TW200914467A - A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides - Google Patents

A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides Download PDF

Info

Publication number
TW200914467A
TW200914467A TW097127550A TW97127550A TW200914467A TW 200914467 A TW200914467 A TW 200914467A TW 097127550 A TW097127550 A TW 097127550A TW 97127550 A TW97127550 A TW 97127550A TW 200914467 A TW200914467 A TW 200914467A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
ser
leu
gly
val
Prior art date
Application number
TW097127550A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephan Fischer
Erhard Kopetzki
Stefan Ries
Suryanarayana Sankuratri
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of TW200914467A publication Critical patent/TW200914467A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

200914467 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗CD4抗體及抗融合肽之結合物，其中2 至8個抗融合肽各自與抗CD4抗體之重鏈及/或輕鏈的—末 端結合。該等抗融合肽在胺基酸水準上可不同、相似或相 同。 【先前技術】 人類免疫缺陷病毒（HIV)感染細胞藉由待感染細胞的膜 與病毒膜融合之過程實現。提出此過程之一般流程：病毒 包膜醣蛋白複合物（gpl20/gp41)與位於待感染細胞之膜上 的細胞表面受體相互作用。gpl2〇與（例如）與共受體（諸如 CCR-5或CXCR-4)組合之cd4受體結合，導致gpuo/gpw複 合物之構形發生變化。由於此構形變化，gp4丨蛋白能插入 乾細胞之膜中。此插入為膜融合過程之開始。已知由於多 態現象天然存在，因此不同HI V病毒株中gp4i蛋白之胺基 酸序列不同。然而可識別出相同結構域構造，確切而言為 融合信號、兩個七肽重複結構域（HR1、HR2)及跨膜結構 域（以N末端至C末端方向）。據提議，融合（或致融）結構域 參與插入細胞臈及細胞膜之解體。HR區由包含7個胺基酸 ("七肽"）之多個片段組成（參見例如shu，w等人，
Biochemistry 38 (1999) 5378-5385)。除七肽外，存在一或 多個白胺酸拉鏈樣基元。此組成造成gp4 1蛋白之捲曲螺旋 結構的形成且正好亦造成源自此等結構域之肽的形成。捲 曲螺旋一般為由兩個或兩個以上相互作用之螺旋組成的寡 132628.doc 200914467 聚物。具有由gP41之HR1或HR2結構域所推導之胺基酸序 列的肽為抑制HIV攝入細胞内的有效活體外及體内抑制劑
(例如肽’參見例如 US 5,464,933、US 、US 6,258,782、US 6,348,568 或 US 6,656,906)。舉例而言， T20(亦稱為 DP178、Fuzeon®、HR2 狀）、T651(US 6,479，055)及 T2635(WO 2004/029074)為 HIV感染的極有效 抑制劑。已嘗試以例如胺基酸取代或化學交聯增強HR2衍 生肽之功效（Sia，S.K.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 14664-14669，Otaka，A.荨人，Angew. Chem. Int.
Ed. 41 (2002) 2937-2940) ° 肽與特定分子之結合可改變其藥物動力學性質，例如可 增加該等肽結合物之血清半衰期。已關於例如聚乙二醇 (PEG)及介白素-6(EP 0 442 724)、PEG及紅血球生成素 (WO 01/02017)、包含内皮抑制素（Endostatin)及免疫球蛋 白之嵌合分子（US 2005/008649)、基於分泌之抗體之融合 蛋白（US 2002/147311)、包含白蛋白之融合多肽（US 2005/0100991 ;人類血清白蛋白，US 5，876,969)、聚乙二 醇化多肽（US 2005/0114037)及干擾素融合物報導了結合 物。現有技術中亦描述包含介樂寧（Gelonin)及抗體之免疫 毒素（WO 94/26910)、經修飾之轉鐵蛋白·抗體融合蛋白 (US 2003/0226155)、抗體-細胞因子融合蛋白（US 2003/0049227)及由具有免疫刺激、跨膜輸送或嗜同性活性 之肽與抗體組成之融合蛋白（US 2003/0103984)。在WO 2004/085 5 05中，報導了由與巨分子化學連接的生物活性 132628.doc 200914467 化合物組成的長效生物活性結合物。 T-淋巴細胞視表面醣蛋白CD4及CD8之存在分為CD4 + -T-細胞及CD8 + -T-細胞。CD4表面醣蛋白之複合可起始（例 如）T-細胞增殖或淋巴介質釋放。CD4為55 kDa之膜醣蛋 白’其藉由與MHC第II類抗原在於T細胞上呈現抗原特異 性受體之肽的抗原呈現細胞上相互作用，從而在T細胞反 應起始中起重要作用。該等作用經由具有p56〗Ck(T淋巴細 胞活化中涉及之酪胺酸激酶）之細胞質域中之基元傳遞至 細胞夤（Brady，R.L 及 Barclay，A.N.，Curr. Top. Microbiol.
Immunol. 205 (1996) 1-18 ; Rudd，C.E·等人，proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5190-5194 ; Weilette，A.等人， Eur. J· Immunol. 20 (1990) 1397-1400)。CD4表面受體為進 入細胞所需之HI-病毒的標靶。CD4+-淋巴細胞在經HIV感 染時變得不具功能性。 在US 2006/0121480中，報導一種藉由將標靶細胞暴露 於至少一種附著抑制劑及至少一種融合抑制劑之協同組合 來預防輔體τ及其他標靶細胞受出…丨感染的方法。在w〇 2004/103312中，報導適用作HIV融合抑制劑之肽。抗(：£>4 分子與HIV-1融合抑制肽之結合物報導於w〇 2〇〇1/43779 中。FC嵌合蛋白及抗HIV藥物報導於w〇 2〇〇4/ι〇8885中。 【發明内容】 本發明包含-種包含兩個或兩個以上抗融合肽及一個抗 CD4抗體（mAb CD4)之結合物，其特徵在於⑴個抗融合 肽各自與該抗CD4抗體之重鏈及/或輕鏈之—末端結合（許 132628.doc 200914467 多8個抗融合肽/mAb CD4僅在mAb CD4包含8個末端，亦 即由（例如）兩個重鏈及兩個輕鏈構成時為可能的；若mAb CD4包含較少數量之c末端及N末端（例如作為scFv)，則結 合物中最大可能之相應抗融合肽之數目亦減少，亦即減少 至少於8個）。 在一實施例中，抗CD4抗體鏈之羧基末端胺基酸與抗融 合肽之胺基末端胺基酸結合或抗融合肽之缓基末端胺基酸 與該抗體鏈之胺基末端胺基酸結合，較佳係在有或無中間 (、 連接子之情況下經肽鍵結合。 在另一實施例中，結合物係由如下通式表徵： mAb CD4-[連接子]m-[抗融合肽]n 其中對於各抗融合肽而言m獨立地為〇(亦即，mAb (：£)4與 抗W合肽之間為肽鍵）或1(亦即，mAb CD4與抗融合狀之間 有連接子）且!!為2至8之整數，在一實施例中，為2至8之偶 數，較佳為2或4。 〇 纟—實施例巾，mAb CD4之重鏈及/或輕鏈與抗融合狀 之較佳結合物(”鏈結合物")係選自由以下各物組 N末端至C末端方向）： 群（以 (1)[抗融合肽Μ連接子]m-[重鏈] - (2)[重鏈H連接子]m_[抗融合肽] (3) [抗融合肽]_[連接子U-[重鏈]-[抗融合肽] (4) [抗融合肽]-[連接子^ -[輕鏈] (5) [輕鏈]-[連接子]m_[抗融合肽] ()[抗融合肽]_[連接子U輕鏈Η抗融合肽] 132628.doc 200914467 (7) [抗融合肽]-[連接子]m-[重鏈]-[連接子]m-[抗融合肽] (8) [抗融合肽]-[連接子]m-[輕鏈]-[連接子]m_[抗融合肽] 其中’該鏈結合物中（其中或之間）之連接子可相同或不 同’其中m為1或0之整數，且該鏈結合物（其中或之間）的111 可獨立地相同或不同。肽或mAb CD4鏈之左側意謂n末 端，右側意謂C末端。因此在（1)中’抗融合肽之c末端藉 由肽鍵或連接子與mAb CD4的重鏈之N末端連接。 在另一實施例中，鏈結合物經組裝成包含mAb CD4(例 如’由兩個輕鏈及兩個重鏈組成，包括恆定Fc域、scFv片 段或Fab片段）之本發明結合物。 較佳鏈結合物為（2)、（3)、（4)及（7)。本發明之較佳結合 物包含2x[mAb CD4輕鏈]及2x(2)、2x[mAb CD4輕鏈]及 2x(3)或 2x[mAb CD4 重鏈]及 2χ(4)，或 2x[mAb CD4 輕鏈]及 2χ(7)。重鏈及/或輕鏈較佳包含丨亙定區。 在另一實施例中’本發明之結合物之特徵在於包含由免 疫球蛋白構架及選自SEQ ID NO: 29、30或31之重鏈CDR3 序列的CDR3區組成之可變重鏈結構域。 在另一實施例中，該結合物之特徵在於包含由免疫球蛋 白構架及選自SEQ ID NO·· 29、30或31之CDR3序列的CDR3 區、選自SEQ ID NO: 26、27或28之CDR2序列的CDR2區及 選自SEQ ID NO: 23、24或25之CDR1序列的CDR1區組成之 可變重鏈結構域。 在另一實施例中’該結合物之特徵在於包含一重鏈可變 域，其中該重鏈可變域包含SEQ ID NO: 08或10。 132628.doc -10- 200914467 在一實施例中，該結合物之特徵在於包含由免疫球蛋白 構架及選自SEQ ID NO·· 13、14、15或16之CDR1區、選自 SEQ ID NO: 17、18 或 19 之 CDR2 區及選自 SEQ ID NO: 20、21或22之CDR3區組成的可變輕鏈結構域。 在另一實施例中，該結合物之特徵在於包含SEQ ID NO: 07之CDR作為重鏈CDR及SEQ ID NO: 01之CDR作為輕鏈 CDR、SEQ ID NO: 08之 CDR作為重鏈 CDR及 SEQ ID NO: 02之CDR作為輕鏈CDR、SEQ ID NO·· 10之CDR作為重鏈 CDR 及 SEQ ID NO: 04 之 CDR 作為輕鏈 CDR、SEQ ID NO: 11之CDR作為重鏈CDR及SEQ ID NO: 05之CDR作為輕鏈 CDR 或 SEQ ID NO: 12 之 CDR 作為重鏈 CDR 及 SEQ ID NO: 06之CDR作為輕鏈CDR。 在一實施例中，該結合物之特徵在於包含獨立地選自以 下各物之可變重鏈結構域及可變輕鏈結構域： a) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 07界定之重鏈可變域及由胺 基酸序列SEQ ID NO: 01界定之輕鏈可變域； b) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 08界定之重鏈可變域及由胺 基酸序列SEQ ID NO: 02界定之輕鏈可變域； c) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 10界定之重鏈可變域及由胺 基酸序列SEQ ID NO: 04界定之輕鏈可變域； d) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 11界定之重鏈可變域及由胺 基酸序列SEQ ID NO: 05界定之輕鏈可變域； e) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 12界定之重鏈可變域及由胺 基酸序列SEQ ID NO: 06界定之輕鏈可變域。 132628.doc 11 200914467 在另一實施例中，該結合物之特徵在於包含由胺基酸序 列SEQ ID NO: 07界定之重鏈可變域及由胺基酸序列SEQ ID NO: 01界定之輕鏈可變域；或由胺基酸序列SEQ ID NO: 08界定之重鏈可變域及由胺基酸序列SEQ ID NO: 02 界定之輕鏈可變域；或由胺基酸序列SEQ ID NO: 10界定 之重鏈可變域及由胺基酸序列SEQ ID NO: 04界定之輕鏈 可變域；由胺基酸序列SEQ ID NO: 11界定之重鏈可變域 及由胺基酸序列SEQ ID NO: 05界定之輕鏈可變域；或由 胺基酸序列SEQ ID NO: 12界定之重鏈可變域及由胺基酸 序列SEQ ID NO: 06界定之輕鏈可變域；選自胺基酸甘胺 酸（G)及天冬醯胺酸（N)、三肽GST及SEQ ID NO: 46至76之 連接子；及選自SEQ ID NO: 35至44之抗融合肽之抗融合 肽。 在一實施例中，該結合物之特徵在於包含選自抗融合肽 C34、T20、T1249、T651、T2635、N36、DP107 或 afp-Ι 之 抗融合狀。 在另一實施例中，該結合物之特徵在於在重鏈之各c末 端或在輕鏈之各N末端包含抗融合肽（兩個抗融合肽）。在 一實把例中，該結合物之特徵在於在重鏈之各C末端及在 輕鏈之各N末端包含抗融合肽（四個抗融合肽）。在另一實 施例中，該結合物之特徵在於在重鏈之兩個c末端及在輕 鏈之兩個N末端包含抗融合肽（四個抗融合肽）。 在實鉍例中，該結合物之特徵在於包含SEQ ID NO: 01之兩個輕鏈可變域，各自包含SEQ ID N〇: 〇7之重鏈可 132628.doc -12- 200914467 變域、SEQ ID NO: 75之連接子及SEQ ID NO: 42之抗融合 肽的兩個（2)型結合物；特徵在於包含SEQ ID NO: 02之兩 個輕鏈可變域，各自包含SEQ ID NO: 08之重鏈可變域、 SEQ ID NO: 75之連接子及SEQ ID NO: 42之抗融合肽的兩 個（2)型結合物；特徵在於包含SEQ ID NO: 04之兩個輕鏈 可變域，各自包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變域、SEQ ID NO: 75之連接子及SEQ ID NO: 42之抗融合肽的兩個（2)型 結合物；特徵在於包含SEQ ID NO: 05之兩個輕鏈可變 域，各自包含SEQ ID NO: 11之重鏈可變域、SEQ ID NO: 75之連接子及SEQ ID NO: 42之抗融合肽的兩個（2)型結合 物；或特徵在於包含SEQ ID NO: 06之兩個輕鏈可變域， 各自包含SEQ ID NO: 12之重鏈可變域、SEQ ID NO: 75之 連接子及SEQ ID NO: 42之抗融合肽的兩個（2)型結合物。 在一實施例中，該結合物之特徵在於該抗CD4抗體為 IgG 1子類或IgG4子類。在一實施例中，該抗CD4抗體亦為 IgG4或IgGl或IgG2子類，其在胺基酸位置S228、L234、 L23 5及/或D265具有突變，及/或含有PVA236突變。在另一 實施例中，該結合物之特徵在於該IgG4子類之抗CD4抗體 具有S22 8P突變且該IgGl子類之抗CD4抗體具有L234A及 L235A突變。 本發明包含一種產生本發明之結合物之方法，特徵在於 該方法包含： a)在適於表現該結合物之條件下，培養含有一或多個各 自含有一或多個編碼本發明結合物的核酸分子之質體 132628.doc -13 - 200914467 的細胞； b)自該細胞或上清液回收該結合物。 在一實施例中，編碼與抗融合肽連接或未與抗融合肽連 接之mAb CD4之輕鏈及重鏈的基因位於同_表現载體或不 同表現載體上。 本發明亦包含一種醫藥組合物，其含有本發明之結合物 以及醫藥學上可接受之賦形劑或载劑。 本發明進-步包含本發明之結合物用於製造供治療病毒
感染用之藥物的用途。在一實施例十，該用途之特徵在於 該病毒感染為HIV感染。 本發明包含本發明之結合物用於治療需要抗病毒治療、 較佳抗HIV治療之患者的用途。 【實施方式】 本發明報導包含兩個或兩個以上抗融合肽及一個抗⑽ 抗體（mAb CD4)之結合物’其特徵在於⑴個抗融合狀各 自與該抗CD4抗體之重鏈及/或輕鏈的一末端結合。許多8 個抗融合肽/mAb CD4僅在mAb CD4包含8個末端，亦即由 (例如）兩個重鏈及兩個輕鏈構成時為可能的^mAb CD4 包含較少數量之C末端及N末端(例如作為㈣)，則結合物 中最大可能之相應抗融合肽之數目亦減少，亦即減少至少 於8個。 1抗融合肽”為抑制盥 .^ /、膜融合關聯之事件或膜融合事件本 身（其中包括抑制病毒因膜、 / 、w &感尜未焚感染細胞）的肽。 此#抗融合肽在一訾w 1了中為線性肽。舉例而言，其可源 I32628.doc 200914467
自gp41胞外域，例如DP 107、DP 178。該等肽之實例可見 於 US 5,464,933 > US 5,656,480、US 6,013,263 > US 6,017,536、US 6,020,459、US 6,093,794、US 6,060,065、 US 6,258,782、US 6,348,568、US 6,479,055、US 6,656,906、 WO 1996/19495、WO 1996/40191、WO 1999/59615、WO 2000/69902及WO 2005/067960中。舉例而言，該等肽之胺基 酸序列包含或可選自以下各者之群：1；8 5,464,933之3丑(^ IDNO:1至10;US 5,656,480之SEQIDNO··1至15;US 6,013,263之 SEQ ID NO: 1 至 10及 16至 83 ; US 6,017,536之 SEQ ID NO: 1 至 1〇、20至 83及 139至 149 ; US 6,093,794之 SEQ ID NO: 1 至 10、17至 83及 210至 214 ; US 6,060,065之 SEQ ID NO: 1 至 10、16至 83及 210至 211 ; US 6,258,782之 SEQ ID NO: 1286及 1310 ; US 6,348,568 之 SEQ ID NO: 1129、1278-1309、1311 及 1433 ; US 6,479,055 之 SEQ ID NO: 1 至 10及 210至 238 ; US 6,656,906之 SEQ ID NO: 1 至 171 ' 173至216 、 218至219 、 222至228 、 231 、 233至366 、 372至398 、 400至456 、 458至498 、 500至570 、 572至620 、 622至 651、653 至 736、739至 785、787 至 811、813 至 823、 825 ' 827至863 、 865至875 、 877至883 、 885 、 887至890 、 892至 981、986至 999、1001至 1003、1006至 1018 ' 1022至 1024、1026 至 1028、1030 至 1032、1037 至 1076、1078 至 1079、1082 至 1117、1120 至 11 76、11 79 至 1213、1218 至 1223、1227 至 1237、1244 至 1245、1256 至 1268、1271 至 1275、1277、1345 至 1348、1350 至 1362、1364、1366、 132628.doc -15- 200914467 1368、1370、1372、1374 至 1376、1378 至 1379、1381 至 1385、1412 至 1417、1421 至 1426、1428 至 1430、1432、 1439 至 1542、1670 至 1682、1684 至 1709、1712 至 1719、 1721 至 1753、1755 至 1757 ;或 WO 2005/067960之 SEQ ID NO: 5至95。在一實施例中’抗融合肽具有包含5至1〇〇個 胺基酸、較佳10至75個胺基酸且更佳15至50個胺基酸之胺 ' 基酸序列。在一較佳實施例中，抗融合肽為C-34、T-20、 T-1249、T-651、T-2635、N-36(Root，M.J,等人，Curr. D Pharm. Des· 10 (2004) 1805-1825)及 DP-107(Wild，C.等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 12676-12680)。 在一實施例中，本發明之結合物包含一或多個抗融合肽及 一個抗CD4抗體（mAb CD4)，其中i)該抗融合肽為具有5至 1 00個胺基酸之胺基酸序列的線性肽，及ii) 1至8個抗融合 肽各自與該抗CD4抗體之重鏈及/或輕鏈之一末端結合。在 另一實施例中，本發明之結合物包含一或多個抗融合肽及 一個抗CD4抗體（mAb CD4)，其中i)該抗融合肽係源自gp41 J- ' 胞外域’及ϋ)1至8個抗融合肽各自與該抗CD4抗體之重鏈 及/或輕鏈之一末端結合。術語” gp41胞外域，，表示以hiv_ 1 gpl 60之胺基酸位置561開始且以胺基酸位置620結束或以 - HIV-1 gp41之胺基酸位置50開始且以胺基酸位置1〇9結束 的胺基酸序列（SEQ ID NO: 66)(亦參見，例如Bar，S.及 Alizon, M. J. Virol. 78 (2004) 811-820) 〇 術語"抗體"涵蓋包括完全抗體及抗體片段之抗體結構的 各種形式。在一實施例中，本發明之抗體為人類抗體、人 132628.doc 16- 200914467 源化抗體、嵌合抗體或耗盡τ細胞抗原之抗體（參見例如 WO 98/33523、WO 98/52976 及 WO 00/34317)。抗體之遺 傳工私（例如）描述於Morrison, S.L.等人，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ; US 5,202,238 及 US 5,204,244 ; Riechmann，L.#A，Nature 332 (1988) 323-327 ; Neuberger，M.S.等人，Nature 314 (1985) 268-270 ; Lonberg，N，，Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1 1 17-1 125 中。 "抗體片段”包含全長抗CD4抗體之部分，較佳其可變域 或至少其抗原結合部分。抗體片段之實例為（例如）單鏈抗 體分子（scFv)、Fab、F(ab)2片段及其類似物，只要其保持 抗CD4抗體之結合特徵即可。§cfv抗體（例如）描述於
Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88 中。
Huston亦描述連接適用於本發明之多肽的連接子及方法。 "CD4"意謂如（例如）Brady, R L.及 BarcIay，a N，Curr. Top. Microbiol. Immun〇i· 205 (1996) 1-18 及 SwissProt P01730中所述之人類CD4。在本申請案中可互換使用之術 語”與CD4結合之抗體”、”抗cD4抗體”或”mAb CD4”表示與 CD4特異性結合且較佳抑制與標靶細胞的HIV融合之抗 體。可基於活體外ELISA檢定（使用CD4表現CHO細胞）測 5式細胞中之結合。若在丨00 ng/ml之抗體濃度下所論述抗體 導致5或5以上、較佳1〇或1〇以上之S/N(信號/雜音）比率， 則發現結合。術語”抑制與標靶細胞之HIV融合"係指在包 含使該標靶細胞（例如PBMC)與病毒在所論述抗體存在下 在有效抑制病毒與該細胞之間的膜融合之濃度下接觸，且 132628.doc 200914467 量測（例如）螢光素酶報導基因活性或HIV p24抗原濃度的 檢定中量測之與標靶細胞之HI V融合的抑制。術語”膜 融合”係指表現CD4多肽之第一細胞與表現HIV包膜蛋白之 第二細胞或病毒之間的融合。膜融合係藉由報導基因檢定 (例如藉由螢光素酶報導基因檢定）藉由經遺傳工程之細胞 及/或病毒測定。 本申請案中所用之術語π嵌合”表示抗體或抗體結構域包 含源自來自非人類動物之抗體之胺基酸序列以及源自人類 C' 源抗體之胺基酸序列。 較佳抗CD4抗體在（例如）Reimann, Κ.Α.等人，Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943、EP 0 512 112、US 5,871,732、EP 0 840 618、EP 0 854 885、EP 1 266 965、US 2006/0051346、WO 97/46697、WO 01/43779、US 6,136,310、 W091/009966中提及。尤其較佳之抗CD4抗體描述於US 5,871,732 及 Reimann, K.A.等人，Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943 及 WO 91/009966 中。尤其較佳 (： 之抗CD4抗體之特徵在於當向人類投與時其為非免疫抑制 性或非耗盡性抗體，且亦不阻斷HIV gpl20與人類CD4的 結合。在一實施例中，較佳抗CD4抗體之進一步特徵在於 - 該抗體包含由免疫球蛋白構架及選自SEQ ID NO: 29、30
或3 1之重鏈CDR3序列的CDR3區組成之可變重鏈結構域。 在另一較佳實施例中，該抗體包含由免疫球蛋白構架及選 自SEQ ID NO: 29或30或31之CDR3序列的CDR3區、選自 SEQ ID NO: 26或27之CDR2序列的CDR2區及選自SEQ ID 132628.doc -18- 200914467 NO: 23或24之CDR1序列的CDR1區組成之可變重鏈區。在 一較佳實施例中，重鏈可變域以SEQ ID NO: 08、10或12 展示。在一較佳實施例中，抗CD4抗體另外包含由免疫球 蛋白構架及選自SEQ ID NO: 13、14或15之CDR1序列的 CDR1區、選自SEQ ID NO: 17或18之CDR2序列的CDR2區 及選自SEQ ID NO: 20或21之CDR3序列的CDR3區組成之 可變輕鏈結構域。在一實施例中，抗CD4抗體之特徵在於 含有 SEQ ID NO: 08之 CDR作為重鏈 CDR及 SEQ ID NO: 02 之CDR作為輕鏈CDR、SEQ ID NO: 10之CDR作為重鏈CDR 及 SEQ ID NO: 04之CDR作為輕鏈CDR、SEQ ID NO: 11之 CDR作為重鏈CDR及SEQ ID NO: 05之CDR作為輕鏈CDR或 SEQ ID NO: 12之 CDR作為重鏈 CDR及 SEQ ID NO: 06之 CDR作為輕鏈CDR。 CDR 序列可根據 Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)之標準定 義進行判定。SEQ ID NO: 01至SEQ ID NO: 12之CDR以 SEQ ID NO: 13 至 31展示。 在一實施例中，抗CD4抗體包含獨立地選自由以下各物 組成之群的可變重鏈結構域及可變輕鏈結構域： a) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 08界定之重鏈可變域及由 SEQ ID NO: 02界定之輕鏈可變域； b) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 10界定之重鏈可變域及由 SEQ ID NO: 04界定之輕鏈可變域； 132628.doc -19- 200914467 C)由胺基酸序列SEQIDN0:14定之重鏈可變域及由 SEQ ID NO: 〇5界定之輕鏈可變域； d)由胺基酸序列SEQ ID N〇:㈣定之重鍵可變域及由 SEQ Π) NO: 06界定之輕鏈可變域。 :-實施例中，本發明結合物中所用之抗體的特徵在於 恆定域為人類來源的。該等恆定域在現有技術中孰知，且 例如由Kabat(參見例如J〇hns〇n，G·及，丁 丁，
Acids Res. 28 (2_) 214·218)所述。舉例而言在一實施 例中，適用之人類IgGl重鏈恆定區（Ch1_鉸鏈_Ch2_Ch3)包 含獨立地選自由SEq ID N〇: 32、33組成之群的胺基酸序 列。舉例而言，適用之人類κ輕鏈恆定域包含SEQ ID NO: 34之κ輕鏈恆定域（Cl)的胺基酸序列。在另一實施例中’ 抗體可變域為小鼠來源的且包含根據Kabat(參見例如 Johnson, G^Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218) 的小鼠抗體之抗體可變域序列構架。在另一實施例中，抗 體可變域為小鼠來源的且已經人源化。 較佳抗CD4抗體展示與具有可變域1(us 5,871，732)或可 變域2(Reimann，κ·Α·等人，Aids Res, Human Retrovir. 13 (1997) 933-943)之抗體相同的（：〇4抗原決定基結合或與 CD4之結合由於結合或競爭性結合的位阻而受具有可變域 1或可變域2之抗體抑制。抗原決定基結合係藉由使用丙胺 酸掃描根據 Olson, W.C 等人（J, Virol. 73 (1999) 4145-4155)針對 抗原決定基定位所述之方法來研究。75%或75%以上之信 號降低展示該（等）突變之胺基酸有助於由該抗體識別之抗 132628.doc -20- 200914467 原決定基。若有助於抗原決定基之胺基酸係由具有可變域 1或可變域2之所研究抗體識別，則發現抗體與同一抗原決 定基之結合。 術語"抗原決定基”表示能夠與抗體特異性結合之蛋白質 決定子。抗原決定基通常由分子之化學活性表面基團（諸 如胺基酸或糖側鏈）組成且通常具有特定三維結構特徵以 及荷質比特徵。構形抗原決定基與非構形抗原決定基之區 別在於在變性溶劑存在下與前者而非後者的結合會喪失。
本文所用之術語，，可變域”（輕鏈可變域（Vl)、重鏈可變域 (VH))表示標靶抗原與抗體之結合中直接涉及的抗體之輕鏈 及重鏈對的個別結構域。可變域一般為輕鏈及重鏈對的N 末端結㈣。輕鏈及重鏈之可變域具有才目㈣$式結構， 亦即其具有，，免疫球蛋白構架"，且各結構域包含四個"構 架區（FR)其序列廣泛守十互，由三個”高變區”（或”互補判 定區”，CDR)連接。構架區採用β-摺疊片構形且CDR可形 成連接都摺疊片結構之環。各鏈中之cdr藉由構架區保 持其三維結構，且與來自其他鏈之CDR-起形成抗原結合 位,,、占抗體重鏈及輕鏈CDR3區在本發明之抗體的結合特 異性/親和力中起尤其重要之作用且因此提供本發明之另 一目標0 w枯机體之抗原結合部分"或”抗體之抗原 結合位點”係指連· & p店&人 成抗原、、Ό 5之抗體的胺基酸殘基。抗體 之抗原結合位點包含爽白” 采自互補判疋區，，或，，CDR”的胺基酸 殘基。構架”或"F R n f& &為彼荨可變域區而非本文定義之高 132628.doc 200914467 變區殘基。因此，抗體之輕鏈可變域及重鏈可變域自N末 端至 C末端包含區 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及FR4(免疫球蛋白構架）。尤其，重鏈之CDR3區為最有助 於抗原結合且界定抗體的區。在一實施例中，本發明之抗 體的特徵在於其重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO:30之CDR3序列。互補判定區（CDR)及構架區（FR)係 根據 Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD( 1991)之標準定義進行判定。 抗CD4抗體之”Fc部分”不直接涉及於與CD4的結合中， 但具有各種效應功能。視重鏈之恆定區的胺基酸序列而 定，抗體（免疫球蛋白）分為以下類別：IgA、IgD、IgE、 IgG及IgM。此等類別中之一些進一步分為以下子類（同 型），亦即IgG分為IgGl、IgG2、IgG3及IgG4，或IgA分為 IgAl及IgA2。根據抗體所屬之免疫球蛋白類別，將免疫球 蛋白之重鏈恆定區分別表示為a(IgA)、5(IgD)、e(IgE)、 Y(IgG)及p(IgM)。在一實施例中，本發明之抗體屬於IgG 類。”抗體之Fc部分"為熟練技術者所熟知之術語且其係基 於抗體之番木瓜蛋白酶裂解來定義。本發明之抗體含有人 類Fc部分或衍生自人類來源之Fc部分作為Fc部分。在本發 明之另一實施例中，Fc部分為子類IgG4之人類抗體的Fc部 分或子類IgGl、IgG2或IgG3之人類抗體的Fc部分，其係以 不可偵測到下文所定義之Fey受體（例如FcyRIIIa)結合及/或 C 1 q結合的方式經修飾。在一實施例中，F c部分為人類F c 132628.doc -22- 200914467 部分且較佳來自人類IgG4子類或來自人類IgGl子類的突變 Fc部分。在另一實施例中，FC部分為來自具有突變L234A 及L235A的人類IgGl子類之Fc部分。在另一實施例中，Fc 部分為 SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、具有突變 L234A 及 L23 5A之 SEQ ID NO: 32、具有突變 S228P之 SEQ ID NO: 33之Fc部分。雖然IgG4展示降低之FcY受體（FcyRIIIa)結 合，但其他IgG子類之抗體展示強結合。然而，pr〇238、
Asp265、Asp270、Asn297(喪失 pc碳水化合物）、Pr〇329、 Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、 Lys288、Thr307、Gln311、Asn434或 /及 His435 為若經改變 則亦提供降低之Fey受體結合的殘基（Shieids，R.L.等人，】·
Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Lund，J·等人，FASEB J. 9 (1995) 1 15-1 19 ’ Morgan, A,等人，Immunology 86 (1995) 3 19-324 ; EP 0 307 434)。在一實施例中，本發明 之抗體係關於在L234、L235及/或j)265中具有突變及/或含 有PVA236突變之IgG4子類或IgGl或igG2子類的Fey受體結 合。在一較佳實施例中，突變為S228P、L234A、L235A、 L235E及/或PVA236 (PVA236意謂來自IgG1之胺基酸位置 233至236的胺基酸序列ELLG(以單字母胺基酸編碼給出）或 IgG4之EFLG由PVA置換），較佳為igG4之突變S228P，及 IgGl之L234A及L235A。抗體之pc部分直接涉及於 ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性）與CDC(互補依賴 性細胞毒性）中。補體活化（CDC)藉由補體因子ciq與多數 IgG抗體子類之Fc部分的結合起始。Clq與抗體之結合係由 132628.doc -23· 200914467 所謂結合位點處之經界定蛋白質-蛋白質相互作用引起。 該等Fc部分結合位點在現有技術中已知且由（例如）Lukas， T.J.等人，J. Immunol· 127 (1981) 2555-2560 ; Brunhouse，R.及 Cebra，J.J.，Mol. Immunol· 16 (1979) 907-917 ; Burton, D.R.等 人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen, J.E.等人，Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie，Ε·Ε.等人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh，M等人，J· Virol. 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan, A 等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ;及EP 0 307 434中所述。該等Fc部分結合位點（尤其）表 徵為胺基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、 K322、P331 及 P329(根據 Kabat 之 EU 指數編號）。IgGl、 IgG2及IgG3子類之抗體通常展示補體活化作用，包括Clq 及C3結合，而IgG4不活化補體系統且不與Clq及/或C3結 合。不與Fey受體及/或補體因子Clq結合之抗CD4抗體不引 起抗體依賴性細胞毒性（ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)。在一實施例中，此抗體之特徵在於其與CD4結 合，含有衍生自人類來源之Fc部分且不與Fey受體及/或補 體因子Clq結合。在一較佳實施例中，此抗體為人類或人 化或T細胞抗原耗盡之抗體。Clq結合可根據Idusogie, E.E. 等人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184量測。若在該檢 定中在抗體濃度為8 pg/ml下所論述抗體在492-405 nm下之 光學密度（OD)比未經修飾之野生型抗體Fc部分之人類Clq 結合值低15%，則未見"Clq結合”。ADCC可如抗體與人類 NK細胞上的人類FcyRIIIa之結合來量測。結合係在20 132628.doc -24- 200914467 pg/ml之抗體濃度下測定。”無Fcy受體結合”或，，無adcc"意 謂相較於與人類IgGl(SEQ ID NO:32)相同之抗體的結合， 在20 pg/ml之抗體濃度下與人類nk細胞上的人類FcyRIIIa 之最高30%之結合。 本發明結合物中所用之抗體另外包括具有”保守序列修 飾"之抗體（變體抗體）’其為不影響或改變本發明抗體之上 述特徵的胺基酸序列修飾。修飾作用可藉由諸如定點突變 及PCR介導之突變之此項技術中已知之標準技術引入。保 守胺基酸取代包括胺基酸殘基係經具有類似侧鏈之胺基酸 殘基置換者。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘 基之豕族。此專家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸（例如離 胺酸、精胺酸、組胺酸）、具有酸性側鏈的胺基酸（例如天 冬胺酸、麩胺酸）、具有不帶電極性侧鏈的胺基酸（例如甘 胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺 酸、半胱胺酸、色胺酸）、具有非極性側鏈的胺基酸（例如 丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺 酸、甲硫胺酸）、具有β-支鏈側鏈的胺基酸（例如蘇胺酸、 纈胺酸、異白胺酸）及具有芳族側鏈的胺基酸（例如酪胺 酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。因此，在一實施例 中，在人類抗CD4抗體中所預計之非必需胺基酸殘基可經 來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。因此，在—實 施例中，本文中"變體"抗CD4抗體係指與來自”親本"抗 CD4抗體之胺基酸序列的胺基酸序列之區別為高達1 〇個増 加、缺失及/或取代的分子，在另一實施例中，係指在^ 132628.doc -25- 200914467 鍵CDR3區之外親本抗體的可變域區中之一或多者中具有 約2至約5個增加、缺失及/或取代的分子。每個其他重鏈 CDR區包含至多一個單胺基酸增加、缺失及/或取代。本 發明包含一種修飾與CD4結合之親本抗體之CDR胺基酸序 列之方法’其特徵在於自SEQ Π) NO: 08或10之重鏈可變 域選擇重鏈可變域’及/或自SEq ID NO: 02或04之輕鏈可 變域選擇輕鏈可變域’提供編碼該起始可變域胺基酸序列 之核酸’修飾該核酸使得在重鏈CDR1中一個胺基酸經修 飾、在重鏈CDR2中一個胺基酸經修飾、在輕鏈CDR1中1_ 3個胺基酸經修飾、在輕鏈CDR2* ^個胺基酸經修飾及/ 或在輕鏈CDR3中1 -3個胺基酸經修飾，在抗體結構中表現 且併入該經修飾之可變域胺基酸序列，量測該抗體是否與 CD4結合且若抗體與CD4結合則選擇該（等）經修飾之可變 域/CDR。在一實施例中’該等修飾為保守序列修飾。胺 基酸序列修飾可藉由基於如Riechmann，L.等人，Nature 332 (1988) 323-327及 Queen，C 等人 ’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033所述之分子模型的突變進行。 如本申請案中所用之術語”連接子，，或，，肽連接子，，表示天 然及/或合成來源的肽連接子。其由線性胺基酸鏈組成， 其中20個天然存在之胺基酸為單體架構基塊。該鏈之長度 為1至50個胺基酸，較佳介於1與28個胺基酸之間，尤其較 佳介於3與25個胺基酸之間。此連接子可含有重複胺基酸 序列或天然存在之多肽（諸如具有鉸鏈功能的多肽）的序 列。連接子具有可藉由容許結合至抗（：1)4抗體之肽正確摺 132628.doc -26- 200914467 疊且適當呈現來確保該肽執行其生物活性的功能。在一實 施例中，該連接子為經指明富集甘胺酸、麩醯胺酸及/或 絲胺酸殘基的"合成肽連接子"。此等殘基以（例如）多達五 個胺基酸之小型重複單元（諸如GGGGS、QQQQG或SSSSG) 排列。此小型重複單元可重複2至5次以形成多聚單元。在 多聚單元之胺基末端及/或羧基末端處，可添加多達六個 額外任意的天然存在之胺基酸。其他合成肽連接子係由單 個胺基酸構成，其重複1〇至20次且可在胺基末端及/或羧 Γ 基末端包含多達6個額外任意的天然存在之胺基酸，諸如 連接子GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO: 64)中之絲胺 酸。較佳連接子展示於表2中。在一實施例中，連接子係 選自[GQ4]3GNN(SEQ ID NO: 50)、LSLSPGK(SEQ ID NO: 46)、LSPNRGEC(SEQ ID NO: 47)、LSLSGG(SEQ ID NO: 71)、LSLSPGG(SEQ ID NO: 72)、G3[SG4]2SG(SEQ ID NO: 75)或G3[SG4]2SG2(SEQ ID NO:76)。所有肽連接子均可由 核酸分子編碼且因此可重組表現。由於該等連接子本身為 (j 肽，因此抗融合肽經由形成於兩個胺基酸之間的肽鍵與連 接子連接。肽連接子在抗融合肽與抗融合肽所結合之抗 CD4抗體鏈之間引入。因此，分別存在兩種或三種可能序 列（在胺基末端至羧基末端方向）：a)抗融合肽-肽連接子-抗CD4抗體多肽鏈，或b)抗CD4抗體多肽鏈-肽連接子-抗融 合肽，或c)抗融合肽-肽連接子-抗CD4抗體多肽鏈-肽連接 子-抗融合肽。 在本發明之一實施例中，該結合物之特徵在於包含i)由 132628.doc •27- 200914467 胺基酸序列SEQ ID NO: 08界定之重鏈可變域及由SEQ ID NO: 02界定之輕鏈可變域；或由胺基酸序列SEQ ID NO: 10界定之重鏈可變域及由SEQ ID NO: 04界定之輕鏈可變 域，或由胺基酸序列SEQ ID NO: 11界定之重鏈可變域及 由SEQ ID NO: 05界定之輕鏈可變域；或由胺基酸序列seq ID NO: 12界定之重鏈可變域及由SEq id NO: 06界定之輕
鏈可變域；ii)選自胺基酸甘胺酸（G)及天冬醯胺酸（N)、三 肽GST及SEQ ID NO: 46至76或80或81之連接子；及丨丨丨）選 自SEQ ID NO: 35至44或83之抗融合肽的抗融合肽。本發 明之另一態樣為SEQ ID NO: 42之抗融合肽afiM。在一實 施例中’抗融合肽具有SEq ID N〇: 36、38、39或42或 83。在另一實施例中，連接子具有SEQ ID N0: 46、47、 50 、 64 、 71 、 72 、 75或76 。 、把例巾，mAb CD4之重鏈及/或輕鏈與抗融合肽 之結合物（”鏈結合物")係選自以下順序之鏈結合物：⑴[抗 ^合叫連接子^ [重鏈]、⑺[重鏈]•[連接子k·[抗融合 、（3)[抗融合狀η連接子]m_[重鏈]_[抗融合肽 融合肽]-「連接+ Ί n ^ 1 肽1、⑻[輕鏈]_[連接子^[抗融合 几U 口肽]-[連接子]m_[輕鏈]_[抗 融合肽]-[連接子]r舌，狀]、（7)[机 融合狀Η連接H 子]^[抗融合狀]、⑻[抗 接手在兮堂 _H連接子]m'[抗融合狀]，其中連 μ *結合物内及該等鏈結合物之同 同，其中…或。之整數，且_該等鏈 ：： 鏈結合物之間可總+ L 内及該專 蜀立地相同或不同。舉例而言，在包含鍵 132628.doc -28· 200914467 結合物（7)及mAb CD4輕鏈之結合物中，鏈結合物中之 兩個連接子可相同（亦即具有相同胺基酸序列及長度）或可 不同（亦即具有不同胺基酸序列及/或長度），或一者或兩者 可不存在。舉例而言，在包含鏈結合物（2)及（4)之結合物 中’鏈結合物（2)中所含連接子與鏈結合物（4)中所含連接 子可相同（亦即具有相同胺基酸序列及長度）或可不同（亦即 具有不同胺基酸序列及/或長度），或一者或兩者可不存 在。在鏈結合物中，該（等）連接子可存在（m=1)或不存在 (m=0)。較佳鏈結合物為鏈結合物（2)、（3)、（4)及（乃。本 發明之一實施例為包含2 X [mAb CD4輕鏈]及2 χ鏈結合物（2) 之結合物。Α結合物包含兩個非結合抗⑽抗冑輕鍵及兩 個抗CD4抗體重鏈，其各自經由μ末端與單個抗融合狀 之Ν末端、視情況與中間連接子結合。本發明之另一實施 例為包含兩個mAb CD4輕鏈及兩個鏈結合物（3)之結合物。 另-實施例為包含兩個mAbCD4重鏈及兩個鍵結合物⑷之 結合物。本發明之另-實施例為包含兩個_ CD4輕鍵及 兩個鏈結合物（7)之結合物。番絲B + ± ^重鏈及/或輕鏈較佳包含恆定 區（Fc) 〇 本發明進一步提供一種製造包含有效量之 藥學上可接受之載劑的醫藥組合物之方法及二明 結合物用於該方法之用途。 —w a 本發明進一步提供本發明6士 贫乃之結合物之用途，其 量（較佳與醫藥學上可接受 …、有效 供治療罹患AIDS之患者。 醫樂d以 132628.doc -29· 200914467 本申請案中所用之術語”胺基 群’其可直接或以前驅物形式由 酸n表示羧基(X-胺基酸之 核酸編碼。個別胺基酸係 藉由由三個核苷酸（所謂 碼。各胺基酸係由至少一個密碼子編 碼之產生"。本申請案中所用之術語" 也馬子或二驗基體）組成之核酸編 碼。此稱為"遺傳編 胺基酸"表示包含丙 胺酸（三字母編碼·· ala， 予母編碼：A)、精胺酸（arg， 半胱胺酸 R) '天冬醯胺酸（asn，N)、天冬胺酸（asp，D)
(CyS，c)、麩醯胺酸（gln，Q)、麵胺酸（咖，E)、甘胺酸 (giy，g)、組胺酸（his，η)、異白胺酸（ile，d、白胺酸 (leu ’ L)、離胺酸（lys ’ κ)、甲硫胺酸（met，M)、苯丙胺 酸（phe，F)、脯胺酸（pro，P)、絲胺酸（ser，s)、蘇胺酸 (thr ’ T)、色胺酸（trp，W)、酪胺酸（tyr，Y)及纈胺酸 (val ’ V)的天然存在之羧基α_胺基酸。 熟習此項技術者已知的適用於進行本發明之方法及技術 描述於（例如）：Ausubel，F.M·編，Current Protocols in Molecular Biology，第 I 卷至第 ΙΠ 卷（1997)，Wiley 及 Sons，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ’ 第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)。 在一實施例中，在本發明之結合物中，抗CD4抗體鏈之 羧基末端胺基酸經由肽鍵與抗融合肽之胺基末端胺基酸結 合或抗融合肽之羧基末端胺基酸經由肽鍵與抗CD4抗體鏈 之胺基末端胺基酸結合。在一實施例中，中間連接子存在 於抗融合肽與抗CD4抗體鏈之間。因此，本發明之結合物 132628.doc -30· 200914467 由以下通式表徵： mAb CD4-[連接子]m_[抗融合肽]n ”中對於各抗融合肽而言爪獨立地為〇(亦即，mAb CD4與 抗融合肽之間為直接肽鍵）或1(亦即，mAbCD4與抗融合肽 之間存在連接子）且η為2至8之整數。在—實施例中， 至8之整數。在另一實施例中，^為2至8之偶數。在另一實 施例中，η為2至4之整數。在另一實施例中，11為2或4之整 數。本發明之一實施例為特徵為在抗（：1)4抗體之重鏈之各 C末端或在輕鏈之各Ν末端包含抗融合肽的結合物。在此 實施例中，兩個抗融合肽與一個抗CD4抗體結合。在另一 實施例中，該結合物之特徵在於在重鏈之各C末端及在輕 鏈之各N末端包含抗融合肽。在此實施例中，四個抗融合 肽與一個抗CD4抗體結合。 在mAb CD4重鏈及/或輕鏈之末端處引入之抗融合肽相 較於mAb CD4尺寸較小。舉例而言，最小的免疫球蛋白_G 類免疫球蛋白具有約1 50 kDa之分子量；在一實施例中， 抗融合肽的尺寸（分子量）小於12·5 kDa，其等效於約1〇〇個 胺基酸，一般小於7·5 kDa，其等效於約60個胺基酸。在一 實施例中’抗融合肽具有5至1 〇〇個胺基酸殘基、較佳丨〇至 75個胺基酸殘基、更佳15至50個胺基酸殘基的胺基酸序 列。本發明之結合物適用於醫藥、治療及/或診斷應用。 可與mAb CD4重鏈及/或輕鏈結合之抗融合肽的數目為1至 抗CD4抗體多肤鍵的胺基末端及缓基末端的組合數。因為 本發明涵蓋不同形式之抗CD4抗體，所以抗融合肽之可能 132628.doc 31 200914467 數目可又化。右抗CD4抗體包含兩個重鏈及兩個輕鍵，則 :基末端(N末端)與羧基末端(c末端)的組合數為：，其同 f為可犯之經結合抗融合肽的最大總數；若（例如）抗 抗體片段諸如為單鏈抗體(scFv)，則末端之組合數及因此 可結合抗融合肽之最大數為2。若單個抗融合肽與誕^ CD4結合，則該肽可佔據抗CD4抗體鏈之任一末端。同 樣，若最大可能數目的肽與mAb CD4結合，則所有末端均 由單個肽佔據。若與mAb CD4結合之肽數目小於最大可能 數，則肽在抗CD4抗體鏈末端可能有不同分布。舉例而 言，若四個肽與G類或E類免疫球蛋白結合，則可能存在 五種不同組合（參見表1)。在兩個組合中，一類的所有末端 (亦即抗CD4抗體鏈之所有四個胺基末端或所有四個羧基末 端）各自與單一抗融合肽結合。其他末端則不結合。在一 實施例中，此導致在抗CD4抗體之一區域中分配修飾/結 合。在其他狀況下’多肽與許多兩末端結合。在此等組合 内’經結合肽分配至抗CD4抗體之不同區。不論哪種狀況 下’結合末端之總和為4。 表1:四個肽與由四個肽鏈構成之抗CD4抗體之末端之結 合的可能組合。 經佔據胺基末端數 經佔據羧基末端數 經佔據末端的總數 4 0 4 3 Γ 1 4 — 2 2 4 __ 1 3 4 0 4 4 132628.doc -32- 200914467 經結合抗融合肽的胺基酸序列可不同、相似或相同。在 一實施例中，胺基酸序列一致性介於90%至小於1 00%之範 圍内；此等胺基酸序列與相應肽定義為相似。在一較佳實 施例中，抗融合肽為相同的，亦即胺基酸一致性為100% 且長度相同。 在一實施例中，本發明之結合物之特徵在於i)包含SEQ ID NO:02之兩個輕鏈可變域，各自包含SEQ ID NO: 08之 重鏈可變域、SEQ ID NO: 75或76之連接子及SEQ ID NO: 42或83之抗融合肽的兩個（2)型鏈結合物，ii)包含SEQ ID NO: 04之兩個輕鏈可變域，各自包含SEQ ID NO: 10之重 鏈可變域、SEQ ID NO: 75或76之連接子及SEQ ID NO: 42 或83之抗融合肽的兩個（2)型鏈結合物，iii)包含SEQ ID NO: 05之兩個輕鏈可變域，各自包含SEQ ID NO: 11之重 鏈可變域、SEQ ID N〇：75或76之連接子及SEQ ID NO: 42 或83之抗融合肽的兩個（2)型鏈結合物，或iv)包含SEQ ID NO: 06之兩個輕鏈可變域，各自包含SEQ ID NO: 12之重 鏈可變域、SEQ ID NO: 75或76之連接子及SEQ ID NO:42 或83之抗融合肽的兩個（2)型鏈結合物。 抗融合肽與抗CD4抗體之間的結合係在核酸水準上進 行。因此，在有或無中間連接子之情況下，在抗融合肽與 抗CD4抗體鏈之間形成肽鍵。因此，抗融合肽之羧基末端 胺基酸在有或無中間連接子之情況下與抗CD4抗體鏈之胺 基末端胺基酸結合，或抗CD4抗體鏈之羧基末端胺基酸在 有或無中間連接子之情況下與抗融合肽之胺基末端胺基酸 132628.doc -33- 200914467 Γ 結合，或抗CD4抗體鏈之兩個末端各自在有或無中間連接 子之情況下與抗融合肽結合。對於重組產生本發明之抗融 合肽-抗CD4抗體-結合物而言，需要編碼不同多肽之一或 多個核酸分子’在一實施例中，採用2至4個核酸分子。在 -實施例中，採用兩個核酸分子。此等核酸分子編碼結合 物之不同抗CD4抗體多肽鏈且在下文中稱為結構基因。其 可位於同一表現質體（載體）上或可替代地位於不同表現質 體（载體）上。結合物之組裝較佳在分泌結合物之前發生且 因此在表現細胞内發生H，在一實施例中，編碼結合 物之多肽鏈的核酸分子表現於同一宿主細胞内。若在重电 表現後獲得結合物之混合物，則結合物可藉由熟習此項技 術者已知的方法分離及純I此等方法已良好確立且普遍 用於免疫球蛋白純化中且經單獨或組合採用。料方法為 (例如）使用微生物衍生蛋白之親和層析法（例如蛋白a或蛋 白G親和層析法）、離子交換層析法（例如陽離子交換（缓甲 基樹脂）、陰離子交換（胺基乙基樹脂）及混合模式交換層析 法）、親硫吸附（例如用β巯基乙醇及其他§11配位體）、疏水 性相互作用或芳族吸附層析法（例如用苯基_境脂糖、氮雜_ 親芳族樹脂或間胺基苯基蝴酸)、金屬整合物親和層析法 (例如用Ni(II)-及Cu(II)省和性物質）、尺寸排阻層析法及 製備型電泳方法（諸如凝膠電泳、毛細管電 泳）（Vijayalakshmi，M.A.，Appl nh 75 (1998) 93_1G2)。可用熟習此項技術者已知的重組工程設 計方法在核酸/基因水準上定製結合物。編碼免疫球蛋白 132628.doc •34. 200914467 輕鏈及重鏈之核酸序列為已知的且可(例如)自染色體組資 料庫獲得。同#，編碼抗融合肽之核酸序列為已知的或可 自其相應胺基酸序列容易地推斷。建制於表現本發明結 合物之表$見質體所需的元件為（例如）天然及/或結合形式之 抗CD4抗體輕鏈的表現卡£、天然及/或結合形式之抗⑽ 抗體重鏈的表現卡匣(或者，抗CD4抗體輕鏈及抗CD4抗體 重鏈結構基因可含於同一表現卡度中，例如作為雙順反子 表現元件）、選擇標記及大腸桿菌（E c〇u)複本以及選擇單 _表見卡匣包3啟動子、編碼分泌信號序列之DNA區 段、結構基因及終止子/多聚腺該等元件以操 作性連接形式組裝於一個編碼結合物之所有鏈的質體上， 或組裝於兩個或兩個以上各自編碼結合物之一或多個鏈的 質體上。為表現結構基因，可將質體引入合適宿主細胞 中。蛋白質在諸如CH〇細胞、勵細胞、Sp2/〇細胞、c〇s 、田胞HEK細胞、K562細胞、BHK細胞、PER.C6®細胞及 類似細胞之哺乳動物細胞中製備。在-實施例中，結合物 係表現於CHO細胞或BHK細胞或HEK細胞中。質體之調控 元件必肩以其在所選宿主細胞中起作用的方式選擇。對表 見而σ铟主細胞係在適於表現結合物的條件下培育。所 表見之、° 〇物鏈經功能上組裝。完全加工之抗融合肽-抗 CD4抗體-結合物經分泌入培養基中。 表現貝體’，為提供在宿主細胞中表現所包含之結構基因 所:的所有70件的核酸。通常，表現質體包含原核質體繁 單元（例如對於大腸桿菌而言，其包含複製起點及可選 132628.doc -35- 200914467 擇私°己）真核選擇標記及一或多個用於表現所關注結構 基因之表現卡匣，該等表現卡匣各自包含啟動子、結構基 因及包括多聚腺嘌呤信號的轉錄終止子。基因表現通常置 於啟動子之控制下且該結構基因據稱與啟動子”可操作地連 接π。類似地，若調控元件調節核心啟動子的活性，則該 5周控元件與該核心啟動子係操作性地連接。 本發明之一態樣因此為一種產生本發明之結合物之方 法’其包含以下步驟： a) 在適於表現該結合物之條件下培育含有編碼本發明結 合物之核酸分子的細胞， b) 自該細胞或上清液回收該結合物。 術語”在適於表現結合物之條件下"表示用於培育表現多 肽之細胞且為熟習此項技術者已知或可由其容易地判定之 條件。熟習此項技術者已知此等條件可視所培育細胞之類 型及所表ί見多肽之類型❿變化。—般而t，細胞係在（例 如）介於2代與贼之間的溫度下肖育，録時足以允許有 效產生結合物的時期’例如4至28天，體積為〇 〇1至1〇7公 升。 如本文所用’”醫藥學上可接受之載劑，|包括生理學上相 容之任何及全部溶劑、分散介質、塗覆劑、抗細菌劑及抗 真菌劑、等張劑及吸收/再吸收延遲劑及其類似物。該載 劑較佳適於注射或輸注。醫藥學上可接受之載劑包括益菌 水溶液或分散液及用於製備無菌可注射溶液或分散液的無 菌散劑。該等介質及試劑用於醫藥活性的用途為此項 132628.doc -36 - 200914467 技術中已知。除水以外， 鹽水溶液。 θ可（例如）為等張緩衝生理食 不考慮所選擇之投藥途徑 發明之醫藥組合物使用之本 。適水合形式及/或本 術者已知之習知方n π D物係藉由熟習此項技 〈為夫方法調配成醫藥學 本發明醫藥組合物中活性成份之劑型。 獲得有效達成對特定患者、組合 水準可變化以 反應，而對患者不具有毒性的:^式之所要治療 量水車脾讳少接皱此 注成伤之垔。所選定之劑 里水羊將視多種樂物動力學因 ^ ^ go ^ 、疋，該等因素包括所採 用之本發明特定組合物之 ^ 椟田夕杜—儿人 ’才又樂途徑；投藥時間；所 才木用之特疋化合物的排泄速率；與 杜 、汀妹用特疋組合物組合 使用之其他藥物、化合物及/ < 獻t ^材枓；所治療患者之年 々、性別、體重、病症、一般健康义 +丄 健康及先刖病史；及醫學技 術中熟知之類似因素。 本發明較佳包含本發明結合物用於治療罹患免疫缺乏症 候群（諸如AIDS)之患者的用途。 提供以下實例、序列表及圖以幫助瞭解本發明，其真實 範嘴閣明於所附申請專利範圍中。應瞭解，可在不偏離本 發明精神之狀況下對所闡述程序進行修正。 圏示說明 W 1 : mAb CD4 κ-輕鏈表現載體631〇之質體定位。 SU: mAbCD4Yl-重鏈表現載體63〇9之質體定位。 ®3: mAbOMW-重鏈結合物表現載體63〇3之質體定 位。 132628.doc -37- 200914467 囷4: mAb CD4 γΐ-重鏈結合物表現載體6304之質體定 位。 抗體命名法 可變域 1報導於US 5,871，732之 SEQ ID NO: 10、15、45 及5 6中。 可變域2及4報導於Reimann, K.A.等人，Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943 中。 可變域3報導於WO 9 1/009966之圖3、4、12及13中。 抗CD4抗體序列 、抗融合肽之序列及肽連1 SEQ ID NO: 01 鼠科動物輕鏈可變域1 SEQ ID NO: 02 嵌合輕鏈可變域1 SEQ ID NO: 03 嵌_合輕鏈1 SEQ ID NO: 04 嵌_合輕鏈可變域2 SEQ ID NO: 05 嵌合輕鏈可變域3 SEQ ID NO: 06 嵌合輕鏈可變域4 SEQ ID NO: 07 鼠科動物重鏈可變域1 SEQ ID NO: 08 嵌合重鏈可變域1 SEQ ID NO: 09 嵌合重鏈1 SEQ ID NO: 10 嵌合重鏈可變域2 SEQ ID NO: 11 嵌合重鏈可變域3 SEQ ID NO: 12 嵌合重鏈可變域4 SEQ ID NO: 13 輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 14 輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 15 輕鍵CDR1 f
L 132628.doc -38- 200914467 SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: Γ' SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: I SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: 輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR2 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3 輕鏈CDR3 輕鏈CDR3 重鏈CDR1 重鏈CDR1 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR2 重鏈CDR2 重鏈CDR3 重鏈CDR3 重鏈CDR3 人類γ 1重鏈恒定區 人類γ4重鏈恒定區 人類κ輕鏈恒定域 C34 Τ20 Τ1249 Τ651 Τ2635 132628.doc -39- 200914467 SEQ ID NO: 40 N36 SEQ ID NO: 41 DP107 SEQ ID NO: 42 afp-1 SEQ ID NO: 43 HIV-1 I568P SEQ ID NO: 44 HIV-1 I568P SEQ ID NO: 45 HIV-1 SEQ ID NO: 46-76 連接肋
gp41胞外域變體單個突變： gp41胞外域變體四重突變： 、L550E 、 L566E 、 I580E gp41 80, 81 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 79 成熟mAb CD4 K-輕鏈之胺基酸序列 具有afp-1的成熟mAb CD4 γΐ-重鏈之 胺基酸序列 成熟mAb CD4結合物重鏈之胺基酸序列 SEQ ID NO: 82 具有T-65 1的成熟mAb CD4 γ 1 -重鏈之 胺基酸序列
SEQ ID NO: 83 afp-2 表2 :連接子 編號 連接肽 SEQ ID NO: 1 LSLSPGK 46 2 LSPNRGEC 47 3 「gq4i3 48 4 [GQ4I3G 49 5 「gq4i3gnn 50 6 GGG[SG412SGG 51 7 GGG[SG4]2SGN 52 8 「sg4i3 53 132628.doc -40- 200914467 編號 連接肽 SEQ ID NO: 9 iSG4l3G 54 10 g『sg4]3t 55 11 『sg4]3gg 56 12 『sg4i3ggt 57 13 [SG413GGN 58 14 [SG413GAS 59 15 [SG4l5 60 16 [SG415G 61 17 [SG415GG 62 18 rSG4l5GAS 63 19 G(S)15G 64 20 G(S)15GAS 65 21 G - 22 N - 23 GST - 24 [(G)4S13GAS 66 25 r(G)4Sl3G 67 26 r(G)4Sl5G 68 27 「(g)4si3gg 69 28 r(G)4S]5GG 70 29 LSLSGG 71 30 LSLSPGG 72 31 rosSis 73 32 『g3si5ggg 74 33 g3『sg4i2sg 75 34 G3[SG4l2SG2 76 35 rG4Sl3GGN 80 36 『g4si3ggn 81 實例 材料及方法 關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資 訊係在 Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)中給出。抗體鏈之胺 基酸根據 EU 編號（Edelman，G.M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 132628.doc -41 - 200914467 USA 63 (1969) 78-85 ; Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD，（1991))編號且提 及。 重組DNA技術 如 Sambrook，J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，New York, 1989中所述使用標準方法操作DNA。根 據製造商說明使用分子生物試劑。 基因合成 自化學合成製成之寡核苷酸製備所要基因區段。藉由募 核苷酸之黏接及接合（包括PCR擴增）來組裝側接有單數個 限制性核酸内切酶裂解位點的100-600 bp長基因區段且隨 後經由A懸垂物將其選殖入pCR2.1-T〇P〇_TA選殖載體 (Invitrogen Corp., USA)中。次選殖基因片段的DNA序列藉 由DNA定序來確認。 蛋白質測定 結合物之蛋白質濃度係藉由在280 nm下測定光學密度 (OD)、使用根據胺基酸序列所計算之莫耳消光係數來測 定。 實例1 表現質體之製備 如將抗CD4抗體重鏈可變域（VH)及人類γι_重鏈恆定域 (CH1-鉸鏈-CH2-CH3)之基因區段拼接之方式，將編碼抗 132628.doc .42- 200914467 CD4抗體輕鍵可變域（Vl)及人類κ輕鍵怪定域（Cl)之基因區 段拼接。 在SEQ ID NO: 77/78之mAb CD4之狀況下，重鏈及輕鏈 可變域係自如（例如）Reimann，K.A.等人，Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943 或 US 5,871,732 所述經人源化 之小鼠抗體產生’且重鏈及輕鏈恆定域係自人類抗體（C_K 及IgGl)產生。
隨後，使編碼完全抗CD4抗體輕鏈之基因區段在n末端 及/或C末端與編碼包括連接連接子序列之抗融合肽的核酸 拼接及/或使編碼完全抗CD4抗體重鏈之基因區段在1^末端 及/或C末端與編碼包括連接連接子序列之抗融合肽的核酸 拼接。 a)載艘6310 載體63 10為HEK293細胞中（例如）用於瞬間表現mAb cD4 輕鏈之表現質體（染色體組組織化表現卡匿；外顯子-内含 子組織）。 除mAb CD4 κ-輕鏈表現卡匣外，此載體亦含有： 新黴素抗性基因作為可選擇標記， 來自載體PUC18之複製起點，其允許此f體在大腸桿菌 中複製，及 β-内醯胺酶基因 (ampicillin)抗性。 其賦予大腸桿菌 以安比西林 mAb CD4 κ-輕鏈基因之轉錄單元係由以下元件構成 來自人類巨大細胞病毒之即刻早期增強子及啟動子 132628.doc -43· 200914467 人類抗體生殖系基因之5'-未轉譯區， 包括信號序列内含子（信號序列1、内含子、信號序列2 [L1 -内含子_L2])之鼠科動物免疫球蛋白重鏈信號序列’ 在3'-端排列有剪接供體位點及獨特BamHI限制位點的人 源化抗CD4抗體成熟可變κ-輕鏈編碼區段， 截斷之人類κ輕鏈内含子2， 人類κ-輕鏈基因恆定域，
牛生長激素（bGH)多聚腺嘌呤（"聚A")信號序列，及 3'_端之獨特限制位點AscI及SgrAI。 «1八13〇〇4 1<-輕鏈表現載體6310之質體定位展示於圖1 中。成熟（無信號序列）mAb CD4 κ-輕鏈之胺基酸序列以 SEQ ID NO: 77展示。 b)載體6309 載體6309為HEK293細胞中（例如）用於瞬間表現瓜^^ CD4 γΐ-重鏈之表現質體（染色體組組織化表現卡度；外顯子-内 含子組織）。 示mAbCD4Yl-重鏈表現卡匣外，此载體亦含有： 來自載體PUC18之複製起點，其允許此f體在 中複製，及 囷 β_内醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌以安比西林抗性。 mAbCD4yl_重鏈之轉錄單元係由以下元件構成： 來自人類巨大細胞病毒之即刻早期增強子及 人類抗體生殖系基因之5，·未轉譯區， ， 包括信號序列内含子（信號序列卜内含子、信號序列2 I32628.doc -44 - 200914467 [L1 -内含子_L2])之鼠科動物免疫球蛋白重鏈信號序列， 在3'-端排列有剪接供體位點及獨特xh〇i限制位點的人源 化抗CD4抗體成熟可變重鏈編碼區段， 小鼠/人類重鏈雜交内含子2 含有L234A及L235A突變之染色體組人類γ1_重鏈基因恆 定域， 牛生長激素（bGH)多聚腺嘌呤（”聚Α")信號序列，及 3'-端之獨特限制位點SgrAI。
mAb CD4 γΐ-重鏈表現載體63〇9之質體定位展示於圖2 中。成熟（無信號序列）mAb CD4 γ 1 -重鏈之胺基酸序列以 SEQ ID NO: 78展示。 c)載體6303 載體63 03為HEK293細胞中（例如）用於瞬間表現嵌合肽_ 抗CD4抗體γΐ-重鏈結合物之表現質體（染色體組組織化表 現卡匣；外顯子-内含子組織）。 載體6303係以mAb CD4 γΐ-重鏈在倒數第二個c末端胺 基駄（亦即，重鏈之C末端離胺酸殘基經移除）處與編碼抗 融合肽afp-Ι之核酸（SEq ID Ν〇_ 42)及沾9 ι〇 ν〇 Μ之肽 甘胺酸·絲胺酸連接子接合之方式自載體63〇9產生。 除嵌合肽抗CD4抗體yl_重鏈結合物表現卡g之外， 體亦含有： 來自載體PUC18之複製起點 中複製，及 ，其允許此質體在大腸桿菌 β-内醯胺酶基因 其賦予大腸桿菌以安比西林抗性。 J32628.doc -45- 200914467 嵌δ肽-抗c D 4抗體γ 1 -重鏈結合物之轉錄單元係由以下 元件構成： 來自人類巨大細胞病毒之即刻早期增強子及啟動子， 人類抗體生殖系基因之5，-未轉譯區， 包括信號序列内含子（信號序列1、内含子、信號序列2 [L1-内含子_L2])之鼠科動物免疫球蛋白重鏈信號序列， 在3’-端排列有剪接供體位點及獨特Xh〇I限制位點的人源 化抗CD4抗體成熟可變重鏈編碼區段，
含有L23 4A及L235A突變之小鼠/人類重鏈雜交内含子， SEQ ID NO: 75之肽絲胺酸·甘胺酸連接子序列， SEQ ID NO: 42之抗融合肽afp]， 牛生長激素（bGH)多聚腺嘌呤（"聚A")信號序列，及 3'_端之獨特限制位點SgrAI。 mAb CD4 γΐ-重鏈結合物表現載體63〇3之質體定位展示 於圖3中。成熟（無信號序列）結合物重鏈之胺基酸序列以 SEQ ID NO: 79展示。 d)載體6304 載體6304為HEK293細胞中(例如)用於瞬間表現嵌合肽 抗CD4抗體γ1_重鏈結合物之表現質體（染色體組組織化表 現卡匣；外顯子-内含子組織）。 除嵌合肽抗CD4抗體γΐι鏈結合物表現切 體亦含有： 來自載體PUC18之複製起點，其允 中複裳，& 允才此質體在大腸桿菌 132628.doc -46 - 200914467 β-内醯胺酶基因’其賦予大腸桿菌以安比西林抗性。 . 嵌合肽-抗004抗體Ύ1·重鏈結合物之轉錄單元係由以下 元件構成： 來自人類巨大細胞病毒之即刻早期增強子及啟動子， 人類抗體生殖系基因之5，-未轉譯區， 包括信號序列内含子（信號序列丨、内含子、信號序列2 [L1-内含子_L2])之鼠科動物免疫球蛋白重鏈信號序列， 在3'·•端排列有剪接供體位點及獨特XhoI限制位點的人源 化抗CD4抗體成熟可變重鏈編碼區段， 含有L234A及L235A突變之小鼠/人類重鏈雜交内含子， SEQ ID NO: 80之肽絲胺酸-甘胺酸連接子序列， 8£〇1〇!^0:3 8之抗融合肽丁-651， 牛生長激素（bGH)多聚腺嘌呤（”聚A”）信號序列，及 3'-端之獨特限制位點SgrAI。 mAb CD4 γΐ-重鏈結合物表現載體6304之質體定位展示 於圖4中。成熟（無信號序列）結合物重鏈之胺基酸序列以 ' SEQ ID NO: 82展示。 載體6304係以mAb CD4 γΐ-重鏈在倒數第二個c末端胺 基酸（亦即，重鏈之C末端離胺酸殘基經移除）處與編碼抗 融合肽Τ-651之核酸（SEQ ID NO: 38)及SEQ ID NO: 80之狀 甘胺酸-絲胺酸連接子接合之方式自載體6309產生。 e)載體6305 載體63 05為HEK293細胞中（例如）用於瞬間表現嵌入狀 抗CD4抗體γΐ-重鏈結合物之表現質體（染色體組組織化表 132628.doc -47· 200914467 現卡n ;外顯子-内含子組織）。 除嵌合肽抗CD4抗體γ1_重鏈結合物表現卡£之外，此载 體亦含有： 來自載體pUC 18之複製起點，其允許此質體在大腸桿菌 中複製，及 β山-内醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌以安比西林抗性。 嵌合肽-抗CD4抗體γΐ-重鏈結合物之轉錄單元係由以下 元件構成： 來自人類巨大細胞病毒之即刻早期增強子及啟動子， 人類抗體生殖系基因之5’-未轉譯區， 包括信號序列内含子（信號序列1、内含子、信號序列2 [L1内3子-L2])之鼠科動物免疫球蛋白重鏈信號序列， 在31-端排列有剪接供體位點及獨特Xh〇I限制位點的人源 化抗CD4抗體成熟可變重鏈編碼區段， 含有L234A及L23 5A突變之小鼠/人類重鏈雜交内含子， SEQ ID NO: 76之肽絲胺酸-甘胺酸連接子序列， SEQ ID NO: 83 之抗融合肽 afp-2， 牛生長激素（bGH)多聚腺嘌呤（”聚A”）信號序列，及 3'-端之獨特限制位點SgrAI。 載體6305係以mAb CD4 γ 1 -重鏈在倒數第二個c末端胺 基酸（亦即，重鏈之C末端離胺酸殘基經移除）處與編碼抗 融合肽afp-2之核酸（SEQ ID NO: 83)及SEQ ID NO: 76之狀 甘胺酸·絲胺酸連接子接合之方式自載體6309產生。 實例2 132628.doc -48 * 200914467 最终表現質體之製備 已使用已矣重組方法及技術藉由相符核酸區段連接來組 裝包含mAb CD4基因區段、可選之連接子基因區段及抗融 。肽基因區&之融合基因（重鏈及/或輕鏈抗體融合基因）。 編碼肽連接子及抗融合彡肽的錢序列各自藉纟化學合成 法合成且接蓍接合成大腸桿菌f體以便擴增。藉由腦定 序檢驗經次選殖之核酸序列。 實例3 HEK293 EBNA細胞中免疫球蛋白及免疫球蛋白變想之癖 間表現 藉由瞬間轉染培育於補充有丨〇%超低IgG FCS(胎牛血 /月，Gibco)、2 mM麵醯胺酸（Gibco)、1%體積/體積（v/v)非 必需胺基酸（Gibco)及 250 pg/ml G418(Roche Molecular Biochemicals)之DMEM(杜貝卡氏改良依格培養基 (Dulbecco's modified Eagle’s medium)，Gibco)中之黏著生 長 HEK293-EBNA細胞（表現愛-巴病毒（Epstein-Barr-Virus) 核抗原之人類胚腎細胞株293 ;美國典型菌種保藏中心寄 存編號ATCC # CRL-10852)來產生重組抗CD4抗體及抗 CD4抗體-變體。對於轉染FuGENE™ 6而言，轉染試劑 (Roche Molecular Biochemicals)係以 3:1至 6:1範圍内之試 劑（μΐ)與DNA(pg)之比率使用。包括抗融合肽-抗CD4抗體 結合物輕鏈及重鍵之輕鏈及重鏈分別使用1:2至2:1範圍内 的編碼質體之輕鏈與重鏈莫耳此自兩個不同質體表現。在 轉染後第4天至第11天採集含有細胞培養物上清液之抗融 132628.doc -49 - 200914467 合肽-抗CD4抗體結合物。關於人類免疫球蛋白在（例 如）HEK293細胞中之重組表現的一般資訊係在Meissner, P 等人，Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203 中給出。 實例4 使用SDS PAGE、西方墨點轉移及偵測法對免疫球蛋白特 異性抗體結合物進行表現分析
所表現及分泌之抗融合肽-抗CD4抗體結合物經十二烷基 硫酸鈉（SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)加工，且將 經分離之抗CD4-抗體及抗融合肽-抗CD4-抗體-結合物鏈轉 移至來自凝膠之膜且隨後藉由免疫學方法偵測。 SDS-PAGE LDS樣本緩衝液，四倍濃度（4x) : 4 g甘油、0.682 g TRIS-Base、0.666 g TRIS-鹽酸鹽、0,8 g LDS(十二烷基硫 酸鋰）、0.006 g EDTA(乙二胺四乙酸）、Serva Blue G250於 水中之0.75 ml之1重量％(w/w)溶液、0.75 ml之1重量 °/〇(w/w)盼紅溶液，添加水將總體積補足為1 0 ml。 將含有所分泌之抗融合狀-抗C D 4抗體結合物之培養物肉 湯離心以移除細胞及細胞碎片。將澄清上清液的等分試樣 與1/4體積（v/v)之4xLDS樣本緩衝液及1/10體積（v/v)之0.5 Μ 1,4-二硫蘇糖醇（DTT)混合。接著，將樣本在70°C下培 育10 min，且藉由SDS-PAGE將蛋白質分離。根據製造商 說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統（Invitrogen)。詳言 之，使用 10% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠 (pH 6·4)及 NuPAGE® MOPS 流動緩衝液。 132628.doc -50- 200914467 西方墨點法 轉移緩衝液：39 mM甘胺酸、48 mM TRIS-鹽酸鹽、 0.04 重量 ％ (w/w)SDS及 20體積％ (v/v)甲醇。 在 SDS-PAGE 後，根據 Burnette 之"Semidry-Blotting-Method” (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203)將經分離之抗 融合肽-抗CD4抗體結合物鏈電泳轉移至硝化纖維素過濾膜 (孑L 徑：0.45 μπι)。 免疫偵測 TBS-緩衝液：50 mM TRIS-鹽酸鹽，150 mM NaCl，調 整至pH 7.5。 阻斷溶液··於TBS-緩衝液中之1°/〇 (w/v)Western阻斷試 劑（Roche Molecular Biochemicals) TBST-緩衝液：具有 0.05體積。/。（v/v)Tween-20之 lxTBS-緩衝液 對於免疫偵測而言，在振盪下將西方墨點膜在室溫下在 TBS-緩衝液中培養兩次，歷時5 min，且在阻斷溶液中培 養一次，歷時90 min。 肽免疫球蛋白結合物鏈之偵測 重鏈：對於偵測抗融合肽-抗CD4抗體結合物之重鏈而 言，使用與過氧化酶結合之經純化之家兔抗人類IgG抗體 (〇八反〇，編碼第？0214號）。 輕鏈：抗融合肽-抗CD4抗體結合物之輕鏈使用經純化之 過氧化酶結合之家兔抗人類κ輕鏈抗體偵測（DAKO，編碼 第 P 0129號）。 132628.doc -51 - 200914467 對於目測抗體輕鏈及重鏈而言，在重鏈具有與過氧化酶 結合的經純化之家兔抗人類IgG抗體之狀況下或在輕鍵具 有經純化之過氧化無結合之家兔抗人類κ輕鏈抗體之狀 '、兄 下首先將經洗務且阻斷之西方墨點臈在丨：丨〇,〇〇〇稀釋度下 在10 ml阻斷溶液中在4°c下振盪隔夜。在室溫下，將^以 TBTS-緩衝液洗蘇三次且以TBS緩衝液洗滌一次歷時1〇 min之後，將西方墨點膜以魯米諾（Lumin〇1)/過氧化物溶液 顯色產生化學螢光（Lumi-LightPLUS西方墨點基質，R〇ehe Molecular Biochemicals)。因此，將膜在1〇 ml魯米諾/過氧 化物溶液中培育10 s至5 min，且隨後以LUMI-Imager F1
Analysator(Roche Molecular Biochemicals)偵測到發射光， 及/或以x射線膠片記錄。以LumiAnalyst軟體（3.1版）定量斑 點強度。 免疫墨點之多重著色 藉由將膜在70〇C下、在含有100 mM β-魏基乙醇及 20%(w/v)SDS之1 M TRIS-鹽酸鹽-緩衝液（ρΗ 6·7)中培育j h，可將用於偵測之二次過氧化酶標記抗體結合物自經染 色之墨點移除。在此處理之後，墨點可經不同二次抗體第 二次染色。在第二次偵測之前，在室溫下，在振盪下，將 墨點以TBS-緩衝液洗滌三次，每次1 0 min。 實例5 狀免疫球蛋白結合物之親和力純化、透析及濃縮
所表現及分泌之抗融合肽-抗CD4抗體結合物根據已知方 法藉由親和力層析法使用pr〇tein A_sepharoseTM CL-4B(GE 132628.doc • 52- 200914467
Healthcare former Amersham Bi〇science，Sweden)純化。簡 言之’在離心（10,000 g，歷時l〇 min)且經〇 45 μπι過濾器 過濾之後，將含有肽免疫球蛋白結合物之澄清培養物上清 液施用於經PBS緩衝液（10 rnM Na2HP04、1 mM ΚΗ2Ρ〇4、 137 mM NaCl 及 2.7 mM KC1 ’ pH 7,4)平衡的 Protein Α·
Sephar〇seTM CL-4B柱上。以PBS平衡緩衝液及M檸檬 酸鹽緩衝液（pH 5.5)將未結合之蛋白質洗去。將抗融合肽_ 抗CD4抗體結合物以〇 · 1 Μ檸檬酸鹽緩衝液，pH 3.0溶離， 且將含有結合物之溶離份以1 M TRIS-鹼中和。接著，在 4°C下將抗融合肽-抗CD4抗體結合物針對ρβS緩衝液廣泛 透析，用裝備有 Biomax-SK 膜（Millipore Corp.，USA)之
Ultrafree®-CL離心過濾單元濃縮且在〇°c下在冰水浴中儲 存。在存在及不存在還原劑之狀況下藉由SDS-PAGE且如 實例4所述以Coomassie亮藍染色來分析結合物之完整性。 藉由分析型尺寸排外層析法來分析抗融合肽-抗C〇4抗體結 合物之聚集。 實例6 肽免疫球蛋白結合物之去糖基化 將抗CD4抗體與抗融合肽-抗CD4抗體結合物之]sf-連接之 碳水化合物藉由以肽-N-醣苷酶F(PNGaseF, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany 〇r Prozyme San Leandro，CA)酶處理來分解。因此，將抗CD4抗體及 抗融合肽-抗CD4抗體結合物在37〇C下每毫克N-糖基化蛋白 質使用5 0 mU PNGaseF在約2 mg/ml之蛋白質濃度下培育 I32628.doc -53 - 200914467
12_24 h ^此後，肽_N-醣苷酶F根據已知方法藉由製備型凝 膠過濾分離。簡言之，將PNGaseF處理之抗CE>4_抗體及抗 融合肽-抗CD4抗體結合物施用於以PBS緩衝液（1〇 mM
Na2HP04、1 mM KH2P〇4、137 mM NaCl及 2.7 mM KCn， pH 7·4)平衡之 SuperoseTM 12 10/300 GL 管柱（GE Healthcare former Amersham Bioscience，Sweden)上，且接著以平衡緩 衝液以0.5-1.0 ml/min之流動速率使用來自Amersham Bioscience 之 Akta 探測層析系統（GE Healthcare former Amersham Bioscience，Sweden)溶離。 實例7 單循環抗病毒活性檢定 對於產生假型NL-Bal病毒而言，將質體pNL4-3Δεην(Ηΐν pNL4-3染色體組結構，在env基因内有缺失）及 pCDNA3.1/NL-BAL env [含有 NL-Bal env基因之 pcDNA3.1 質體（購自 NIBSC Centralized Facility for AIDS Reagents)] 共轉染至培養於含有10%胎牛血清（FCS)、100 U/mL青黴 素、100 pg/mL鏈黴素、2 mM L-麵醯胺酸及0,5 mg/mL新 Μ素（geniticin)(所有介質均購自invitr〇gen/Gibco)之杜貝 卡氏改良基本培養基（DMEM)中的HEK 293FT細胞株 (Invitrogen Corp.)中。轉染後第2天採集含有假型病毒的上 清液，且藉由經Ο·45 μιη孔徑PES(聚醚砜）過濾器（Nalgene) 過遽移除細胞碎片，且以等分試樣在-8〇。〇下儲存。為使 檢定效能標準化，使用病毒儲備等分試樣感染JC53_BL(US NIH Aids Reagent Program)細胞，每孔產生約 i.5xi〇s 132628.doc ·54· 200914467 RLU(相對發光單位）。將測試抗融合肽抗CD4抗體結合 物、親本抗CD4抗體、參照抗體及參照抗融合肽（Τ-65 1)於 96-孔培養中連續稀釋。將檢定重複進行四次。各培養盤 含有細胞對照孔及病毒對照孔。將1.5 X 1 〇5 RLU當量之病 毒儲備液添加至各孔中，接著將2·5χ104 JC53-BL細胞添加 至各孔中，每孔最終檢定體積為2〇〇 μΐ。在37。(：下、90% 相對濕度及5% C02下培育3天後，將介質吸出且將50 μΐ之 Steady-Glo®螢光素酶檢定系統（proniega)添加至各孔中。 在室溫下培育10 min後，在光度計（Luminoskan，Thermo Electron Corporation)上讀取檢定板。減去背景後，對各劑 量點計算螢光素酶活性之抑制百分比，且使用Excel之 XLfit曲線擬合軟體（3·0.5版Buildl2;Microsoft)測定IC50及 IC90值。結果展示於表3中。 表3 :抗融合多肽、抗體及抗融合肽·抗CD4抗體結合物之抗病 毒活性（以重量計） 化合物 抗病毒活性 NL-BAL (R5) NL-4-3 (X4) IC5〇 [ng/mL]/IC9〇 [ng/mL1 IC5〇 [ng/mL]/IC9〇 fng/mLl 參照抗體1(惰性） 非活性/非活性 非活性/非活性 參照抗體2(惰性） 非活性/非活性 非活性/非活性 T-651 ~ 21.5/181.9 169.2/1099.7 afp-1 19.6/- mAb CD4 (6310/6309) 最大抑制=50% 最大抑制=20% 抗融合狀-抗CD4抗體結合物 (6310/6303) 6.1/32.2 43.9/123.9 表4 :抗融合多肽、抗體及抗融合肽-抗CD4抗體結合物之抗病 毒活性（以莫耳濃度計） 132628.doc •55- 200914467 化合物 NL-BAL iR5> 抗病毒活性 NL-4-3 ίΧ4^ IC5〇 [nM]/IC9〇 fnMl IC5〇 [nM]/IC9〇 fnMl 參照抗體1(惰性） 1 非活性/非活性 非活性/非活性 參照抗體2(惰性） 非活性/非活性 非活性/非活性 T-651 5.4/45 42/275 mAb CD4(6310/6309) 最大抑制=50% 最大抑制=20% 抗融合肽-抗CD4抗體結合物 (6310/6303) 0.038/0.201 0.275/0.774 實例8 細胞-細胞融合檢定 在第1天’將gpl60-表現HeLa細胞（2xl04個細胞/50 μΐ/ 孔）接種於白色96微量滴定盤中的補充有丨〇% FCS及2 pg/ml多西環素（doxycycline)之DMEM培養基中。在第2 天’在透，明96微量滴定盤中每孔添加丨〇〇 μ丨之上清液樣本 或抗體對照物。接著添加100 μΐ含有8xl04 CEM-NKr-Luc 懸浮液細胞之培養基且在37。(：下培育30 min。自96孔培養 盤吸出HeLa細胞培養基，添加2〇〇 μ1抗體/CEM-NKr-Luc混 合物中的100 μΐ且在37°C下培育隔夜。在第3天，每孔添加 100 μΐ Bright-GloTM螢光素酶檢定底物（1，4-二硫蘇糖醇及 連二亞硫酸鈉；Promega Corp., USA)且在室溫下培育最少 1 5 min後量測發光。 材料
HeLa-R5-16細胞（在多西環素培育時表現HIV gpl60之細 胞株）在含有營養素及10% FCS以及400 pg/ml G418及200 pg/ml潮黴素B(Hygromycin B)的DMEM培養基中培養。 CEM.NKR-CD4-Luc(目錄編號：5198，購自 NIH AIDS 132628.doc -56· 200914467
Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USA之 T-細胞株）細胞類型：CEM.NKR-CD4(Cat. #4376)在 HIV-2 LTR之轉錄控制下經轉染（電穿孔）以表現螢光素酶基因且 在含有10%胎牛血清、4 mM麩醯胺酸、盤尼西林 (penicillin)/鏈黴素（1〇〇 U/mL盤尼西林、100 yg/mL 鏈黴 素）及0.8 mg/ml硫酸新黴素（G418)之RPMI 1640中繁殖。生 長特徵：圓形淋巴樣細胞，形態並非極可變。細胞作為單 個細胞在懸浮液中生長，其可形成小叢簇。每週兩次以 1:10分裂》特定特徵：在HIV-2 LTR轉錄活化後表現螢光 素酶活性。適用於以初級HIV分離物感染、適用於中和及 藥物敏感性檢定（Spenlehauer，C.等人，Virology 280 (2001) 292-300 ; Trkola，A.等人，J. Virol. 73 (1999) 8966-8974)。細胞株係經 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID，NIH 得自 Drs. John Moore 及 Catherine Spenlehauer。Bright-GloTM榮光素酶檢定緩衝液 (Promega Corp. USA，部分編號E2264B)、Bright-GloTM螢 光素酶檢定底物（Promega Corp. USA,部分編號EE26B)。 實例9 周邊血液單核細胞（PBMC)之抗病毒活性檢定 根據製造商規程，藉由 Ficoll-Paque(Amersham, Piscataway, New Jersey, USA)密度梯度離心法自膚色血球層（buffy-coats)(得自 Stanford Blood Center)中分離人類 PBMC。簡言 之，將血液自膚色血球層轉移入50 ml錐形管中且以無菌 132628.doc •57- 200914467 杜貝爾磷酸鹽緩衝鹽水（Invitrogen/Gibco)稀釋至50 ml之最 終體積。將25 ml所稀釋之血液轉移至兩個小心地襯有12.5 ml Ficoll-Paque Plus(Amersham Biosciences)的 50 ml錐形 管中’且在室溫下、以450 x g轉速離心20 min而不制動。 小心地將白血球層轉移至新5〇 ml錐形管中且以PBS洗滌兩 次。為移除剩餘紅血球’將細胞在室溫下以ACK溶胞緩衝 液（Biosource)培育5 min且以PBS再洗滌一次。對PBMC計 數且在37°C下、在2-4 xlO6個細胞/毫升之濃度下在含有 10% FCS(Invitrogen/Gibco)、1% 青黴素 / 鏈黴素、2 mM L- 麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及2 pg/ml植物凝血素 (Invitrogen)之RPMI1640中培育24 h。在檢定前，將細胞用 5早位/宅升人類 IL-2(Roche Molecular Biochemicals)培育 最少48 h。在96孔圓底培養盤中，在連續稀釋之測試抗融 合肽-抗CD4抗體-結合物、參照免疫球蛋白、親本抗CD4 抗體及參照肽（T-651)存在下，將ixio5 PBMC以HIV-1 JR- CSF病毒（Koyanagi，Y.等人，Science 236 (1987) 819-822) 感染。所用病毒之量等於每孔1.2 ng HIV-1 p24抗原。感染 重複建立四次。將培養盤在37〇C下培育6天。在感染結束 時，藉由使用 p24 ELISA(HIV-1 p24 ELISA #NEK050B，
Perkin Elmer/NEN)使用S形劑量反應模式用一個結合位點 以 Microsoft Excel 擬合（3.0,5 版 Build 12 ;等式 205 ;
Microsoft)來量測病毒產生。 表5 :抗融合多肽、抗體及抗融合肽-抗匚!^抗體結合物之 抗病毒活性（以重量計） 132628.doc -58- 200914467 化合物 抗病毒活性 NL-BAL NL-4-3 IC5〇 [ng/mL]/IC9〇 IC5〇 [ng/mL]/IC9〇 fng/mLl 參照抗體1(惰性） 非活性/非活性 非活性/非活性 參照抗體2(惰性） 非活性/非活性 非活性/非活性 T-651 14.1/57.8 .. 41.4/79.6 afp-1 -/57.6 抗 CD4 抗體(6310/6309) 917.6/最大54%抑制 35.6/1117.0 抗融合肽-抗CD4抗體結合物 (6310/6303) 5.3/18.2 3.2/25.1 在表6中，給出視分子中糖基化位點數目而定的抗融合 肽-抗CD4抗體結合物之抗病毒活性。如以糖基化位點數目 C ' 可見’抗病毒活性有所變化。 表6 :抗融合多肽、抗體及抗融合肽-抗CD4抗體結合物之 抗病毒活性（以重量計） 化合物 抗病毒活性 NL-BAL NL-4-3 IC50 [ng/mL]/IC9〇 [ng/mLl IC5〇 [ng/mL]/IC9〇 [ng/mLl T-651 7.3/36.0 26.7/95.7 抗 CD4 抗體(6310/6309) 重鏈中有一個糖基化位點 514.4/> 5000 32.7/743.6 抗融合肽-抗CD4抗體結合物 (6310/6304) 重鏈中有一個糖基化位點 抗融合肽中有兩個糖基化位點 7.1/44.0 4.2/17.54 抗融合肽-抗CD4抗體結合物 (6310/6303) 重鏈中有一個糖基化位點 抗融合肽中有一個糖基化位點 3.4/12.1 2.5/19.5 k融合肽-抗CD4抗體結合物 (6310/6305) 重鍵中有一個糖基化位點 抗融合肽中無糖基化位點 1.4/8.5 1.3/7.5
【圖式簡單說明】 圖1:111八1)€〇4 1^輕鏈表現載體6310之質體定位。 132628.doc -59- 200914467 圖2 : mAb CD4 γΐ-重鏈表現載體6309之質體定位。 圖3 : mAb CD4 γΐ-重鏈結合物表現載體6303之質體定 位。 ' 圖4 : mAb CD4 γ卜重鏈結合物表現載體6304之質體定 位。 132628.doc -60- 200914467 序列表
<1丨〇> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120> 抗CD4抗體及抗融合肽之結合物 <130> 24395-FT <140> 097127550 <141> 2008-07-18 <150> EP07014335.9 <151> 2007-07-20 <160> 83 <170> Patentln version 3.2
<210> 1 <211> 112 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 1
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met lie Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Thr Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>嵌合輕鍵可變域 132628-seq.doc 200914467 <400> 2
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Thr Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
o lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 241 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>嵌合輕鏈 <400> 3
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Gly Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser 20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser 35 40 45
Gly Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr 50 55 60
Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser 65 70 75 80 2- 132628-seq.doc 200914467
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala 100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Arg Gly 115 120 125
Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie 130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys 165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu 180 185 190
Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 210 215 220
His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 225 230 235 240
Cys <210> 4 <2H> 112 <212> prt <213>人工 <220〉 <223>嵌合輕鏈可變域 <400> 4
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 132628-seq.doc 200914467
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Thr Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
He Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110 <210〉 5 <211> l〇8 <212> PRT <213>人工 <220> <223>嵌合輕鏈可變域 <400> 5
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15 c
Asp Arg Val Thr 20 lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Asn Tyr 25 30
He Ma Trp Tyr Gln His
Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 40 45
His Tyr Thr Ser 50
Thr Leu Gin Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 55 60 gr Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 70 Ί5 80
Glu Asp lle 心厂 Tyr Cys Leu Gin Gin Tyr Asp Asn Leu Leu Phe 85 90 95 132628-seq.doc -4- 200914467
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Gin lie Thr Arg 100 105 > > > > 0 12 3 I—11 ϊ—~ X 2 2 2 2 < < V < 2 T工 1RV 1 p人 <220> <223>嵌合輕鏈可變域 <400> 6
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Thr Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
<210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 7
Glu Val Lys Leu Gin Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Val lie His Trp Val Arg Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Asp Trp lie 35 40 45 132628-seq.doc 200914467
Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 8 <211> 122 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>人源化重鍵可變域 <400> 8
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Val lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Leu Asp Pro Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 -6 - 132628-seq.doc 200914467
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 467 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>嵌合重鏈 <400> 9
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 15 10 15
Ala His Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Ser Tyr Val lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60
Glu Trp lie Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp 65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Leu Asp Pro Ser Thr Asn 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe 115 120 125
Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 145 150 155 160
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 132628-seq.doc 200914467
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 210 215 220
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285
Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr 305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 340 345 350 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 132628-seq.doc 200914467
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460
Leu Gly Lys 465 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> 人工
<223>嵌合重鏈可變域 <400> 10
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 .30
Val He His Trp Val Arg Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Asp Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 ϋ
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 7 5 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 132628-seq.doc 200914467 <210> 11 <211> 120 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>嵌合重鏈可變域 <400> 11
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ala lie Ser Asp His Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 7 0 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Lys Tyr Gly Gly Asp Tyr Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 120 L- <210> 12 <211〉 122 <212> PRT <213> 人工 ' <220> <223>嵌合重鏈可變域 - <400> 12
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 10 132628_seq.doc 200914467
Val lie His Trp Val Arg Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Asp Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 no
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211〉 17 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 13
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gin Lvs Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> CDR ' <400> 14
Lys Ser Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gin Lys Asn Tyr Leu - 15 10 15
Ala <210> 15 -11 - 132628-seq.doc 200914467 <211> 17 <212> <213> PRT 人工 <22〇> * <223> CDR <400> 15
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 16 <211> <212> s <213> 9 PRT 人工 <220> <223> CDR <400> 16
Lys Ala Ser Gin Asp lie Asn Asn Tyr 1 5 <210> <211> 17 7 <212> <213> PRT 小家鼠 <400> 17
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 j <210> <211> 18 7 <212> <213> PRT 小家鼠 <400> 18
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 19 11 PRT 小家鼠 <400> 19 -12- 132628-seq.doc 200914467
Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Pro Gly Val Pro Ser 1 5 10 <210> * <211> 20 8 <212> <213> PRT 小家鼠 <400> 20
Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr 1 5 <210> <211> 21 8 <212> <213> PRT 小家鼠 , <400> 21
Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr 1 5 <210> <211> 22 6 <212> <213> PRT 小家鼠 <400> 22
Tyr Asp Asn Leu Leu Phe 1 5 <210> 23 <211> <212> <213> fe；,- 5 PRT 小家鼠 <400> 23
Ser Tyr Val lie His 1 5 <210> 24 <211> <212> <213> 5 PRT 小家鼠 <400> 24
Ser Tyr Val lie His 1 5 -13 - 132628-seq.doc 200914467 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 25
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser 15 10 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 26
Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15
Gly <210> 27 <211〉 17 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 27
Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 28
Ala lie Ser Asp His Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Pro 15 10 <210> 29 <211〉 13 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 29 • 14· 132628-seq.doc 200914467
Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 15 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 30
Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 31
Ala Arg Lys Tyr Gly Gly Asp Tyr Asp Pro Phe 15 10 <210> 32 <211> 330 <212> PRT <213> 智人 <400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys .15- 132628-seq.doc 200914467 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 16- 132628-seq.doc 200914467 <210> 33 <211> 327 <212> PRT <213> 智人 <400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125
Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 -17- 132628-seq.doc 200914467
Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285
O
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213>智人 <400> 34
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 -18- 132628-seq.doc 200914467
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 35 <211> 34 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> C34 <400> 35
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Asn Tyr Thr Ser Leu lie His 1 5 10 15
Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu 20 25 30
Leu Leu <210> 36 <211> 36 <212> PRT <213>人工 <220> <223> T2〇 <400> 36
Tyr Thr Ser Leu lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin 15 10 15
Glu Lys Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 20 25 30
Trp Asn Trp Phe 35 <210> 37 <211> 39 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> T1249 -19- 132628-seq.doc 200914467 <400> 37
Trp Gin Glu Trp Glu Gin Lys lie Thr Ala Leu Leu Glu Gin Ala Gin 15 10 15 lie Gin Gin Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gin Lys Leu Asp Lys Trp 20 25 30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 35 <210> 38 <211> 36 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> T651
<400> 38
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Asn Tyr Thr Ser Leu 15 10 15 lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu 20 25 30
Gin Glu Leu Leu 35 <210〉 39 <211> 38 <212> PRT <213> 人工 <220〉 <223> T2635 <400> 39
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 1 5 10 15 lie Glu Ala Leu lie Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 20· 132628-seq.doc 200914467 <210> 40 <211> 36 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> N36 <400> 40
Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Leu Leu Arg Ala lie Glu Ala 15 10 15
Gin Gin His Leu Leu Gin Leu Thr Val Trp Gly lie Lys Gin Leu Gin 20 25 30
Ala Arg lie Leu 35 <210> 41 <211> 38 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> DP107 <400> 41
Asn Asn Leu Leu Arg Ala lie Glu Ala Gin Gin His Leu Leu Gin Leu 1 5 10 15
Thr Val Trp Gly lie Lys Gin Leu Gin Ala Arg lie Leu Ala Val Glu 20 25 30
Arg Tyr Leu Lys Asp Gin 35 <210〉 42 <211> 37 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> afp-1 <400> 42
Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Gin Tyr Thr Ser 15 10 15
Leu lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn -21 - 132628-seq.doc 200914467 20 25 30 Glu Gin Glu Leu Leu 35 <210〉 43 <211〉 123 <212> PRT <213> 人工 <220>
<223> HIV-1 gp41胞外域變體單個突變：I568P <400> 43
Val Gin Ala Arg Gin Leu Leu Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn 15 10 15
Leu Leu Arg Ala He Glu Gly Gin Gin His Leu Leu Gin Leu Thr Val 20 25 30
Trp Gly Pro Lys Gin Leu Gin Ala Arg He Leu Ala Val Glu Arg Tyr 35 40 45
Leu Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly lie Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu 50 55 60 lie Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser 65 70 75 80
Leu Glu Gin lie Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu 85 90 95 lie Asn Asn Tyr Thr Ser Leu lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin 100 105 no
Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu Leu Leu 115 120 <210> 44 <211> 132 <212> PRT <213> 人工 <220>
<223> HIV-1 gp4胞外域變體四重突變：I568P、L550E、L566E、I580E <400> 44 22 · 132628-seq.doc 200914467
Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin Leu Leu 15 10 15
Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Glu Leu Arg Ala lie Glu Gly 20 25 30
Gin Gin His Leu Glu Gin Leu Thr Val Trp Gly Pro Lys Gin Leu Gin 35 40 45
Ala Arg Glu Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu Leu 50 55 60
Gly lie Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu lie Cys Thr Thr Ala Val Pro 65 70 75 80
Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gin lie Trp Asn Asn 85 90 95
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Asn Tyr Thr Ser Leu 100 105 110 lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu 115 120 125
Gin Glu Leu Leu 130 <210> 45 <211> 345
<212> PRT <213>人類免疫缺陷病毒 <400> 45
Ala Val Gly lie Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly 15 10 15
Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin 20 25 30
Leu Leu Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Leu Leu Arg Ala lie 35 40 45
Glu Ala Gin Gin His Leu Leu Gin Leu Thr Val Trp Gly lie Lys Gin 50 55 60 -23 - 132628-seq.doc 200914467
Leu Gin Ala Arg lie Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin 65 70 75 80
Leu Leu Gly lie Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu lie Cys Thr Thr Ala 85 90 95
Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gin lie Trp 100 105 110
Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Asn Tyr Thr 115 120 125
Ser Leu lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys 130 135 140
Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn 145 150 155 160
Trp Phe Asn lie Thr Asn Trp Leu Trp Tyr lie Lys Leu Phe He Met 165 170 175 lie Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg lie Val Phe Ala Val Leu Ser 180 185 190 lie Val Asn Arg Val Arg Gin Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gin Thr 195 200 205
His Leu Pro Thr Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly lie Glu Glu 210 215 220
Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser lie Arg Leu Val Asn Gly 225 230 235 240
Ser Leu Ala Leu lie Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser 245 250 255
Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu lie Val Thr Arg lie Val Glu 260 265 270
Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu 275 280 285
Leu Gin Tyr Trp Ser Gin Glu Leu Lys Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu 290 295 300 • 24- 132628-seq.doc 200914467
Asn Ala Thr Ala lie Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val lie 305 310 315
Val Val Gin Gly Ala Cys Arg Ala lie Arg His lie Pro Arg Arg 325 330 335
Arg Gin Gly Leu Glu Arg lie Leu Leu 340 345 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 連接子1 <400> 46
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>連接子2 <400〉 47
Leu Ser Pro Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>連接子3 <400> 48
Gly Gin Gin Gin Gin Gly Gin Gin Gin Gin Gly Gin Gin Gin Gin 15 10 15
<210> 49 <211> 16 <212> PRT -25 -
Glu 320 lie 132628-seq.doc 200914467 <213〉人工 <220〉 <223>連接子4 <400> 49
Gly Gin Gin Gin Gin Gly Gin Gin Gin Gin Gly Gin Gin Gin Gin Gly 15 10 15 <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>連接子5 <400> 50
Gly Gin Gin Gin Gin Gly Gin Gin Gin Gin Gly Gin Gin Gin Gin Gly 1 5 10 15
Asn Asn <210> <211> <212> <213> <220> <223> 連接子6 <400> 51
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 15 10 15 <210> <211> <212> <213> <220> <223> 連接子7 <4〇0> 52
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn 15 10 15 <210> 53 <211> 15 26- 132628-seq.doc 200914467 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 連接子8 <400> 53
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 54 <211> 16 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> 連接子9 <400〉 54
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 15 10 15 > > > > 0 12 3 Tx -—l i—I 2 2 2 2 T工 5 7 R > 5 X p <220> <223> 連接子10 <400> 55
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15
Thr <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>連接子11 <400> 56
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Gly -27- 132628-seq.doc 200914467 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> 連接子12 <400> 57
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glv 15 10 15
Gly Thr <210> 58 <211> 18 <212> PRT <213〉人工 <220〉 <223>連接子13 <400> 58
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Gly Asn <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> 連接子14 <400> 59
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Ala Ser <210> 60 <211> 25 132628-seq.doc - 28 - 200914467 <212> PRT <213>人工 <220> <223>連接子15 <400> 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 G1V G1Y Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 <210> 61 <211> 26 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 連接子16 <400> 61
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 <210> 62 <211> 27 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 連接子17 <400> 62
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 2〇 25 <210> 63 <211> 28 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>連接子18 132628-seq.doc - 29 - 200914467 <400> 63
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser 20 25 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 連接子19 <400> 64 Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Gly <21〇> 65 <211> 19 <212> PRT <213〉人工 <22〇> <223> 連接子20 <400〉 65
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15
Gly Ala Ser <210> 66 <211> 18 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>連接子24 <400> 66
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 •30· 132628-seq.doc 200914467
Ala Ser <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 連接子25 <400> 67
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15
<210> 68 <211> 26 <212> PRT <213> 人工 <220〉 <223>連接子26 <40〇> 68
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 2〇 25 <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> 連接子27 <400> 69
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15
Gly <210> 70 <211> 27
<212> PRT -31 - 132628-seq.doc 200914467 <213> 人工 <220> <223> 連接子28 <400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 <210> <211> <212> <213> 71 6 PRT 人工 <220> <223> 連接子29 <400> 71
Leu Ser Leu Ser Gly Gly 1 5 <210> <211> 72 7 <212〉 PRT <213> 人工 <220> <223> 連接子30 <400 72
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly 1 5 <210> <211> <212> <213> 73 20 PRT 人工 <220> <223> 連接子31 <400> 73
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 15 10 15
Gly Gly Gly Ser 20 132628-seq.doc -32- 200914467 <210> 74 <211> <212> <213〉 23 PRT 人工 • <220> <223> 連接子32 _ <400> 74
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 15 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 <210> 75 <211> <212> ' <213> 15 PRT 人工 <220> <223> 連接子33 <400> 75
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15 <210> 76 <211> <212> <213> 16 PRT 人工 <220> <223> 連接子34 <400> 76
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 15 10 15 <210> 77 <211> <212> <213> 219 PRT 人工 <220> <223> 抗CD4抗體輕鏈 <400> 77
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly -33- 132628-seq.doc 200914467 1 10 15
Glu Arg Val
Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Thr Asn Gin 35
Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 40 45
Ser Pro Lys 50
Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 55 60
Pro Asp Arg 65
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 70 75 80 lie Ser Ser
Val Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser
Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val 115
Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 120 125
Gin Leu Lys 130
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 135 140
Tyr Pro Arg 145
Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 150 155 160
Ser Gly Asn
Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175
Thr Tyr Ser
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190
Lys His Lys 195
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 200 205
Pro Val Thr 210
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 <210> 78 <211> 452 <212> PRT <213〉 人工 132628-seq.doc -34· 200914467 <220> <223>抗0〇4抗體重鏈 <400> 78
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Val lie His Trp Val Arg Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Asp Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175
Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn 195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser -35- 132628-seq.doc 200914467 210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val 370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 -36 132628-seq.doc 200914467
Ser Pro Gly Lys 450 <210> 79 <211〉 503 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>抗0〇4抗體重鏈-afp-1抗融合肽結合物 <400> 79
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
Val lie His Trp Val Arg Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Asp Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 37- 132628-seq.doc 200914467
Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr ISO 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn 195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 -38- 132628-seq.doc 200914467
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460
Ser Gly Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu 工le Asn Gin Tyr 465 470 475 480
Thr Ser Leu He His Ser Leu He Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu 485 490 495
Lys Asn Glu Gin Glu Leu Leu 500 <210> 80 <211> 18 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> 連接子35 <400> 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15
Gly Asn <210> 81 <211> 19 <212〉 PRT <213> 人工 <220> <223>連接子36 <400> 81
Lys Gly Gly Gly cly Ser Gly Qly Gly Giy 10 15
Gly Gly Asn 132628-seq.doc 39- 200914467 <210> 82 <211> 506 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>抗〇〇4抗體重鏈 <400> 82
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Val lie His Trp Val Arg Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Asp Trp lie 35 40 45
Gly Tyr 工le Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175
Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 -40- 132628-seq.doc 200914467
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn 195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 -41 - 132628-seq.doc 200914467
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445
Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 450 455 450
Gly Gly Ser Gly Gly Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu He 465 470 475 480 e s 5 8
L o 9 9 4 so y o
L o 5 0 12 3 t ~I ϊ~I <~~1 <~i 2 2 2 2 < < < <
T工 3 6 Rv 8 3 p -A <220> <223> afp-2 <400> 83
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Gin Tyr Thr Ser Leu 1 5 10 lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu 20 25 30
Gin Glu Leu Leu 35 42- 132628-seq.doc

Claims (1)

  1. 200914467 十、申請專利範圍： 1. 一種結合物，其包含兩個或兩個以上抗融合肽及一個抗 CD4抗體，其特徵在於2至8個抗融合肽各自與該抗cD4 抗體之重鏈及/或輕鏈的一末端結合。 2. 如咕求項1之結合物，其特徵在於抗匚〇4抗體鏈之羧基末 端胺基酸與抗融合肽之胺基末端胺基酸結合或該抗融合 肽之羧基末端胺基酸與該抗體鏈之胺基末端胺基酸結 合，較佳係在有或無中間連接子之情況下經肽鍵結合。 3. 如明求項1之結合物，其特徵在於該結合物具有以下通 式： mAb CD4-[連接子1•[抗融合肽]n 其中對於各抗融合肽而言m獨立地為〇或i， 其中η為2至8之整數。 4. 如請求項3之結合物，其特徵在於„為2或4。 5. 如請求項1之結合物，其特徵在於該結合物包含選自由 以下各物組成之群（以Ν末端至〇末端方向）的mAb 〇1)4之 重鏈及/或輕鏈及抗融合肽（”鏈結合物”）： (1) [抗融合肽]-[連接子]m_[重鏈]， (2) [重鏈]-[連接子]m_[抗融合肽]， (3) [抗融合肽H連接子]m_[重鏈]_[抗融合肽], (4) [抗融合肽]-[連接子][輕鏈]， (5) [輕鏈H連接子]m_[抗融合肽]， (6) [抗融合肽]·[連接子[輕鏈]_[抗融合肽]， ⑺[抗融合肽Η連接子]m-[重鏈]_[連接子[抗融合 132628.doc 200914467 、[抗融合 (8)[抗融合肽]、[連接子k_[輕鏈]_[連接子]
    冋或不同，其中m為1 m可獨立地相同或不 6 ·如請求項5之結合物，其包含 2x[mAb CD4輕鏈]及2><鏈結合物（2)、 2x[mAb CD4輕鏈]及2χ鏈結合物（3) 2x[mAbCD4重鏈]及2χ鏈結合物⑷，或 2x[mAb CD4輕鏈]及2Χ鏈結合物（7)。 7. 如請求項1或4之結合物，其特徵在於該可變重鏈結構域 係由免疫球蛋白構架及選自SEQ ID N〇: 29、3〇或31之重 鍵CDR3序列的CDR3區組成。 8. 如請求項7之結合物，其特徵在於該結合物包含由免疫 球蛋白構架及選自SEQ ID N〇: 29、3〇或31iCDR3序列 的CDR3區、選自SEQ ID NO: 26、27或28之CDR2序列的 CDR2區及選自SEQ ID NO: 23、24或25之CDR1序列的 CDR1區組成之可變重鏈結構域。 9·如明求項1或4之結合物，其特徵在於其包含SEq ID N〇: 08或1〇之重鏈可變域。 1 〇.如請求項1或4之結合物，其特徵在於其包含由免疫球蛋 白構架及選自SEQ ID NO: 13、14、15或16之CDR1區、 選自 SEQ 1〇 N〇: 17、18或 19iCDR2區及選自 SEq 1〇 132628.doc 200914467 NO: 20、21或22之CDR3區組成的可變輕鏈結構域。 11.如請求項1或4之結合物，其特徵在於其包含SEQ ID NO: 07之CDR作為重鏈CDR及SEQ ID NO: 01之CDR作為輕鏈 CDR、SEQ ID NO: 08之 CDR作為重鏈 CDR及 SEQ ID NO: 02之CDR作為輕鏈CDR、SEQ ID NO: 10之CDR作為重鏈 CDR及 SEQ ID NO: 04之 CDR作為輕鏈 CDR、SEQ ID NO: 11之CDR作為重鏈CDR及SEQ ID NO: 05之CDR作為輕鏈 CDR 或 SEQ ID NO: 12 之 CDR 作為重鍵 CDR 及 SEQ ID NO: 06之CDR作為輕鏈CDR。 1 2.如請求項1或4之結合物，其特徵在於包含獨立地選自以 下各物之可變重鏈結構域及可變輕鏈結構域： a) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 07界定之重鏈可變域及 由胺基酸序列SEQ ID NO·· 01界定之輕鏈可變域； b) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 08界定之重鏈可變域及 由胺基酸序列SEQ ID NO: 02界定之輕鏈可變域； c) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 10界定之重鏈可變域及 由胺基酸序列SEQ ID NO: 04界定之輕鏈可變域； d) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 11界定之重鏈可變域及 由胺基酸序列SEQ ID NO: 05界定之輕鏈可變域； e) 由胺基酸序列SEQ ID NO: 12界定之重鏈可變域及 由胺基酸序列SEQ ID NO: 06界定之輕鏈可變域。 1 3 .如請求項1或4之結合物，其特徵在於其包含由胺基酸序 列SEQ ID NO: 07界定之重鏈可變域及由胺基酸序列SEQ ID NO: 01界定之輕鏈可變域；或由胺基酸序列SEQ ID 132628.doc 200914467 NO: 08界定之重鏈可變域及由胺基酸序列SEq ID N〇: 〇2 界定之輕鏈可變域；或由胺基酸序列SEQ ID NO: 10界定 之重鏈可變域及由胺基酸序列SEQ ID NO: 04界定之輕鏈 可變域；或由胺基酸序列SEQ ID NO: 11界定之重鏈可變 域及由胺基酸序列SEQ ID NO: 05界定之輕鏈可變域；或 由胺基酸序列SEQ ID NO: 12界定之重鏈可變域及由胺基 酸序列SEQ ID NO: 06界定之輕鏈可變域；選自胺基酸甘 胺酸（G)及天冬醯胺酸（N)、三肽GST及SEQ ID NO: 46至 76或80或81之連接子；及選自SEQ ID NO: 35至44或83之 抗融合狀的抗融合狀。 1 4·如請求項1或4之結合物’其特徵在於該結合物包含選自 抗融合肽 C34、T20、T1249、T651、T2635、N36、 〇?107或3[口-1或3£口-2之抗融合肽。 1 5.如請求項1或4之結合物，其特徵在於其在該等重鏈之各 C末端或在該等輕鏈之各N末端包含抗融合肽。 1 6.如請求項1或4之結合物，其特徵在於其在該等重鏈之各 C末端及在該等輕鏈之各n末端包含抗融合肽。 1 7.如請求項1或4之結合物’其特徵在於其包含SEq id NO: 〇1之兩個輕鏈可變域’各自包含§EQ N〇: 〇7之重鏈可 變域、SEQ ID NO: 75之連接子及SEQ ID N〇: 42之抗融 合肽的兩個（2)型結合物；特徵在於包含SEq id NO: 02 之兩個輕鏈可變域，各自包含Seq id NO: 08之重鏈可變 域、SEQ ID NO: 75之連接子及SEQ id NO: 42之抗融合 肽的兩個（2)型結合物；特徵在於包含SEQ id NO: 04之 132628.doc 200914467 兩個輕鏈可變域，各自包含SEQ ID NO: 1 0之重鏈可變 域、SEQ ID NO: 75之連接子及SEQ ID NO: 42之抗融合 肽的兩個（2)型結合物；特徵在於包含SEQ ID NO: 05之 兩個輕鏈可變域，各自包含SEQ ID NO: 11之重鏈可變 域、SEQ ID NO: 75之連接子及SEQ ID NO: 42之抗融合 肽的兩個（2)型結合物；或特徵在於包含SEQ ID NO: 06 之兩個輕鏈可變域，各自包含SEQ ID NO: 12之重鏈可變 域、SEQ ID NO: 75之連接子及SEQ ID NO: 42之抗融合 肽的兩個（2)型結合物。 18. 如請求項1或4之結合物，其特徵在於該抗CD4抗體為 IgGl子類或IgG4子類。 19. 如請求項18之結合物，其特徵在於該IgG4子類之抗CD4 抗體具有S228P突變且該IgGl子類之抗CD4抗體具有 L234A及 L235A突變。 20. 如請求項1或4之結合物，其特徵在於該抗CD4抗體為人 類抗體、人源化抗體、嵌合抗體或T細胞抗原耗盡之抗 體。 2 1 —種產生如請求項1之結合物的方法，其特徵在於該方 法包含： a) 在適於表現該結合物之條件下，培養含有一或多個 含有一或多個編碼本發明之結合物之核酸分子的質 體的細胞； b) 自該細胞或上清液回收該結合物。 22. —種SEQ ID NO: 42之抗融合肽。 132628.doc 200914467 23. —種醫藥組合物，其含有如請求項1之結合物以及醫藥 學上可接受之賦形劑或載劑。 24. —種如請求項1之結合物之用途，其係用於製造用以治 療病毒感染之藥物。 25. —種SEQ ID NO: 83之抗融合肽。 132628.doc
TW097127550A 2007-07-20 2008-07-18 A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides TW200914467A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07014335 2007-07-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW200914467A true TW200914467A (en) 2009-04-01

Family

ID=38825000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW097127550A TW200914467A (en) 2007-07-20 2008-07-18 A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20090022720A1 (zh)
EP (2) EP2178566A1 (zh)
JP (1) JP2010534212A (zh)
KR (1) KR20100049547A (zh)
CN (2) CN102099057B (zh)
AR (1) AR067584A1 (zh)
AU (1) AU2008280443B2 (zh)
BR (1) BRPI0814533A2 (zh)
CA (1) CA2693663A1 (zh)
CL (1) CL2008002092A1 (zh)
IL (1) IL202565A0 (zh)
PE (1) PE20090503A1 (zh)
TW (1) TW200914467A (zh)
WO (1) WO2009012944A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101280704B1 (ko) 2007-10-12 2013-07-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 다수의 핵산으로부터의 단백질 발현
US20120028347A1 (en) * 2009-01-28 2012-02-02 Tokai University Educational System Agent for suppressing replication of hiv and use thereof
KR20130045385A (ko) * 2010-09-14 2013-05-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 세르핀-핑거 융합 폴리펩티드
US8440797B2 (en) 2010-12-06 2013-05-14 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Human monoclonal antibody
KR20130132904A (ko) * 2010-12-06 2013-12-05 다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤 인간 모노클로날 항체
JOP20140087B1 (ar) * 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
PT3286212T (pt) * 2015-04-24 2021-08-24 Viiv Healthcare Uk No 5 Ltd Polipéptidos dirigidos para fusão com hiv
CN105039379A (zh) * 2015-08-31 2015-11-11 浙江大学 一种大肠杆菌无细胞体系生产HIV-1 gp41重组抗原的方法
EP3559042A4 (en) * 2016-12-22 2020-11-25 Icahn School of Medicine at Mount Sinai ANTI-LILRB3 ANTIBODIES AND METHOD OF USING THEREOF
CN111278461A (zh) * 2017-08-16 2020-06-12 百时美施贵宝公司 可前药化抗体、其前药以及使用和制备方法
EP3849996A1 (en) * 2018-09-11 2021-07-21 NanoTag Biotechnologies GmbH Epitope tags recognized by specific binders
JP2022520632A (ja) * 2019-02-15 2022-03-31 インテグラル・モレキュラー・インコーポレイテッド 共通軽鎖を含む抗体及びその使用
CN113461811A (zh) * 2021-06-30 2021-10-01 复旦大学 一种双特异性抗hiv-1抗体

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8603765D0 (en) * 1986-02-15 1986-03-19 Beecham Wuelfung Gmbh & Co Kg Compounds
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5202238A (en) * 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) * 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
JPH0468776A (ja) * 1990-07-04 1992-03-04 Pioneer Electron Corp 情報記録及び静止画再生装置
DE69126301T2 (de) 1990-11-27 1998-01-02 Biogen, Inc., Cambridge, Mass. Hiv-induzierte synzytien blockierender anti-cd-4-antikörper
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
NZ243706A (en) 1991-07-25 1994-08-26 Idec Pharma Corp Recombinant monkey antibodies, pharmaceutical compositions
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
DE69326069T2 (de) * 1992-07-20 2000-03-23 Univ Durham Zusammensetzungen die die hiv replikation inhibieren
CA2162689C (en) 1993-05-12 2000-07-18 Marc D. Better Immunotoxins comprising gelonin and an antibody
US5464933A (en) * 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6017536A (en) * 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6479055B1 (en) * 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
CA2221350A1 (en) 1995-05-18 1996-11-21 Ortho Pharmaceutical Corporation Induction of immunological tolerance by the use of non-depleting anti-cd4 antibodies
KR100571215B1 (ko) 1995-06-07 2006-10-24 트라이머리스 인코퍼레이티드 복합적인치료요법을이용한hiv와다른바이러스감염의치료
US5646480A (en) * 1995-06-19 1997-07-08 Northrop Grumman Corporation Metal assist structure for an electroluminescent display
WO1997046697A2 (en) 1996-06-03 1997-12-11 United Biomedical, Inc. Antibodies against a complex of cd4 and a chemokine receptor domain, and their use against hiv infections
US6020159A (en) 1996-09-24 2000-02-01 Smithkline Beecham Corporation 3-dehydroquinate synthase
AU5874798A (en) 1997-01-31 1998-08-25 Biovation Limited Vaccination methods and molecules
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
US20030103984A1 (en) * 1998-05-04 2003-06-05 Heinz Kohler Fusion proteins of biologically active peptides and antibodies
US6258782B1 (en) * 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6656906B1 (en) * 1998-05-20 2003-12-02 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
CA2346943A1 (en) * 1998-10-13 2000-04-20 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Cyclic tetrapeptide compound and use thereof
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6138310A (en) * 1999-04-23 2000-10-31 Porper; Robert P. Electric toothbrush having opposed bristle heads
TWI230178B (en) * 1999-05-13 2005-04-01 Sumitomo Chemical Co Liquid crystal polyester resin composition and molded article thereof
EP1264840B1 (en) 1999-05-17 2009-09-23 ConjuChem Biotechnologies Inc. Long lasting fusion peptide inhibitors of viral infection
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
US6430559B1 (en) * 1999-11-02 2002-08-06 Claritech Corporation Method and apparatus for profile score threshold setting and updating
WO2001043779A2 (en) 1999-12-16 2001-06-21 Tanox, Inc. Anti-hiv-1 conjugates for treatment of hiv disease
ES2269366T3 (es) * 2000-02-11 2007-04-01 Merck Patent Gmbh Mejoramiento de la vida media en circulacion de proteinas de fusion basadas en anticuerpos.
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
DE60129695T2 (de) * 2000-06-29 2008-06-05 Merck Patent Gmbh Steigerung von durch antikörper-zytokin-fusionsproteine mediierten immunantworten durch eine kombinierte behandlung mit mitteln zur erhöhung der immunzytokinaufnahme
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
EP1471928A1 (en) * 2002-02-07 2004-11-03 Delta Biotechnology Limited Hiv inhibiting proteins
US20040076637A1 (en) 2002-09-27 2004-04-22 Delmedico Mary Kay HIV-derived HR1 peptides modified to form stable trimers, and their use in therapy to inhibit transmission of human immunodeficiency virus
BR0314711A (pt) * 2002-09-27 2005-07-26 Tanox Inc Composições sinérgicas para a prevenção e tratamento da sìndrome da imunodeficiência adquirida
EP1460088A1 (en) * 2003-03-21 2004-09-22 Biotest AG Humanized anti-CD4 antibody with immunosuppressive properties
US20070207952A1 (en) 2003-03-24 2007-09-06 Sequoia Pharmaceuticals Long Acting Biologically Active Conjugates
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
WO2004108885A2 (en) 2003-05-06 2004-12-16 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Fc chimeric proteins with anti-hiv drugs
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005034842A2 (en) * 2003-05-19 2005-04-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Peptides useful as hiv fusion inhibitors
WO2005021710A2 (en) * 2003-06-02 2005-03-10 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
WO2005067960A1 (en) 2004-01-07 2005-07-28 Trimeris, Inc. HIV gp41 HR2-DERIVED SYNTHETIC PEPTIDES, AND THEIR USE IN THERAPY TO INHIBIT TRANSMISSION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS
BRPI0617515A2 (pt) * 2005-10-24 2011-07-26 Centocor Inc mimeticorpos, polipeptÍdeos, composiÇÕes, mÉtodos e usos de glp-2
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
BRPI0715794A2 (pt) * 2006-08-17 2013-07-23 Hoffmann La Roche conjugado de anticorpo contra ccr5 e peptÍdeo antifusogÊnico

Also Published As

Publication number Publication date
AU2008280443B2 (en) 2013-08-01
WO2009012944A1 (en) 2009-01-29
US20090022720A1 (en) 2009-01-22
CN103554271A (zh) 2014-02-05
CL2008002092A1 (es) 2009-05-29
PE20090503A1 (es) 2009-04-29
IL202565A0 (en) 2010-06-30
EP2178566A1 (en) 2010-04-28
AR067584A1 (es) 2009-10-14
CN102099057B (zh) 2013-11-13
BRPI0814533A2 (pt) 2015-01-27
CN102099057A (zh) 2011-06-15
EP2526972A1 (en) 2012-11-28
AU2008280443A1 (en) 2009-01-29
KR20100049547A (ko) 2010-05-12
JP2010534212A (ja) 2010-11-04
CA2693663A1 (en) 2009-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW200914467A (en) A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides
US11655285B2 (en) Human immunodeficiency virus neutralizing antibodies
KR101105610B1 (ko) Ｃｃｒ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트
CN107847591B (zh) 多价人免疫缺陷病毒抗原结合分子及其应用
JP2010500984A5 (zh)
US20070148180A1 (en) Peptide-immunoglobulin-conjugate
AU2002355966B2 (en) Virus coat protein/receptor chimeras and methods of use
JP4960459B2 (ja) Ｃｃｒ５に対する抗体およびその使用
BRPI0617688A2 (pt) método para expressão recombinante de um polipeptìdeo
US20110165182A1 (en) Conjugate of an antibody against ccr5 and an antifusogenic peptide
ES2374962T3 (es) Conjugados de complemento péptido.
AU2013251184A1 (en) A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides