wti表現HLA_A*〇2〇6陽性白血病細胞顯示細胞傷害活性。又，因為WTh87胜肽特異性CTL活性及WTlm胜肽特異性CTL活性，可經由抗HLA class I抗體使其受到抑制，因此可確認其活性是由於hla class I限制性CTLs所致。wti187胜肽及//或mm胜肽，或含有其修飾胜肽的WT1蛋白質或WT1胜肽，與HLA-A*0201 同樣地，可以成為HLA-A*0206陽性患者的疫苗。由於此，〇對於造血器官腫瘤、實體癌等惡性腫瘤患者之以WT1蛋白質或WT1胜肽為基礎的免疫療法，可以將其應用擴及 HLA A*G2G6 1%性患者。將本發明的癌疫苗組成物給藥至 HLA-A*祕陽性者之HLA—A_6陽性者的癌治療及/或預防法，是本發明的理想的實施態樣之一。本發明的癌疫苗組成物可使用於在HLA-A*0206陽性者伴隨有WTl基因的表現程度上升的癌，例如，白血病、骨，發育不良症候群、多發性骨聽瘤、惡性淋巴腫等造血二B腫瘤’月癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、 28 320827 200930402 -皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等實體癌的治療及/或預防。又，本發明的癌疫苗組成物的給藥方法，也可舉由 HLA-A*0206陽性患者的末梢血收集pMCs，由其中取出樹狀細胞，經以本發明的癌疫苗組成物所含有之作為有效成分的胜肽，例如WTlm胜肽或WTlm胜肽、或DM或RM等多核苷酸’脈衝（pulse)至患者以皮下給藥等.而回送至患者 ❹的方法。對樹狀細胞脈衝WT1胜肽等的條件，只要能顯現本發明的效果並無特別限定，可採用通常的條件、編碼WT1蛋白質或WT1胜肽的RNA使用於癌疫苗組成物時，以該RNA能被導入至iiLA-A* 0206陽性患者的樹狀細胞的方式給藥組成物為佳。將RNA導入至HLA_A*〇2〇6陽性者的樹狀細胞的方法，可舉如上述由HLA_A*〇2〇6陽性者採取樹狀細胞，對該樹狀細胞以電脈衝（electric pulse) 將RNA導入的方法。由導入至樹狀細胞的rma表現的ψτΐ ❹蛋白質或WT1胜肽，由於呈現於該樹狀細胞表面，因此將經脈衝RNA的樹狀細胞回送至HLA-A*0206陽性者體内’可迅速在生體内產生癌免疫。這種將編碼WT1蛋白質或fTl 胜肽的RNA導入至HLA-A*0206陽性者的樹狀細胞的癌的治療或預防方法，是本發明理想的實施態樣之一。本發明的另一個態樣是關於一種WT1特異性CTLs的誘導方法’係將源自HLA-A*0206陽性者的週邊血液單核球，在WT1蛋白質或WT1胜肽的存在下培養，由該週邊血液單核球誘導WT1特異性CTLs。週邊血液單核球的來源對象， 320827 29 200930402 • 只要是HLA-A*0206.陽性即可’並無特別限制。wti蛋白質或WT1胜肽，可舉TOm胜肽或WT1!26胜肽或其修飾胜肽，而以WT1 is7胜肽或WT1 m胜肽為合適。例如將源自 HLA-A*0206陽性者的週邊血液單核球，在訂1187胜肽（或 WT1 m胜狀）的存在下培養_ ’可由週邊血液單核球中的ctls 前驅細胞誘導WT1特異性CTLs。源自HLA-A*0206陽性者的週邊血液單核球的培養條件沒有特別限制，可在通常的條件下培養。如此得到的CTLs辨認WTlm胜肽（或WTli26 ® 胜肽）與HLA-A*0206分子的複合體。因此，使用本發明誘導的WT1特異性CTLs，在HLA-A*0206陽性者中可特異性地傷害WT1高表現腫瘤細胞，可治療及/或預防為其對象之HLA-A*0206陽性者的造血器官腫瘤、實體癌。將WT1特異性CTLs給藥至HLA-A*0206陽性對象者的方法並無特別限制，例如可與上述癌疫苗組成物同樣的方法給藥。本發明的另一態樣是有關用於誘導WT1特異性CTLs的〇套組（kit)，係包含HLA-A*0206限制性WT1蛋白質或WT1 胜肤為必需構成成分。理想的是，該套組使用於上述源自 HLA-A*0206陽性者的WT1特異性CTLs的誘導方法。這種套組除了 HLA-A*0206限制性WT1蛋白質或WT1胜肽之外，也可以含有例如週邊血液單核球的取得手段、佐劑、反應容器等。使用這種套組，則可將辨認WTlm胜肽或WT.l126 胜肽等癌抗原與HLA-A*0206分子的複合體之訂1特異性 CTLs有效率地誘導。. 本發明的再另一態樣是關於一種呈現WT1蛋白質或 30 320827 200930402 -wti胜肽的樹狀細胞的誘導方法，係將源自HLA_A*0206陽性者的未成熟樹狀細胞，在WT1蛋白質或WT1胜肽的存在下培養，由該未成熟樹狀細胞誘導呈現WT1蛋白質或WT1 胜肽的樹狀細胞。WT1蛋白質或WT1胜肽可舉WTlm胜肽或 WTlm.胜肽或其修飾胜肽，而以WTlm胜肽或WTli26胜肽為合適。未成熟樹狀細胞的來源對象，只要為HLA_A*〇2〇6陽性者即可’沒有特別限制。未成熟樹狀細胞是含在例如週〇邊血液單核球等中’因此也可以將這種細胞在WT1187胜肽或WTli26胜肽的存在下培養。如此所得的樹狀細胞給藥至 HLA-A*0206陽性者，有效率地誘導上述wti特異性cTLs，由此可治療及/或預防對象的造血器官腫瘤、實體癌。將樹狀細胞對HLA-A*0206陽性對象者給藥方法並無特別限制，例如可與上述癌疫苗組成物同樣的方法給藥。本發明的再另一態樣是有關一種套組，係用於誘導呈現WT1蛋白質或WT1胜肽的樹狀細胞，係包含hlA-A*0206 〇限制性WT1蛋白質或WT1胜肽為必需構成成分。理想的是將該套組使用於上述樹狀細胞的誘導方法。這種套組除 HLA-A*0206限制性WT1蛋白質或WT1胜肽之外，也可以含有例如未成熟樹狀細胞或週邊血液單核球的取得手段、佐劑、反應容器等。使用這種套組，則可經由HLA-A木0206分子將呈現WT1蛋白質或WT1胜肽之樹狀細胞有效率地誘導。使用（1)WT1蛋白質或WT1胜肽，經由上述方法誘導的 WT1特異性CTLs ’或經由上述方法誘導的樹狀細胞，或使用（2)對抗WT1蛋白質或WT1胜肽、經由上述方法誘導的 31 320827 200930402 • WT1特異性CTLs、或經由上述方法誘導的樹狀細胞的抗體，可診斷HLA-A*0206陽性者的癌。這種癌的診斷方法也是本發明之一。在（1)中’以使用經由上述誘導方法講導的 WT1特異性CTLs進行診斷為佳。WT1蛋白質或WT1胜肽可舉WTlm胜肽或WTl·26胜肽或其修飾胜肽，而以wTlis7胜肽或WTll26胜狀_為合適。本發明的HLA-A*0206陽性者的癌的診斷方法，可舉例如下述方法’包含：檢測或定量源自HLA-A*0206陽性者的樣品中’ WT1蛋白質或WT1胜肽、其抗體、或WT1特異性 CTLs的步驟；及其次將該蛋白質或其部分胜肽、其抗體、或WT1特異性CTLs的量’與癌未發症的情況相比較的步驟。源自癌發症的患者的樣品（例如血液）中，含有由癌細胞流出的WT1胜肽及/或WT1蛋白質，並由於對抗癌抗原的免疫應答提高，所以對抗該WT1胜肽或WT1蛋白質的抗體、WT1特異性CTLs等的量增加。因此，與癌未發症的情 Ο 況相比較’該樣品中的訂1胜肽或WT1蛋白質、其抗體或 WT1特異性CTLs的量增加時，則有癌發症的可能性。抗體量可用例如ELISA法測定。WT1特異性CTLs可用下述的使用MHC四聚體等WT1多聚體的方法檢測。又例如，將上述CTLs、樹狀細胞或抗體，與源自 HLA-A*0206陽性對象的樣品培育，或對hla_a*〇2〇6陽性對象給藥’，而可決定該CTLs、樹狀細胞或抗體之例如位置、部位、里等’而做癌的診斷。由於CTLs及樹狀細胞有 t集於癌細胞的性質，因此在GTLs或樹狀細胞給藥後調查 32 320827 200930402 - 該CTLs或樹狀細胞的位置或部位，而可以做癌的診斷。包含將經由上述方法誘導的WT1特異性CTLs或經由上述方法誘導的樹狀細胞給藥至HLA-A*0206陽性對象的步驟，及其次之決定HLA-A*0206陽性對象中該CTLs或樹狀細胞的位置或部位的步驟之HLA-A*0206陽性者的癌診斷，也是本發明之一。又’例如將CTLs或樹狀細胞，與源自HLA-A*0206陽 ❹ 性對象的樣品培育反應後，繼而加入對該CTLs或樹狀細胞的抗體再培育，可由附在抗體的標識等，而檢測或定量與該抗體結合的癌細胞與CTLs的複合體、與該抗體結合的樹狀細胞等，而做癌的診斷。與癌未發症的情況相比較，與癌細胞與CTLs的複合體、與該抗體結合的樹狀細胞增加時，則有癌發症的可能性。上述CTLs、樹狀細胞或抗體，可以是經標識者。附上這種標識，可有效率地做診斷。源自HLA-A*0206陽性對象的樣品可舉尿、血液、組織抽出 Ο 液、唾液、淚液、其他體液等之由HLA-A*0206陽性對象採取的生體樣品’而以血液為佳。使用上述WT1蛋白質或WT1胜肽之人類白血球型抗原 (HLA)-A*0206陽性者用的癌的診斷法，可舉例如用訂丨胜肽為抗原之MHC四聚體分析、MHC五聚體分析、MHC右旋體 (deXtramer)等。例如使用WTlm胜肽或WTlm胜肽做為抗原胜肽之MHC四聚體分析或MHC五聚體分析中，以 MHC/WT1 m胜肽複合體或MHC/WT1 m胜肽複合體做為探針 (probe)，可檢測人類白血球型抗原（HLA)_A*〇2〇6陽性者 33 320827 200930402 •的WT1特異性CTLs。由於癌發症的患者中，WT1特異性ctls 的表現頻率增高’所以可由WT1特異性(^。表現頻率，做人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者的癌的診斷。又，由於癌發症的患者中，對癌抗原的免疫應答增高，所以由調查人類白血球型抗原（HLA)_A)lc0206陽性者對WT1蛋白質或WT1胜肽的免疫應答，也可做癌的診斷。調查免疫應答的方法，可舉以ELISA測定對WT1蛋白質或WT1胜肽的抗 ❹ 體的方法。這種使用癌抑制基因WT1的基因產物之蛋白質或其部分胜肽的人類白血球型抗原（HLA)_A>k〇2〇6陽性者用的癌的#斷法，也是本發明之一。MHC四聚體分析、mhc五聚體分析，則可使用市售的套組，例如rWT1四聚體」（醫學生物學研究所），而以公知的方法進行。又’藉由下述方法，包含：將對抗WT1蛋白質或WT1 胜肽、經由上述方法誘導的訂1特異性CTLs、或經由上述方法誘導的樹狀細胞的抗體，與源自HLA_A)(c〇2〇6陽性對象 Ο 的樣品反應的步驟，及其次之檢測或定量該抗體與wti蛋白質或WT1胜肽、與WT1特異性CTLs或與樹狀細胞的複合體的步驟，也可以做HLA-A*0206陽性對象的癌的診斷。與癌未發症的情況相比較’抗體與WT1蛋白質或WT1胜肽、與WT1特異性CTLs或與樹狀細胞的複合體增加時，就有癌發症的可能性。對樹狀細胞的抗體，可舉辨認WT1胜肽/HLA-A*0206 複合體的抗體。這種抗體可辨認訂1胜肽及HLA-A*0206，因此在樹狀細胞的class !上有呈現Wti胜肽時，可以辨 34 320827 200930402 '· 認該樹狀細胞。又，辨認WT1胜肽/HLA-A*0206/CTRs的TCR(T細胞抗原受體）複合體的抗體，也可使用做為對樹狀細胞的抗體。這種抗體是可辨認樹狀細胞與CTLs的複合體及癌細胞與 CTLs的複合體的抗體。源自HLA-A*0206陽性對象的樣品與這種抗體培育反應而形成複合體，繼而由附在抗體的螢光等，檢測或定量與該抗體結合之癌細胞與CTLs的複合體、與該抗體結合之〇呈現WT1胜肽的樹狀細胞等，而可做癌的診斷。與癌未發症的情況相比較，與該抗體結合之癌細胞與CTLs的複合體、與該抗體結合之呈現WT1胜肽的樹狀細胞有增加時，有癌發症的可能性。將含有WT1蛋白質或WT1胜肽的組成物，給藥至 HLA-A*0206陽性者的癌的治療或預防法，也是本發明之一。含有WT1蛋白質或f τι胜肽的組成物及其較佳態樣， ◎ 是與上述的癌疫苗組成物一樣。 ' 用於HLA_A*〇2〇6陽性者的癌的治療或預防的WT1蛋白質或WT1胜肽；及用於製造HLA_A*0206陽性者的癌的治療或預防的癌疫苗組成物之WT1蛋白質或WT1胜肽的使用，也疋本發明之一。WT1蛋白質或WT1胜肽以及其較佳態樣，是與上述癌疫苗組成物一樣。一種HLA-A*0201陽性者用癌疫苗組成物，含有癌抑制基因wti的基因產物的蛋白質的部分胜肽之WTh87胜肽（序列編號2)或WTlm胜肽（序列編號3)的修飾胜肽，且對 320827 35 200930402 • HLA-A>|i〇2〇6陽性者有免疫原性的胜肽，也是本發明之一。

WTlm胜肽的修飾胜肽或WTlm胜肽的修飾胜肽，可舉在上述的WTlm胜肽或WTlm胜肽中，有1個或數個胺基酸欠缺、取代或附加的胜肽。WTlm胜肽的修飾胜肽，以N末端起第4至第8個胺基酸殘基，與WTlm胜肽的N末端起第4至第8個胺基酸殘基相同的胜肽為佳。這種修飾胜肽以上述序列編號4至12，序列編號15及16，序列編號18 ❹ 至20 ’以及序列編號22至25的胜肽為佳。又，訂lmP9L 胜肽（SLGEQQYSL ;序列編號53)也佳。WTlm胜肽的修飾胜肽，以N末端起第4至第8個胺基酸殘基，與訂1126胜肽的N末端起第4至第8個胺基酸殘基相同的胜肽為佳，例如上述序列編號27至37及序列編號39至52的胜肽為佳。又在本發明的另一種較佳態樣中，可分別使用上述序列編號4至26及53至62的胜肽作為WTlm胜肽的修飾胜肽’序列編號27至52及序列編號63至75的胜肽作為WT1126 〇胜肽的修飾胜肽。序列編號4至.75的修飾胜肽中，除 WTlmPlD 胜肽、WTlmPlE 胜肽、WTlmPlH 胜肽、WTlmPlP 胜肽及WTlmP2Q胜肽，以及WTlmPlD胜肽、WTlmPlE胜肽、WTlmPlP胜肽、fTl126P2A胜肽、及WTlmPlD以外的胜肽為佳® 其中，WTli87胜肽的修飾胜肽以WT1187P1F胜肽、 WTlmP2M胜肽或WTlmP3M胜肽為佳，以wTlmPlF胜肽、 WTli87P2M胜肽為較佳。WTlm胜肽的修飾胜肽以WTll26p1F 胜肽、WT1 mP2L胜肽、WT1 mP3M胜肽或WT1126爾胜肽為佳， 320827 36 200930402 • 而以WTlmPlF胜肽或WTlmP2L胜肷較佳。對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的訂lm胜肽的修飾胜肽或WTlm胜肽的修飾胜肽的使用量，則與上述 HLA-A*0206陽性者用疫苗組成物中的WT1胜肽相同。又， HLA-A*0201 1¾•性者用癌疫苗組成物的其他成分及較佳態樣，則與上述HLA-A*0206陽性者用疫苗組成物相同。編碼上述對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的wn187胜 ❹ 肽的修飾胜肽或WTlm胜肽的修飾胜肽dm及RNA，也可做為HLA-A*0201陽性者用癌疫苗組成物的有效成分。這種 HLA-A*0201陽性者用癌疫苗組成物也是本發明之一。含有上述DNA或RNA的HLA-A*0201陽性者用癌疫苗組成物的其他成分及癌疫苗的較佳態樣，則與上述 HLA-A*0206陽性者用癌疫苗組成物所使用者相同。將源自HLA-A*0201陽性者的週邊血液單核球，於上述對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的WTlm胜肽的修飾胜肽〇或WTl126胜肽的修飾胜肽的存在下培養，可由該週邊血液單核球誘導WT1特異性的CTLs。這種WT1特異性的CTLs 的誘導方法也是本發明之一。較佳的HLA-A*0201陽性者有免疫原性的WTli87胜肽的修飾胜肽或WTlm胜肽的修飾胜肽，與上述HLA_A*〇2〇1陽性者用疫苗組成物所使用者相同。將源自HLA-A*G201陽性者的未成熟樹狀細胞，於上述對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的WTlm胜肽的修飾胜肽或WTlm胜肽的修飾胜肽的存在下培養，可由該未成熟樹 37 320827 200930402 狀細胞誘導呈現該修飾胜肽的樹狀細胞。這種呈現WTli87 胜肽的修飾胜肽或WTlrn胜肽的修飾胜肽的樹狀細胞的誘導方法也是本發明之一。較佳的修飾胜肽，是與上述 HLA-A*0201陽性者用癌疫苗組成物所使用者相同。使用自上述對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的WTli87 胜肽的修飾胜肽或WTlm胜肽的修飾胜肽、其抗體、該修飾胜肽所誘導的WT1特異性CTLs或該修飾胜肽所誘導之樹狀細胞，可做人類白血球型抗原HLA-A*0201陽性者的癌的 #斷。這種HLA-A*0201陽性者的癌的診斷方法也是本發明之一。HLA-A*0201陽性者的癌的診斷方法及其較佳態樣，是與上述HLA-A*0206陽性者用的的癌的診斷方法及其較佳態樣相同。又，這種HLA-A*0201陽性者用的癌的診斷方法，可舉使用對HLA-A^ZOl陽性者有免疫原性的WTli87胜肽的修飾胜肽或WTlm胜肽的修飾胜肽為抗原的MHC四聚體分析、〇 MHC五聚體分析、MHC右旋體等。較佳的修飾胜肽與上述 HLA-A*0201陽性者用癌疫苗組成物所使用者相同。使用自對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的WTlm胜肽的修飾胜肽或WTlm胜肽的修飾胜肽、該修飾胜肽誘導的 WT1特異性CTLs或該修飾胜肽所誘導之樹狀細胞的抗體，可做人類白血球型抗原HLA_A*〇2〇1陽性者的癌的診斷。這種HU A*0201陽性者的癌的診斷方法也是本發明之一。較佳的修飾胜肽與上述HLA一A*〇2〇1陽性者用癌免疫組成物所使用者相同。HLA-A*G2G1陽性者的癌的診斷方法及其較 320827 38 200930402 ’-佳態樣’與上述HLA-A*0206陽性者用的癌的診斷方法及其較佳態樣相同。將含有下列胜肽的癌疫苗組成物給藥至HLA-A*0201 陽性者的癌的治療或預防法也是本發明之一。癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質·的部分胜肽的 WTlm胜肽（序列編號2)或WTlm胜肽（序列編號3)的修飾胜肽’且對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的胜肽。較佳的修飾胜肽，與上述HLA-A*0201陽性者用癌疫苗〇組成物相同。又，癌疫苗組成物及其較佳態樣，與上述 HLA-A*0201陽性者用疫苗組成物相同。本發明又關於下列胜肽的使用，係用於HLA-α木0201陽性者的癌的治療或預防；及下列胜肽之使用，係用於製造 HLA-A*0201陽性者的癌的治療或預防用的癌疫苗組成物的使用。癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質的部分胜肽的 O WTll8?胜肽（序列編號2)或WTlm胜肽（序列編號3)的修飾胜肽’且對HLA-A*0201陽性者有免疫原性的胜肽。較佳的修飾胜肽，與上述HLA-A*0201陽性者用癌疫苗組成物所使用者相同。又，癌疫苗組成物及其較佳態樣，與上述HLA-A*0201陽性者用疫苗組成物所使用者相同。 [實施例] 其次以實施例詳細說明本發明，但本發明並不限定於下列實施例。又，在實施例中的縮寫字有下列的意思。又合成胜肽是由SIGMA GENOSYS JAPAN購入。 320827 39 200930402 .· DCs :樹狀細胞 PBMCs :週邊血液單核球 CD · Cluster of Differentiation(白血球分化抗原） GM-CSF :顆粒單核球群落生長因子 IL.介白素（interieukin) TNFa ♦踵瘤壞死因子（tumer necrosis fact〇r-a) PGE .則列腺素（prostagiandin)

Gy:戈雷（gray) ® B-LCLS : 淋巴母細胞株 EB 病毒：依波病毒（EpStein Barr Virus) tBu ··三級丁基 Trt :三苯甲基

Fmoc . 9-第甲氧基幾基（9-Fluorenylmethoxy Carbonyl) 實施例1(與WT1胜肽結合之HLA分子的預測）用NetMHC2.0伺服預測程式’進行與wTlm胜肽（序列 Q 編號2)結合之HLA分子的預測。結果，有引發具HLA-A*0201限制性之WT1胜肽特異性 CTLs的能力的WTli87胜肽，在NetMHC2. 0伺服預測程式 (http://www. cbs. dtu, dk/services/NptMHr.-9 〇/)中，位於顯示對HLA-A*0206分子有高結合親和性的位置。實施例2(由HLA-A*0206陽性健康供血者的pBMCs製作 WTlm胜肽特異性CTLs，及使用其細胞傷害性試驗） (1)由HLA-A*0206陽性健康供血者的PBMCs的分離及DCs 的製作 320827 40 200930402 首先’由HLA-A*0206陽性健康供血者（3人）的週邊血液，以Ficol卜Hypaque密度梯度離心法分離pMCs。繼而以抗人類 CD14 粒子-DM(Becton，Dickinson and Company 製），由HLA-A*0206陽性健康供血者的PBMCs選出CD14陽性細胞。此時，認為CD14陽性細胞多數在單核球中。所選出的CD14陽性細胞以含lv/v%人類AB血清、800IU/ml的 GM-CSF(Pepro Tech. Inc·，Rokey Hill, NJ 製）、及 lOOOIU/ml 的 IL-4(Pepro Tech. Inc.製）X-VIV015 培養基 (BioWhittaker，Walkersville，MD 製）培養而製作 DCs。 (2)自體成熟DCs的誘導在（1)製成的DCs在37°C培養1日後，將含10ng/ml的 TNF a (tumor necrosis factor α ; Pepro Tech. Inc., Rokey

Hill, NJ)、10ng/ml 的 IL-/3、1000IU/ml 的 IL-6 及 1/zg/ml 的PGE2的成熟細胞介素混合物（cytokine cocktail)加入於 DCs培養孔。在37°C培養24小時，得到自體成熟的DCs。〇 (3)m187胜肽特異性CTLs的誘導在自體成熟DCs脈衝WTlm胜肽後，照射放射線 (30Gy)’與由HLA-A*0206陽性健康供血者得到的CD8陽性 T細胞濃縮PBMCs —起培養。以WTlm胜肽之DCs脈衝，係與10/z g/ml的WTlm胜肽一起，將DCs在37°C培養30分鐘而進行。CD8陽性T細胞，是由HLA-A*0206陽性健康供血者的PBMCs使用CD8微珠（CDs microbeads)及MS管柱 (Miltenyi Biotec GmbH 製）濃縮。由第2次的刺激起，將經胜肽脈衝後經放射放射線的 41 320827 200930402 自體成熟PBMCs，使用做為選擇性刺激細胞。第2次刺激的2日後，將重組rIL-2(鹽野義製藥股份公司提供）與 IL-7(Pepro Tech. Inc.製）分別以 l〇lu/ml 與 l〇ng/mi 的 5辰度添加於培養液。在第4次刺激後，在37¾培養10曰所付細胞（CTLs)以離心機離心而回收。使用這個細胞 (CTLs)，以51Cr遊離細胞傷害性試驗，調查對巨標細胞的細胞傷害活性。 (4)細胞傷害性試驗細胞傷告性試驗’是以51Cr遊離細胞傷害性試驗實施。51Cr遊離細胞傷害性試驗是以下面方式進行。首先，將目標細胞（lxl〇7個/ml)與1〇〇/z i的51(：Γ(比活性lmCi/ml) 一起，在RPMI1640(曰本製藥公司製）+1〇%胎牛血清培養基中，在37 C培養1. 5小時，將目標細胞以wCr標識。繼而將經Cr標識的目標細胞，加入於含有不同濃度的在（3) 所付的CTLs(100#l的分析_培養基中懸浮者）的孔⑽底的 96孔板）’混合，在37 C培養4小時^ CTLs與目標細胞，設CTLs為「E」，經51Cr標識的目標細胞為「τ」，則以成為 Ε/Τ(細胞數Μ :、5 :〗、20 :丨或25 :丨的方式混合。培養後，由各孔收集100“丨的上澄液。測定由標識細胞遊離及放出的Cr，算出51Cr的特異性溶解（％)。特異性溶解（％) 是以下列方法算出。【數1】特異性溶解（％)= _1_电測試樣品竺量-自然放出量） (最大放出量-自然放出量）x100 320827 42 200930402 上式中，自然放出量是指只有目標細胞的培養上澄液的螢光發光量，最大放出量是指以1質量％TritonX-100 處理而完全溶解目標細胞的培養液的螢光發光量。目標細胞是使用下面所記載的B-LCLs、K562細胞、JY 細胞及KH88細胞。又，KH88細胞是與後述的實施例9所使用的KH880F8細胞相同。 B-LCLs是以EB病毒由HLA-A*0206陽性供血者所得的週邊血液B淋巴球的形質轉換而建立的，但不表現WT1。 ) K562細胞是由慢性骨髓性白血病母細胞危象(Chronic myeloid leukemiablast crisis)的患者建立，表現 WT1，但為HLA class I非表現細胞株。本發明者未能得到野生型WT1表現HLA-A*0206陽性白血病細胞株。因此，也使用了將HLA-A*0206基因導入於K562細胞經形質轉換而做出來的0206K562細胞。以HLA-A*0206基因形質轉換的 0206K562 細胞，是以使用抗 HLA-A2 抗體（cloneBB7. 2 ; BD _ Biosciences Pharmingen製）的FACS分析，確認在細胞表面表現HLA-A*0206分子。以WT1基因形質轉換的B-LCL細胞，是以西方墨點分析法（Western blot analysis)確認表現WT1。又，以空的載體做為經形質轉換的B-LCL細胞的對照。 JY細胞株是以WT1不表現HLA-A*0206陰性EB病毒轉換的B細胞株。 KH88是WT1表現HLA-A*0206陰性白血病細胞株。所有的細胞株，都以補充有1 Ov/v%的經加熱不活性化 43 320827 200930402 » • 的胎牛血清、50IU/ml的盤尼西林及50mg/mi的鍵徽素的 RPMI 1640培養液培養。 (5)抗體及流式細胞技術（f 1 〇w cytometry)解析抗人類 CD14、CD86、CD80、CD83、HLA-DR mAbs 是由

Becton Dickinson公司購入。DCs的濃度及成熟的確認，是使用上述列表的單株抗體（mAbs)的細胞的細胞表面抗原的分析實施。樣品是以使用Ce 11 Qest軟體的流式細胞儀 (FACS Calibur; Becton Dickinson 製）解析。 ❹（6)結果試驗WT1胜肽特異性CTLs是否可由HLA-A*0206的供血者的PBMCs做出。將由HLA-A*0206陽性健康供血者的 CD8陽性T細胞濃縮PBMCs，經WTlm胜肽特異性脈衝的自體DCs或以PBMCs反覆刺激而得到的CTLs，調查其WTlm 胜肽特異性細胞傷害活性。CTLs對經WTlm胜肽脈衝的自體B-LCL細胞’比未經WTli87胜肽脈衝的B-LCL細胞，顯 Q 示較強的細胞傷害活性（第1圖a)。在第1圖a中，縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激而得的CTLs (Effector:E)與目標細胞（Target:T)之比（E/T)。三角（▲) 表示經10/zg/ml的WTlm胜肽脈衝的細胞，四角（)表示未經WTlm胜肽脈衝的細胞。又，由不同二人的HlA-A*0206 陽性健康供血者分離的PBMCs同樣方式做出的CTLs，也確認與上述同樣的細胞傷害活性（第2圖a及b)。第2圖中，三角（▲)表示經10/zg/ml的WTlm胜肽脈衝的細胞，四角 (_)i示未經WT1187胜肽脈衝的細胞。這些結果表示，這 44 320827 200930402 * • 些細胞傷害活性是WTl m胜肽特異性的。並且’ CTLs的細胞傷害活性，是與對j)Cs或pbmCs脈衝的WTlm胜肽的濃度增高成平行地增加，在〇. 的濃度達穩定（plateace)(第1圖b)。特異性溶解的wTlm 胜肽的半數最大分解（half maximul lysis)濃度約為5x10-5 //g/ml。這表示CTLs的TCRs(T細胞抗原受體）對WTlm胜肽/HLA-A*0206複合體的親和性相對性的高。這個結果強列暗示由WTlm胜肽誘導的CTLs可辨認WTli87胜肽。其次，如上述使用經WTlm胜肽脈衝的DCs或PBMCs，刺激由HLA-A*0206陽性供血者的CD8陽性T細胞濃縮 PBMCs而製作的CTLs ’調查其對内在性表現WT1的各種目標細胞的細胞傷害活性。其結果示於第3圖a及b。第3 圖a及b所示對各目標細胞的細胞傷害活性是同時測定的。第3圖a顯示對於以WT1形質轉換的B-LCLs(WTl表現， HLA-A*0206陽性；▲)或以空載體形質轉換的b_lcLs(WT1 〇不表現，HLA-A*0206陽性；)之WTlm胜肽特異性CTL^ 的細胞傷害活性。第3圖b顯示對0206K562細胞（表現 WTl，HLA-A*0206 陽性；)、K562 細胞（表現 WT1， HLA-A*0206 陰性；□)、KH88 細胞（表現 WTl，HLA-A*0206 陰性；·）及JY細胞（非表現WTl，HLA-A*0206陰性；▲) 之WTlm胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性。 CTLs對於以WTlm胜肽形質轉換過的B-LCL(WT1非表現HLA-A*0206陽性）比以空白載體形質轉換的B-lcL(WT1 表現HLA-A*0206陽性）顯示較強的細胞傷害活性（第3圖 45 320827 200930402 a)。又，如第3圖b所示，該CTLs對以HLA-A*0206形質轉換的0206K562細胞（WT1表現HLA-A*0206陽性）比鮮 K562 細胞（WT1 表現 HLA-A*0206 陰性）、KH88(WT1 表現 HLA-A*0206陰性）、或JY〇m非表現HLA-A*0206陽性）顯示更強的細胞傷害活性。換言之，CTLs對WT1表現 HLA-A*0206陽性目標白血病細胞顯示顯著的細胞傷害活性’但對WT1不表現及/或HLA-A*0206陰性細胞則不顯示細胞傷害活性。這個結果顯示，在活體外作成的對wti 187 > 胜肽特異性的CTLs，對包含具HLA-A*0206限制性的白血病在内之表現WT1的腫瘤細胞，顯示細胞傷害活性。第3 圖b所示的結果，強列暗示由WTlm胜肽特異性的CTLsm 帶來的細胞傷害活性，受到HLA_A Class丨限制。這是由於觀察到，對0206K562細胞比K562細胞有較強的細胞傷害活性之故。證明前述培養細胞（CTLs)為WTh87胜由以上的事實 Q 肽特異性CTLs。異，但都可以再現的。又’圖所示的結果是典型的數據，且基本上多少有變

在實施例2所得的訂胜肽特異

320827 46 200930402 • 其結果示於第4圖。第4圖中的a是以B-LCLs(WTh87 不表現HLA-A*0206陽性）為目標細胞，在對HLA class I 的 mAb(抗-HLA class I 瓜Ab)及對 HLA class II 的 mAb(抗 -HLA class II mAb)不存在下做試驗的結果。b是經WTli87 胜肽脈衝的B-LCLs(WTlm表現HLA-A*0206陽性）為目標細胞’在抗-HLA cl ass I mAb 不存在且對抗-{{LA cl ass 11 mAb ❹ 〇存在下做試驗的結果。c是經WTlm胜肽脈衝的{JLA-A*0206 陽性為目標細胞’在抗-HLA class I mAb存在下且抗-HLA. class II mAb不存在下做試驗的結果。d是經wt1187胜肽脈衝的HLA-A*0206陽性為目標細胞，在抗_hla class丨mAb 及抗-HLA class II mAb不存在下做試驗的結果。由第4圖可知WTW胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性，非由抗HLA class 11抗體的添加，而是 I抗體的添加而完全被抑制。WTli87胜肽特異性心的細胞傷害活性，顧示如預料為Hu class 1限制性。實施例4(對腫瘤細胞的細胞傷害性試驗）使用在實施例2所得的WTli87胜肽特異性ctLs，在活二細胞傷害性試驗是使用實施例2所記載的Cr遊離、讀傷害性試驗而實施。其結果，該訂^胜 =特f性心請表現腫瘤細胞顯示細胞傷害活性(圖未不）。的製作’及使用該CTLs 實施例5(WTlm胜肽特異性ctls 的細胞傷害性試驗） 320827 47 200930402 « •- 在實施例2(3)中，除了以WTlm胜肽（序列編號3)取代WTlm胜肽以外，以同樣的方法製成WT1!26胜肽特異性 CTLs。使用此CTLs，與實施例2同樣進行細胞傷害性試驗，測定WTlm胜肽特異性細胞傷害活性。第.5圖中顯示，由與第2圖b同一位HLA-A*0206陽性健康供血者的PBMCs誘導的WTlm胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性。第5圖中，三角印（▲)表示經10 # g/ml的WTlm胜肽脈衝的細胞，四角印（)表示未經以WTlm胜肽脈衝的細胞。CTLs對經以 WTl·26胜肽脈衝的自體B-LCL細胞，比未經以WTlm胜肽脈衝的B-LCL細胞，顯示更強的細胞傷害活性（第5圖）。這個結果顯示’CTLs的細胞傷害活性是WT1126胜肽特異性者。又，與實施例2同樣的方法，使用以經WT1126胜肽脈衝過的DCs或PBMCs刺激HLA-A*0206陽性供血者的CD8陽性T細胞濃縮PBMCs而製成CTLs，調查對内在性表現WT1 的各種目標細胞的細胞傷害活性。對各目標細胞的細胞傷 ❹ 害活性示於第6圖a及b。圖a及b中的目標細胞是， 0206K562 細胞（WT 表現 1，HLA-A*0206 陽性；_)，K562 細胞（WT1表現，HLA-A*0206陰性；□)，KH88細胞（WT1表現’ HLA-A*0206陰性；#)及JY細胞（WT1非表現， HLA-A*0206陰性；▲)。第6圖a顯示’由與第2圖a同一 HLA-A*0206陽性健康供血者的PBMCs誘導的WTlm胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖’第6圖b顯示，由與第2 圖b同一 HLA-A*0206陽性健康供血者的pBMCs誘導的 WTlI26胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖。 48 320827 200930402

Ο WTll2e胜肽特異性CTLs，與WTlm胜肽特異性CTLs同樣’對WT1表現hla-A*0206陽性目標白血病細胞顯示顯著的細胞傷害活性，對WT1非表現及/或HLA-A*0206陰性細胞則不顯不細胞傷害活性。此結果顯示，在活體外作成的 WTll2e胜肽特異性CTLs ’對包含具HLA-A氺0206限制性的白血病之内在性表現WT1的腫瘤細胞，顯示細胞傷害活性。第6圖a及b所示結果，強烈暗示wTlm胜肽特異性CTLs 所帶來的細胞傷害活性’受到HLA-A class I限制。這是由於觀察到對0206K562細胞，比對K562細胞有更強的= 胞傷害活性之故。 ' 由以上所述，證明這些CTLs為訂1⑵胜肽特異性CTLs。又，圖所示的結果是典型的數據，且基本上多少有變異，但都是可再現的。實施例6(疫苗組成物的調製）調製如下所列的疫苗組成物1至8。這些是本發明的癌疫苗組成物的一例。癌疫苗組成物1 WTlm 胜肽 3mg

Montanide ISA51 400mg 5%葡萄糖液 400mg 將上述成分混合，做為癌疫苗組成物1。癌疫苗組成物2 WTli87 胜肤 lmg

Montanide ISA51 400mg ΛΟ 320827 200930402 ‘ 5%葡葡糖液 400mg 將上述成分混合，做為癌疫苗組成物2。癌疫苗組成物3 WTlm 胜肽 O.OOlmg

Montanide ISA51 4〇Omg 5%葡萄糖液 400mg 將上述成分混合，做為癌疫苗姐成物3。癌疫苗組成物4 WTlm胜肤 Montanide ISA51 5%葡萄糖液將上述成分混合，癌疫苗組成物5至8 10mg 400mg 400mg 做為癌疫苗組成物4。在上述癌疫苗組成物1至4中，以WTlue胜肽取代WTll87 胜肽’而製造癌疫苗組成物5至8。 ❹ 實施例7(修飾胜肽對HLA-A*0206分子的親和性）對WTlm胜肽、FTli26胜肽及這些胜肽的n末端起第1 個、第2個、第3個或第9個的胺基酸殘基經置換的修飾胜肽，以NetMHC2_ 0伺服預測程式分析其對HLA-A*0206分子的親和性（affinity)。分別將WTlm胜肽的修飾胜肽的分析結果示於表1，WT1126胜肽的修飾胜肽的分析結果示於表· 2。親和性數值越小（可結合的胜狀濃度低），表示親和性越高。 50 320827 200930402 【表1】胜肽胺基酸序列序列編號預測分數親和性(nM) 結合程度 WT1187 SLGEQQYSV 2 0.776 11 強結合(SB) WTlmPlG GLGEQQYSY 4 0.756 13 SB WTIistPIA ALGEQQYSV 5 0.812 7 SB WTIistPIV VLGEQQYSV 6 0.755 14 SB WTIistPIL LLGEQQYSV 7 0.810 7 SB WTlrnPlI ILGEQQYSV 8 0.782 10 SB WTIistPIM MLGEQQYSV 9 0.877 3 SB WTlmPlW WLGEQQYSV 10 0.876 3 SB WTIistPIF FLGEQQYSV 11 0.926 2 SB WTlmPlY YLGEQQY SV 12 0.896 3 SB WT1187P2V SVGEQQYSV 13 0.722 20 SB WT1187P2Q SQGEQQYSV 14 0.824 6 SB WT1187P2I SIGEQQYSV 15 0.734 17 SB ¥Tli87P2M SMGEQQYSV 16 0.798 8 SB WT1187P3L SLLEQQYSV 17 0.865 4 SB WT1187P3A SLAEQQYSV 18 0.844 5 SB WT1187P3V SLVEQQYSV 19 0.869 4 SB WTli87P3M SLMEQQYSV 20 0.896 3 SB WT1is7P3P SLPEQQYSV 21 0. 791 9 SB WT1i8tP3W SLWEQQYSV 22 0.883 3 SB WTh87P3F SLFEQQYSV 23 0.864 4 SS WT1ib7P3Y SLYEQQYSV 24 0.857 4 SB WTli87P3S SLSEQQYSV 25 0.801 8 SB WT1i8tP3I SLI EQQYSV 26 0.880 3 SB WTli87P9L SLGEQQYSL 53 0.586 88 弱結合 51 320827 200930402 【表2】

胜肽胺基酸序列序列編號預測分數親和性（nM) 結合程度 WT1126 RMFPNAPYL 3 0. 83 6 SB WT1126P1G GMFPNA PYL 27 0.76 14 SB WTlrnPlA AMFPNAPYL 28 0. 80 8 SB WT1126P1V VMFPNAPYL 29 0. 75 15 SB WT1126P1L LMFPNAPYL 30 0, 80 8 SB WTlizePll IMFPNAPYL 31 0.77 11 SB WTlrnPlM MMFPNAPYL 32 0. 86 4 SB WT1126P1W WMFPNAPYL 33 0. 88 3 SB WTlrnPlF FMF PNAPYL 34 0.91 2 SB WT1126P1Y YMFPNAPYL 35 0.88 3 SB WT1126P2V RVFPNAPYL 36 0. 78 11 SB WT1126P2Q RQFPNAPYL 37 0. 85 4 SB WTlmP2A RAF PNAPYL 38 0. 67 35 SB WTli26P2L RLFPNAPYL 39 0. 80 8 SB WTli26P2I RIFPNAPYL 40 0. 78 10 SB WT1i2bP3I RMIPNAPYL 41 0. 84 5 SB WTli26P3L PMLPNAPYL 42 0.83 6 SB WTli26P3G RMGPNAPYL 43 0.71 23 SB WTli26P3A RMAPNAPYL 44 0.79 9 SB WTli26P3V RMVPNAPYL 45 0.82 6 SB WTli26P3M RMMPNAPYL 46 0.86 4 SB WTli26P3P RMPPNAPYL 47 0.72 21 SS WTli26P3W RMWPNAPYL 48 0.85 5 SB WTli26P9V RMFPNAPYV 49 0.91 2 SB WTli26P9A RMFPNAPYA 50 0.77 12 SB WTli26P9I RMFPNAPYI 51 0.81 7 SB WT1i2bP9M RMFPNAPYM 52 0.65 42 SB 52 320827 200930402 . 實施例8(修飾胜肽對HLA-A*0201分子的親和性）對WT1187胜肽、WTlm胜肽及這些胜肽的N末端起第1 個、第2個、第3個或第9個的胺基酸殘基經置換的修飾胜肽，以NetMHC2. 0伺服預測程式分析其對HLA-A木0201分子的親和性（affinity)。將WTli87胜肽的修傅胜肽的分析結果示於表3,將WTlm胜肽的修飾胜肽的分折結果示於表 4。親和性數值越小，表示親和性越高。〇 €> 53 320827 200930402 ’ · 【表3】

胜肽胺基酸序列序列編號預測分數親和性(nM) 結合程度 WT1187 SLGEQQYSV 2 0. 721 20 SB WTlmPlG GLGEQQYSV 4 0.672 34 SB WTIistPIA ALGEQQYSV 5 0. 648 44 SB WTIibtPIV VLGEQQYSV 6 0. 705 24 SB WTlrnPlL LLGEQQYSV 7 0. 658 40 SB WTIistPI I ILGEQQYSV 8 0.898 26 SB WTIistPIM MLGEQQYSV 9 0.717 21 SB WTIistPI W WLGEQQYSV 10 0.628 55 SB WTIistPIF FLGEQQYSV 11 0. 824 6 SB WTIibtPIY YLGEQQYSV 12 0.809 7 SB WT1i8tP2I SIGEQQYSV 15 0.556 121 SB WT1i8tP2M SMGEQQYSV 16 0.740 16 SB WT1is7P3A SLAEQQYSV 18 0.811 7 SB WT1is7P3V SLVEQQYSV 19 0.766 12 SB WT1is7P3M SLMEQQYSV 20 0. 876 3 SB WT1ib7P3W SLWEQQYSV 22 0.863 4 SB WT1is7P3F SLFEQQYSV 23 0.852 4 SB WTli87P3Y SLYEQQYSV 24 0. 854 4 SB WT1i8tP3S SLSEQQYSV 25 0.793 9 SB WTli87P9L SLGEQQYSL 53 0. 640 49 SB 54 320827 200930402

【表4】胜肽胺基酸序列序列編號預測分數親和性(nM) 結合程度 WTlmPlG GMFPNAPYL 27 0.80 9 SB WTlmPlA AMFPNAPYL 28 0.81 7 SB WTlmPlV VMFPNAPYL 29 0.81 8 SB WT1126P1L LMFPNAPYL 30 0.82 7 SB WT1126P1I IMFPNAPYL 31 0.81 8 SB WT1126P1M MMFPNAPYL 32 0. 85 4 SB WT1126P1W WMFPNAPYL 33 0.80 8 SB WTlmPlF FMFPNAPYL 34 0.91 2 SB WTlmPlY YMFPNAPYL 35 0. 90 2 SB WT1I26P2V RVFPNAPYL 36 0.55 127 SB WT1126P2Q RQFPNAPYL 37 0.49 262 SB WT1126P2L RLFPNAPYL 39 0.78 10 SB WTlmP2I RI FPNAPYL 40 0.64 48 SB WTli26P3I RMI PNAPYL 41 0. 74 16 SB WTli26P3L RMLPNAPYL 42 0. 78 10 SB WTli26P3G RMGPNAPYL 43 0.60 73 SB WTli26P3A RMAPNAPYL 44 0.73 17 SB WTli26P3V RMVPNAPYL 45 0. 68 31 SB WTli26P3M RMMPNAPYL 46 0.83 6 SB WTli26P3P RMPPNAPYL 47 0.61 66 SB WTli26P3W RMWPNAPYL 48 0. 83 6 SB WTli26P9V RMFPNAPYV 49 0.84 5 SB WTli26P9A RMFPNAPYA 50 0. 73 18 SB WTli26P9I RMFPNAPYI 51 0.79 9 SB WT1i2bP9M RMFPNAPYM 52 0.69 29 SB 55 320827 200930402 « ' 貫施例9(因WTli26修飾胜肽之HLA-A*0201限制性CTL誘導的比較） (1) 目的考慮實施例8的結果在内’WTli26修飾胜肽選擇WT1126P1F 胜肽（序列編號34)、WTli26P2L胜肽（序列編號39)、WTlmP3M 胜肽（序列編號46)及rrh26P9V胜肽（序列編號49)，篩選能誘導細胞傷害活性高的CTL的WTlm修飾胜肽為目的，而進行本實驗。又，在實施例9至12所用的試藥、培養基、〇實驗方法等，如無特別說明’與實施例1相同。在實施例 9至12中，如無特別說明，培養均在37°C進行。 (2) 材料及方法由表現HLA-A*0201分子的健康提供者（HLA-A*0201健康供血者）分離週邊血液單核球（PBMCs)，再以抗人類CD14 粒子-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)分離 CD14 陽性細胞。將本細胞以含有1 v/v%人類AB血清（1 % human AB Q serum)的 X-VIV015 培養基，添加 800IU/ml 的 GM-CSF 及 1000IU/ml的IL-4的培養液中，培養1日。對本培養物添加含有10ng/ml的TNFa、10ng/ml的 IL-石、1000IU/ml 的 IL-6 及 1/zg/ml 的 PGE2 的成熟細胞介素混合物（maturation cytokine cocktail)。再培養 1 曰後，獲得自體成熟DCs(mature DCs)。經在實施例13所得10/zg/ml的WTlm修飾胜肽 (WTlmPlF 胜肽、WT1126P2L 胜肽、WT1126P3M 胜肽或胜肽）脈衝的自體成熟DCs，在培養4小時後，照射放射線 56 320827 200930402 (35Gy) ’使用做為CTLs誘導的刺激細胞。在24孔盤的1個孔中，pBMCs(2xl05個/孔）做為應答細胞（responder) ’而與前述的DCs(2xl05個/孔）一起培養。1週後，以經胜肽脈衝的放射線照射（75Gy)T2細胞再刺激。再刺激3日後，添加20IU/ml的IL-2。經胜肽脈衝的放射線照射T2細胞同樣再刺激再反覆3次後，濃縮應答細胞中的CD8陽性細胞。將此CD8陽性T細胞，使用WTlm胜肽的HLA-A*0201 四聚體的流式細胞儀解析反應性以及檢討對各種目標細胞的細胞傷害活性。目標細胞是使用表5所示的K562細胞、0206K562細胞、JY細胞、KH880F8細胞、TF-1細胞及THP-1細胞。這些細胞的特徵示於表5。又，由HLA-A*0201陽性提供者的血液以EB病毒感染所建立的b淋巴母細胞（B-LCL)也做為目標細胞而使用。目標細胞 HLA-A*0201 HLA-A*0206 WT1 Κ562 陰性陰性表現 0206Κ562 陰性陽性表現 JY 陽性陰性非表現 KH880F8 陰性陰性表現 TF-1 陽性陰性表現 ΤΗΡ-1 陽性陰性表現 0 [ ^ 5]__Γ__________ 57 320827 200930402 « • · (3)結果將以各WT1126刺激的HLA_A*0201陽性的提供者1白勺 PBMCs，以 PE(Phycoerythrin)標識的 WTli26胜肽的 HLA-A*0201的四聚體（醫學生物研究所）及APC-Cy7 (Allophycocyanin-Cyanine-7)標識的抗 CD8 抗體染色，而以流式細胞儀解析的結果，示於第7圖。將PBMCs以上述四聚體及抗CD8抗體染色時，由修飾胜肽的刺激而誘導的 CTLs與該四聚體及抗CD8抗體結合，結果可檢測該四聚體 ® 的螢光及抗CD8抗體的螢光。在第7圖a至e中，分別為縱軸表示HLA-A*0201四聚體的螢光強度，橫軸為抗CD8抗體的螢光強度。在第7圖a至e中的四邊形所圍的範圍，是表示被誘導的、具有HLA-A*0201限制性的、可辨認WTlm 胜肽的CTLs的頻率（％)。第7圖a是將未以WTlm修飾胜肽刺激的PBMCs，以上述四聚體及抗CD8抗體染色者（背景）。第7圖b是將以WTlmPlF胜肽刺激的PBMCs染色而〇解析的結果。第7圖c是將以WTlmP2L胜肽刺激的PBMGs 染色而解析的結果。第7圖d是將以WT1126P3M胜肽刺激的 PBMCs染色而解析的結果。第7圖e是將以WTlmP9V胜肽刺激的PBMCs染色而解析的結果。以WTlmPlF胜肽刺激的PBMCs誘導的上述CTLs的頻率是0. 14%(第7圖b)，以WT1126P2L胜肽刺激的PBMCs誘導的上述CTLs的頻率是〇. 37%(第7圖c)，由這些胜肽誘導的CTLs是HLA四聚體陽性且CD8陽性，為可與WTlm胜肽的HLA-A*0201四聚體結合的CTLs。由此結果顯示，由 58 320827 200930402 * - PBMCs的WTlm修飾胜肽刺激，誘導出能辨認野生型胜肽 (WT1126修飾胜肽）的CTLs。測定提供者1的PBMCs以WTlmPlF胜肽刺數誘導的 CTLs之細胞傷害活性的結果示於第8圖。第8圖中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8 陽性T細胞（Effector, E)與目標細胞（Target, T)之比 (E/T比）。菱型（♦)表示以JY細胞做為目標細胞的情況，四角（_)表示以經WTlmPlF胜肽脈衝的JY細胞做為目標 ®細胞的情況。 JY細胞是HLA-A*0201陽性，且是Π1陰性，CTLs對經WTlmPlF胜肽脈衝的JY細胞，比未脈衝過的JY細胞，顯示較強的細胞傷害活性。由此結果顯示，用於刺激之胜肽特異性的HLA-A*0201限制性的CTLs受到誘導。測定提供者1的PBMCs以WTll26P2L胜肽刺激誘導的 CTLs之細胞傷害活性的結果示於第9圖。第9圖中，分別〇為縱軸表示細胞傷害活性’橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8 陽性T細胞⑽eetc)r，E)與目標細胞加机τ)之比 (Ε/Τ比）。在第9圖a .中，分別為菱型（♦)表示以jy細胞做為目標細胞的情況’四角（_)表示以經WTh26p2L胜狀脈衝的JY細胞做為目標細胞的情況。在第9圖b中，分別為菱型(♦)表示以TH細胞做為目標細胞的情况，四角() 表示以ΤΗΡ-i細胞做為目標細胞的情況，三角（▲)表示以 KH88〇F8細胞做為目標細胞的情況，叉型（X)表示以B_CLC 細胞做為目標細胞的情況。 320827 59 200930402 f • 所誘導的CTLs，對經WTlmP2L胜肽脈衝的JY細胞，比未經該胜肽脈衝的JY細胞，顯示較強的細胞傷害活性 (第9圖a)。又，所誘導的CTLS對於HLA-A*0201陽性且 WT1陽性的TF-1細胞及THP-1細胞，比對於HLA-A*0201 陰性且WT1陽性的KH880F8細胞株，及HLA-A*0201陽性且 WT1陰性的B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性（第9圓 b)。由此結果可知，以wTlmP2L胜肽刺激所誘導的CTLs 為HLA-A*0201限制性，傷害内因性表現WT1的癌細胞。將經rrimP2L胜肽刺激的HLA-A*0201陽性提供者2 的PBMCs以經PE標識的WTlm胜肽的HLA-A*0201的四聚體及經APC-Cy7標識的抗CD8染色，以流式細胞儀解析的結果示於第10圖。即第1〇圖顯示，所誘導的CTLs以WTlm 胜肽的四聚體及抗CD8抗體染色而以流式細胞儀解析的結果。分別為縱軸表示由HLA-A*0201四聚體所致之螢光強度’橫軸表示由抗CD8抗體所致之螢光強度。〇第10圖的右上（UR)部分的細胞，被誘導而具有 HLA-A*0201限制性的，為可辨認WTll26胜肽的CTLs。經 WTlmP2L胜肽刺激PBMCs的淋巴球中，5.43%為HLA四聚體陽性且CD8陽性，為可與WT1I26胜肽的HLA-A*0201四聚體結合的CTLs。此結果顯示，由pBMCs的修飾胜肽刺激所致之能辨認野生型胜肽的CD8陽性的CTLs受到誘導。經WTlmP2L胜肽刺激提供者2的PBMCsm誘導的CTLs 的細胞傷害活性的測定結果，示於第u圖。第Η圖a及第11圖b中’縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺 60 320827 200930402 ' 激得到的CD8陽性T細胞（Effector，E)與目標細胞 (Target，T)之比（E/T比）。在第11圖a中’分別為菱型（♦) 表示以JY細胞做為目標細胞的情況，四角（)表示經 WT11”胜肽脈衝的jy細胞做為目標細胞的情況。在第11圖 b中，菱型（♦)表示以jy細胞做為目標細胞的情況，四角 (_)表示經WTh26P2L胜肽脈衝的JY細胞做為目標細跑的情況' ^ 所誘導的CTLs對經WTlm胜肽脈衝的JY細胞，比未以胜肽脈衝的JY細胞，顯示較強的細胞傷害活性（第1 1圖 a)。又，所誘導的CTLs對經WTlmP2L胜肽脈衝的JY細胞，比未以胜肽脈衝的JY細胞，顯示較強的細胞傷害活性（第 11圖b)。由此結果可明白，以WTli26P2L胜肽刺激所誘導的CTLs，可辨認WTlmPZL胜肽及野生型WTlm胜肽二者。實施例10(以WTlm修飾胜肽所致之HLA-A*0206限制性 CTLs誘導的比較） · 〇 ⑴目的考慮實施例7的結果’選擇WTlmPlF胜狀、WTli26P2L 胜肽、WTlmP3M胜肽及WTlmPgV胜肽做為WTlmP2L修飾胜肽，以篩選能誘導細胞傷害活性高的CTLs的WTlm修飾胜肽為目的，進行本實驗。 (2)材料及方法由表現HLA-A*0206的健康提供者（HLA-A*0206健康供血者）分離週邊血液單核球（PBMCs)，再使用抗人類CD14粒子-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)分離 CD14 陽性細 \ 61 320827 200930402 7 胞。將該細胞以含有lv/v%人類AB血清（UhumanABserum) 的X-VIV015培養基中，添加8〇〇IU/ml的GM_CSF及 1000IU/ml的IL-4的培養液，培養1日。在本培養物中，添加含有10ng/ml的TNFa、l〇ng/ml 的IL-y5、1000IU/ml的IL-6及lyg的PGE2的成熟細胞介素此合物（maturation cytokine cocktail)。再培養 1 曰後’獲得自體成熟DCs(mature DCs)。 ❾ 經在實施例13所得的10//g/ml的WTlm修飾胜肽

(WTlmPlF 胜肽、WT1I26P2L 胜肽、WTlmP3M 胜肽或 WTlmP9V 胜肽）脈衝的自體成熟DCs，在培養4小時後，照射放射線 (35Gy)，使用做為誘導CTLs的刺激細胞。在24孔盤的一個孔，經濃縮cD8陽性T細胞的BMCs(2 xlO6個/孔）及前述的DCs(lxl〇5個/孔）一起培養。1〇日後，經胜肽脈衝之以放射線照射(^冗幻的PBMCs細胞再刺激。再刺激的2日後，添加i〇iu/mi的il-2及10ng/ml的IL-7。 Ο 同樣的刺激再重複4次後，濃縮CD8陽性T細胞。以此CD8 陽性T細胞，檢討其對各種目標細胞的細胞傷害活性。使用HLA-A*0206陽性提供者的血液以EB病毒感染而建立的B-LCL細胞、K562細胞及0206K562細胞，做為目標細胞。 (3)結果測定HLA-A*0206陽性提供者3的PBMCs，以胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性結果示於第12圖。分別為第12圖a顯示以WTli26P2L胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞 320827 62 200930402 ·, 傷害活性，第12圖b顯示以WTlmP3M胜肽刺激所誘導的 CTLs的細胞傷害活性，第12圖c顯示：以mmP9V胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性。第12圖a至c中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞（Effector, E)與目標細胞（Target，T) 之比（E/T比）。分別為菱型（♦)表示使用自己B-LCL細胞做為目標細胞的情況，四角（_)表示使用經用於刺激之 WT1!26胜肽脈衝的自己B-LCL細胞做為目標細胞的情況。

® 以WT1i26P2L胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WTlmP2L 胜肽脈衝的HLA-A*0206陽性且WT1陰性的自己B-LCL細胞’比未以胜狀脈衝的自己B-LCL細胞.，顯示較強的細胞傷害活性（第12圖a)。以WTli26P3M胜肽刺激所誘導的 CTLs ’對經WT1126P3M胜肽脈衝的HLA-A*0206陽性且WT1 陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性（第12圖b)。以WTlmP9V Q 胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WTli26P9V胜肽脈衝的 HLA-A*0206陽性且WT1陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性（第 12 圖 c)。此結果顯示，用於刺激的胜肽特異性的HLA-A*0206限制性的CTLs受到誘導。測定HLA-A*0206陽性提供者3的PBMCs，以nimP9V 胜肽刺激誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第13 圖。第13圖中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫轴表示 63 320827 200930402 ，-由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞（Efiector，E)與目標細胞（Target，T)之比（E/τ比）。分別為菱型（♦)表示以^已 B-LCL細胞做為目標細胞的情況，四角（)表示使用於自己B-LCL細胞經導入WT1基因的細胞的情況。第13圖顯示，以WT1i26P9V胜肽刺激所誘導的CTLs，對HLA-A*0206陽性且WT1陰性的於自己b-LCL細胞經導入 WT1基因而成為WT1陽性的細胞，比未導入WT1.基因的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性。由此結果可知，以WTlmP9V胜肽刺激所誘導的CTLs，為HLA-A；k〇2〇6限制性，辨認内因性呈現野生型的WTlm胜肽，顯示細胞傷害活性。 ° 測定HLA-A*0206陽性提供者4的PBMCs，以胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第14圖。分別為第14圖a顯示以WTli26P2L胜肽刺激所誘導的cTLs的細胞傷害活性，第14圖b顯示以WTlmP3M胜肽刺激所誘導〇的CTLs的細胞傷害活性，第14圖c顯示以WTli26P9V胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性。第14圖^至c中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞（Effector，E)與目標細胞（Target，τ) 之比(E/T比）。分別為菱型（♦)表示使用自己b-LCL細胞做+為目.標細胞的情況’四角（)表示使用用於刺激之經 WTli26修飾胜肽脈衝的自己B-LCL細胞做為目標細胞的情況。

以WT1i26P2L胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WTli26P2L 320827 64 200930402 * - 胜肽脈衝的HLA-A*0206陽性且m陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活.性（第14圖a).。以WT1 i26P3M胜狀脈衝所誘導的

I CTLs ’對經WTlmP3M胜肽脈衝的HLA-A*0206陽性且WT1 陰性的自己B-LCL細胞’比未以胜肽脈衝的自己β-lcL細胞，顯示較強的細胞傷害活性（第14b圖）。以訂1126p9V胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WTlmP9V胜肽脈衝的 HLA-A*0206陽性且WT1陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜〇肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性（第 14圖c)。由此結果顯示，所誘導的CTLs，對於使用於刺激的胜肽有特異性的HLA-A*0206限制性的CTLs受到誘導。測定HLA-A*0206陽性提供者4的PBMCs，以胜肽刺激誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第15圖。目標細胞是分別使用HLA-A*0206陰性且WT1陽性的K562細胞，及在K562細胞導入HLA-A*0206基因而内因性地呈現訂1 ◎ 的抗原胜肽的細胞（0206K562細胞）。第15圖a顯示以 WTlmP2L胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活，第15圖 b顯示以WTlmP3M胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性，第15圖c顯不以WTlmP9V胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性'第15圖c中，分別為縱歸示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性τ細胞 (Effector，Ε)與目標細胞（Target，τ)之比（Ε/Τ比）。又，分別為菱型（♦)表示使用Κ562細胞做為目標細胞的情況，四角（_)表示使用在Κ562細胞導入HU 一 Α*〇2〇6基因 320827 65 200930402 •-而内因性地呈現fTl的抗原胜肽的0206K562細胞做為目標細胞的情況。由第15圖a至c顯示，以WTli26P2L胜肽、冗1'1126?311 胜肽或WTli26P9V胜肽刺激所誘導的CTLs’在任一情況都對 0206K562細胞’比K562細胞，顯示較強的細胞傷害活性。由此結果可知’以這些修.飾胜肽刺激所誘導的CTLs，為 HLA-A*0206限制性’辨認内因性呈現野生型的WT1126胜肽，而顯示細胞傷害活性。〇實施例11 (WT1126修飾胜肽所致之HLA-A*0201限制性的 CTLs誘導的比較） (1)目的考慮實施例8的結果，而選擇WTlmPlF胜肽（序列編號ll)、m丨87P2M胜肽（序列編號16)及WTlmP3M(序列編號 20)做為WTlis?修飾胜肽，以篩選能誘導細胞傷害活性高的 CTLs的WTli87修飾胜肽為目的，進行本實驗。 ❹ （2)材料及方法由表現HLA-A*0201的健康提供人（HLA-A*0201健康供血者）分離週邊血液單核球（PBMCs)，再使用抗人類CD14粒子_〇]\1(八111:丨-刖11^11 CD14 Particles-DM)分離 CD14 陽性細胞。將該細胞以含有1 v/v%人類AB血清（1 % human AB serum) 的 X-VIV015 培養基中添加 800IU/ml 的 GM-CSF 及 1000IU/ml 的IL-4的培養液，培養1日。在本培養物中’添加含有lOng/ml的TNFo;、10ng/ml 的IL-冷、1000IU/ml的IL-6及l"g/ml的PGE2的成熟細 66 320827 200930402 « • 胞介素混合物（maturation cytokine cocktai 1)。再培養 1曰後，獲得自體成熟DCs(mature DCs)。經在實施例13所得的10//g/ml的WTlm修飾胜肽 (WThnPlF胜肽、WTlmP2M胜肽或ΓΓ1187Ρ3Μ胜肽）脈衝的自體成熟DCs，在培養4小時後，照射放射線（35Gy)，使用做為誘導CTLs的刺激細胞。在24孔盤的一個孔，做為應答細胞的PJBMCs(2xl06個/ 孔）及前述的DCs(2xl05個/孔）一起培養。1週後，經胜肽 ® 脈衝的放射線照射（75Gy)T2細胞再刺激。再刺激的3日後，添加20IU/ml的IL-2。同樣地重複3次經胜態脈衝的放射線照射T2細胞的刺激，濃縮應答細胞中的CD8陽性T 細胞。以此CD8陽性T細胞，檢討其對JY細胞做為目標細胞的細胞傷害活性。 (3)結果測定HLA-A*0201陽性提供者的PBMCs，以WTlmPlF q 胜肽（第16圖a)或WTlmP2M胜肽（第16圖b)刺激誘導的 CTLs的細胞傷害活性的結果示於第16圖。第16圖a及第 16圖b中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的01)8陽性1'細胞（£££6^:〇1*，£)與目標細胞 (Target，T)之比（E/T比)。分別為菱型（♦)表示使用jy 細胞做為目標細胞的情況，三角（▲)表示使用經WTlm脈衝的JY細胞做為目標細胞的情況，四角（)表示使用經用於刺激的WTli8?修飾胜肽（WTlmPlF胜肽）脈衝的JY細胞做為目標細胞的情況。JY細胞是HLA-A*0201陽性且WT1陰 67 320827 200930402 性。以WT1】87P1F胜肽所誘導的CTLs，對經WTlm胜狀脈衝的jy細胞及經mmPiF胜肽脈衝的JY細胞，顯示同等的細胞傷害活性，其活性比未以胜肽脈衝的JY細胞較強（第 16圖a)。以WTlmP2M胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WTh87 胜肽脈衝的JY細胞及經打^小⑽胜肽脈衝的几細胞顯示同等的細胞傷害活性’其活性比未以胜肽脈衝的JY細胞較強（第16圖b)。由此結果可知’以修飾胜肽刺激所誘導的 CTLs，可辨認修飾胜肽及野生型WTh87胜肽兩者。只施例12(WTli87修飾胜肽所致之hla-a*0206限制性CTLs 誘導的比較） (1) 目的考慮實施例7的結果，選擇wti187pif胜肽、WT1187P2M 胜肽及WTli87P3M胜肽做為飾胜肽，以篩選能誘導細胞傷害活性高的CTLs的WTlm修飾胜肽為目的，進行本 ❾ 實驗。 (2) 材料及方法由表現HLA-A*0206的健康提供人（HLA_A*〇206健康供血者）分離週邊血液單核球（PBMCs)，再使用抗人類〇])14粒子-DM(Anti-Human CD14 Particles-M)分離 CD14 陽性細胞。將該細胞以含有1 v/v%人類AB血清（丨％ human AB serum) 的X-VIV015培養基中添加8〇〇IU/ml的GM-CSF及 1000IU/ml的IL-4的培養液，培養丨日。在本培養物中’添加含有l〇ng/ml的TNFa、i〇ng/ml 68 320827 200930402 « 的 IL-冷、1000IU/ml 的 IL-6 及 1/zg/ml 的 PGE2 的成熟細胞介素混合物（maturation cytokine cocktail)。再培養 1曰後，獲得自體成熟DCs(mature DCs)。經在實施例13所得的lOyg/ml的WTlm修飾胜肽 (WTlmPlF胜狀、WTli87P2M胜肽或WTlmP3M胜狀）脈衝的自體成熟DCs，在培養4小時後，照射放射線（35Gy)，使用做為誘導CTLs的刺激細胞。在24孔盤的一個孔，經濃縮CD8陽性T細胞的PBMCs(2 ❹ X10個/孔）及前述的DCs(2xl05個/孔）--起培養。1 〇日後，經胜肽脈衝的放射線照射（35Gy)PBMCs細胞再刺激。再刺激的2日後’添加l〇IU/ml的IL-2及10ng/ml的IL-7。同樣的刺激再重複4次後’濃縮CD8陽性T細胞。以此CD8 陽性T細胞’檢討其對各種目標細胞的細胞傷害活性。使用的目標細胞有HLA-A*0206陽性提供者的血液以 EB病毒感染而建立的B-LCL細胞、K562及0206K562細胞。 ( 3 )結果.. 測定HLA-A*0206陽性提供者的PBMCs，以WTh87piF 胜肽刺激誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第圖。第17圖中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞（Effect〇r，E)與目標細胞（Target，T)之比（E/T比）。在第17圖a中，菱型（♦) 表不使用B-LCL細胞做為目標細胞的情況，四角（鼸）表示使用經WT—lm脈衝的B-LCL細胞做為目標細胞的情況，三角（▲)表示使用經WTlmPlF胜肽脈衝的、[邙細胞做為: 320827 69 200930402 » -標細胞的情況。在第17圖b中’菱型（♦)表示使用K562 細胞做為目標細胞的情況，四角（)表示使用在K562細胞導入HLA-A*0206基因而内因性呈現WT1的抗原胜肽的 0206K562細胞做為目標細胞的情況。以WTlmPlF胜肽所誘導的ctLs，對經WTlu7胜肽脈衝的B-LCL細胞，及經WTlmpiF胜肽脈衝的B-LCL細胞，顯示同等的細胞傷害活性’其活性比未以胜肽脈衝的b_lcl 細胞較強（第17圖a)。又，在使用HLA-A*0206陰性且WT1 陽性的K562細胞，與在K562細胞導入HLA_A>|c〇2〇6基因而内因性呈現WT1抗原胜肽的細胞（Q206K52細胞）的情況，以WTlmPlF胜肽所誘導的cTLs，對0206K52細胞，比對 K562細胞’顯示較強的細胞傷害活性（第17圖b)。由這些結果可知，以WTlmPlF胜肽刺激所誘導的CTLs，可辨認 WTlmPlF胜肽及野生型的WT1胜肽兩者，為HLA-A*0206 限制性，辨識内因性呈現的野生型WTlm胜肽而顯示細胞 ❹ 傷害活性。

測定HLA-A*0206陽性提供者的PBMCs，以WTlmP2M 胜肽刺激誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第18 圖。第18圖中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的〇08陽性1'細胞（£行6<:1:〇]：，£)與目標細胞（Target，T)之比（E/T比）。在第18圖a中，分別為菱型（♦)表示使用B-LCL細胞做為目標細胞的情況，四角（麵) 表示使用經WTlm脈衝的B-LCL細胞做為目標細胞的情況’三角（▲)表示使用經rrimP2M脈衝的B-LCL細胞做為 320827 70 200930402 镄 •目標細胞的情況。在第18圖b中，分別為菱型（♦)表示使用K562細胞做為目標細胞的情況，四角（)表示在K562 細胞導入HLA-Α*〇2〇6基因而内因性呈現WT1的抗原胜肽的 0206Κ562細胞做為目標細胞的情況。以WTlmP2M胜肽所誘導的CTLs，對經wti187胜肽脈衝的B-LCL細胞及經rnmP2M胜肽脈衝的B-LCL細胞，顯示同等的細胞傷害活性，其活性比未以胜肽脈衝的B-LCL細胞較強（第18圖a)。又，在使用hlA-A*0206陰性且WT1 陽性的K562細胞，與在K562細胞導入HLA_A*〇2〇6基因而内因性呈現WT1抗原胜肽的細胞（〇2〇6Κ562細胞）做為目標細胞的情況，以WT1187P2M胜肽誘導的CTLs，對0206K562 細胞比對K562細胞顯示較強的細胞傷害活性（第18圖b)。由這些結果可知，以WTlmP2M胜肽刺激所誘導的CTLs，可辨認mmP2M胜肽及野生型的WTlm胜肽雙方，為 HLA-A*0206限制性，内因性呈現的野生型WTlm胜肽而顯 q 示細胞傷害活性。由實施例9至12的結果可知，以WTlm修飾胜肽之 WTlmPlF 胜肽、WTlmP2L 胜肽 WTlmP3M 胜肽及 WTlmP9V 胜肽刺激所誘導的CTLs，為HLA-A*0206限制性，辨識内因性呈現的野生型WTlm胜肽，而顯示細胞傷害活性。其中，尤以WTlmP9V胜肽、WTlmP2L胜肽及WT1i26P3M胜肽的效果為南。以WTlisf修_胜狀之WTlmPlF胜肽、WTli87P2M胜肽及 WTlmP3M胜肽刺激所誘導的CTLs’為HLA-A*0206限制性， 71 320827 200930402 * • · 辨識内因性呈現的野生型WTlm胜肽，而顯示細胞傷害活性。其中’尤以WTlrnPSM胜肽及WTlmPlF胜肽的效果為高。如此顯示，這些修飾胜肽，在HLA-A*0206陽性者中，有效於伴隨WT1基因的表現水準上升之癌的治療及預防。由上述結果也可知，以WT1⑶胜肽的修飾胜肽之

WTlmPlF 胜肽、WTlmP2L 胜肽、WT1126P3M 胜肽及 WT1126P9V 胜肽刺激所誘導的CTLs，為HLA-A*0201限制性，辨識内因性呈現的野生型WTlm胜肽’而顯示細胞傷害活性。其 ® 中，尤以WTlmPlF胜肽及WTlmP2L胜肽的效果為高。由上述結果也可知，以WT1 m胜肽的修飾胜肽之 WTlmPlF胜肽、WTlmP2M胜肽及WTImPSM胜肽刺激所誘導的CTLs ’為HLA-A*0201限制性，辨識内因性呈現的野生型WTl·87胜肽，而顯示細胞傷害活性。其中，尤以丨i87p2M 胜月太及.WTImPlF胜狀的效果為高。因此顯示，這些修飾胜肽在HLA-A*0206陽性者中，有效於伴隨WT1基因的表現水 Q 準上升之癌的治療及預防。實施例13 WTlmP2V胜肽（SVGEQQYSV ;序列編號13 ; H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-0H)的合成 1、保護胜肽樹脂（H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln (Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin)的合成。將Fmoc-Val-Alko-樹脂（在此處，Alko表示P-烷氧基卞醇.）0.4g(渡邊化學製，0.8Ominol/g)放在 Advanced ChemTech公司製ACT496型固相合成機的反應槽内，以dmf 72 320827 200930402 • - (Ν，Ν’ -二甲醯胺）清洗（步驟1)，以2.5%哌啶（piperidine) DMF處理（5分鐘χΐ次及30分鐘xl次）切斷Fmoc基後（步驟 2) ’再以DMF清洗（步驟3)而得H-Val-Alko-樹脂。在此反應槽中加入NMP(N-甲基吡咯烷酮）0. 7ml，及DIPCI(N，N’ -二異丙基碳二亞胺）121mg(0. 96mmol)的NMP溶液0. 9nd，再加入 Fmoc-Ser(tBu)-0H 368mg(0. 96mmol)及 H0BTU-羥基苯並三峻）1水合物147mg(0. 96mmol)的NMP溶液1. 8ml.，在室溫下進行偶合反應60分鐘（步驟4)。以同量的Fmoc-Ser ® (tBu)-OH、H0BT1水合物及DIPCI再度進行偶合反應（步驟 5) ’以DMF清洗樹脂（步驟6)，脫保護（步驟7)及清洗（步驟 8)而得H-Ser(tBu)-Val-Alko-樹脂。繼而反覆步驟4至步驟 8 依次偶合 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、 Fmoc-Gln(Trt)-0H、Fmoc-Glu(0tBu)-0H、Fmoc-Gly-OH、

Fmoc-Va卜OH及Fmoc-Ser(tBu)-OH。由反應槽取出胜肽樹脂以乙醚清洗，之後減壓乾燥而得H-Ser(tBu)-Val-Gly- q Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser<tBu)-Val-

Alko-Resin 980mg。將上述合成步驟的概要示於表6。〈合成步驟〉 73 320827 200930402 【表6】步驟試藥處理次數時間（分） 1)清洗 DMF 3ml 5 0.3 2)脫保護 25%哌啶/DMF 3ml 1 5 1 30 3 )清洗 DMF 3m1 5 0· 3 4)偶合各Fmoc胺基酸（3當量）、 1 60 H0BT(3 當量）、 DIPCK3 當量）/NMP3.4ml 5)偶合各Fmoc胺基酸（3當量）、 1 60 H0BT(3 當量）、 DIPCK3 當量）/NMP 3. 4ml 6 )清洗 DMF 3ml 5 0· 3 7)脫保護 25%哌啶/DMF 3ml 1 5 1 30 8)清洗 DMF 3m1 5 0.3 2、保護胜肽樹脂的脫保護 H-SerCtBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt) -Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin 980mg 中加入三氟乙酸/水/三異丙基矽烷（95/2· 5/2. 5(容量比））混合液 5ml，在室溫攪拌2. 5小時。過濾樹脂，將濾液加至A乙、中，所得析出物以玻璃過濾器過濾。濾器上物以乙_、、主、先' 減壓乾燥而得粗胜肽268mg。 ' 320827 74 200930402 •' · 3、粗胜肽的精製所得粗胜肽268mg溶解於20%乙酸水，以逆相液體層析法精製。

幫浦：島津LC-8A 管柱：YMC-Pack Pro C18 AS12S11-2530WT 3cmOx25cm 溶出液 1 : H2〇/0. 1%TFA 溶出液 2(2 液）：CH3CN/0· 1%TFA 流速：10ml/min 〇 v 檢測：UV220nm 管柱以2液濃度1%平衡化以後，將粗胜肽溶液饋入。之後費30分鐘將2液濃度提高為8%，再費120分鐘將2 » 液濃度提高到14%。將含有目的物的部分收集，將乙腈減 .壓餾去，冷凍乾燥而得目的之WT1187P2V胜肽（SVGEQQYSV; 序列編號 13; H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Va 卜 0H) 105mg。 0 精製後的胜肽的HPLC分析及質量分析的條件如下。 HPLC 分析（島津 LC-lOAvp)

管柱：YMC-Pack Pro C18 AS-302 4. 6ππηΦχ150πιιη 溶出液 1 : H2〇/0. 1%TFA 溶出液 2 : CH3CN/0. 1%TFA 濃度梯度：溶出液2的濃度在30分鐘内由10%提高到 40%。流速：lml/min 檢測：UV220nm 75 320827 200930402 r • 純度：97. 4%，保持時間：11. 22分鐘胺基酸分析（日立L-8500胺基酸分析裝置）加水分解：1%酚/6N鹽酸水，110°C 24小時分析法：茚三酮（ninhydrin)法 Ser： 1.78(2) Glx: 3. 26(3) *Gly·· (1) Val ： 2. 04(2) Tyr ： 1.06(1) *) Gly =基準胺基酸（）内理論值質量分析（Applied Biosystems API 150EX質量分析計）》111/^=996.9【1+1】+ (理論值=996.5) 胺基酸序列分析（Appl ied Biosystems 491 蛋白質序列分析儀，Protein Sequencing System) 序確認由N末端Ser到C末端Val。與上述相同，表7及表8所示為所合成的各胜肽。〇 76 320827 200930402 ¥ 【表7】胜肽胺基酸序列序列編號粗胜肽取得量mg 精製品取得量 (mg) HPLC 純度⑻ HPLC保持時間（分）質量分析 (m/z) WT1i8tP2Q SQGEQQYSV 14 251 88 98.2 9.21 1026.0 WT1.87P2I SIGEQQYSV 15 244 91 97.6 12. 98 1010,7 WT1i8tP2M SMGEQQYSV 16 260 22 96. 9 11.91 1029.1 WT1is7P3L SLLEQQYSV 17 238 176 96.8 18.24 1066.9 WT1i87P3A SLAEQQYSV 18 268 172 99.1 13.67 1024.8 ?Tll87P3V SLVEQQYSV 19 267 182 98.7 15.26 1052.8 WT1i87P3M SLMEQQYSV 20 280 63 94.8 16.12 1084.8 WTlmP3P SLPEQQYSV 21 227 132 98.1 14.02 1050.8 WTlmP3W SLWEQQYSV 22 248 40 (由粗胜肽 100 mg) 99.4 20.00 1139.5 WTlmP3F SLFEQQYSV 23 224 110 98.3 19.44 1100.8 WT1.8tP3Y SLYEQQYSV 24 236 114 98.5 15.76 1116.7 WTli87P3S SLSEQQYSV 25 261 130 99.1 13.33 1040,8 WTli87P3I SLIEQQYSV 26 270 162 97. 3 . 17.51 1066. 9 77 320827 200930402

【表8】胜肽胺基酸序列序列編號粗胜肽取得量mg 精製品取得量 (mg) HPLC 純度(%) HPLC保持時間（分） WT1I26P2V RVFPNAPYL 36 253 130 96,5 20. 65 WTli26P2Q RQFPNAPYL 37 274 87 98.7 18.43 WT1i26P2A RAFPNAPYL 38 240 63 99.0 19. 03 WT1126P9A RMFPNAPYA 50 .262 139 94.3 16.59^ WTli26P9M RMFPNAPYM 52 295 167 95.7 19.75

表9至表12所示的各胜肽，也以同樣方法合成。但，精製後的胜肽的HPLC分析及質量分析的條件如下。 HPLC 分析（Agilent HP1100 或 Thermo Fisher Scientific

Surveyor) 管柱：Thermo Fischer Scientific BioBasic-18 3咖 Φ x250mm

溶出液 2 : CHsCI^O. irrFA 梯度‘溶出液2的濃度在2 0分鐘内依表中所列的濃度改變。流速：0. 4ml/min 檢測：215nm 質量分析

Applied Biosystems Dynamo 質量分析計(MALDI-T0F) 78 320827 200930402 【表9】胜肽胺基酸序列序列編號粗胜肽取得量 mg HPLC保持時間(分） HPLC梯度 (%) 質量分析 (m/z) WTlmPlG GLGEQQYSV 4 100 12. 72 5-60% 980.7 WTlmPlA ALGEQQYSV 5 98.9 12. 00 10-50% 993.0 WTlmPlV VLGEQQYSV 6 98.9 14.98 5-50% 1022. 3 WTlmPlL LLGEQQYSV 7 97.6 12.75 10-65% 1037.6 WTIibtPII ILGEQQYSV 8 98.8 13.46 5-60% 1037.2 WTlmPlM MLGEQQYS V 9 95.5 14.15 5-60% 1054.0 WTlmPlW WLGEQQYSV 10 98.9 15.60 5-60% 1109.9 WTlmPlF FLGEQQYSV 11 95.8 13.14 10-65% 1070.8 WT1is7P9L SLGEQQYSL 53 95.4 12. 49 10-55% 1024.6 Ο 79 320827 200930402 【表10】胜肽胺基酸序列序列編號粗胜肽取得量mg HPLC保持時間 (分） HPLC梯度 (%) 質量分析 (m/z) WT1126P1G GMFPNAPYL 27 99.6 15. 39 10-70% 1009.5 WT1126P1A AMFPNAPYL 28 98.8 13. 79 10-85% 1023.3 ?Tli26PlV VMFPNAPYL 29 98.4 14. 00 10-85% 1052.2 WTlizePlL LMFPNAPYL 30 98.9 14.91 10-80% 1066.3 WTlrnPlI IMFPNAPYL 31 99.2 13. 93 10-80¾ 1065.4 WTlizePlM MMFPNAPYL 32 100 13. 77 10-80% 1083.5 WT1126P1W WMFPNAPYL 33 97.5 15.64 10-80% 1139.3 WTluePlF FMFPNAPYL 34 98.8 14.78 10-85% 1099.7 WT1126P2L RLFPNAPYL 39 98.6 13.11 10-80% 1090.9 WT1126P2I RIFPNAPYL 40 100 13. 74 10-70% 1090.1 WT1126P3I RMIPNAPYL 41 97.4 14.17 10-70% 1076.7 WT1126P3L RMLPNAPYL 42 100 13.88 10-65% 1076.4 WT1126P3G RMGPNAPYL 43 96.7 12. 63 10-65% 1020.9 WTli26P3A RMAPNAPYL 44 95.2 13.95 10-60% 1034.9 WTli26P3V RMVPNAPYL 45 92.9 14. 67 10-60% 1062.7 ffTli26P3M RMMPNAPYL 46 91.8 14.87 10-60% 1094.8 WTlmP3P RMPPNAPYL 47 95.8 13. 56 10-65% 1058.8 WT1.26P3W RMWPNAPYL 48 99.6 15. 21 10-70% 1149.7 WT1i2bP9V RMFPNAPYV 49 99.2 13.86 10-60% 1096.5 ffTli26P9I RMFPNAPYI 51 99.4 14. 00 10-65% 1110.7 80 320827 200930402 【表11】胜肽胺基酸序列序列編號粗胜肽取得量mg ^------ HPLC保持時間（分） HPLC 梯度(％) 質量分析 (m/z) WTI.stPID DLGEQQYSV 54 96.6 13.43 5-60% 1038.2 WTlmPlE ELGEQQYSV 55 96.4 11.83 10-60% 1052.2 WTlmPlH HLGEQQYSV 56 98.0 ——^ 15. 79 5-40% ^ 1060.2 WTlmPlK KLGEQQYSV 57 99.0 13.77 5-45% 1052.2 . WTIistPIN NLGEQQYSV 58 95.8 —— 14. 34 5-50% 1037. 0 WTlmPlP PLGEQQYSV 59 95.9 14.68 5-50% 1020.0 WTIistPIQ QLGEQQYSV 60 96.8 13. 28 5-60% 1051.3 WTlrnPlR RLGEQQYSV 61 100 13.27 5-60% 1079.6 ffTlmPlT TLGEQQYSV 62 96.7 14.40 — _ 5-50% 1025.0 【表12】胜肽胺基酸序列序列編號粗胜肽取得量mg HPLC保持時間（分） HPLC梯度 (%) 質量分析 (m/z) ¥Tli26PlD DMFPNAPYL 63 99.2 --- 14. 72 10-75% 1067.3 WTlizePlE WTlmPlH EMFPNAPYL HMFPMAPYL 64 65 99.1 96.7 --- 15.20 -- 14.52 5-70% 10-70% 1082.1 1089.9 WTlmPlK KMFPNAPYL 66 95.9 ------ 13.96 10-75% 1080.0 WT1126P1N NMFPMAPYL 67 99.8 14. 69 10-75% 1066. 3 WTlmPlP PMFPNAPYL 68 96.9 〜-- 14. 26 10-80% 1049. 3 WTlrnPlQ QMFPNAPYL 69 95.1 ^—. 14. 94 10-70% 1080.3 320827 81 200930402 WTlrnPlS SMFPNAPYL 70 99.8 14.28 10-80% 1040.8 WT1.26P1T TMFPNAPYL 71 98.8 13.72 10-85% 1053.5 WT1i26P21&P9I RIFPNAPYI 72 97.0 14.23 10-65% 1089.5 WT1iZ6P2I&P9V RIFPNAPYV 73 100 12.23 10-80% 1077. 0 WTli26P2L&P9I RLFPNAPYI 74 97.7 13.43 10-75% 1090.8 WT1.26P2L&P9V RLFPNAPYV 75 97.0 12.83 10-75% 1076. 9 實施例14(使用HLA-A*0201表現之基因轉殖小鼠的修飾胜肽的特異性免疫細胞誘導活性能的評估，及所誘導的特異性免疫細胞對野生型胜肽的交叉反應性的確認）〈方法〉 (1)修飾胜肽候補 WTlrn胜肽、WT1126胜肽及其修飾胜肽（WTlm胜肽或WT1126 胜肽的N末端起第1個、第2個、第3個或第9個的1個或 2個胺基酸以其他胺基酸置換的胜肽），利用在該領域已知的 ❹ BIMASChttp:7/www. mpi ib-berlin. mpg.de/MAPPP/bi ndi ng. h

tml) 、 SYFPEITHI (http;//www. mpi jp-berlin. mt)g· de/MAPPP/binding. html) 、RANLPEP(htt^//immunax. dfci. harvard. edu/Tools/ rankpep. html)及 NetMHC3. 0 (http://cbs. dtu^dk/services/NetMHC/")等 4 個電腦資料庫的方法，分析對HLA-A*0201分子的結合性（親和性）。 WTlm胜肽及其修飾胜肽的分析結果示於表η至16, WT1126 胜肽及其修飾胜肽的分析結果示於表17至及表22至 82 320827 200930402 • · 23。所推定的結合性的高度以分數（score)表示。【表13】胜肽胺基酸序列序列編號 HUHW)201結合分數 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0 WT1187 SLGEQQYSV 2 285 27 95/64.43% 0.721 WTlisvPIA ALGEQQYSV 5 285 27 95/63. 76% 0.720 WT1.87P1F FLGEQQYSV 11 1312 26 82/55.03% 0. 862 WTI^PIG GLGEQQYSV 4.. 285 26 86/57. 72% 0.672 WTI187PII ILGEQQYSV 8 485 27 90/60.40% 0.698 WTlmPlL LLGEQQYSY 7 485 27 89/59.73% 0.719 WTIistPIM MLGEQQYSV. .9 485 25 92/61.74% 0. 770 WTIistPIV VLGEQQYSV 6 485 26 92/61.74% 0. 705 WTlmPlW WLGEQQYSV 10 1312 25 71/47. 65% 0.593 【表14】胜肽胺基酸序列序列編號 HLA-A*0201結合分數 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3. 0 WTlm SLGEQQYSV 2 285 27 96/64.43% 0.721 WTlmP2I SIGEQQYSV 15 39 25 85/57. 05% 0.556 WTlmP2M SMGEQQYSV 16 206 25 . 84/56. 38% 0.740 WT1i8tP2Q SQGEQQYSV 14 29 17 52/34. 90% 0.455 WT1i87P2V SVGEQQYSV 13 25 21 78/52. 35% 0.461 83 320827 200930402 【表15】胺基酸序列序列編號 HLA-A*0201結合分數胜肽 E列 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3. 0 WT1187 SLGEQQYSV 2 285 27 96/84. 43¾ 0.721 WTli87P3A SLAEQQYSV 18 285 29 110/73.83% 0.811 WT1187P3F SLFEQQYSV 23 1055 28 114/76.51% 0.852 WTli87P3I SLIEQQYSV 26 285 29 115/77.18% 0.817 WT1is7P3L SLLEQQYSV 17 1055 29 116/77. 85% 0.839 WT1i8tP3M SLMEQQYSV 20 1055 28 114/76. 51% 0. 876 WTli87P3P SLPEQQYSV 21 285 27 95/63. 76% 0.748 WTli87P3S SLSEQQYSV 25 285 27 110/73.83% 0.793 ffTlmP3V SLVEQQYSV 19 285 27 113/75.84% 0.766 WTli87P3ff SLWEQQYSV 22 2367 28 98/65. 77% 0.883 WTli87PSY .SLYEQQYSV 24 913 28 111/74. 50% 0. 854 〇【表16】胺基酸序列序列編號 HLA-A*0201結合分數胜肽 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3. 0 WTll87 SLGEQQYSV 2 285 27 96/64. 43% 0.721 WT1.87P9L SLGEQQYSL 53 88 27 89/59. 73% 0. 640 84 320827 200930402 【表17】胜肽胺基酸序列序列編號 HLA-A*0201結合分數 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3. 0 WT1I26 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0. 802 WTlmPlA AMFPHAPYL 28 314 24 77/51. 68% 0.808 WTlmPlF FMFPNAPYL 34 1444 23 64/42. 95% 0.909 WTImPIG GMFPNAPYL 27 314 23 68/45. 64% 0. 795 WTlizePlI IMFPNAPYL 31 534 24 72/48.32% 0.802 WTlmPlL LMFPNAPYL 30 534 24 71/47. 65% 0.819 WTli26PlM MMFPMAPYL 32 534 22 74/49.66% 0.852 WTlizsPlV VMFPNAPYL 29 534 23 74/49. 66% 0.804 WT1126P1W WMFPNAPYL 33 1444 22 53/35. 57% 0. 799 【表18】胜肽胺基酸序列序列編號 HLA-A*0201結合分數 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3. 0 WTlm RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0.802 WTlmP2A RAFPNAPYL, 38 6 18 47/31.54% 0.376 WTlmP21 RIFPNAPYL 40 60 22 71/47. 65% 0. 640 WTli26P2L RLFPNAPYL 39 435 24 82/55. 03% 0.784 WT1J26P2Q RQFPNAPYL 37 44 14 38/25. 50% 0.485 WTli26P2V RVFPNAPYL 36 38 18 64/42. 95% 0.552 85 320827 200930402 » 【表19】胜肽胺基酸序列序列編號 HLA-A*0201結合分數 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0 WT1126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46. 98% 0.802 WTUP3A RMAPNAPYL 44 85 23 66/44. 30% 0. 734 WT1.26P3G RMGPNAPYL 43 85 21 52/34.90% 0.602 ΨΤ1.26Ρ3Ι RMIPNAPYL 41 85 23 71/47. 65% 0.741 WTli26P3L RMLPNAPYL 42 314 23 72/48.32% 0.781 WTlmP3M RMMPNAPYL 46 314 22 70/46. 98% 0.834 WTli26P3P RMPPNAPYL 47 85 21 51/34.23% 0.613 WT1,26P3V RMVPNAPYL 45 85 21 69/46.31% 0.680 WT1u6P3W RMWPNAPYL 48 2293 22 61/40.94¾ 0.867 【表20】胜肽胺基酸序列序列編號 HLA-A*0201結合分數 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3. 0 ffTll26 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% I 0. 802 WT1.26P9A RMFPNAPYA 50 73 15 53/35.57% 0.731 WTli26P9I RMFPNAPYI 51 153 20 74/49.66% 0. 790 WT1i26P9M RMFPNAPYM 52 73 16 65/43. 62% 0. 686 WTli26P9V RMFPNAPYV 49 1022 22 77/51. 68% 0.838 86 320827 200930402 « 【表21】胜肽胺基酸序列序列編號 HLA-A初201結合分數 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3. 0 WT1187 SLGEQQYSV 2 285 27 96/64.43% 0.721 WTlmPlD DLGEQQYSV 54 21 24 81/54. 36% 0.252 WTlmPlE ELGEQQYSV 55 21 22 85/57. 05% 0.366 WT1.87P1H HLGEQQYSV 56 10 25 83/55.70% 0. 610 WTlmPlK KLGEQQYSV 57 998 26 89/59.73% 0.745 WTIistPIN NLGEQQYSV 58 285 25 90/68. 40% 0.613 WTIistPIP PLGEQQYSV 59 6 22 78/52.35¾ 0.287 WTlrnPlQ QLGEQQYSV 60 285 25 87/58. 39% 0. 630 WTlrnPlR RLGEQQYSV 61 285 25 88/59.06% 0. 690 WTlrnPlT TLGEQQYSV 62 285 25 93/62. 42% 0.669 【表22】

胜肽胺基酸序列序列編號 HLA-A*0201結合分數 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3. 0 WTll26 RMFPNAPYL 3 314 .22 70/46. 98% 0.802 WTlizePID DMFPNAPYL 63 24 21 63/42.28% 0.353 WTI126PIE EMFPNAPYL 64 24 19 67/44. 97% 0.501 WTliaePlH HMFPNAPYL 65 11 22 65/43. 62% 0. 747 IT1.26P1K KMFPNAPYL 66 1099 23 71/47. 65% 0.841 WTlizePIN NMFPNAPYL 67 314 22 72/48. 32% 0.734 WT1126P1P PMFPNAPYL 68 7 19 60/40. 27% 0.802 WT1126P1Q QMFPNAPYL 69 314 22 69/46. 31¾ 0.757 WTlizePIS SMFPNAPYL 70 314 24 78/52. 35% 0. 819 WTlrnPlT TMFPNAPYL 71 314 22 75/50. 34% 0,779 87 320827 200930402 【表23】胜肽胺基酸序列序列編號 HLA-A利201結合分數 BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0 WT1126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46. 98% 0. 802 WT1i26P2I&P9I RIFPNAPYI 72 29 20 75/50. 34% 0.617 WT1i26P2I&P9V RIFPNAPYV 73 195 22 78/52.35% 0.722 WTli26P2L&P9I RLFPNAPYI 74 212 22 86/57. 72% 0.780 WT1126P2L&P9V RLFPNAPYV 75 1415 24 89/59.73% 0. 818 任一資料庫中’推定具有與野生型胜肽（WTll87胜肽或 WTlm胜肽）同等或其以上的結合性之修飾胜肽，與野生型胜肽一起做為其次之（2)至（4)的試驗對象。 (2) 胜肽的藥劑調製與給藥在實施例13合成並冷凍乾燥的胜肽，以DMSOCNacalai Tesque公司製）調製為40mg/ml。之後，將調製好的胜肽 ❹ DMS0液32. 5/z 1與540/z 1的注射用蒸餾水（大塚製藥公司製）混合。繼而將此混合液550/z 1用玻璃注射器與1 的弗氏不完全佐劑（Freund’ s incomplete adjuvant，

Montanide ISA51)混合，做成油中水（water_in_〇il)型乳化物。將30(^ i的該藥劑（油中水乳液）在ημ_α聊工表現的基因轉殖小鼠（品系名HLA-A2+HLA-DR1+/1 α沒。点 &，臟ID號碼ΕΜ:咖3)的尾根部皮下做免疫。每！胜狀使用2或3隻小鼠做評估。 (3) 脾細胞的調製 320827 88 200930402 免疫7日後，將脾臟取出。在玻片的毛玻璃部分磨破之後’以ACK Lysing Buffer(Lonza公司製）做溶血處理，而調製脾細胞。此時以CTM(Complete T-cell Medium， Invitrogen公司製的RpMI-164〇培養基中以最後濃度添加為 10% FBS、10mM HEPES、20mM L-麵酿胺、ImM 丙酮酸納、 lmM MEM非必需胺基酸、丨％ MEM維生素及55以μ 2-巯乙醇）做為培養基，調整脾細胞濃度為5xl06cells/ml。 (4)Elispot法（酶聯免疫斑點法） 0 由以IFNr做為指標的ELISP0T法的實施，評估給藥的胜肽是否具有WT1特異性免疫細胞的誘導活性。方法是遵照附帶的說明書進行。在ELISP0T(日本Becton DiCkins〇n 公司製，型錄號碼551083)的盤上，先將CTM培養基每孔播種50/z 1後’將脾細胞含有液每孔播種ι〇〇//丨（5><1〇5 cells/well)。再將給藥胜肽或野生型胜肽每孔添加5〇以^ (胜肽最終濃度2/zg/mi)。本分析方法是被認為可預測細 ❹胞傷害活性的代替法之一（J.丨舰un〇1〇gical Meth〇ds， 1995， 181， 45-54)。 < _結果〉 WTlm胜肽之修飾胜肽的特異性細胞免疫誘導活性的評估結果，分別示於第19圖至第22圖，WTlm胜肽之修飾胜肽的評估結果，分別示於第23圖至第27圖及第3〇圖至第32圖。f 19圖至帛32圖之各圖中，分別為縱轴表示牌細胞5xl05個中存在的對抗原胜肽特異性反應細胞的數目 (Spots/5xl05cells)，橫軸表示用於評估的小鼠個體（2隻 89 320827 200930402 '或3隻白柱表示在抗原胜肽未刺激之際反應的特異性免疫細胞的數目’灰柱表示對野生型胜肽刺激反應的特異性免疫細胞的數目’黑柱表示對所給藥（改變）胜肽的刺激反應的特異性免疫細胞的數目。第19圖至第32圖的各圖，分別表示以下各胜肽的特異性細胞免疫誘導活性。

第 19 圖 a:WTWPlA胜肽，b:WTl187PlF 胜肽，c:WT1187P1G 胜肽，d : WTlmPlI 胜肽，e : wTImPIL 胜肽，f : WTlmPlM ❹胜肽。

第 20 圖 a:m187PlV胜肽，b:WTlmPlW胜肽，C:WT1187P2I 胜肽，d : WT1187P2M 胜肽，e : WTlmP2Q 胜肽，f : WTlmP2V 胜肽。第 21 圖 a:WTlmP3A 胜肽，b:WTlmP3F 胜肽，c:WTlmP3I 胜肽，d : WTlmP3L 胜肽，e : WT1187P3M 胜肽，f : WTlmP3P 胜肽。第 22 圖 a: WTlu7P3S胜肽，b:WTl187P3V胜肽，c:WTlmP3W 胜肽，d : WTlmP3Y 胜肽，e : WTlmP9L 胜肽。第 23 圖 a:WTlmPlA胜肽，b:WTlmPlF胜肽，c:WTlmPlG 胜肽，d : WTlmPl I 胜肽，e : WTlmPlL 胜肽，f : WT1i26P1M 胜肽。第 24 圖 a:WTli26PlV胜肽，b:WTl126PlW胜肽，c:WT1126P2A 胜肽，d : WT1126P2I 胜肽，6 1：1'1126?21^胜肽，：^¥1'1126?2卩胜肽。

第 25 圖 a:WTli26P2V胜肽，b:WTli26P3A胜肽，c:WT1i26P3G 90 320827 200930402 ' -胜肽，d : WTlmP3I 胜肽，e : WTli26P3L 胜肽，f : WT1126P3M 胜肽。第 26 圖 a:WTlI26P3P胜肽，b:WTl126P3V胜肽，c:WT1126P3W 胜肽，d : WTli26P9A 胜肽，e : WTlmP9I 胜肽，f : WTlmP9M 胜肽。第 27 圖：WT1126P9V 胜肽。第 28 圖 a:WTl187PlD胜肽，b:WTlmPlE胜肽，c:WT1i87P1H 胜肽，d : WTlmPlK胜肽。

❹ 第 29 圖 a:WTlmPlN胜肽，b:WTlmPlP胜肽，c:WTlmPlQ 胜肽，d : WTlmPlR 胜肽，e : WTlmPlT 胜肽。

第 30 圖 a:WTlmPlD胜肽，b:WTlmPlE胜肽，c:WTlmPlH 胜肽，d : WTlmPlK 胜肽，e : WTlmPlN 胜肽，f : WTlmPlP 胜肽。第 31 圖 a:rrimPlQ胜肽，b:WTl126PlS胜肽，c:m126PlT 胜肽，d : WTlrnP2I&P9I 胜肽，e : WTlmP2I&P9V 胜肽，f : ❹ WT1126P2L&P9I 胜肽。第 32 圖 WT1126P2L&P9V 胜肽。由此結果可知，在給藥除WTlmPlD胜肽、WTlmPlE胜肽、rrimPiH胜肽、WTimPip胜肽或wTimP2Q胜肽，或 WTlrnPlD 胜肽、WTlrnPlE 胜肽、WTlmPlP 胜肽、WT1126P2A 胜肽或WTlrnP2Q胜肽之外的修飾胜肽時，顯著地有效率地誘導特異性免疫細胞。其次，由修飾胜肽所誘導的特異性免疫細胞對野生型胜肽的交叉反應性，加以解析（表24至25)。其結果可知， 91 320827 200930402 « • 在WT1187修飾胜肽中之WTlmPlA胜肽、WT1187P1I胜肽、 WTlmPlL 胜肽、WTlmPlM 胜肽、WTlmPlN 胜肽、WTlmPlQ 胜肽、WTlmPlT 胜肽、WTlrnPlV 胜肽、WTlrnP2V 胜肽、 WTlmP2M 胜肽、WT1187P2I 胜肽、WTlmP3A 胜肽、WTlmP3F 胜肽、WTlmP3P胜肽、WTlmP3S胜肽、WTlmP3V胜肽及 WT1187P9L胜肽，WTlrn修飾胜肽中之WTlmPlS胜肽、 WTlmP2I 胜肽、WTh26P2L 胜肽、WT1126P2V 胜肽、WTlmP3W 胜肽、WTlmP9I胜肽、界1'1126?9河胜肽及訂1126?91胜散，特 ® 別可有效率地誘導可辨認修飾胜肽及野生型胜肽二者的特異性免疫細胞。 Ο 92 320827 200930402

【表24】交叉反應性(％) WTlm胜肽的變異體 1位變異體 2位變異體 3位變異體 9位變異體 80-100 WTIibtPIA WTlmPlN WTI187PIQ WTlmPlT WTIibtPIV WT1is7P2V WT1is7P2M WTlrnPlI WT1i8tP3A WT1i8tP3P WT1.87P3S WTli87P9L 60-80 WTlrnPlI WTlrnPlL WTlmPlM WT1is7P3F WT1i8tP3V 40-60 WTlmPlR WTli87P3Y 20-40 WTIistPIF WTlrnPlW WTli87P3L 0-20 WTlrnPlG WTlrnPlK WT1i8tP3I WTli87P3M WTli87P3W ND木 WTlrnPlD WTlrnPlE WTIibtPIH WTIistPIP WTli87P2Q 93 320827 200930402 【表25】

〇〇交叉反應性 (%) WTlm胜肽的變異體 1位變異體 2位變異體 3位變異體 9位變異體 2位及9位變異體 80-100 WTli26P2L WTlmP2V WT1：26P3W WT1i26P9M WTlmP9I 60-80 WTlrnPlS WT1i26P2I WT1126P9V 40-60 WTlizePlA WTlmPlH WTlmPlK WT1.26P1M WTlizePIN 20-40 WTlrnPlG WTlrnPlI WT1.26P1Q WTlmPlW WTli26P9A 0-20 WT1126P1F WT1126P1L WTlmPlT WTlmPlV WTlmP3A WTli26P3G WT1i26P3I WTli26P3L WTli26P3M WTli26P3P WT1i26P3V ffTli26P2I&P9I WTli26P2I&P9V ffTli26P2L&P9I WTli26P2L&P9V _ WT1126P1D WT1126P1E WTlmPlP WT1i26P2Q WTli26P2A ND* :未發現活性，不能測定 94 320827 200930402 •- [產業上的利用可能性] . 本發明的癌疫苗組成物，有用於做為HLA_A*〇2〇6陽性 .者之表現WT1的癌㈣療及預防用醫藥。本發_癌疫苗組成物，也有用於做為HLA-M0201陽性者之表現WT1的癌的治療及預防用醫藥。【圖式簡單說明】第1圖表示由HLA-A*0206陽性健康供血者的pBMCs所得WTlm胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖。3表示對經 ❹51Cr標識的B-LCLs的細胞傷害活性圖。b表示與脈衝至 PBMCs的WTlm胜肽的濃度平行而對經MCr標識的自體 B-LCLs的細胞傷害活性增加的圖。弟2圖表示由HLA-A*0206陽性健康供血者的pbmcs所得WTlm胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖。a及b是由與第1圖a表示的供血者以外的二位不同健康供血者所得 CTLs對經51Cr標識的B-LCLs的細胞傷害活性圖。 Q 第3圖之a表示對於以WT1基因形質轉換的β—LCLs或以空載體（vector)形質轉換的B-LCLs的WTlm胜肽特異牲 CTLs的細胞傷害性圖。b表示對於0206K562細胞、K562 細胞、KH88細胞及JY細胞的WTli87胜肽特異性CTLs的細胞傷害性圖。第4圖表示由HLA class I抗體及HLA class II抗體引起的WTlm胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性的抑制圖。第5圖表示由HLA-A*0206陽性健康供血者的pBMCs的 WT1!26胜肽特異性CTLs之對經51 Cr標識的B-LCLs的細胞傷 95 320827 200930402 ' 害活性圖。第6圖之a及b表示對於0206K562細胞、K562細胞、 KH88細胞及JY細胞的由不同提供者誘導的WTlm胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖。第7圖a至e表不以修飾胜狀刺激HLA-A*0.2 01陽性的提供者1的PBMCs所誘導的CTLs，以WTlm胜肽的四聚體及抗CD8抗體染色之使用流動細胞儀解析的結果圖。第8圖表示以WTlmPlF胜肽刺激HLA-A*0201陽性的 ® 提供者1的PBMCs所謗導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。第9圖a及b表示以WTli26P2L胜肽刺激HLA-A*〇2〇l 陽性的提供者1的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。第10圖表示以WTli26P2L胜肽刺激HLA-A*0201陽性的提供者2的PBMCs所謗導的CTLs，以WTlm胜肽的四聚體 Q 及抗CD8抗體染色之使用流動細胞儀解析的結果圖。第11圖a及b表示以WTl^PSL胜肽刺激提供者2的 PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。第12圖a至c表示以WTlm修飾胜肽刺激提供者3的 PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。第13圖表示以WT1126P9V胜肽刺激HLA-A*0206陽性的提供者3的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。第14圖a至c表示以WTlm修飾胜肽刺激HLA-A*0206 96 320827 200930402 陽性的提供者4的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的 . 測定結果圖。第15圖a至c表示以wTlm修飾胜肽刺激HLA-A*0206 陽性的提供者4的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。. 第W圖a及b表示以WTlm修飾胜肽刺激HLA-A*0201 陽性的提供者的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。第Π圖a及b表示以WTlmPlF修飾胜肽刺激 HLA-A*0206陽性的提供者的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖_。第18圖a及b表示以rn187p2M修飾胜肽刺激 HLA-A*0206陽性的提供者的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。第19圖a至f表示WTI187胜肽的修飾胜狀之特異性細 Q 胞免疫誘導活性的評估結果圖。第20圖a至f表示WTlm胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。第21圖a至f表示WT1 is·?胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。第22圖a至e表示WTlm胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。第23圖a至f表示WTli26胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。 320827 97 200930402 ‘- 第24圖a至f表示WT1126胜肽的修飾胜肽之特異性細 .胞免疫誘導活性的評估結果圖。第25圖a至f表示WTlm胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。第26圖a至f表示WT1126胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。第27圖表示WT1126胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。 ® 第28圖a至d表示WT1187胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。第29圖a至e表示WT1187胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。第3 0圖a至f表示WT1126胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。第31圖a至f表示WT1126胜肽的修飾胜肽之特異性細 Q 胞免疫誘導活性的評估結果圖。第32圖表示WT1126胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。【主要元件符號說明】無 98 320827

Claims

200930402 • 七、申5青專利範圍： 1· 一種人類自血麵減（HLA)_胸施陽性者用癌疫苗組成物，係以含有癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽為特徵。 2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中，該癌抑制基因 wti的基因產物蛋白質，為下列的⑷或⑸的任一種蛋白質。 (a)序列編號1的胺基酸序列 5 (b)在胺基酸序列（a)中，有丨個或數個胺基酸欠缺、置換或附加的胺基酸序列所成，且對（HLa)-a*〇2〇6 陽性者具有免疫原性的蛋白質。 3. 如申請專利範圍第丨項之組成物，其中，該部分胜肽為： WTlm胜肽：Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號2)、 WTlm胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)、 ) WTlmPlF 胜肽：Phe Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val(序列編號11)、 WT1 mP2M 胜狀：Seritet Gly.Glu Gin Gin Tyr Ser Val (序列編號16)、 m187P3M 胜肽：Ser Leu Met Glu Gin Gin Tyr Ser Val (序列編號20)、 WTlmPlF 胜肽：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號34)、 99 320827 200930402 .· WTli2eP2L 胜肽·· Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號39)、 WTlmP3M 胜肽：Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號4 6)、或 WTli2eP9V 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(序列編號4 9) 〇 4.如申請專利範圍第1項或第2項之組成物，復含有佐劑q ❹ 5. 一種人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者用癌疫苗：組成物’係以含有編碼癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的DNA為特徵。 6. —種人類白血球型抗原（HLA)_A*〇2〇6陽性者用癌疫苗組成物，係以含有編碼癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的RNA為特徵。 7. —種WT1特異性CTLs的誘導方法，包含下述步驟：將源自人類白金球型抗原（jjLa)-a*〇206陽性者之週邊血〇液單核球，在癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的存在下培養，由該週邊血液單核球誘導WT1特異性CTLs 〇 8. 一種樹狀細胞的誘導方法，該樹狀細胞係呈現癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽者，該方法包含下述步驟：將源自人類白血球型抗原（HLA)_A邛2〇6陽性者的未成熟樹狀細胞’在癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的存在下培養，由該未成熟樹狀細胞誘導呈現該蛋白質或其部分胜肽的樹狀細胞。 100 320827 200930402 ，- 9. 一種人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者用的癌診 • 斷方法’係包含下述步驟：檢測或定量源自人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者的樣品中之癌抑制基因 WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽、其抗體或wti特異性CIls的步驟，以及其次將該蛋白質或其部分胜肽、其抗體或WTl·特異性CTLs量與癌未發症的情況做比較的步驟；或將經由申請專利範囷第7項的方法所誘導的WT1特異性CTLs或經由申請專利範圍第8項的方〇法所誘導的樹狀細胞’給藥至HLA-A*0206陽性對象的步驟，以及決定在HLA-A*0206陽性對象中該CTLs或樹狀細胞的位置或部位的步驟。 10· —種人類白血球型抗原（HLA)-A*0201陽性者用癌疫苗組成物’係含有下列胜肽為特徵，癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽之 WT1187 胜肽：Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val (序 ❹ 列編號 2).或 WT1126胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對jjla-A*0201陽性者具有免疫原性的胜肽。 11·如申請專利範圍第10項之組成物，其中，該胜肽為： WTlmPlF 胜狀.Phe Leu Gly Giu.Gin Gin Tyr Ser Val (序列編號11)、 WTl 187P2M 胜狀· Ser Met Gly Gin Gin Tyr Ser Val (序列編號16)、 WTli87p3M 胜狀.Ser Leu Met Glu Gin Gin Tyr Ser Val (序 101 320827 200930402 ，· 列編號20)、 • WTlwPlF 胜狀：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號34)、 * ♦ WTlmP2L 胜肽：Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號39)、 WTlmP3M 胜肽：Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序: 列編號46)、或，； WTlmP9V 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (序 ❺ 列編號49)。 12. —種癌的治療或預防方法，係將含有癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的組成物，給藥至人類白血球型抗原（HLA)--A*0206陽性者。 13. —種癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的用途，係用於人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者的癌的治療或預防。 Q 14. 一種癌的治療或預防方法.，係將含有下列胜肽的組成物給藥至人類白血球型抗原（HLA)-A*0206陽性者，癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽之 WT1187 胜肽：SerLeuGly GluGlnGlnTyrSer Val (序列編號 2)或 WTlm胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A*0201陽性者具有免疫原性的胜肽。 15. —種胜肽的用途，係用於人類白血球型抗原（HLA)-A*0206 陽性者的癌的治療或預防，該胜肽為 102 320827 200930402 癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的 WTli87胜肽：861'1^11617 611161116111丁5^861'¥&1(序列編號 2)或 WTlm胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A*0201陽性者具有免疫原性的胜肽。〇〇 103 320827 200930402 序列表 ω〇>癌免疫研究所股份有限公司 <120〉癌疫苗組合物 <Ϊ30> G06F2975 <150> JP2007-314552 <151〉 2007-12-05 <160> 75 <170> Patentln version 3.1 <210〉 1 <211〉 449 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 1 Met Gly Ser Asp Va! Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Va! Pro 15 10 15 〇 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Vai Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Giy Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe lie Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Vai His Phe 85 90 95 Ser Gly Gin Phe Thr Giy Thr Ala Giy Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Afa Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ale Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala lie 130 135 140 Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Vai Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gty Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190 Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220 Asn Leu Tyr Gin Met 了hr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 22S 230 235 240 320827 200930402 Met Asn Leu Giy Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Giy Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro lie Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg lie 275 280 285 His Thr His Gly Val Phe Arg Gly lie Gin Asp Val Arg Arg Val Pro 290 2S5 300 Giy Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Giu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 ❹ Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Giy Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gin 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gin Ar? Lys Phe Ser Arg Ser A^p His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Giy Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys (〇rs Phe Ala Arg Ser Asp Glu Uu Val 420 425 430 Arg His His Asn llet His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala 435 440 445 Leu <210〉 2 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 2 Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 3 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 2 320827 200930402 <400> 3 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210〉 4 <Z11> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <4〇0> 4 Gly Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 5 <211> 9 <212〉 PRT 〈213〉人造

<220> <223〉合成胜肽 <400> 5 Al丨 Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 6 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400〉 6 Val Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210〉 7 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 7 Leu Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210〉 8 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <2Z0> <223〉合成胜肽 <400> 8 lie Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210〉 9 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 3 320827 200930402 <220> <223〉合成胜肽 <400> 9 Met Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <Z10> 10 <211〉 9 <212> PRT <213〉人造〈220〉 <223>合成胜肽 <400〉 10 Trp Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val

<210> 11 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 11 Phe Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <Z10> 12 <Z11> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 12 Tyr Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 13 <2U> 9 〈212〉 PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 13 Ser Val Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 14 <211〉 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <Z23>合成胜肽 <400> 14 Ser Gin Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val 4 320827 200930402 <210〉 15 <211> 9 <Z1Z> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 15 Ser lie Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <Z20> <223〉合成胜肽 <400> 16 Ser Met Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val ❹ 1 5 <210> 17 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人造 <2Z0> <223〉合成胜肽 <400> 17 Ser Leu Leu Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210〉 18 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 18

<210> 19 <211> 9 <21Z> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成肚肽 <400〉 19 Ser Leu Val Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 20 <211> 9 <Z12> PRT <213〉人造 <2Z0> <223〉合成胜肽 <400> 20 5 320827 200930402 Ser Leu Met Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210〉 21 <211> 9 <212> PRT <Z13>人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 21 Ser Leu Pro Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <220>

<223〉合成胜肽 <400> 22 Ser Leu Trp Glu Gin Gin Tyr Ser Vai <210〉 23 <211〉 9 <Z12> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 23 Ser Leu Phe Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210〉 24 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 24 Ser Leu Tyr Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 25 <211〉9. <212〉 PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 25 Ser Leu Ser Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 26 <2J1> 9 <212> PRT <213>人造 6 320827 <220> 200930402 <223〉合成胜肽 <400> 26 Ser Leu lie Giu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 27 <211〉 9 <2J2> PRT <213〉人造 <ZZ0> <223〉合成胜肽 <400> 27 Gly Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu

<210> 28 <211> 9 <21Z> PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <4O0> 28 Ala Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 29 <211〉 9 <Z12> PRT <213〉人造 <Z20> <2«>合成胜肽 <400> 29 Val Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210> 30 <211〉 9 <21 Z> PRT <213〉人造 <220> <223>合成胜肽 <400> 30 Leu Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210> 31 <211〉 9 <Z12> PRT <2U>人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 31 lie Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210〉 32 <211〉 9 7 320827 200930402 <212> PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 32 Met Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <21〇> 33 <211〉 9 <21Z> PRT <2Π>人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 33 Trp Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu

<210> 34 <211> 9 <212〉 PRT <2U>人造 <22 0> <223〉合成胜肽 <400> 34 Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210> 35 <Z11> 9 <212> PRT <213>人造 <220> <2Z3>合成胜肽 <400> 35 Tyr llet Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210> 36 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400〉 36 Arg Val Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210> 37 <Z11> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 37 Arg Gin Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 8 320827 200930402 <210> 38 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 38 Arg Ala Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210〉 39 <Z11> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 39

Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <Z20> <223〉合成胜肽 <400> 40 Arg lie Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210〉41 <Z11> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 41 Arg Met lie Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <Z10> 42 <211> 9 <21Z> PRT <213〉人造 <Z20> <223〉合成胜肽 <400> 42 Arg Met Leu Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 〈210〉 43 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <2Z0> <2Z3>合成胜肽 9 320827 200930402 <400> 43 Arg Bet Gly Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210〉 44 <Z11> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 44 Arg Met Ala Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213〉人造

〈220〉 <223〉合成胜肽 <400> 45 Arg Met Val Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <Z10> 46 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400〉 46 Arg list Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210> 47 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <ZZ0> <2Z3>合成胜肽 <400> 47 Are Het Pro Pro Asn AIb Pro Tyr Leu <210> 48 <211> 9 <212〉. PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 48 Arg Het Trp Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <Z10> 49 <211〉 9 <212〉 PRT <2Π>人造 10 320827 200930402 <Z20> <223〉合成胜肽 <400> 49 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val <210> 50 <Z11> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 50 Arg Het Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Ala

<210> 51 <2I1> 9 <Z12> PRT <213〉人造 <Z20> <223〉合成胜肽 <400> 51 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr lie <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 52 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Het <210> 53 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉：人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 53 Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Leu <Z10> 54 <211〉 9 <21Z> PRT <2Π>人造 <220> <223〉合成胜肽 <400〉 54 Asp Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val 11 320827 200930402 <Z10> 55 <211〉 9 <Z1Z> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400〉 55 Glu Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 56 <2I1> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 56 His Leu Gfy Glu Gin Gin Tyr Ser Val 〇 1 5 <210> 57 <2I1> 9 <21Z> PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 57 Lys Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210〉 58 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <Z20> <223〉合成胜肽 <400〉 S8

<210> 59 <211> 9 <Z12> PRT «13〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <40〇> 59 Pro Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210〉 60 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <Z20> 〈223>合成胜肽 <400> 60 12 320827 200930402 Gin Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Va! <210> 61 <211> 9 <Z12> PRT <213〉人造 <2Z0> <223>合成胜肽 <400> 61 Arg Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 62 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人造 <Z20> <223〉合成胜肽 <400〉 62 Thr Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val <210> 63 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400〉 63 Asp Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 64 <210 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223>合成胜肽 <400> 64 Glu Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 5RTa 6 9 F A 012 3 1— t— i— ij 2222 <220> <223〉合成胜肽 <400> 65 His Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 6RT^ 6 9 p人 »» > 0 12 3 o en 11 1— 1— 22 22 2 13 320827 200930402 <223〉合成胜肽 <400> 66 Lys Met Phe Pro Asri Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <220> <223〉合成胜肽 <400〉 67 Asn Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu

<210> 68 <2Π> 9 <212> PRT <213〉人造 <2Z0> <223〉合成胜肽 <4O0> 68 Pro Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210〉 69 <2U> 9 <212> PRT <2U>人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 69 Gin Uet Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210> 70 <Z11> 9 <212> PRT <213>人造 <Z20> <223〉合成胜肽 <400> 70 Ser Met Phe Pro Asn Ata Pro Tyr Leu <2I0> 71 <211> 9 <212> PRT <213〉人造 <2Z0> <223〉合成胜肽 <400> 71 Thr Uet Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu <210〉 72 <21!> 9 14 320827 200930402 <212〉 PRT <213〉人造 <220> <Z23>合成胜肽 <400> 72 Arg lie Phe Pro Asn Ala Pro Tyr lie <210> 73 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400> 73

Arg lie Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val <Z10> 74 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造 <220〉 <223〉合成胜肽 <400〉 74 Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr lie <210> 75 <211> 9 <212〉 PRT <2U>人造 <220> <223〉合成胜肽 <400> 75 Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val 15 320827