TH19897Y - ชุดไพร์เมอร์ (primer) และตัวตรวจจับ (DNA probe) สำหรับการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตว์น้ำ - Google Patents

Abstract

------14/12/2564------(OCR) ชุดไพรเมอร (primer) และตัวตรวจจับ (probe) สำหรับการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตวน้ำประกอบด้วยการออกแบบชุดไพรเมอรและตัวตรวจจับใหม่ที่มีความจำเพาะกับลำดับเบสนิวคลีโอไทดของเชื้อ TiLV การประยุกต์ใช์ชุดไพรเมอรและตัวตรวจจับสำหรับตรวจหาเชื้อและวัดปริมาณเชื้อ TiLV ด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณ (quantitative PCR; qPCR) ชุดไพร์เมอรและตัวตรวจจับมีความจำเพาะสูงกับเชื้อ TiLV โดยไม่เพิ่มจำนวนเชื้อก่อโรคชนิดอื่นในตัวอย่างสัตวนํ้า นอกจากนี้วิธีตรวจที่พัฒนาขึ้นใหม่ยังสามารถตรวจหาเชื้อไวรัส TiLV ที่แยกได้จากประเทศอื่น และบ่งบอกปริมาณเชื้อในตัวอย่างสัตวนำได้อย่างถูกตองและแม่นยำ วิธีที่พัฒนาขึ้นใหม่นี้จะเปีนเครื่องมือสำคัญที่ช่วยในการควบคุมปองกันโรคไวรัสอุบัติใหม่ TiLV ที่สรางความเสียหายใหกับเกษตรกรที่เลียงสัตวนํ้าในประเทศไทยและประเทศอื่นๆ ทั่วโลก ------------ ------10/06/2563------(OCR) ชุดไพร์เมอร์ (primer) และตัวตรวจจับ (probe) สำหรับการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตว์น้ำประกอบด้วยการออกแบบชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับใหม่ที่มีความจำเพาะกับลำดับเบสนิวคลีโอไทด์ของเชื้อ TiLV การประยุกต์ใช้ชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับสำหรับตรวจหาเชื้อและวัดปริมาณเชื้อ TiLV ด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณ (quantitative PCR; qPCR) ชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับมีความจำเพาะสูงกับเชื้อ TiLV โดยไม่เพิ่มจำนวนเชื้อก่อโรคชนิดอื่นในตัวอย่างสัตว์น้ำ นอกจากนี้วิธีตรวจที่พัฒนาขึ้นใหม่ยังสามารถตรวจหาเชื้อไวรัส TiLV ที่แยกได้จากประเทศอื่น และบ่งบอกปริมาณเชื้อในตัวอย่างสัตว์น้ำได้อย่างถูกต้องและแม่นยำ วิธีที่พัฒนาขึ้นใหม่นี้จะเป็นเครื่องมือสำคัญที่ช่วยในการควบคุมป้องกันโรคไวรัสอุบัติใหม่ TiLV ที่สร้างความเสียหายให้กับเกษตรกรที่เลี้ยงสัตว์น้ำในประเทศไทยและประเทศอื่นๆ ทั่วโลก ------------ บทสรุปการประดิษฐ์ ชุดไพร์เมอร์ (primer) และตัวตรวจจับ (probe) สำหรับการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัส (Tilapia Lake Virus; TiLV) ที่ก่อปัญหาการป่วยและตายในสัตว์นํ้า ประกอบด้วยการออกแบบชุดไพร์ เมอร์และตัวตรวจจับใหม่ที่มีความจำเพาะกับลำดับเบสนิวคลีโอไทด์ของเชื้อ TiLV การประยุกต์ใช้ชุด ไพร์เมอร์และตัวตรวจจับสำหรับตรวจหาเชื้อและวัดปริมาณเชื้อ TiLV ด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณ (quantitative PCR; qPCR) ชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับมีความจำเพาะสูงกับเชื้อ TiLV โดยไม่เพิ่ม จำนวนเชื้อก่อโรคชนิดอื่นในตัวอย่างสัตว์น้ำ นอกจากนี้วิธีตรวจที่พัฒนาขึ้นใหม่ยังสามารถตรวจหา เชื้อไวรัส TiLV ที่แยกได้จากประเทศอื่น และบ่งบอกปริมาณเชื้อในตัวอย่างสัตว์น้ำได้อย่างถูกต้องและ แม่นยำ วิธีที่พัฒนาขึ้นใหม่นี้จะเป็นเครื่องมือสำคัญที่ช่วยในการควบคุมป้องกันโรคไวรัสอุบัติใหม่ TiLV ที่สร้างความเสียหายให้กับเกษตรกรที่เลี้ยงสัตว์น้ำในประเทศไทยและประเทศอื่นๆ ทั่วโลก

Claims (2)

------14/12/2564------(OCR) 1. ชุดไพร์เมอร์ (primer) และตัวตรวจจับ (probe) สำหรับการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตวนํ้าที่มีความจำเพาะต่อชิ้นส่วนที่ 3 (segment 3) มีลำดับนิวคลีโอไทดดังนี้ - ฟอรเวิรดไพรเมอร (forward primer) TiLV-93F: 5'-AGC CTG CCA CAC AGA AG-3' - รีเวอรสไพรเมอร (reverse primer) TiLV-93R: 5'- CTG CTTGAG TTG TGC TTC T-3' - ตัวตรวจจับ (probe) TiLV-93Probe 5’-CTC TAC CAG CTA GTG ccc CA-3’ 2. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตวนํ้าโดยการใช้ชุดไพรเมอร (primer) และตัวตรวจจับ (probe) สำหรับการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตวนี้าที่มีความจำเพาะตอชิ้นส่วนที่ 3 (segment 3)มีลำดับนิวคลีโอไทดตามข้อถือสิทธิ 1 ร่วมกับเทคนิคพีซีอารเชิงปริมาณ มีขั้นตอนตังนี้ ก. การสกัดอารเอ็นเอจากตัวอย่าง โดยการนำเนื้อเยื่อสัตวนํ้า ได้แก่ ตับ สมอง ด้าม ไต เลือด เหงือกลำไส เมือก อวัยวะสืบพันธุ์ รังไข่ ถุงนำเชื้อ หรือตัวอย่างจากพาหะและสิ่งแวดด้อม โดยอารเอ็นเอถูกสกัดด้วยชุดสกัดอารเอ็นเอหรือสกัดด้วยวิธีไตรซอล-คลอโรฟอรม (Trizol-chloroform extraction) ข. การเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมด้วยวิธีพีชีอารเชิงปริมาณแบบ 1 ขั้นตอนในหลอดเดียว (single?tube qPCR) โดยการเปลี่ยนอารเอ็นเอ (RNA) ไปเป็นซีดีเอ็นเอ (cDNA) ดวยเอนไซม์รีเวิรสทรานสคริปเตส(reverse transcriptase) และเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมภายในหลอดเดียวดวยวิธีพีซีอารเชิงปริมาณ หรือการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมเชิงปริมาณแบบ 2 ขั้นตอน (2-step qPCR) โดยการเปลี่ยนอารเอ็นเอเป็นซีดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์รีเวิรสทรานสคริปเตส แล้วย้ายชีดีเอ็นเอที่เตรียมได้ไปยังหลอดทดลองใหมเพื่อเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมด้วยวิธีพีชีอารเชิงปริมาณ ค. ส่วนผสมของปฏิกิริยาพีซีอารเชิงปริมาณเพื่อเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมของเชื้อ TiLV มีสวนผสมของไอแทคยูนิเวอร์แชลโพรบมาสเตอรมิกซ์ (iTaq universal probes mastermix) ที่ประกอบด้วยเอนไซม์แทคดีเอ็นเอโพลีเมอเรส (Taq DNA polymerase) สารดีออกชีนิวคลีโอไทด ไตรฟอสเฟต(Deoxynucleotide triphosphate; dNTPs) สารแมกนีเซียมคลอไรด (MgC12) ปริมาณทั้งหมด 5 ไมโครลิตรส่วนผสมของไพรเมอร TiLV-93F ไพรเมอร TiLV-93R และตัวตรวจจับ (probe) TiLV-93Probe ที่มีความเข้มข้น50-1000 นาโนโมลาร (nM) ปริมาณ 0.5 ไมโครลิตร ง. ผสมตัวอย่างสารพันธุกรรมจากตัวอย่างสัตวนํ้าจำนวน 1-1,000 นาโนกรัมต่อไมโครลิตร ในปริมาตร 1ไมโครลิตร และน้ำกลั่นบริสุทธิ์ (molecular grade water) เพื่อปรับปริมาตรสุดท้ายเป็น 10 ไมโครลิตรในหลอดทดสอบที่มีส่วนผสมของนายาทั้งหมด จ. สภาวะที่เหมาะสมต่อการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมของเชื้อไวรัส TiLV ด้วยชุดไพรเมอรและตัวตรวจจับใหม่ ประกอบดวยอุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 นาที ต่อจากนั้นเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมจำนวน 40 รอบ ที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 วินาที 56 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาที ฉ. การวิเคราะห์ผลที่เกิดชื้นวัดจากปริมาณการปล่อยแสงของตัวตรวจจับ (probe) ที่เกิดจากปฏิกิริยาการเพิ่มจำนวนของสารพันธุกรรมของไวรัส ซึ่งจะถูกบันทึกโดยเครื่องพีซีอาร ผลิตภัณฑ่ที่เกิดจากการเพิ่มจำนวนของปฏิกิริยาทีซีอาร์เชิงปริมาณวัดด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟไรชิส (agarose gel electrophoresis) จะพบผลิตภัณฑ์ขนาด 93 นิวคลีโอไทด เมื่อย้อมเจลด้วยสีเอธิเดียมโบรไมด (ethidium bromide) แล้วดูผลภายได้เครื่องกำเนิดแสงยูวี ช. การสรางกราฟมาตรฐานเพื่อหาความไวของชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับ โดยการเจือจางตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตวนำที่ติดเชือทิลาเปียเลคไวรัสมาเจือจางทีละ 10 เท่า (10-fold serial dilution) ซึ่งครอบคลุมระดับความเข้มข้นของเชื้อไวรัสระหว่าง 1010-104 ตัวต่อไมโครลิตร (copies/pl) แล้วนำตัวอย่างไปทดสอบด้วยวิธีพีซีอารเชิงปริมาณ ทำทั้งหมด 3 ซ้ำ นำค่าเฉลี่ยของแต่ละความเข้มขนมาสร้างกราฟมาตรฐานได้ค่าที่ต่างกันไม่เกิน 1เปอร์เซ็นต์ ช. ทดสอบความจำเพาะของชุดไพรเมอรและตัวตรวจจับชุดใหม่ กับตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตวทั้าที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัส ตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตวนํ้าที่ติดเชื้อไวรัสและแบคทีเรียชนิดอื่น ตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตวนํ้าปกติ ผลพบว่าชุดไพรเมอรและตัวตรวจจับที่พัฒนาขึ้นใหม่ ให้ผลบวกเฉพาะตัวอย่างสัตวนํ้าที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสเท่านั้น ณ. การทดสอบตัวอย่างสัตวนํ้าที่ติคเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสจากประเทศอื่น พบว่าชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับสามารถเพิ่มจำนวนเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสที่แยกได้จากประเทศอื่นอย่างถูกต้อง ------------ ------10/06/2563------(OCR) 1. ชุดไพร์เมอร์ (primer) และตัวตรวจจับ (probe) สำหรับการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตว์น้ำที่มีความจำเพาะต่อชิ้นส่วนที่ 3 (segment 3) มีลำดับนิวคลีโอไทด์ดังนี้ - ฟอร์เวิร์ดไพร์เมอร์(forwardprimer) TiLV-93F: 5'-AGC CTGCCACAC AGA AG-3' - รีเวอร์สไพร์เมอร์ (reverse primer) TiLV-93R: 5'- CTG CTT GAG TTG TGC TTC T-3' - ตัวตรวจจับ (probe) TiLV-93Probe 5’-CTC TAC CAG CTA GTG CCC CA-3’ 2. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตว์น้ำโดยการใช้ชุดไพร์เมอร์ (primer) และตัวตรวจจับ (probe) สำหรับการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตว์น้ำที่มีความจำเพาะต่อชิ้นส่วนที่ 3 (segment 3)มีลำดับนิวคลีโอไทด์ตามข้อถือสิทธิ 1 ร่วมกับเทคนิคพีซีอาร์เชิงปริมาณ มีขั้นตอนดังนี้ ก. การสกัดอาร์เอ็นเอจากตัวอย่าง โดยการนำเนื้อเยื่อสัตว์น้ำ ได้แก่ ตับ สมอง ม้าม ไต เลือด เหงือกลำไส้ เมือก อวัยวะสืบพันธุ์ รังไข่ ถุงนำเชื้อ หรือตัวอย่างจากพาหะและสิ่งแวดล้อม โดยอาร์เอ็นเอถูกสกัดด้วยชุดสกัดอาร์เอ็นเอหรือสกัดด้วยวิธีไตรซอล-คลอโรฟอร์ม (Trizol-chloroform extraction) ข. การเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณแบบ 1 ขั้นตอนในหลอดเดียว (single-tube qPCR) โดยการเปลี่ยนอาร์เอ็นเอ (RNA) ไปเป็นซีดีเอ็นเอ (cDNA) ด้วยเอนไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเตส(reverse transcriptase) และเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมภายในหลอดเดียวด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณ หรือการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมเชิงปริมาณแบบ 2 ขั้นตอน (2-step qPCR) โดยการเปลี่ยนอาร์เอ็นเอเป็นซีดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเตส แล้วย้ายซีดีเอ็นเอที่เตรียมได้ไปยังหลอดทดลองใหม่เพื่อเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณ ค. ส่วนผสมของปฏิกิริยาพีซีอาร์เชิงปริมาณเพื่อเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมของเชื้อ TiLV มีส่วนผสมของไอแทคยูนิเวอร์แซลโพรบมาสเตอร์มิกช์ (iTaq universal probes mastermix) ที่ประกอบด้วยเอนไซม์แทคดีเอ็นเอโพลีเมอเรส (Taq DNA polymerase) สารดีออกซีนิวคลีโอไทด์ ไตรฟอสเฟต(Deoxynucleotide triphosphate; dNTPs) สารแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) ปริมาณทั้งหมด 5 ไมโครลิตรส่วนผสมของไพร์เมอร์ TiLV-93F ไพร์เมอร์ TiLV-93R และตัวตรวจจับ (probe) TiLV-93Probe ที่มีความเข้มข้น50-1000 นาโนโมลาร์ (nM) ปริมาณ 0.5 ไมโครลิตร ง. ผสมตัวอย่างสารพันธุกรรมจากตัวอย่างสัตว์น้ำจำนวน 1-1,000 นาโนกรัมต่อไมโครลิตร ในปริมาตร 1 ไมโครลิตร และน้ำกลั่นบริสุทธิ์ (molecular grade water) เพื่อปรับปริมาตรสุดท้ายเป็น 10 ไมโครลิตรในหลอดทดสอบที่มีส่วนผสมของน้ำยาทั้งหมด จ. สภาวะที่เหมาะสมต่อการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมของเชื้อไวรัส TiLV ด้วยชุดไพรเมอร์และตัวตรวจจับใหม่ ประกอบด้วยอุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 นาที ต่อจากนันเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมจำนวน 40 รอบ ที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 วินาที 56 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาที ฉ. การวิเคราะห์ผลที่เกิดขึ้นวัดจากปริมาณการปล่อยแสงของตัวตรวจจับ (probe) ที่เกิดจากปฏิกิริยาการเพิ่มจำนวนของสารพันธุกรรมของไวรัส ซึ่งจะถูกบันทึกโดยเครื่องพีซีอาร์ ผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากการเพิ่มจำนวนของปฏิกิริยาพีซีอาร์เชิงปริมาณวัดด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟไรซิส (agarose gel electrophoresis) จะพบผลิตภัณฑ์ขนาด 93 นิวคลีโอไทด์ เมื่อย้อมเจลด้วยสีเอธิเดียมโบรไมด์ (ethidium bromide) แล้วดูผลภายใต้เครื่องกำเนิดแสงยูวี ช. การสร้างกราฟมาตรฐานเพื่อหาความไวของชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับ โดยการเจือจางตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตว์น้ำที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสมาเจือจางทีละ 10 เท่า (10-fold serial dilution) ซึ่งครอบคลุมระดับความเข้มข้นของเชื้อไวรัสระหว่าง 1011-104 ตัวต่อไมโครลิตร (copies/pl) แล้วนำตัวอย่างไปทดสอบด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณ ทำทั้งหมด 3 ซ้ำ นำค่าเฉลี่ยของแต่ละความเข้มข้นมาสร้างกราฟมาตรฐานได้ค่าที่ต่างกันไม่เกิน 1เปอร์เซ็นต์ ซ. ทดสอบความจำเพาะของชุดไพรเมอร์และตัวตรวจจับชุดใหม่ กับตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตว์น้ำที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัส ตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตว์นำที่ติดเชื้อไวรัสและแบคทีเรียชนิดอื่น ตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตว์น้ำปกติ ผลพบว่าชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับที่พัฒนาขึ้นใหม่ ให้ผลบวกเฉพาะตัวอย่างสัตว์น้ำที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสเท่านั้น ฌ. การทดสอบตัวอย่างสัตว์นำที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสจากประเทศอื่น พบว่าชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับสามารถเพิ่มจำนวนเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสที่แยกได้จากประเทศอื่นอย่างถูกต้อง 6. กรรมวิธีการทดสอบสารสกัดจากเชื้อราเอนโดไฟด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 5 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งใบพืชที่ถูกสกัดเอาคลอโรฟิลล์ออกแล้วจากข้อ ง. มาทำการย้อมสี โดยนำมาแช่ในสีย้อมเชื้อราที่มีส่วนผสมของ โคมาสซี่ บริลเลี่ยนบลู อาร์-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250) ปริมาณ 0.1-0.4 กรัม ละลายในสารละลายเมทานอลร้อยละ 50 (50% methanol) ปริมาตร 70-100 มิลลิลิตร ผสมกับกรดอะซิติก (acetic acid) ปริมาตร 8-12มิลลิตร เป็นเวลา 0.5-2 นาที 7. กรรมวิธีการทดสอบสารสกัดจากเชื้อราเอนโดไฟด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 6 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่งใบพืชที่ผ่านการย้อมสีจะทำการเก็บไว้ในกลิเซอรอลร้อยละ 25 (25% glycerol) ------------ หน้าที่ 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ

1. ชุดไพร์เมอร์ (primer) และตัวตรวจจับ (DNA probe) ออกแบบและ สังเคราะห์ขึ้น สำหรับการตรวจหาเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในสัตว์นำ มีความจำเพาะต่อชิ้นส่วนที่ 3 (segment 3) มี ลำดับนิวคลีโอไทด์ ดังนี้ -ฟอร์เวิร์ดไพร์เมอร์ (forward primer) TiLV-93F: 5'-AGC CTG CCA CAC AGA AG-3' -รีเวอร์สไพร เมอร์ (reverse primer) TiLV-93R: 5'- CTG CTT GAG TTG TGC TTC T-3' -ตัวตรวจจับ (probe) TiLV-93Probe 5’-CTC TAC CAG CTA GTG ccc CA-3’

2. กรรมวิธีการใช้ชุดไพร์เมอร์ (primer) และตัวตรวจจับ (DNA probe) สำหรับตรวจหา เชื้อทิลาเปียเลคไวรัสในตัวอย่างสัตว์น้ำประกอบด้วย ก. การสกัดอาร์เอ็นเอจากตัวอย่าง โดยการนำเนื้อเยื่อสัตว์น้ำ ได้แก่ ตับ สมอง ม้าม ไต เลือด เหงือก ลำไส้ เมือก อวัยวะสืบพันธุ์. รังไข่ ถุงน้ำเชื้อ หรือตัวอย่างจากพาหะและสิ่งแวดล้อม โดย อาร์เอ็นเอถูกสกัดด้วยชุดสกัดอาร์เอ็นเอหรือสกัดด้วยวิธีไตรซอล-คลอโรฟอร์ม (Trizol-chloroform extraction) ข. การเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณแบบ 1 ขั้นตอนในหลอด เดียว (single-tube qPCR) โดยการเปลี่ยนอาร์เอ็นเอ (RNA) ไปเปีนซีดีเอ็นเอ (cDNA) ด้วยเอนไซม์รี เวิร์สทรานสคริปเตส (reverse transcriptase) และเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมภายในหลอดเดียวด้วยวิธี พีซีอาร์เชิงปริมาณ หรือการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมเชิงปริมาณแบบ 2 ขั้นตอน (2-step qPCR) โดย การเปลี่ยนอาร์เอ็นเอเป็นซีดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเตส แล้วย้ายซีดีเอ็นเอที่เตรียมได้ไป ยังหลอดทดลองใหม่เพื่อเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณ ค. ส่วนผสมของปฏิกิริยาพีซีอาร์เชิงปริมาณเพื่อเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมของเชื้อ TiLV มีส่วนผสมของไอแทคยูนิเวอร์แซลโพรบมาสเตอรมิกซ์ (iTaq universal probes mastermix) ที่ ประกอบด้วยเอนไซม์แทคดีเอ็นเอโพลีเมอเรส (Taq DNA polymerase) สารดีออกซีนิวคลีโอไทด์ ไตร ฟอสเฟต (Deoxynucleotide triphosphate; dNTPs) สารแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgC12) ปริมาณทั้งหมด ไมโครลิตร ส่วนผสมของไพร์เมอร์ TiLV-93F ไพร์เมอร์ TiLV-93R และตัวตรวจจับ (probe) TiLV- 93Probe ที่มีความเข้มข้น 50-1000 นาโนโมลาร์ (nM) ปริมาณ 0.5 ไมโครลิตร ง. ผสมตัวอย่างสารพันธุกรรมจากตัวอย่างสัตว์น้ำจำนวน 1-1,000 นาโนกรัมต่อ ไมโครลิตร ในปริมาตร 1ไมโครลิตร และน้ำกลั่นบริสุทธิ์(molecular grade water) เพื่อปรับปริมาตร สุดท้ายเป็น 10ไมโครลิตรในหลอดทดสอบที่มีส่วนผสมของน้ำยาทั้งหมด หน้าที่ 2 ของจำนวน 2 หน้า จ. สภาวะที่เหมาะสมต่อการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมของเชือไวรัส TiLV ด้วยชุดไพร์ เมอร์และตัวตรวจจับใหม่ ประกอบด้วยอุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 นาที ต่อจากนั้นเพิ่ม จำนวนสารพันธุกรรมจำนวน 40 รอบ ที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 วินาที 56 องศา เซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาที ฉ. การวิเคราะห์ผลที่เกิดขึ้นวัดจากปริมาณการปล่อยแสงของตัวตรวจจับ (probe) ที่เกิด จากปฏิกิริยาการเพิ่มจำนวนของสารพันธุกรรมของไวรัส ซึ่งจะถูกบันทึกโดยเครื่องพีซีอาร์ ผลิตภัณฑ์ ที่เกิดจากการเพิ่มจำนวนของปฏิกิริยาพีซีอาร์เชิงปริมาณวัดด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟไรซิส (agarose gel electrophoresis) จะพบผลิตภัณฑ์ขนาด 93 นิวคลีโอไทด์ เมื่อย้อมเจลด้วยสีเอธิเดียมโบร ไมด์ (ethidium bromide) แล้วดูผลภายใต้เครื่องกำเนิดแสงยูวี ช. การสร้างกราฟมาตรฐานเพื่อหาความไวของชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับ โดยการ เจือจางตัวอย่างเบือเยื่อสัตว์นำที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสมาเจือจางทีละ 10 เท่า (10-fold serial dilution) ซึ่งครอบคลุมระดับความเข้มข้นของเชื้อไวรัสระหว่าง l010-104 ตัวต่อไมโครลิตร (copies/pl) แล้วนำตัวอย่างไปทดสอบด้วยวิธีพีซีอาร์เชิงปริมาณ ทำทั้งหมด 3 ซ้ำ นำค่าเฉลี่ยของแต่ละ ความเข้มข้นมาสร้างกราฟมาตรฐานได้ค่าที่ต่างกันไม่เกิน 1 เปอร์เซ็นต์ ช. ทดสอบความจำเพาะของชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับชุดใหม่ กับตัวอย่างเนื้อเยื่อ สัตว์น้ำที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัส ตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตว์นำที่ติดเชื้อไวรัสและแบคทีเรียชนิดอื่น ตัวอย่างเนื้อเยื่อสัตว์น้ำปกติ ผลพบว่าชุดไพร์เมอร์และตัวตรวจจับที่พัฒนาขึ้นใหม่ ให้ผลบวก เฉพาะ ตัวอย่างสัตว์น้ำที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสเท่านั้น ฌ. การทดสอบตัวอย่างสัตว์น้ำที่ติดเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสจากประเทศอื่น พบว่าชุดไพร์ เมอร์และตัวตรวจจับสามารถเพิ่มจำนวนเชื้อทิลาเปียเลคไวรัสที่แยกได้จากประเทศอื่นอย่างถูกต้อง