TW200906426A - Method for the utilization of and product containing inactivated probiotic - Google Patents

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200906426 九、發明說明 相關專利及申請申請案之交互參照 本專利申請案爲非臨時申請案且主張於2007年2月 28日申請之美國專利臨時申請案第60/904,1 22號之優先 權益’該案全部倂此以爲參考。 【發明所屬之技術領域】 本發明大致上係有關一種含有至少一種失活的益生菌 (probiotic )之產物及使用彼之方法。 【先前技術】 發炎反應爲身體受到感染劑侵入、抗原挑釁，或物理 性、化學性或創傷性損害時，企圖恢復及維持體內平衡之 反應。局部性發炎局限於特定區域且可顯現出不同症狀， 包括發紅、腫脹、發熱及疼痛。 雖然一般認爲發炎反應係針對受傷的健康反應，不過 若未經適當調節，免疫系統卻會表現出不當的生理反應。 在這種情況下，正常時應爲保護性的免疫系統卻會傷害自 體組織，因爲它會把正常組織當作感染或異常組織來處 置。另一種情況爲身體受傷時，發炎反應卻以超過導致受 傷之威脅程度的比例來反應。當這種情況發生時，發炎反 應對身體的傷害會遠超過受傷本身所造成的傷害。 現在已知發炎反應在某種程度上係由於前·發炎性及 抗-發炎性細胞激素的表現提高所造成的。細胞激素爲低 -5- 200906426 分子量、具生物活性之蛋白質，其涉及免疫性與發炎性反 應之協調以及特定免疫細胞族群間之溝通。發炎期間有多 種類型細胞會產生細胞激素，包括噬中性球、單核球及淋 巴球。 發炎部位產生之細胞激素可經由多種機制來影響發炎 反應。不過，若前-發炎性反應未成功地受到抗-發炎性細 胞激素制衡，那麼就會產生失控的全身性發炎。 相對於局部性發炎，全身性發炎遍佈全身。此類型的 發炎可包含特定部位的局部發炎，還伴有“類流感”症狀， 包括發燒、發冷、疲倦或喪失活力、頭痛、沒有食慾，及 肌肉僵硬。全身性發炎可導致蛋白質分解、異化及代謝亢 進。結果，可能會危及基礎器官（像是肌肉、心臟、免疫 系統及肝）之結構及功能且造成多器官衰竭及死亡。 Jeschke, e t al., Insulin Attenuates the Systemic

Inflammatory Response to Thermal Trauma, Mol. Med. 8(8) 443 -45〇 (2002)。雖然對全身性發炎機制的瞭解已有巨大 進步，不過此等疾病造成的死亡率仍高得難以接受。 呼吸道感染很常見，尤其好發於嬰兒。於生命的頭一 年，嬰兒易於重複地發生呼吸道感染，單單一年通常就有 3到6次的感染。僅僅美國，每一年就有約6%小於一歲的 嬰兒因下呼吸道感染而住院。 依感染的病毒類型及感染部位而定，呼吸道感染的程 度及症狀可從很輕微到很嚴重。上呼吸道感染通常看起來 好像一般感冒，會造成鼻、喉嚨及鼻竇的襯膜發炎及腫 -6- 200906426 脹。流行性感冒，一般稱爲流感，爲一種高 染之上呼吸道疾病。流感之症狀包括發燒、 肌肉酸痛、頭昏、咳嗽、喉矓痛、流鼻水、 另一種上呼吸道感染，哮吼，會導致劇烈咳 之呼吸困難，主要是吸氣困難。 一般認爲下呼吸道感染比上呼吸道感染 吸道融合病毒（RSV )爲導致嬰兒及小於4 下呼吸道感染之最常見原因。Van Woens Viral Lower Respiratory Tract Infection i Young Children, BMJ 3 27:3 6-40 (2003 )。由 此常見，因此所有小孩在三歲以前都曾受到 染。對多數的嬰兒及孩童而言，RSV係造成 什麼兩樣的輕微呼吸道感染。通常會鼻塞 嗽。 預防RSV病毒涉及了 T-細胞及B-細胞 應（IgM、IgG及IgA)，以及其他因細菌及 活化之免疫系統反應。有人認爲嬰兒期受至[ 稍後在孩童時期再發生呼吸喘鳴、氣喘及 關。因此，限制RSV感染還可預防延伸到 吸道倂發症。 支氣管炎爲一種下呼吸道感染’其會影 病毒性發炎而導致支氣管狹窄及腫脹。細支 管炎很像，不過主要發生在嬰兒。其爲氣管 徑更小的支氣管發炎。此種感染會導致呼吸 傳染性病毒感 發冷、頭痛、 噁心及腹瀉。 嗽及不同程度 更爲嚴重。呼 歲之孩童發生 el, I., et al., n Infants and 於此等病毒如 丨RSV病毒感 與一般感冒沒 、流鼻水及咳 反應、抗體反 病毒感染而被 丨RSV感染與 異位性體質有 孩童時期之呼 響支氣管，因 氣管炎與支氣 分支系統中口 吃力、頻繁及 200906426 劇烈的咳嗽及呼吸喘鳴且可能需要住院。 對嬰兒而言最嚴重的下呼吸道感染就是肺炎。肺炎係 由於肺泡受到感染所造成的’其內會充滿濃稠之膿狀性質 液體，而妨礙適當的二氧化碳交換。肺炎的嚴重性將視所 涉及之肺部組織的多寡而定。 多數的上呼吸道及下呼吸道感染係由目前沒有特定預 防或治療方式之病毒所引起。某些呼吸道感染’例如流 感，可用疫苗接種來預防。不過’即使可對特定的呼吸道 感染發展出疫苗，這些疫苗往往很昂貴而無法普遍使用。 類似地，治療此等感染的藥物應用有限也很昂貴。因此， 宜提供一種非醫學性方法以預防或治療嬰兒之呼吸道感 染。 常見的呼吸道感染通常伴有急性中耳炎（AOM )，亦 稱爲中耳感染。Α Ο Μ的特徵爲急性、短期的發炎病程及 液體充塞於中耳。ΑΟΜ亦伴有鼻炎、咳嗽、發燒、喉嚨 痛、耳痛、聽力減退、心神不定、易怒 '喪失食慾、噁心 或腹瀉。ΑΟΜ還包括通過穿孔鼓膜之化膿性耳漏。 50%的孩童在1歲時發生至少一次ΑΟΜ。80%的孩童 在第三次生日時發生至少一次ΑΟΜ。在1至3歲間，35% 的孩童將再發生ΑΟΜ。 ΑΟΜ可由病毒或細菌引起。引起ΑΟΜ之最常見的細 菌菌株爲肺炎雙球菌（57/^广〇<:〇(：£；«5'；7以歸2〇心〇^，35%病 例）、流感嗜血桿菌（//aewap/ulw·? ，30°/〇 病 例）及黏膜炎莫拉氏菌（从〇^^//<3。〇^"〃/^仏，10%病 200906426 例）。由於細菌性菌株經常會引起感染，所以aom通常 會藉由投予抗生素來治療。事實上，在嬰兒時期’醫生爲 了治療AOM所開出之抗生素類處方比起其他疾病更多。 一般來說，細胞激素反應爲前-發炎性或抗-發炎性反 應將視於任何特定時間定殖在腸腔內之諸微生物間之平衡 而定。習知地，腸道黏膜表面係由數量龐大的、複雜且動 態平衡之微生物聚集體所定殖。該腸道微生物菌叢的組成 會隨著消化道及不同的微生境，例如上皮黏液層、隱窩黏 液深層及黏膜上皮細胞之表面，而有所不同。特定的菌落 形成將視外在及內在因素而定，包括腔室內可供利用之分 子、黏液性質，及宿主-微生物間及微生物-微生物間之交 互作用等。Murch， S. Η·， Γο// 〇/

Probiotics, Lancet, 357:1057-1059 (2001)。 組成腸道微生物菌叢之此等微生物活躍地涉及免疫反 應。他們與上皮組織間的互動可爲兩者皆獲利之關係（互 利共生）或者爲一方受利但另一方未受損之關係（片利共 生) ° Hooper, e t al.， Ho w Host-Microbial Interactions

Shape the Nutrient Environment of the Mammalian Intestine, Annu. Rev. Nutr. 22:283-307 (2002)。事實上， 有大量證據顯示：於腸黏液中腸道微生物菌叢及不同的細 胞族群間之相互影響或“交談”非常熱烈。Bourlioux, d α/.， The Intestine and its Microflora are Partners for the Protection of the Host: Report on the Danone Symposium “The Intelligent Intestine”’ 2002 年 6 月 14 日於巴黎舉 200906426 行，Am. J. Clin Nutr. 78:675 (2003); Hooper，L-V. &

Gordon， J. I.， Commensal Host-Bacterial Relationships in the Gut, Sci. 292:1 1 1 5 (200 1 ); Haller, et al.t Non-

Pathogenic Bacteria Elicit a D i ff e r enti al Cytokine Response by Intestinal Epithelial Cell/Leucocyte C o -Cultures, GUT 47:79 (2000); Walker, W.A., Role of

Nutrients and Bacterial Colonization in the Development of Intestinal Host Defense, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr 3 0:S2 (20 0 0)。此外，該腸微生物菌叢還可於成人引發局 部或全身性層次之特異性免疫反應。Isolauri，E.，W α/., Probiotics: Effects on Immunity^ Am. J. Clin. Nutr. 73: 444S-50S (2001) ° 已知嬰兒腸道之微生物菌叢的發展較成人差。雖然成 人之微生物菌叢係由多於1013個微生物及近乎5 00種物種 (有些有害有些有益）所組成，然而嬰兒的微生物菌叢， 就絕對數目及物種歧異性兩者而言，皆只有成人微生物菌 叢之一小部份。嬰兒出生時只有無菌的腸道，但會從產 道、初始環境及消化的食物中獲得腸道菌叢。由於早期的 新生兒生命中腸道微生物族群很不穩定，因此嬰兒腸道很 難維持有益及有害細菌間之平衡，故而會降低免疫系統正 常運作的能力。 由於餵食配方食品之嬰兒與餵母乳之嬰兒其腸道內之 細菌物種有所不同，所以對於餵食配方食品之嬰兒而言維 持此種平衡會更困難。餵母乳之嬰兒糞便內主要是雙歧桿 -10- 200906426 菌屬 (Bifidobacterium ) 細菌’而鏈球囷 (•Sirepiococcw·?)及乳酸桿菌則較少。 相對地，餵食配方食品之嬰兒的微生物菌叢之歧異性更 大，其除了雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬細菌以外’還含有致 病性較強之物種，包括葡萄球菌（、大 腸桿菌 (Escherichia coli ) 及梭狀牙孢桿囷屬 ()細菌。餵食配方食品之嬰兒與餵母乳之嬰 兒之糞便內的雙歧桿菌屬細菌之菌種亦有所不同。已有多 種因素被認爲是引起餵食配方食品之嬰兒與餵母乳之嬰兒 糞便內微生物菌叢不同的原因，其包括母乳內蛋白質含量 較低及組成不同，母乳內磷含量較低，母乳內有大量寡聚 醣，母乳內還有多種免疫功能之體液性及細胞性調節劑。 Agostoni, e t al. t Probiotic Bacteria in Dietetic Products f o r I nf a nt s : A Commentary by the E S P G HA N Committee on

Nutrition， J. Pediatr. Gastro, Nutr. 3 8:3 65.3 74 (Apr. 2004) 〇 由於餵食配方食品之嬰兒的微生物菌叢如此不穩定而 腸道之微生物菌叢又深入地參與激發腸道免疫之作用，因 此韻食配方食品之嬰兒似乎較容易發生炎性疾病。影響嬰 兒的多種主要疾病’包括慢性肺病、腦室周圍白質軟化、 新生兒腦膜炎、新生兒肝炎、敗血病及壞死性腸炎，皆具 有發炎本質。依該特定疾病而定’所伴隨的發炎可發生在 特疋器B，例如肺 '腦、肝或腸，或者發炎作用實質上遍 佈全身。 -11 - 200906426 舉例來說，慢性肺病會使肺內組織發炎而新生兒腦膜 炎則涉及腦及脊髓的底膜發炎。腦室周圍白質軟化則是由 於正在發育的腦之腦室周圍區域發炎性損傷所造成的。壞 死性腸炎會引起腸發炎而導致部份或所有的腸道損壞，而 新生兒肝炎則涉及於嬰兒早期肝發炎的現象。敗血病，亦 稱爲全身性發炎反應症候群，係由毒素-產生細菌於血流 造成全面性感染而引起的嚴重疾病。此種疾病係由血流內 之病原體引發全身性發炎反應。 早產及重病嬰兒在發展腸道免疫及預防全身性發炎上 有著嚴重挑戰。早產或重病嬰兒通常會馬上被放到無菌保 溫箱中，於此他們保持著不曝露在健康、足月的嬰兒通常 會接觸之細菌族群中。此舉可能會延遲或損及自然的菌落 定殖過程。此等嬰兒通常還會用廣效性抗生素來治療，而 廣效性抗生素卻會殺死試圖定殖到嬰兒腸道之共生細菌。 此外，這些嬰兒通常會餵食嬰兒配方食品，而非母奶來餵 養。任一此等因素都可能會使得嬰兒腸道微生物菌叢發展 不良，因此造成或加重危及生命之全身性發炎。 近年來，人們建議於餵食配方食品之嬰兒的飮食中補 充益生菌以利於有益微生物於腸道定殖。益生菌爲對宿主 健康顯示出有利影響之活微生物。Fuller, R. ProHohcs Man and Animals, J. Appl. Bacteriol. 66:365-78 (1989)。 雖然活的益生菌可有效地讓腸道微生物菌叢正常化， 不過僅有極少數已公開之硏究評估其於早產及免疫受抑制 之嬰兒的安全性。此種特定群體只有不成熟之腸道防禦障 -12- 200906426 壁，如此會增加腸腔細菌移位的風險，而有可能 之高度危險。於許多情況下，人們並不建議把活 投予給免疫受抑制之患者、心臟手術後之患者、 衰竭之患者，或糞便中有血之患者。已有報導指 一起死亡係由於免疫受抑制之個體補充益生菌所 MacGregor G.， e t al. Yoghurt biotherapy: c ontr c in immunosuppressed patients? Postgrad Med J 367 (2002) 〇 因此，對免疫受抑制之患者或早產嬰兒而言 種能治療或預防全身性發炎之非活體補充品會很 對於活性或活體益生菌，非活體之另一選項還有 命較長的額外優點。活性或活體益生菌對溫度、 線很敏感’理想上應冷藏保持活性。即使在這樣 料下’典型的益生菌上架壽命仍很短。相對於活 之非活體選項則可以免除冷藏需求且能提供上架 之產物。這種產物無需冷藏即可流通到全世界 域。益生菌之非活體選項還可減少其與其他食物 生交互作用的風險，例如醱酵、風味及質感改變 新鮮度等。據此，提供一種藉由投予失活的益生 食配方食品之嬰兒減少或預防全身性發炎之方 用。 【發明內容】 發明總論 造成感染 的益生菌 胰臟功能 出至少有 造成的。 lindi c at e d .78:366- ’提供一 有用。相 著上架壽 濕度及光 小心的照 體益生菌 壽命較長 的每個區 成份間發 ，及產物 菌來於餵 法會很有 -13- 200906426 fe要地’本發明係關於一種含有至少一種失活的益生 菌之新穎產物’其中該益生菌不是有活力的，但是該失活 的益生菌之細胞成份仍保有與該益生菌之有活力的或非失 活化細胞之同樣或類似的生物反應性特質。 於其他具體例中，本發明係關於一種使用一或多種與 有活力或活的益生菌具有同樣或類似的生物反應性優點之 益菌的失活菌株的方法。 於其他具體例中，本發明係關於一種治療、預防或減 少個體的全身性發炎或呼吸性發炎之方法，該方法包含把 治療有效量之至少一種失活的益生菌投予給該個體，其中 該益生菌之活體形式可用來治療、預防或減少個體之全身 性發炎或呼吸性發炎。 於其他具體例中，本發明係關於一種治療、預防或減 少個體的呼吸性發炎之方法，該方法包含把治療有效量之 至少一種失活的益生菌投予給該個體，其中該益生菌之活 體形式可用來治療、預防或減少個體之呼吸性發炎。 於其他具體例中，本發明係關於一種減少或預防個體 的一或多種前-發炎性細胞激素或趨化素之釋出的方法， 該方法包含把治療有效量之至少一種失活的益生菌投予給 該個體。 於一特定具體例中，本發明係關於一種治療、預防或 減少個體的全身性發炎之方法，該方法包含把治療有效量 之至少一種失活的益生菌以及至少一種長鏈多不飽和脂肪 酸（LCPUFA )及/或至少一種活的益生菌投予給該個體。 -14- 200906426 於特定具體例中，該LCPUFA可爲二十二碳六儲酸 (DHA )或花生四烯酸（Ara )。 於本發明所提供之多項優點中，有一項爲能降低或預 防全身性或呼吸性發炎。本發明還能減少肝、血漿、肺及 腸之發炎。此外’本發明還能減少或預防多種前-發炎性 細胞激素及趨化素之釋出，其包括（影響）介白素_1/3 (IL-1石）、IL-8、CINC-1及生長相關致癌基因 (GRO/KC)之含量。由於本發明可用來改善發炎病況， 所以還能預防不當感染或疾病之發生。 較佳具體例之詳細說明 現在將詳細參照本發明之具體例，以下顯示本發明之 一或多個實施例。各實施例係用以解釋本發明，而非限制 本發明。事實上’對於熟悉此技術者而言很明顯地，可在 不偏離本發明之範疇或精神下對本發明進行多種修正及改 變。舉例來說，於一具體例中顯示或描述之特性，可用在 另一具體例而產生再一具體例。 故而’本發明意圖涵括伴隨後附申請專利範圍及其均 等物之此等修正與變化。本發明之其他目標、特性及態樣 係揭露於以下詳細說明中’或者基於此等說明即明顯可 知。熟知此技術之一般人士應瞭解現在的討論僅是針對示 範性具體例的說明’而非意圖限制本發明之較廣態樣。 在此使用以下縮寫：LGG，鼠李糖乳酸桿菌GG (或 雷諾氏菌GG) ;LCPUFA，長鏈多不飽和脂肪酸；LPS， -15- 200906426 脂多醣；IL，介白素；CINC-l，細胞激素誘生之嗜中性球 趨化因子-1 ; GRO/KC，生長-相關致癌基因；ELISA，酵 素-連結免疫吸附檢定；RT-PCR，逆轉錄-聚合酶連鎖反 應；ANOVA，變異數分析；SD，標準差；RMS，大鼠乳 汁替代品；TLR，類鐸受體（Toll-like receptor);核因 子kB，NF-kB ; EPA，二十碳五烯酸；DHA，二十二烷基 六烯酸；ARA，花生四烯酸。 TLR爲一群脊椎動物辨識受體。它們已演化成先天性 及適應性免疫力的關鍵分子。它們在辨認保留之微生物成 份上扮演著重要的角色。生物之細胞壁成份、DNA及雙股 RNA明顯地係由不同的TLR來辨認。此等細菌-衍生之成 份（不論其爲LPC、狀聚醣或CpG DNA )爲天然的TLR 配體，其在缺乏病原性序列（一般係源自正常的細菌性增 殖作用-腹瀉、組織毀損、全身性發炎、障壁穿透性）下 仍保有強烈的免疫調節性質。該等細菌性成份一般係對適 應性免疫反應發生作用，然而細菌本身則由先天性免疫反 應來辨識。 術語“益生菌（probiotic ) ”意指對宿主健康有益之活 的、活性或有活力的微生物。 術語“促生素（prebiotic ) ”意指能刺激益生菌生長或 增進其活性之不可消化的食物成份。 在此使用時，術語“治療”意指緩和、改善或醫治一疾 病、病況或一疾病或病況之症狀。 術語“減少”意指縮小範圍、降低數量或減輕程度。 -16- 200906426 術TO “預防”意指透過某些動作來停止或阻礙一疾病、 病況或一疾病或病況之症狀。 術語“全身性”在此使用時意指關於或影響到整個身 體。 術語“呼吸性感染”或“呼吸性疾病”意指影響到負責把 氧氣從空氣中攜載到血流內及排除掉二氧化碳之器官群的 疾病或感染。 術語“失活的益生菌”或“失活LGG”意指該益生菌或 LGG生物之內代謝活性或繁殖能力已被降低或破壞。一般 相信該“失活的益生菌”或“失活LGG”於細胞層次上仍保有 至少一部份天然TLR配體，其換句話說仍保有至少一部份 免疫調節性質。在此使用時，“失活”與“非活力的”爲同義 詞。 術語“治療有效量”意指能改善或醫治該疾病、病況或 該疾病或病況之症狀之份量。 術語“早產”意指妊娠未滿3 7週即出生之嬰兒。 術語“嬰兒”意指小於約1歲之已出生人類。 術語“兒（孩）童“意指從約1歲到12歲之人類。於 特定具體例中，兒童係約1歲到6歲之人類。於其他具體 例中，兒童係約7到1 2歲之人類。 在此使用時，術語“嬰兒配方食品”意指能滿足嬰兒營 養需求、可作爲母乳替代品之組成物。 根據本發明，現已發現一種使用益生菌之新穎產物及 方法。該產物及方法包含治療有效量之至少一種失活的益 -17- 200906426 生菌之使用及投予給個體。於某些具體例中，該個體爲嬰 兒。 有效投予失活的益生菌之早期嘗試遭遇實質阻礙。舉 例來說，Kirjavainen, P.等人指出：在比較補充活性LGG及 熱-失活的LGG之孩童以後，發現補充失活LGG之孩童近 乎 40% 會有嚴重腹蕩。/Voiu'ohc in the

Management of Atopic Disease: Underscoring the

Importance of Viability, J. P e d. Gastro. 36:223-227 (2003)。安慰劑組或活的LGG組則沒有副作用，历處局 第 225頁。由於腹瀉廣泛地伴有發炎反應，所以該 hr/avfl/ae«硏究顯示失活的LGG實際上可能會造成消化 道發炎。事實上，該硏究指出“熱-失活化過程可能會造成 表面肽變質及熱-休克蛋白質之表現，經如此修改之LGG 免疫剌激性質會使得該熱失活化形式引起發炎反應且繼而 增加腸道之通透性”。汸蘑原J：，第226頁。相對地，本 案發明者則發展出一種新穎的方法，其能藉著食用含有失 活的益生菌之產物來投予至少一種失活的益生菌以治療或 預防發炎。 本案發明者發現到人類食用失活的益生菌也可以達到 人類食用同種活的或有活力之益生菌時所達到之相同或類 似的有益影響。本發明之失活的益生菌除了不具有繁殖力 以及嚴格伴隨著活生物體之其他活性特質以外，仍保有其 細胞性及分子性特質且可於攝取它們之宿主體內引發生物 反應性反應。因此，本發明之失活的益生菌可爲此技術習 -18- 200906426 知之任一益生菌或任何益生菌之組合。 於其他具體例中’該失活的益生菌可爲乳酸桿菌屬 之一員。例如，該失活的益生菌可爲嗜 酸乳酸桿菌（I. aci山)，嗜澱粉乳酸桿菌（JL· amy/ovorw·?)，保加利亞乳酸桿菌（)，皺 緣乳酸桿菌（Z. crkpWMi) ’戴耳布呂克氏乳酸桿菌（I. “ 6 r w e c A /〖），鼠李糖乳酸桿菌（Z . rA a m « 〇 ^ s )，乾酪 乳酸f干囷（Z. caxei) ’豕馬乳酸桿菌（ζ· ga//z_narw7w)， 醱酵乳酸桿菌（/erwe^wm )，加氏乳酸桿菌（I. gas seri)，瑞士乳酸桿菌（I _ ；z e / v e r i c μ·?)，佐氏乳酸桿 菌（i： . / W g W ΓΗ·)，約氏乳酸桿菌（Ζ _ y· 〇 /j w 〇 „ h )，萊希 曼氏乳酸桿菌（Z_ leichmannii )，胚芽乳酸桿菌 (Z.p/awiarwm)，洛德乳酸桿菌（Z_ rewierz·)或唾液乳 酸桿菌（Ζ· 。於特定具體例中，該失活的益 生菌可爲嗜酸乳酸桿菌LA-5®、嗜酸乳酸桿菌NCFM、嗜 酸乳酸桿菌AS-1、嗜酸乳酸桿菌DDS-1、嗜酸乳酸桿菌 HP10、嗜酸乳酸桿菌HP100、嗜酸乳酸桿菌HP101、嗜酸 乳酸桿菌Η P 1 0 2、嗜酸乳酸桿菌Η P 1 0 3、嗜酸乳酸桿菌 ΗΡ104、嗜酸乳酸桿菌ΗΡ15、嗜酸乳酸桿菌ΡΙΜ703、嗜 酸乳酸桿菌SBT2062、乾酪乳酸桿菌DN- 1 1 4 00 1、乾酪乳 酸桿菌LC10、乾酪乳酸桿菌ΡΙΜ61、乾酪乳酸桿菌43 1® (CRL431 )、乾酪乳酸桿菌 F19、乾酪乳酸桿菌 S h i r 〇 t a、乾酪乳酸桿菌 i m m u n i t a s s、皴緣乳酸桿菌 BG2F04、戴耳布呂克氏乳酸桿菌保力口利亞亞種、戴耳布 -19- 200906426 呂克氏乳酸桿菌保加利亞亞種2038、戴耳 菌保加利亞亞種M R1 2 0、戴耳布呂克氏乳酸桿 亞種ΡΙΜ695、胚芽乳酸桿菌299V、洛德乳酸 S、洛德乳酸桿菌1 1 2 8 4、洛德乳酸桿菌8 D 2 1 酸桿菌T-1、洛德乳酸桿菌ATTC 5 5 73 0、'洛 SD2112、洛德乳酸桿菌 RC-14®、鼠李糖乳 (LGG) ATCC 53013、鼠李糖乳酸桿菌 酸桿菌LB21、鼠李糖乳酸桿菌R-011、鼠李 R - 0 4 9、鼠李糖乳酸桿菌Μ X 1、加氏乳酸桿菌 乳酸桿菌M R 2 2 0、瑞士乳酸桿菌N C Κ 3 8 8、約 1 1 08 8 ( NCK08 8 )、約氏乳酸桿菌 La- 1、唾； UCC500、唾液乳酸桿菌UCC1 1 8或雷特氏乳酸 如前文所述，於本發明一特定具體例中， 生菌可爲LGG。LGG爲一種從健康人類腸菌叢 益生菌株。揭示於Gorbach等人之美國專利第 號，其全部倂此以爲參考。LGG能耐受大多數 於酸及膽汁中很穩定，緊密地依附在人類腸道 上。於大多數個體內可存活1-3天，於30°/。個 7天。除了定殖能力以外’ LGG還能有益地影 疫反應。LGG已寄存於寄存機構美國菌種中心 爲 ATCC 53 1 03。 於再一具體例中，該失活的益生菌可爲雙 一員。例如，該失活的益生菌可爲動物 (5. a d w a / k )、短雙歧桿菌（5. & r e v e )、嬰」 克氏乳酸桿 菌保加利亞 桿菌 1 0 6 3 -1 2、洛德乳 德乳酸桿菌 酸桿菌 GG 、鼠李糖乳 糖乳酸桿菌 ADH，瑞士 氏乳酸桿菌 液乳酸桿菌 桿菌S a η。 該失活的益 中分出來的 ；5,032,399 的抗生素， 的黏膜細胞 體中可長達 響黏膜之免 且寄存編號 歧桿菌屬之 雙歧桿菌 i雙歧桿菌 -20- 200906426 (B. infant is )、雷特氏雙歧桿菌（、豬雙歧桿 菌（β.·ϊΜί·〇 、或羅根雙歧桿菌（S./o«gwm)。於特定亘 體例中，該失活的益生菌可爲動物雙歧桿菌動物亞種、動j 物雙歧桿菌DN- 1 73 0 1 0、動物雙歧桿菌雷特氏亞種（BB-12®)、短雙歧桿菌Yakult、短雙歧桿菌R-〇7〇、嬰兒雙 歧桿菌 BBI、嬰兒雙歧桿菌35624、雷特氏雙歧桿菌 HN019 ( DR10 )、羅根雙歧桿菌 B B 4 6、羅根雙歧桿菌 BBL或羅根雙歧桿菌BB536。 如同所提到地，該失活的益生菌可爲動物雙歧桿菌雷 特氏亞種 （BB-12® )，其係來自 Chr. Hansen Biosystems，位於密爾瓦基市，WI (美國威斯康辛州）。 BB-12®爲一種格蘭氏陽性厭氣性桿狀細菌，存在於大多 數哺乳動物（包括人類）的大腸內。 於其他具體例中，該失活的益生菌可爲大腸桿菌 (Escherichia coli ) 、糞腸球菌(Enterococcus: faecium )、釀酒酵母菌（cerevkz'ae)、雷 特氏乳酸球菌（Zaciococcwi· /acn、）、凝結芽孢桿菌 (Bacillus coagulans )、戊糖小球菌（ pentosaceus ) 、 乳 酸 小 球 菌 （Pediococcus acit/i/aciici)、血鏈球菌sa/igwk)或嗜 熱鏈球菌（*S7re;?iocoC£m i/zermop/zi/wj1)。於特定具體例 中，該失活的益生菌可爲大腸桿菌Nissle 1917。於另一具 體例中，該失活的益生菌可爲釀酒酵母菌（boulardii ) ly〇。於另一具體例中，該失活的益生菌可爲雷特式乳酸 -21 - 200906426 球菌L1A。於再一具體例中，該失活的益生菌可爲嗜熱鏈 球菌 T Η - 4 τ M。 於本發明一具體例中，可使用一種以上的失活益生 菌。於此具體例中，任何失活的益生菌之組合乃爲意圖提 供能達到所欲結果之組合。於一特定具體例中，組合可包 含一或多種雙歧桿菌屬細菌及一或多種乳酸桿菌屬細菌， 例如可使用BB-12®及LGG。於一個別具體例中，係採用 BB-12®及LA-5®之組合。 於本發明方法中’該失活的益生菌之治療有效量乃爲 可於個體減少或預防全身性發炎之份量。此份量相當於約 1 xlO4到lxl 012個細胞當量/公斤體重/天。於另一具體例 中，本發明包括投予約1 X 1 0 6到1 Χ 1 〇 9個細胞當量/公斤體 重/天。於再一具體例中，本發明包括投予約1 x i 0 9個細胞 當量/公斤體重/天。於另一具體例中，本發明包括投予約 1 X 1 0 1 ^個細胞當量/公斤體重/天。 本發明使用至少一種已經失活化之益生菌。失活化可 採用此技術現在已知或未來發展出之任何方法來進行。失 活化可透過例如加熱、凍乾、紫外線、伽瑪輻射、壓力、 化學瓦解或機械瓦解來達成。舉例來說，該益生菌可藉著 置於8 0 °C到1 〇 〇 °C下1 0分鐘加熱失活化。該益生菌亦可 藉由置於離3 0瓦UV C燈5公分處用紫外線照射5分鐘來 失活化。另外’該益生菌還可用鈷-60源以20公分的距離 用2 kg-Gray(kGy)伽瑪照射來失活化。 於本發明方法中’失活的益生菌之投藥形式並不重 -22- 200906426 要，只要^ ί又予治療有效量即可。於某些具體例中，該至 少一種失活益生菌係經由藥錠、藥片、封裝物、糖衣片、 膠囊錠、膠囊、油滴或小包來投予給個體。於另一具體例 中’该失活的益生菌係封裝在糖、脂肪或多醣內。於另一 具體例中’該失活的益生菌係被添加到食品或飲品中攝 取。該食品或飲品可爲兒童營養品如較大嬰兒配方食品、 成長乳、飲料、乳品、優格、果汁、水果_基礎飲品、可 嚼錠、甜餅乾、鹹餅乾或奶粉。於另一具體例中，該產品 可爲嬰兒營養食品，像是嬰兒配方食品或母乳強化營養 品。 若該至少一種失活的益生菌係經由嬰兒配方食品投 予，那麼該嬰兒配方食品宜營養完備且含有適當類型及份 量之脂質、醣類、蛋白質、維生素及礦物質。脂質或脂肪 的份量典型地可爲約3到約7 g/100 kcal不等。脂質源可 爲任何此技術已知或使用之來源，例如植物油像是棕櫚 油、黃豆油、精品棕櫚、椰子油、中鏈三酸甘油酯、高油 酸葵花油、高油酸紅花油等等。蛋白質份量可爲約1到約 5 g/1 00 kcal不等。蛋白質源可爲任何此技術已知或使用 之來源，例如無脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白質、 水解蛋白質、胺基酸等等。醣類份量可爲約8到約12 g/1 00 kcal不等。醣類源可爲任何此技術已知或使用之來 源，例如乳糖、葡萄糖、玉米糖漿固體、麥芽糊精、蔗 糖、澱粉、米糖漿固體等等。 方便地，可使用市售之嬰兒配方食品。例如，可於 -23- 200906426

Enfamil®、Enfamil®早產兒配方奶粉、Enfamil®含鐵奶 粉 、 Lactofree® 、 Nutramigen® 、 Pregestimil® 及

ProSobee® (來自 Mead Johnson & Company，Evansville， 美國印地安那州）補充適量之失活益生菌且用以實施本發 明之方法。 於本發明一具體例中，該至少一種失活的益生菌可組 合一或多種活的益生菌以於餵食配方食品之嬰兒治療或預 防全身性發炎。任何此技術已知之活的益生菌只要能達到 所需效果皆可用於此具體例。於一特定具體例中，該活的 益生菌係選自任一種以上討論之益菌屬或種。 若活的益生菌係與失活的益生菌一起投予，該活的益 生菌之份量可相當於約1 X 1 04到1 X 1 〇 1 2菌落形成單位 (cfu) /公斤體重/天。於另一具體例中，該活的益生菌份 量可爲約lxio6到lxio9 cfu/公斤體重/天。於另一具體例 中’該活的益生菌份量可爲約lxlO9 Cfu/公斤體重/天。於 再一具體例中，該活的益生菌份量可爲約lxl〇1G cfu/公斤 體重/天。 於本發明另一具體例中，該至少一種失活的益生菌可 組合一或多種促生素以於餵食配方食品之嬰兒治療或預防 全身性或呼吸性發炎。任何此技術已知之促生素只要能達 到所需效果皆可用於此具體例。用於本發明之促生素可包 括乳酮搪、葡萄-寡醣、菊糖、聚葡萄糖、半乳-寡醣、果_ 寡醣、異麥芽-寡醣、大豆寡醣、乳蔗糖、木-寡醣及龍膽_ 寡醣。 -24- 200906426 於本發明另一具體例中，該嬰兒配方食品還可含 它活性劑如LCPUFA。適當的LCPUFA包括但不限於 麻油酸、r -亞麻油酸、蘇子油酸、二十碳五 (EPA ) 、ARA及/或DHA。於一具體例中，失活的 菌係與DHA —起投予。於一具體例中，失活的益生 與ARA —起投予。於一具體例中，失活的益生菌 DHA及ARA —起投予。亦可於含有DHA、ARA或其 之市售嬰兒配方食品中補充至少一種失活的益生菌且 本發明。例如，Enfamil®LIPIL®，其含有有效量之 及ARA ’可商業性購得且可補充至少一種失活的益生 用於本發明。 於一具體例中，係以DHA及ARA兩者與至少一 活的益生菌組合來治療嬰兒之全身性發炎。與此具 中，該ARA:DHA之重量比一般爲約1:3到約9:1。於 明一具體例中’該比例爲約1 :2到約4 : 1。於本發明 具體例中，該比例爲約2:3到約2: 1。於一特定具 中’該比例爲約2 : 1。於另一特定具體例中’該比例 1 : 1 · 5。於其他具體例中，該比例爲約1 :丨.3。於再一 例中’該比例爲約1 :1.9。於一特定具體例中，該比 約1 _ 5 : 1。於更一具體例中，該比例爲約1 · 4 7 :1。 於本發明特定具體例中，該DHA之份量爲脂肪 量之約0 _ 0重量％到約1 · 0 〇重量％。

該D Η A量可爲約〇 . 3 2重量％。於某些具體例中 DHA量爲約0.33重量％。於其他具體例中，該DHA 有其 2 -亞 稀酸 益生 菌係 係與 組合 用於 DHA 菌且 種失 體例 本發 另一 體例 爲約 具體 例爲 酸重 ，該 量爲 -25- 200906426 約0.64重量％。於另一具體例中，該DHA量爲約0.67重 量％。於再一具體例中’該D Η A量爲約〇. 9 6重量％。於更 一具體例中，該DHA量爲約1.〇〇重量％。 於本發明特定具體例中，該ARA之份量爲脂肪酸重 量之約0 · 0重量％到約〇 · 6 7重量％。於另—具體例中，該 ARA量可爲〇 _ 67重量％。於其他具體例中，該ARA量爲 約0.5重量％。於再一具體例中，該DHA量爲約〇·47重 量％到0.4 8重量％。 若含有DHA，那麼於本發明具體例中該DHA之有效 里一般爲約3 mg/公斤體重/天到約15〇 mg/公斤體重/天。 於一具體例中，該份量爲約6 mg/公斤體重/天到約1〇〇 mg/公斤體重/天。於另—具體例中，該份量爲約1〇 mg/公 斤體重/天到約60 mg/公斤體重/天。於再一具體例中，該 份量爲約1 5 mg/公斤體重/天到約3〇 mg/公斤體重/天。 若含有ARA，那麼於本發明具體例中該ARA之有效 里—般爲約5 mg/公斤體重/天到約15〇 mg/公斤體重/天。 ^ 具體例中，該份量爲約1 0 mg/公斤體重/天到約1 2〇 mg/公斤體重/天間。於另一具體例中，該份量爲約15 mg/ 公斤體重/天到約90 mg/公斤體重/天間。於再一具體例 中’該份量爲約20 mg/公斤體重/天到約6〇 mg/公斤體重/ 天間。 右採用嬰兒配方食品，那麼在嬰兒配方食品中DHA 里可爲約5 mg/100 kcal到約80 mg/l〇〇 kcal。於本發 明—具體例中，該DHA量爲約l0 mg/l〇〇 到約5〇 -26- 200906426 mg/100 kcal;且於另一具體例中，爲約15 mg/100 kcal到 約20 mg/1 00 kcal。於本發明一特定具體例中，該DHA量 爲約 17 mg/100 kcal。 若採用嬰兒配方食品，那麼在嬰兒配方食品中ARA 之份量可爲約10 mg/100 kcal到約1〇〇 mg/100 kcal。於本 發明一具體例中，該ARA量爲約1 5 mg/100 kcal到約70 mg/100 kcal。於另一具體例中，該ARA量爲約20 mg/100 kcal到約40 mg/1 00 kcal。於本發明一特定具體例中，該 ARA 量爲約 34 mg/100 kcal。 若採用嬰兒配方食品時，可用此技術習知之技藝把含 有DHA及ARA之油類補充到該嬰兒配方食品中。例如， 可用DHA及ARA取代等當量之油類（例如於嬰兒配方食 品中常見之高油酸葵花油）來把DHA及ARA添加到該配 方食品中。於另一具體例中，可用含有DHA及ARA之油 類來取代等當量之總脂肪混合物之其餘部份，在配方食品 中這部份往往不含DHA及ARA。 若使用DHA及ARA時，該DHA及ARA的來源可爲 任何此技術習知的來源，例如水產油脂、單細胞油脂、卵 黃脂、腦脂等等。於某些具體例中，該DHA及ARA係來 自單細胞Martek油，DHASCO®，或其變化。該 DHA及 ARA可爲天然形式’惟該LCPUFA源之其餘部份不能對嬰 兒產生任何實質的不良影響。另一選擇地，該DHA及 ARA可爲精製形式。 於本發明具體例中’該DHA及ARA來源可爲單細胞 -27- 200906426 油脂，如同美國專利第5,374，567號；5,550,156號及 5，3 9 7，5 9 1號所教不般’該寺專利揭不全部倂此以爲參 考。不過，本發明並不只限於此等油類。 於一具體例中’係以含有EPA之LCPUFA源組合至 少一種失活的益生菌來使用。於另一具體例中，係以實質 上不曰EPA之LCPUFA源組合至少一種失活的益生菌來 使用。舉例來說，本發明一具體例係於含有少於約1 6 mg EPA/100 kcal之嬰兒配方食品中補充至少—種失活的益生 菌且用於本發明之方法。於另一具體例中，係於含有少於 約10 mg EPA/100 kcal之嬰兒配方食品中補充至少—種失 活的益生菌且用於本發明之方法。於再一具體例中，係於 含有少於約5 mg EPA/1 00 kcal之嬰兒配方食品中補充至 少一種失活的益生菌且用於本發明之方法。本發明之另一 具體例係於連微量EPA都沒有之嬰兒配方食品中補充至少 一種失活的益生菌。 一般認爲提供至少一種失活的益生菌及DHA及/或 ARA之組合可對含有此等成份之調合劑的抗發炎性質有增 效或協同的效果。雖然不希望將本發明用此一理論或任何 其他的理論來束縛，不過一般相信失活的益生菌能提供 抗-發炎效果一部份是由於其能預防抑制性-kB ( IkB )之 泛素化。於正常細胞內，IkB會在細胞質內結合核因子-kB (NFkB )。當IkB泛素化發生時，NFkB被釋出，進入到 細胞核中，且活化負責發炎反應之基因。就是這種特異个生 交互作用及所導致之基因表現的變化被認爲涉及發炎的言周 -28- 200906426 節作用。一般相信該失活的益生菌可以預防IkB泛素化， 藉此防止NFkB釋出及減少或預防發炎產生。 相對地，ω ·3脂肪酸例如DHA被認爲係透過改變前-發炎性、脂肪酸-衍生之介質（以二十酸類廣泛爲人所 知）來提供抗-發炎作用。ω -6脂肪酸例如ARA係位於細 胞膜之磷脂質池內，發炎反應期間會被釋出而提供一池游 離的ARA。而後此ARA池會被兩種酶（脂氧化酶及環氧 化酶）作用，產製出特殊的二十碳酸類，其包含2-系列前 列腺素類（激素），像是前列腺素、凝血噁烷及白三烯 素。 此等前列腺素類已知對多種類型細胞及器官有過多的 前-發炎性作用。已知當飲食中富含ω -3脂肪酸例如EPA 及DHA (於此過程多個步驟中，ω -3脂肪酸爲ω -6脂肪 酸之競爭物）時，可以緩和 ARΑ之前-發炎性作用。例 如，ω -3脂肪酸能調節ω -6脂肪酸延長成ARA，把ARA 倂入細胞膜磷脂質池內，且從ARA製造前發炎性前列腺 素類激素。因此，DHΑ及ARA之組合可提供獨特但互補 的效用以緩和多組織之發炎反應。 此外，於本發明某些具體例中，活的及失活的益生菌 會彼此組合來投藥。此種活的及失活的益生菌之組合被認 爲對於含有此等成份之調合物的抗發炎性質有互補或協同 的效果。雖然不希望將本發明用此一理論或任何其他的理 論來束縛，不過一般相信活的益生菌能有抗發炎效果一部 份是透過與特殊受體（即，位於特異性免疫細胞表面上的 -29- 200906426 類鐸受體（TLR ))之間的交互作用來達成。活的益生菌 與此等受體間直接或間接的交互作用會引發細胞內訊號傳 遞級聯’其會導致此等目標細胞內基因表現的改變。就是 這種特異性交互作用導致基因表現改變以及其他涉及發炎 調節之細胞性影響。由於活的及失活的益生菌被認爲係透 過不同機制來運作，所以一般認爲合倂此等成份可提供互 補或協同的抗發炎效果。 此外，於本發明某些具體例中，係組合至少一種活的 益生菌、至少一種失活的益生菌及至少一種LCPUFA來投 予。由於活的益生菌、失活的益生菌及LCPUFA被認爲各 透過不同的機制來作用，所以一般認爲這種組合對於含有 此等成份之調合物的抗發炎性質有互補或協同的效果。 於本發明一些具體例中，個體爲需要治療、減少或預 防全身性發炎者。該個體係由於遺傳性體質、飲食、生活 型態、疾病、異常等而有全身性發炎的風險。舉例來說， 早產或免疫受抑制之嬰兒可能會有全身性發炎的風險，因 此需要此等治療、減少或預防作用。 於特定具體例中，可把失活的益生菌投予給嬰兒或孩 童以預防、治療或減少全身性發炎。於一具體例中，該嬰 兒可小於一歲。於另一具體例中，該孩童可介於一到六歲 之間。於再一具體例中，該孩童可爲七到十二歲。 於本發明一具體例中，該個體爲館食配方食品之嬰 兒。於一具體例中’該嬰兒從一出生即餵食配方食品。於 另一具體例中，該嬰兒出生後係餵食母乳但在一歲以前改 -30- 200906426 餵配方食品，此時即開始補充失活的益生菌。 於本發明特定具體例中，該方法包含於餵食配 之早產嬰兒治療或預防全身性發炎。於此方法中， 的益生菌係以嬰兒配方食品、母乳營養強化品或任 適當的形式來投予給該早產嬰兒。此外，若有需要 活的益生菌係組合DHA、ARA及/或一或多種活的 來投予給該早產嬰兒以創造出可能的協同性抗-果。

於本發明一具體例中，該失活的益生菌能減少 一或多種前發炎性細胞激素或趨化素之全身性釋出 使用時，“前發炎性”細胞激素或趨化素包括此技術 之涉及發炎反應上升調節作用之物質。其實例包括 於 TNF-ct、IL-1/3、IL-6、IL-8、IL-1 8 及 GRO/KC 趨化素爲一群細胞激素，其能令白血球從血液 到發炎部位的組織。當其過量產生時，趨化素會導 組織受損。生長-相關之致癌基因（GRO/KC )爲一 免疫細胞吸引到發炎部位之趨化素。其爲對應於大 激素-誘生之嗜中性球趨化因子（CINC-1 )之人 物，且功能上與介白素-8家族相關。 於本發明再一具體例中，失活的益生菌已顯示 制核因子-kB(NFkB)之移動（translocation)。 爲一種可於所有類型細胞發現到之主要轉錄因子， 爲與發炎之發端有關。於多數細胞中，NF-kB係以 無活性、抑制性kB ( IkB )-結合複合物的形式存在 方食品 該失活 何其他 ，該失 益生菌 發炎效 或預防 。在此 所習知 但不限 〇 中移動 致健康 種能把 鼠細胞 體對應 出能抑 NF-kB 其被認 隱性、 於細胞 -31 - 200906426 質中。當細胞接受到任一種細胞外訊號（例如來自細胞激 素、細菌性抗原或自由基）時，NF-kB會迅速進入到細胞 核中且活化負責發炎反應之基因。現已發現到抑制NF-kB 引起發炎之作用可以降低發炎反應。Lawrence, ei α/., Possible New Role for N FkB in the Resolution of Inflammation, N at u r e M e d · 7 : 1 2 9 1 ( 2 0 0 1 )。因此，本發明 經由補充失活的益生菌來抑制NFkB能有助於減輕或預防 全身性發炎。 如同於實施例中所見到地，失活的益生菌能於餵食配 方食品之嬰兒有效地減輕全身性發炎。餵食配方食品之大 鼠嬰兒補充失活的益生菌時，其體內之CINC-1及多種細 胞激素的含量會減少到類似於餵食母乳之大鼠嬰兒體內的 量。 如同於實施例中所見到地，失活的益生菌還顯示出能 夠顯著地減少IL-8之製造、降低NF-kB移動及增加腸上 皮細胞中IkB之製造。本案發明者還意外地發現到失活的 益生菌能預防IkB泛素化，而活的益生菌則不能。 以下實施例說明本發明之多種具體例。熟悉此技術之 人士在考量在此揭露之本專利說明書的內容或施行本發明 以後，即能明顯得知在此所述之申請專利範圍所涵蓋之其 他具體例。 本發明之專利說明書及實施例應僅被視爲闡述舉例 用’本發明之範疇及精神將由跟隨在實施例後方之申請專 利範圍來界定。於此等實施例中，除非另有說明，否則所 -32- 200906426 有的百分率（％)係以重量爲基礎來提供。 【實施方式】 實施例1 此實施例係顯示於餵食配方食品之大鼠新生幼鼠補充 失活的益生菌對全身性發炎的影響。於此實施例中係採用 LGG爲益生菌。 材料及方法 於兩組各別的實驗中，把史伯格-達利（T a c ο n i c， Germantown，NY )大鼠嬰兒隨機分成四組胃造口 -餵食 組’每組五隻：對照組（無L P S或L G G ) 、L P S組、L P S + 活的LGG組’及LPS +失活的LGG組。使用同樣年齢之母 鼠-撫育之大鼠爲參考對照組。胃造口 -餵食，係採用大鼠 嬰兒“杯中幼鼠（pup-in-the-cup)，，模式，於大鼠幼鼠出生 後7天開始施行。胃造口餵食管係由24-cm切面之管道系 統所組成，其可插入幼鼠胃內。胃造口管置入係在異氟烷 麻醉下進行。該餵食管上接有計時器-控制之針筒泵且設 定成於每個小時前2 0分鐘依體重-相關流速來餵食大鼠。 在2-天適應期期間’胃造口-餵食之大鼠幼鼠係餵以 大鼠母乳替代品（RMS )。於適應期結束後，有一組rMS 飽食組會補充lxl〇8細胞當量/公斤體重/天之失活LGG。 該LGG係以致命性加熱來失活化。第二組則給予j χ l〇8cfu/L /公斤體重/天之活的LGG。第三組則餵食RMS且 -33- 200906426 未補充任何類型之LGG。此種餵食連續6天。所有的胃造 口-餵食組都接受相同份量之脂肪及醣類，且蛋白質成份 近似於正常生長所需份量。使用同樣年齡之母鼠·撫育之 大鼠爲參考對照組。 把來自大腸桿菌〇127:BB之脂多醣（LPS; Sigma, St. Louis，MO)以2 mg/ml的濃度攪拌溶於水中。胃造口-餵 食之大鼠在開始人工餵食2天後，會給予0.25到0.5 mg/kg/天之LPS。該幼鼠以LPS補充營養6天。此劑量係 以前導硏究決定出來，其會導致非經常性顫抖、豎毛、體 重增加不良但是並不會顯著提高這6天期間之死亡率。 在這6天治療期結束後，把大鼠幼鼠用過量戊巴比妥 鈉安樂死。取出小腸且分成三份：迴腸、空腸及十二指 腸，儲存於-80 °C下以供進行酵素檢定及ELISA，或以 1 〇 %中性緩衝之福馬林固定以進行腸形態學分析。肺、肝 及血漿儲存於-80°C以供進行酵素檢定及ELISA。 使用 Sigmastat 統計軟體（SPSS, Chicago，IL )分析 體重、CINC-1之ELISA分析、及細胞激素/趨化素多重檢 定結果。所有數據皆以平均値±標準差（SD )來表示。使 用單因子群組間變異數分析（ANOVA )來決定所有治療群 組間是否有顯著差異。當ANOVA之顯著性p<〇.〇5時，採 用Holm-Si dak方法來作成對比較。 結果及討論 生長 -34- 200906426 此實施例係顯示益生菌投予對於胃造口 -餵食之幼鼠 生長的影響。該等大鼠幼鼠在以胃造口管餵食以後每日坪 重且與母鼠餵哺之參考組動物作比較。母鼠餵哺之動物較 LPS-治療、胃造口-餵食之動物生長得更快。對胃造口-餓 食、LPS -治療之幼鼠提供活的或失活的益生菌並不會改善 體重增加的現象。 CINC-1 於本發明，補充活的或失活的益生菌會降低CINC_1 量。CINC-1量係使用大鼠生長-相關之致癌基因 的TiterZyme酵素免疫度量檢定套組（Assay Designs，Ann Arbor, MI)來測定。組織樣本係從肝、腸、血漿及肺之全 組織細胞萃取物中分離出來。吸光率係於450 nm下測 定，且濃度係用衍生自線性標準曲線之方程式計算出來。 如第1圖到第3圖所顯示地，ELISA結果顯示LPS能 增加肝、肺及血漿內之C IN C-1含量。活的及失活的益生 菌兩者皆能減少肝（第1圖）及血漿（第2圖）內LPS-誘生之CINC-1的製造（p<0.05)，還顯示出肺部CINC-1 含量的變化趨勢（Ρ = 〇·〇9)(第3圖）。 第1圖顯示補充活的益生菌會使得肝之CINC-1含量 較該LPS組降低約50%。然而，失活的益生菌則使得肝之 CINC-1含量相較於該LPS組降低約75%。因此，相較於 活的益生菌，失活的益生菌對於肝之C IN C -1含量有顯著 更好的降低效果。類似地，第2圖顯示失活的益生菌組之 -35- 200906426 血漿C IN C - 1含量較活的益生菌組更低。於肺部，活的及 失活的益生菌可讓CIN C- 1含量降低到類似的程度（第3 圖）。

GRO/KC 如第4圖及第5圖所顯示地，該細胞激素多重檢定顯 示肝及肺內之GRO/KC含量有類似的減少現象。於肝臟’ 失活的益生菌令GRO/KC含量減少的程度較活的益生菌更 大，顯示出其有更強的抗-發炎效果（第4圖）。於肺 部，活的及失活的益生菌可讓GRO/KC含量降低到類似的 程度（第5圖）。 此實驗於肺部觀察到之CINC-1及GRO/KC含量較低 的現象顯示失活的益生菌之抗發炎效果可擴及末端器官。 因而，該失活的益生菌之抗發炎效果本質上的確是全身性 的。 於肝臟，補充失活的益生菌可讓cwc-1含量減少到 實質上低於餵食母乳之大鼠幼鼠體內之cINc-1含量。於 肺及血漿，失活的益生菌能令c 1N c -1含量減少到類似於 餵食母乳之大鼠幼鼠體內之CINC-1含量。此等結果顯示： 失活的益生菌具有讓餵食配方食品之嬰兒的全身性發炎程 度減低到類似於（於某些例子中’則低於）餵食母乳之嬰 兒的發炎程度。 細胞激素及趨化素 -36- 200906426 活的及失活的益生菌還能減少細胞激素及趨化素的含 量。從 LINCO Research, Inc. ( St. Charles，MO, USA)購 得多樣珠粒套組。藉由套組來分析細胞激素/趨化素，其 包括：顆粒球-巨噬細胞集落-刺激因子（G M C S F )、干擾 素-入（IFN-入）、介白素_10：(11^1«)、11^-1/3、11^ 2 、 IL-4 、 IL-5 、 IL-6 、 IL-8 、 IL-10 、 IL-12p70 、 IL-18 、 單核球趨化蛋白-1 ( MCP-1 ) 、GRO/KC (大鼠ΟΙΝΟ Ι ) 及 TNF- 〇: 。 該多樣 檢定係依照廠 商的說 明書來 進行。 各細胞激素/趨化素之標準曲線係使用廠商提供之參考濃 度來產生。原始數據（平均螢光強度）係使用 MasterPlex 定量軟體（MiraiBio，lnc. Alameda, CA，USA)分析以得 到濃度値。 如第6圖所顯示地，以胃造口-餵食、LPS -治療之幼 鼠之肝臟的IL-1 /3含量顯著地高於對照組幼鼠之含量。活 的及失活的益生菌顯著地鈍化LPS引發之IL-10升高現 象。事實上，失活的益生菌降低IL-10量之程度會大於補 充活的益生菌時的程度。失活的益生菌能令IL-1/3的表現 減少到類似於對照組幼鼠之程度。因此，這一部份的實驗 進一步顯示該失活的益生菌之全身性抗發炎活性。 總括來說，此等結果顯示補充失活的益生菌能減少全 身性發炎。進一步地，此等結果顯示該失活的益生菌能使 餵食配方食品之嬰兒體內之全身性發炎減少到類似於餵食 母乳之嬰兒的程度。透過比較失活的益生菌-治療之群組 及充份餵食母乳之群組可以顯示在此說明之結果。於多種 -37- 200906426 情況下’投予失活的益生菌所造成之發炎反應係類似於餵 食母乳之群組。 實施例2 此實施例係顯示於餵食配方食品之大鼠新生幼鼠補充 失活的益生菌對發炎的影響。於此實施例中係採用LGG 爲該益生菌。 腸上皮細胞先用濃度1 X 1 〇8 Cfu/L之活的L GG或U V-失活的LGG預處理’然後用鞭毛蛋白5〇〇 ng/mL刺激。 IL-8之製造量係用ELIS A測量。ikB及泛素化-IkB ( UbQ-IkB )之表現係用Western墨漬法及免疫沉澱法測量。 NFkB位置係用免疫螢光染色來評估。 實驗期間’鞭毛蛋白會導製細胞性IL-8之製造顯著 增加（Ρ<〇·〇5)。細胞先用活的LGG或UV-失活的LGG 預處理且然後用鞭毛蛋白刺激，顯示出IL-8、NFkB核轉 位、IkB及UbQ-IkB有顯著（ρ<〇·〇5)改變。此等結果示 於表1。箭頭向上顯示該參數値增加，而箭頭向下顯示該 參數値減少。 表1.補充活的或失活的益生菌所造 成之表現改變 IL-8 NFkB移動 IkB UbQ-IkB 只有鞭毛蛋白 Τ T 丄 T 活的LGG 1 丄 T T 失活的LGG i 1 T 1 -38- 200906426 如表1所顯示地，鞭毛蛋白會導致腸上皮細胞之細胞 性IL-8的製造顯著地增加（p<0.05 )。當有活的及失活 LGG時，IL-8的製造顯著地向下調節。此外，受到鞭毛蛋 白刺激之細胞顯現出NFkB核移動的現象，此現象在有活 的及失活的LGG時會被抑制。鞭毛蛋白會減少IkB的製 造，但是若以活的及失活的LGG預處理時此作用會被逆 轉（p<0.05 )。鞭毛蛋白及活的 LGG會增加 UbQ-IkB (p<0.05 )，而失活的LGG會減少UbQ-IkB。 此實施例顯示活的及失活的益生菌能有效減少IL-8 (一種前發炎性細胞激素）之製造，因此具有抗-發炎的 效果。因爲鞭毛蛋白及該活的益生菌會增加UbQ-IkB，但 是失活的益生菌則會減少UbQ-IkB，所以失活的益生菌似 乎是透過防止IkB泛素化來運作，而活的益生菌則非如 此。因此，此實施例進一步顯示活的及失活的益菌似乎是 透過不同機制來運作且當一起投予時可具有協同效果。 本發明已顯示能減少肝、血漿及肺發炎。由於本發明 可改善發炎病況，所以其亦可用來預防嚴重感染或病況之 發生。 所有在本專利說明書中引用之參考資料，包括但不限 於所有論文、刊物、專利、專利申請案、演講 '教科書、 報告、手稿、小冊、書籍、網路發表、雜誌、期刊等等， 全部倂入本專利說明書以爲參考。此等參考資料之討論僅 是意圖簡介原作者之主張，並非同意任何參考資料構成本 案先前技術。申請人仍保留挑戰引用資料之正確性及適當 -39- 200906426 性之權力。 熟悉此技術之人士可在不悖離本發明之精神及範疇τ 進行本發明這些及其他的修改及變化，而本發明之精神& 範疇係由後附之申請專利範圍來詳細說明。此外，應瞭Μ 地，不同具體例之態樣可全部或部份互換。進一步地’熟 悉此技術之人士應瞭解前述說明僅係用來舉例，而非意® 限制本發明，本發明之範圍應由所附之申請專利範圍來說 明。因此，後附申請專利範圍之精神及範疇不應限於內含 之較佳版本的描述。 【圖式簡單說明】 爲了更徹底地了解本發明，以上說明宜參考後附圖 式。 第1圖顯示使用酵素連結免疫吸附檢定（ELISA )檢 測活的及失活的益生菌對於肝臟之細胞激素誘生之嗜中性 球趨化因子-1 (CINC-1)肽之製造的影響。失活的鼠李糖 乳酸桿菌 GG，LGG)，爲 舉例用之失活的益生菌，係標示成“加熱-LGG”。 第2圖顯示使用ELISA檢測活的及失活的益生菌對於 血漿之CINC-1肽之製造的影響。失活LGG係標示成“加 熱-LGG”。 第3圖顯示使用ELISA檢測活的及失活的益生菌對於 肺臟之CINC-1肽之製造的影響。失活LGG係標示成“加 熱-LGG”。 -40 - 200906426 第4圖顯示使用細胞激素多重檢定檢測活的益生菌及 失活的益生菌對於肝臟之生長相關致癌基因（GRO/KC ) 之製造的影響。失活LGG係標示成“加熱-LGG”。 第5圖顯示使用細胞激素多重檢定檢測活的及失活的 益生菌對於肺之GRO/KC之製造的影響。失活LGG係標 示成“加熱-LGG”。 第6圖顯不使用細胞激素多重檢定檢測活的及失活的 益生囷對於肝臟之介白素-1冷)含量的影響。失 活L G G係標示成“加熱-L G G ”。 -41 -

Claims (1)

1. 200906426 十、申請專利範圍 1. 一種含有至少一種失活的益生菌（probiotic)之兒 童或嬰兒產品，其中該產品係調製成能遞送約1 X 1 〇4到約 1 X 1 〇 1 °細胞當量/公斤體重/天之失活的益生菌給兒童或嬰 兒，且其中該至少一種失活的益生菌除了不具備繁殖性質 以外，仍保有活的益生菌之細胞性及分子生物反應性特 質。 2 .如申請專利範圍第1項之產品，其中該至少一種失 活的益生菌係選自所有已知的益生菌及其組合。 3 .如申請專利範圍第1項之產物，其中該至少一種失 活的益生菌係選自乳酸桿菌屬菌、雙歧 桿菌屬（仏/W△ a w w )菌、及其組合。 4 .如申請專利範圍第1項之產物，其中該失活的益生 菌包括一或多種乳酸桿菌屬（ZacioZiaciZ/ws)菌及一或多 種雙歧桿菌屬（⑴)菌之組合。 5 .如申請專利範圍第1項之產物，其中該產品係調製 成能遞送約1x1 〇6到約ix109細胞當量/公斤體重/天。 6 .如申請專利範圍第1項之產物，其中該產品係調製 成能遞送約1 X 1 〇9細胞當量/公斤體重/天。 7 .如申請專利範圍第1項之產物，其進一步含有至少 一種活的益生菌。 8 .如申請專利範圍第7項之產物，其中該活的益生菌 係選自鼠李糖乳酸桿菌 GG ( iaciohci/Zw r/zawwosw GG，LGG)、動物雙歧桿菌雷特氏亞種（BB-12®，3· -42- 200906426 animalis s s p. l act i s ) 、及其糸且合。 9 .如申請專利範圍第1項之產物，其中該產物進一步 含有至少一種長鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA)。 10.如申請專利範圍第 9項之產物，其中該LCPUFA 係選自二十二碳六烯酸（DHA )、花生四烯酸（ARA )及 其組合。 1 1 .如申請專利範圍第 1 〇項之產物，其中該 ARA:DHA之比例爲約2:3到約2: 1之間。 -43-