TW200928364A - Microfluidic platforms for multi-target detection - Google Patents

Description

200928364 九、發明說明： 相關申請案 本申請案主張2007年10月9曰申請之標題為 ^Nano-Bead Electrokinetics: Enabling Microfluidic Platform for Rapid Multi-Target Detection”之美國臨時專利申請案第 60/978,544號及2008年5月15日申請之標題為“Rapid， Mismatch-Free and Strong Hybridization Technique for High-Throughput Genetic Surface Assays” 之美國臨時專利 © 申請案第61/127,812號的優先權，該兩者據此以全文引用 之方式併入本文中。 【發明所屬之技術領域】 本揭示案大體而言係關於微流體裝置，且更詳言之， 係關於用於多標靶偵測之微流體晶片。 背景 【先前技術】 診斷檢定為可用於偵測及鑑別病原體（例如，有害細 菌、病毒、有機體等）及/或患病細胞之生物化學技術。一 種已知診斷檢定包括使用聚合酶鏈反應（PCR)，pCR使用 DNA聚合酶藉由活體外酶促複製而擴增一段dna，亦即標 乾DNA。PCR能夠快速擴增最初以極小濃度存在之dNA序 歹J最終產生數百萬相同的DNA分子，且因此指數增加對 相應DNA序列/標靶之偵測靈敏度。 5 200928364 一些診斷檢定亦包括選擇性捕獲偵測標靶，諸如擴增 DNA序列、生物標記分子、病原體及/或其他標靶自大樣 本中移出標靶且使標靶與分子探針對接。可用不同技術偵 測經對接標靶，該等技術包括基於螢光標記或發射、拉曼 及IR或UV光譜學之光學感應器技術。 該等診斷檢定通常在醫學診斷實驗室中用於遺傳診斷 技術中。另外，食品雜貨店使用診斷檢定（諸如酶聯免疫 吸附檢疋）偵測新鮮產品中之細菌，諸如大腸桿菌（E · Coli)。雖然該等技術適用於細菌偵測或其他、生物 標記或其他標靶之偵測，但其通常受昂貴且笨重之實驗室 設備束缚，通常需要增加人工管理及處理，且需要數天或 更久來產生結果（例如，TB細菌需要一週來培養）。 亦可購得搞帶型PCR套組；然而，該等檢定具有至少 -小時長之回應時間，此對攜帶型現場使用裝置或高生產 量生物標記筛選而言通常太長。另外，習知檢定套組亦使 肖低生產量分批格式進行單標_測，祕式具有低標把 計數及不可靠靈敏度。 詳細敘述 【發明内容】 *丨野谓測一或多個標靶，諸 如病原體及/或患病細胞。例示方法包括將包括第一標把之 樣本置於微流録置中及使複數個第—神之複本與複數 個奈米結構雜交。例示方法包括向複數個奈米結構施加交 6 200928364 流電流及使用由電流產生之電場捕集及移動奈米結構。捕 集使得樣本通過奈米結構快速流動，從而使得自超過例如 100微升之樣本溶液中捕獲標靶。隨後將奈米結構分顏及評 估以確定是否存在第一標靶，此可包括（例如）確定標靶 之數量。 此外，樣本流動由例如機械注射泵、手動驅動注射泵、 微泵及/或其他合適裝置提供之外部或内部施加壓力所驅 動。壓力驅動連續流動允許取樣大體積樣本並防止通道及 孔被碎片堵塞，且因此為高生產量攜帶型裝置所希望。因 此，本文中所述之例示方法及系統之分類及捕集及其他態 樣係在壓力下工作，且因此可防阻塞物、碎片及/或其他障 礙物。換言之，增壓的存在並不阻礙本文中所述之例示方 法或系統的操作。 充當標靶偵測器單元之例示裝置包括置放第一標靶之 樣本的微流趙裝置入口及使複數個第一標乾之複本與複數 ❹個奈米結構對接的雜交腔室。另外，例示裝置包括集中奈 米、’、σ構之集中器、將奈米結構分類之分類器及收集經分類 的奈米結構之阱。 另一偵測標靶之例示方法包括獲得包括標靶之樣本及 t製樣本中之標靶以產生擴增混合物。該例示方法包括使 ^米結構與腔室耦合及使分子探針官能化於奈米結構。例 方法包括使擴增混合物流過奈米結構以使擴增混合物中 =標乾雜交》雜交產率及速率兩者均因存在交流或直流電 而增強。X ’由任何合適偵測裝置及/或方法偵測標把是 7 200928364 否存在。 另一例示標勒•债測器包括複製標乾以產生擴增混合物 的複製腔室及含有分子探針官能化於其上之奈米結構的微 流體腔室《例示標靶摘測器亦包括保持奈米結構於微流體 腔室中的過濾器、擴增混合物藉以流經奈米結構以使擴增 混合物中之標靶雜交的通道及確定標靶是否存在的偵測 器。 偵測複數個標靶之另一例示方法包括將包括一或多個 標靶之樣本插入微流體裝置中，保持標靶於貯槽中，使標 靶通過至複數個偵測管及使標靶雜交。例示方法亦包括由 任何合適偵測裝置及/或方法偵測標靶是否存在。 用於偵測多標靶之又一例示標靶偵測器包括用於接受

匕括或多個標乾之樣本於微流體裝置中之注射小孔、保 持標靶之貯槽、複數個與貯槽連通地耦合之偵測管及一於 複數個㈣管中之雜交腔室。其他替代性例示標㈣測裝 置類似地包括用以偵測標靶是否存在之偵測器。 尽文中所述之例 ▼S W 巴拓目思耆及/或 用於例如國防、國土或國家安全、醫學、％究、環境、程 ^控制應用或任何其他合適用途之測試環境中獲得樣本。 一些樣本在進行其他測試之前可能需要預處理。預處理可 匕括（例如）過濾、用化學試劑沈澱及/或分解物理 :化學抑制劑以在物理上、化學上或其他方面自樣本中移 除碎片及/或抑制劑。在-些實施例中，預處理亦可包括若 干其他不同程序。 200928364 向樣本中添加分子偵測標靶。分子偵測標靶可包括（例 如）生物標記或基因。一些例示生物標記包括生物小泡、 肽及/或其他非DNA分子。基因包括DNA及/或尺1^人鏈。 在些實施例中’若標靶包括基因，則可使用pcR複製/擴 增樣本中DNA及/或RNA鏈之數目。 使價測標乾與官能化（亦即，化學上附著）於奈米結 構上之互補分子探針雜交（亦即，對接）。藉由存在諸如 由c =流產生之電場之電場可促進標靶雜交於奈米結構 上電場之存在大大減少雜交所需之時間量。在一些實施 例中，雜交可發生在將镇測標乾引入奈米結構時的約ι秒 ❹

以内。減少雜交時間對高生產量攜帶型裝置有益。例示奈 米結構包括奈米碳管（CNT)、奈㈣粒、奈轉、奈米膠 體、奈米粒子、奈米桿、量子點、奈米晶體、脂質體、二 氧化石夕珠粒、乳膠珠粒、金㈣及/或尺寸在次微米級（亦 即小於1微米）之具有任何其他幾何形狀的其他結構。 可官能化奈米結構之分子探針可包括（例如）纟聚物、探 針、螢光團、㈣、鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素或使微米 :構變我水之其他合適分子探針1料时米結構之 每一種作為分子探針存在*同優點。舉例而言，具有均一 j之乳膠粒子谷易合成，而用不同化學品及分子探針官 能化二氧切奈米珠粒已f規彳卜探針及㈣團與加之 連接亦相對㈣單。奈米線允許較容易地編碼（例如，在 不同奈米線上添加螢光染料及，或其他記號），且⑶ 較佳特隸，因為因靜電相互作用所致，分子不會任意地 9 200928364 吸附於CNT上^ CNT之電導率亦對分子雜交敏感，使得標 靶雜交事件產生大電阻抗信號。此外，不同馨 ^ J龙"：¾聚料可相 繼連接於膠體、脂質體或奈米線上以提供勞光條碼或如 文中所說明之其他記號。 【實施方式】 如下文更詳細地描述，存在可雜交偵測標靶之不同方 〇 S。舉例而言，基因可經由氫鍵與互補分子探針（例如， 亦為DNA之寡核苷酸）雜交。若使用生物標記作為偵測標 粗’則生物標記與奈米結構對接。因&，雜交發生在生物 標記分子與奈米結構上之互補分子之間。在生物標記為分 子之實施例中，雜交將發生在生物標記本身與奈米結構上 之互補分子之間。該雜交包括氫鍵或任何其他合適化學及/ 或物理鍵結機制。另一例示雜交包括如下文詳述 - 鏈霉抗生物素蛋白。 〇 可以不同方式偵測偵測標靶。舉例而言，在一些實施 .2中向對接奈米結構施加介電泳（DEP)讀奈米結構經 士電場從而將奈米結構移動形成不同圖案及/或量測含奈米 構之/合液之阻抗。在其他實施例中，偵測藉由光學觀察 進:如）含奈米結構之溶液之螢光性質（例如，強度）而 „ '在另實施例中，可採用對螢光與阻抗兩者的量測 及/或觀察。 整人、種可用於須測標乾之例示診斷套組或須測裝置包括 、連續流動的介電泳晶片。基於包括使用AC電場賦予 200928364 粒子力之DEP之微米/奈米結構晶片操縱奈米結構以使微流 體曰曰片偵測及識別標靶。特定而言，DEp指在電場梯度影 響I遷移粒子（其不需帶電）。當暴露於不均勻電場下時， 電場在每一個別奈米結構上感應粒子偶極。奈米結構經歷 ^丨起受控遷移之淨力，視朝高場區遷移或是遷移遠離高場 區而定，描述該力為正DEp(p_DEp)或負DEp(n_DEP)。

隨所施加之頻率增加，大多數奈米結構將自p-DEP轉變為 n-DEP。奈米結構轉變之點為“交越（cr〇ss〇ver)”點。利用 奈米結構之間# “交越”頻率之差異提供了快速賦予不同 奈米結構不同粒子力（諸如不同方向之力）之方式。 _奈米結構之方向可藉由分子對接反轉。舉例而 °對接改變g忐化奈米結構之表面電導率及有效大小， 而此可改變在不均勻AC電場下奈米結構之感應偶極矩。因 此，視是否已發生對接/雜交而定，奈米結構在不均勻Μ 電場下組合成明顯不同之圖案。 舉例而言，圖1A-F展示四極電極附近之奈米結構懸浮 液在圓1A-C中奈米結構懸浮液未對接而在圖Dp中已 對接。另外，® ^ 10展示在鳩KHz頻率下之奈紗 構懸浮液，圖m1E展示，KHz頻率下之奈米結構懸 浮液，且圖 1C 及 + 0 1 lV/rir ^ 展不2.1 MHz頻率下之奈米結構懸浮 液。如圖1A-F中所示，有及無職寡聚物雜交（亦即， 對接及未對接）之奈米結構懸浮液在不同AC頻率下展現明 顯不同之圖案。可使用該等圊案快速識別雜交，而 記或標籤試劑。偵測可用攜帶型光學顯微鏡代替共焦鸯： 200928364 顯微鏡來進行。雜交 (方即’偵測標靶與奈米結構之結合） 越月.4且雜交越多，則原始樣本存在越多的標乾，且因此 在患者或環境t存在越多的㈣，其可提供關於例如國 防、國土或國家安全、魅風 醫學、研究、環境、程序控制應用 或任何其他合適用途之有用信息。 因為奈米結構在電場下移動，所以可使用力方向之差 異，分離及將奈米結構分類，或在一些實施例中，如下文 ❾^詳述，保持奈米結構在適#位置。另外，不同於細胞計 ’ DEP分類在分類之前並不需要識別奈米結構。該技術 了應用於DNA-寡聚物雜交、蛋白質_腿、抗體-抗原（例 二如下文論述之生物素_鏈霉抗生物素蛋白）&包括表面 ^化奈米結構之其他分子對接檢定，而無需標記或其他 武劑。 另外，奈米結構之二元、三元或四元懸浮液可 二多標…貞測之甚至更豐富之圖案譜。具有例如不同幾 〇 &構及大小之奈米結構之懸浮液亦會造成複雜性。最 用生物統計整合，可產生大的圖案庫。能夠存取圖案 將促進如本文中所詳述的藉由比較所觀察到之圖案與已 圖案以確定是否存在_或多個標把的標乾债測。 極易2中所述之例示DEP晶片（如電動流動控制組件） ，因為僅需要微電池及微變壓器。因為芯片上光 :::經電子控制’所以隨後可用最少的致動器及感應 ，整個裝置/芯片之完全整合電子監控結構。另外，保 、機械移動部分在最少限度。舉例來說，在-些實施例中， 12 200928364 僅有的機械移動部分為數個球閥。減少機械移動部分之數 目將降低芯片製造成本。此外，反饋控制及自動化可用龄 控微電路結構實施。 现 圖2展示允許無感應器奈米結構分類及識別之例示整 合多路連續流動DEP分類裝置/芯片2〇〇β在該實施例中， 芯片200包括三個不同的連續〇ΕΡ組件且可以例如每秒約 100個奈米結構之速度將三個不同奈米結構分類至三個不 同通道中。芯片200及任何周圍裝置可為手持式、抛棄式 ® 且以諸如小於約1 ·00美元之低價製造。經分類奈米結構可 由每一通道内之DEP阱捕獲而無需使用微過濾器。隨後可 用芯片上或芯片外感應器及偵測器進一步探測所聚集之奈 米結構。亦可例如藉由量測一或多個捕集電極之阻抗來計 數奈米結構。 另外，一或多個例示芯片200可串聯或並聯且以模組 化方式使用以實現大規模平行篩選。該模組化形式促進擴 ❹ 大規模來適應藉由大量不同標靶的樣本探測。該組態亦可 允許支流及再循環流。 例示整合DEP芯片模組200之不同組件利用在產生高 電場之微電極組件附近不同奈米結構在不同方向上所經歷 之不同粒子力。如上所述，例示芯片200在粗ΒΕΡ碎片過 濾器210(如上所述，其可用於預處理樣本）下游包括三個 階段/由三個階段組成。第一階段220為在所有粒子之n_DEp 區操作之集中單元。集中階段220包括電極222之兩個側 陣列’其中間隙寬度遞減且頻率比大多數奈米結構之交越 13 200928364 頻率高。間隙224之遞減縫隙將連續流中大體上所有的夺 米結構集中於通道中間的小於約（例如）1〇微米寬之區中。 所集中之奈米結構形成直線型單行佇列，且隨後可在下游 被個別地詢問。第二單元230包括三個DEp分類器232, 每-者由位於上基材之傾斜電極及位於底部之鏡像電極 (未圖示）組成。電極對之間的間隙維持將排斥η·奈 米結構而允許Ρ·卿奈米結構穿過之高電埸，從而實現該 ❹ ❹ 等奈米結構之分離UEP冑米結構沿傾斜電極對移動且 隨後以不同於P-DEP奈米結構之流線234a_d釋放於下一分 類器中。奈米結構因此在分類單元23〇後可佔據四條可能 的流線234a-d:原始集中流線加穿過三個分類器加之尖 端之流線。該等流線234a_d隨後可饋入四個不同通道以 ::考慮圖2之實施例中所示之集中單元22〇之解析度， 量操作條件下僅使用三個分類通道236。藉由在不 使用不同頻率’可將三種不同奈米結構分類於三 $獨立的通道中。在最後階段中，製造3_〇牌24()以捕獲 通道中之所有奈米結構，同時溶液流經間 的流體動力阻力。 叩热頻汁 “當大規模並聯或串聯時，該連續流動芯片200允許高 的分：筛=鐵分類而無需使用引入明顯的流艘動力阻力 率，整入遽器。藉由使用對某些奈米結構特異的頻 特異性：：捕集232及味240提供比分子奈米筛高得多的 構的數目處之阻抗量測可估算所捕集之奈米結 J奈米結構之例示捕集見於圖3中。在該實 200928364 施例中，在約每秒1 〇〇個粒子下，對於二元分離可實現約 80/°刀離效率。因此，兩個或三個串聯模組可實現約99%的 純度。 藉由將具有對接抗原之奈米結構（或雜交遺傳奈米結 構）分類與未對接奈米結構，以上單元提供用不同奈米结 構而無需（或外加）光學感應或螢光標記的連續流動的多 “靶偵測的簡單方法。對接奈米結構具有與未對接奈米結 構明顯不同的DEP遷移率及/或交越頻率。DEP遷移率為大 小敏感的，且雖然較小奈米結構可能對分子錨固dna標靶 更敏感但（例如）奈米結構不能太小，否則遷移率將變 得可忽略不計。最佳大小可在約5〇11111與5〇〇nm之間，此 將產生例如同達約1 00 ^m/s之DEp速度。因為DEp遷移率 為大小敏感的，與對接分子尺寸相同之奈米結構應具有不 同DEP遷移率。同時，DNA為導電分子，且其對接可相對 於緩衝溶液之導電率顯著增加小奈米結構之粒子導電率。 舉例而言，® 4展示隨著導電率增加，不同大小之奈米結 構之交越頻率之間的差異不成比例地增加。舉例而言對 於低於約1 mS/m之導電率，兩種大小比率為約6之奈米結 構可具有僅約5倍不同的交越頻率。在較高導電率下兩 種奈米結構之間的交越頻率可能相差約兩個數量級。 圖5展示奈米結構之極的例示傳導充電。如由各極處 高得多的螢光強度顯而易見，在每一半週期帶電螢光染料 積聚在相反極處且增加其濃度（例如，約6個數量級） 雙層之相同的正常充電、切向遷移及極聚集機制可將帶負 15 200928364 聚焦在奈米結構之-極處。該等對接dna分 改變極處之後續導電極化且影響奈米結構之交越頻 此’雜交及未雜交奈米結構懸浮液在相 圖案（參見圓1A-F)。因此，歸 展現不同 歸因於雙層效應，對 對接奈米結構之間的交越頻率存在差異，i DEp 、 可有效刀類該兩種奈米結構而無需感應器。 ❹

另外’如本文中所詳述，奈米結構之幾何形狀及材料、 緩衝液之電容率、導電率及離子價數及奈米結構·奈米結構 相互作用均影響奈米結構之DEp特性並影響分類。在所說 明之實施例中’探# 232之長度影響發生交越時的頻率。 一些諸如（例如）CNT及細長奈米線之奈米結構具有高得多 的DEP遷移率（歸因於細長幾何形狀之場集中）、更具選 擇性的分子捕獲、可忽略的染料吸附，且因此對一些例示 DEP晶片而言，可為較佳奈米結構。另外’ cnt及細長奈 米線亦相對易於編條碼。實際上，CNT比奈米球體更易與 、’、田菌對接，且對接CNT實際上可增強聚集體之DEp且成為 標把（例如病原體）之DEP轉運體。 另外’在例如兩性離子、離子液體及其他添加劑改變 "質電容率及導電率之情形下，可能需要實施緩衝液調節。 圖ό展示另一例示快速標靶偵測裝置6〇〇的方框圖， 其用以偵測患者、環境中的細菌、病毒及其他有害物質或 者例如監測超出傳統DNA微陣列或即時PCR之能力的流行 病、恐怖主義、生物戰等。例示快速標靶偵測裝置6〇〇包 括基於利用鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白及生物素之特 16 200928364 異性及強結合性質之修改PCR方法的偵測技術及定製微流 體製造技術。鏈霉抗生物素蛋白為自細菌親和素鏈黴菌 (•SVra/owyce·? )純化之四聚蛋白質且生物素 (C1()H16N203S)(亦稱為維生素η或b7)為水可溶性B_ 複合維生素。鏈霉抗生物素蛋白對生物素具有格外強的親 和力，生物素·鏈霉抗生物素蛋白複合物之解離常數為約 10_15 mol/L，列為最強的已知非共價相互作用之一。因此， 可使用強鏈霉抗生物素蛋白_生物素鍵使不同生物分子彼此 ^ 附著或使不同生物分子附著於固體支撐物（例如，奈米結 構）以促進如本文中所述偵測不同生物分子。 在PCR方案期間’向具有樣本/標把DNA 608之PCR 腔室606中添加兩種經不同標記之引子：一種經生物素標 記602且另一種經螢光標記6〇4，且使用該兩種引子擴增所 關注之標靶物種之DNA以擴大樣本中單鏈DNA ( ssDNA ) 的量。因此’擴增標靶DNA 610經由雙鍵DNA ( dsDNA) 之一端附著於生物素基團且另一端附著於螢光標記染料。 鍵霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白可官能化於裝置/芯 片通道上或芯片中所含之奈米/微米珠粒、磁性奈米粒子、 奈米碳管、奈米線、奈米桿及/或其他奈米結構（展示於本 文中之其他實施例中）上。為實現PCR產物之快速偵測， 隨後藉由例如使擴增DNA 610穿過微流體芯片614中之通 道612内所捕集之經鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白官能 化之奈米結構而使擴增sdDNA暴露於經鏈霉抗生物素蛋白 /抗生物素蛋白官能化之奈米結構中，以經受生物素與鏈霉 17 200928364 抗生物素蛋白或生物素與抗生物素蛋白之間的強相互作 用。使經生物素標記擴增DNA 610穿過通道612内所捕集 之奈米結構會減小擴散長度且因此允許快速與附著於奈米 結構表面之鏈霉抗生物素蛋白相互作用。僅螢光標記的經 生物素標記dsDNA被特異、快速且強有力地附著於奈米結 構表面。 由於強鍵，因此相互作用動力學極快，且奈米結構晶 片顯著減少傳輸時間。此外，使用奈米結構亦為生物素與 鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白部分之相互作用提供較高 表面積，且因此增強偵測靈敏度。生物素鏈霉抗生物素蛋 白/抗生物素蛋白結合比募核苷酸_DNA雙鏈形成更具特異 性且為大樣本提供更穩定且更精確的檢定。另外，在高流 速大生產量芯片中強雜交尤其有利，其中流體動力學剪切 力通常扯掉弱雜交DNAe另外，由於強且特異性的結合， 因此雜交步驟後可緊接著沖洗緩衝液以移除所有未附著之 螢光染料分子608。 最後，可藉由量測奈米結構之榮光強度實現谓測。另 外，使用具有高電導率之官能化破奈米結構亦促進使用阻 抗量測來如本文中所述快速偵測擴增產物而無需光 器。 圖7-11展示用於遺傳識別單個標靶之另—例示以奈米 結構為基礎的雜交晶片。圖7展示形成含有奈米結構不704 之腔室702之微流體通道7〇〇的一部分，雖然在所說明之 實施例中，奈米結# 704以探針官能化的二氧切珠粒展 18 200928364 示 ，但可使用任何合適的奈米結構。藉由穿過 4χ標準檸檬酸鹽生理 ^如） 王埋鹽水（standard saline咖价， 雜交緩衝溶液之緩衡滚_ &、奋+ 液適备捕集及封裝探針官能化奈米 、'Ό構（例如’二氧切珠粒）。成功封裝奈米結構704後， ，例之溫度下以例如㈣5錢之流速使諸如1〇〇 微升1之經生物素標記ssDNA寫通過封裝腔室㈣以與 官能化於奈米結構（例如，二氧切）表面上之互補募聚

物雜交。使DNA 706通過封裝腔室7〇2減小標無dna與奈 米結構704表面上之寡聚物探針之間的間距，且因此減少 雜交時間。另夕卜’該奈米結構系統為雜交提供大得多的表 面積’從而增強偵測靈敏度。 可添加諸如純水或去離子水之洗滌溶液或其他液體以 洗滌未雜交的DNA或與奈米結構7〇4之表面或與腔室7〇2 之過濾器（如下文所述）結合的非特異性DNA。另外，雜 交偵測可藉由添加鏈霉抗生物素蛋白結合螢光染料7〇8，從 而利用強鏈霉抗生物素蛋白-生物素結合反應來實現。隨後 例如用麟酸鹽緩衝生理鹽水（pBS )緩衝溶液自通道洗滌過 量染料708 ’且量測及/或觀察螢光71〇之圖案及/或強度。 當使DNA 706通過通道700被視為偵測起點時，則在該實 施例中’偵測時間可為約2至3小時，且偵測靈敏度如下 文所述在約ΙΟΟρΜ-ηΜ範圍内。 本文中所述之例示以奈米結構為基礎的偵測技術包括 複數個組件’包括（例如i )在載玻片8〇〇上製造微通 道7〇〇 (圖8 )’（ ϋ )使用甲基丙烯酸酯光聚合物的混合 19 200928364 物在微通道700内製造過濾器（圖9)，（出）官能化募聚 物探針於奈米結構（例如，二氧化矽珠粒）上（圖ι〇)， (1V )不對稱PCR，及最後藉由使標靶DNA溶液通過裝置/ 〇片内之封裝奈米結構微通道而成功執行雜交（圖7)。如 上所述，藉由存在諸如由AC電流產生之電場之電場可促進 在奈米結構上雜交標靶，電場之存在大大減少雜交所需之 時間量。在一些實施例中，雜交可發生在將偵測標靶引入 _ 奈米結構時約i秒内。雜交時間減少對高生產量攜帶型裝 置有益。 圖8展現在載玻片800上製造微通道7〇〇β鑽孔通道 700之入口及出口 802。將遮罩布局8〇4與載玻片8〇〇組合， 且使間隔物墊片806耦合於蓋玻片808,向蓋玻片8〇8添加 可例如用UV能量烘焙約5秒之υν可固化膠（諸如L〇cUte⑧ 363膠）以耦合元件。隨後用諸如丙酮及甲醇之溶劑清洗通 道700，且可能存在最後的υν烘焙，例如歷時兩分半鐘。 泛藉由使用甲基丙烯酸酯光聚合物（單體）的混合物以 及甲苯及異丁醇（孔原（P〇r〇gen))的混合物在微通道7〇〇 内進行過濾器900之製造（圖9) »藉由改變單體與孔原之 比率’可操縱過濾器900之孔徑。在一些實施例中，孔徑 為約2微米之過濾器係用於大小為約微米之奈米結構。 另外’遮罩係亦經組合且使該組合經UV烘焙例如約1分 鐘。烘焙後’移除遮罩，且用甲醇沖洗通道700例如約2 小時。整合UV烘焙（亦即，固化聚合法）用於微通道7〇〇 製造過程與微過濾器900製造過程中以使得過濾器9〇〇能 20 200928364 夠與微通道700強有力結合。 在I實施例中’奈来結構官能化、PCR設計及雜交镇 測可使用任何'所有或部分上述實施例進行。更詳言之， 在本文中所述之實施例中，使胺接合27，er募聚物探針藉 由與水可溶性碳二醯亞胺（EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) _合而官能化於奈米結構（例如，缓基化二氧切 珠粒）上。該組合之實施例說明於圖1〇中。 #在-些實施例中，為使以奈米結構為基礎的雜交晶片 更簡單且為避免標靶職變性(因為變性MB·在到達及 與捕集於微通道内之探針官能化奈米結構相互作用之前將 重組在—起）’進行不對稱pCR來產生單鏈DNA。在該方 法中使用不等濃度之引子（與例如正常對稱相反）。 最初，擴增按指數開始，但隨著較低濃度之引子耗盡較 高濃度之引子繼續擴增以產生單鏈DNA。 在該實施例中，在向通道702添加奈米結構704之前， 可使諸如2/。血清牛白蛋白（BSA)溶液之溶液通過微通道 700以防止標靶DNA 7〇6及螢光染料與過濾器_及 通道700表面之任何非特異性結合。 圖Π為整合且'揭帶型PCR偵測芯片8〇〇之更詳細的示 意圖。展示過濾器900於芯片8〇〇上部之通道7〇〇中。囷 7-11中所示之實施例可在例如3〇分鐘内進行單標靶偵測， 其中大部分時間用於PCR循環。如圖u中可見，來自捕集 奈米結構706之螢光信號可用無共焦部件之攜帶型數位相 機容易地拍攝。該拋棄式芯片8〇〇含有芯片上泵及閥以及 21 200928364 一極管感應器。因此，芯片8〇〇為自持式攜帶型遣傳識別 裝置/套組。 就偵測而S ’歸因於每單位體積寡聚物官能化的奈米 …構的大表面積’尺寸為數毫米之微貯槽可捕獲1立方公 刀體積樣本中之所有標靶DNA ,靈敏度為皮莫耳 (picomolar)。然而’因為所有螢光分子均聚集在1微升體積 内’所以發光強度極高。作為參考，DNA微陣列上之單個 Q 像素（例如’圖15_17)具有1〇-2 cm2之面積，且1微升微 珠（50體積％ )之面積高四個數量級，同時螢光強度成比 例增大。在該增強下’可取消雷射激發及共焦偵測。如本 文中所不，具有數位相機、二極管感應器或ccd相機之簡 單光學過遽器可適用於正負識別。快速且攜帶型正負診斷 法作為初步篩選步驟具有許多重要現場使用應用：港口 /機 場之流行病控制、家禽進口之禽流感監測、環境監測等。 圖12-19展示可用作具有整合pCR/偵測單元之多標靶 φ DNA偵測單元之其他例示實施。圖12_19中所示之實施例 可擴展為具有甚至更高的生產量的連續流動格式。 所展不之實施例使用阻抗偵測或成像來偵測及量測奈 米^構上之雜交。如上所述’奈米結構包括在雜交之前及 之後具有極靈敏阻抗信號的CNT。如上所述，該兩種偵測 方法利用奈米結構技術之雜交快速性及靈敏性及由雜交所 致之奈米結構之導電率、大小、感應偶極及介電泳遷移率 之變化。 在圖12-19中所示之實施例中，雜交為一般雜交，如上 22 200928364 所述使用鏈霉抗生物素蛋白官能化奈米結構及獨立地用不 同引子PCR的經生物素標記ssDNA。在該實施例中，複製 或PCR模組1200包括包含複數個偵測小瓶或管12〇4的可 移除式耦合之管陣列盒1202，該等小瓶或管12〇4中之—個 更詳細地展示於圖13中。可使用注射器或泵12〇6經由注 射小孔1208傳遞含偵測標靶的樣本至pCR模組12〇〇。將 樣本注射至PCR模組1200中，至貯槽121〇中。另外， 模組1200包括提供熱源以維持諸如約5〇9〇τ：之溫度的加 & 熱元件（未圖示）。 如圖13及14中所示，貯槽ι21〇中之偵測標靶1212 0齒合搞合於至少第一電極或第一電極對1216之第一膜 1214。第一膜1214為奈米多孔或水凝膠及水可滲透的，但 其不允許其他分子穿過，亦即，偵測標靶不能通過膜1214。 尤其，當偵測小瓶太小而不允許氣泡逸出時，膜1214應為 水可渗透的。一種用於膜1214之例示材料為納菲昂 ◎ ( Nafion)。然而’對於半徑大於丄之管丨2〇4，膜不需 要允許水通過。第一電極1216上之電場及/或電壓溶解崩 解或以其他方式損壞第一膜1214之完整性以打開至少一個 小孔以用於偵測標靶丨2丨2之分子轉運。

在偵測標靶1212穿過第一膜1214後，對於特定偵測 管1204’用特定引子/酶pcR偵測標靶1212。因為每一 pcR

小瓶（亦即，偵測管12〇4)之擴增物由特異性標靶ssDNA (右存在）支配’且因為傳遞每一擴增物以分離偵測單元， 所以不需要在識別階段具有特異性。 23 200928364 經擴增铺測標靶嚙合耦合於至少第二或第二組電極 1220之第二模1218,其功能與第一膜1214及第一電極1216 類似。 在第二電極1220上施加電壓後，第二膜受損且偵測標 乾1212自PCR層穿至雜交及偵測層。此處，如上所詳述使 用鍵霉抗生物素蛋白官能化奈米結構雜交偵測標靶1212以 形成對接分子探針或對接奈米結構1222。該反應在例如約 ©

至溫下發生〇 雜交後’對接分子探針1222嚙合阻抗偵測器1224 (圖 13 及 15) 如本文中所詳述，阻抗偵測器1224處所量測 1212之指示。囷16為 1224之一部分的放大視 之阻抗之值提供是否存在偵測標靶 圖13及15中所示之阻抗偵測器 圈。微電極柵1228包括複數個像素123〇，其中一個放大展 示於圖17中。像素1230可定址，且在一些實施例中，可 同時定址’而在其他實施例中’像素123〇不可同時定址。 像素1230包括在兩個直線陣列i 234之交又點處的介 電質間隔物1232。介電質間隔物1232使得在兩個直線陣列 34之父叉點處生成咼電場。電可操縱如上所述之經對接 奈米結構1226之移動。移動經對接奈米結構1226以聚集 麵對接奈米結構1226用於成像或阻抗讀數。 圖18展示例示成像偵測單元i 8〇〇 ^在例示成像偵測單 疋18〇〇中，相機1802經由一或多個電極柵1228之光學透 明覆蓋透鏡或蓋玻片1804捕捉影像❶柵1228之影像將展 示是否已聚集複數個對接奈米結構1226。圖19展示例示影 24 200928364 像1900。例示影像19〇〇展示已聚集對接奈米結構1226之 擁擠區域1902及尚未聚集對接奈米結構1226的空曠區域 1904。 或者，在圖20-21中所示之實施例中，在標靶ssDna 與S能化於奈米結構上之互補募聚物之間的雜交可為標靶 特異性的。在該替代實施例中，在包括具有用於所有可能 的標靶ssDNA之所有引子的貯槽的替代例示複製或pCR單 ❹元2000中進行PCR以產生擴增偵測標靶2〇〇2。因此貯 槽含有樣本中所包括之所有類型的標靶的所有類型的擴增 物。微泵/微閥2004將具有擴增偵測標靶2〇〇2之樣本轉移 至含有複數個個別偵測管或小瓶2008之雜交/偵測單元 2006中，該荨偵測管或小瓶2008中之一個放大展示於圖 21中。在一些實施例中，微閥2004僅需要打開一次。將集 體PCR擴增物送至所有都I別小瓶2008中，且每一個別小瓶 2〇〇8含有經特異性寡聚物官能化之奈米結構。在一些實施 Q 例中，如以上所詳述’歸因於電場或電極上之電壓的存在， 偵測標靶2002在膜開口下方之雜交層中自奈米結構中分離 出來 旦偵測標把2002進入雜交層，則雜交如以上所詳 述發生。在該實施例中，雜交在約7〇C發生。 在偵測標靶2002與奈米結構雜交而形成對接探針或對 接奈米結構2010後，對接奈米結構201 〇可喷合阻抗偵測 器2012 ^阻抗偵測器2012與以上詳述之阻抗偵測器1224 十分類似之方式偵測是否存在偵測標把2002。另外，影像 偵測器1800亦可用於該實施例中來偵測是否存在偵測標把 25 200928364 2002 ° 本文中所述之例示診斷裝置/偵測單元實現許多優點及 益處。舉例而言’本文中所述之實施例使得病原體診斷法 能夠更快速、更特異、更靈敏且更具現場適用性。優點很 多，包括（例如）早期且快速癌症偵測或如膿毒病之急性 感染之迅速且病原體特異性診斷’此將顯著增加患者存活 率。除速度及特異性外，本文中所述之例示裝置及方法具 有允許現場使用之高可攜帶性，此尤其可適用於現場應用 (諸如流行病控制）及多種可能危害全世界健康之感染性 病原體之病原體識別，該等病原體包括（例如）禽流感、 SARS、溶血性尿毒癥侯群及帶血絲腹濱（大腸桿菌 (仏c〇/〇 〇157:H7)、肺結核（結核分枝桿菌 (ΜγΜα价W請仏))、炭疽（炭疽桿菌（及⑽ anthracis ))、肺炎（肺炎鏈球菌（ M ))、瘧疾（瘧原蟲（户/似所〇山·M/w ))、肝炎（a、 B、C、D及E型肝炎病毒）及出血熱（伊波拉病毒（烈〇/β )。本文中所述之例示裝置及方法亦可用於偵測食 品及水源中之大腸桿菌（丑.Ci>/z·)及識別具有对抗生素性之 再出現病原體’諸如肺炎球菌（pWeMWOCOCCZ·)、腸球菌 (ewierococcz·)、葡萄球菌、惡性瘧原蟲 (尸/a/cz>arwm )及結核分枝桿菌或第三世界國家 的瘧疾細菌。對於面向消費者之診斷裝置/套組，例示搆帶 型裝置之樣本接觸組件可為抛棄式的。另外，例示裝置具 有高靈敏度’其適用於偵測包括少量標乾之病原趙，諸如 26 200928364 經歷生物恐怖主義之情形及環境應用。 本文中所述之實施例為藉由自單一芯片内之一站移動 離散樣本或連續流至下一站而無需人為介入的允許大生產 量連續流動格式的芯片上實驗室（lab_〇n_a_chip )微流體晶 片。另外，因為想要之標乾（例如，特異性Dna片段）由 如本文中所述之微流體構件及DEP聚集在探針附近，所以 裝置特異性增強。 Ο

另外，上述AC電動晶片極易攜帶，因為其可由如行動 電話内之電源之手持式電源驅動。高頻率（例如，超過約 100 kHz) AC場通常具有比相應電壓之法拉第反應時間 (Faradaic reaction time )短的週期，且因此電極處不發生 氣泡及離子產物的淨產+ ^ 展奶刃乎座生。冋樣地，電極可嵌入例示裝置 内以提供更精確的流體管理。 此外，本文中所述之實施例之主要優點之一為使用例 不裝置進行多絲診斷的能力。即使僅—個錄（例如， —種病原體）待债測，通常亦需要多個來自其基因組之祖 標乾以產生精碑識別。 矸…开力少尺亇、大數目及大表 面積與體積比之次微半本本 、奈水、纟°構表面上增加偵測靈敏度。

Jit二〇〇微升1%奈米結構（例如，微米級膠體）懸 傳餅3有Μ億個奈米結構，總表面積為1⑽2。與 傳統DNA微陣列夕！ 2 提供大八個數I 像素面積相比，該等奈米結構 促供穴八個數量級的插 ^ ^ n 捕集面積及靈敏度的相當增加。此 卜在相同樣本中，牟半仕祕 卡結構之間的平均間隔比樣本之線 27 200928364 性尺寸小三個數量級。 況，此轉化為擴散時間 何對流增強質量轉移率 對於存在少量偵測標靶分子之狀 之最大六個數量級的降低，此比任 高得多。 該奈米結構晶片存在袁杨、想*兴奋 于也具他潛在益處。若該等奈米結構 可裝配及分散於微通道内， 内貝I奈米結構可形成微CSTR、微 層析及微栓流反應器，且描 且從而援引該等反應器設計之優 點：較敞開流動式CSTR夕ϋ * 之熱力產率更佳之產率，增強平行 ❹ 對接反應之選擇性的分離，及辦強太可.送β由土在 及增強不可逆反應產率之低分 散。 另外’在PCR技術與強鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋 白及生物素相互作用組合之實施例中，偵測標靶物質之遺 傳識別更簡單、更快速、更穩定且更靈敏。本文中所述之 實施例顯著減少反應時間，而增加靈敏度。因此，本文中 所述之攜帶型PCR芯片或其他裝置提供現場應用。本文中 所述之實施例亦消除對用於螢光偵測之需要實驗室訓練技 ❹ 師及實驗室設備之多步攪拌、洗滌及清洗方案的需要。另 外，本文中所述之實施例及方法移除對促進偵測的實驗室 結合共焦設備及數小時長之雜交時間的需要。同時，可使 用與光學過濾器及矽光電二極體耦合之發光二極艎（LED ) 來進一步開發及微型化光學偵測晶片。 此外’本文中所述之例示微通道及奈米結構之幾何結 構玫寬習知微流體設計所經歷之靈敏度及可攜帶性的限 制。微通道内大表面積與體積比允許更多表面探針官能化 於通道壁，此顯著增加捕獲以極小濃度存在之標靶之可能 28 200928364 性，且從而改進相應診斷檢定之靈敏度。 例示裝置偵測感染性病原體之能力使得能夠對病原體 引起2疾病的暴發做出快速且有效的反應。諸如臨床微生 物學家、護士或其他技師之操作員可確定樣本（其為臨床 樣本、食物樣本、環境樣本等）巾是否存在病原體，且若 存在，則識別病原體之類型及數量。可能存在僅少量（例 如，小於約5個）至數百個經識別之病原體，且各類型之 ❹ ❹ 數目可在數個數量級内變化，諸如每毫升樣本十數個至數 百萬個菌落形成單位（CFu )不等。 雖然本文中已描述某些例示方法、裝置及製品，作本 專利所涵蓋之範㈣受此_。相反，本專心蓋所有文 :上：均等論下完全屬於附加申請專利範圍之範缚的方 Η 、置及製品。此外’可整體或部分組合本文中所述之 任何例示裝置及/或方法。 【圖式簡單說明】 =1A_1F為由四極電極附近例示對接及未對接奈米社 構形成之例示圖案的影像。 ’、 圖。圖2為例示整合多路連續流動介電泳分類裝置之示意 圈3為例示對接奈米結構之放大例示捕集的相片。 交越料…例㈣衫㈣狀料率相對於 圖5為例示對接奈米結構之極點之傳導充電的放大影 29 200928364 像。 圖6為展示兩種不同例示偵測技術之例示快速標乾偵 測裝置之示意圖。 圖7展示例示偵測裝置上之例示微流體通道的一部分。 圖8展示例示載玻片上之圖7之例示微通道的例示製 造。 圖9展示圖8之例示載玻片上之例示過濾器的例示製 造。 ❹

圖10說明例示寡聚物探針於例示奈米結構上之例示官 能化。 圖11展示圖6之例示偵測裝置之更詳細的示意圖及例 示裝置的攝影影像以及例示過濾器及例示微通道之放大視 圖。 圖12為使用一般雜交之例示多標靶偵測單元的示意 圖。 圖為圖12之站w _ 、谓測单元之例示偵測子單元的示意圖。 圖為圖13夕y _ &例示偵測子單元之例示膜及例示電極 對的示意圖。 圖15為圖13夕7, <例示偵測子單元之例示阻抗偵測器的 米意圖。 圖16為圖15 例不阻抗偵測器之例示電極柵的放大 圖17為圖丨6之备丨 列不電極栅之例示陣列交又點的放大 祝圖° 30 200928364 圖18為例示成像偵測器之示意圖。 圖19為來自圖18之例示成像偵測器之例示影像的示 意圖。 圖20為使用特定雜交之例示多標靶偵測單元 g。 j小忍

圖21為圖20之偵測單元之例示偵測子單元的示意圖。 【主要元件符號說明】 200整合多路連續流動DEP分類裝置/芯片或芯片或 整合DEP芯片模組或〇ΕΡ晶片 210 粗DEP碎片過濾器 220 第一階段或集中階段或集中單元 222 側電極陣列 224 間隙 230 第二單元或分類單元

234a 流線 234b 流線 234c ’流線 234d 流線 236 分類通道 240 3_D阱或阱 600 快速標靶偵測裝置 602 經生物素標記引子 31 200928364 604 經螢光標記引子 606 PCR腔室 608 樣本/標靶DNA或螢光染料分子 610 擴增標靶DNA或擴增DNA 612 通道 614 微流體芯片 700 微流體通道或微通道或通道 702 腔室或通道 Ο 704 奈米結構 706 經生物素標記ssDNA或DNA或標靶DNA或來 自捕集奈米結構之螢光信號 708 鏈霉抗生物素蛋白結合螢光染料或染料或螢光 染料 710 螢光之圖案及/或強度 800 載玻片或PCR偵測芯片或芯片 802 入口及出口 〇 804 遮罩布局 806 間隔物墊片 808 蓋玻片 900 過濾器或微過濾器 1200 複製或PCR模組 1202 可移除可耦合管陣列盒 1204 偵測小瓶或管 1206 注射器或泵 32 200928364 1208 注射小孔 1210 貯槽 1212 偵測標靶 1214 第一膜 1216 第一電極對 1218 第二膜 1220 第二電極或第二組電極 1222 對接分子探針或對接奈米結構

1224 阻抗偵測器 1226 對接奈米結構 1228 電極栅或柵 1230 像素 1232 介電質間隔物 1234 直線陣列 1800 成像偵測單元或成像偵測器 1802 相機 1804 覆蓋透鏡或蓋玻片 1900 影像 1902 擁擠區域 1904 空曠區域 2000 複製或PCR單元 2002 擴增偵測標靶或偵測標靶 2004 微泵/微閥 2006 雜交/偵測單元 33 200928364 2008 偵測管或小瓶 2010 對接探針或對接奈米結構 2012 阻抗偵測器

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Claims (1)

1. 200928364 十、申請專利範面： 1.一種偵測一或多個標靶之方法，該方法包含： 將包括第一標靶之樣本置於微流體裝置申； 使複數個第一標靶之複本與複數個奈米結構雜交； 向該複數個奈米結構施加電流； 使用由該電流產生之電場移動該複數個奈米結構； 將該複數個奈米結構分類；及

   評估該經分類之複數個奈米結構以確定第一標靶之存 在、不存在或數量中之至少一項。 2·如申請專利範圍第1項之方 珩孭乙万法，其中紐由介電泳添加 該電流。 3·如申請專利範圍第丨項之方法，其中增壓之存在並不 阻礙該方法。 、4.如申請專利範圍第1項之方法，其中複數個第一㈣ 之複本係經由聚合酶鏈反應產生。 5.如申請專利範圍第1項之方法，其中該電場在第一電 流下具有第—頻率及在第二電流下具有第二頻率，且其中 該複數個奈米結構中之至少—個在第—頻率下在第—方向 上移動且纟第二頻率下在第二方向上移動。 6·如申請專利範圍第1 ^ _ ^ ^ 項之方法，其中該複數個奈米結 構形成視該電場之頻率而定之圖案。 7.如申請專利範圍第1 . . ^ ^ . . . „ ^ 唄之方法，其中該第一標靶之是 否存在表不病原體、癌細胞、 生物小泡、肽、DNA、RNA 或非DNA分子之是否存在。 35 200928364 8·如申請專利範園第〗項之方 流體裝置之不同點施加複數個電流。' '包含在該微 9·如申請專利範圍第8項之方法，其中該複數個電流產 生橫越該微流體裝置之不均勻電場。 孜個U 10.如申請專利範圍第丨項 ^^^ _ 万法其中該複數個奈米 、=構為奈未碳管、奈米珠粒、奈米 子、太丰炉» ? 奈未膠體、奈米粒 '一干、量子點、奈米晶體、脂質體、二氧化矽珠粒、 乳膠珠粒、金膠邀或尺寸小於！ 2石夕珠粒 多者。 爾木之其他結構中的一或 化一 ❹ 項之方法 12.如申請專利範圍第1 子探針包括寡聚物、螢光團 的一或多者。 13·如申請專利範圍第 理該樣本。 1項之方法’丨t該一或多個分 、幾基或鏈霉抗生物素蛋白中 其進一步包含預處 如申請專利範圍第13 濾或移除抑制财之至少—者。^，其中預處理包括過 15·如申請專利範圍第丨項之方 個奈米結構之評估包括測定阻抗值、觀類之複數 中之一或多項。 觀察圖案或偵測螢光 其進一步包含在分 其進一步包含： =·如申請專利範圍第1項之方法， 類之刖集令該複數個奈米結構。 I?·如申請專利範圍第1項之方法， 36 200928364 偵測該樣本中所包括之第二標 使複數個第二標無之複本與複數個奈米結構雜交；及 評估該經分類# + 之複數個奈米結構以確定該第二標靶之 存在、不存在或數量中之至少-項。 其中向該複數個奈米結構施加電流引起與 交之複數個奈米妗播夕哲 知耙雜 雜交之複數個夺来铨搂_ 祀 I卡結構在第二方向上移動’且其中基於第

   ❹ ° 5第一方向來將第一標靶及第二標靶分類。 18.—種標靶偵測器單元，其包含： 微机體裂置之入口，其中置放第一標把之樣本； 使複數個第一標乾之複本與複數個奈米結構對接的雜 交腔室； 集中該複數個奈米結構之集中器； 將該複數個奈米結構分類之分類器；及 收集該複數個奈米結構之阱。 19.如申請專利範圍第18項之標靶偵測器，其中該集中 器包括一或多個向該複數個奈米結構施加電場以排列第— 標靶複本的電極。 2〇.如申請專利範圍第18項之標靶偵測器，其中該分類 器包括一或多個向該複數個奈米結構施加電場以在第一方 向上移動第一標靶複本的電極。 21·如申請專利範圍第18項之標靶偵測器，其中該集中 器或該分類器中之至少一者使用介電泳。 22,如申請專利範圍第18項之標靶偵測器，其進一步包 37 200928364 含用以產生該複數個第一標靶複本的複製腔室。 23. 如申請專利範圍第22項之標靶偵測器 腔室使用聚合酶鏈反應。 X複製 24. 如申請專利範圍帛18帛之標㈣剛器其中 器或該分類器中之至少一者施加電流以產 工电續，其中# 電場在第一電流下具有第一頻率及在第二、μ 电⑼L下具有第- 頻率，且其中該複數個奈米結構在第一頻率下在第一 一 上移動且在第二頻率下在第二方向上移動。 方向 25. 如申請專利範圍第24項之標靶偵測器，其中該 個奈米結構形成視該電場之頻率而定之圖案。 26. 如申請專利範圍第18項之標靶偵剛器其進一步包 含一或多個在該微流體裝置之不同點處施加複數個電流之 電極。 27. 如申請專利範圍第26項之標靶偵測器其中該複數 個電流在產生橫越該微流體裝置之不均勻電場。 G 28. 如申請專利範圍第18項之標靶偵測器，其中該複數 個奈米結構為奈米碳管、奈米珠粒、奈米線、奈米膠體、 奈米粒子、奈米桿、量子點、奈米晶體、月旨質體、二氧化 碎珠粒、乳膠珠粒、金膠體或尺寸小& 1微米之其他結構 中之一或多者。 29. 如申請專利範圍第i8項之標靶偵測器，其中一或多 個分子探針被官能化至該複數個奈米結構上。 30. 如申請專利範圍第29項之標靶偵測器其中該一或 多個分子探針包括募聚物、螢光團、羧基或鏈霉抗生物素 38 200928364 蛋白中之一或多者。 3 1 ·如申請專利範圍第丨8項之標靶偵測器其進一步包 含用以預處理該樣本之過濾器。 32. 如申請專利範圍帛18 #之標㈣測器，其中該牌包 括用以藉由収阻抗值、觀察圖案或㈣螢光中之至少一 項來評估該經分類之複數個奈米結構之偵測器。

   33. 如申請專利麵32 #之標㈣測器，其中該阻抗 值、圖案或螢光指示是否存在該第一標靶。 34. 如申請專利範圍第33項之標靶偵測器其中該第一 標乾之是否存在表示病原體'癌細胞、生物小泡、肽職、 RNA或非DNA分子之存在、不存在或數量中之至少一項 35·如申請專利範圍第18項之標靶備測器，其中該太 中包括第二標乾， 人 其中該雜交腔室使複數個第二標把之複本 米結構對接，及 双筑個奈 其中該分類器在不同於該第一標把之 二標靶。 刀類該第 36. 如申請專利範圍第35項之標靶偵測器其 器包括-或多個用以向該複數個奈米結構施加電〜分類 -方向上移動第一標靶之複本及在第二方向 ：在第 靶之複本的電極。 第一標 37. —種偵測標靶之方法，該方法包含： 獲得包括該標靶之樣本； 複製該樣本中之標靶以產生擴增混合物； 39 200928364 將奈米結構耦合至腔室； 使分子探針官能化至該奈米結構上； 使該擴增混合物流過該奈米結構以使該擴增混合物中 之標靶雜交；及 偵測標靶之存在、不存在或數量中之至少一項。 38.如申請專利範圍第37項之方法，其中該標靶係經由 聚合酶鍵反應複製。 39·如申請專利範圍第38項之方法，其中該聚合酶鏈反 應使用兩種經不同標記之引子。 40. 如申請專利範圍第39項之方法其十引子中之一者 經生物素標記且另一者經螢光標記。 41. 如申請專利範圍第37項之方法’其_該奈米結構經 由化學鍵、物理鍵、電場力或置放於過漶“面之間中之 一方式而轉合至該腔室。 42. 如申請專利範圍第37項之方法’其令鏈霉抗生物素 生物素蛋白令之至少一者·合至奈米結構且所複 製標㈣該鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白結合。 43·如申請專利範圍第37項之方 φ ,a 甘士—办 其進一步包含施加 電場’其中該電場之存在促進該標乾之雜交。 44. 如申請專利範圍第37項之方 阳少· ^ ® ^ ^ 具中該標乾由測定 觀察圖案或備測螢光中之一或多項來偵測。 45. —種標靶偵測器，其包含： 二:中複_以產生擴增混合物； …微流趙腔室，該奈米結構上已官能化 200928364 有分子探針； 保持奈米結構於微流體腔室中之過濾器； 通道，擴增混合物經此流過該奈米結構以使擴增混合 物中之標靶雜交；及 用以测定該標乾之存在、不.存在或數量中之至少一項 的偵測器。

   46. 如申請專利範圍第45項之標靶偵測器，其中該標靶 經由聚合酶鍵反應而複製。 47. 如申請專利範圍第46項之標靶偵測器，其中該聚合 酶鏈反應使用兩種經不同標記之引子。 48. 如申請專利範圍第47項之標靶偵測器其中引子之 一經生物素標記且另一者經螢光標記。 49_如申請專利範圍第45項之方法’其中該奈米結構經 由化學鍵、物理鍵或電場力中之—方絲合至該腔室。 5〇·如申請專利範圍第45項之標靶偵測器，其中鏈霉抗 生物素蛋白或抗生物素蛋白中之至少—者耗合至奈米結: :所複製標乾與該鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白結 .如申凊專利範圍第45項之標靶偵測器其中該 器經由阻抗、圖案或勞光㈣該縣。 J 52·—種偵測一或多個標靶之方法該方法包含： 將匕括4多個標乾之樣本插入微流體裝置中； 將標靶保持於貯槽申； 使標靶通過至複數個偵測管； 41 200928364 使標靶雜交；及 偵測標靶之存在、不存在或數量中之至少一項。 53. 如申請專利範圍第52項 .,^ ^ 心万去，其中膜崩解以允許 標乾通過至該複數個偵測管。 54. 如申請專利範圍第53項之方法，其中藉由施加電子 電壓使該膜崩解。 55. 如申請專利範圍第52項之方法，其中㈣係在該複 ❹ ❹ 數個偵測管中複製。 56·如申請專利範圍第55項之方法，其中標乾係用特異 性引子複製以在該複數個㈣管中之每一者中產生標無特 異性擴增物。 57. 如申請專利範圍帛52項之方法，其中餘與鍵霉抗 生物素蛋白官能化奈米結構雜交。 58. 如申請專利細52項之方法，其令㈣係在貯槽 中複製。 59. 如申請專利範圍帛58項之方法，其中標乾係用非特 異社弓f子複製以在該貯槽中產生供複數個標乾用之各種類 型的擴增物。 6〇.如申請專利範圍第59項之方法’其中使標靶通至該 複數個伯測管包括使各種類型之擴增物通至該複數個伯測 管中之每一者。 61.如申請專利範圍第60項之方法，其令該複數個備測 管中之每一者經單一類型之寡聚物官能化，所以在該複數 個偵測管之每一者令僅雜交各種類型之擴増物中對應於單 42 200928364 一標靶之一種類型。 62. 如申請專利範圍帛52項之方法，其冑一步包含施加 電場以引起標㈣微電極柵移動；及量測橫越該栅之阻抗 或觀察該柵之影像中之至少一或多項來㈣標無之存在、 不存在或數量_之至少一項。 63. —種用於偵測多標靶之標靶摘測器，該標靶偵測器 包含： 用於接受包括一或多個標靶之樣本進入微流體裝置中 ❽之注射小孔； 用於保持標靶之貯槽； 複數個連通地耦合於該貯槽之偵測管； 在該複數個偵測管中之雜交腔室；及 用以偵測標靶之存在、不存在或數量中之至少一項的 偵測器。 64. 如申請專利範圍第63項之標靶偵測器，其進一步包 ❹ 含複數個轉合於該貯槽與該複數個偵測管之每一者之間的 膜’其中該複數個膜中之至少一者經崩解以允許標靶通過 至該複數個^貞測管中之一者。 65. 如申請專利範圍第61項之標把偵測器，其進一步包 含一或多個電極，其中藉由橫越該一或多個電極施加電子 電壓而崩解該膜。 66. 如申請專利範圍第63項之標靶偵測器，其中標靶係 在該複數個偵測管中被複製。 67. 如申請專利範圍第66項之標靶偵測器，其中標靶係 43 200928364 用特異性引子複製以在該複數個偵測管之每一者中產生標 靶特異性擴增物。 68. 如申請專利範圍第63項之標把4貞測器’其中標把與 鏈霉抗生物素蛋白官能化奈米結構雜交。 69. 如申請專利範圍第63項之標靶偵測器，其中標靶係 在該貯槽中被複製。 70. 如申請專利範圍第69項之標靶偵測器，其中標靶係 用非特異性引子複製以在該貯槽中產生供複數個標靶用之 Θ 各種類型的擴增物。 71. 如申請專利範圍第7〇項之標靶偵測器，其中使標靶 通至該複數個偵測管包括使各種類型之擴增物通至該複數 個偵測管中之每一者。 72. 如申請專利範圍第71項之標靶偵測器，其中該複數 個摘測管中之每一者經單一類型之寡聚物官能化，所以在 該複數個偵測管中之每一者中僅雜交各種類型之擴增物中 對應於單一標無之一種類型。 73_如申請專利範圍第63項之標靶偵測器，其中該貯槽 及該複數個偵測管經由微泵耦合。 74. 如申請專利範圍第63項之標靶偵測器，其進一步包 含施加電場以引起標靶朝微電極柵移動；及量測該柵上之 阻抗或觀察該栅之影像中之至少一或多項來偵測標靶之存 在、不存在或數量中之至少一項。 75. 如申請專利範圍第74項之標靶偵測器，其進一步包 含捕捉該柵之影像的相機。 44 200928364 76.如申請專利範圍第63項之標靶偵測器，其中該標靶 偵測器為攜帶型。 十一、圖式： 如次頁。

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