TW200810757A - Multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin for treatment of breast, colorectal, pancreatic, ovarian and lung cancers - Google Patents

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Description

200810757 v 九、發明說明: iL關申諳案之交互象照 本申凊案主張美國臨時專利申請案序號6〇/772,464(申 請曰2006年2月9曰)、60/804,391 (申請曰2〇〇6年6 •月 9 日)、60/844,938(申請日 2006 年 9 月 15 日)及 6〇/864 516 (申請日2006年11月6日)的優先權利益,其完整内容 以引用方式納入本文中。 【發明所屬之技術領域】 • 纟發明是有關於7-乙基-ίο-羥喜樹鹼共軛物的多臂聚 合性前藥。特別地,本發明是有關於7_乙基-1〇_羥喜樹鹼 的4臂聚乙二醇共軛物及其用途。 【先前技術】 在數年的期間,許多將生物有效性物質投予哺乳動物 时法已被提出。當所要的醫藥作用劑在水溶液中是不溶 時,問題就會產生。生物鹼通常是特別難以溶解的。 φ 喜樹鹼是一種由原產於中國的喜樹(C㈣p⑻ αα細-μ )及原產於印度的青脆枝(办如 細所製造的水不溶性細胞毒性生物驗。喜樹驗及相 關的類似物已知是有潛力的抗癌作用劑,並且已顯示試管 内及活體内的治療活性。 喜樹驗以及類似物已知是DNA抬普異構酶!抑制劑。 例如,一種喜樹驗類似物是愛萊諾迪肯(ΐΗη〇ί_ ; cpT_ U,Camptosar®),其也是DNA拓普異構酶!抑制劑,並 且也已顯示抗癌活性。7_乙基-1〇•經喜樹驗是cpT七的一 5 200810757 , 種活性代謝物。 【發明内容】 為了克服上述問題並且改善經由聚乙二醇化的藥物傳 遞之技術,本發明提供經由適當連接子而直接使用多臂聚 • 乙二醇以共軛到藥物分子的新方法。在這個方法中,不需 , 要將費力的分支分子部分併入到聚乙二醇中。此外,藥物 分子彼此之間是相當遠的。因此,與聚乙二醇的共軛效率 是大幅地增加。聚乙二醇共軛物的溶解度相較於末端分支 φ 方法也是改善的。 本發明的一種形態係提供式(1)化合物:
其中
Ri、尺2、R3及R4獨立地是OH或(L)m。; L是雙功能性的連接子; D是喜樹鹼或喜樹鹼類似物的殘基,例如:
6 200810757 m是〇或正整數;以及 η是正整數; 限制條件為心、&、1及n4不全是0Η。 在本毛月的這個形悲中’喜樹鹼或喜樹鹼類似物是與 聚合物反應,使其2罐基團形成具有4臂聚合物的共軛 物。 在本4月的車又佳形悲中,L是胺基酸殘基。在本發明 的特定較佳形態中,η是從約$ μ ^, % 疋攸幻28至約341,以及較佳是約 227 〇 本lx月也提供製造共軛物的方法以及利用本發明的化 合物之治療方法。 攸以下的說明及圖示中,優點將是顯而易見的。 為了本叙明之目的,名詞“殘基,,應理解為是指所提 到的化合物(也就是,喜樹鹼類似物、7_乙基-10_羥喜樹 驗、胺基酸等)之部分,其在與另一化合物經歷取代反應 Φ 之後其仍然繼續存在。 為了本發明之目的,名詞“包含聚合物的殘基,,或‘‘聚 乙二醇殘基”應個別理解為是指聚合物或聚乙二醇的部 刀’在經歷與包含喜樹驗或喜樹鹼類似物的化合物反應之 後其仍然繼續存在。 為了本發明之目的,名詞“烷基,,應理解為包括直鏈、 支鏈、取代(例如,鹵…烷氧基_、硝基_)的C112,但較 佳是Cw烷基、C^8環烷基或經取代的環烷基等。 為了本發明之目的,名詞“經取代的,,應理解為包括 200810757 w
以一個或多個不同的原子加入或取代一個或多個包含在官 能基或化合物内的原子。 為了本發明之目的,經取代的烷基包括羧烷基、胺烧 基、二烷胺基、羥烷基及巯烷基;經取代的烯基包括羧烯 基、胺烯基、二烯胺基、羥烯基及毓烯基,·經取代的炔基 包括緩快基、胺炔基、二炔胺基、羥炔基及巯炔基;經取 代的環烧基包括例如4-氣環己基的分子部分;芳基包括例 如蔡基的分子部分;經取代的芳基包括例如弘溴苯基的分 子部分;芳烧基包括例如甲苯基的分子部分;雜烷基包括 例如乙基噻吩的分子部分;經取代的雜烷基包括例如3•甲 虱基-噻吩的分子部分;烷氧基包括例如甲氧基的分子部 分,以及苯氧基包括例如3_硝基苯氧基的分子部分。画應 理~為包括氟、氣、蛾及溴。 為了本發明之目的,名詞“有效量,,及“足夠量,,應 :可達到所要效果或治療效果的量,就效果本身而論是由 般熟悉於此技藝者所理解。 【實施方式】 在本發明的一個具體實財係提供式⑴化合物
200810757 R1、R2、R3及R4獨立地是OH或(D^D ; L是雙功能性的連接子; D是喜樹驗或喜樹鹼類似物的殘基,例如:
m是〇或正整數,較隹是從約1到約,以及更佳是 1 ;以及 n疋正整數’較佳是從約28到約341,更佳是約227 ; 限制條件為R!、r2、r3及r4不全是〇H。 Α·喜樹鹼及相關的喜樹鹼類似物: 喜樹驗是一種由原產於中國的喜樹及原產於印度的青 脆枝所製造的水不溶性細胞毒性生物鹼。喜樹鹼以及相關 的化合物及類似物已知是有潛力的抗癌或抗腫瘤作用劑, 並且已顯示可在實驗室動物的試管内及活體内具有這此活 性。 一 / 喜樹驗及特定相關的類似物共享以下結構:
9 200810757
V 從這個核心結構中,許客p左 夕已知的類似物已被製備。例 如’在10 -及位置的任一壶 -兩者中的A環可被〇H取代。 A環也可被直鏈或分支的Ci ^ ^ 〇 、 々刀又』鴕基或烷氧基取代, 視需要耩由雜原子(也就是 〇志、 T J V L机疋_〇或-S )而連結到環。在7β
位置中的B環可被直鏈或分支的%院基(較佳是匕烧 基)、c5.8環烧基、Ci.3。燒氧基、苯烧基等、氨基甲酸烧 基酯、烷基二卡肼、苯肼衍生物等取代。在c、d及E環 中的其他取代是可能的。例如,參見美國專利第5,〇〇4,758 ^ 4,943,579 ,32,518號,其内容以引用方式納人本文中。 如同在此技藝中之人士將理解者,1〇_羥喜樹鹼、u_羥喜 树鹼以及l〇,U_二羥喜樹鹼類似物是在喜樹及其親屬樹種 中以微量成分之一的形式天然存在。對於這些化合物的其 他取代,也就是,7-烷基_、7_經取代的烷基_、7_胺基_、
胺烷基-、7-芳烷基-、9-烷基…9_芳烷基_喜樹鹼等衍生物, 可利用已知的合成技術無須過度實驗而製得。部分喜樹屬 的生物鹼具有以下所示的結構: (Π)
在以上所示的結構中,r7是N〇2、NH2、N3、氫、鹵 (F、Cl、Br、I)、COOH、OH、0-CV8 烷基、SH、S-CV: 10 200810757 烷基、CN、CH^NH^NH-Cu 烷基、CHfNH-Cu 烷基、N(Cb3 烷基)2、CE^NCCw 烷基)、Ο-、NH-及 S-CH2CH2N(CH2 CH2OH)2、Ο-、NH-及 S-CH2CH2CH2N(CH2 CH2OH)2、Ο-、 NH-及 S-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2、Ο-、NH-及 S-CH2CH2 CH2N(CH2CH2CH2OH2)2、Ο-、NH-及 烷 基)2、Ο-、NH-及 S-CH^CI^CI^NCC^ :):完基)2、CHO 或 ¢^-3 烧基之一。 在以上所示的結構(II)中,r8可以是H或Cle8烷基 (較佳是C2烷基)或CH2NR9R1〇,其中: (a) R9及R1G獨立地是氫、Cl_6烷基、C3_7環烷基、 〔Η環烷基-Cw烷基、C2:_6烯基、羥基_cv6烷基、Cu烷 氧基-CU6烷基;可選擇地 (b) R9可以是氫、Ci 6烷基、c3 7環烷基、c3_7環烷 基-Cw烷基、CM稀基、羥基烷基、ci6烷氧基_c 1-6 烷基,以及R 10可以是-C〇Ru,其中是氫、Ci 6烷基、
C ) R9及r1g與它們附屬的氮原子一起形成飽和的
[R12基團,其中R12是氫、C 1 -(
以選自由C1-6烧基、鹵素、 hcv6烷基、羥基-(ν6烷基、 烷基以及-COR!3所組成的族 的芳基,其中R13是氫、C 200810757 烧基、過鹵-C1-6烧基、CV6燒氧基、芳基及以一個或多個 CV6烷基、過鹵-Cw烷基、羥基-c1-6烷基或c1-6烷氧基-cv 烧基經取代的芳基; R11 〇 - R1 η各自獨立地是選自由氫;鹵;酿基;烧基(例 如,Cw烷基);經取代的烷基;烷氧基(例如,c16烷 氧基),經取代的烧氧基;浠基;炔基;環烧基;經基; 氰基,确基,疊氮基;醢胺基;肼;胺基;經取代的胺基
(例如,單烧胺基及二烷胺基);羥羰基;烷氧羰基;烷 羰氧基,烷羰胺基;氨基甲醯氧基;芳磺醯氧基;烷磺醯 氧基’ -C(R117)=N_⑼j_Rn8,其中是H、烷基、烯基、 環烧基或芳基,j是〇或丨,以及尺⑴是H、烷基、烯基、 環烷基或雜環;以及Rii9C(0)0·,其中Rii9是鹵素、胺基、 經取代的胺基、雜環、經取代的雜環或Ri2G_〇_(CH2)k_,其 中k疋11〇的整數,以及是烷基、苯基、經取代的苯 基、環烷基、經取代的環烷基、雜環或經取代的雜環所組 成的族群中;或 一 7 一 RllG或Ru❶與Rin 一起形成取代或未經取代的亞 甲二氧基^伸乙二氧基或乙烯氧基;以及 RU2疋Η或〇R’,其中R’是烧基、烯基、環烧基、函 烷基或羥烷基。 疋本基及奈基。適合的雜環(當R9及R10 與它們附屬的筒眉;—土士、 鼠原子一起日守)包括:吖口元、四氫吖唉、吡 略口定、派 ^ ^ /、甲伸乙亞胺、咪唑啶、吡唑啶、異聘唑啶、 口辰啡、N-甲萁γ ^ 四氫 σ丫庚因(tetrahydroazepine ) 、Ν- 12 200810757 甲基-四氫吖庚因、噻唑啶等。在共軛之後,剩下的喜樹鹼 類似物是指未共軛的化合物之殘基。 為了谷易説明並且非為限制,說明以7_乙基_丨〇_羥喜 樹鹼作為喜樹鹼類似物作為較佳及說明性的化合物。應理 解的疋,所主張的本發明包括所有該等衍生物及類似物, 只要類似物具有0H (例如,20·ΟΗ基)以用作為聚合物 連接的點即可。喜樹鹼或喜樹鹼類似物可以是外消旋混合 物或光學純的異構物。較佳地’例如2G⑻喜樹驗或喜樹 鹼類似物之實質上純的及活性的形式是用於多臂聚合性的 前藥中。 B.雙功能性連接子: 在本發明的特定較佳形態中,L是胺基酸的殘基。可 從任何已知的天然存在的L_胺基酸中被選出的胺基酸是, 僅列舉一些,例如,丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、 甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、曱硫胺酸、半胱胺酸、苯丙胺 φ ^酪胺I、色胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺 酸、組胺酸、脯胺酸、及/或其組合等等。在另一形態中, L可以是肽殘基。肽的大小範圍可是,例如,從約2至約 10個胺基酸殘基。 天然存在的胺基酸之衍生物及類似物,以及各種在此 技藝中已知的非天然存在的胺基酸(D或L ),無論是疏 水性或非疏水性,也被涵蓋在本發明的範疇之内。僅作為 例子’胺基酸類似物及衍生物包括·· 2_胺基己二酸、弘胺 基己二酸、/3 _丙胺酸、石-胺基丙酸、2-胺基丁酸、4_胺基 13 200810757 、 丁酸、哌啶酸、6_胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、 3 -胺基異丁酸、2 -胺基庚二酸、2,4 -胺基丁酸、鎖鍵離胺素、 2,2 -一胺基庚一酸、2,3 -二胺基丙酸、正-乙基甘胺酸、 乙基天冬醯胺酸、3-經基脯胺酸、4-經基脯胺酸、異鎖鏈 離胺素、別-異白胺酸、N-甲基甘胺酸或肌胺酸、N_甲基_ 異白胺酸、6-N-甲基-離胺酸、N-曱基纈胺酸、正纈胺酸、 正白胺酸、鳥胺酸及其他不勝枚舉,其等列舉在63 Fed. Reg. 29620、29622 ’係以引用方式納入本文中。一些較佳的l _ 基團包括甘胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸或肌胺酸殘基。更佳 地’本發明的化合物包括甘胺酸殘基以作為連接子基團 (L )。 在本發明的另一形態中,於喜樹鹼類似物及聚合物間 附著之後的L是選自由: _[C(0)]vNR21(CR22R23〇)t-、 -[C(0)]vNR21(CR22R23〇)t(CR24R25)yO_、 -[C(0)]vNR21(CR22R230)t(CR24R25)y- ^ -[C(〇)]vNR21(CR22R23)t〇-、 _[C(0)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR250)yNR26-、 -[C(〇)]vO(CR22R23)tNR26-、 -[C(〇)]v〇(CR22R23)t〇-、 _[C(0)]vNR21(CR22R23)tNR26-、 _[C(0)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR250)y_、 _[C(〇)]vNR21(CR22R23〇)t(CR24CR25)yNR26-、 14 200810757
其中 R21-R26是獨立地選自由氫、c"烷基、C2_6烯基、c2_6 炔基、C3^9分支的烷基、〇3.8環烷基、經取代的烷基、 C2·6經取代的浠基、c2.6經取代的炔基、c3-8經取代的環烧 基、芳基、經取代的芳基、芳烷基、C1_6雜烷基、經取代 的C!·6雜烧基、c1-6烷氧基、苯氧基以及Cw雜烷氧基所 組成的族群中; • R27是選自由氫、c1-6烷基、c2_6烯基、c2.6炔基、c3_19 分支的燒基、C3_8環烷基、Cl.6經取代的烷基、c2_6經取代 的烯基、C2·6經取代的炔基、c3-8經取代的環烷基、芳基、 經取代的芳基、芳烷基、雜烷基、經取代的雜烷 基、烷氧基、苯氧基、ci6雜烷氧基、N〇2、鹵烷基以 及鹵素所組成的族群中; ί及y是從約1到約4之個別選擇的正整數;以及 V是0或1。 在本發明的一些較佳形態中,化合物包括一個單元的 15 200810757 ~ 雙功能性連接子,並且因此m是1。 其他的連接子可在Greenwald等人(扔〇〇rga心设 Me山·cka/C/zemWr;;,1998,6: 551-562)的表 1 中找到, 其内容以引用方式納入本文中。 C ·多臂聚合物: 多臂PEG是在NOF公司。藥物傳遞系統目錄本第8 版( 2006年4月)中所說明者,其揭露以引用方式納入本 文中。一種特別較佳的多臂PEG具有以下結構··
其中η是正整數。 在本毛明的一個較佳具體實例中,對於聚合物的聚合 作用私度(n)是從% 攸約28至約341,以提供具有總分子量 從約5,000 Da至約6_ Da的聚合物,以及較佳是從約 m至約227’以提供具有總分子量從約2〇,_Da至%嶋
Da的承合物。这代表在聚合物鏈中的重複單元之數目 且是取決於聚合物的八工旦品— 杜日 的刀子里而疋。在本發明的一個特別較 佳具體實例中,η是約227。 ^車又 D·前藥的合成: -般而言’本發明的前藥是藉 多臂聚合物與例如每個活性位夕化的 酸共扼物,在足以右对油此盆-次夕田里的吾树鹼·胺基 放使胺基經歷與聚合物的羧酸反應並 16 200810757 形成連結的條件下反應而製備。 更特別地,方法可包括: 1)提供—當量包含可利用的2〇_羥基之喜樹鹼或喜樹 驗類似物,以^ ρ|> ^ χ 及一或夕包含可利用的叛酸基團之雙功 能性連接子; 、2 )在惰性溶劑中(例如,DCM (或DMF、氯仿、甲 苯或其混合物)),於偶聯試劑(例如,1-(3-二甲基胺丙 修基>3_乙基碳化二亞胺(EDC)(或1,3-二異丙基碳化二亞 、 ) 任何適合的一烧基碳化二亞胺、Mukaiyama 試劑(例如,2-^4-烷基-吡啶鑌齒化物)或丙烷膦酸環酐 ( CA )專專))以及適合的驗(例如,DMAP )之存 在下,將兩個反應物反應以形成喜樹鹼-雙功能性連接子中 間產物;以及 3 )在惰性溶劑中(例如,DCM (或DMF、氯仿、甲 苯或其混合物)),於偶聯試劑(例如,二甲基胺丙 φ 基)_3_乙基碳化二亞胺(EDC) 、PPAC (或153_二異丙基 石反化二亞胺(DiPC )、任何適合的二烷基碳化二亞胺、 Mukaiyama試劑(例如,2_鹵小烧基^比啶鑌鹵化物)或丙 燒膦酸環酐(PPACA)等等))以及適合的驗(例如,DMAp), 其可得自,例如,市售來源(例如,Sigma化學)或利用 已知的技術在0°C至多達22t的溫度下合成,之存在下將 每個活性位置一或多當量具有胺基的所得中間產物(在實 施例中是2當量)與一當量活化的聚合物(例如,pEG_酸) 反應。 17 200810757 在一較佳开> 怨中,7-乙基-1 〇-羥喜樹驗的丨_其是在 步驟1 )之前被保護。 工土疋 用^喜樹驗或喜樹義似物# 〇H基(例如,7_乙基_ 10-經喜樹鹼中的10-羥基)之芳香保護基是較佳的,因為 其7-乙基-10-羥喜樹鹼中間產物具有較佳的溶解度,並且 可高效率及有效地以高純度的形式而純化。例如二包含矽 烷基的保護基例如TBDPSC1、TBDMSC1及TMSC1 於 保遵吾樹驗或吾樹驗類似物中的1 經基。 活化的聚合物(也就是,包含W個末端竣酸基團的 聚合物)可例如藉由將NOF Sunbright型或其他呈有末端 OH基的分支聚合物’利用一般熟悉於此技藝者所孰知的 標準_轉換成對應的缓酸衍生物而製備。例如,參見此 處的實施例mx及共同讓與的美國專利第5,6G5州號, 其内容在此以引用方式納入本文中。 第一及第二偶聯作用劑可以是相同或不同的。 較佳雙功能性連接子基團的例子包括甘胺酸、丙胺酸、 甲硫胺酸、肌胺酸等’以及合成是在實施例中顯示。可替 代及特定的合成是在實施例中提供。 例如,本發明的化合物是在以下之中:
18 200810757
19 200810757
特別較佳的化合物是:
其中聚合物的所有4臂都經由甘胺酸而共軛到7_乙基_ 10—殘喜樹鹼。根據本發明的這個形態所進行的化合物之
HpLC分析顯示,平均而士,4彻77*1 口 9 # 〇 個乙基一l〇-羥喜樹鹼分子 疋/、軛到I個PEG分子(4重量% )。 E. 組成物/調配物·· 包含本發明聚合共軔私μ膝— 物的醫樂組成物可藉由在此技藝 20 200810757 中熟知的方法而製造,例如, 用各種已知的混合、溶解、 粒化、磨細(levigating)、乳 寸匕 包膠(encapsulating )、 ,入(entrapping)或冷象乾燥方法。組成物可結合一種或 Γ生理上可接受的載劑(包括賦形劑及辅助劑)而調配, 其可促進將活性化合物加工点 # 工成可醫樂上使用的製備物。適 备的調配物是根據所選擇的 俘旳杈予迷徑而定。非腸胃道途徑 在本發明的許多形態中是較佳的。
對於注射,包括但並不限於靜脈、肌肉内及皮下注射, 本發明的化合物可在水溶液中調配’溶液較佳是在生理上 相容的緩衝溶液(例如’生理鹽緩衝溶液)或極性溶劑(包 括但並不限於,吡咯烷g同或二甲基亞砜。 曰:合物也可例如藉由快速注射或連續式注入而調配成 非腸月道投予。用於注射的調配物可以單位劑型而呈現, 例如,在安瓶或多劑的容器中。㈣的組成物包括,但並 =限於’懸浮液、溶液、或在油性或水溶性載劑中的乳液, 亚且可包含附屬物,例如,懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。 用於非腸胃道投予的醫藥組成物包括水可溶解形式的水溶 液,例如,但並不限於,活性化合物的鹽(較佳)。此外, 活性化合物的懸浮液也可在親脂性載劑中製備。適合的親 脂性载劑包括脂肪油,例如,芝麻油、合成的脂肪酸醋(例 油乙1曰及二甘油酯)或例如微脂粒的材料。水溶性 左射懸浮液可包含增加懸浮液黏度的物質,例如,羧甲基 纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖聚糖。視需要地,懸浮液也 可包δ適合的穩定劑及/或可增加化合物溶解度的作用劑, 21 200810757 以使製備高濃縮溶液成為可能。可替代地,活性成分可以 :粉末的形式1以在㈣之前以適合的載劑(例如,無 囷、無熱原的水)構成。 對於Π服投予,化合物可藉由將活性化合物與在此技 :中热知的醫藥上可接受的載劑結合而調配。該等載劑可 的化合物被調配成旋劑、丸劑、菱形鍵、糖衣鍵、 用暴液體、凝膠、糖漿、糊劑、漿體、溶液、懸浮液、 於在W者的飲用水中稀釋的濃縮溶液及懸浮液、用於在 〜者的餐飲中稀釋的預混物等,以被患者Π服攝取。口服 2的醫藥製備物可利用固體賦形劑,視需要研磨所得到 助:口物並且處理顆粒混合物(在加入其他想要的適合辅 以獲传錠劑或糖衣錠核心而製得。有用的賦形 L 1填齊j(例如,糖類,包括乳糖、嚴糖、甘露糖 戈山梨糖醇)、纖維素製備物(例如,〗米澱粉、小麥 凝粉、稻米澱粉及馬鈴薯澱粉)以及其他物質(例如二 膠、特拉加康斯膠、甲基纖維素、㈣基_¥基纖維素、竣 甲基纖維素鈉及/或聚乙稀吨洛烧酮(p vp )如果需要 白’可添加崩散劑’例如’交聯的聚乙婦吼n各燒綱、瓊 脂或藻酸。也可使用鹽類,例如,藻酸鈉。 ^對於藉由吸入的投予,本發明的化合物可便利地以氣 溶膠噴劑的形式,利用加壓包或噴霧器以及適合的推匈 而傳遞。 4 ^化合物也可利用例如傳統的栓劑基底(例如,可可油 或其他甘油酯),而調配於直腸組成物(例如,拴劑或保 22 200810757 留灌腸劑)。 除::述的調配物之外’也可將化合物調 肉內…: 精由植人(例如,皮下或肌 當的肉内注射而投予。本發明的化合物可與適 接:口 /疏水性物質調酉己(例如’在乳液中與藥學上 二:勺油)、與離子交換樹脂調配、或調配為難溶性衍 例如’但並不限於,難溶性鹽),以用於這個投予 途徑。
/、他的傳遞系統’例如,微脂粒及乳液,也可被使用。 —卜化σ物也可利用持續釋放系統而傳遞,例如, 包含治療作用劑的固體疏水性聚合物之半通透基質。許多 持續釋放的材料ρ姑读·# 被建立’並且疋在此技藝中之人士所熟 知的、。根據它們的化學特性,持續釋放的膠囊可釋放化合 數k至夕達超過⑽&。根據特^化合物的化學特性及 生物穩定性,可使用其他的穩定化策略。 F·劑量: 治療有效量是指有效於預防、減輕或緩和可受喜樹鹼 或相關一似物(也就是,7乙基·1(),喜樹驗)影響的症 狀之化合物的量。治療有效量的測定是充分在熟悉於此技 藝者的能力内,特別是依照此處之揭露。 對於在本發明方法中所使用的任何化合物,治療有效 1可從試管内的分析中初步估計。接著可調配劑量以用於 動物杈式,以便達成可包括有效劑量的循環濃度範圍。該 等貝讯可接著用於更精確地測定有效於患者的劑量。 23 200810757 此處所說明的化合物之毒性及治療功效,可藉由在細 胞培養或實驗動物中的標準藥學程序,利用在此技藝中孰 知的方法而測定。當然,劑量可根據劑型及投予途徑而改 變。確實的調配物、投予途徑以及劑量,彳由個別醫師考 量患者的症狀而選擇。然而,一般而t,對於本發明化合 物的全身性傳遞,目前較佳的劑量範圍將從約i至約ι〇〇 mg/kg/週,以及較佳是從約2至約6〇 mg/kg/週。
組成物可母天投予一次或分成多個劑量其可作為多 週治療方法的部分而給予。精確的劑量將取決於症狀的階 段及嚴重性、腫瘤對於聚合物·前藥組成物的敏感性以及要 被治療的患者之個人特質而定,#同將由-般熟悉於此技 藝者所理解。 G.治療方法: 有L於以上祝明’本發明也提供治療哺乳動物的方法, 其包括將治療有效量的式⑴之本發明化合物投予至有需 =的患者,其巾D是生物活性的分子部分,也就是,喜樹 似物。在本發明的較佳形態中,d是7·乙基-I。.羥直 樹鹼的殘基。 工η X月的另形恶係提供在哺乳動物中治療各種醫療 方法。相較於其他疾病,組成物是特別有效於在哺 子L勳物中、;Λ、爽k 預防^ α療新 (neoplasm)疾病、減少腫瘤負擔、 形能中 轉移以及預防踵瘤/新生物生長的復發。在另— 淋:疒,、破治療的癌症可以是以下一種或多種:固態腫瘤、 4、小細胞肺癌、急性淋巴細胞白血病(ALL· )、胰 24 200810757 臟癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、胃癌等。 被投予的組成物的量(例如# 便用作為刖樂)將取決 於包括在其中的母體分子而定。一 飯而3 ’用於治療方法 中的前藥的量是可以在哺乳動物中 切初中有效達到所要治療結果 的量。天然地’各種前藥化合物的劑量將取決於母體化合 物、活體内水解速率、聚合物的分子量等而有猶微改變。 一般而言,喜樹驗的聚合性酯粉崦 曰竹生物以及相關組成物是以 範圍從約1至約1〇〇 mg/kg/週的旦 s 的里而投予,以及較佳是從 約2至約60 mg/kg/週的|而如& g g k扪里而技予。以上所列舉的範圍是說 明性的,以及熟悉於此技藝者蔣 贫有將根據臨床經驗及治療指示 而決定所選擇的前藥之最適給藥。 在本發明的另一形態中’治療方法包括將有效量的此 處所說明之化合物,投以有可藉由拓普異構酶干擾而治 療的症狀之有需要的哺乳動物或患者。 實施例 以下的實施例係用以提供本發明進一步的理解,但絕 非欲以任何方式限制本發明的有效範圍。在實施例中列出 的晝底線及粗體數字係對應於第〗_5圖所示者。 -艘方法:所有的反應都是在乾燥的氮氣或氬氣氣氛 下進行。使用市售的試劑而無進一步純化。所㈣pEG化 合物在使用之前,都在真空下或從ψ苯中藉由共沸蒸餘而 乾燥。除非有其他不同的指明,否則“CNMR光譜是在75 46 MHz,利用Varian Mercury0 3〇〇 Nmr光譜儀,並且以氣 化的氯仿及甲醇作為溶劑而獲得。化學位移("是以從 25 200810757 四曱基矽烷(TMS )起的百萬分之一(ppm )低磁場而報 HPLC方法:反應混合物以及中間產物及最終產物的 純度’是藉由 Beckman Coulter System Gold® HPLC 儀器而 監測。它使用ZOBAX® 3 00SB C8反相管柱(150χ4·6 mm) 或 Phenomenex Jupiter® 300A C18 反相管柱(150χ4·6 mm ), 具有多波長的UV偵測器,利用10-90%乙腈於〇·〇5%三 貌醋酸(TFA )中的梯度,流速1 mL/min。 實施例1 : 4臂_PEG-tBu酯(化合物2 ): 將 40k 4 臂-PEG-OH ( 12.5 g,1 eq·)與 220 mL 的甲苯 共沸,以移除35 mL的曱苯/水。將溶液冷卻至3〇°c,並 且加入1·0 Μ於第三-丁醇中的第三-丁醇鉀(3·75 mL,3 eq x4=12 eq·)。將混合物於30°C攪拌30 min ,然後加入演 醋酸第三-丁基酯(0.975 g,4 eq.x4 = 16 eq. ) 〇將反應在 30°C維持1小時,然後等卻至25°C。將150 mL的乙醚緩 慢加入以將產物沈澱。將所得的懸浮液冷卻至丨7〇c,並且 在17°c保持半小時。將粗產物過濾,並將濕的濾餅以乙醚 清洗兩次(2x125 mL)。將分離的濕濾餅溶解在5〇 mi的 DCM,並將產物以350 ml的乙醚沈澱,並且過濾。將濕的 濾餅以乙醚清洗兩次(2x125 mL )。將產物在真空下以4〇 。(:乾燥(產率= 98%,12.25 g) 。% NMR (75·4 MHz, CDC13) : 5 27.71, 68.48-70.71 ( PEG) 5 80.94, 168.97 〇 實施例2:4Gk4臂-PEG酸(化合物3):
將碰4臂-PEG-tBu醋(化合物2, 12g)溶解在i2〇mL 26 200810757 的DCM,然後加入60 mL的TFA。將混合物於室溫攪拌3 小時,然後將溶劑在真空下於35t移除。將所得的油狀殘 留物洛解在37.5 mL的DCM。將粗產物以375 mL的乙醚 沈澱。將濕的濾餅溶解在30 mL的〇5%NaHC〇3。將產物 以DCM萃取兩次(2x150 ml)。將結合的有機層在2·5 g 的MgS〇4上乾燥。將溶劑在真空下於室溫移除。將所得的 殘留物洛解在37.5 mL的DCM,並將產物以3〇〇 mL的乙 醚沈澱,並且過濾。將濕的濾餅以乙醚清洗兩次(2χΐ25 ml)。將產物在真空下以4(rc乾燥(產率= 9〇%,i〇75g)。 -C NMR( 75.4 MHz? CDC13 ) : 5 67.93^71.6( PEG), 170.83 〇 實施例3 : TBDPS-(l〇)-(7•乙基_1〇_羥喜樹鹼)(化合 物5): 將 Et3N ( 4·3 mL,30.5 8 mmo卜 6 eq·)及 TBDPSC1 ( 7.8 mL,30.58 mmol,6 eq.)加到7_乙基_1〇-羥喜樹鹼(化合 物 4 ’ 2·0 g,5.10 mmo卜 1 eq·)於 1〇〇 mL 無水 DCM 的 懸浮液中。將反應混合物加熱以迴流隔夜,然後以〇 ·2 N 溶液(2x50 mL)、飽和的NaHC〇3溶液(1〇〇 mL)及濃 鹽水(100 mL )清洗。將有機層在MgS〇4上乾燥、過濾並 且在真空下瘵發。將殘留物溶解在無水DCM中,並且藉 由加入己烷而沈澱。重複以DCM/己烷沈澱以除去過量的 tbDPSC1。將固體濾出並且在真空下乾燥,得到2〇9 g的 產物(65% 產率)。NMR (300 MHz,CDC13): δ 0.90 (3 H, t,J = 7.6Hz),1.01(3H,t,J = 7.3Hz),1.17(9H,s),L83· 1.92 (2Η,m),2·64 (2Η,q,6.9 Ηζ),3·89 (1 Η,s,ΟΗ),5.11 27 200810757 (2H,s),5·27 (ΓΗ,d,J = 16.1 Ηζ),5·72 (1H,d,J = 16.4 Hz〇, 7.07 (2 H,d,J - 2.63 Hz),7.36-7.49 (7 H, m),7·58 (1 H,s), 7·75-7·79 (4H,m),8·05 (1 H,d,J = 9·4 Hz)。13C NMR (75.4 MHz, CDC13): δ 7.82,13.28,19.52,22.86,26.48,31.52, 49.23,66.25,72.69,97·25,110.09,ιΐ7·57,125.67,126.57, 127.65,127.81,130.02,131.69,131.97,135·26,143.51, 145·05,147·12,149·55,149.92,154.73,157.43, 173.72。 實施例4: TBDPS_(l〇)_(7·乙基_ι〇_羥喜樹鹼χζο)-
Gly-Boc (化合物 6): 將 EDC( 1.72 g,8.99 mmol,1.5 eq·)及 DMAP( 329 mg, 2·69 mmo卜 0.45 eq·)加到 TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羥喜樹 鹼)(化合物 5,3.78 g,5.99 mmol,1 eq·)及 Boc-Gly-OH (1.57 g,8,99 mmol,1·5 eq.)於 loo mL 無水 DCM 中的 〇 C溶液。將反應混合物於〇°c攪拌,直到HPLc顯示原料 完全 >肖失為止(大約1小時45分鐘)。將有機層以0.5% NaHC03 溶液(2x50 mL)、水(1χ5 0 mL) 、0.1 N HC1 溶 液(2x5 0 mL)及濃鹽水(1><50111[)清洗;並且在]^8〇4 上乾燥。在過濾以及在真空下蒸發之後,得到4.94 g的粗 產物(定量的產率)。將粗固體用於下一個反應而無進一 步純化。1H NMR (300 MHz,CDC13): δ 0.89 (3 H,t,J = 7.6 Ηζ),0·96 (3 Η,t,J = 7.5 Ηζ),1·18 (9Η,s),1·40 (9Η,s), 2·07-2·29 (3Η,m),2·64 (2Η,q,7.5 Ηζ),4.0卜4.22 (2Η,m)5 5·〇〇 (1 Η, br s),5.01 (2Η,s),5·37 (1Η,d5 J = 17·〇 Ηζ),5·66 (1Η,d,J = 17·0 Ηζ),7·08 (1 Η,d,J = 2.34 Ηζ),7·16 (1Η,s), 28 200810757 7·37-7·50 (7 H,m),7·77 (4H,d,J = 7.6 Hz),8.05 (1 H,d,J = 9.4 Hz)。13C NMR (75·4 mHz,CDC13): δ 7.52, 13.30, 19.50, 22.86, 26.45, 28.21,31.64, 42.28, 49.14, 67.00, 76.65, 79.96, 95.3 1, 1 10.13, 1 18.98, 125.75, 126.45, 127.68, 127.81? 130.03,131.54,131.92,135.25,143.65,144.91,145.19, 147.08, 149.27, 154.75, 155.14, 157.10, 166.98, 169.17。
實施例5 : TBDPS_(10)_(7·乙基-10-羥喜樹鹼)_(20)-GlyHCl (化合物 7): niL的4 M HC1於二聘烷中的溶液加到 將 (10)-(7-乙基-10-羥喜樹(化合物6,i g, 1.27 mmol)於5 mL無水二聘烷的溶液中。將反應混合物 於室溫中攪拌,直到HPLC顯示原料完全消失為止(1小 % )。將反應混合物加到50 mL的乙醚中,並且過濾所得 到的固體。將固體溶解在50 mLDCM,並以濃鹽水清洗(藉 由加入飽和的NaHC〇3溶液而將pH調整至2 5)。將有機 層在MgS04上乾燥、過據並且在真空下蒸發。將殘留物溶 解在5 mL的DCM ’並且藉由加入5〇虹乙喊而沈澱。過 濾得到77〇 mg (㈣產率)的最終產物。1h nmr (鳩顧z CDCl3po.84(3H,t,J = 7.6Hz),1〇5(3Htj = 73Hz),, 1.16 (9H, s), 2.15-2.30 (3H, m), 2.59 (2H, q, 7.6 Hz), 4.16 (1H, d, J = 17.9 Hz), 4.26 (1H, d, J = ! 7>9 Hz), 5.13 (2H, s),
5.46 (1H, d, J = 17.0 Hz), 5.60 (1H, d, J = 17.〇 Hz), 7.11 (1 H, d5 J = 2.34 Hz)5 7.30 (1JJ c\ 7 λ f\ 7 r λ {c TT V ,S),7·40·7·51 (6 H,m)5 7.56 (1H,dd J = 2.34, 9.4 HZ), 7.77 (4H,dd,J = 7.6il.6Hz) 7 98 (1 H>ci; 29 200810757 J = 9·1 Hz)。13C NMR (75.4 MHz,CDC13): δ 8.09,13.72, 20.26, 23.61,26.94, 31.83, 41.01,50·71,67.62, 79·51,97·〇3, 111.65,119.69,127.13,128.97,128.99,129.11,13143, 13 1.96,133.00,133·03,136·51,145.62,145.81,147.24, 148.29,150.58,156·27,158.68,167.81,168.34。 實施例 6:4(>k4 臂-PEG_Gly-(20)-(7-乙基-10_ 羥喜樹 鹼)-(10)-TBDPS (化合物 8):
將 TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)-(2〇)_GlyHCi(化 合物7,207 mg,0·29 mmo卜每個活性位置2.0 eq· )、DMAP (175 mg,1·44 mmo卜 10 eq·)及 PPAC ( 0·85 mL 的 50 % 溶液於 EtOAc 中,1 ·44 mmol,1 〇 eq.),加到 4〇k 4 臂.
PEGCOOH (化合物 3 ’ 1.4 g ’ 0.036 mmol,1 eq·)於 14 mL 的無水DCM溶液中。將反應混合物在室溫中攪拌隔夜, 然後在真空下蒸發。將所得到的殘留物溶解在DCM,並將 產物以乙醚沈澱,並且過濾。將殘留物以DMF/IPA再結晶, 得到產物(1.25 g) 。13C NMR (75.4 MHz,CDC13)·· δ 7.45, 13.20, 19·39, 22.73, 26·42, 31.67, 40.21,49.01,66.83, 95.16, 110.02,118.83,125.58,126.40,127.53,127.73,129.96, 131.49,131_76,131.82,135.12,143.51,144.78,145.13, 146.95, 149.21,154.61,156.92, 166.70, 168.46, 170.30。 實施例7 : 4Gk 4臂-?£〇-〇以(20)-(7-乙基-ΐ〇-羥喜樹驗) (化合物9): 將 TBAF ( 122 mg ’ 〇·46 mmol,4 eq.)於 THF 及 0.05 M HC1 >谷液(12·5 mL )的1 : 1混合物中之溶液,加到化 30 200810757 合物術4臂-PEG-Gly-(20)-(7-乙基-10、經喜樹驗)_(ι〇)_ TBDPS (化合物8,1 ·25 g )。將反應混合物在室溫中擾拌 4小時,然後以DCM萃取兩次。將結合的有機相在MgS〇4 上乾燥、過濾並且在真空下蒸發。將殘留物溶解在7 mL 的DMF ’並以37 mL IPA沈澱。將固體過濾出,並以IpA 清洗。重複以DMF/IPA的沈澱。最後,將殘留物溶解在2·5 mL的DCM,並且藉由加入25 mL的乙醚而沈澱。將固體 過濾出,並且在在真空烘箱中以40。〇乾燥隔夜(86〇 mg)。 13C NMR (75_4 MHz,CDC13): δ 7.48,13.52,22.91,31.67, 40.22,49.12,66·95,94.82,105.03,118.68,122.54,126·37 128.20,131.36,142.92,144.20,144.98,147.25,148.29, 156.44,156.98,166·82,168.49,170.39。這個 NMR 數據顯 示沒有PEG-COOH的訊號,代表所有的c〇〇H都被反應。 以同由螢光偵測所測定的裝載經發現是3·9,其與乙基· 1 0-羥喜樹鹼在聚合物的4個分支的每一個上之完全裝載一 致。以更大的規模重複進行這個實驗,得到一致的結果。 實施例8 : Boc_(10)-(7-乙基4恥羥喜樹鹼)(化合物 10): 將二_第三-丁基重碳酸酯(1·764 g,13 eq)及無水 吡啶(15·2 mL,30 eq.)在氮氣下於室溫加到7_乙基_1〇_ 羥喜樹鹼(化合物4,2.45g,leq·)於250 mL無水dCM 的懸子液中。將懸浮液於室溫中攪拌隔夜。將薄霧狀的溶 液、、工由賽力4寸(ceilte) ( 1〇 g)而過濾,並將濾液以n HC1⑺洗三次(3χ15〇 mL)及以Ν^〇〇3飽和溶液清洗一 31 200810757 次(1x150 ml)。將溶液在MgS〇4上乾燥(125§)。將 溶劑在真空下以30Ό移除。將產物在真空下以4(rc乾燥 (產率=82%,2.525 g)。NMR (75·4 MHz, CDC13) § 173.53,157·38,151.60,151.28,150.02,149.70,147·〇〇, 146.50,145.15,131.83,127.19,127_13,124.98,118.53, 113.88,98.06,84·26,72.80,66.18, 49·33,31.62,27.73 23.17, 13.98, 7·90 〇 實施例 9 : Boc_(10)-(7_ 乙基-1〇-羥喜樹驗)-(2〇)-Ala-
Bsmoc (化合物 11 ): 將 EDC ( 0.51g,2.67 mmol)及 DMAP ( 0.065g,0.53 mmol )於〇°C時加到Boc-(10)-(7-乙基-i〇-羥喜樹鹼)(化 合物 10,0.85g,1.71 mmol)及 Bsmoc-Ala ( 0.68g,2.30 mmol )於無水CH2C12 ( 20 mL )的溶液中。將混合物在氮 氣下於0°C攪拌45分鐘,然後回溫至室溫。當反應的完成 藉由HPLC確認時,將反應混合物以1 % NaHC03 ( 2x50 ml) 、H20 ( 50 mL)及 0·1 N HC1 ( 2x50 mL)清洗。將有 機相以無水MgS04乾燥並且過濾。將溶劑在減壓下移除。 將所得到的固體在真空下以低於40°C乾燥隔夜,得到1.28 g 的產物,產率為 95%。13C NMR (75.4 MHz,CDC13) δ : 171· 16,166.83,157.16,154.78,151.59,151.33,149.82, 147.17,146.68,145.35,145.15,139.08,136.88,133·60, 131.83,130.45,130.40,130.33,127.40,127.08,125.32, 125.14, 121.38,120.01,114.17, 95·9Ό,84·38, 77.19, 76.64, 67.10, 56.66, 53·45, 49.96, 49.34, 31.7, 27·76, 17.94, 14.02, 32 200810757 7·53。ESI-MS,786·20 [Μ + H]+。 實施例10 : Boc-(10)-(7·乙基-10-羥喜樹鹼H20)-Ala (化合物12):
將 Boc-(1〇)_(7-乙基-10-羥喜樹鹼)-(20)-Ala-Bsmoc (化 合物 11,4·2 g,5.3 5 mmol)及 4-哌啶基哌啶(1.17g,6.96 mmol)於無水CH2C12 ( 200 ml )中的溶液,在室溫攪拌5 小時。然後將這個混合物以〇·1 N HC1 ( 2x40 ml)清洗, 然後將有機層在無水MgS04上乾燥。將這個溶液過濾,並 且藉由真空蒸餾而將溶劑移除,得到2·8 g的產物,具有93 %的純度’係由HPLC所測定。將這個產物藉由以乙醚研
製(3x20 ml),然後以乙酸乙酯研製(4x20 ml)而進一 步純化’得到1.52 g( 2.70 mmol ),具有純度97%。13C NMR (75·4 MHz,CDC13) δ 168.39,166.63,156.98,151.20,151.15, 149.69,146.67,146.56,145.37,144.53,131.66,127.13, 124.99’ 119.80,113.82,96·15,84.21,77·67,67.16,49.48, 49_06,31.56,27.74,23.14,15·98,13.98,7·57。 實施例11 · 4“ 4臂_peg_A1M20)_(7-乙基_10_襄喜樹 驗)-(10)-Boc (化合物 13): 將Boc (10)-(7-乙基經喜樹驗)-(2〇)_Ala (化合物 ,L50 g,2·5 mm〇1)及 4 臂 PEG-C〇〇h(化合物 3,ι〇 〇1 g,L〇mm〇1)於室溫中加到無水CH2Cl2(1〇〇mL)。將 溶液冷卻至〇°c,然後加入FnrY Λ 0〇 t ^ 、
1 夂刀口入 EDC( 0.29 g,1·5 mm〇l)及 DMAP (0.30 g 2·5 mmol )。將混合物在氮氣下於〇。〇攪拌^小 時。接著將其保持在室溫φ陪爲 脸、々w上 主皿中隔仪。將溶劑在減壓下蒸發。 33 200810757 將殘留物溶解在40 mL的DCM,並將粗產物以乙醚沈澱 (300 mL )。將得自過濾的濕固體於65°C溶解在DMF/IPA 的混合物中(60/240 mL )。在2-3小時之内使溶液冷卻至 室溫’並且將產物沈澱。接著,將固體過濾出,並以乙醚 清洗(2x200 mL )。將濕的濾餅在真空下以低於4〇。〇乾燥 隔夜,得到8·5 g的產物。 實施例 12 : 4Gk 4 臂 _PEG-Ala-(20)-(7-乙基-10-羥喜樹 • 松)(化合物14) 將 40k 4 臂-PEG-Ala-(20)-(7_ 乙基·1〇-經喜樹驗)_(1〇)_ B〇c(化合物13, 7·98 於室溫加到3〇% TFA於無水CH cu Z It 的溶液中(1 3 〇 mL )。將混合物攪拌3小時,或直到原料 的/肖失係藉由HPLC確認為止。將溶液在真空下於35 °C儘 可能移除。將殘留物溶解在50 mL的DCM,並將粗產物以 乙醚(350 mL)沈澱,並且過濾。將濕的固體於65°c溶解 在DMF/IPA的混合物中(50/200 mL)。使溶液在2-3小 φ %之内冷卻至室溫,並將產物沈澱。接著將固體過滤出, 並以乙醚清洗(2x200 mL )。將濕的濾餅在真空下以低於 乾燥隔夜,得到6·7 g的產物。13C NMR (75.4 MHz, CDC13) δ : 17〇·75, 169.30, 166.65, 157.00, 156.31,148.36, ΐ47·19,145.03,144.29,143.00,131·49,128.26,126.42, 122·47, 1 18.79, 105.10, 94.57, 78.08, 77.81,77.20, 71.15, 7〇·88, 70.71,70.33, 70.28, 70.06, 69·93, 69.57, 66.90, 49.14, 47.14, 31.53, 22.95, 17.78, 13.52, 7.46。 實施例13 : Boc_(10)_(7_乙基-1〇-羥喜樹驗卜(2〇)-Met· 34 200810757
Bsmoc (化合物 15 ): 將 EDC ( 1.64g,8.59 mmol)及 DMAP ( 0.21g,1·72 mmol)於〇°C時加到Boc-(10)-7-乙基-10-羥喜樹鹼(化合 物 10’ 2·73 g’ 5.53 mmol)及 Bsmoc-Met( 3.19 g,8.59 mmol) 於無水CH2C12 ( 50 mL )的溶液中。將混合物在氮氣下於 〇°C攪拌45分鐘,然後回溫至室溫。當反應的完成係藉由 HPLC確認時,將反應混合物以i%NaHC03 ( 2x100 ml)、 H20 ( 100 mL)及 〇·1 N HC1 ( 2xl〇〇 mL)清洗。將有機相 以無水MgS〇4乾燥,並且過濾。將溶劑在減壓下移除。將 所得到的固體在真空下已低於40°C乾燥隔夜,得到4.2 g 的產物,具有 88% 的產率。13C NMR (75.4 MHz,CDC13) δ: 170.3, 166.8, 157·1,155·2, 151·4, 151.2, 149.7, 147·0, 146·6, 145.3, 145·1,138.9, 136.6, 133.5, 13 1.7, 130·5, 130.3, 130.2, 127.3,127.0,125.3,125·1,121·2,119.8,114.1,96.1,84.3, 76.7, 67.0, 56.7, 53.5, 53.4, 49·3, 31.6, 31.0, 29.7, 27.7, 23·1· 1 5 ·4’ 13 .9,7.4; ESI-MS,846·24 [Μ + Η]+。 實施例 14 : B〇C_(l〇)-(7-乙基羥喜樹鹼)-(2〇)-Met NH2.HC1 (化合物 16 ): 將 Boc-(l〇)-(7_ 乙基 _1〇•羥喜樹鹼(化 合物 15,4.1 g,4.85 mmol)及 4·哌啶基哌啶(1〇6 g,6 31 mmol )於無水CH2cl2 ( 2〇〇 mL )的溶液在室溫中攪拌$ 小時。接著將這個混合物以〇.丨N HC1 (厶4〇㈤丨)清洗, 然後將錢層在無水MgS〇4上乾燥。將這個溶液過渡,並 將’合J藉由真空瘵餾而移除,得到28 g的產物,具有約π 35 200810757 ' %的純度,係由HPLC所測定。將這個產物籍由以乙鱗(3 x2〇 ml)研製,然後以乙酸乙酯(4><2〇 ml )研製而進一步
純化,得到1.54g,具有97%的純度。13CNMR(75.4]VmZ CDC13) δ: 167.2,166.5,156.9,151.12,150.9,149.8,146 3 145.9, 145·8, 144.9, 131.3, 127.2, 127.0, 125.1,119·6, 113 8 96·7, 84.3, 78·2, 67.0, 60·4, 52.2, 49.4, 31.4, 29.6, 29.1,27.7 23.2, 15·1,13.9, 7.7。 實施例15 : 4Gk 4臂彳£〇-]\1以-(20)-(7-乙基-10_趣喜樹 • (化合物 17): 將Boc-(l〇)-(7-乙基-10-經喜樹驗)-(2〇)-Met (化合物 16,1·48 g,2·25 mmol)及4臂-卩£0-(:0011(化合物3,9〇 g,〇.9mmol)於室溫加到無水CH2Cl2(80mL)的溶液中。 將溶液冷卻至0°C,然後加入EDC ( 〇·26 g,1·35 mmol) 及DMAP ( 〇·27 g,2·25 mmol)。將混合物在氮氣下於〇 C擾拌1小時。接著將其保持在室溫中隔夜。將反應混合 ❿ 物以 70 ml 的 CH2C12 稀釋、以 30 ml 的 0·1 N HC1/1M NaCl 水溶液萃取。在有機層以MgS〇4乾燥之後,將溶劑在減壓 下蒸發。將殘留物溶解在40 mL的Ch2C12,並將粗產物以 乙沈澱(300 mL )。將源於過濾中所得到的濕固體於65 °C溶解在270 mL的DMF/IPA中。使溶液在2_3小時之内 冷卻至室溫,並將產物沈澱。接著將固體過濾出,並以乙 醚清洗( 2x400 mL)。重複上述在DMF/IpA中的結晶步 驟。將濕的濾餅在真空下以低於4(TC乾燥隔夜,得到7〇g 的產物。NMR (75.4 MHz,CDC13) δ:169·8, 169 6, 166 5, 36 200810757 156.9, 151·2, 151.1,149.9, 147.0, 146·6, 145.0, 131.7, 127,1, 126.8, 124.9, 1 19.7, 1 13.8, 95.5, 84.1,70.1,69·9, 66.9, 50·7, 49.2, 31.5, 31.2, 29·6, 27.6, 23·1,15·3, 13·9, 7.5。 實施例16 ·· 4❶k 4臂-pEG_Met_(20)_(7_乙基-10-羥喜樹 驗)(化合物18 ) ·· 將一甲基亞颯(2.5 mL)及 4 臂-PEG-Met-(20)-(7-乙 基-10-羥喜樹鹼(化合物17,6 〇 g)在室溫加 到3 0%TFA於無水CH2C12 ( 100 mL)的溶液中。將混合 物攪拌3小時,或直到原料的消失係藉由Hp]LC確認為止。 將溶劑在真空下於35°C儘可能移除。將殘留物溶解在5〇mL 的CH2Ci2,並將粗產物以乙醚(35〇ml)沈澱,並且過濾。 將濕的固體於65°C溶解在DMF/IPA ( 60/300 mL)的混合 物中。使溶液在2-3小時之内冷卻至室溫,並將產物沈澱。 接著將固體過濾出,並以乙醚(2x2〇〇 mL )清洗。將濕的 濾餅在真空下以低於40°C乾燥隔夜,得到5·ΐ g的產物。i3c NMR (75·4 MHz,CDC13) δ :169·7,166.6,157.0,156:3,148.4, 147.3, 145.0, 144.4, 142.9, 131.5, 128.3, 126·4, 122·5, 118.7, 105.2,94.7,78.1,67·0,50·7,49.2,31.6,31.3,29.7,23.0, 15.3,13.5, 7·5 ; 7-乙基-10-羥喜樹鹼與peg的比例:2.1% (重量)。 實施例 17: Boc-(10)-(7-乙基 _1〇_致喜樹驗)_(2〇)_Sar·
Boe (化合物19): 將 Boc-Sar_OH ( 432 mg,2.287 mmol )加到 Boc-(IO)- (7-乙基-10-羥喜樹鹼)(化合物ι〇,750 mg,1·52 mmol) 37 200810757 於75 mL DCM的溶液中,並且冷卻至0°C。加入DMAP( 432 mg,2.287 mmol )及 EDC ( 837 mg,0.686 mmol ),並將 反應混合物從〇°C至室溫攪拌1.5小時。然後將反應混合 物以 0·5 % NaHC03 清洗(75 mLx2 )、以水清洗(75 1111^2), 並且最終以0·1 N HC1清洗(75 mLxl )。將二氯甲烷層在 MgS04上乾燥,並將溶劑在真空下蒸發以及乾燥。產率= 0.900 mg ( 89% )。結構係由NMR所確認。 實施例18 : 7-乙基-10-羥喜樹鹼-(20)-SwTFA (化合 春物20): 將 Boc-(10)-(7-乙基-10-羥喜樹鹼H20)-Sar-Boc (化合 物 19,900mg,1.357 mmol )加到 4 mL TF A 及 1 6 mL DCM 的溶液中,並且在室溫攪拌1小時。將反應混合物與甲苯 於3 0°C蒸發。將殘留物溶解在10 mL的011(:13,並且以乙 醚沈殿。將產物過濾並且乾燥。得到700 mg ( 1.055 mmol, 78% )。13CN]\m(67.8MHz,CDCl3)δ 168.26, 167.07, 158.84, 158.71,148.82, 147.94, 147.22, 146.34, 144.04, 131.18, 130.08, 128.97, 124.46, 119.78, 106.02, • 97.23, 79.84, 79.34, 66.87, 50.84, 49.86, 31·81,23.94, 15.47, 13.84, 8·08。 實施例19 : TBDMS-(10)_(7-乙基-10-羥喜樹綸)·(20> Sai-HCl (化合物 21) ·· 將7-乙基-10-羥喜樹鹼-(20)-Sai-TFA(化合物20, 2.17 g,3 ·75 mmol,1 eq.)於無水 DMF ( 30 mL)中的溶液, 以 200 mL 的無水 DCM 稀釋。加入 Et3N ( 2.4 mL,17·40 mmol,4.5 eq·),然後再加入 TBDMSC 1( 2.04 g,13_53 mmol, 3.5 eq·)。將反應混合物在室溫攪拌,直到HPLC顯示原 38 200810757 料消失為止(大約1小時)。將有機層以〇 5%NaHC〇3清 洗兩次,以水清洗一次,並且以濃鹽水飽和的〇1 N HC1 /容液清洗兩次,然後在MgS〇4上乾燥。在過濾以及在真空 下將溶劑蒸發之後,將所得到的油溶解在DCM。加入乙醚 得到固體,將該固體利用細或中的布氏漏斗而過濾(2. 〇〇 g ’ 87%產率)。固體的HPLC顯示96%的純度。1H NMR 及 13C NMR 確認了 結構。4 NMR (300 MHz,CD3OD): δ 0.23 (6Η,s),〇·96 (9Η,s),〇·98 (3 H,t,J = 7.3 Ηζ),1.30 (3 H,t,J =7·6 Hz),2.13-2.18 (2H,m),2·67 (3H,s),3.11 (2 H,q,J = 7.6 Hz),4.10 (1H,d,J = 17.6 Hz),4.22 (1H,d,J = 17.6 Hz), 5.23 (2 H,s),5.40 (1 H,d,J = 16·7 Hz),5·55 (1H,d,J = 16·7 Hz),7.32 (1H,s),7.38·7·43 (2H,m),8.00 (1H,d,J = 9.1 Hz). 13C NMR (75·4 MHz,CD3OD): δ -4·14, 8·01,14.10, 19.30, 23·98, 26.16, 31.78, 33.52, 49.46, 5G.95, 67·66, 79.8G,97.41, 111·96,119.99,127.75,129.28,129.67,131.57,145·24, 146.86,147.16,148.02,150.34,156.69,158.72,167.02, 168.27 〇 實施例 20 ·· 4°κ 4 臂-PEG-Sar-(20)-(7-乙基-10-羥喜樹 驗)-(l〇)-TBDMS (化合物 22) ·· 將 ΤΒΟΜ8-(10)-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)-Sai-HCl (化合 物 21,1.53 g,2.5 mmol,2.5 eq.)於 20 mL 無水 DMF 的 溶液,加到 4()K4 臂 _PEG-COOH(化合物 3, 10 g,0.25 mmo卜 1 eq_ )於150 mL無水DCM的溶液中,並將混合物冷卻至 〇°C。將 EDC ( 767 mg,4 mmo卜 4 eq.)及 DMAP ( 367 mg, 39 200810757 3 mmol,3 eq.)加到這個溶液中,並使反應混合物緩慢回 溫至室溫,並且在室溫中攪拌隔夜。接著,將反應混合物 在真空下蒸發,並將殘留物溶解在最少量的DCM中。在 加入乙醚之後形成固體,並且將固體在真空下過濾。將殘 留物溶解在30 mL的無水CH3CN,並且藉由加入600 mL 的IPA而沈澱。將固體過濾出,並以IP A及乙醚清洗,得 到產物(9.5 g )。結構係由NMR所確認。 實施例 21 : 40K 4 臂-PEG-Sar-(20)-(7-乙基 _10_ 羥喜樹 _ 鹼)(化合物23): 方法A:將4GK 4臂-PEG-Sar-(2〇H7-乙基-10·羥喜樹 鹼)-(10) TBDMS (化合物 22)溶解在 TFA 於 H20 ( 200 mL) 的5 0%混合物中。將反應混合物在室溫攪拌1 0小時,然 後以100 mL的H20稀釋,並以DCM萃取(2x300 mL)。 將結合的有機相以H20清洗(2x100 mL)、在MgS04上 乾燥、過濾並且在真空下蒸發。將殘留物溶解在1 00 mL 的無水DMF,以加熱槍溫和地加熱,並且藉由緩慢加入400 ® mL的DMF而沈澱。將固體過濾出,並以20%DMF於IPA 及乙醚清洗。將固體溶解在DCM,並以乙醚沈澱(6·8 g)。 結構係由NMR確認。 方法B:將4GK 4臂-PEG-Sar_(2〇H7-乙基-10-羥喜樹 鹼)-(10)-TBDMS ( 1 g)溶解在 10 mL 的 IN HC1 溶液中。 將反應混合物在室溫攪拌1小時(由HPLC檢測),然後 以DCM萃取(2x40 mL)。將有機層在MgS04上乾燥、 過濾並且在真空下蒸發。將所得到的亮黃色殘留物溶解在 40 200810757 10 mL的DMF (以加熱槍稍微加熱),然後加入40 mL的 IPA。將所得到的固體過濾出,並且在真空烘箱中以40°C 乾燥隔夜。結構係由NMR所確認。 生物學數據 實施例22 :毒性數據 4-臂PEG共軛的7-乙基-10-羥喜樹鹼之最大耐受劑量 (MTD )是利用裸鼠而研究。對於死亡及疾病的徵候監測 小鼠14天,並且當體重喪失> 20%治療前的體重時將小 鼠犧牲。 表1顯示每個化合物對於單劑及多劑投予之最大耐受 劑量。對於多劑投予,每個劑是每隔一天給予小鼠共10 天,並且觀察小鼠另外4天,因此總共是14天。 表1 :在裸鼠中的MTD數據 化合物 劑量水平 (mg/kg) 存活/總數 評論 化合物9 單劑 25 5/5 30 5/5 35 4/5 使小鼠安樂死因為>20%的體重喪失 化合物9 多劑* 10 5/5 15 3/5 使小鼠安樂死因為>20%的體重喪失 20 0/5 使小鼠安樂死因為>20%的體重喪失 當以單劑給予時,對於4臂-PEG_Gly-(7-乙基-10-羥喜 樹鹼)(化合物9)發現到MTD是30 mg/kg,以及當以多 劑給予時,發現到MTD是10 mg/kg ( q2dx5 )。 41 200810757 實施例23 :試管内的數據 在表2中,細胞毒性(可導致IC5。的每個化合物的mM) 提供每個化合物的試管内抗腫瘤效價之指標。這個研究是 用於測定4-臂聚乙二醇化的7-乙基-10-羥喜樹鹼共軛物的 聚乙二醇化作用之效果。PEG-Gly-('乙基-10-羥喜樹鹼)、 7-乙基-10-羥喜樹鹼及CPT-11的試管内細胞毒性,是利用 MTS分析而測定。將細胞於37 C以藥物培養72小時。在 培養之後,加入MTS 染劑’以及有色產物(曱脯 (formazan ))的形成是在490 nm測量。 4-臂 PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)及 CPT-11 的 IC50 值顯示在所有測試的腫瘤細胞中,4-臂-Gly-(7-乙基-10-羥 喜樹鹼)比CPT-11具有更高的試管内抑制。此外,4-臂 PEG-Gly-(7-乙基-10-經喜樹驗)也比天然的7-乙基-10-經喜 樹鹼具有明顯更高的試管内抑制測試的腫瘤細胞,除了 HT29腫瘤細胞之外。 PEG-Gly-(7-乙基-10-沒吾樹驗)共輕物是比 Camptosar® 更有效大約 10 至 600 倍。在 c〇LO 205、HT-29 及OVCAR-3細胞系中,PEG-Gly-(7•乙基-10-羥喜樹鹼)共 軛物是比Pegamotecan (—種喜樹鹼的聚乙二醇化前藥) 更靈敏8至16倍。 42 200810757 表 2 : IC50 ( // Μ)數據 腫瘤類型 細胞系 7-乙基 化合物9 CPT-11 喜樹鹼 結腸直腸 Colo 205 0.2±0·2 1.0 士 0.6 11 ±1.4 HT29 0.1 ±0.04 0.5 土 0.3 27 ± 8.6 肺臟 A549 1·0±0.1 2.7 ± 0.4 67 ±17 胰臟 PANC-1 0.56 ±0.38 0.67 ±0.14 34 ±16 MIAPaCa-2 0.18 0.09 67 土 46 ASPC-1 0.64 ±0.13 1.6±1.1 33 ±1.0 BxPC-3 0.54 ±0.58 0.24 ± 0.04 44 ±44 卵巢 OVCAR-3 0.1 土 0.02 0.3 ± 0.2 20 ±7.1 OV90 0.1 土 0.02 0.6 ± 0.7 18 ±4.8 OVCAR-8 0.03 ±0.01 0·5±0·1 9.0 ±1.3 A2780 0.02 ± 0.01 0.2 ± 0.2 8.0 士 3.5 SK-0V-3 0_2±0.1 0.9 ±0.01 52 ±8.5
4臂PEG-Gly-(7-乙基-10·羥喜樹驗)(化合物9)的IC5。是以7-乙基-10-羥喜樹 驗的當量方面而表示。 所示的數值是平均值±SD (n=3);當沒有顯示SD時,所示的數值是二重複的 平均值。 包含各種胺基酸的PEG-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)共輛物 對表3所摘述的一些癌細胞系具有有效的試管内細胞毒 性。所有的PEG-7 -乙基-10-羥喜樹驗共輕物都顯示有效的 試管内抗腫瘤活性,其超過小分子前藥 CPT-11及 Pegamotecan 的活性0 表3 :各種PEG-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)共梃物的IC50 ( μ Μ)數值 化合物 結腸直腸 卵巢 肺臟 Colo 205 HT29 OVCAR-3 A549 化合物12 (Ala) 0.03 0.16 0.14 4.4 化合物23 (Sar) 0.04 0.27 0.17 11 化合物18 (Met) 0.03 0.14 0.13 1.6 7-乙基-10-經喜樹驗 0.08 0.08 ND ND CPT-11 20 56 41 13 43 200810757 實施例24 :活體内數據_在乳房腫瘤異種移植小鼠中 的單劑功效 4-臂PEG-Gly-(7-乙基-10—羥喜樹鹼)共軛物(化合物 9 )對生長在裸鼠中的皮下人類乳腺癌(MX- 1 )之功效, 是以下述方式測定。在環境適應至少一週之後,將腫瘤藉 由將來自供體小鼠的小腫瘤片段移植到裸鼠左副脅區域上 的單一皮下位置而建立。每週兩次觀察腫瘤移植位置,並 且觸診測量一次。每隻小鼠的腫瘤體積是藉由以卡鉗測量 二維而測定,並且利用計算公式··腫瘤體積=(長度χ寬 度)而计昇。當腫瘤達到約100 mm3的平均體積時,將 小鼠分開至它們的實驗組,其係由未處理的對照組、根據 此處實施例7所製得的4_臂PeG-G丨y_(7_乙基羥喜樹 驗)、如 Conover 等人(Drwg ,1 999,1 4 : 499-5 06 )之說明所製備的pEG_Ala-CpT (其内文以引用方 式納入本文中)以及CPT_U所組成。藥物是經由尾靜脈 以20 mg/kg小鼠體重的單劑而靜脈投予。共軛物的劑量是 指等同於7-乙基-ίο-羥喜樹鹼的量。小鼠的重量及腫瘤大 小是在研究一開始以及單劑投予後的第3 1天測量。 表4顯示在20 mg/kg小鼠體重的單劑靜脈注射後第3 i 天’在MX-1乳房腫瘤細胞異種移植的小鼠中測量的腫瘤 減小。腫瘤的整體生長是以平均腫瘤體積(τν)計算。同 時也計算治療組與對照組(T/C )的百分比。腫瘤退化的 百分比代表每個化合物的活體内活性。4_臂PEG_gly_7-乙 基-1 0-备吾樹驗共輛物顯示明顯的抗_腫瘤活性,其具有1⑼ 44 200810757 x %的小鼠存活率以及100%的治癒。CPT-l 1以及鹽溶液對 照組都顯示0%存活率的無保護作用。所有的數據都摘述 於表4。 表4 :在MX-1乳房艟瘤異種移植小鼠模式中的單劑功效比較 化合物 平均 TV士 SD (mm3) 中數TV (mm3) m (%) TV土SD 的 變化(%) TGI (%) 退化 (%) 治癒 (%) 存活率 (%) T/C (%) 對照組 1136 土 686 785 1259 1399士658 0 0 0 0 --- 化合物9 7士 9 3 7 -94 士 10 99 100 100 100 0.3 PEG-Ala-CPT 43 士 41 40 42 -40 土 93 96 50 33 100 5 CPT-11 845 士 50 845 843 1424 士 432 26 0 0 0 108 結果顯示4-臂PEG_Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)是比 PEG-Ala-CPT或CPT-11更明顯有效於治療乳癌。 在乳房MX-1腫瘤模式中,以4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)的治療導致幾乎100%的腫瘤生長抑制,以及所 有動物的完全治癒。在等同的劑量水平時,以CPT-11的 治療則產生26%的腫瘤生長抑制。 實施例25:活髏内數據-在乳房艫瘤異種移植小鼠中 的多舞丨功效 這個實施例測定一系列4-臂PEG-胺基酸(衍生物)-(7_ 乙基-10-羥喜樹鹼)共軛物對生長在裸鼠中的人類乳腺癌 (MX-1 )之功效。將小鼠分成數個組別,每個接受4臂-PEG-Ala-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)、4 臂-PEG_Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)、4臂-PEG_Met-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)、4臂- 45 200810757 PEG-Sar- (7 -乙基-10-經吾樹驗)(每個都是如此處的說明而 製得)、CPT-11或鹽溶液對照組。將小鼠給藥5 11^/1^/天, 連續6天(每2天[qx2d]x6)。小鼠的重量及腫瘤大小係 監測至第一劑投予以及後續投予之後的第3 1天。 表5顯示在5 mg/kg/劑的靜脈注射六天(q2dx6 )之後 的第3 1天,在MX-1乳房腫瘤細胞異種移植的小鼠中測量 的腫瘤減小。所有的4-臂PEG-胺基酸(衍生物H7-乙基-10-羥喜樹鹼)共軛物都顯示明顯的抗腫瘤活性,其具有100% 的小鼠存活率以及100%的復原。CPT-11及鹽溶液對照組 都顯示〇%存活率的無保護作用。所有的數據都摘述於表 表5 :在MX-1乳房膣瘤異種移植小鼠模式中的多劑功效比較 化合物 平均τν± SD (mm3) 中數TV (mm3) F/I (%) TV+SD 的變化 (%) TGI (%) 退化 (%) 治癒 (%) 存活率 (%) T/C (%) 對照組 1136 ± 686 785 1259 1399 士 658 0 0 0 0 … 化合物12 (Ala) 10 士 11 9.6 10 -91 士 11 99 100 67 100 1.2 化合物9 (Gly) 12 土 18 6.6 14 -91 士 10 99 100 100 100 0.8 化合物18 (Met) 8 ± 9 5.6 7.8 -94 土 7 99 100 100 100 0.7 化合物23 (Sar) 12 士 10 14.6 13 -87 士 12 99 100 100 100 1.9 CPT-11 632 ± 698 340 594 423 土 243 44 0 0 0 43 46 200810757 數據顯示7-乙基-10-羥喜樹鹼的4_臂peg-胺基酸衍生 物是比CPT-11更明顯有效於治療乳癌。 實施例26 :在小及大乳房踵瘤異種移植小鼠中的活艘 内功效 4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)的抗腫瘤功效是在 帶有小的(約100 mm3)或大的(約450 mm3)已建立之 人類乳腺腫瘤MX-1的裸鼠中評估。抗腫瘤的治療活性是 鲁在小鼠中同時以單劑或多劑攝生法而測定。在具有小乳房 腫瘤異種移植的小鼠中,以單劑的4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-备喜樹驗)(20 mg/kg)之治療導致1〇〇%的TGI。以多劑 的 4 臂 PEG_Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)(2〇 mg/kg q2dx5) 之治療也導致100%的TGI。單劑(20 mg/kg )投予CPT-11 並不能抑制腫瘤生長,以及多劑的cpT_u (2〇 mg/kg q2d X5)在第Μ天時導致44%的TGI。 在帶有大乳房腫瘤的小鼠中,以單一 MTD的4臂 _ PEG-Gly-(7·乙基_10_羥喜樹鹼)(30 mg/kg )之治療導致96 %的TGI。在第54天時六隻小鼠中的四隻被治癒。以單一 MTD的CPT-11 ( 80 mg/kg)之治療在第13天導致7〇%的 TGI。使所有的動物在第2〇天犧牲,因為過量的腫瘤負擔 所致。在其MTD以多劑的4臂PEG-Gly_(7-乙基-10-羥喜 樹鹼)(10 mg/kg q2dX5)之治療也導致96%的TGI,以及 在第54天時六隻小鼠中的五隻被治癒。當在其mtd以多 劑給予時(40 mg/kg q2dx5) ,CPT-11在第13天時導致 約95%的TGI。然而,腫瘤卻在約5週之後在六隻小鼠中 47 200810757 的四隻中再次·生長。當以如4臂PEG-Gly-(7_乙基_ι〇,直 樹鹼)的等同劑量水平給予時(10 mg/kg q2dx5) ,CPT_^ 具有有效# TGI直到治療中斷為止,其後腫瘤再次生長。 結果是列於第6A及6C圖。抗腫瘤效果並非歸因於一般的 毋性作用,因為當在MTD給予時,以4臂pEG_Gly_(7_乙 基10 &吾树鹼)或CPT_U之治療,在治療期間並沒有明 顯減少動物的體重,如同第6B及6D圖所示。 在以單劑或多劑注射的ΜΧβ1乳房腫瘤模式中,4臂 PEG-Gly-(7-乙基-10_羥喜樹鹼)在小(i〇〇mm3)及大(45〇 匪3)體積已建立的腫瘤中有效抑制腫瘤生長。在H 礼房腫瘤異種移植的小鼠中,大小從約乃my至約45〇 mm3 的腫瘤是成功地被治療。 實施例27 ·活髏内數據在結勝直勝腫瘤異種移植小 鼠中的單舞丨功效 在這個實施例中,腫瘤減小是在以HT-29結腸直腸腫 瘤細胞異種移植的小鼠中,在單劑靜脈注射3〇㈤以“的4_ # PEG-Gly-(7-乙基-10_羥喜樹鹼)或cpT_u之後的第4、 及22天而測置。CPT 11也給藥80 mg/kg。 、、、口果疋列於第7目。4_臂pEG_Gly_(7_乙基-1〇_羥喜樹鹼) ,、軛物顯不明顯的抗腫瘤活性。鹽溶液對照組顯示存 活率的無保護作用。結果顯示4-臂PEG-Gly-(7-乙基-10-經 。树驗)疋比CPT-11明顯有效於治療結腸直腸癌。 實施例28:活髖内數據在結腸直膦膣瘤異種移植小 鼠中的多瘌功效 48 200810757 腫瘤減小是在以ΗΤ-29 -結腸直腸腫瘤細胞異種移植的 小鼠中,在靜脈注射1〇 mg/kg/劑的‘臂PEG-Gly-(7-乙基_ 10-經喜樹驗)或CPT-11共5天之後的第4、8、11、15、18 及22天而測量。CPT 11也給藥40 mg/kg/劑共5天。結果 是列於第8圖。相似的結果在多劑投予中獲得。此外,4_ 臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)的多劑投予也顯示比 CPT-11明顯的治療功效。結果顯示多劑的臂pEG-Gly-(7_ 乙基-10-經喜樹驗)是比CPT-11更明顯有效於治療結腸直 腸癌。如同在MX-1腫瘤異種移植的小鼠中所觀察到的, 以4臂PEG-Gly-(7-乙基-10·羥喜樹驗)或cpTM1之治療, 在治療期間並沒有明顯減少小鼠的體重。 實施例29:活髏内數據—在胰臟踵瘤異種移植小鼠中 的單舞丨功效 在這個實施例中,腫瘤減小是在以MiaPaCa-2胰臟腫 瘤細胞異種移植的小鼠中,在單劑靜脈注射3〇 mg/kg的4_ 臂PEG_Gly-(7-乙基_1〇_羥喜樹鹼)或cpm之後的第4、 15 18及22天而測量。CPT11也給藥80 mg/kg。 結果是列於第9圖。4_臂pEG-Gly_(7_乙基_1〇_羥喜樹鹼) 共軛物顯示明顯的抗腫瘤活性。鹽溶液對照組及cpT_工i 顯不無保護作用。結果顯示4-臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜 树驗)疋比CPT-11明顯有效於治療胰臟癌。以單劑的4臂 PEG-Gly-(7-乙基_1〇_羥喜樹鹼)之治療導致的tGI, 而單丄主射cpt_i 1的治療則導致〇%的TGI。 資施例30:活II内數據在胰臟臌瘤異植移植小鼠中 49 200810757 的多鮝I功效 腫瘤減小是在以MiaPaCa-2胰臟腫瘤細胞異種移植的 小鼠中,在靜脈注射10 mg/kg/劑的4-臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)或CPT-11共5天之後的第4、8、11、15、18
及22天而測量。CpT i i也給藥4〇 mg/kg/劑共5天。結果 是列於第10圖。4-臂PEG_Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)的多 劑投予顯示比CPT-11明顯的治療功效。結果顯示多劑的仁 臂PEG-Gly-(7乙基-10-羥喜樹鹼)是比CPT-11更有效於治 療騰臟癌。以多劑的4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜樹驗) 之冶療導致95%的TGI,而CPT-11則導致34%的TGI。 實施例31 :试管内的代謝 PEG-Gly-(7-乙基-ίο-羥喜樹鹼)共軛物的試管内代謝是 在大鼠肝細胞中觀察。將PEG_Gly(7_乙基_1〇_羥喜樹鹼) 與大鼠肝細胞在PH 7.5、371培養2小時。如第u圖所 =,7-乙基-10_羥喜樹鹼及7_乙基_1〇_羥喜樹鹼-葡萄糖苷 酉欠(7-乙基-1 喜樹鹼_G )是被鑑定出的主要代謝物, 其與7-乙基-10-羥喜樹鹼在活體内的已知代謝途徑一致。 實施例32 : pEG共軛物的性質 表6顯示四種不同pEG_(7_乙基_1〇_羥喜樹鹼)共軛物 在水溶性鹽溶液中的溶解度。所有的4_臂pEG_(7·乙基·ι〇· =喜樹驗)共輛物都顯示達4叫/机7-乙基_1〇_經喜樹驗的 當量之優異溶解度。在人類血毁中,I乙基·ι〇_羥喜樹鹼 是從顺共輛物^ 22至52分鐘的倍增時間而穩定釋 放’以及釋放似乎1 pH及濃度依賴性的,如同在以下實 50 200810757 " 施例33中之說日月。 表6 : PEG-7·乙基-10羥喜樹鹼共軛物的性質 化合物 在鹽溶液中的溶 解度(mg/mL) a 在人類血漿中的 t1/2 (min) b 在血漿1 Γ的倍增時間(min) c 人類 小鼠 大鼠 化合物9 ( Gly) 180 12.3 31.4 49.5 570 化合物12 (Ala) 121 12.5 51.9 45.8 753 化合物23 (Sar) ND 19.0 28.8 43.4 481 化合物18 (Met) 142 26.8 22.2 41.9 1920 a 7 -乙基-1 0 -控吾樹驗是不溶於鹽溶液中。 b PEG共軛物半生期。 e 7-乙基-10-經喜樹驗從共輛物中的形成速率。 在室溫時’ P E G - 7 -乙基-10 -經喜樹驗共辆物在鹽溶液 及其他水溶性媒介中顯示優異的穩定性達24小時。 實施例33 :濃度及pH對於穩定性的影響 根據我們先前的成果,在20-OH位置處的醯化可以活 性封閉的形式保護内酯環。在大鼠及人類血漿中的水溶性 穩定性及水解性質,是利用UV為基礎的HPLC方法而監 測。將4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)共輛物與每個 樣品在室溫培養5分鐘。 PEG-7-乙基-10-羥喜樹鹼共軛物在緩衝溶液中的穩定 性是pH依賴性的。第12圖顯示4臂PEG-Gly-(7-乙基-10· 羥喜樹鹼)在各種樣品中的穩定性。第13圖顯示7-乙基-10-羥喜樹鹼從PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)釋放的速率是 隨著pH的增加而增加。 實施例34 :藥物動力學 51 200810757 以單一注射20 mg/kg的4臂PEG-Gly-(7-乙基-l〇-經 吾樹驗)共輛物注射無腫瘤的Balb/C小鼠。在各個時間點, 使老鼠犧牲,並且藉由HPLC分析血漿的完整共軛物以及 釋放的7-乙基-1 〇-羥喜樹驗。藥物動力學分析是利用無分 隔分析(Non-Compartmental Analysis,WinNonlin)而完 成。細節列於表7。 表7 :藥物動力學數據
參數 化合物9 從化合物9釋放的7-乙基
如第14圖所示,7-乙其1Λ , 士 G基-10-經喜樹鹼的聚乙二醇化使 天然藥物7-乙基-1 〇-經喜樹f古 W驗有長的循環半生期以及高度 暴露。4臂PEG-Gly-(7-乙其飞a
_ t 土 _i0_羥喜樹鹼)共軛物的腸肝循 %也被觀察。PEG_Gly_(7_乙其 队壬 羥喜樹鹼)在小鼠中的藥 物動力學紀錄是雙相的,顯 ’ ,v 貝不在—開始2小時期間的快速 血水为佈期,然後是18_22 ^ . j %對於共軛物的終端排除半 生期以及伴隨的丨8_26小時斟 立山、;k ϊι/v I ; 7 -乙基-1 〇-經吾樹驗的終 鹆消除半生期。 、 此外,4 臂 PEG-Gly-(7-? a , ^ ^ 暴4 0-羥喜樹鹼)的藥物動力 予曲線也在大鼠中研究。在大鼠 r 7 ^ ^ 以甲,係使用3、10及30mg/kg 物二 經喜樹驗當量)的劑量水平。在大鼠中的華 力學曲線是與小鼠的藥物動力學紀錄一致。 52 200810757 在大鼠中,4臂PEG-Gly-(7-乙基】Λ “士丄 〇_羥吾树鹼)顯示從 循裱中的雙相清除,而在大鼠中具有 頁1118小時的排除 生期。從4臂㈣-Gly小乙基·1G,喜樹驗共㈣中釋放 的7-乙基喜樹鹼具有21-22小時顯著排除半生期。 最大血襞濃度(cmax)以及曲線下的面積(auc)在大白 中是以劑量依賴性的方式增加。在小氣或大鼠中從4 ; PEG-Gly共輕物中釋放# 7_乙基·1G,喜樹驗之顯著半生 期,是比從CPT-U中釋放的7_乙基]〇_經喜樹驗之報導 的顯著半生期明顯更長,以及從4臂PEG_Gly_(7_乙基_ι〇_ 羥喜樹鹼)釋放的7-乙基-10-羥喜樹鹼之暴露,^比從 C/T-n中釋放的7_乙基魯經喜樹驗之報導的暴露明顯= 咼。母體化合物在大鼠中的清除是0 35 mL/hr/kg。母體化 合物在穩定態之估計的分佈體積(Vss)是5·49 mL/kg 在大鼠中釋放的7-乙基-1 〇-羥喜樹鹼之清除是i 3 1 mL/hr/kg。在大鼠中釋放的7_乙基·1〇-羥喜樹鹼之估計的 Vss是2384 mL/kg。釋放的7-乙基-1〇_羥喜樹鹼之腸肝循 環是在小鼠及大鼠中觀察到。 【圖式簡單說明】 第1圖概要地說明製備4臂聚乙二醇酸的反應方案。 第2圖概要地說明製備在實施例3_7中所說明的*臂_ PEG-Gly-(7-乙基-10-羥喜樹鹼)之反應方案。 第3圖概要地說明製備在實施例8_12中所說明的4臂 -PEG-Ala-(7-乙基-10·羥喜樹驗)之反應方案。 第4圖概要地說明製備在實施例13_16中所說明的* 53 200810757 臂-PEG-Met-(7-乙基-i〇-羥喜樹鹼)之反應方案。 第5圖概要地說明製備在實施例17-21中所說明的4 臂-PEG-Sar-(7-乙基-ίο-羥喜樹鹼)之反應方案。 第6圖顯示在實施例26所說明的大]^[\-1乳房腫瘤異 種移植小鼠中的單一劑及多劑功效。 第7圖顯示在實施例27所說明的HT-29結腸直腸腫 瘤異種移植小鼠中的單一劑功效。 第8圖顯示在實施例28所說明的HT_29結腸直腸腫 瘤異種移植小鼠中的多劑功效。 第9圖顯示在實施例29所說明的Miapaca_2胰臟腫 瘤異種移植小鼠中的單一劑功效。 第10圖顯示在實施例30所說明的MiaPaCa_2胰臟腫 瘤異種移植小鼠中的多劑功效。 第11圖顯示如實施例31中所說明的斗臂-^①⑴ 乙基-10-羥喜樹鹼)之試管内代謝。 第12圖顯示如實施例33中所說明的4 乙基-10 - 吾樹驗)之穩定性。 第13圖顯示pH對於如實施例33中所說明$ 4臂-PEG-Gly-(7-乙基-〗羥喜樹鹼)之穩定性的影響。 第14圖顯示如實施例34中所說明的4f_pEG_Gly_(7_ 乙基-10-羥喜樹鹼)之藥物動力曲線。 【主要元件符號說明】 (無) 54

Claims (1)

  1. 200810757 十、申請專利範園: 1 · 一種式(I)化合物:
    其中 Ri、R2、R3 及 R4 獨立地是 OH 或(L)m-D ; L是雙功能性的連接子; D是喜樹驗或喜樹驗類似物的殘基; m是0或正整數;以及 η是正整數; 限制條件為h、R2、R3及R4不全是ΟΗ。 2.如申請專利範圍第1項之化合物,其中D是式(II ) 化合物的殘基:
    其中 R7 是選自由 N〇2、NH2、N3、氫、鹵素、卩、(31、:61^、 I、COOH、OH、O-Cu 烷基、SH、S-CV3 烷基、CN、CH2NH2、 55 200810757 NH_CV3 烷基、CHfNH-Cw 烷基、NCCu 烷基)2、CHzNCC】-3 烷基)、Ο-、NH-U&S-CH2CH2N(CH2CH2OH)2、0-、NH- 及 s-ch2ch2ch2n(ch2ch2oh)2、o-、nh-及 s-ch2ch2n(ch2 ch2ch2oh)2、Ο-、NH-及 S-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH 2)2、Ο-、NH-及 S-CI^CI^NCCu 烷基)2、Ο-、NH·及 s· 烷基)2、CHO以及Ch烷基所組成的族 群中;以及 R8是選自由Η、C1-8烷基以及CH2NR9R1{)所組成的族 群中; 其中 R9是選自由氫、CY6烷基、c3_7環烷基、(:3·7環烷基-C 1-6 烷基、C:2·6烯基、羥基-Cw烷基以及Cw烷氧基_Ci 6烷基 所組成的族群中; R1〇是選自由氫、Cw烷基、C%7環烷基、C3 7環烷基_ clfc6烷基、c2_6烯基、羥基-Ci6烷基、Ci6烷氧基π"烷 基以及-CORn所組成的族群中; 其中R"是選自由氫、CV6烷基、過鹵-Ci6烷基、q 環烷基、cs·7環烷基-Cw烷基、ο:”烯基、羥基_c"烷基3、7 C!-6烷氧基以及Cw烷氧基_Ci_6烷基所組成的族^ |或 及B環的氮形成飽和的3_7員雜環,其包人 S 或 nr12 ; " ^ 5 X s 其中R12是選自由氫、C16烷基、過鹵_ 1-6沉暴、芳 土、以選自由CV6烷基、鹵素、硝基、胺基、◦ 過-一 一屬、C』氧^ 56 200810757 C"烷基以及-CORu所組成的族群中之一個或多個基團經-取代的务基’其中Rls是選自由氫、C16烧基、過鹵-Cw 烷基、C!·6烷氧基、芳基及以一個或多個ci 6炫基、過鹵-C!-6烧基、經基- C!·6烧基以及Cl 6烧氧基- C1-6炫基經取代 的芳基所組成的族群中; Rll〇-Rlll各自獨立地是選自由氫、鹵、醯基、烧基、 經取代的烷基、烷氧基、經取代的烷氧基、烯基、炔基、 環烷基、羥基、氰基、硝基、疊氮基、醯胺基、肼、胺基、 籲 經取代的胺基、羥羰基、烷氧羰基;烷羰氧基、烷羰胺基、 氨基甲醯氧基、芳磺醯氧基、烷磺醯氧基、-C(R117) = N_ (0)j-R118 ’其中R117是Η、烷基 '烯基、環烷基或芳基,j 是0或1,以及R118是Η、烷基、烯基、環烷基或雜環; Ru9C(0)0-,其中RU9是齒素、胺基、經取代的胺基、雜 環、經取代的雜環以及R12(r〇-(CH2)k-,其中k是1_1〇的 整數’以及R^o是烧基、苯基、經取代的苯基、環烧基、 經取代的環烷基、雜環或經取代的雜環所組成的族群中; 籲或 R7與R110或Rug與Rill —起形成取代或未經取代的甲 二氧基、乙二氧基或乙烯氧基;以及 Rin是Η或OR’,其中R’是烷基、烯基、環烷基、_ 燒基或經烧基。 3 ·如申请專利範圍弟1項之化合物’其中喜樹鹼類似 物的殘基是 57 200810757
    4·如申請專利範圍第1項之化合物,其中L是胺基酸 或胺基酸衍生物的殘基,其中胺基酸衍生物是選自由2-胺 基己二酸、3·胺基己二酸、々-丙胺酸、/5 -胺基丙酸、2-胺 $ 基丁酸、4-胺基丁酸、哌啶酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、 2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸、2,本胺基丁 酸、鎖鏈離胺素、2,2-二胺基庚二酸、2,3_二胺基丙酸、正 -乙基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺酸、3-羥基脯胺酸、‘經基 脯胺酸、異鎖鏈離胺素、別-異白胺酸、N-曱基甘胺酸、肌 胺酸、N-曱基-異白胺酸、6-N-曱基-離胺酸、N_曱基織胺 酸、正纈胺酸、正白胺酸以及鳥胺酸所組成的族群中。 5·如申請專利範圍第4項之化合物,其中l是甘胺酸、 φ 丙胺酸、曱硫胺酸或肌胺酸的殘基。 6·如申請專利範圍第1項之化合物,其中L是甘胺酸 的殘基。 义 7·如申請專利範圍第〗項之化合物,其中^是選自由 以下所組成的族群中: -[C(0)]vNR21(CR22R23〇)t·, "[C(0)]vNR21(CR22R230)t(CR24R25)y0- ^ -[C(0)]vNR21(CR22R23〇)t(CR24R25)y. ^ 4C(0)]vNR21(CR22R23)t〇-, 58 200810757 -[C(0)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR250)yNR26. -[C(0)]v0(CR22R23)tNR26,, -[C(0)]v0(CR22R23)t0-, -[C(0)]vNR21(CR22R23)tNR26_, [C(0)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR250)y-, -[C(0)]vNR21(CR22R23〇)t(CR24CR25)yNR26-,
    R21-R26是獨立地選自由氫、Cu烷基、C2.6烯基、C2-6 炔基、C^9分支的烷基、c38環烷基、Ci6經取代的烷基、 C:2-6經取代的烯基、C2_6經取代的炔基、c3 8經取代的環烷 基、芳基、經取代的芳基、芳烷基、C1_6雜烷基、經取代 的Cw雜烷基、Cw烷氧基、苯氧基以及Ci·6雜烷氧基所 組成的族群中; i R27是選自由氫、Cw烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、^ 分支的烷基、Cw環烷基、ci 6經取代的烷基、c 1 59 200810757 、的稀基、^2·6經取代的块基、(:3,8經取代的環烧基、芳基、 、、二取代的芳基、芳烷基、Cl、雜烷基、經取代的c"雜烷 基、C 1 · 6烧氧基、笨轰其 p 本氧基、CU6雜烷氧基、N〇2、鹵烷基以 及鹵素所組成的族群中; t及y疋k約1到約4之個別選擇的正整數;以及 V是〇或1。 8·如申請專利範圍第1項之化合物,其中m是從約1 到約10。 9 ·如申请專利範圍第1項之化合物,其中m是約1。 1 〇 ·如申凊專利範圍第1項之化合物,其中η是從約 28到約341。 11.如申請專利範圍第1項之化合物,其中η是從約 114 到約 227。 12·如申請專利範圍第1項之化合物,其中η是約227。 13 ·如申請專利範圍第1項之化合物,其具有至少約 φ 3·9 裝載的(L)m-D。 14.如申請專利範圍第1項之化合物,係選自由以下 所組成的族群中:
    60 ,200810757
    61 200810757
    申請二利範申圍第1項之化合物,投予有、需 ?申請專利範圍第16項之方法,其中 基-10-.喜樹驗的殘基。 疋7· 18· —種治療轉移性疾病 自由硬塊腫瘤、淋巴瘤、肺 /〜轉移性疾病係 η > , . 在、小細胞肺癌、各性% t〇 胞白企病(ALL)、乳癌 U淋巴 直腸癌、騰臟癌、膠質 62 200810757 細胞瘤、卵巢癌以及胃癌所組成的族群中,係包括將有致 量的如申請專利範圍第1項之化合物,投予有需要的患者。 19·如申請專利範圍第18項之方法,其中轉移性疾病 是乳癌’以及如申請專利範圍第1項之化合物是
    20.如申請專利範圍第19項之方法,其中化合物是以 從約5至約20 mg/kg/劑的量而投予。 21 ·如申請專利範圍第1 8項之方法,其中轉移性疾病 是結腸直腸癌,以及如申請專利範圍第〗項之化合物是
    22.如申請專利範圍第21項之方法,其中化合物是以 從約10至约30 mg/kg/劑的量而投予。 23·如申請專利範圍第1 8項之方法,其中轉移性疾、 是胰臟癌’以及如申請專利範圍第1項之化合物是 63 200810757
    24.如申請專利範圍第23項之方法,其中化合物是以 從約1〇至約30 mg/kg/劑的量而投予。 φ 25· 一種製備多臂聚合性前藥之方法,其包括: (a)提供一當量包含可利用的20-羥基之喜樹鹼或直 樹鹼類似物,以及一或多當量包含可利用的羧酸基團之1 功能性連接子; 又 ^ (b)將兩個反應物在可有效形成具有可利用的胺基之 «祕鹼-雙功能性連接子中間產物的條件下反應;以及 A (〇將每個活性位置一或多當量所得中間產物,與一 當量式(I)活化的聚合物, _ 其中式(I)是
    在可有效形成多臂聚合性前藥的條件下反應,該多臂 聚合性前藥具有結構 64 200810757
    R1、R2、R3及R4獨立地是OH或⑹m_D ,· L是雙功能性的連接子; • D疋吾樹驗或喜樹驗類似物的殘基; 111是〇或正整數;以及 n是正整數; 限制條件為Rl、r2、1及R4不全是OH。 26·種製備多臂聚合性前藥之方法,其包括: (a )將*里包含可利用的20-羥基之喜樹鹼或喜樹 鹼犬員似物,與-或多當量包含可利用的魏鱗基團之雙功能 _ 性連接在可有效形成具有可利用的胺基之喜樹鹼·雙功 月b性連接子中間產物的條件下反應;以及 (b )將每個活性位置一或多當量的自步驟(& )所得 中間產物,與一當量式⑴活化的聚合物, 其中式(I)是
    65 200810757 在可有效形成多臂聚合性前藥的條件下反應,該多臂 聚合性前藥具有結構
    Ri、R2、R3 及 R4 獨立地是 OH 或(L)m-D ; L是雙功能性的連接子; D是喜樹鹼或喜樹鹼類似物的殘基; m是0或正整數;以及 η是正整數; 限制條件為Ri、R2、R3及R4不全是ΟΗ。 十一、圖式: 如次頁。 66
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