KR20240037439A - 전기유전영동 핀셋을 이용한 표면전하 의존 다중검출법 - Google Patents
전기유전영동 핀셋을 이용한 표면전하 의존 다중검출법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 전기유전영동 핀셋을 이용한 표면전하의존 다중검출법에 관한 것으로, 기존 방법과 비교하여 검출한계, 선택성 측면에서 우수한 효과를 나타내고, 무표지방식으로 생화학 물질의 특이적 검출이 가능하며, 다중 검출이 가능한 새로운 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 전기유전영동 핀셋을 이용한 표면전하의존 다중검출법에 관한 것으로, 상세하게는 (a) 검출 물질이 흡착된 미세 프로브 입자를 포함하는 용액을 유전영동 칩에 담지하는 단계; (b) 유전영동 칩에 유전영동 신호를 적용하는 단계; (c) 미세 프로브 입자를 포착하고, 입자 이미지의 밝기 강도를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 입자 이미지 밝기 강도로 전이 주파수를 측정하는 단계;를 포함하는 다중 검출 방법에 관한 것이다.
지난 수년간, 항체, DNA, 세포, 기타 소분자 등 다양한 분석 물질의 검출을 위한 수 많은 종류의 바이오센서가 개발되었다. 광학, 전기화학, 기계적 특징 등의 물리화학적 특성을 기반으로 활용하여 미세한 분석물질의 양을 식별하는 방법이 다수 연구되어 왔고, 이 중 전자검출에 의한 전기화학적 바이오센서가 고감도, 저비용, 소형화 용이성으로 주목받고 있다. 또한, 전기화학적 바이오센서는 표면 과학을 더해 초고감도 특성을 가지며 라벨 없이도 감지가 가능하다.
이러한 방식으로 알려진 바로, KPFM(Kelvin probe force microscopy), FET(field-effec transistor) 및 나노포어 센싱(nanopore sensing)이 있다. 해당 방식은 사전 라벨링 절차 없이 펨토몰 수준의 감도를 보여줄 수 있고, 이와 함께 상기 전기화학 바이오센서의 장점을 함께 가지고 있다. 따라서, 상기 전기화학적 바이오센서에서 표면 과학을 더한 표면 전하/전위 센서는 높은 감도에 대한 가능성을 보여 주목받고 있다.
바이오 센서에 있어 또 다른 중요한 문제는 다중 감지로, 높은 효율성과 높은 처리량을 위하여 요구된다. 또한, 하나 이상의 분석 물질이 검출가능한 경우 조기질병진단, 식품검사, 환경평가 등에서 이용될 수 있다. 다중 감지의 경우 광 신호(optical signal)을 통해 용이하게 가능하다는 것이 알려진 바 있으나, 고감도 또는 고선택성을 위해서는 라벨링 절차가 필요하다는 문제가 있다.
유전 영동(Dielectrophoresis, DEP)은 영구 또는 유도 쌍극자를 가지는 물질이 불균일한 전기장 하에서 전기장의 구배 방향을 따라 받게 되는 힘에 의한 물질의 이동으로, 전기적 특성을 기반으로 불균일 전기장에서 마이크로 또는 나노 크기 입자의 움직임을 효율적으로 제어가능하여 생체 입자 및 생물학적 기능화된 입자에서 널리 사용되고 있다.
이와 관련하여, 일본공개특허 제2021-509265호에 AC 유전영동 전기장을 이용하여, DNA, RNA 등의 분석물을 검출하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국공개특허 제10-2021-0102363호에는 폴리-시토신 DNA로 기능화하여 금속이온을 검출하는 방법이 개시된 바 있다.
다만, 상기 방법은 다중 검출이 불가능하거나 표지가 요구되는 등의 기존의 방식이 속한 문제를 여전히 가지고 있다. 이에 본 발명자는 추가 표지 없이 유전영동 힘을 통해 다중 프로브의 운동성 분석으로 프로브의 표면전하를 변화시키는 분석물질의 검출이 가능하며, 중금속이온에 대하여 높은 선택성과 감도를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Chalklen, T. et al., 2020, Sensors 20 (19), 5605.
본 발명은 전기유전영동 핀셋을 이용하여, 높은 선택성과 감도로 다중 검출하는 새로운 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 검출 물질이 흡착된 미세 프로브 입자를 포함하는 용액을 유전영동 칩에 담지하는 단계; (b) 유전영동 칩에 유전영동 신호를 적용하는 단계; (c) 미세 프로브 입자를 포착하고, 입자 이미지의 밝기 강도를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 입자 이미지 밝기 강도로 전이 주파수를 측정하는 단계;를 포함하는 다중 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 표면 전하 차이를 감지한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 검출 물질은 생체 분자이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 검출 물질은 생체 분자이고, 여기에서, 생체 분자는 화학작용기, 단백질, 효소, 항체, 항원, 핵산, ssDNA, ssRNA, dsDNA, dsRNA, 올리고뉴클레오티드, 엑소좀, DNA 압타머 또는 금속 이온-압타머 복합체이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 미세 프로브 입자는 크기가 1 내지 30 ㎛이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고, 여기에서, 초기 전압은 0.1 내지 2 Vp-p, 초기 주파수는 200 내지 500 kHz이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고, 여기에서, 주파수는 -0.1 내지 5 kHz/s의 속도로 변화하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (c)의 미세 프로브 입자 포착은 CCD 카메라 또는 CCD 고속 카메라로 초당 0.1 내지 5 프레임으로 캡쳐하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)의 입자 이미지 밝기 강도는 정규화된(normalized) 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)의 전이 주파수는 입자 이미지의 정규화된 밝기 강도의 임계값 전이가 발생하는 주파수이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)의 전이 주파수는 2선 회귀 선형 맞춤(two-line regression linear fit)을 사용하여 결정된 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 검출 한계(limit of detection, LOD)가 아토몰(attomolar) 내지 나노몰(nanomolar)이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 증류수에서 검출 한계가 아토몰(attomolar)이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 라벨링(labelling) 하는 단계를 포함하지 않는다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 검출물질의 프로브의 상호결합 결과를 확인할 수 있는 광학 라벨링 하는 단계를 포함하지 않고, 여기에서 광학 라벨링은 형광표지(fluorescent dyes)를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 2 이상의 검출 물질을 동시에 검출가능하다.
본 발명은 검출 물질이 흡착된 미세 프로브 입자 사이의 표면 전하 차이를 감지하여, 다중 검출하는 신규한 방법으로, 검출한계, 선택성 측면에서 우수한 효과를 나타낸다. 또한, 무표지로 다중 검출이 가능하다는 점에서 이점이 있다.
도 1은 DEP 기반 표면 전하 감지 시스템을 위한 설계를 나타낸 도이다.
도 2는 DEP 표면 전하 검출 방법에서 미세 프로브 입자의 전이 주파수(transition frequency)의 특성화를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 다양한 검출 물질이 흡착된 미세 입자 프로브의 표면 전하 차이 감지를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명 시스템에서 수은 이온(Hg2+) 농도에 따른 수은 이온(Hg2+) 결합 압타머의 표면 전하 변화 특성화를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 서로 다른 검출 물질(표적 이온)의 다중 검출을 나타낸 도이다.
도 2는 DEP 표면 전하 검출 방법에서 미세 프로브 입자의 전이 주파수(transition frequency)의 특성화를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 다양한 검출 물질이 흡착된 미세 입자 프로브의 표면 전하 차이 감지를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명 시스템에서 수은 이온(Hg2+) 농도에 따른 수은 이온(Hg2+) 결합 압타머의 표면 전하 변화 특성화를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 서로 다른 검출 물질(표적 이온)의 다중 검출을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서, 하기 용어가 의미하는 바에 대해서 설명한다. 이는 발명을 이해하기 위한 것으로, 용어의 의미는 설명되는 바에 의해 제한되지 않고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 용어의 의미를 포함한다.
본 발명에서, “유전영동(Dielectrophoresis, DEP)”은 극성이 없는 입자가 불균일한 교류 전기장에 노출되었을 때 쌍극성(dipole)이 입자에 유도되며, 유도된 입자와 전기장 사이의 상호작용으로 인해 힘이 발생하며, 발생된 힘을 통해 프로브 입자가 분극화(polarization)되는 것을 말한다. 입자의 분극성(polarizability)이 입자 주위를 둘러싼 용액의 분극성보다 클 경우 입자는 전기장이 강한 곳으로 이동하고(양의 유전영동, positive DEP). 반대로 입자의 분극성이 용액의 분극성보다 작을 경우에 입자는 전기장의 세기가 약한 방향으로 이동한다(음의 유전영동, negative DEP).
본 발명은 (a) 검출 물질이 흡착된 미세 프로브 입자를 포함하는 용액을 유전영동 칩에 담지하는 단계; (b) 유전영동 칩에 유전영동 신호를 적용하는 단계; (c) 미세 프로브 입자를 포착하고, 입자 이미지의 밝기 강도를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 입자 이미지 밝기 강도로 전이 주파수를 측정하는 단계;를 포함하는 다중 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 유전영동 칩은 마이크로섬유화(microfabrication) 제작 과정을 통한 다중선형전극으로, 절연기판에 크롬, 금, 백금 등의 전극을 증착시키고, CVD 또는 ALD 공정을 이용하여 세라믹 고분자를 추가적으로 증착된 것일 수 있다. 여기에서, 전극의 두께는 300 Å 내지 2 kÅ 범위일 수 있고, 세라믹 고분자는 Al2O3, TiO2, Si3N4, SiO2로, 전기인가조건(교류전압 및 주파수) 및 샘플용액에 의한 전극을 보호 (예를 들면, 유전체 절연파괴 및 전극 단락, 전극 표면에서의 산화 및 전기분해(electrolysis) 현상을 억제), 그리고 기타 전기동역학현상 (electrokinetic phenomena)를 억제하고, 전기유전영동현상을 대두하기 위한 목적으로 적절한 두께(예를 들어, 100 kÅ 내지 1000 kÅ)를 선택하여 사용한다. .
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 검출 물질과 특이적으로 결합하는 프로브 입자의 종류(예를 들어, 프로브 입자의 모양, 크기 등)를 다르게 구성한 후, 유동영동 칩에 표면 전하 차이를 감지한다. 예를 들어, 수은 이온의 검출을 위하여 10 ㎛의 폴리스티렌 프로브 입자를 사용하고, 은 이온의 검출을 위하여 15 ㎛의 폴리스티렌 프로브 입자를 사용할 수 있으나, 이는 예시적인 것으로 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 표면 전하 차이는 미세 프로브 입자의 수직 이동/위치에 따른 표면 전하 차이를 감지한다. 구체적으로, 프로브가 불균일한 전기장에 위치할 때, 칩 표면으로부터 프로브의 수직 위치(높이)는 퇴적력(sedimentary force) 및 수직 유전 영동 힘 사이의 평형 위치에 의해 결정된다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 미세 프로브 입자는 검출 물질이 흡착된 것이다. 상세하게는, 상기 단계 (a)의 미세 프로브 입자는 특이적 결합 상호작용에 의하여 검출 물질이 흡착된 것이다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 미세 프로브 입자는 검출 물질로 기능화된 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 미세 프로브 입자는 고분자 마이크로스피어(microsphere), 보다 상세하게는 폴리스티렌 마이크로스피어 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 검출 물질은 생체 분자이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 검출 물질은 생체 분자이고, 여기에서, 생체 분자는 화학작용기, 단백질, 효소, 항체, 항원, 핵산, ssDNA, ssRNA, dsDNA, dsRNA, 올리고뉴클레오티드, 엑소좀, DNA 압타머 또는 금속 이온-압타머 복합체이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 검출 물질은 생체 분자이고, 여기에서, 생체 분자는 화학작용기, 단백질, ssDNA, dsDNA, DNA 압타머 또는 금속 이온-압타머 복합체이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 화학작용기는 아민, 알데히드, 카르복실, 히드록실, DBCO, 숙신이미드, 아지드, 알킨, 티올, 말레이미드 및 숙신이미드로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화학작용기이고, 구체적으로 화학작용기는 아민, 알데히드 또는 카르복실이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단백질은 비오틴, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘-비오틴 또는 이의 유도체이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 금속 이온은 특별히 제한되지 않으나, Ag+, Ca2+, Cu2+, Fe3+, Hg2+, Mg2+, Mn2+, Ni2+를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 미세 프로브 입자는 크기가 1 내지 30 ㎛이다. 구체적으로, 상기 단계 (a)의 미세 프로브 입자는 크기가 5 내지 20 ㎛이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)의 미세 프로브 입자를 포함하는 용액은 버퍼 또는 물로 희석하여 제조된 것일 수 있다. 여기에서, 버퍼는 수크로오스, D-글루코스, 인산완충식염수, 소혈청 알부민 등을 포함하고, 물은 음용수, 탈이온수, 증류수를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 검출 물질을 미세 프로브 입자에 흡착시키기 위하여 배양하고, 헹구는 단계를 거칠 수 있다. 이는 해당 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 검출 물질 및 미세 프로브 입자의 종류에 따라 시간, 온도, 방법 등을 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이다. 본 발명에서, 미세 프로브 입자의 표면전하량, 미세 프로브 입자의 주성분 등에 유전영동 신호의 조절이 요구될 수 있고, 유전영동 신호의 방향성 또는 유전영동 신호의 크기변화를 고려하여 인가전압, 주파수 변화 범위 및 주파수 변화 속도가 각각 독립적으로 변경될 수 있다. 예를 들어, 미세 프로브 입자의 유전영동 특성에 따라 주파수 변화는 증가 또는 감소시킬 수 있다.
본 발명에서, 초기 전압 및 초기 주파수는 미세 프로브 입자를 유전영동 칩 표면으로부터 멀어지게 하는 것일 수 있다. 상세하게는, 초기 전압 및 초기 주파수는 미세 프로브 입자를 유전영동 칩 표면으로부터 멀어지게 할 수 있는 충분한 음의 유전영동 힘을 안정적으로 발생시킬 수 있는 범위에서 설정할 수 있고, 유전영동 칩 표면으로부터 멀어지는 것은 미세 프로브 입자를 포착하는 것에 의해 확인할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고, 여기에서, 초기 전압은 0.1 내지 2 Vp-p, 초기 주파수는 200 내지 500 kHz이다. 또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고, 여기에서, 초기 전압은 0.1 내지 1 Vp-p, 초기 주파수는 300 내지 400 kHz이다.
또한, 본 발명에서, 종료 전압 및 종료 주파수는 미세 프로브 입자를 유전 영동 칩 표면의 일정 범위에서 가라앉게 하는 것이다. 상세하게는, 종료 전압 및 종료 주파수는 미세 프로브 입자가 유전영동 칩 표면에 가라앉아 있으나, 미세 프로브 입자의 확산을 억제시키고 1 내지 2 픽셀 이내로 미세 프로브 입자의 중심점 위치를 국한할 수 있는 범위에서 설정할 수 있다. 상세하게는 미세 프로브 입자의 움직임은 열역학이론에 근거하여 브라운 모션과 같은 상태로 브라운 모션(Brownian motion)과 같은 상태로 확산 억제 및 국한되고, 이는 미세 프로브 입자를 포착하는 것에 의해 확인할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 종료 전압은 초기전압과 동일하며 (0.1 내지 2 Vp-p), 종료 주파수는 50 내지 200 kHz이다.
또한, 본 발명에서, 주파수 변화는 미세 프로브 입자의 높이변화가 수 초 이내로 안정화가능한 범위에서 설정할 수 있다. 상세하게는, 주파수는 미세 프로브 입자의 높이변화가 1 내지 10초, 구체적으로 1 내지 5초 이내 안정화되는 범위로 변화시키는 것이다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고, 여기에서, 주파수는 0.1 내지 5 kHz/s의 속도로 변화하는 것이다. 또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고, 여기에서, 주파수는 0.5 내지 2 kHz/s의 속도로 변화하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고, 주파수는 단계적으로 감소하며, 주파수 변화에 의한 프로브 입자의 수직위치가 안정되도록 각각 변화된 주파수에서 1 내지 10초 동안 지연시키는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (c)의 미세 프로브 입자 포착은 CCD 카메라 또는 CCD 고속 카메라로 초당 0.1 내지 10 프레임으로 캡쳐하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)의 입자 이미지 밝기 강도는 정규화된(normalized) 것이다. 상세하게는, 상기 정규화 방법은 종료 전압과 종료 주파수에서 촬영한 미세 프로브 입자 이미지의 평균 밝기 강도를 기준으로 촬영한 프로브 입자 이미지의 밝기를 보정하는 방법에 의한 것이다. 또한, 상기 정규화 방법에서 미세 프로브 입자 이미지의 평균 밝기 강도는 최종 10 내지 100개의 프레임을 사용한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)의 전이 주파수는 입자 이미지의 정규화된 밝기 강도의 임계값 전이가 발생하는 주파수이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (d)의 전이 주파수는 2선 회귀 선형 맞춤(two-line regression linear fit)을 사용하여 결정된 것이다.
구체적으로, 본 발명에서 전이 주파수는 입자가 표면과 상호 작용 전 수직 방향으로 이동하는 동적 상태(dynamic state)에서, 입자가 수직 방향으로 작은 진동 운동만을 하는 착지 상태(landing state)로 전이가 발생하는 주파수를 의미할 수 있다. 또한, 전이 주파수의 결정은 측정된 값을 기초로, 2선 회귀 선형 맞춤의 통계적 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 검출 한계(limit of detection, LOD)가 아토몰(attomolar) 내지 나노몰(nanomolar)이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 증류수에서 검출 한계가 아토몰(attomolar)이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 음용수에서 검출 한계가 펨토몰(femtomolar)이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 라벨링(labelling) 하는 단계를 포함하지 않는다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 검출물질의 프로브의 상호결합 결과를 확인할 수 있는 광학 라벨링 하는 단계를 포함하지 않고, 여기에서 광학 라벨링은 형광표지(fluorescent dyes)를 포함한다. 본 발명에서 후처리, 배양 등의 추가과정이 요구되지 않음으로써 비교적 간단한 과정에 의하면서도 우수한 검출 능력을 발휘한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 다중 검출 방법은 2 종류 이상의 검출 물질을 동시에 검출가능하다. 예를 들어, 2 종류 이상의 금속 이온(은 이온, 수은 이온 등)을 포함하는 경우, 이와 특이적 결합을 하는 각각의 프로브 입자를 준비하고 전기유전영동 칩에서 동시에 각각의 전이 주파수 차이를 확인함에 따라, 차이를 나타내는 주파수에 의해 샘플시료에서 각 금속 이온을 검출할 수 있다.
또한, 본 발명 다중 검출 방법은 농도에 따른 전이 주파수 차이(|Δ(f transition-f transition-control)|)가 선형 관계를 나타내는 구간을 확립하고, 이로부터 검출물질의 농도를 추정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 실험방법
<실시예 1-1> 재료 및 시약
디옥시올리고뉴클레오티드(deoxyoligonucleotide) (Cosmogenetech (Seoul, Republic of Korea)는 HPLC에 의해 정제되었으며, 서열은 하기 표 1에 나타난 바와 같다. 사용된 각 재료 및 시약은 하기와 같다.
- 일반 폴리스티렌 입자(polystyrene particle, 10㎛-radius) 및 카르복실기 기능화 폴리스티렌 입자(carboxyl group-functionalized polystyrene particle, 10㎛-, 15㎛-radius)
- 스트렙타비딘(Streptavidin)이 고정된 입자(10㎛)
- 1-에틸-3-디메틸아미노-프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylamino- propyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)), N하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide (NHS)), 2-n-모르폴리노 에탄술폰산(2-(n-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate (MES hydrate)), 비오틴(Biotin), AgNO3, CaCl2, CuCl2, FeCl3, HgCl2, MgCl2, MnCl2, NiCl2, 트리스-EDTA 완충액(Tris-EDTA buffer solution)
인산 완충 식염수(Phosphate-buffered saline), 탈이온수(Deionized water), 식수(Drinking water)
| 이름 | 수정 이름 | DNA 서열(5’→3’) | 용도 |
| 6T | 5′ -NH2-(CH2)12 | TTT TTT | 6A용 프로브(probe) |
| 6A | W/O modification | AAA AAA | 6T용 타겟(target) |
| 28nt | 5′ -NH2-(CH2)12 | TTT CTT TCT TCC CCC CGG TTG TTT GTT A | Hg2+용 프로브(probe) |
| 32nt | 5′ -NH2-(CH2)12 | CTC TCT TCT CTT CAT TTT TCA ACA CAA CAC AC | Ag+용 프로브(probe) |
<실시예 1-2> 스트렙타비딘-비오틴 복합체(streptavidin-biotin complex) 제조
순도 99% 비오틴 분자를 PBS 완충액에 용해시켜 10 μM 비오틴 스톡 용액을 제조하였다. 스트렙타비딘 입자를 비오틴 스톡 용액(1.86 * 105 particles mL-1)에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 전도도가 35 μS/cm인 2 μM PBS 완충액으로 용액을 헹구어 복합체를 제조하였다.
<실시예 1-3> 마이크로입자 프로브에서 올리고뉴클레오티드 기능화
마이크로입자의 표면은 다양한 올리고뉴클레오티드로 기능화 되었다 (표 1).
구체적으로, 3 mg/mL 카르복실기 기능화 폴리스티렌 입자를 1M MES 완충액에서 제조하였다. 입자의 카르복실기는 30분 동안 EDC 및 NHS로 활성화되었고, free EDC 및 NHS 분자를 제거하기 위해 원심분리를 사용하여 1M MES 완충액으로 헹구고, 5 μM의 아민-변형 올리고뉴클레오티드를 첨가하고 반응 혼합물에서 밤새 교반시켰다. 이후, 생성된 입자를 원심분리 및 재현탁에 의해 4회 정제하였다.
<실시예 1-4> DNA 혼성화 복합체 제조
DNA-DNA 혼성화 반응은 폴리-6 티민 단일가닥 DNA(6T)와 폴리-6 아데닌 단일 가닥 DNA(6A)으로 수행하였다.
구체적으로, 혼성화 반응을 위하여 1 μM 6A DNA 용액을 Tris-EDTA 완충액, 및 표 1에 따른 DNA 올리고뉴클레오티드의 서열에 준비하였다. A, T, C 및 G는 각각 DNA 서열에서 아데닌(adenine), 티민(thymine), 시토신(cytosine) 및 구아닌(guanine) 염기를 나타내고, 굵은 문자는 구조상 특정 금속 이온에 대해 상보적인 리간드 결합 부위를 나타내었다. 6T DNA 고정 입자 용액을 6A DNA 용액(1.86 * 105 particles mL-1)에 첨가하고, 40 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 용액을 1시간 동안 실온으로 냉각시키고, 입자-DNA 용액을 탈이온수로 세척하였다. 이후, 상기 35 μS/cm 전도도의 2 μM PBS 완충액으로 헹구어, 10 ㎛ 입자로 코팅된 6A DNA 혼성화 6T DNA(6T+6A)를 제조하였다.
<실시예 1-5> DNA-금속이온 복합체 제조
Ag+, Ca2+, Cu2+, Fe3+, Hg2+, Mg2+, Mn2+ 및 Ni2+ 이온을 포함한 모든 금속 용액은 탈이온수 또는 음용수에서 준비되었다. DNA-고정화 마이크로입자를 금속이온 용액(1.86 * 105 particles mL-1)에 첨가하고, 1시간동안 인큐베이션하였다. 이후, 용액을 상기 35 μS/cm 전도도의 2 μM PBS 완충액으로 헹구어, DNA-금속이온 복합체를 제조하였다.
<실시예 1-6> 제타 전위(Zeta potential) 측정
일반 폴리스티렌 입자 vs 카르복실기 기능화 폴리스티렌 입자, 스트렙타비딘 입자 vs 스트렙타비딘-비오틴 기능화 입자, 6T 입자 6T+6A 입자 및 28nt 입자 vs 28nt-Hg2+ 입자의 제타 전위를 측정하였으며, 제타 전위는 Zetasizer Nono ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK)으로 측정하였다.
각 입자는 상기 시험 완충액(1.86 × 105 particles mL-1)으로 별도로 침지시켰다. 각 입자 용액을 초음파 배스(ultrasonic bath)에서 3분 동안 초음파처리하여 샘플에 입자를 분산시키고, 이를 Zetasizer 셀에 주입하고 10회씩 측정하였다.
<실시예 1-7> 유전영동(DEP) 실험방법
폭 8 mm, 높이 20 mm DEP 칩에 PDMS 원형 도넛 모양의 저장소를 부착하여 미세 프로브 입자 용액을 담지하였다. 반경 10 ㎛ 입자, 반경 15 ㎛ 입자, 또는 반경 10 입자와 15 ㎛ 입자를 포함하는 액체를 내부 원형 영역에 주입하고, 증발 방지를 위해 커버 유리로 덮었다. 이후, DEP 신호를 DEP 칩에 적용하고, 맞춤형 프로브 스테이션(probe station)을 사용하여 미세입자를 관찰하였다. Function Generator(NI PCI-5421, National Instrument, Austin, TX, USA)를 사용하여 초기 입력 전압 0.6Vp-p, 주파수 350 kHz를 적용하였다.
DEP 시스템의 평면도 이미지는 브라이트 필드 현미경(bright-field microscope)에 연결된 CCD 카메라로 초당 1 프레임의 속도로 캡처하였다. 이후, 주파수는 1 kHz/s의 속도로 350 kHz에서 75 kHz로 단계적으로 감소시켰으며, 각각의 새로운 주파수에서 5초동안 고정하였다. (예를 들어, 350 kHz에서 349 kHz로 1초 간격으로 이동 후, 349 kHz를 4초 동안 인가한 후 1초 간격으로 348 kHz로 이동)
<실시예 2> 유전영동 표면 전하 검출 방법의 특성화
<실시예 2-1> DEP 표면 전하 감지방법의 작동 배경
마이크로입자 프로브의 수직 이동을 관찰하여 다양한 유형의 생체 분자에 대한 표면 전하 차이의 감지를 위한 시스템은 도 1A에 나타난 바와 같다. 도 1A에 나타난 바와 같이, 표면 전하가 다른 프로브가 칩의 균일하지 않은 전기장에 있을 때 프로브의 수직 위치는 퇴적력(sedimentary force) 및 수직 DEP 힘(vertical DEP force) 사이의 평형 위치에 의해 결정된다. 다양한 시스템에서 표면 전하를 감지하는 시스템의 능력을 입증하기 위해, 도 1B와 같이 기능화된 입자 프로브로 표면 전하를 변경하는 상기 실시예 1에서와 같은 4가지 방법(표면 기능화, 리간드-수용체 상호작용, DNA 혼성화 및 표적분자검출)으로 확인하였다.
표면기능으로 인해 전하를 감지하는 방법은 일반 입자와 카르복실기 기능화된 입자로 조사하였으며, 리간드-수용체 상호작용은 스트렙타비딘 코팅 입자 및 스트렙타비딘-비오틴 코팅 입자를 사용하여 조사하였고, DNA 혼성화 검출은 ssDNA 코팅 입자 및 dsDNA 코팅 입자를 사용하여 조사하였으며, 금속이온 킬레이트의 유무에 따른 DNA 압타머 기능화된 입자를 사용하여 표적분자검출을 확인하였다. 구체적으로, 수은 이온(II) 및 은 이온(I) 특이적 결합 DNA 압타머 서열을 준비하였다.
표면 전하 판별은 다음과 같은 절차에 의해 수행하였다.
- 표면 기능화된 입자 프로브가 있는 용액이 서로 맞물린 DEP 칩에 도입되면, 프로브가 불균일한 전기장이 없을 때 무작위로 분포된다(도 1A-i 및 도 1A-iv). 특정 주파수를 가진 인가된 전기장에서, 프로브에 작용하는 음의 DEP 힘에 의하여 프로브는 두 개의 원형창 사이에 정렬된다(도 1A-ii). 입자 프로브는 전기 신호가 인가될 때 프로브에 작용하는 퇴적력와 수직 DEP 힘이 균형을 이루는 DEP 칩 기판 높이에 정렬된다(도 1A-ii). 평형 입자 프로브가 있는 상태는 DEP 표면 전하 검출 방법을 위한 초기 상태로 정의되고, DEP 힘 감소의 함수로 수직 이동을 관찰하는데 추가로 사용된다.
<실시예 2-2> DEP 표면 전하 검출방식 측정 원리
입력 주파수의 감소에 따라 DEP 힘이 퇴적력와 균형을 이루는 수직 위치는 수직 전기장 기울지의 재분배로 인해 낮아진다. 따라서, 입자 프로브는 초기 상태에서 감소하는 입력 주파수에 의해 새로 결정되는 수직 아래로 이동한다. 4가지 대표적인 입력 주파수 350, 250, 150, 75 kHz에서 일반 입자 프로브의 이미지는 도 2에 나타난 바와 같다(도 2A). 입력 전압 0.6 Vp-p 및 입력 주파수 350 kHz의 초기 상태에서 입력 주파수를 입력 전압을 유지한 상태로 75 kHz로 낮추었다. 입력 주파수는 각 상태에서 4초의 안정화 기간을 가지고 1 kHz/s로 낮추었다.
입력 주파수가 낮아짐에 따라 입자 이미지(Iparticle)의 밝기 강도가 변하였으며, 이는 도 2에 나타난 바와 같다(도 2A). 입력 주파수가 감소했을 때 입자 프로브의 정규화된 밝기 강도 변화(normalized brightness intensity variation)가 나타났으며, 이는 도 2에 나타난 바와 같다(도 2B). 밝기 강도의 정규화는 최종 50개 프레임을 사용하여 베이스라인 보정에 의해 수행되었다.
입자 이미지의 정규화된 밝기 강도(ΔIparticle)는 초기 상태의 최소값에서 최대값으로 변경됨에 따라 증가하였다. ΔIparticle이 최대값에 도달하면 ΔIparticle이 특정 임계값에 도달할 때까지 일정한 기울기로 감소한다고 가정할 수 있으며, 임계값에 도달한 경우 다른 기울기의 선형 관계를 따르는 것을 확인하였다(도 2B). 첫 번째 급경사는 ΔIparticle 값의 동적 변화로, 입자가 표면과 상호 작용하기 전에 수직으로 이동함을 나타낸다. 두 번째 기울기는 입자가 표면에 근접하여 수직 방향으로 작은 진동 운동만 관찰되는 영역으로, 착지 상태(landing state)를 나타낸다. 이를 기반으로, 동적 상태(dynamic state)에서 착지 상태(landing state)로의 전이가 발생하는 전이 주파수(f transition)를 정의 할 수 있으며, 2선 회귀 선형 맞춤(two-line regression linear fit)을 사용하고, 두 선의 교차점을 전이 주파수로 정의하였다.
<실시예 2-3> 다양한 생체 분자의 입자 프로브 전이 주파수
상기 실시예 1에 따른 입자 프로브의 4가지 쌍(일반 vs 카르복실화 입자 / 스트렙타비딘 vs 스트렙타비딘-비오틴 기능화 입자 / 6T vs 6T+6A 코팅 입자 / 28nt 압타머 vs Hg2+ nt 압타머 코팅 입자)로 표면 전하 검출 방법을 실시하였다.
표면 전하 검출 방법이 각각의 입자 프로브를 구별하는 것을 확인하였다(도 3A). 또한, 기능화된 입자 프로브의 전이는 2선 회귀 선형 방법 방법을 특징으로 하는 것을 확인하였다(도 3B). 또한, 표시된 각 제타 전위 결과를 비교하여, 각 프로브 쌍의 더 큰 음의 제타 전위를 가진 프로브는 쌍의 더 높은 f transition를 생성하고, 이는 더 많은 음으로 대전된 입자가 더 높은 f transition에서 0의 힘(착지 상태)에 접근하는 것을 확인하여 DEP 이론과 일치하는 것을 확인하였다(도 3C). 또한, DC 및 AC 전기장에 의한 분극 차이 또는 분자 구조의 복잡성으로 인해, 제타 전위와 f transition의 관계가 서로 다른 분자 구조 간의 비교에서는 불일치하는 보여주는 것을 확인하였다(도 3B 및 도 3C).
<실시예 3> 유전영동 표면전하 검출 방법 평가
<실시예 3-1> DEP 표면 전하 검출 방법의 감도(sensitivity) 평가
상기 방법의 검출 능력을 다양한 표적 분자에 대한 펨토몰(femtomolar, fM) 검출 한계(limit of detection, LOD)를 비교하였다. 기능화된 입자 프로브의 순차 이미지는 10 aM에서 10 μM의 다양한 Hg2+ 농도에서 입력 주파수가 감소됨에 따라 캡쳐되고, 각 Hg2+ 농도에 대한 순차적 이미지의 정규화된 밝기 강도를 확인하였으며, 그 결과는 도 4A에 나타난 바와 같다.
정규화된 밝기 강도 플롯을 기반으로 금속 이온 유무에 따른 전이 주파수(f transition)의 절대값 차이(=|Δ(f transition-f transition-control)|)가 각 Hg2+ 농도에 따라 결정되었고, 그 결과는 도 4B에 나타난 바와 같다. 특히, 현재 DEP 전하 검출 방법은 같은 환경에서 수많은 프로브(~ 2 × 102 particle/mm2)를 동시에 측정하였고, 도 4B에 나타난 바와 같이 f transition과 Hg2+ 농도 사이에 선형 관계가 있는 것을 확인하였다. 또한, 검출 최저 농도가 아토몰(attomolar, aM) 범위에 있고, 검출 한계(LOD)가 ~5.6 aM(in DI water)로 추정되는 것을 확인하였다.
<실시예 3-2> DEP 표면 전하 검출 방법의 선택성(selectivity) 평가
28nt 압타머 프로브 입자가 다양한 간섭 이온과 상호 작용할 때의 측정결과를 통해 상기 방법의 선택성을 확인하였다. Hg2+ 이온을 감지하도록 설계된 28nt로 코팅된 입자 프로브를 10 μM의 Ag+, Ca2+, Cu2+, Fe3+, Mg2+, Mn2+, Na+, Ni2+ 또는 10 nM의 Hg2+ 이온을 포함하는 탈이온수에 넣었다. 1000 : 1 (10μM : 10 nM) 농도비에서도, 간섭 이온(Ag+ 등)의 측정된 값(=|Δ(f transition-f transition-control)|)은 1.2~16 kHz 범위에 있는 반면 10 nM Hg2+ 이온의 측정값은 약 35 kHz로 나타난 것을 확인하였다(도 4C). 이로부터 DNA 압타머 기능화된 입자 프로브가 다른 간섭 이온보다 Hg2+ 이온에 의해 더 크게 영향 받는다는 것을 확인하였다. 따라서, 간섭 이온이 1000배 농축된 경우에도 입자 프로브에 표적 이온을 위한 압타머를 도입하는 경우, 표적 이온에 대한 높은 선택성을 가지는 것을 알 수 있다.
또한, 음용수에서 상기 방법을 통해 민감도를 확인하였다. 음용수에는 다양한 이온과 미네랄이 포함되어 있어 감지 성능이 저하될 수 있다. 음용수 모델에서 최저 검출 농도 및 검출 한계(LOD)가 5.6 aM에서 7.7 fM으로 이동하여 LOD가 증가하였음에도 본 발명은 기존 기술에 비해 우수한 검출 성능을 나타내는 것을 확인하였다(표 2A). 또한, 일반적으로 감도를 높이기 위해서는 별도의 준비 과정이나 Hg2+ 배양후 후처리와 같은 과정이 요구되나, 본 발명은 DNA 압타머 기능화 후 2단계 준비과정(표적 분자 배양 및 프로브 정제)라는 비교적 간단한 과정을 거쳐 우수한 검출능력을 나타내었다.
| (A) Hg 2+ 검출 | |||
| 검출 방법 | 선형 범위(linear range) (Molarity) |
검출 한계(LOD) (Molarity) |
참조 |
| 광학 (Optical (counting of binding probes)) |
1 × 10-10 ~ 1 × 10-7 | 2.7 × 10-11 | Chun et al., 2018 |
| 형광 (Fluorescence) |
1 × 10-9 ~ 6 × 10-8 | 3.9 × 10-10 | Gu et al., 2017 |
| 측색 (Colorimetry) |
1 × 10-9 ~ 1 × 10-8 | 5.1 × 10-10 | Li et al., 2018 |
| 전기화학 임피던스 (Electrochemical Impedance Analysis) |
5 × 10-11 ~ 1 × 10-7, 10-7 ~ 10-5 | 1.6 × 10-12 | Hong et al., 2017 |
| 단일벽 탄소나노튜브 전계효과 트랜지스터 (Single-walled carbon nanotube Field Effect Transistor) |
1 × 10-11 ~ 1 × 10-8 | 1.0 × 10-11 | Wang et al., 2018 |
| 전기화학적 차동 펄스 전압전류법 (Electrochemical Differential Pulse Voltammetry) |
1 × 10-12 ~ 1 × 10-6 | 2.2 × 10-13 | Wang et al., 2021 |
|
유전영동 모션
(DEP motion) (본 발명) |
1 × 10 -14 ~ 1 × 10 -5 | 7.7 × 10 -15 | 본 발명 |
| (B) Hg 2+ 및 Ag + 동시 검출 | |||
| 검출 방법 | Hg2+ 검출 한계(LOD) (Molarity) |
Ag+ 검출 한계(LOD) (Molarity) |
참조 |
| 형광 (Fluorescence) |
2.7 × 10-7 | 4.5 × 10-7 | Chun et al., 2018 |
| 측색 (Colorimetry) |
5.7 × 10-7 | 1.92 × 10-6 | Phichi et al., 2020 |
| 형광 (Fluorescence) |
1.3 × 10-12 | 3.4 × 10-11 | Ravikumar et al., 2018 |
| 형광 (Fluorescence) |
4.8 × 10-9 | 1.0 × 10-9 | Ren et al., 2017 |
| 형광 (Fluorescence) |
7.9 × 10-7 | 2.5 × 10-7 | Xiao et al., 2021 |
|
유전영동 모션
(DEP motion) (본 발명) |
2.4 × 10-14 | 2.6 × 10-9 | 본 발명 |
<실시예 3-3> DEP 표면 전하 검출 방법의 무라벨(label-free) 다중 검출 평가
Ag+ 특이적 압타머 프로브를 사용하여 Ag+의 감도를 측정하였다. 측정 결과 넓은 선형 검출 범위(10 pM ~ 10 μM)와 우수한 검출 한계(115 fM in DI water, 265 fM drinking water)를 나타내었다.
동일한 환경에서 28nt 코팅 입자와 32nt 코팅 입자를 동시에 사용하여 두 개의 서로 다른 입자 프로브를 사용하여, Hg2+ 및 Ag+ 이온을 검출하는 방법을 나타내었다(도 5A). 탈이온수 및 음용수에서 Hg2+ 및 Ag+ 이온 동시 검출에 대한 평균 f transition를 확인하였다(도 5B 및 도 5C).
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명으로 두 이온의 농도를 명확히 구분할 수 있으며, 광범위한 농도(pM ~ μM)에서 다중 검출이 가능함을 확인하였다. 또한, 본 발명의 검출 한계(LOD)는, 예를 들어, 음용수(drinking water)에서 Hg2+의 경우 24.1 fM, Ag+의 경우 2.57 nM로 확인되어 FDA 이온 농도 표준을 검출하기에 충분한 것을 확인하였다. 또한, 다른 중금속 이온 검출과 비교하여 검출 한계 측면에서 우수함을 확인하였다(표 2B).
따라서, 본 발명은 입자 프로브의 유전 영동 거동을 광학적으로 관찰하여, 생체 분자 기능화된 입자 프로브 사이의 표면 전하 차이를 감지하는 새로운 방법에 해당한다. 본 발명에 따른 방법은 다양한 생체 분자에서 생성된 표면 전하 차이의 검출에 사용될 수 있고, 표적 이온에 대한 우수한 감도 및 선택성을 나타내며, 2 이상의 서로 다른 이온을 동시에 무표지로 검출할 수 있는 우수한 성능을 나타낸다.
Claims (18)
- (a) 검출 물질이 흡착된 미세 프로브 입자를 포함하는 용액을 유전영동 칩에 담지하는 단계;
(b) 유전영동 칩에 유전영동 신호를 적용하는 단계;
(c) 미세 프로브 입자를 포착하고, 입자 이미지의 밝기 강도를 측정하는 단계; 및
(d) 상기 입자 이미지 밝기 강도로 전이 주파수를 측정하는 단계;를 포함하는 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 다중 검출 방법은 표면 전하 차이를 감지하는 것인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 검출 물질은 생체 분자인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 검출 물질은 생체 분자이고,
여기에서, 생체 분자는 화학작용기, 단백질, 효소, 항체, 항원, 핵산, ssDNA, ssRNA, dsDNA, dsRNA, 올리고뉴클레오티드, 엑소좀, DNA 압타머 또는 금속 이온-압타머 복합체인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 미세 프로브 입자는 크기가 1 내지 30 ㎛인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고,
여기에서, 초기 전압 및 초기 주파수는 미세 프로브 입자를 유전영동 칩 표면에서 멀어지게 하는 것인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고,
여기에서, 종료 전압 및 종료 주파수는 미세 프로브 입자를 유전 영동 칩 표면의 일정 범위에서 가라앉게 하는 것인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)의 유전영동 신호는 주파수 변화에 의한 것이고,
여기에서, 주파수는 미세 프로브 입자의 높이변화가 1 내지 10초 이내 안정화되는 범위로 변화시키는 것인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (c)의 미세 프로브 입자 포착은 CCD 카메라 또는 CCD 고속 카메라로 초당 0.1 내지 5 프레임으로 캡쳐하는 것인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (d)의 입자 이미지 밝기 강도는 정규화된(normalized) 것인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (d)의 전이 주파수는 입자 이미지의 정규화된 밝기 강도의 임계값 전이가 발생하는 주파수인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (d)의 전이 주파수는 2선 회귀 선형 맞춤(two-line regression linear fit)을 사용하여 결정된 것인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 다중 검출 방법은 검출 한계(limit of detection, LOD)가 아토몰(attomolar) 내지 나노몰(nanomolar)인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 다중 검출 방법은 증류수에서 검출 한계가 아토몰(attomolar)인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 다중 검출 방법은 음용수에서 검출 한계가 펨토몰(femtomolar)인, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 다중 검출 방법은 라벨링(labelling) 하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 다중 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 다중 검출 방법은 2 이상의 검출 물질을 동시에 검출가능한 것을 특징으로 하는, 다중 검출 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220115866A KR20240037439A (ko) | 2022-09-14 | 2022-09-14 | 전기유전영동 핀셋을 이용한 표면전하 의존 다중검출법 |
| PCT/KR2023/005118 WO2024058331A1 (ko) | 2022-09-14 | 2023-04-14 | 전기유전영동 핀셋을 이용한 표면전하 의존 다중검출법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220115866A KR20240037439A (ko) | 2022-09-14 | 2022-09-14 | 전기유전영동 핀셋을 이용한 표면전하 의존 다중검출법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240037439A true KR20240037439A (ko) | 2024-03-22 |
Family
ID=90275388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220115866A KR20240037439A (ko) | 2022-09-14 | 2022-09-14 | 전기유전영동 핀셋을 이용한 표면전하 의존 다중검출법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240037439A (ko) |
| WO (1) | WO2024058331A1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021509265A (ja) | 2017-12-19 | 2021-03-25 | バイオロジカル ダイナミクス，インク． | 生体サンプルからの複数の分析物の検出のための方法およびデバイス |
| KR20210102363A (ko) | 2018-12-12 | 2021-08-19 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 중합성 액정 잉크 제형 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009048878A2 (en) * | 2007-10-09 | 2009-04-16 | University Of Notre Dame Du Lac | Microfluidic platforms for multi-target detection |
| KR102222061B1 (ko) * | 2018-08-31 | 2021-03-03 | 연세대학교 원주산학협력단 | 유전영동을 이용한 주파수의 급격한 변화를 통한 세포 종류 구분 및 특성 분석법 |
-
2022
- 2022-09-14 KR KR1020220115866A patent/KR20240037439A/ko unknown
-
2023
- 2023-04-14 WO PCT/KR2023/005118 patent/WO2024058331A1/ko unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021509265A (ja) | 2017-12-19 | 2021-03-25 | バイオロジカル ダイナミクス，インク． | 生体サンプルからの複数の分析物の検出のための方法およびデバイス |
| KR20210102363A (ko) | 2018-12-12 | 2021-08-19 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 중합성 액정 잉크 제형 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Chalklen, T. et al., 2020, Sensors 20 (19), 5605. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024058331A1 (ko) | 2024-03-21 |
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