KR20170115157A - 임피던스를 이용한 유전자 분석용 비표지 전기적 센서 및 이를 이용한 랩온어칩 시스템 - Google Patents

Abstract

임피던스를 이용한 유전자 분석용 비표지 전기적 센서 및 이를 이용한 랩온어칩 시스템이 개시된다. 전극표면에서 고체지지상 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭되어진 DNA의 양에 따라 변화하는 임피던스 허수파트의 커패시턴스(capacitance)를 비표지 방식으로 측정할 수 있는 검출 환경에서, 증폭된 유전자를 정량적으로 검출하기 위해, 단일 마스크(Mask)의 MEMS 공정으로 제작된 챔버 내에서 반응 및 검출을 동시 수행하는 전극 어레이를 포함하고, DNA/RNA 정제, 농축부와 미세유체 제어부가 융합된 랩온어칩(lab-on-a-chip) 기반의 전기적 센서를 구비한, 정성 및 정량분석이 가능한 임피던스를 이용한 유전자 분석용 비표지 전기적 센서 및 이를 이용한 랩온어칩 시스템은, 모든 실험과정이 자동화되어 있고, 또한 검사/진단 결과가 디지털로 표시됨으로써, 비전문가도 쉽게 검사를 수행할 수 있으며 또한 진단결과를 판독할 수 있는 검사/진단 기기로 개발될 수 있다.

Description

임피던스를 이용한 유전자 분석용 비표지 전기적 센서 및 이를 이용한 랩온어칩 시스템{Unlabeled electric sensor for analyzing gene using impedance and lab on a chip system using the same}

본 발명은 임피던스를 이용한 유전자 분석용 비표지 전기적 센서 및 이를 이용한 랩온어칩 시스템에 관한 것이다.

일반적으로 혈액이나 약물을 이송하기 위해 MEMS 기술로 만들어진 미세유체소자 시스템들은 미세펌프, 미세센서, 미세유체채널과 이를 제어하는 서킷으로 구성된다. 미세펌프는 유체를 이송하는 핵심 모듈로서 물리적 에너지 사용여부에 따라 크게 기계식 미세펌프와 비기계식 미세펌프로 대별할 수 있다.

전형적인 기계식 미세펌프 모식도는 도 1과 같으며, 압전소자나 열전소자를 이용해 팽창과 압축을 통해 밸브를 구동하는 과정을 통해 유체를 이송한다. 이러한 기계식 미세펌프의 단점은 기계적으로 복잡하며 전기를 인가하는 별도의 장치가 필요하기에 1회용 POCT 진단키트나 환자 피부에 장착하기에는 그 크기나 무게가 부담스럽다는 한계가 있다.

이러한 미세유체채널을 이용해 각 파트를 유기적으로 연결하여 이동되는 유체에 샘플 및 감지에 필요한 시약을 순차적으로 주입, 혼합 및 반응을 유도함으로서 생체 시료로부터 채취한 미량의 DNA/RNA 샘플을 기하급수적으로 증폭시키고 표적에 관한 높은 민감도와 특이성 확보가 가능하다.

미세유체소자 내에 주입된 유체는 층류를 이루어 미세 채널로 흐르게 되며, 층류에서의 혼합은 대류(convection)와 분자 확산(molecular diffusion)에 의해서만 일어나게 된다.

따라서 미세유체의 대류 및 분자 확산 확률을 증가시키기 위해 대량 병렬 처리 시스템을 구현하는 것과 유체의 성질에 따라 유체를 제어할 수 있는 기술을 개발할 필요가 있으며, 실생활에 사용이 용이하도록 소형화하고, 제조단가를 감소시켜 종래 미세유체보다 경제성을 향상 시키는 것이 중요하다.

미세유체칩 기반의 농축은 미국, 중국 등의 나라에서 활발한 연구가 진행되고 있으며 그 중 미세유체채널을 표적 물질에 특이적으로 반응하는 물질을 표지하여 표적 물질을 칩 내에 고정시켜 농축시키는 방법 또는 표적 물질과 비표적 물질의 물리적 성질의 차이를 기반으로 분리하여 농축하는 방법 등이 연구되고 있다.

미세유체채널 내 시약과 DNA/RNA 시료의 적절한 반응이 유도되어야 하는데 이 때 기존의 중합효소 연쇄반응 수행에 사용하는 펠티어는 연쇄 반응시 중요한 요소 중의 하나인 온도가 필요에 따라 증감하는 속도가 느리며, 열전달 효율이 기종마다 편차를 보이고, 반응량이 커서 고비용 장시간의 문제점을 내재하고 있다.

특히 형광물질을 이용하여 질병 조기 검사에 신뢰성 있게 사용되는 real-time PCR은 DNA/RNA 추출 과정을 제외하고 30~60분 이내에 정량 분석이 가능하고 주요한 질병 관리와 연관하여 매우 신뢰성 높은 분자유전 진단 툴로 활용되고 있지만, 이 진단방법은 중합효소 연쇄반응에 의해 정량진단이 가능하여 분자진단시장에서 그 신뢰성에 대한 경쟁력을 상당히 인정받고 있는데 비해 기기 및 진단에 필수적인 형광물질이 광원의 파장의 한계로 인해 최고 6개의 DNA/RNA만 동시 분석이 가능하다는 한계점이 있다.

또한 광학적 검출장비의 특성상 소형화의 한계가 있고, 분석시 형광물질이 고가여서 운용비용이 높아 질병 발병 현장으로의 이동이 용이하고, 운영비용이 저렴한 비표지 DNA/RNA 전기적 센서의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 기존의 DNA/RNA 진단 기법의 단점을 보완하기 위한 현장진단, 고효율 및 고감도의 새로운 DNA/RNA 분석 시스템의 필요로 인해 랩온어칩 기술이 급부상하고 있다.

기기의 소형화와 분석의 용이성을 지향하는 유비쿼터스 기술 개발 방향에 따라 진단 결과를 디지털화 하여 분석 및 네트워크를 구축할 수 있는 전기적 센서에 대한 필요성 증대되고 있다.

기존의 전기적 바이오센서는 높은 감도를 나타내는 검출신호 중의 하나로 표적 DNA/RNA의 생화학적 반응에 대한 임피던스 변화를 측정하여 신호를 모니터링 해서 주로 표적의 유무를 확인하는 정성분석에 응용하였다.

임피던스 측정은 다른 발광물질에 의존하지 않으며 MEMS 기술로 임피던스 감지부의 전극성형을 DNA/RNA의 고유한 물성치에 따라 성형이 가능하고 일반 반도체 공정을 이용한 대량 생산이 용이하므로 센서칩 제조단가를 충분히 낮출 수 있다.

기존에는 DNA/RNA를 검출하기 위해서 DNA/RNA를 AuNP나 다른 인터컬레이팅 물질과 부착시킨 뒤 그 물질에 특이적인 자극으로 신호를 인가했을 때 모니터링 되는 검출값으로 DNA/RNA를 인식하는 반면, 임피던스 측정은 DNA/RNA 자체의 전기적 신호를 높은 감도로 측정이 가능하다.

임피던스 감지 부분의 전극 형태는 나노 수준으로 극소형화하여 극소량의 시료도 검출할 수 있도록 감도를 개선하는 것을 이상적인 형태로 보고 있다.

그러나 위와 같은 감도를 구현하기 위해 나노 구조체를 제작하는 방식은 고난이도의 기술을 필요로 하는 만큼 고가의 장비를 사용해야 하고 현장에서 사용되기에 적당한 규모로 제작하기 어렵다는 단점이 있다.

또한, 생화학 반응 전후로 발생하는 미세한 전기적 특성 및 회로 구조 특이적인 잡음신호가 결과적으로 검침하고자 하는 표적 DNA/RNA 고유 물성치의 변화에 따른 임피던스 측정에 영향을 미치고, 시료 용액 내 염도 및 조성에 따라 재현성을 확보에 어려움이 있다.

그러므로 임피던스 측정에 의한 표적 DNA/RNA 검침에서 사용될 바이오센서 개발에서 진단비용은 중요한 매개 변수 중 하나이므로 고가의 시약사용을 최소로 하고 제조비용이 저렴해야하며 품질관리 및 소형화가 가능하여 다양한 환경에서 사용할 수 있는 특징을 충분히 반영해야 한다.

랩온어칩 시스템은 현장에서 채취한 샘플로 바로 진단검사를 진행하는 경우 고재현성, 고감도의 신속하게 결과 모니터링 가능하다는 장점이 있다.

마이크로 레벨로 소형화되어진 기기의 기능들로 이루어져 마이크로 용량의 검사 시료와 실험 반응에 필요한 시약을 요구하므로 짧은 반응 시간과 경제적으로 실험 진행이 가능하며, 모든 실험 기능 및 수행 단계가 자동화되어 있어 전문가가 아닌 일반인도 손쉽게 분자 진단검사를 수행할 수 있는 시스템으로 개발되어야 한다.

기존에는 박테리아 또는 바이러스 샘플을 채취하여 특이적인 배양 후 유전자 분석을 진행해야 했지만 랩온어칩 시스템을 이용하면 현장에서 채취하는 적은 샘플 농도 상에서도 기존의 방법보다 높은 효율성을 가지고 분자진단 검사 수행이 가능하며 검사결과의 정확성과 감도를 향상시킬 수 있다.

또한 검사 과정의 자동화로 한 번의 작동시 1시간 이내에 검사를 완료시킬 수 있으며 현장에서 누구나 손쉽게 검사를 수행할 수 있으며 수행단계에서 실험자에 의한 검사결과의 오류를 제거하여 신뢰도를 높일 수 있다.

종래의 표적의 분리 및 농축을 위한 샘플 전처리 기술로는, 첫째, 독일 HSG-IMIT의 M. Karle, et al.의 연구를 들 수 있다. 여기에서는 Microfluidic platform을 기반으로 하는 DNA 추출 방법을 개발하고, Magnetic bead를 이용하여 DNA의 지속적인 분리, 농축을 하였으며, Bead 기반의 기존 회분식 추출법(batch-wise extraction) 대비 147%의 DNA 회수율을 보여주었다.

즉, 샘플 내에 존재하는 세포를 파괴한 뒤 자성입자(magnetic bead)를 이용하여 DNA만 선택적으로 분리, 농축하는 방법으로, 미세유체학(microfluidics)을 기반으로 하여 세포 용해물(cell lysate)로부터 DNA를 연속적으로 분리, 농축이 가능하고 PCR 등의 효율을 떨어뜨릴 수 있는 여러 물질을 제거할 수 있으며 기존 자성입자 기반 방법 대비 높은 효율을 보여준다는 장점이 있다.

그러나, 이와 같은 방법은 표적 DNA만을 선택적으로 분리하는 것이 아니므로 비표적 DNA에 의해 검출 효율이 떨어질 수 있고 장치에 주입할 샘플의 이물질을 제거하기 위한 과정이 필요할 수 있는 등 본 기술을 이용하기 위한 또 다른 전처리 과정을 필요로 한다는 단점을 가지고 있다.

둘째, 미국 Johns Hopkins University의 S. K. Park et al.의 연구를 들 수 있다. 여기에서는 Microfluidic device를 기반으로 하여 균을 분리, 농축하는 기술을 개발하였고, 분리 능력은 최대 97%에 달하며, 분리된 표적을 100% 농축하는 것이 가능하였다.

즉, 유전영동(dielectrophoresis)을 이용하여 장치 내에서 주입되는 샘플로부터 박테리아를 선택적으로 분리, 농축하는 방법으로, microfluidic device를 기반으로 하기 때문에 연속적으로 처리가 가능하다는 장점을 가지고 있으며 높은 효율을 보여주었다.

하지만, 샘플로부터 표적을 분리하는 원리인 유전영동 방법은 표적의 크기(size)를 특정하여 분리하는 방식으로 샘플 내에 존재하는 물질의 크기가 표적과 비슷한 경우에는 표적만을 특이적으로 분리하는 것이 어려웠다.

셋째, 중국 Chinese Academy of Science의 J. Qiu, et al.의 연구를 들 수 있다. 여기에서는 Microfluidics와 IMS 방법을 기반으로 하여 표적 박테리아를 선택적으로 분리하고 생물 발광(bioluminescence)을 통해 검출하였고, Tosyl group으로 표지된 자성입자를 항체로 기능화 하였으며, 면역자기입자의 효율이 매우 높아 표적균을 10 CFU/ml 수준까지 검출하였다.

즉, 면역자성입자를 이용한 IMS 방법을 통해서 목표 균을 선택적으로 분리하고, microfluidic device를 이용하여 농축한 후 luciferin-ATP간의 반응을 기반으로 하는 bioluminescence 기술을 통해 검출하였다.

Tosylactivated 자성입자에 항체(antibody)가 결합된 면역자성입자를 통한 분리 효율은 90% 이상으로 매우 효율적이며, microfluidic device를 통해 농축하여 매우 높은 민감성을 보여주었다.

그러나, 이 방법에서는 목표 균을 특정 하는 방법이 IMS 방법을 통한 면역분리방법 뿐이기 때문에, 자성입자와 비특이적으로 결합한 기타 균을 구분할 수 없어, 검출 신뢰도에 문제가 있을 수 있다.

넷째, 미국 Colorado School of Mines의 A. J. Madonna의 연구를 들 수 있다. 여기에서는 IMS 방법과 MALDI-MS (matrix- assisted laser desorption / ionization mass spectrometry) 방법을 기반으로 하여 목적균을 검출하고, 자성입자에 secondary antibody를 결합시킨 후 primary antibody를 이용해 기능화하였으며, 검출한계는 약 106 CFU/ml이었다.

즉, Secondary와 primary antibody를 연속적으로 자성입자에 결합시키는 방식을 통해서 primary antibody의 배향성(orientation)을 확보하여 표적인 박테리아와의 결합 효율을 높이도록 하였다.

그러나, 위와 같은 방법을 통해서 primary antibody의 배향성을 확보하였음에도 불구하고 검출한계가 낮다는 한계점을 가진다.

국내의 세균 검출용 센서 개발 연구는 항원-항체 사이의 전기적 신호를 파악하는 방법과 유전자 판독을 이용한 방법이 대부분이었으나, 최근 바이오센서의 재현성 및 검출 한계 향상을 위한 바이오센서 기술 연구의 도입부에 진입하였다.

국내에서는 미생물 배양배지를 대량생산, 판매하는 생배지 제조 전문 업체로서 한일 코메드가 EASY 24E plus 제품을 생산하고 있으며 장내세균 및 비브리오의 신속, 정확한 동정을 위한 검사키트를 시판중이며 24종의 생화학적 검사를 한꺼번에 실시하여 보다 정확한 결과를 얻고 있으나, 역시 다른 식중독균 검출 키트 시스템과 같이 18~24시간 의 측정 시간을 요구하고 있음.

또한, 2007년 삼성에버랜드에서 multiplex PCR 을 통해 다양한 식중독균을 동시에 분석하는 방법을 정립한 후 국제위생학회(IAFP) 및 학술지, Journal of food protection 에 발표하였다. 이 방법에 의해 Eschorichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Listeira monocytogenes, Samonella 가 동시적으로 분석되었다.

한편, 금 전극 표면을 개질함으로써 표적 미생물 검출 민감도 향상 기술을 개발한 사례도 있다. 히알루논산(Hyaluronic acid)을 이용한 비특이적 결합을 저감함으로써 검출 민감도 향상시키고 전기화학적 임피던스 분광법에 의한 병원균 검출 시스템 구축하였다.

한편, 색전이 특성을 가지는 PDA vesicle을 마이크로 사이즈의 입자 표면에 고정화시킴으로써 표적 물질 검출 민감도를 향상 시키는 기술을 개발한 사례도 있다. PDA vesicle의 색전이는 표적 물질이 vesicle의 표면에 결합할 때 생기는 물리적 스트레스로 유발되는 센서 시스템으로서 개발된 센서의 성능을 표적 GMO 단백질 검출 실험을 통해 입증하였다.

국내 다수의 산,학,연 의 연구자들 또한 다양한 융복합적인 기술을 이용한 고감도 바이오센서 개발을 통해 바이러스나 미생물 등의 식중독 유해인자의 고감도 검출을 위한 기술들이 개발되고 있으나, 식품 전처리 샘플에의 적용 및 현장 적용 등에 한계를 보이고 있어, 소형 분석기기의 현장적용 및 초고감도 분석 원천기술의 융합을 통한 통합적인 검출 시스템의 개발이 시급한 실정이다.

전술한 배경기술은 발명자가 본 발명의 도출을 위해 보유하고 있었거나, 본 발명의 도출 과정에서 습득한 기술 정보로서, 반드시 본 발명의 출원 전에 일반 공중에게 공개된 공지기술이라 할 수는 없다.

한편, 한국등록특허 제10-0969671호에는 고감도 바이오센서 및 이를 포함하는 바이오 칩 그리고 이를 제조하는 방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0969667호에는 생리활성물질을 전기적으로 검출하는 방법 및 이를 위한 바이오칩이 개시되어 있다.

특허문헌 1 : 한국등록특허 제10-0969671호 특허문헌 2 : 한국등록특허 제10-0969667호

본 발명은, 핵산 추출 미세 기술과 임피던스를 이용한 비표지 전기적 고체지지상 중합효소 연쇄반응 센서 기술을 융합하여 실험실의 장소적 제약과 전문가의 인력 한계성을 극복한 유전자 정량 분석용 랩온어칩 시스템을 제공하는 것이다.

또한, 하나의 칩 상에서 핵산추출, 증폭 및 검출을 동시에 수행하며 유전자 증폭단계에서 전기적으로 핵산을 정량 분석하는 기술로서 마이크로 전극 어레이칩을 이용하여 고체지지상 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응을 수행하고 유전자 증폭 단계에서 전기적으로 핵산을 정량 분석하는 기술을 제공하는 것이다.

또한, 본 유전자 진단 분석기기는 핵산 추출 부분에서 30분 이내의 소요시간과 80% 이상의 DNA/RNA 수율을 실현하고, 검출한계는 102 DNA Template copie를 목표로 한다. 센서 부분에서 8ul이하의 반응챔버를 이용하여 한 개의 챔버안에서 6개 이상의 유전자를 동시에 다중 분석할 예정이며 핵산 추출을 포함해 총 분석 소요시간은 60~90분 사이로 수행 하고 5kg미만의 데스크탑형으로 제작하고자 한다.

또한, 핵산추출을 위한 전처리 과정을 하나의 칩 내에서 자동으로 수행하고 바로 30분 이내고 중합효소연쇄반응을 통해 표적 DNA/RNA를 증폭 시킨 뒤 하나의 미세챔버에 전극 어레이를 이용하여 6개 이상의 유전자를 동시다중 분석 수행하고자 한다.

또한, DNA 추출부터 반응 및 검출을 자동화하고 이동이 용이하여 실험실이 아닌 현장에서 통합적인 유전자 분석 수행이 가능하고 비전문가도 수행이 용이하며 비표지 전기적 검출 기술을 이용하여 광학 검출 시스템보다 유전자 분자진단과 관련해 운용비용을 상당히 감축시킬 수 있다.

또한, 전기적 결과 값으로 비전문가도 진단 분석 결과를 인지하기 용이하고 데이터의 디지털화가 수월하므로 무선, 유선을 통한 분석 결과 데이터 송신이 가능하다(u-Healthcare / u-Monitoring).

본 발명의 이외의 목적들은 하기의 설명을 통해 쉽게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 전극표면에서 고체지지상 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭되어진 DNA의 양에 따라 변화하는 임피던스 허수파트의 커패시턴스(capacitance)를 비표지 방식으로 측정할 수 있는 검출 환경에서, 증폭된 유전자를 정량적으로 검출하기 위해, 단일 마스크(Mask)의 MEMS 공정으로 제작된 챔버 내에서 반응 및 검출을 동시 수행하는 전극 어레이를 포함하고, DNA/RNA 정제, 농축부와 미세유체 제어부가 융합된 랩온어칩(lab-on-a-chip) 기반의 전기적 센서를 구비한 시스템으로서, 상기 DNA/RNA 정제, 농축부는, 시료로부터 분리되어 자석나노입자에 부착된 세포나 바이러스로부터 DNA/RNA을 분리하기 위해 lysis buffer, chaotrophic salt, washing buffer, elution buffer 또는 silica bead (magnetic)를 이용하며, guanidine hgydrochloride, guanidine thicyanate, 및 sodium iodide로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 chaotrophic salt로 물 분자들의 네트워크를 붕괴시키고, 이로 인해 고체상 표면에 있는 물 분자가 제거되면, silica 표면에 있는 hydroxyl group과 용액 내에 존재하는 양이온 분자가 치환되므로 고체상 표면이 양극화되어 최종적으로 음극을 띄는 DNA/RNA의 흡착이 가능한 기작으로 이루어진 Boom technology에 의해 구현되어, Boom technology에서 사용하는 chaotrophic salt와 washing buffer와 같은 reagent의 구성을 조절하면 DNA와 RNA를 보다 선택적으로 정제, 농축하는 것을 특징으로 하고, 상기 미세유체 제어부는, control layer와 microchannel layer를 독립적으로 제작한 후 맞추어 붙여 microvalve를 제작하고, 기형성된 PDMS채널을 통과하는 유체의 흐름을 미세펌프로 조절하기 위해 사각형의 미세펌프를 제작하며, 그 펌프에 공기압을 주입함으로써 팽창시켜 밑에 놓인 채널을 눌러 닫는 효과를 가지며, 이러한 효과를 통해 잘 섞이지 않은 것으로 알려진 서로 다른 층상의 유체를 혼합하고 유체의 방향을 조절함으로써 칩 내 모든 유체의 흐름을 조절하여 전극부위에 시료의 전달과 단백질의 검출이 용이하게 일어날 수 있도록 한 것을 특징으로 하며, 정성 및 정량분석이 가능한 임피던스를 이용한 유전자 분석용 비표지 전기적 센서 및 이를 이용한 랩온어칩 시스템이 제공된다.

전술한 것 외의 다른 측면, 특징, 잇점이 이하의 도면, 특허청구범위 및 발명의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.

분자유전학적 검사/진단은 현재 분자유전학 실험기기와 전문가의 인프라가 갖춰져 있는 전공분야 실험실 또는 임상실험실이 갖춰져 있는 종합병원 수준에서 가능하나, 본 발명의 실시예에 따른 랩온어칩은 모든 실험과정이 자동화되어 있고, 또한 검사/진단 결과가 디지털로 표시됨으로써, 비전문가도 쉽게 검사를 수행할 수 있으며 또한 진단결과를 판독할 수 있는 검사/진단 기기로 개발될 수 있다.

본 실시예에 따른 분자진단/검사를 실험실이 아닌 현장에서, 그리고 일반 개인병원, 보건소 및 소규모 의료시설에서도 분자유전학적 진단을 수행이 가능하도록 개발하여, 식품 위생, 의료산업 및 보건복지에 기여할 수 있다.

검사/진단 결과를 디지털화하여 스크리닝하는 방식은 향후 유비쿼터스-헬스케어 시대의 자가진단 시스템에 최적으로 적용시킬 수 있는 기술로서, 현재 의료산업에서 뿐만 아니라 미래 의료산업에서도 큰 응용성과 산업성을 가질 수 있다.

미세유체 제어기술을 이용하여 혈액 또는 병원성 미생물 등에서 높은 효율로 유전자를 자동 추출하는 기능과 비표지 전기적 유전자 센서를 이용한 특정 유전자의 정량 검출을 통합하여 제품의 응용성과 경쟁력을 높여 세계 최고의 분자유전학적 검사 및 진단 목적 랩온어칩을 개발할 수 있다.

먼저, 고성능 식중독 원인균 분석 검사기로 활용할 수 있다. 식품 내 존재하는 병원성 미생물에 의해 발생하는 식중독에 대한 예방 및 진단을 통해 식품안전 관리 강화를 목적으로 식중독 원인균 분석 검사기로 개발하여 제품화할 수 있다.

기존의 특정 미생물 배양 방법을 통한 미생물 오염에 대한 검사에서 상기 개발 제품을 이용할 경우, 30분 이내에 미생물 오염 여부를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 일회 시료 주입으로 다 종류의 미생물 오염 여부를 분석해 낼 수 있으므로 검사를 위한 시간적 경제적 제한이 최소화 된다.

보건산업진흥원에 따르면 우리나라에서 식중독 사고로 인한 사회/경제적 직접 손실비용이 매년 1조 3천억원 이상이며, 이중 학교를 비롯하여 기업, 병원, 군대에서 시행하는 단체 급식에서 발생한 식중독 사고로 인한 손실비용은 전체 손실 비용의 40% 이상 차지한다.

본 실시예에 따라 제안하는 식품 안정성 측정 시스템은 실험실 기반 측정 방법인 기존의 기술과 비교하여 간소화하고 소형화하여 현장에서 신속 정확하게 식중독 균을 분석하여 검출하는 통합 시스템으로, 이 기술로서 식품 안전, 검출 및 진단 분야에서 국가 경쟁력을 향상시켜 거대한 경제적 파급효과를 가져올 것으로 기대된다.

다음으로, 고성능 수의진단기기로 활용할 수 있다. 최근 각종 수의 질환으로 인한 피해가 속출됨과 동시에 주변 감염을 최소화하기 위해 주변 일정 지역 내의 가축을 모두 살처분 하는 등 농가 및 수의 관련 기업이 입는 피해가 점차 증가되고 있는 실정이다.

대부분의 진단 검사가 특정 검역기관에서 행해짐에 따라 추가적인 시간적 소요와 경제적 비용 부담이 증가된다. 이러한 많은 시간적 소요에서 발생하는 수의 질환에 대한 조기 대책의 어려움과 그로 인한 추가 경제적 손실을 최소화하기 위하여 가축 농장 등의 현장에서 비전문가도 손쉽게 검사 및 진단을 할 수 있는 시스템의 요구가 증대되고 있다.

본 실시예에 따라 구제역 바이러스 (Foot-and-Mouth Disease Virus) 또는 조류독감 바이러스 (Avian Influenza Virus) 등의 수의 조기 검사/진단기기로 개발될 수 있다.

다음으로, 고성능 의료진단 플랫폼으로 활용될 수 있다. 대형 의료기관 임상센터와 유전자를 이용한 질병진단 기기로서의 요구기능과 사용자 편의성에 중점을 두고 개발하여, 소형 로컬병원만이 아닌 중/대형 의료기관에서 분자유전학 임상진단 기기로 개발될 수 있다.

특정 질환의 진단 혹은 질환 관련 변이 유전자의 유전형을 고성능 고재현성의 진단시스템을 통해 진단함으로서 유전형에 따른 약물 처방을 목적으로 하며 나아가서 SNP 관련 유전자의 변이 진단을 통해 환자에게 맞는 약물 처방을 유도함으로서 질환에 대한 약물 효과를 극대화 시킬 것으로 기대된다.

도 1은 종래 기술에 따른 기계식 미세펌프의 모식도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Buffer 환경과(좌측) Reference solution환경(우측) 에서의 PCR 반응에 따른 Impedance의 변화를 나타낸 그래프.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Target probe로 immobilization 한 후 SP-PCR을 수행 후 임피던스를 이용한 전기적 센싱을 진행한 결과를 나타낸 그래프.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Target probe로 immobilization 한 후 SP-PCR을 수행 후 임피던스를 이용한 전기적 센싱을 진행한 정량분석 기초실험 결과를 나타낸 그래프.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 고체지지상 중합효소연쇄반응이 진행되는 비표지 DNA 전기적 센서 칩 디자인을 나타낸 도면.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 자석나노입자를 이용하여 세포 농축 및 유전자 추출을 수행하기 위한 칩 디자인을 나타낸 모식도.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유체제어용 마이크로 밸브 제작공정(A) 및 작동 원리(B)를 나타낸 도면.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 전극을 어레이 한 멀티플렉스용 DNA/RNA 센서칩을 나타낸 도면.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 칩 내부에서 자석을 이용한 면역자성나노입자-타겟균 complex의 분리 및 조절 모식도.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA/RNA 추출용 미세유로에 충진된 실리카 비드를 이용한 DNA/RNA의 선택적 정제, 농축과정을 나타낸 모식도.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA/RNA의 전자적 인식 및 검출방법을 나타낸 모식도.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부한 도면들을 참조하여 상세히 설명하기로 하며, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 도면번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Buffer 환경과(좌측) Reference solution환경(우측) 에서의 PCR 반응에 따른 Impedance의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Target probe로 immobilization 한 후 SP-PCR을 수행 후 임피던스를 이용한 전기적 센싱을 진행한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Target probe로 immobilization 한 후 SP-PCR을 수행 후 임피던스를 이용한 전기적 센싱을 진행한 정량분석 기초실험 결과를 나타낸 그래프이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 고체지지상 중합효소연쇄반응이 진행되는 비표지 DNA 전기적 센서 칩 디자인을 나타낸 도면이고, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 자석나노입자를 이용하여 세포 농축 및 유전자 추출을 수행하기 위한 칩 디자인을 나타낸 모식도이고, 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유체제어용 마이크로 밸브 제작공정(A) 및 작동 원리(B)를 나타낸 도면이고, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 전극을 어레이 한 멀티플렉스용 DNA/RNA 센서칩을 나타낸 도면이고, 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 칩 내부에서 자석을 이용한 면역자성나노입자-타겟균 complex의 분리 및 조절 모식도이고, 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA/RNA 추출용 미세유로에 충진된 실리카 비드를 이용한 DNA/RNA의 선택적 정제, 농축과정을 나타낸 모식도이고, 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA/RNA의 전자적 인식 및 검출방법을 나타낸 모식도이다.

본 실시예는 고체지지상 중합연쇄반응으로 증폭된 DNA에 따른 임피던스의 변화를 비표지 전기적으로 검출한 것을 특징으로 한다.

IT-BT-NT의 융합산물로서 랩온어칩 시스템은 실험실에서 분자진단 검사를 수행하기 위한 실험기기 및 실험 과정을 반도체 기술인 MEMS (Micro Electro Mechanical Systems) 및 미세유체제어기술 (Microfluidics)을 이용하여 손바닥만 한 크기의 칩 위에 구현하면서 전 실험 과정을 자동화하는 차세대 진단검사 플랫폼이다.

특히 본 실시예는 실리콘 반도체 공정에서 한 장의 마스크 공정으로 생산되며 이는 제작 공정을 단순화하고 칩의 제작비용과 제작시간을 현저히 낮출 수 있는 큰 경제적 장점을 가지고 있다.

본 실시예에 따른 센서 기술은 광학 검출 센서나 전기화학센서와 달리 형광물질이나 산화/환원물질을 사용할 필요가 없는 비표지 검출 기술이므로, 센서의 제작이 쉽고 단순하며 광원 및 이와 관련한 필터 등 부수적인 기구 및 시약을 필요로 하지 않는다.

전극 표면의 증폭된 DNA를 임피던스를 이용하여 전기적 또는 전기화학적으로 검출하기 위한 등가회로 구성에서 지금까지는 병렬등가회로로 이해되어 왔으나, 본 실시예에 따른 센서 기술은 이 등가회로를 직렬회로로 이해하여 새로운 검출 기술의 메커니즘을 개발한 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라 기존의 Buffer환경에서의 임피던스 측정 시 PCR 전후의 차이가 충분히 나타나지 않았으나, 본 실시예에서 개발한 Reference solution을 이용하여 임피던스 측정시 PCR 도 2에 도시된 것처럼 전, 후의 차이가 확연히 구분되는 것을 확인하였다.

본 실시예에서 개발된 DNA 센서칩을 활용하여 시료 안에 포함되어 있는 목표 유전자를 SP-PCR (solid-phase polymerase chain reaction, 고체지지상 중합효소 연쇄반응) 기술을 이용해 증폭시킨 후 목표 유전자의 물리적 성질에 따른 미세한 전하량의 차이로 대상 유전자의 단순 검출뿐만 아니라 증폭된 유전자에 대해 준 정량 분석을 기초실험 데이터를 모니터링하여 가능성을 확인하였으며 본 기술을 활용하여 POCT용 현장진단에 적합한 분자진단기기를 구성할 수 있다.

Target probe로 chip에 immobilization 한 후 SP-PCR 수행 후 임피던스를 이용하여 전기적으로 센싱을 진행하며, 도 3에 도시된 것처럼, Target으로 생각되어지는 DNA의 증폭 여부를 판단하는 결과를 볼 수 있다.

즉, 전극 표면에서 고체지지상 유전물질이 중합연쇄반응을 일으킴으로서 증폭되기 전과 증폭된 후의 Target DNA의 유무 여부에 따라 측정되어지는 임피던스의 리액턴스 값의 변화를 측정한다.

또한 Target probe로 immobilization 한 후 SP-PCR 수행 후 임피던스를 이용하여 전기적 센서로 분석 데이터를 검출하면 도 4에 도시된 것처럼, Target으로 예상되는 DNA의 증폭된 정도를 측정할 수 있는 정량분석에 대한 가능성을 보여준다.

본 실시예에서는 민감도를 향상시켜 넒은 target DNA 농도범위에서 정량분석이 가능하도록 개발하고자 하였다.

한편, 다양한 미세구조물을 활용한 병원성 미생물 선택적 분리 포집 및 DNA 검출 센서도 개발하였다.

고체지지상 표면을 이용한 DNA/RNA 정제, 농축 및 RT-PCR 기반의 증폭 검출 시스템을 이용하여 병원성 미생물 검출 시스템을 개발하였으며, 임피던스 측정 기술 기반으로 미세 다공성막 또는 금전극 표면 개질을 통해 병원성 미생물 검출 민감도를 향상시켰으며, 실제 식품 시료 내에 존재하는 병원성 미생물 검출 가능성을 입증하였다.

비색 전이 특성을 가지는 PDA를 이용한 표적 단백질 검출 연구를 통해 수용액내에서 마이크로 입자를 고체지지상으로 이용하여 표적 단백질 검출능을 향상시킨 시스템을 개발하였다.

칩 내부의 pillar 구조가 가진 큰 표면적을 이용한 DNA의 선택적 농축 시스템 및 단일 칩을 이용한 DNA의 선택적 농축 및 Real-time PCR 수행에 의한 표적 DNA 검출 시스템을 개발하였으며, 개발된 칩을 이용하여 대표적인 식중독 유발균주인 E.coli O157과 혈액 샘플 내 존재하는 미생물을 검출하였다.

Kosmotropic solution상에서 DNA가 소수성표면이나 고체표면에 결합하는 특성을 발견하였으며 기존의 Boom Tech에서 사용하는 Chaotropic solution의 PCR 저해특성을 개선할 수 있는 기술로 확인하였다.

이는 넓은 범위의 pH에서 DNA의 결합특성이 영향을 받지 않아서 다양한 종류의 시료에 적용이 가능하다.

하나의 칩에서 세포의 파괴 및 정제, 농축을 수행함으로 온칩 핵산정제기술로 적용이 가능하다.

동일 Chip상에서 DNA를 정제하고 또한 타겟유전자를 증폭하는 기술로 DNA 결합능력을 극대화하면서 PCR을 저해하지 않는 표면기술 확립하였으며, DNA와 정제와 증폭을 동시에 수행할 수 있는 기술로 진단기기의 소형화 핵심기술로 적용이 가능하다.

혈액 등 복잡한 성상의 시료 중 존재하는 병원성균을 모양과 크기를 이용하여 포집 농축하는 기술로 다중 원심력을 이용하여 세포를 크기별로 분별 포집하였으며, 디스크형태의 타겟세포 포집기구로써 CD형의 리더기로 검출이 가능하다.

양 전극 사이에 미세다공성 막을 위치시키고 미세다공성 막 표면을 개질하여 표적 미생물 검출 민감도를 향상시킨 결과를 얻었고, 히알루논산(Hyaluronic acid)을 이용한 비특이적 결합을 저감 및 검출 민감도 향상시켰으며, 전기화학적 임피던스 분광법에 의한 병원균 검출하고 실제 식품시료에 존재하는 미생물 검출가능성을 확인하였다.

또한, 미량의 DNA/RNA 추출 및 감지 효율을 높이기 위한 미세유체제어 기술도 개발하였다.

기존의 PDMS 기반 미세유체소자가 가지는 표면 소수성 문제와 열경화를 바탕으로 한 제작 공정을 개선하기 위해 UV-경화성 고분자 (NOA63) 미세유체소자 제작 방법을 개발하였다. 본 제작 공정은 대량 생산에 적합하며 별도의 추가 공정 없이 채널에 장기간 유지되는 친수성을 부여하였으며, 채널의 친수성은 유체소자 내 무동력 시료 이송을 가능하게 하였다.

UV-경화성 고분자 미세유체소자의 장기간 친수성 유지 특성을 이용한 면역실험을 수행하였는데, 무동력 샘플 이송을 이용한 면역분석칩을 제작하고 염소 혈청과 그에 대한 항체를 이용하여 면역실험 수행한 결과 10 ng/L의 민감도를 확인한 바 있다.

고가 장비와 장시간의 공정 시간을 필요로 하는 전자빔리소그래피와 웨이퍼 본딩 공정을 이용한 기존의 나노유체소자 제작 기술을 대체할 수 있는 저가형 제작 공정을 개발하였다.

본 실시예를 통해 제작된 나노유체소자는 구조 정확도가 뛰어나며 별도의 추가 공정 없이 친수성을 획득하고 한 달 이상 그 친수성을 유지한다. 이를 이용하여 바이러스 DNA 단분자가 나노유체채널 내로 무동력 이송되는 것을 형광이미지로 확인한 바 있다.

Microvalve와 미세유체소자를 이용한 분자 논리 회로를 개발하여 나노단위의 용액 내에서 다양한 논리적인 연산이 가능한 연구를 통해, 시린지 펌프를 이용하여 시료가 들어가는 층, 그리고 랩뷰 소프트웨어를 사용하여 가스의 주입을 조절하여 시료가 들어가는 층을 “On-Off” 할 수 있도록 만든 밸브층 이 두 층의 polydimethylsiloxane (PDMS)를 이용한 미세유체소자를 이용하여 형광화학센서와 시료를 섞어주어 단시간 내에 형광을 통하여 결과를 확인할 수 있었다. 이와 같은 방식으로 pH 센서, Cu2+ 센서 등 다양한 센서를 이용한 측정이 가능함을 보여주었다.

미세 농도의 물질에 대한 민감성과 운동성을 가진 섬모충류(Tetrahymena pyroformis)와 가스 압력으로 조절되는 미세유체소자(microfluidic device)를 접목하여 친환경적인 새로운 형태의 환경 센서 개발 연구를 통해, 자극 물질의 확산과 섬모충의 움직임을 유체의 흐름이 통제된 환경에서 실시간으로 관찰 할 수 있으므로 다양한 물질에 대한 섬모충을 포함한 모든 운동성을 가진 생명체의 주화성 연구를 가능하게 하며 섬모충이 피코 몰 (pico mol) 농도의 펩타이드를 감지 할 수 있음을 보여주었다.

샘플 전처리 미세유체채널 소자와 그래핀 센서 시스템을 통합하여 보다 정확한 바이오 진단이 용이해졌고 현장에서 고속 병원체 규명을 수행할 수 있는 통합 시스템을 구축하였다.

마이크로유체시스템 기술을 이용하여 환경유해물질을 선택적으로 포획하고 농축할 수 있는 샘플 전처리 디바이스를 개발하고 이를 그래핀 센서 소자와 연계시켜 통합형 환경 센서 시스템을 구축하였다.

미세유체소자와 PCR소자의 사용되는 물질로 polycarbonate(PC)를 선택하여 urethane을 통해 아미노실란 처리를 하여 두 polycarbonate 층 embossing과정을 통해 결합시켰다.

본 polycarbonate결합의 바이오응용성을 검증하기 위해 aminosilane기를 지닌 표면에 carboxyl기를 지니는 polystyrene bead를 사용시 표면에 잘 고정화됨을 확인할 수 있다. 본 기술의 칩의 대량생산과정에 적합하며 특히 열팽창에 민감하게 반응하지 않기에 PCR소자에 사용될 수 있다.

본 실시예에 따른 비표지 전기적 고체지지상 다중 분석용 중합효소연쇄반응 검출 센서의 개발을 위해, DNA 센서 기기의 적절한 바이오 컨텐츠를 식중독 유발균주로부터 선별하고 DNA 센서칩을 이용하여 전기적 센서 분석이 가능한 데이터를 확보하고 활용 검증 실험을 진행하였다.

개별적인 칩 센서에서 고체지지상 중합효소연쇄반응을 수원하게 수행할 수 있는 적절한 칩디자인 설계 시 간단한 MEMS공정으로 대량 생산이 용이할 수 있게 기획하고 각 계면의 임피던스 분석이 가능한 회로를 활용하여 도 5에 도시된 것처럼, 칩 센서의 기능을 향상시켰다.

전극표면에서 고체지지상 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭되어진 DNA의 양에 따라 변화하는 임피던스 허수파트의 capacitance를 비표지 방식으로 측정할 수 있는 검출 환경을 조성하였다.

기존의 전기화학적 이론인 두 개의 정전용량이 병렬구조라는 잘못된 등가회로 이해를 직렬구조로 이해하고 이에 전극 표면의 DNA에 의한 높은 캐패시터 값을 측정할 수 있는 환경을 구성하였다.

증폭된 유전자를 정량적으로 검출하기 위한 전극 시뮬레이션 및 단일 Mask의 MEMS 공정으로 챔버 내에서 반응/검출을 동시 수행하는 전극 어레이 기술 개발하였다. 지속적인 정량 센서칩의 QC 구도를 확립하고 전기적 센서 데이터를 충분히 확보하여 각 silicon wafer들의 물리적 특징의 차이에 의해 발생될 수 있는 오류를 최소화하였다.

각 전극의 표면에 정량적으로 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 올리고머 고정화 기술의 개발 및 재연성을 확보하였고, 약 8㎕의 반응 및 검출 챔버에 6개 이상의 전극을 어레이하여 멀티플렉스 고체지지상 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 102 ~ 1013 copies DNA Template의 농도와 고체지지상 중합효소연쇄반응에 의한 임피던스 변화가 선형을 이룰 수 있는 센서로 개발하였다.

또한, 타겟균의 분리 및 농축을 위한 면역자성나노입자도 개발하였다.

샘플로부터 목표로 하는 병원균 등을 선택적으로 분리하는데 이용하는 방법은 면역자기입자(Immunomagnetic bead)를 이용한 면역자기분리법(Immunomagnetic separation)이다.

이 방법은 항원-항체의 특이적 결합 특성을 이용한 방법으로 상자성입자(paramagnetic bead)와 결합된 항체를 항원에 결합시킨 후 분리, 정제하는 기술로서 사용하는데 필요한 조건이 간단하며 쉽고, 낮은 비용으로도 자동화된 능력을 사용할 수 있는 점 등으로 인해 매우 각광 받는 기술이다.

면역자기분리법의 가장 기본적인 형태는 항체로 기능화 된 자성입자(Magnetic bead)와 자석을 이용하는 방식으로 항체가 붙어있는 면역자성입자는 샘플 내의 항원과 특이적으로 결합하게 되는데, 이 후 자석을 사용하여 용액으로부터 분리한다.

자기분리법에 사용되는 입자(Bead)는 주로 수 nm에서 수십 um 범위의 크기를 가지는 산화철(Iron oxide)로 만들어지는데, 이러한 입자는 자기장에서 강하게 반응하지만 자기장이 제거 되었을 때는 자력이 계속 유지되지 않는다.

랩온어칩 형태의 장비 내에서 면역자기분리법을 시행하기 위해서는 자성입자의 크기가 중요한 요인이다. 칩 내에서 자유로운 조작이 가능하게 하려면 수십 나노미터 정도의 크기를 가지는 자성입자를 사용하는 것이 가장 이상적인 조건이며 이러한 자성나노입자를 제작하는 방법으로 폴리스티렌(polystyrene)과 같은 중합체(polymer)를 자성물질과 함께 용매(solvent)에 녹인 후 ultrasonicator 등을 이용하여 나노크기의 emulsion을 형성하여 emulsion- evaporation 방법으로 자성나노입자를 제작하는 에멀젼 방법(emulsion method)과 젤 형태의 Fe-Oleate complex 등을 전구체(precursor)로 사용하여 고온 열분해법(thermal decomposition)으로 균일한 나노자성입자를 제조하는 방법을 사용한다.

나노자성입자를 제작하는 과정에서 폴리스티렌이나 올레산(oleic acid), 실리카(silica) 등을 혼합하거나 코팅하여 원하는 표면 성질을 가지도록 할 수 있다.

이렇게 제작된 나노자성입자 표면은 항체를 이용하여 기능화 하도록 할 수 있다. 입자의 표면에 항체를 결합하는 방법은 crosslink agent를 이용하여 공유결합(covalent bond)을 형성시키는 방법을 이용하고 앞서 제작된 자성나노입자는 표면을 기능화하기 쉽게 하기 위해서 작용기인 카르복시기(carboxyl group)이나 아민기(amine group)를 가지는 물질로 혼합 또는 코팅되어 있다.

표면에 있는 두 기능화기(functional group)는 각각 EDS/NHS crosslinker와 glutaraldehyde crosslinker에 의해서 공유결합을 형성하는 특성을 가지고 있다. 따라서 항체(antibody)에 존재하는 아민기와 특이적으로 공유결합을 형성시킴으로써 자성나노입자 표면에 항체를 결합하게 할 수 있다.

이러한 과정을 거쳐 제작된 면역자성나노입자는 샘플과 혼합하여 타겟균과 결합된 상태로 칩 안으로 주입되어 검출에 사용된다.

본 실시예에서는 생물 시료로부터 DNA/RNA을 정제, 농축하기 위해 Boom technology를 이용하였으며, 랩온어칩 상에서의 DNA/RNA 정제, 농축 및 증폭 검출 시스템에 적합한 기술로 최적화하였다.

Boom technology 기술은 chaotrophic salt로 알려져 있는 guanidine hgydrochloride, guanidine thicyanate, sodium iodide 등이 물 분자들의 네트워크를 붕괴시키고, 이로 인해 고체상 표면에 있는 물 분자가 제거되게 되면, 이때 silica 표면에 있는 hydroxyl group과 용액 내에 존재하는 양이온 분자가 치환되므로 고체상 표면이 양극화되어 최종적으로는 음극을 띄는 DNA/RNA의 흡착이 가능한 기작으로 이뤄져 있다.

또한, 온칩 세포농축 및 DNA/RNA추출 모듈도 개발하였다. 기형성된 PDMS채널을 통과하는 유체의 흐름을 미세펌프로 조절하기 위하여 사각형의 미세펌프를 제작하고 그 펌프에 공기압을 주입함으로써 팽창시켜 밑에 놓인 채널을 눌러 닫는 효과를 가져다 줄 수 있다.

이러한 효과를 통해 잘 섞이지 않은 것으로 알려진 서로 다른 층상의 유체를 혼합하고 또한 유체의 방향을 조절함으로써 칩 내 모든 유체의 흐름을 조절하여 전극부위에 시료의 전달과 단백질의 검출이 용이하게 일어날 수 있도록 도 6과 같이 설계하였다.

또한, 온칩 유체제어 마이크로 밸브 모듈도 개발하였다. 도 7의 (A)와 같이 control layer와 microchannel layer를 독립적으로 제작 후 맞추어 붙여 microvalve를 제작하였다. 기형성된 PDMS채널을 통과하는 유체의 흐름을 미세펌프로 조절하기 위하여 사각형의 미세펌프를 제작하고 그 펌프에 공기압을 주입함으로써 팽창시켜 밑에 놓인 채널을 눌러 닫는 효과를 가져다 줄 수 있다.

이러한 효과를 통해 잘 섞이지 않은 것으로 알려진 서로 다른 층상의 유체를 혼합하고 또한 유체의 방향을 조절함으로써 칩 내 모든 유체의 흐름을 조절하여 전극부위에 시료의 전달과 단백질의 검출이 용이하게 일어날 수 있도록 도 7과 같이 설계하였다.

나아가, 고체지지상 중합효소연쇄반응에서 정량적으로 다중전극의 동시 분석이 가능한 기술 조건을 수립하였다.

증폭된 유전자를 Multiplex SP-PCR/Multiplex RT-SP-PCR으로 검출하기 위한 전극 시뮬레이션 및 단일 Mask의 MEMS 공정으로 전극 어레이 기술을 개발하였다.

각 전극의 표면에 정량적으로 Multiplex SP-PCR/Multiplex RT-SP-PCR을 수행하기 위한 올리고머 선정 및 고정화 기술을 개발하였다. 다양한 DNA/RNA 바이러스 검출에 적합한 Multiplex SP-PCR/Multiplex RT-SP-PCR의 실험 조건을 확립하고, 실험용 DNA/RNA바이러스 확보하여 기초 실험을 진행하였다.

재현성 실험을 통해 102 ~ 1013 copies DNA Template의 농도와 Multiplex SP-PCR/Multiplex RT-SP-PCR로 증폭된 뒤 정량적 측정이 가능한 센서로 개발하였다.

임피던스를 이용하여 비표지 전기적 센서 기술의 시스템 인테그레이션을 수행하였다. 즉, DNA/RNA 정제, 농축 기술과 미세유체제어 기술을 통해 개발된 기술을 lab-on-a-chip 기반의 임피던스를 이용한 비표지 전기적 센서에 하나의 시스템으로 융합하여 정성(SP-PCR / RT-SP-PCR / Multiplex SP-PCR / Multiplex RT-SP-PCR), 정량분석이 가능한 시스템을 구축하였다.

프로토 타입 센서를 제작하여 센서 테스트 및 기존 검출방법과 비교 분석을 하고, 검출 한계 농도, 신뢰성 등을 측정하였으며, 통합형 시제품 제작하여 QC (Quality Control) 테스트를 진행하였다.

시스템에서 타겟균의 분리 및 농축을 위한 면역자기분리 기술 integration을 수행하였다. 즉, 면역자기나노입자를 이용한 칩 내에서의 목표 균의 분리 및 농축 시스템을 최적화 및 integration 하였다.

개발된 면역자성나노입자를 lab on a chip 기반의 디바이스에서 활용하기 위해서는 그 둘 간의 호환성 및 융합성이 매우 중요할 것으로 판단된다.

따라서, 본 실시예에서는 면역자성나노입자를 칩 디바이스에서 사용하는데 중요한 요소인 타겟균 분리 능력, magnet에 의한 자성나노입자의 포집 능력과 칩 내부에서 DNA/RNA 추출 효율 증대하기 위한 조절 능력을 검증하고, 타겟균 농축 능력 등에 대해서 평가하고 최적화하였다. 이에 따라, 면역자기입자의 타겟균 농축 능력을 평가함으로써 그 효율성을 파악할 수 있을 것으로 판단된다.

DNA/RNA 정제, 농축 기술의 시스템 integration을 수행하였다. 개발된 온칩 세포농축 및 DNA/RNA추출 모듈에 최적화된 DNA/RNA 정제, 농축 시스템을 integration하였다.

최적화된 Boom technology를 이용하여 DNA/RNA를 랩온어칩 기반에서 정제, 농축하는 시스템을 구현하기 위해서는 디자인된 모듈과의 융합성이 가장 중요하다고 판단된다. 따라서 기 개발된 모듈과의 연동성에 초점을 맞춰 사용하는 silica bead (magnetic)의 크기 및 silica bead (magnetic)의 고정화 방법 또한 chaotrophic salt 농도 및 washing buffer, elution buffer의 주입 volume 및 주입 rate를 최적화 하였다. 이에 따라, 유체소자를 통해 용출되어 나오는 DNA/RNA의 농도를 평가함으로써 가장 효율적인 조건을 확립할 수 있다.

또한, 각 모듈의 시스템 integration을 통한 LOD를 완성하여 통합시스템의 전자적 제어를 구현하였다. 시료 분석방법은 도 11과 같으며 다음과 같은 순서로 진행된다.

먼저, 표적이 들어 있을 것으로 추정되는 시료를 마이크로 칩 시료 주입부를 통해 흘린다. 시료 내 존재하는 여러 종류의 분자들에 의해 전극이 오염되는 것을 막기 위해 micro-valve를 ON상태로 유지하여 시료를 포함한 유체가 전극이 위치하는 채널에 접근하는 것을 제어한다. 이 때 칩 내에는 표적 단백질(Target 분자)과 결합할 수 있는 항체가 고정화된 미세유리입자들이 시료검출부에 충진 되어 있어 시료 중 표적 단백질만 예비 농축시킨다.

다음으로, 표적 단백질의 예비 농축 후 표적과 결합할 수 있는 또 하나의 항체인 AP-IgG(reporter 항체)를 흘려 그 항체가 시료 검출부에 표적과 샌드위치 결합을 할 수 있도록 한다.

다음으로, 알칼리성 포스포테이즈의 기질인 1-NP를 마이크로 칩 내로 첨가하여 시료 검출부에서 AP와 1-NP의 반응에 의한 α-나프톨을 생성하게 한다.

다음으로, α-나프톨이 포함된 유체가 전극이 위치한 채널로만 전달될 수 있도록 하기 위하여 micro-valve를 OFF시키며 동시에 waste가 배출되는 채널에 위치한 micro-valve를 ON시킨다.

α-나프톨의 분석 방법은 cyclic voltammetry를 사용하여 작업전극 (working electrode)에 전압을 주사하면, 특정 전위에서 α-나프톨(R-OH)이 R=O의 변화로 H+와 e-(electron)를 발생한다. 따라서 상기 특정전위를 통해 정성분석하며, 또한 발생되는 전자에 의한 전류량 세기로 정량분석을 한다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (1)

1. 전극표면에서 고체지지상 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭되어진 DNA의 양에 따라 변화하는 임피던스 허수파트의 커패시턴스(capacitance)를 비표지 방식으로 측정할 수 있는 검출 환경에서,
   증폭된 유전자를 정량적으로 검출하기 위해, 단일 마스크(Mask)의 MEMS 공정으로 제작된 챔버 내에서 반응 및 검출을 동시 수행하는 전극 어레이를 포함하고,
   DNA/RNA 정제, 농축부와 미세유체 제어부가 융합된 랩온어칩(lab-on-a-chip) 기반의 전기적 센서를 구비한 시스템으로서,
   상기 DNA/RNA 정제, 농축부는, 시료로부터 분리되어 자석나노입자에 부착된 세포나 바이러스로부터 DNA/RNA을 분리하기 위해 lysis buffer, chaotrophic salt, washing buffer, elution buffer 또는 silica bead (magnetic)를 이용하며, guanidine hgydrochloride, guanidine thicyanate, 및 sodium iodide로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 chaotrophic salt로 물 분자들의 네트워크를 붕괴시키고, 이로 인해 고체상 표면에 있는 물 분자가 제거되면, silica 표면에 있는 hydroxyl group과 용액 내에 존재하는 양이온 분자가 치환되므로 고체상 표면이 양극화되어 최종적으로 음극을 띄는 DNA/RNA의 흡착이 가능한 기작으로 이루어진 Boom technology에 의해 구현되어, Boom technology에서 사용하는 chaotrophic salt와 washing buffer와 같은 reagent의 구성을 조절하면 DNA와 RNA를 보다 선택적으로 정제, 농축하는 것을 특징으로 하고,
   상기 미세유체 제어부는, control layer와 microchannel layer를 독립적으로 제작한 후 맞추어 붙여 microvalve를 제작하고, 기형성된 PDMS채널을 통과하는 유체의 흐름을 미세펌프로 조절하기 위해 사각형의 미세펌프를 제작하며, 그 펌프에 공기압을 주입함으로써 팽창시켜 밑에 놓인 채널을 눌러 닫는 효과를 가지며, 이러한 효과를 통해 잘 섞이지 않은 것으로 알려진 서로 다른 층상의 유체를 혼합하고 유체의 방향을 조절함으로써 칩 내 모든 유체의 흐름을 조절하여 전극부위에 시료의 전달과 단백질의 검출이 용이하게 일어날 수 있도록 한 것을 특징으로 하며,
   정성 및 정량분석이 가능한 임피던스를 이용한 유전자 분석용 비표지 전기적 센서 및 이를 이용한 랩온어칩 시스템.

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