TW200839011A - Bacillus natto highly producing vitamin B2 and natto product produced by using the bacillus natto - Google Patents
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200839011 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於使用新穎納豆菌及該納豆菌所製造之新 穎納豆，詳細而言，係關於具有納豆菌組胺酸類似物耐性 、及/或組胺酸必要性，高生產維他命b2之納豆菌、及使 用該納豆菌所製造之維他命B2高含量納豆。 【先前技術】 維他命B2(亦稱爲核黃素）係多種微生物、植物所生合 成之水溶性維他命之一種。 以人類爲首之脊椎動物係不能生合成維他命B2。因 此，對人類而言，維他命B2係必須營養素之一，已知缺 乏維他命B2會引起口腔黏膜炎症、皮膚炎症及其他皮膚 損傷、結膜炎、視力減退、成長阻礙等。 另外，維他命B2之每日所需量係依據厚生勞働省之「 第六次改定日本人之營養所需量」，成人男性爲l.lmg。 另外，厚生勞働省認可之營養功能食品係食品每日攝 食量之維他命B2含量爲0.3 3mg以上者被認可。 另一方面，深植於日本人飮食生活中，因近年來的健 康取向，該消費量擴大的納豆係含有較多維他命B 2的食 品，已知爲攝取維他命B2之適合食品。然而，試看市售 納豆之維他命B2含量，每50g不超過0.2mg左右，若考慮 攝食納豆一般爲每日1盒（40〜50g裝）程度時，一日可自傳 統的納豆攝取的維他命B2量’不超過〇·16〜0.2mg程度。 200839011 接著，若可提高納豆之維他命B2含量時，可期待納 豆作爲可更容易攝取維他命B2之健康食品。 由以上可知，提高維他命B2含量之納豆產業上價値 高，迫切期待提高維他命B2含量。 在此，作爲用以提高納豆維他命B2含量之手段’考 慮添加維他命B2於納豆之方法，及提高納豆菌之維他命 B2生產性之方法。添加維他命以於納豆時’當然發生添 加部份之維他命B2成本，而且，就使用添加物觀點上， 成爲不適合消費者之嗜好者，所以以提高納豆菌之維他命 B2生產性之方法爲宜。 另一方面，試看關於提高納豆菌之維他命B2生產性 之方法時，過去並無提高納豆菌之維他命B2生產性之事 例，僅有關於類緣之桿菌屬細菌提高維他命B2生產性之 事例。 亦即，對於桿菌屬細菌，例如賦予嘌呤必要性且組胺 酸類似物耐性之方法（例如參考專利文獻1 )、賦予核黃素 類似物耐性於枯草桿菌之方法（例如參考非專利文獻1)、 賦予蘇胺酸類似物耐性於枯草桿菌之方法（例如參考專利 文獻2)、賦予脯胺酸類似物耐性於枯草桿菌之方法（例如 參考專利文獻3)等之許多事例。 然而，對於桿菌屬細菌，具體上並不知道關於至今之 維他命B 2生合成及組胺酸生合成於途徑上之關聯性，另 外，對於納豆菌，因爲與類緣之枯草桿菌不同，已知無組 胺酸之利用性（例如參考非專利文獻2)等，尤其設定維他 200839011 命B2生產性與組胺酸之關聯性係困難之狀況。 非專利文獻1:〇〇1^1丨1^，18號5?.319〜321，19 82年 非專利文獻2 :醫學與生物學，第1 05卷，第2號’ p.l19〜122， 1982年 專利文獻1 :特開昭49-66 8 94號公報 專利文獻2 :特開2004- 1 8067 1號公報 專利文獻3 :特開2004- 1 8 06 72號公報 【發明內容】 發明之揭示 發明所欲解決之課題 本發明係對於製造維他命B2高含量納豆，依據消費 者需求，不添加（強化）維他命B2於納豆，提供育種新穎高 生產維他命B2之納豆菌，用以使納豆所含之維他命B2含 量增加之維他命B2高生產納豆菌、及使用該納豆菌所製 造之維他命1高含量納豆者。 課題之解決手段 本發明者等爲提升納豆菌之維他命B2生產性，反覆 檢討的結果，發現賦予組胺酸類似物耐性於納豆菌、及/ 或賦予組胺酸必要性，納豆菌之維他命B2生產性提升， 可使納豆之維他命B2含量提高，而完成本發明。 亦即，本發明係關於下述各項。 (1)具有組胺酸類似物耐性，且高生產維他命B2爲特 200839011 徵之屬於枯草桿菌（Bacillus subtilis)之納豆菌。 (2) 組胺酸類似物係至少1種選自2-甲基組胺酸、2-噻 唑丙胺酸、3-胺基-1，2,4-三氮雜茂爲特徵之如上述（1)記載 之納豆菌。 (3) 具有組胺酸必要性，且高生產維他命以爲特徵之 屬於枯草桿菌（Bacillus subtilis)之納豆菌。 (4) 高生產維他命B2之納豆菌係生產每50g之納豆， 含有維他命 B2爲0.2mg以上、1.1〜1.2以下，以0.21〜 1.05mg爲宜，以0.4〜1.05mg更好，以0.6〜1.05mg最好’ 有時生產含有1.1〜1.2mg之維他命B2高含量納豆的納豆菌 爲特徵之如上述（1)至（3)中任一項記載之納豆菌。 (5) 納豆菌係枯草桿菌 AT-75(Bacillus subtilis AT-75) 株（FERM BP- 1 0674)、或枯草桿菌 H-50(Bacillus subtilis 11-50)株卩£11]\4 6?-1 0675)爲特徵之如上述（1)至（4)中任一 項記載之納豆菌。 (6) 使用如上述（1)至（5)中任一項記載之納豆菌爲特徵 之維他命B2高含量納豆之製造方法。 (7) 使用如上述（1)至（5)中任一項記載之納豆菌所製造 爲特徵之維他命B2高含量納豆。 發明之功效 由本發明所提供之育種人類必須營養素維他命B2之 生產性提升之納豆菌之方法，使用由此方法所開發之維他 命B2商生產納丑囷’生產納丑，將可製造維他命B2含量 200839011 非常高之納豆。 若依據本發明，使用有關本發明之維他命B2高生產 納豆菌時，另外依常法製造納豆，可容易製造維他命B2 高含量納豆。亦即，若依據本發明，可自通常的食品攝取 多量的天然維他命B 2。因此，與製造另外添加維他命B2 於納豆之維他命B 2強化納豆，應稱爲所謂的人工食品或 半天然食品之食品時明顯不同，就成本上、操作、步驟上 ，本發明亦卓越。 用以實施發明之最佳形態 以下係詳細說明本發明。 本發明中使用於育種改良之原本的納豆菌，雖無特別 的限制，但以使用通常納豆工業所使用之發酵能力優異之 納豆菌、或由自然界所分離取得之納豆菌、及更加反覆改 良之優異納豆菌爲宜。 納豆菌係分類於枯草桿菌（Bacillus subtilis)，但可將 大豆等之豆類發酵，可製作出黏質物（牽絲物質）等作爲納 豆之特徵，成爲納豆發酵中主體之細菌，另外，因爲具有 生長發育時必須有組胺酸等之特性等，所以分類爲納豆桿 菌（Bacillus natto)，或亦與枯草桿菌區別，分類爲枯草桿 菌變種之枯草桿菌納豆變種（Bacillus subtilis var. natto) 或枯草桿菌（納豆）（Bacillus subtil is (natto))等。 作爲納豆菌，可廣泛使用納豆桿菌 IF03009株 (Bacillus nattο IFΟ3 009)、納豆桿菌 IF〇3 3 3 5 株（B aei 1 lus 200839011
Subtilis IF03335)、同 IF03336 株、同 IF03936 株、同 IF013169株等以外，還有各種納豆菌。 具體上，可舉例如自市售納豆分離之〇-2株或該株之 維他命K2高生產性突變株之OUV2348 1株（於1 999年2月22 日以委託號碼FERM ΒΡ-665 9寄存於獨立行政法人產業 技術綜合硏究所特許生物寄託中心（日本國茨城縣筑波市 東1丁目1番地中央第6)(舊名稱：通商產業省工業技術院 微生物工業技術硏究所，舊住所：日本國筑波市東1 丁目1 番3號）。），另外，可適當使用市售納豆種菌之高橋菌（τ3 株’東京農業大學菌株保存室）或宮城野菌（宮城野納豆製 作所）等之各種納豆菌。 另外，於本發明中，作爲用以得到突變納豆菌之突變 方法係可使用任何突變方法。因爲納豆菌即使不施以特別 的人工突變處理，仍以某程度之機率發生自然突變，所以 由如此之自然突變，可取得目的之維他命Β2生產性提高 之突變納豆菌。 另外’亦有由人工手段使引起突變而取得之方法。突 變係使用物理及化學方法。作爲突變之物理方法，有紫外 線照射、放射線照射等，作爲化學方法，例如有使菌體懸 浮於乙基甲磺酸（EMS)或Ν-甲基-Ν，-硝基-Ν -亞硝基胍 (NTG)等之突變劑溶液之方法等，可單獨或組合此等方法 而適當實施。 本發明中’賦予組胺酸類似物耐性（histidine analog-resistant)及/或組胺酸必要性於納豆菌爲特徵。 200839011 組胺酸類似物耐性株係選擇即使添加組胺酸類 選擇培養基中仍可生長發育之菌株，使用之組胺酸 係可使用任意者，具體上可舉例如2_甲基組胺酸、 丙胺酸、3-胺基-1，2,4-三氮雜茂等，以使用3-胺基 三氮雜茂爲宜。 另外，組胺酸類似物之添加量係必須考慮納豆 胺酸類似物之耐性度而實施，可添加0.1〜10 〇mg 〜20mg/ml程度之濃度於選擇培養基爲宜。 另外，組胺酸之必要性株於不含組胺酸之培養 長發育差，或不生長發育，可選擇僅於含組胺酸之 生長發育之菌株而可取得。例如使用於不含組胺酸 培養基或含有之合成培養基，有無形成菌落作爲判 而可選擇。 另外，維他命B2生產性提高之納豆菌株係可 酸類似物耐性株及/或組胺酸必要性株中，篩選維ft 生產性提高之菌株而可取得。 作爲納豆菌之維他命B2生產性提高菌株之篩 ，培養成爲組胺酸類似物耐性及/或組胺酸必要性 菌後，自原本親株選擇、分離維他命B2生產性提 株而可取得。 亦即，依據例如下揭示之方法製造納豆後，由 豆中所含之維他命B 2濃度而可進行。 製造納豆係使用所得之組胺酸類似物耐性株；； 胺酸必要性株之孢子液及通常納豆菌之孢子液，如 似物於 類似物 2-噻唑 菌對組 ，以 0 · 2 基，生 培養基 之合成 定指標 自組胺 !命 B2 選方法 之納豆 高之菌 測定納 泛/或組 常法發 -10- 200839011 酵納豆。例如將浸漬後之大豆瀝水，以1.8kg/cm2加壓蒸 煮18分鐘而得。於每lg蒸煮大豆接種1，〇〇〇〜4,000個孢子 ，放入各50g於PSP(polystyrene paper，保利龍珍珠板）托 盤，以薄膜覆蓋表面，加蓋後，放入批式納豆發酵室，以 室溫爲40〜45 °C之高濕度下進行發酵。發酵結束後，使熟 成，製造納豆。 另外，測定納豆中之維他命B2係可由例如下述方法 實施。亦即，將適當量的納豆磨碎，取3 g之磨碎納豆於 褐色瓶中，加入50ml之0.1N鹽酸，沸騰水浴中進行酸分 解1 5分鐘。冷卻後，以4M醋酸鈉調整成ρΗ4·5，加入5ml 之2.5%之高峰醣化酶（Takadiastase)B溶液，於37°C進行酵 素分解約16小時，得到酵素分解液。接著，以80mM醋酸 緩衝溶液（pH4.5)定容該酵素分解液成100ml後，加入等量 的甲醇，以過濾器過濾析出物，以高效能液相層析儀之螢 光偵測器（激發波長爲445nm，螢光波長爲53 0nm)可檢測 維他命B2含量。另外，納豆之維他命B2含量係可由使用 核黃素之標準曲線算出。 另外，高效能液相層析儀之管柱係使用 ODS管柱， 流動相係使用甲醇：l〇mmol/L濃度之 NaH2P04溶液 (ρΗ5·5) = 3 5:65之溶劑，流速爲〇.8ml/分。 由上述方法，自組胺酸類似物耐性株及/或組胺酸必 要性納豆菌中’篩選維他命B2高生產性之納豆菌，可取 得本發明之納豆菌，在此所得納豆菌之維他命B2生產性 係比親株高，例如以〇.2mg以上/50g納豆爲宜，以 200839011 0.6 m g / 5 0 g納豆尤佳，以1 m g / 5 0 g納豆更好。 有關本發明之維他命B2高生產納豆菌係每50g之納豆 ，可生產〇.2mg以上之維他命B2，實際證明生產0.210〜 1.05mg。更具體係可生產0.2mg以上、0.3mg以上、0.4mg 以上、0.5mg以上、0.6mg以上、0.7mg以上、0.8mg以上 、〇.9mg以上。關於上限，實際上可進行lmg以上、 1.0 5 m g，亦可充份期待1 . 1〜1.20^，亦可期待1.511^以上 〇 依據本發明時，高生產維他命B2之納豆菌係生產每 5〇g之納豆，含有〇.21mg〜1.05mg之維他命B2，以〇.4mg 〜1.05mg爲宜，以0.6mg〜1.05mg更好之可得到生產維他 命B2高含量納豆之納豆菌，亦可適當生產維他命B2含量 除了此等範圍以外，上述段落記載之各數値所規定之各種 範圍，例如0.3〜0.5mg、0.4〜0.7mg、0.2〜lmg之數値範 圍之維他命B2高含量納豆。 利用如此所開發之高生產維他命B2之納豆菌於納豆 生產係可採用傳統所實施之方法，並無限制。 例如一般納豆係以整粒大豆作爲原料所製造之所謂整 粒大豆納豆，亦有一部份係以預先碾碎的大豆爲原料之碾 碎納豆。 一般整粒大豆納豆之製造方法係浸漬一般原料之整粒 大豆於冷水十幾小時後，以蒸煮釜使用加壓蒸氣加壓蒸煮 (1.5〜2Kg/cm2«128〜133°C)，對於所得之蒸煮大豆，於高 溫狀態（7 〇〜1 〇 〇 °C )接種納豆菌混合後，充塡於所定容器 -12- 200839011 後搬入發酵室，使以較高溫度（40〜55 °C程度）發酵所定時 間（1 2〜4 8小時程度）後，使以5。(：左右冷藏熟成（1 2〜7 2小 時程度）而完成。 另外，碾碎納豆係除了預先浸漬碾碎大豆於水以外， 以與通常整粒大豆納豆時相同的方法所製造。 於如此之傳統的納豆製造方法中，本發明中使用由上 述方法育種改良之維他命B2高產性納豆菌取代發酵步驟 使用的納豆菌所製造。 如此一來，可生產與傳統納豆於品質上無差異，風味 豐富，而且含有高濃度之納豆。 【實施方式】 以下係舉實施例等具體地說明本發明。 (實施例1) (1)使用菌株等 納豆菌係使用 OUV2348 1株（FERM BP-6659)作爲親 株。 培養該納豆菌時使用的培養基係如表1所示之NB培 養基（Nutrient Broth)及表2所τκ之 SP 培養基（改變 Spizizen培養基）。另外，於固體培養基中添加1.5重重/谷 量％之瓊脂。 -13- 200839011 [表1] (NB培養基） 成份 濃度 肉萃取物 聚蛋白陳 氯化鈉 1重量/容量％ 1重量/容量％ 0.5重量/容量％
[表 2] · (SP培養基） 成份 濃度 硫酸錶 〇·2重量/容量％ 磷磷氫二鉀 1.4重量/容量％ 磷酸二氫鉀 0.6重量/容量％ 檸檬酸 〇·1重量/容量％ 硫酸鎂7水合物 0.02重量/容量％ 葡萄糖 〇·5重量/容量％ 麩胺酸鈉 0.01重量/容量％ 生物素 l〇〇〇/zg/L (2) 突變處理方法 以白金環接種納豆菌於NB培養基，於3 7。(：振盪培養一 夜後，離心分離，以50mM磷酸鈉緩衝溶液（PH7)洗淨。 於約107cfu/ml濃度之洗淨菌體，添加N-甲基-N，-硝 基亞硝基胍，使最終濃度成爲160 μ g/ml，振盪60分鐘 ’進行突變處理。此時之生存率爲2%左右。 (3) 組胺酸必要性維他命B2高含量納豆菌之篩選方、法 以NB培養基培養經突變處理之菌體，使表現形質後 -14- 200839011 ，以50mM磷酸鈉緩衝溶液（pH7)洗淨，塗抹培養於NB固 體培養基。 接種出現的菌落於SP(澱粉蛋白腺）固體培養基、及含 最終濃度爲〇.lmg/ml之組胺酸之SP固體培養基，於37°C 培養2〜3日後，判定於SP固體培養基不生長發育，於含 組胺酸之SP固體培養基生長發育之菌落爲組胺酸必要性 株，合計取得68株。 調製所得68株組胺酸必要性株之孢子液、及親株 OUV2348 1株之孢子液，使用該孢子液，如常法製作納豆 〇 亦即，將浸漬後之大豆瀝水，以K8kg/cm2加壓蒸煮 18分鐘。每lg蒸煮大豆接種1，000〜4,000個孢子，放入各 5 〇g於PSP托盤，以薄膜覆蓋表面，加蓋後，放入批式納 豆發酵室，以室溫爲40〜45 °C之高濕度下進行發酵。發酵 結束後，使熟成後，評估作爲納豆之品質。 使用之68株組胺酸必要性株中，對於符合納豆品質之 46株納豆，測定維他命B2含量。另外，維他命B2含量係 以下述方法定量。 亦即，將適量的納豆磨得非常細，取3 g磨碎納豆於 褐色瓶中，加入5〇ml之0.1N鹽酸，沸騰水浴中進行酸分 解15分鐘。冷卻後，以4M醋酸鈉調整成pH4.5，加入5ml 之2.5%之高峰醣化酶（丁&]^心&以3^)8溶液，於37°(：進行酵 素分解約16小時。接著以80mM醋酸緩衝溶液（pH4.5)定容 酵素分解液成1 OOnil後，加入等量的甲醇，以過濾器過濾 -15- 200839011 析出物，以高效能液相層析儀之螢光偵測器（激發波長爲 4 4 5 n m，螢光波長爲5 3 0 n m )，可檢測維他命B 2含量。另外 ，納豆之維他命B2含量係可由使用核黃素之標準曲線算 出。 另外，高效能液相層析儀之管柱係使用ODS管柱， 流動相係使用甲醇：l〇mmol/L濃度之 NaH2P04溶液 (pH5.5) = 35:65之溶劑，流速爲（K8ml/分。 由上述方法，自68株組胺酸必要性納豆菌中，對於可 製造符合作爲納豆品質之納豆之46株，調查維他命B2含 量之結果，可取得下述表3所示之H-6株、H-50株及H-64 株之合計3株之維他命B 2高生產性納豆菌株。另外，表3 中於SP固體培養基之增殖係表示〇：增殖，X :未增殖’ 雖於具有組胺酸之SP固體培養基增殖，但於無組胺酸之 SP固體培養基不增殖之菌株，係指具有組胺酸必要性。 [表3]
納豆菌株 維他命Β2含量 (mg/50g 納豆) 於SP固體培養基之增殖 有組胺酸 無組胺酸 親株(OUV23481 株） 0.177 〇 〇 H-6株 0.210 〇 X H-50 株 0.287 〇 X Η·64 株 0.217 〇 X
得到如此所取得之維他命B2生產性提升之具有組胺 酸必要性之3株（H-6株、H-50株及H-64株）。其中’維他 命B2生產性高之H-50株係命名爲枯草桿菌H-50株 -16- 200839011 (Bacillus subtil is H-50)，於2006年9月11曰寄存於獨立行 政法人產業技術綜合硏究所特許生物寄託中心（日本國 〒305-85 66茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，該委 託號碼爲 FERM BP-10675。 (實施例2) (1) 使用菌株等 納豆菌係與實施例1同樣地使用 OUV23 48 1株（FERM BP-6659)作爲親株。 培養該納豆菌時使用的培養基亦與實施例1同樣地使 用如表1所示之NB培養基（Nutrient Broth)及表2所示之SP 培養基（改變Spizizen培養基）。另外，於固體培養基中添 加1.5重量/容量％之瓊脂。 (2) 突變處理方法 以與實施例1相同的方法進行納豆菌之突變處理。另 外，自OUV23 48 1株取得組胺酸類似物耐性株時之突變處 理係使用最終濃度爲8 0 // g / m 1之N -甲基-N，-硝基-N -亞硝 基胍，生存率爲4 %左右。 (3 )組胺酸類似物耐性維他命B 2高含量納豆菌、及組胺酸 必要性維他命B 2高含量納豆菌之篩選方法 以NB培養基培養經突變處理之菌體，使表現形質後 ，以50mM磷酸鈉緩衝溶液（pH7)洗淨，塗抹於含最終濃 -17- 200839011 度爲0.1mg/ml之腺嘌呤於SP培養基’添加成爲llmg/ml 之3-胺基-1，2,4-三氮雜茂之固體培養基。 於3 7 t培養2〜3日後，將所得之菌落以NB固體培養 基分離單個菌落，進而於含最終濃度爲〇.lmg/ml之腺嘌 呤於SP培養基，添加成爲llmg/ml之3-胺基-1，2,4-三氮 雜茂之固體培養基，再確認類似物耐性，得到79株之類似 物耐性株。 使用如此所得之類似物耐性株，以實施例1記載之方 法，試作納豆，評估作爲納豆之品質、及納豆中之維他命 B2含量。 7 9株之類似物耐性株中，對於可製造符合納豆品質者 之54株，測定維他命B2含量之結果，得到8株可製造維他 命B2含量提升之納豆。對於其中生產性提升之3株，調查 生產性及類似物耐性之結果如表4所示。 上述結果內，對於其中可製造維他命B2含量最高之 納豆之 AT-66株、AT-75株、AT-89株，調查關於維他命 B2生產性、組胺酸類似物耐性之結果如表4所示。另外， 對於表4中之組胺酸類似物耐性，於上述SP培養基添加成 爲llmg/ml之3-胺基-1，2,4-三氮雜茂之固體培養基，可增 殖時係以〇表示，不可增殖時係以X表示，可增殖時係指 具有組胺酸類似物耐性。 如此所得之具有組胺酸類似物耐性，維他命B2生產 性提升之 AT-75株係命名爲枯草桿菌 AT-75株（Bacillus subtilis AT-75)，於2006年9月11日寄存於獨立行政法人 -18- 200839011 產業技術綜合硏究所特許生物寄託中心（日本國郵遞區號 〒3 0 5 -8 5 66茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，該委 託號碼爲 FERM BP- 1 0674。
[表4] 納豆菌株 維他命B2含量 (mg/50g 納豆） 於含組胺国 SP固體培， 隻類似物之 _基之增殖 親株(OUV23481株） 0.177 〇 X AT-66 株 0.319 〇 〇 AT-75 株 1.05 〇 〇 AT-89 株 0.481 〇 〇
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Claims (1)
- 200839011 十、申請專利範園 1·一種屬於枯草桿菌（Bacillus subtilis)之納_a菌’其 特徵爲具有組胺酸類似物耐性，且高生產維他命B2。 2 ·如申請專利範圍第1項之納豆菌，其中組胺酸類似 ^ 物係至少1種選自2-甲基組胺酸、2-噻唑丙胺酸、3-胺基- 1，2,4-三氮雜茂。 3.—種屬於枯草桿菌（Bacillus subtilis)之納丑菌，其 0 特徵爲具有組胺酸必要性，且高生產維他命B2。 4·如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之納豆菌， 其中高生產維他命B2之納豆菌係生產每50g之納豆，含有 維他命：82爲0.211^以上，以0.21〜1.05mg爲宜，以0.4〜 1.05mg更好，以0.6〜l.〇5mg最好之維他命B2高含量納豆 之納豆菌。 5 ·如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之納豆菌， 其中納丑囷係枯皁桿囷AT-75(Bacillus subtilis AT-75)株 (FERM BP-10674)、或枯草桿菌 H-50(Bacillus subtilis H* 50)株（FERM BP- 1 0675) 〇 6·—種維他命Β2高含量納豆之製造方法，其特徵爲使 用如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之納豆菌。 7 · —種維他命Β2高含量納豆，其特徵爲使用如申請 專利範圍第1項至第5項中任一項之納豆菌所製造。 -20- 200839011 明 說 單 無簡 Web :號 為符 圖件 表元 代之 定圖 :指表 圖案代 表本本 無 代 定一二 指c C 八、本案若有化學式時，請揭不最能顧不發明特徵的化學 式：無 -3-
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