SK7797A3 - A method of controlling cell distribution within bioartificial organ - Google Patents

A method of controlling cell distribution within bioartificial organ Download PDF

Info

Publication number
SK7797A3
SK7797A3 SK77-97A SK7797A SK7797A3 SK 7797 A3 SK7797 A3 SK 7797A3 SK 7797 A SK7797 A SK 7797A SK 7797 A3 SK7797 A3 SK 7797A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cells
cell
proliferation
gene
differentiation
Prior art date
Application number
SK77-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Malcolm Schinstine
Molly S Shoichet
Frank T Gentile
Joseph P Hammang
Laura M Holland
Brian M Cain
Edward J Doherty
Shelley R Winn
Patrick Aebischer
Original Assignee
Cytotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/279,773 external-priority patent/US5935849A/en
Application filed by Cytotherapeutics Inc filed Critical Cytotherapeutics Inc
Publication of SK7797A3 publication Critical patent/SK7797A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/383—Nerve cells, e.g. dendritic cells, Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/74—Alginate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Spôsob kontroly distribúcie buniek v bioarteficiálnom orgáne
Oblasť techniky
Vynález opisuje postupy a kompozície, ktoré slúžia na kontrolu distribúcie a rastu buniek zapuzdrených v bioarteficiálnom orgáne.
Doterajší stav techniky
Bioarteficiálne orgány (BAO) sú zariadenia, ktoré obsahujú živé bunky a ktoré slúžia v organizme hostiteľa na výkon požadovaných metabolických funkcií.
Bunky zapuzdrené vnútri BAO dodávajú do organizmu hostiteľa jednu alebo viac biologicky aktívnych molekúl, ktoré sa môžu využiť na prevenciu alebo na liečbu mnohých klinických stavov, deficiencií a chorôb.
Na liečbu diabetes sa môžu napríklad použiť BAO s obsahom buniek, ktoré sekretujú inzulín. Podobne sa môžu na liečbu iných chorôb ako napríklad hypoparatyreózy a anémie použiť bunky, ktoré sekretujú parathormón (liečba hypoparatyreózy) alebo erytropoietín (liečba anémie).’
Bioarteficiálne orgány sa môžu tiež použiť ako zdroj biologicky aktívnych molekúl na liečbu alebo na prevenciu neurodegeneratívnych stavov akými sú napríklad Huntingtonova choroba, Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba a demencie spojené so syndrómom získanej imunodeficience. Okrem toho sa môžu prostredníctvom BAO dodávať do organizmu hostiteľa lymfokíny a cytokíny, ktoré slúžia na ovplyvnenie imunitného systému hostiteľa. Príkladom iných biologicky aktívnych molekúl, ktoré sa môžu dodávať prostredníctvom BAO do organizmu hostiteľa sú katecholamíny, endorfíny, enkefalíny a ďalšie opiátové a ne2 opiátové peptidy používané na tlmenie bolesti. BAO sa môžu použiť tiež na liečbu najrôznejších deficiencií enzýmov. Inou možnosťou je, že biologicky aktívne molekuly môžu z organizmu hostiteľa odstraňovať alebo v organizme hostiteľa eliminovať molekuly škodlivé pre tento organizmus. BAO môžu napríklad obsahovať biologicky aktívne molekuly, ktoré sa môžu v organizme hostiteľa použiť pri vychytávaní cholesterolu (scavengery).
Sú známe najrôznejšie BAO vo forme makrokapsúl; viď napríklad Aebischer (USA patent 5 158 881), Dione a kol. (WO 92/03327), Mandel a kol. (WO 91/00119), Aebischer (WO 93/00128). Medzi BAO tiež patria extravaskulárne difúzne komory, intravaskulárne difúzne komory, intravaskulárne ultrafiltračné komory a mikrokapsule; viď napríklad Lim a kol., Science, 210, str. 908 až 910 (1980); Sun, A. M., Methods in Enzymology, 137, str. 575 až 579 (1988); Dunleavy a kol. (WO 93/03901) a Chick a kol. (USA patent 5 002 661).
Bunky zapuzdrené v bioarteficiálnom orgáne vykonávajú v organizme hostiteľa potrebné metabolické funkcie a je teda potrebné, aby tieto bunky boli optimálnym zdrojom biologicky aktívnej molekuly, ktorá ovplyvňuje uvádzané metabolické funkcie. Obvykle sú na použitie vnútri BAO uprednostňované diferencované, nedeliace sa bunky, pred bunkami deliacimi sa, pretože tieto bunky umožňujú optimálnu produkciu požadovanej biologicky aktívnej molekuly. Napríklad väčšina diferencovaných, nedeliacich sa buniek produkuje väčšie množstvo požadovaného proteínu využívaného na liečbu ako deliace sa bunky, pretože expresia génov špecifických pre diferenciáciu a expresia génov špecifických pre bunkové delenie sú považované za antagonistické procesy, viď Wollheim, Establishment and Culture of Insulin-Secreting B Celí Lines (Založenie a kultivácia línií β-buniek, ktoré sekretujú inzulín), Methods in Enzymology, 192, str. 223 až 235 (1990). Pri diferenciácii buniek dochádza u týchto buniek k zníženiu kapacity replikácie. V mnohých prípadoch sa proliferácia a diferenciácia navzájom vylučujú, viď Oncogenes in Cellular Immortalisation and Differentiation (Onkogény, ktoré majú úlohu pri imortalizácii a diferenciácii buniek), Anticancer Research, 13, str. 1117 (1993).
Veľmi výhodné je použitie diferencovaných tkanív, pretože funkčné vlastnosti tkaniva použitého na inkorporáciu do BAO sú väčšinou zhodné s vlastnosťami diferencovaného tkaniva in vivo. Ďalšou výhodou pri použití diferencovaných, nedeliacich sa buniek je skutočnosť, že počet týchto buniek zostáva vnútri BAO relatívne konštantný. Tento fakt umožňuje lepšie predvídať výsledky experimentu a je tak umožnený aj prísun stále rovnakého množstva aktívnych látok do organizmu hostiteľa. Diferencované bunky sú okrem toho oveľa vhodnejšie na použitie vnútri BAO, v ktorom je zapuzdrený viac ako jeden druh buniek, ktoré sekretujú biologicky aktívne molekuly. Ak sú v takýchto BAO použité deliace sa bunky, môžu rôzne druhy buniek rásť rozdielnou rýchlosťou a výsledkom je potom prerastanie jedného druhu buniek. Pri použití diferencovaných, nedeliacich sa buniek, sa môže relatívne zastúpenie dvoch alebo viacerých synergických druhov lepšie regulovať.
Aj keď je použitie diferencovaných buniek v mnohých prípadoch výhodné, vyskytujú sa pri použití diferencovaných buniek priamo izolovaných z organizmu cicavcov najrôznejšie problémy.
Po prvé: existuje nebezpečenstvo potenciálnej kontaminácie izolovaného tkaniva. Je teda nutné, aby sa tkanivo odobrané z organizmov jednotlivých jedincov podrobilo ako časovo tak finančne nákladnému testovaniu, či neobsahuje nejaké patogény.
Po druhé: tkanivo sa môže počas izolácie poškodiť. Toto poškodenie môže byť mechanické alebo môže nastať poškodenie tkaniva pri použití enzymatických procedúr pri vlastnej izolácii. Proces mechanickej manipulácie nie je možné vždy jednoducho štandardizovať a výsledkom môže byť potom rozdiel medzi jednotlivými izolátmi.
Po tretie: počas izolácie môže nastať ischémia, ktorá má za následok poškodenie tkaniva.
Po štvrté: vzhľadom na rozdiely medzi darcami tkaniva môže byť obtiažne získať reprodukovateľné výsledky. Výťažok a kvalita požadovaného tkaniva môžu byť ovplyvnené vekom, pohlavím, zdravotným stavom a hladinou hormónov u živočícha, ktorý je zdrojom príslušného tkaniva.
Po piate: niekedy nie je možné získať tkanivo v množstve zodpovedajúcom požiadavkám na tvorbu BAO. K tomuto javu napríklad dochádza v prípadoch, keď ako zdroj tkaniva slúži orgán malých rozmerov alebo tam, kde je potrebné použiť veľmi veľké množstvo tkaniva. Ak ako zdroj slúži človek, je veľmi často zjavný nedostatok vhodných tkanív.
Po šieste: v niektorých prípadoch je potrebné bunky použité vnútri BAO geneticky modifikovať. V súčasnosti je obtiažne in vitro geneticky modifikovať nedeliace sa tkanivá a výsledok genetickej modifikácie a vlastnosti takto modifikovaných buniek nie je možné s určitosťou vopred stanoviť. Vzhľadom na vyššie uvedené problémy a na skutočnosť, že je výhodné používať diferencované, nedeliace sa bunky, existuje potreba vytvoriť spôsob, ktorý slúži na produkciu a zachovávanie diferencovaných, nedeliacich sa buniek vhodných na zapuzdrenie vnútri BAO.
Vzhľadom na tieto problémy sa na použitie pri konštrukcii BAO uprednostňovali deliace sa bunky a bunkové línie, ktoré vykonávajú požadované biologické funkcie. Jednou z dôležitých výhod pri použití deliacich sa buniek je skutočnosť, že tieto bunky sa môžu vo veľkom množstve pestovať in vitro, môže sa u nich ľahko zistiť prítomnosť či neprítomnosť patogénov a môžu sa úspešne skladovať. To umožňuje takmer neobmedzený prísun tkaniva pri nízkych nákladoch na jeho produkciu. Na tvorbu subpopulácií buniek so zlepšenými charakteristikami sa môžu na banku buniek aplikovať selekčné postupy, ako napríklad triedenie buniek alebo ich klonovanie. Deliace sa bunky a bun kové línie sú okrem toho prístupnejšie genetickým manipuláciám ako diferencované, nedeliace sa bunky. Skutočnosť, že je možné introdukovať do buniek cudzorodú rekombinantnú DNA vytvára veľa nových možností na zmenu funkcie alebo fenotypu týchto buniek využívaných na zapuzdrenie vnútri BAO. Táto skutočnosť umožňuje väčšiu rozmanitosť použitia BAO na liečebné účely.
Ako bolo uvedené vyššie, medzi nevýhody pri zapuzdrení kontinuálne sa deliacich buniek do BAO patrí nedostatočná regulácia počtu buniek v tomto zariadení, ktorá môže mať za následok zníženú schopnosť predvídať produkované množstvo požadovanej biologicky aktívnej molekuly.
Zatiaľ čo vo veľkej väčšine prípadov je potrebné limitovať alebo minimalizovať rast buniek vnútri BAO, v ojedinelých prípadoch, napríklad keď je BAO implantovaný do nepriateľského prostredia, môže byť žiaduce, aby sa bunkám na zachovanie konštantného počtu buniek vnútri BAO umožnila pozvoľná proliferácia.
Existuje ešte jeden všeobecný problém spojený so zapuzdrením buniek. Množstvo druhov buniek má medzibunkové adhézne vlastnosti, čo znamená, že bunky majú sklon adherovať jedna ku druhej a vytvárať tak husté nahromadenia a zoskupenia (klastre). Táto tendencia je zvlášť zjavná v neprítomnosti vhodného dostupného substrátu. V takých bunkových agregátoch môže dochádzať k vzniku centrálnych nekrotických oblastí v dôsledku toho, že bunky uväznené v centre takého zoskupenia majú sťažený prístup k živinám a kyslíku, alebo že v centre takého zoskupenia buniek dochádza k hromadeniu toxických produktov. Nekrotické tkanivo môže tiež uvoľňovať veľké množstvo bunkových proteínov (xenoproteínov alebo iných faktorov), ktoré zaplavujú organizmus hostiteľa a ktoré sú škodlivé pre prežitie buniek, napríklad faktory, ktoré vyvolávajú imunitnú odpoveď makrofágov alebo iný typ imunitnej odpovede. Tento problém môže byť ešte umocnený, keď sú bunky zapuzdrené vnútri BAO, ktorý má obal zhotovený zo semipermeabilnej membrány, pretože táto membrána tvorí bariéru, ktorá sťažuje difúziu. Veľmi často je vnútri BAO k dispozícii menej kyslíka a tiež menej živín dodávaných hostiteľom. Okrem toho sa vnútri BAO môžu akumulovať odpadové produkty.
Tieto husté bunkové zoskupenia sa môžu vytvárať pozvoľna pri raste buniek, alebo sa môžu tvoriť veľmi rýchlo. K rýchlej tvorbe zoskupení buniek dochádza pri reasociácii čerstvo dispergovaných buniek alebo tkanív a tento proces je sprostredkovaný adhéznymi proteínmi prítomnými na povrchu buniek. Bunky alebo tkanivá s vysokou metabolickou aktivitou môžu obzvlášť citlivo reagovať na znížený prísun kyslíka a živín a hynú krátko potom, čo boli uväznené” vnútri veľkého zhluku buniek. Veľa tkanív s endokrinnou aktivitou, ktoré sú obvykle v organizme prestúpené hustou sieťou kapilár, vykazuje práve také správanie; zdá sa, že práve Langerhansové ostrovčeky sú v zapuzdrenom stave zvlášť citlivé.
Je veľmi výhodné disponovať spôsobom a kompozíciou na reguláciu rastu zapuzdrených buniek, ktoré využívajú výhody ako deliacich sa buniek, tak diferencovaných, nedeliacich sa buniek. Vynález sa týka spôsobov a kompozícií, s ktorých pomocou sa môže in vitro zabezpečiť neobmedzená proliferácia a expanzia buniek a ktoré umožňujú regulovať proliferáciu a diferenciáciu buniek zapuzdrených vnútri BAO tak, aby sa dosiahla rovnováha medzi proliferáciou a diferenciáciou a aby teda mohol BAO vykonávať svoju funkciu požadovaným spôsobom. Vynález teda umožňuje reguláciu počtu buniek zapuzdrených vnútri BAO a môže teda umožniť dokonalejšiu reguláciu hladiny produkcie biologicky aktívnych látok v kapsuli. Vynález ďalej opisuje spôsoby, ktoré slúžia na reguláciu rastu buniek, pričom regulácia rastu buniek je dosiahnutá prostredníctvom kontrolovaného umiestnenia buniek vnútri BAO a teda je znížená možnosť tvorby nežiadúcich nekrotických bunkových oblastí vnútri BAO. Regulácia počtu nekrotických buniek a ich umiestnenia vnútri BAO tiež uľahčuje optimalizáciu vlastností membrány na povrchu BAO a ďalších parametrov tohto zariadenia vzhľadom na druh zapuzdrených buniek. Príčinou ľahšej optimalizácie je skutočnosť, že požadované charakteristiky príslušného zariadenia sa oveľa lepšie stanovujú pre stabilnú populáciu buniek vnútri BAO ako pre populáciu deliacich sa buniek vnútri BAO. Okrem toho sa môže dosiahnuť dlhodobý prísun biologicky aktívnych látok.
Podstata vynálezu
Vynález opisuje spôsoby a kompozície, ktoré slúžia na reguláciu distribúcie buniek (t.j. počtu buniek alebo umiestnenia buniek v BAO alebo ako počtu tak aj umiestnenia buniek vnútri bioarteficiálneho orgánu, ktoré sú zapuzdrené v BAO. Medzi spôsoby a kompozície podľa vynálezu patria:
1) spôsoby a kompozície, ktoré slúžia na modifikáciu buniek, ktoré sú zapuzdrené v BAO a
2) spôsoby a kompozície, ktoré slúžia na modifikáciu povrchov, na ktorých rastú bunky zapuzdrené v BAO.
Medzi spôsoby a kompozície, ktoré slúžia na bunkové manipulácie patrí zmena genetickej informácie buniek pomocou génu, ktorý kóduje produkt ovplyvňujúci proliferáciu a diferenciáciu buniek. Tento spôsob môže zahŕňať podanie chemickej zlúčeniny alebo rastového faktora, ktoré inhibujú proliferáciu alebo naopak indukujú diferenciáciu buniek. Inou možnosťou je odohranie chemickej zlúčeniny alebo rastového faktora, ktoré inhibujú proliferáciu alebo naopak indukujú diferenciáciu buniek, z rastového média. Spôsob sa môže použiť pred alebo až po vlastnom zapuzdrení buniek do BAO, s výhodou však pred zapuzdrením. Proliferácia buniek sa môže tiež regulovať pomocou radiácie.
Medzi spôsoby a kompozície, ktoré slúžia na modifikáciu povrchov, na ktorých rastú bunky (rastové povrchy) patrí potiahnutie aspoň jedného povrchu vnútri BAO jednou alebo viacerými molekulami extracelulárnej matrice (ECM - extracelular matrix molecule). ECM môžu byť potiahnuté priamo na luminálny povrch BAO alebo na akúkoľvek nosnú plochu vnútri BAO alebo na nosiče vo forme mikroguľôčiek (mikronosiče). Bunky alebo mikronosiče s bunkami na svojom povrchu môžu byť okrem toho suspendované v matrici tvorenej materiálom, ktorý fyzicky inhibuje bunkovú proliferáciu. Materiál, ktorý tvorí matricu sa môže ďalej pozmeniť chemickými alebo peptidovými derivátmi.
Rastové povrchy vnútri BAO sa môžu okrem toho modifikovať pomocou chemických postupov, ktoré inhibujú alebo naopak uľahčujú pripojenie buniek k luminálnemu povrchu BAO. Rastové faktory sa môžu pred vlastným umiestnením buniek ďalej upraviť pridaním inertného lešenia k týmto povrchom. Toto lešenie fyzicky inhibuje prerastanie buniek a vytvára dodatočné miesta, ktoré slúžia na pripojenie buniek. Je potrebné si uvedomiť, že je možné kombinovať rôzne spôsoby a kompozície, ktoré slúžia na modifikáciu buniek a na modifikáciu rastových povrchov .
Stručný opis obrázkov
Obr. 1: znázorňuje plazmidovú mapu konštruktu, ktorý sa skladá z fragmentu myšieho promótora Mxl s veľkosťou 2,3 kb pripojeného k časnej oblasti vírusu SV40 nasledovanej fragmentom BamHl-Xbal, ktorý pochádza z 3’ neprekladanej oblasti myšieho B-globínu.
Obr. 2: znázorňuje v časových intervaloch 4 (I), 11 (II) a 25 (III) dní sekréciu NGF (zvislá os, kalibrované v ng/ml/24h) bunkami BHK. Legenda: spôsob modifikácie membrán v percentách PEO-PDMS a hmota použitej matrice: A - 0 %, Vitrogen™; B - 1 %, Vitrogen™; C - 5 %, Vitrogen™; D - 0 %, bez matrice; E - 1 %, bez matrice; F - 5 %, bez matrice; G - 0 %, agaróza; H - 1 %, agaróza; I - 5 %, agaróza.
Obr. 3: znázorňuje sekréciu NGF (zvislá os, kalibrované v ng/ml) bunkami BHK rastúcimi na mikronosičoch CultiSphers™ bez prítomnosti agarózovej matrice (legenda: A (008), D (0709)) alebo v prítomnosti agarózovej matrice (legenda: B (008), C (709)).
Obr. 4: znázorňuje v časových intervaloch 1 (I), 14 (II) a 28 (III) dní sekréciu katecholamínov bunkami PC12A, ktoré boli zapuzdrené vnútri BAO, ktorý niesol inertné lešenie pripravené z PHEMA. Sekrécia je vyznačená na zvislej osi kalibrovanej v pmol/ml/15 min. Časť A znázorňuje bazálnu sekréciu katecholamínov; časť B znázorňuje sekréciu katecholamínov vyvolanú prítomnosťou iónov K*. Sledovali sa hodnoty sekrécie týchto katecholamínov L-dopa (A), norepinephrin, noradrenalín (B), epinephrin, adrenalín (C), dopac (D), dopamín (E) a homovanilovej kyseliny (F).
Obr .5: znázorňuje v časových intervaloch 1 (I), 14 (II) a 28 (III) dní sekréciu katecholamínov bunkami PC 12A, ktoré boli zapuzdrené vnútri BAO, ktorý niesol inertné lešenie pripravené z PHEMA/MMA. Sekrécia je vyznačená na zvislej osi kalibrovanej v pmol/ml/15 min. Časť A znázorňuje bazálnu sekréciu katecholamínov; časť B znázorňuje sekréciu katecholamínov vyvolanú prítomnosťou iónov K*. Sledovali sa hodnoty sekrécie týchto katecholamínov L-dopa (A), norepinephrin, noradrenalín (B), epinephrin, adrenalín (C), dopac (D), dopamín (E) a homovanilovej kyseliny (F).
Obr. 6: znázorňuje v časovej intervaloch 2 (I), 20 (II), 40 (III) a 80 (IV) dní sekréciu L-dopa bunkami SV40/DB4-NGF rastúcich na mikronosičoch CultiSphers™ v prítomnosti alginátovej matrice (A) alebo v prítomnosti agarózovej matrice (B).
Definícia termínov používaných vo vynáleze
Bioarteficiálny orgán alebo BAO podlá vynálezu je zariadenie, ktoré môže byť určené na implantáciu do organizmu hostiteľa alebo ktoré môže fungovať mimo organizmus hostiteľa a môže byť k organizmu hostiteľa pripojené buď trvalo alebo na prechodné obdobie. BAO obsahujú bunky alebo živé tkanivá, ktoré produkujú biologicky aktívne molekuly, ktoré majú v orga nížme hostiteľa terapeuticky efekt. BAO by po implantácii do hostiteľského organizmu recipienta mal byť biokompatibilný. BAO by teda nemal v organizme hostiteľa vyvolávať nežiadúce reakcie, ktoré by mohli zapríčiniť nefunkčnosť BAO, alebo jeho neschopnosť ďalšieho použitia na terapeutické účely. BAO sa môže napríklad stať nefunkčným, ak sa okolo kapsule vytvorí fibrózny obal, ktorý zapríčiní zníženie rýchlosti difúzie živín k bunkám vnútri tejto kapsule. Medzi nežiadúce efekty tiež patrí odvrhnutie kapsule organizmom hostiteľa alebo uvoľňovanie toxických alebo pyrogénnych zlúčenín (napríklad syntetických polymérnych vedľajších produktov) z BAO do okolitého tkaniva hostiteľa.
BAO s obsahom zapuzdrených buniek sa môžu konštruovať tak, aby mali imunoizolačné vlastnosti, ktoré znemožnia prvkom imunitného systému hostiteľa vniknúť do vnútra orgánu a tým vlastne chránia bunky zapuzdrené vnútri BAO pred zničením spôsobeným imunitnou reakciou hostiteľa. Využitie BAO zvyšuje počet druhov buniek, ktoré sa môžu použiť v procese liečby. Vnútri implantovaných BAO, ktoré môžu ale nemusia mať imunoizolačné vlastnosti, sú obvykle prítomné bunky alebo tkanivá, ktoré produkujú vybraný produkt spolu so semipermeabilnou fyzickou bariérou, ktorá umožňuje difúziu živín, odpadových produktov a sekretovaných látok do okolitého tkaniva hostiteľa a súčasne vnútri BAO zadržiava príslušné bunky. Táto semipermeabilná fyzická bariéra tiež minimalizuje zhubné účinky bunkových a molekulárnych efektorov imunitnej reakcie, ktoré vedú k odvrhnutiu BAO. Imunoizolačné vlastnosti nie sú však nevyhnutné vo všetkých prípadoch (napríklad, ak sú použité bunky autológne alebo syngénne k bunkám hostiteľa).
Termín biologicky aktívna molekula označuje látku, ktorá:
a) môže vykonávať funkciu vnútri bunky, ktorá túto molekulu produkuje alebo
b) môže byť exprimovaná na bunkovom povrchu a môže ovplyvňovať interakcie bunky s ostatnými bunkami alebo s biologicky aktívnymi molekulami (napríklad receptor pre neurotransmi11 téry alebo bunková adhézna molekula) alebo
c) môže byť uvoľňovaná alebo sekretovaná z bunky, ktorá túto molekulu produkuje a môže nejakým spôsobom interagovať f s inou cieľovou bunkou alebo cieľovou molekulou v organizme hostiteľa (napríklad neurotransmiter, hormón, rastový faktor alebo cytokín).
Termín bunky” podľa vynálezu, ak nie je špecifikované inak, označuje bunky v akejkoľvek forme, vrátane, ale nielen, buniek tvoriacich tkanivo, zhlukov buniek a jednotlivých izolovaných buniek. Bunky podľa vynálezu produkujú aspoň jednu biologicky aktívnu molekulu.
Regulácia distribúcie buniek vnútri BAO označuje reguláciu počtu buniek vnútri BAO, reguláciu ich umiestnenia v priestore vnútri BAO alebo súčasnú reguláciu obidvoch uvedených charakteristík buniek.
Vo vynáleze sa môže použiť široký rozsah buniek. Patria sem ako zo stavu techniky známe, všeobecne dostupné línie imortalizovaných buniek tak aj deliace sa primárne bunkové kultúry. Ako príklad všeobecne dostupných bunkových línií vhodných na uskutočnenie vynálezu môžu slúžiť bunky L-6, bunky MDCK, bunky LLC-PK, bunky B-CH3, bunky C2, bunky obličiek mláďat škrečkov (BHK), bunky vaječníkov čínskeho škrečka (CHO), myšie fibroblasty (L-M), myšie embryonálne bunky NIH Swiss (NIH/3T3), bunkové línie, ktoré pochádzajú z organizmu mačiaka zeleného (vrátane buniek COS-a, COS-1, COS-6, COS-7, BSC-1, BSC-40, BMT-10 a buniek Vero), bunky adrenálneho pheochromocytómu potkanov (PC 12), gliové nádorové bunky potkanov (C6), bunky RAJI (ľudský lýmfóm), bunky plazmacytómu myší MOPC-31 C, bunky MN9D, bunky MN9H, bunky izolované z transgénnych myší ripTAg, bunky SCT-1, bunky B-TC, bunky Hep-G2, bunky AT-T20, línie beta-buniek ako napríklad bunky NIT alebo bunky RIN, bunky Ntera-2 (Pleasure a ďalší, Journ. Neuroscience, 12, str. 1802 až 1815 (1992)) a bunkové línie ľudských astrocytov ako napríklad bunky U-373 a U-937.
Medzi primárne bunky, ktoré sa môžu použiť, patria kmeňové nervové bunky alebo progenitory nervových buniek, ktoré reagujú na prítomnosť bFGF izolovanej z CNS cicavcov (Richards a kol., PNAS, 89, str. 8591 až 8595 (1992); Ray a kol., PNAS, 90, str.3602 až 3606 (1993)), primárne fibroblasty, Schwannove bunky (WO/03536), astrocyty, oligodendrocyty a ich prekurzory, myoblasty a adrenálne chromatínové bunky. Jednou z takých bunkových línií myoblastov je napríklad bunková línia CC·
Bunky sa môžu tiež vybrať na základe postupu použitého na reguláciu rastu a diferenciácie buniek. Kmeňové bunky sa môžu napríklad jednoducho použiť v spôsoboch, pri ktorých je diferenciácia buniek indukovaná pomocou prídavku chemickej látky. Vo všeobecnosti sa za kmeňové bunky považujú nediferencované bunky, ktoré sú in vi vo obvykle v kľudovom stave, ale sú aj tak schopné proliferácie, ktorej výsledkom je vznik väčšieho počtu kmeňových buniek, ktoré majú schopnosť produkovať veľké množstvo buniek-progenitorov, z ktorých následne vznikajú diferencované alebo diferenciácie schopné dcérske bunky. Kmeňové bunky reprezentujú triedu buniek, ktoré sa môžu ľahko množiť v kultúre a ktorých potomstvo môže byť diferencované pridaním špecifických rastových faktorov; viď napríklad Weiss a kol., (PCT/CA 92/00283).
Myoblasty sú jedným z typov buniek, ktoré môžu byť podľa vynálezu zapuzdrené vnútri BAO. Myoblasty sú prekurzory svalových buniek pôvodne odvodené z populácie mezodermálnych kmeňových buniek. Je dostupné veľké množstvo bunkových línií myoblastov, ktoré môžu byť diferencované v bunkovej kultúre; napríklad bunky L-9 a bunky B-CH3. Primárne myoblasty sa môžu ľahko izolovať z tkaniva získaného pri autopsii alebo biopsii a môžu sa purifikovať a rozmnožiť. Myoblasty proliferujú a fúzu jú za vzniku diferencovaných, polyjadrových myotubúl. Myotubule sa už ďalej nedelia, ale pokračujú v produkcii svalových proteínov. Počas proliferácie sa môžu myoblasty jednoducho geneticky pozmeniť tak, aby produkovali molekuly používané na terapeutické účely. Existujú spôsoby, ktoré slúžia na zavedenie jedného alebo viac génov do myoblastov tak, aby tieto myoblasty produkovali biologicky aktívne molekuly. Myoblasty sú schopné migrovať, fúzovať s už vytvorenými vláknami a môžu slúžiť ako nosiče introdukovaného(ných) génu(ov). Verma ä kol. (WO 94/01 129); Blau a kol., TIG, 9, str. 269 až 74 (1993); WO 93/03768; WO 90/15863. Geneticky upravené bunky môžu byť zapuzdrené vnútri BAO a môže sa im ponechať možnosť diferencovať vnútri BAO alebo môžu byť vnútri BAO zapuzdrené už diferencované bunky.
Výber buniek závisí tiež na požadovanej aplikácii. Bunky zapuzdrené vnútri BAO sa môžu napríklad vybrať s cieľom sekrécie neurotransmitérov. Medzi také neurotransmitery patria dopamín, kyselina gama-aminobutánová (GABA), serotonín, acetylcholín, noradrenalín, adrenalín, kyselina glutámová a iné neurotransmitery peptidovej povahy. Bunky sa môžu tiež použiť na syntézu a sekréciu fyziologicky aktívnych agonistov, analógov, derivátov alebo fragmentov neurotransmitérov. Tu patria napríklad bunky, ktoré sekretujú bromokriptín, ktorý je antagonistom dopamínu, alebo bunky, ktoré sekretujú L-dopa, ktorý je prekurzorom dopamínu.
Môže sa uskutočniť výber buniek s cieľom sekrécie hormónov, cytokínov, rastových faktorov, trofických faktorov, angiogénnych faktorov, protilátok, faktorov, ktoré majú úlohu pri koagulácii krvi, lymfokínov, enzýmov a iných terapeutických agens alebo ich antagonistov, prekurzorov, aktívnych analógov alebo aktívnych fragmentov. Medzi tieto látky patria enkefalíny, katecholamíny, endorfíny, dynorfín, inzulín> faktor VIII, erytropoietín, substancia P, rastový faktor nervových buniek (NGF), neurotrofný faktor produkovaný líniou gliových buniek (GDNF - glial celí line-derived Neurotrophic Factor), rastový faktor produkovaný krvnými doštičkami (PDGF), epidermálny rastový faktor (EGF), neurotrofný faktor produkovaný v mozgu (BDNF - brain-derived neurotrophic factor), neurotrofín-3 (NT-3), neurotrofín-4/5, CDF/LIF, B-FGF, α-FGF, spektrum ďalších rastových faktorov produkovaných fibroblastami, ciliárny neurotrofný faktor (CNTF) a interleukíny.
Z toho vyplýva, že medzi bunky použiteľné v spôsoboch podľa vynálezu patria netransformované bunky, ktoré sekretujú požadovanú(é) biologicky aktívnu(e) molekulu(y) alebo bunky transformované s cieľom sekrécie biologicky aktívnej(ich) molekuly(molekúl).
Klonovali sa gény, ktoré kódujú množstvo biologicky aktívnych molekúl a sú tiež publikované nukleotidové sekvencie týchto génov. Mnohé z týchto génov sú všeobecne dostupné v zbierkach kultúr ako je napríklad Američan Type Culture Collection (ATCC) alebo z rôznych komerčných zdrojov. Gény, ktoré kódujú biologicky aktívne molekuly použiteľné vo vynáleze, ktoré nie sú všeobecne dostupné, sa môžu získať s použitím štandardných metód rekombinácie DNA, akými sú napríklad amplifikácia pomocou PCR alebo screening genómových a cDNA knižníc s použitím akýchkoľvek oligonukletidových sond, ktorých sekvencie boli publikované. V spôsoboch podľa vynálezu sa môžu použiť akékoľvek známe gény, ktoré kódujú biologicky aktívne molekuly; viď napríklad USA patent 5 049 493; Gage a kol, USA patent 5 082 670 a USA patent 5 167 762.
Využiteľné” gény (t.j. gény, ktoré kódujú vhodnú biologicky aktívnu molekulu) sa môžu pomocou štandardných techník vložiť do klonovacieho miesta vhodného expresívneho vektora. Také štandardné techniky sú odborníkom dobre známe.
Expresívny vektor, ktorý nesie využiteľný gén sa môže potom použiť na transfekciu bunkovej línie použiteľnej ďalej v spôsoboch podľa vynálezu. Môžu sa využiť štandardné techniky transfekcie, akými sú napríklad koprecipitácia s fosforečnanom vápenatým, transfekcia pomocou DEAE-dextránu, postupy sprostredkované molekulami lipidov alebo elektroporácia.
Vo vynáleze sú opísané spôsoby, ktoré slúžia na reguláciu rastu deliacich sa buniek, s ktorých pomocou sa môže regulovať vzájomný pomer medzi proliferáciou a diferenciáciou buniek. Výsledkom je potom množstvo diferencovaných, nedeliacich sa buniek zapuzdrených v BAO. Vynález ďalej opisuje spôsoby, kto ré slúžia na reguláciu rastu ako deliacich sa tak nedeliacich sa buniek, s ktorých pomocou sa môže regulovať počet a priestorové usporiadanie buniek vnútri BAO. Výsledkom je spomalenie tvorby nekrotických bunkových oblastí a zníženie rýchlosti tvorby bunkových fragmentov.
Regulácia proliferácie a diferenciácie buniek s využitím metód génového inžinierstva
Vynález opisuje spôsoby a kompozície, ktoré slúžia na reguláciu bunkového rastu. Táto regulácia sa dosiahne zmenou genetickej informácie buniek prostredníctvom génu, ktorý kóduje produkt ovplyvňujúci proliferáciu a diferenciáciu buniek.
V jednom uskutočnení vynálezu sú kvôli dosiahnutiu regulácie rastu buniek v BAO použité podmienene imortalizované bunkové línie. Primárne bunky sú transformované génom, ktorý kóduje produkt podporujúci proliferáciu. Tento gén, ktorý podporuje proliferáciu, je funkčne pripojený k regulovateľnému promótoru. Techniky opísané v Land a kol., Náture, 304, str. 596 až 602 (1983) alebo Cepko, Neurón, 1, str. 345 až 53 (1988), ktoré slúžia na produkciu imortalizovaných buniek sa môžu modifikovať s cieľom produkcie podmienene imortalizovaných buniek.
V spôsobe podľa vynálezu môže byť bunková proliferácia (t.j. mitóza) inhibovaná alebo zastavená pomocou zníženia hladiny expresie génu, ktorý podporuje proliferáciu, akým je napríklad onkogén (napríklad c-myc, v-mos, v-Ha-ras, T-antigén vírusu SV40, El-A z adenovírusov). Zníženie rýchlosti expresie onkogénu sa dosiahne negatívnou reguláciou, represiou alebo inaktiváciou promótora, ktorý riadi expresiu onkogénu, potom čo sa BAO implantuje in vivo do organizmu hostiteľa. Pozitívna regulácia, aktivácia alebo derepresia regulovateľného promótora uskutočnená in vitro má za následok expresiu génu, ktorý podporuje proliferáciu a teda in vitro umožňuje proliferáciu buniek. Vhodnými promótormi sú také promótory, ktoré sa môžu in vivo negatívne regulovať. Medzi také promótory patria na príklad promótory, ktoré reagujú na prítomnosť glukokortikoidov, ako napríklad PNMT (Hammag a kol., Neuroprotocols, 3, str. 176 až 83 (1993)) a promótory, ktoré reagujú na prítomnosť interferónov, ako napríklad Mxl (Hug a kol., Mol. Celí. Biol., 8, str. 3065 až 79 (1988); Arnheiter a kol., Celí, 52, str. 51 až 61 (1990)), promótory v retrovirálnych LTR úsekoch, promótory, ktoré reagujú na prítomnosť tetracyklínu, napríklad lac promótor a promótory, ktoré reagujú na prítomnosť inzulínu; viď tiež McDonnell a kol., WO 93/23431. Je potrebné si uvedomiť, že výber promótora bude závisieť na plánovanom mieste implantácie. Na implantáciu do mozgu podľa tohto spôsobu sú teda vhodné napríklad promótory, ktoré reagujú na prítomnosť glukokortikoidov alebo promótory, ktoré reagujú na prítomnosť interferónov, pretože hladina glukokortikoidov a/alebo IFN v mozgu je veľmi nízka. Nepredpokladá sa teda, že by expresia onkogénu riadená týmito promótormi po implantácii BAO do mozgu dosahovala významnú úroveň.
V jednom uskutočnení vynálezu sú podmienene imortalizované bunky vytvorené spôsobom, pri ktorom je onkogén funkčne pripojený k regulovateľnému promótoru. Tento promótor je aktivovaný alebo pozitívne regulovaný v prítomnosti väzbového proteínu. Produkcia väzbového proteínu sa môže regulovať tak, že gén, ktorý kóduje väzbový proteín je funkčne pripojený k promótoru, ktorý reaguje na prítomnosť tetracyklínu.
Jedno uskutočnenie vynálezu využíva transformované bunky s obsahom konštitutívneho promótora, ktorý riadi expresiu tet represora. Bunky okrem toho obsahujú cudzorodý gén funkčne pripojený k promótoru CMV-IE. Ak je promótor CMV-IE ohraničený sekvenciami tet operátora, expresia riadená týmto promótorom sa môže pomocou tet represora zastaviť. V prítomnosti tetracyklínu dochádza k transkripcii, pretože tet sa viaže na tet represor a umožňuje tým vlastne väzbu ostatných transkripčných faktorov na promótor CMV-IE. Podľa tohto uskutočnenia vynálezu je teda onkogén exprimovaný len v prítomnosti tetracyklínu. V prítomnosti tetracyklínu môže teda in vitro dochádzať k proliferácii buniek.
Niekoľko dní pred vlastnou implantáciou sa môže tetracyklín odstrániť, čo má za následok zníženú rýchlosť expresie cudzorodého génu a teda zodpovedajúce spomalenie alebo zastavenie proliferácie buniek vnútri BAO.
V špecifickom uskutočnení vynálezu sa regulácia rastu u podmienene imortalizovaných buniek dosiahne pomocou promótora Mxl. Gén Mxl kóduje proteín, ktorý prepožičiava organizmu rezistenciu voči chrípke A a B. Gén Mxl je dokonale regulovaný svojím promótorom. V neprítomnosti interferónu (IFN) nie je tento gén exprimovaný a jeho expresiu je možné indukovať pomocou IFN-α a IFN-β. Arnheiter a kol., Celí, 52, str. 51 až 61 (1990) opísal vytvorenie transgénnych myší Mxl, u ktorých je možné pomocou interferónu indukovať v niektorých tkanivách expresiu cudzorodého génu. Bunky získané z najrôznejších tkanív sa môžu transformovať a imortalizovať prostredníctvom veľkého T-antigénu vírusu SV40.
V jednom uskutočnení vynálezu môže byť myší promótor Mxl spojený s časnou oblasťou vírusu SV40 a vzniknutý chimerický produkt potom môže slúžiť na vytvorenie transgénnej myši. Dokonalá regulácia expresie zapríčinená prítomnosťou promótora Mxl umožňuje v tkanivách alebo v bunkových kultúrach pripravených z transgénneho zvieraťa regulovať hladinu expresie onkogénu a tým vlastne umožňuje vytvorenie podmienene imortalizovaných bunkových línií.
Bunkové línie vytvorené opísaným spôsobom sa môžu, tak ako väčšina ostatných bunkových línií, množiť v prítomnosti IFN-α alebo IFN-β. Odstránením IFN-α alebo IFN-β sa môže delenie buniek zastaviť buď pred alebo až po zapuzdrení buniek. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa môžu z transgénnej myši, ktorá nesie konštrukt Mxl-T-antigén vírusu SV40, s použitím postupu podľa Weissa (PCT/CA 92/00283) získať kmeňové nervové bunky (neurosféry). Takto získaná línia podmienene imortalizovaných buniek sa môže následne zapuzdriť a implantovať in vivo do organizmu hostiteľa.
Podmienene imortalizované kmeňové nervové bunky sa môžu okrem toho, ak je to žiaduce, ďalej geneticky modifikovať pomocou štandardných techník. Výsledkom tejto modifikácie je skutočnosť, že kmeňové nervové bunky uvoľňujú niektorý z veľkého počtu rastových faktorov alebo neurotransmiterov. V tomto uskutočnení vynálezu je možné s výhodou použiť aj iné promótory, ktoré reagujú na prítomnosť interferónov. Medzi tieto promótory patria promótor metalotioneínu, H-2Kto, Η-2ϋ^, H-2IT1, HLA-A3, HLA-DRa a gén HLA triedy I, 202, 56K, 6-16, IP-10, ISG15, ISG54 a 2', 5'-oligo(A) syntetázy; viď Hug a kol., Mol. Celí. Biol., 8, str. 3065 až 3079 (1988).
Toto uskutočnenie vynálezu je zvlášť výhodné pre bunky, ktoré majú byť zapuzdrené vnútri BAO, ktorý je určený na implantáciu do mozgu. Hladina IFN-α a IFN-β v mozgu je dostatočne nízka a tak transkripčná aktivita riadená promótorom Mxl nepostačuje na to, aby boli bunky schopné proliferovať. V organizme transgénneho zvieraťa môže byť expresia T-antigénu indukovaná v niekoľkých tkanivách, ale prirodzená expresia tohto onkogénu bola pozorovaná len v týmuse. U transgénnych zvierat, ktoré exprimujú časnú oblasť vírusu SV40 je expresia tohto onkogénu v týmuse aj tak relatívne bežným javom. Pri absencii významnej expresie onkogénu môžu byť teda bunky in vivo udržiavané v stave takmer identickom s kľudovým stavom.
Iné uskutočnenie vynálezu využíva zistenie, že k zmene genetickej informácie buniek, ktoré sa ďalej používajú in vivo, pomocou spôsobov, ktoré využívajú infekciu týchto buniek retrovírusmi, sa využívajú retrovirálne promótory, napríklad promótor dlhej koncovej repetície (•'LTR'· - long terminál repeat); viď napríklad Gage a kol. (USA patent 5 082 670). Expresia génov riadená týmito promótormi je in vivo obvykle negatívne regulovaná. Predpokladá sa, že táto negatívna regulácia je zapríčinená prítomnosťou cytokínov v krvnom obehu. Vynález využíva túto negatívnu reguláciu retrovirálnych génov na zastavenie alebo spomalenie proliferácie buniek v prípadoch, keď sú tieto bunky zapuzdrené vnútri BAO a implantované in vivo. V tomto príklade je gén zodpovedný za imortalizáciu bunky 19 (onkogén) riadený LTR promótorom. Tento gén bude imortalizovať bunky pri ich kultivácii a množení in vivo. V prítomnosti cytokínov po implantácii nastane negatívna regulácia tohto génu zodpovedného za imortalizáciu a výsledkom je spomalenie alebo úplné zastavenie proliferácie a bunky teda môžu vnútri BAO prejsť do kľudového stavu.
Podľa tohto uskutočnenia vynálezu sa môže na vytvorenie podmienene imortalizovaných buniek použiť spôsob retrovirálnej infekcie alebo transfekcie buniek pomocou cDNA s obsahom onkogénu (napríklad c-myc, v-mos, v-Ha-ras, T-antigén vírusu SV40, El-A z adenovírusov) funkčne pripojenej k retrovirálnemu promótoru, napríklad LTR promótoru. Uprednostňujeme promótorové sekvencie Moloneyeho vírusu myšej leukémie (MLV), Rousovho vírusu sarkómu (RSV) a vírusu, ktorý spôsobuje nádory mliečnych žliaz myší (MMTV - mouse mammary tumor vírus).
Tieto transformované bunky budú in vitro normálne exprimovať príslušný onkogén. Úspešne transformované bunky budú kultivované s použitím zavedených techník kultivácie. Kvôli skráteniu času potrebnému na kultiváciu transformovaných buniek sa môže expresia cudzorodého génu riadeného LTR promótorom stimulovať prídavkom dexametazónu alebo epidermálneho rastového faktora. Ak budú bunky vystavené pôsobeniu cytokínov, napríklad interferónu gama (IFN-r), TNF-α a transformujúcemu rastovému faktoru beta (TGFB), nastane v dôsledku zníženia hladiny expresie cudzorodého génu riadeného LTR promótorom zníženie rýchlosti mitózy. Schinstine a Gage, Molecular a Cellular Approaches to the Treatment of Nuerological Diseases, 71, ed. Waxman, S. G. (1993); Selinger a kol., J. Immunol. 141, str. 2138 až 44 (1988); Selinger a kol., J. Virology, 61, str. 2567 až 72 (1987); Selinger a kol., J. Virology, 62, str. 619 až 21 (1988). Výhodné je, ak sú bunky vystavené pôsobeniu cytokínov niekoľko dní pred vlastným zapuzdrením a implantáciou.
Pomocou vyššie uvedených spôsobov sa môže podmienene imortalizovať akákoľvek vhodná bunka. Odborník môže pomocou dy iba v prípade, ak je táto izolácia riadená klonovaným regulátorom. Pri tejto metóde je knižnica mutantov, vznikajúcich včlenením transpozónu, vytvorená v kmeni organizmu, ktorý nemá regulátor alebo u ktorého je gén regulátora ochromený bežne používanou technikou. Transpozón používaný na inzerciu nesie tzv. reportný gén (napr. lacZ). Tento gén nemá promótor. Ak je vytvorená inzerčná knižnica, funkčná kópia regulačného génu je prenesená do knižnice buniek (napr. konjugáciou alebo elektroporáciou) a vyrastené bunky sú hodnotené na základe expresie reportného génu. V kolóniách, ktoré exprimujú reportný gén iba v prítomnosti regulačného génu, sú inzerty umiestnené bezprostredne za promótorom génu riadeného regulátorom. Ak vychádzame z predpokladu, že regulátor je špecifický pre APS biosyntetické gény, potom gény značené touto technikou sú APS biosyntetické gény. V tomto bode klonovaný regulačný gén je gafA gén, ktorý bol opísaný v PCT prihláške WO 94/01561, ktorý riadi expresiu génu pre biosyntézu pyrolnitrínu. Potom táto metóda je preferovanou metódou pre klonovanie génov pre biosyntézu pyrolnitrínu.
Alternatívna metóda pre určovanie a izoláciu génu z organizmu, nevyhnutného pre biosyntézu antipatogénnej látky (APS), kde expresia uvedeného génu je riadená regulátorom biosyntézy APS, zahrňuje:
(a) klonovanie knižnice genetických fragmentov z uvedených or-'· ganizmov do vektora, ktorý susedí s reportným bezpromótorovým génom tak, že k expresii reportného génu dôjde iba v prípade, keď klonovaný fragment poskytuje funkciu promótora .
(b) prenos vektora, opísaného v bode (a) do vhodného hostiteľa (c) určenie transformantov z bodu (b), v ktorých dochádza k expresii (d) určenie a izolácia fragmentu DNK operatívne viazaného ku genetickému fragmentu, ktorý je prítomný v transformantoch určených v kroku (c) (e) uvedený reportný gén iba v prítomnosti spomenutého regulátora (f) určenie a izoláciu fragmentu DNK operabilne viazaného ku genetickému fragmentu, ktorý je prítomný v transformantoch neho génu, výsledkom ktorej je spomalenie alebo úplné zastavenie proliferácie.
Z tohto hľadiska je vo vynáleze výhodné využiť promótory hydroxylázy tyrozínu a erytropoietínu. Tieto promótory sú obvykle negatívne regulované za podmienok, ktoré sa vyznačujú vyššou koncentráciou 02 (také podmienky sú bežné in vitro), ale sú naopak pozitívne regulované za podmienok, ktoré sa vyznačujú nižšou koncentráciou 02, ktorým sú bunky vystavené po zapuzdrení vnútri BAO a následnej implantácii do organizmu hostiteľa.
Kvôli dosiahnutiu požadovanej regulácie génu, ktorý potláča proliferáciu, sa môžu okrem toho využiť vhodné systémy spriahnutých promótorov alebo derepresibilných promótorov. Jedným z vhodných systémov je napríklad systém, ktorý využíva promótor AP 1 spolu s konštruktom lac operátor/promótor PGK1 opísaný v Hannan a koľ., Gene, 130, str. 233 až 39 (1993). Promótor AP 1 je funkčne pripojený ku génu lac represora. lacO (lac operátor) a promótor 3-fosfoglycerát kinázy (PGK 1) sú funkčne pripojené ku génu, ktorý potláča proliferáciu. Po pridaní exogénneho esteru forbolu in vitro nastane indukcia promótora AP 1, čo má za následok expresiu proteínu kódovaného lac represorom. V prítomnosti represorového proteínu nastáva represia konštruktu lacO-promótor PGK1 a teda nedochádza k žiadnej expresii génu, ktorý potláča proliferáciu. Ak je však in vivo ester forbolu neprítomný, nie je exprimovaný žiadny represorový proteín a teda nastane derepresia konštruktu lacO promótor PGK1, čo má za následok expresiu génu, ktorý potláča proliferáciu.
Vynález ďalej opisuje spôsob, v ktorom je vhodná bunka transformovaná génom kódujúcim produkt, ktorý podporuje diferenciáciu. Tento gén, ktorý podporuje diferenciáciu, je funkčne pripojený k regulovateľnému promótoru. Podľa tohto spôsobu by bol gén, ktorý podporuje diferenciáciu, exprimovaný po zapuzdrení a implantácii in vivo do organizmu hostiteľa. Pomocou vhodnej negatívnej regulácie, represie alebo inaktivácie regu lovateľného promótora môže byť však in vitro prerušená alebo inhibovaná expresia tohto génu, čím sa vlastne in vitro umožní proliferácia požadovanej bunky alebo bunkovej línie. V tomto spôsobe sa môžu použiť deliace sa bunky alebo imortalizované primárne bunky. Jedným z príkladov génov, ktoré sa zúčastňujú procesu regulácie diferenciácie buniek, je skupina chromozomálnych proteínov s vysokou pohyblivosťou označená poradovým číslom 14 (HMG). V tomto uskutočnení vynálezu sa môže, tak ako bolo uvedené vyššie v súvislosti s použitím génov potláčajúcich proliferáciu, využiť akýkoľvek vhodný promótor, ktorý je pozitívne regulovaný in vivo, ale ktorý môže byť negatívne regulovaný alebo vypnutý in vitro. Okrem toho sa môže na reguláciu expresie tumor-supresívneho génu použiť akýkoľvek vhodný systém derepresibiIných promótorov uvedený v predchádzajúcom texte.
Iným spôsobom, ktorý slúži na reguláciu rastu je využitie antimediátorovej RNA alebo DNA alebo ich derivátov. Antimediátorová RNA alebo DNA je jednovláknová nukleová kyselina, ktorá je komplementárna ku kódujúcemu reťazcu daného génu alebo ku kódujúcej mRNA, ktorá je produktom transkripcie takého génu. Ak je antimediátorová RNA prítomná v bunke v rovnakom čase ako mRNA, môže antimediátorová RNA hybridizovať s mRNA a výsledkom tejto hybridizácie je vznik dvojreťazcovej molekuly, ktorá nemôže byť prekladaná na ribozómoch a nemôže tak dochádzať k produkcii zodpovedajúceho proteínu. Antisenzia RNA sa môže do buniek zaviesť buď pomocou mikroinjekcií alebo jednoducho pridaním prebytku tejto antimediátorovej RNA do kultivačného média. Výhodnejším spôsobom podľa vynálezu je transfekcia cieľových buniek pomocou eukaryotických expresívnych vektorov. Neckers a kol., Antisense Technology: Biological Utility And Practical Considerations, (Technológia, ktorá využíva antimediátorové molekuly: biologické využitie a praktický význam), Am. J. Physiol., 265 (Lung Celí. Mol. Physiol., 9) str. L1 až L12 (1993).
Podľa tohto uskutočnenia vynálezu môže byť antimediátorový gén kódujúci antimediátorovú RNA ku génu, ktorý podporuje proliferáciu, alebo k tumor-supresívneho génu funkčne pripojený k indukovateľnému promótoru. Výsledkom indukcie promótora je produkcia antimediátorovej RNA. Ak nesú transformované bunky gén, ktorý podporuje proliferáciu podľa tohto uskutočnenia vynálezu, môže sa in vitro zastaviť alebo negatívne regulovať produkcia antimediátorovej RNA a tým vlastne umožniť proliferácia buniek alebo môže sa in vitro produkcia antimediátorovej RNA regulovať pozitívne, čo má za následok zastavenie alebo spomalenie proliferácie.
Ak obsahujú transformované bunky tumor-supresívny gén, je inou alternatívou na dosiahnutie požadovanej regulácie rastu pozitívnej regulácie produkcia antimediátorovej RNA in vitro a negatívna regulácia produkcie antimediátorovej RNA in vitro.
Technológia, ktorá využíva antimediátorové molekuly, sa môže ďalej použiť pri konštrukcii akéhokoľvek antimediátorového génu ku génu, ktorý kóduje produkt nevyhnutný na proliferáciu alebo diferenciáciu. Vhodná indukcia expresie takého antimediátorového génu by odborníkovi umožnila dosiahnuť požadovanú reguláciu rastu zapuzdrených buniek podľa tohto vynálezu.
Je výhodnejšie používať konštrukt tvorený dvojicou regulovateľný promótor/gén, s ktorým je možné manipulovať tiež in vivo, a to, ak sa zdá nevyhnutné alebo je žiadúce indukovať in vivo ďalšiu bunkovú proliferáciu. Napríklad v prípade použitia konštruktu MX1/SV40 uvedeného v predchádzajúcom texte, sa môže za účelom indukcie expresie onkogénu aplikovať buď lokálne alebo systémovo IFN. Zrýchlenie proliferácie buniek in vivo vnútri BAO môže byť žiadúce, ak má zvýšený počet buniek nahradiť vnútri BAO mŕtve bunky alebo ak požadujeme zvýšenie produkcie danej biologicky aktívnej molekuly vnútri BAO.
Regulácia rastu a diferenciácie pomocou chemických zlúčenín
Vynález ďalej opisuje spôsob, v ktorom sa môžu bunky vystaviť pôsobeniu, ktoré inhibuje proliferáciu alebo indukuje diferenciáciu. V niektorých spôsoboch je toto pôsobenie sprostredkované pridaním nejakej chemickej zlúčeniny alebo rastového faktora do kultivačného média. V iných spôsoboch je naopak toto pôsobenie sprostredkované odobratím nejakej chemickej zlúčeniny alebo rastového faktora z kultivačného média. Toto pôsobenie sa môže uskutočniť pred alebo až po zapuzdrení vnútri BAO, výhodnejšie však pred vlastným zapuzdrením.
Druh použitého proteínu alebo chemickej zlúčeniny závisí na druhu bunky a na požadovanom účinku. Odborník môže s použitím bežných techník uskutočniť screening daného druhu buniek s cieľom zistiť, či tieto bunky reagujú zodpovedajúcim spôsobom na prítomnosť zvolenej zlúčeniny alebo proteínu.
V jednom spôsobe podľa vynálezu sa regulácia distribúcie buniek dosiahne odobratím chemickej zlúčeniny, ktorá podporuje proliferáciu alebo rastového faktora z bunkového kultivačného média. V jednom uskutočnení vynálezu sa môžu kvôli indukcii proliferácie kmeňových buniek alebo progenitorov buniek, vrátane buniek z embryonálneho sympatetického ganglia a imortalizovaných progenitorov buniek, výhodnejšie potom kmeňových nervových buniek (Weiss, PCT/CA 92/00283) použiť rastové faktory, ako napríklad epidermálny rastový faktor (EGF), transformujúci rastový faktor a (TGFa), amfiregulín alebo akékoľvek vhodné iné agens. Toto umožňuje zachovanie a rozmnoženie prekurzorov neurónov in vitro. Ak sú prekurzory neurónov zapuzdrené v neprítomnosti týchto rastových faktorov, ktoré podporujú proliferáciu, nastane zastavenie ich proliferácie a diferenciácie.
Diferenciácia prekurzorov neurónov môže byť ďalej indukovaná, ak na bunky pôsobíme napríklad estermi forbolu alebo ak sú bunky pestované na nejakom tuhom substráte. Medzi také substráty patria iónovo nabité povrchy ako napríklad poly-L-lyzín, poly-L-ornitín a podobne. Diferenciácia môže byť tiež indukovaná pôsobením niektorého zo zástupcov rodiny FGF v kombinácii s aspoň jedným zástupcom rodiny ciliárnych neurotrofických faktorov (CNTF-ciliary neurotrophic factor) alebo v kom binácii s aspoň jedným zástupcom rodiny rastových faktorov nervových buniek (NGF) ako je opísané v Ip a kol. (WO 94/03199).
V inom uskutočnení vynálezu sa môže na indukciu proliferácie u hematopoietických kmeňových buniek použiť pluripotentný rastový faktor produkovaný v kostnej dreni, nazývaný tiež rastový faktor tukových buniek, faktor kmeňových buniek (stem celí factor), c-kit-ligand alebo Steel faktor. Kvôli udržaniu dostatočného počtu deliacich sa buniek in vitro sa hematopoietické kmeňové bunky kultivujú v prítomnosti rastového faktora tukových buniek. Zastavenie alebo spomalenie proliferácie sa dosiahne odstránením rastového faktora tukových buniek z kultivačného média. Toto sa môže uskutočniť pred alebo až po vlastnom zapuzdrení, výhodnejšie však pred zapuzdrením.
Príkladom iných pluripotentných rastových faktorov, ktoré podporujú proliferáciu, je interleukín-3 a faktor, ktorý stimuluje tvorbu kolónií granulocytov a makrofágov. Rastový faktor tukových buniek môže tiež ovplyvňovať bunkový rast v kombinácii s inými pluripotentnými rastovými faktormi alebo rastovými faktormi špecifickými pre jednotlivé bunkové línie, medzi ktoré patrí napríklad erytropoietín. Predpokladá sa napríklad, že pri indukcii proliferácie a diferenciácie vysoko obohatenej frakcie myších hematopoietických kmeňových buniek má rastový faktor tukových buniek synergické účinky s molekulou IL-3. Galii a kol., The Biology of Stem Celí Factor, a New Hematopoietic Grow Factor Involved in Stem Celí Regulation (Biologické účinky faktora kmeňových buniek; nový hematopoietický rastový faktor, ktorý sa zúčastňuje regulácie kmeňových buniek), Int. J. Clin. Lab. Res., 23, str. 70 až 77 (1993).
V inom spôsobe podľa vynálezu sa môže regulácia distribúcie buniek vnútri BAO dosiahnuť pridaním chemickej zlúčeniny alebo rastového faktora, ktorý inhibuje proliferáciu alebo indukuje diferenciáciu. Podľa tohto spôsobu sa môže použiť aká- koľvek vhodná zlúčenina, ktorá inhibuje proliferáciu alebo indukuje diferenciáciu.
Je potrebné si uvedomiť, že rôzne druhy buniek môžu reagovať na prítomnosť rôznych chemických zlúčenín najrôznejším spôsobom. Odborník môže ľahko uskutočniť screening príslušnej zlúčeniny s cieľom zistiť, či má táto zlúčenina u daného typu buniek vplyv na ich proliferáciu alebo diferenciáciu.
V inom uskutočnení vynálezu sa môžu na zastavenie alebo inhibíciu proliferácie buniek alebo na indukciu diferenciácie buniek použiť cytokíny, medzi ktoré patrí napríklad transformujúci rastový faktor β 1 (TGFB 1). Napríklad u buniek BHK sa môže spomalenie proliferácie a zvýšenie rýchlosti diferenciácie dosiahnuť vystavením týchto buniek pôsobeniu TGFB 1 a kyseliny askorbovej. Podobne sa môže TGFB 1 použiť na indukciu diferenciácie u fibroblastov a tiež ako rastový inhibítor pre keratinocyty a endotelové bunky. Phillips a koľ., Ascorbic Acid and Transforming Growth Factor B 1 Increase Collagen Biosynthesis via Different Mechanism: Coordinate Regulation of Proal (I) and Proal (III) Collagens (Kyselina askorbová a transformujúci rastový faktor BI zvyšujú rýchlosť biosyntézy kolagénu prostredníctvom rôznych mechanizmov: koordinovaná regulácia biosyntézy kolagénov typu Proal (I) a Proal (III)), Archives of Biochemistry and Biophysics, 295, str. 397 až 403 (1992) .
V inom uskutočnení vynálezu sa môže na reguláciu rastu neuroendokrinných buniek využiť TGFB 1, serotonín alebo FGF. Rast neuroendokrinných buniek sa môže regulovať pomocou vlastných produktov, čo vlastne zodpovedá autokrinnej regulácii. Pre bunky ľudského karcinómu pankreasu (BON) funguje TGFB 1 ako autokrinný faktor, ktorý inhibuje ich rast, zatiaľ čo FGF a serotonín fungujú ako autokrinné faktory, ktoré stimulujú ich rast. Inhibičné účinky TGFB 1 na rast buniek BON sa môžu zrušiť prídavkom serotínu. Townsend Jr. a kol., Studies of Growth Regulation in a Neuroendocrine Celí Line (Štúdium re27 gulácie rastu u línie neuroendokrinných buniek), Acta Oncologica, 32, str. 125 až 130, 1993.
V spôsoboch podľa vynálezu sa môže na zastavenie alebo inhibíciu proliferácie alebo na indukciu diferenciácie buniek využiť množstvo iných chemických zlúčenín. Medzi tieto chemické zlúčeniny patria mytomycín C, 5-bróm-deoxyuridín (BrdU), prostaglandín Εχ (PGE^J, dibutyryl cAMP, l-B-D-arabinofuranozyl cytozínu (Ara-C), nikotínamid a heparín. Mytomycín môže byť zvlášť vhodný na reguláciu proliferácie zapuzdrených bunkových línií BHC; viď napríklad Radvanyi a kol., Mol. Celí Biol., 13, Str. 4223 až 4227 (1993).
Niekedy sa môžu použiť rôzne kombinácie chemických zlúčenín. In vitro diferenciácia u buniek ľudského neuroblastómu (IMR-32) môže byť indukovaná, ak bunky vystavíme pôsobeniu mytomycínu C a Brdu alebo PGE a dibutyryl cAMP (dbcAMP). Gash a kol., Amitotic Neuroblastoma Cells Used for Neural Implants in Monkeys (Nedeliace sa bunky neuroblastómu použité na implantáciu do organizmu opíc), Science, 233, str. 1420 až 1426 (1986). Pôsobenie Ara-C na bunkovú líniu ľudského embryonálneho rabdomyosarkómu má in vitro za následok významnú inhibíciu rastu týchto buniek, in vivo potom stratu schopnosti tvoriť nádory a tiež viac diferencovaný fenotyp a to aj po odstránení tejto zlúčeniny. Crouch a kol., Ara-C Treatment Leads to Differentiation and Reverses the Transformed Phenotype in a Human Rabdomyosarcoma Celí Line (Pôsobenie Ara-C na bunkovú líniu ľudského rabdomyosarkómu vedie k diferenciácii buniek a k zmene fenotypu transformovaných buniek), Experimental Celí Research, 204, str. 210 až 216 (1993). Predpokladá sa, že nikotínamid (NIC) indukuje diferenciáciu a maturáciu fetálnych buniek ľudských pankreasových ostrovčekov. Otonski a kol., Nicotinamid Is a Potent Inducer of Endocrine Differentation in Cultured Human Pancreatid Cells (Nikotínamid je silným induktorom endokrinnej diferenciácie u kultivovaných ľudských pankreasových buniek), J. Clin. Invest., 92, str. 1459 až 1466 (1993).
Publikovalo sa, že diferenciácia vyvíjajúcich sa tkanív sa môže tiež ovplyvniť prídavkom dbcAMP. Predpokladá sa napríklad, že dbcAMP moduluje diferenciáciu prekurzorov astrocytov, indukuje tvorbu neuritov u buniek PC 12 a stimuluje proliferáciu Schwannových buniek. Baron-Van Evercooren a kol., Schwann Celí Differentiation in vitro: Extracelular Matrix Deposition and Interaction (Diferenciácia Schwannových buniek in vitro: Ukladanie a interakcia extracelulárnej matrice), Dev. Neurosci., 8, str. 182 až 196 (1986). Podobne môže byť diferenciácia Schwannových buniek indukovaná prostredníctvom kyseliny askorbovej.
Na inhibíciu alebo zastavenie proliferácie buniek sa môžu ďalej využiť molekuly sialoglykopeptidov (SPG). Napríklad sialoglykopeptid s veľkosťou 18 kDa izolovaný z povrchu intaktných buniek cerebrálneho kortexu dobytka bol schopný zastaviť proliferáciu exponenciálne rastúcich buniek Swiss 3T3; viď napríklad Toole-Simms a kol., Jour. Celí. Physiol147, str. 292 až 297 (1991); Fattaey a kol., Exp. Celí. Res., 194, str. 62 až 68 (1991). Dokázalo sa, že na prítomnosť niektorých SGP citlivo reaguje veľké množstvo druhov transformovaných aj netransformovaných buniek. Medzi tieto bunky patria bunky podobné epitelovým bunkám a fibroblasty získané zo širokého spektra druhov stavovcov a bezstavovcov; viď napríklad Fattaey a kol., Jour. Celí. Physiol., 139, str. 269 až 274 (1989).
Je potrebné si uvedomiť, že niektoré z vyššie uvedených pôsobení môže mat na proliferáciu a diferenciáciu len prechodný účinok. V takých prípadoch môže byť žiadúce,. aby sa zapuzdreným bunkám po ich in vivo implantácii do organizmu hostiteľa umožnil neustály prísun príslušnej chemickej zlúčeniny alebo rastového faktora. To sa môže dosiahnuť použitím polyméru, u ktorého nastáva v organizme pozvoľný rozklad a ktorý teda slúži ako nebunkový zdroj rastového faktora alebo chemickej zlúčeniny. Inou možnosťou je spolu s bunkami, ktoré produkujú požadovanú biologicky aktívnu molekulu zapuzdriť tiež bunkový zdroj rastového faktora alebo chemickej zlúčeniny. Samozrejme sa môžu využiť aj iné spôsoby; viď napríklad USA patent 5 106 627 a 5 156 844.
Regulácia rastu pomocou ožiarenia
Proliferácia buniek sa môže tiež regulovať, ak vystavíme bunky vhodným dávkam žiarenia, napríklad RTG žiarenia, ultrafialového (UV) žiarenia a podobne. Ak sú bunky vystavené účinkom žiarenia, môže nastať prerušenie ich bunkového cyklu. Kritická radiačná dávka alebo minimálna radiačná dávka sa môže pre daný druh buniek stanoviť prostredníctvom známych spôsobov; viď napríklad Stanley a Lee, Radiat. Res., 133, str. 163 až 169 (1993); Mitchell a kol., Radiat. Res., 79, str. 537 až 551 (1979). Napríklad normálne ľudské epidermálne keratocyty ožiarené ultrafialovým žiarením typu B (UVB) s intenzitou 5 a 10 mJ/cm2 vykazujú po 3 až 5 dňoch po ožiarení významný pokles rýchlosti (až 78 %) proliferácie. Prystowski a kol., J. Invest. Dermat., 101, str. 54 až 58 (1993). Yi a kol., Radiation Research, 133, str. 163 až 169 (1993) opisuje spôsob, ktorý slúži na výpočet najnižšej dávky RTG žiarenia nutnej na zastavenie proliferácie buniek.
Regulácia rastu a diferenciácie prostredníctvom molekúl extracelulárnej matrice
Vynález opisuje spôsoby, ktoré slúžia na reguláciu distribúcie buniek v BAO prostredníctvom modifikácie rastových povrchov pomocou samotnej extracelulárnej matrice (”ECM), ktorá reguluje rast (alebo pomocou zložiek tejto matrice) alebo pomocou extracelulárnej matrice, ktorá reguluje rast v kombinácii s nejakou inou substanciou, ktorá reguluje rast.
V živých tkanivách je ECM tvorená množstvom proteínov a polysacharidov sekretovaných bunkami, ktoré vytvárajú v blízkosti týchto buniek sieť. Medzi molekuly, ktoré tvoria ECM patria glykozaminoglykány a proteoglykány ako napríklad chondroitínsulfát, fibronektín, heparínsulfát, hyalurón, dermatansulfát, keratínsulfát, laminím, kolagén, proteoglykán, ktorého sacharidovou zložkou je heparansulfát (HSPG) a elastín. Hlavným komponentom ECM in vivo je kolagén. O molekulách ECM je známe, že spôsobujú zníženie rýchlosti proliferácie buniek a naopak zvýšenie rýchlosti diferenciácie buniek. ECM bez prítomnosti buniek môže okrem toho, ak sa použije v spôsoboch podľa vynálezu, ovplyvňovať priestorové rozloženie buniek zapuzdrených vnútri BAO.
ECM sa môže získať pri kultivácii buniek, ktoré produkujú komponenty ECM, medzi ktoré patria bunky pôvodom mezenchymálne alebo astrocytálne. Pôsobením kyselinou askorbovou alebo cAMP na Schwannove bunky, môžeme u týchto buniek indukovať syntézu ECM. Tieto komponenty ECM sa podobajú prekurzorom, ktoré tvoria bazálnu membránu (basement membráne), ktorá podporuje proliferáciu Schwannových buniek. Rast a diferenciácia najrôznejších endotelových a epitelových buniek sú okrem toho podporované ECM prirodzene produkovanou endotelovými bunkami a gélom z rekonštituovaných bazálnych membrán produkovaných bunkami Engelbrethovho Holm-Swarmovho nádoru (EHS), Baron-Van Evercooren a kol., Schwann Celí Differentiation in vitro: Extracelular Matrix Deposition and Interaction (Diferenciácia Schwannových buniek in vitro: Ukladanie a interakcia extracelulárnej matrice), Dev. Neurosci., 8, str. 182 až 196 (1986).
V jednom uskutočnení vynálezu sa regulácia rastu dosiahne potiahnutím rastového povrchu vnútri BAO pomocou ECM (alebo jej komponentov, ktoré regulujú rast). My uprednostňujeme vysadenie buniek, ktoré produkujú ECM na rastový povrch vnútri BAO a ich následnú kultiváciu do stavu konfluencie. Na bunky sa potom pôsobí detergentom a NH^OH. Vzniknutý BAO, ktorý má rastový povrch potiahnutý ECM bez prítomnosti buniek, sa môže potom použiť na zapuzdrenie buniek, ktoré produkujú požadovanú biologicky aktívnu molekulu.
V inom uskutočnení vynálezu sa ECM pripraví podobným spôsobom in vitro, lyofilizovaním, fragmentovaním a zmiešaním s bunkami za vzniku suspenzie. Bunky sa potom spolu s fragmentárni vtlačia do BAO.
Bunky, ktoré rastú v prítomnosti niektorých molekúl z extracelulárnej matrice (ECM) vykazujú zníženú proliferáciu a naopak zvýšenú diferenciáciu v porovnaní s bunkami, ktoré rastú v štandardnej kultúre v monovrstvách. Napríklad adrenokortikoidné bunky, známe produkciou niektorých steroidných hormónov ako napríklad aldosteróňu, vykazujú zníženú proliferáciu, ak sa pestujú in vitro v prítomnosti kolagénového gélu, viď Fujiyama a kol., Influence of Extracellular Matrix on the Proliferation and the Differentation of Adrenocortical Cells in Culture (Vplyv extracelulárnej matrice na proliferáciu a diferenciáciu adrenokortikoidných buniek v kultúre), Path. Res. Pract. 189, str. 12051 až 12114 (1993).
Tiež u Schwannových buniek môže nastať zníženie proliferácie a zvýšenie diferenciácie v prítomnosti kolagénu.
Je tiež známe, že endokrinné bunky sa diferencujú v in vitro podmienkach, ak je kultivačný povrch potiahnutý kombináciou kolagénu typu IV a HSPG. Kolagén typu IV je nutný na dosiahnutie bunkovej adhézie a HSPG indukuje diferenciáciu, viď de Bruine a kol., Extracellular Matrix Components Induces Endocrine Differentiation In vitro in NCI-H716 Cells (Komponenty extracelulárnej matrice indukujú diferenciáciu v bunkách NCI-H716 in vitro), Američan J. of Pathology, 142, str. 773 až 782 (1993).
S cieľom ďalej kontrolovať rast a diferenciáciu buniek sa môžu ku komponentom ECM pridať rôzne ďalšie rastové faktory vrátane vyššie uvedených. Rastové faktory sa môžu administrovať in vitro ešte pred implantáciou alebo in vivo, alebo obidvoma spôsobmi, viď USA patenty 5 156 844 a 5 106 627, ktoré opisujú spôsoby distribúcie rastových faktorov pomocou spoločného zapuzdrenia bunkového alebo nebunkového zdroja týchto rastových faktorov. Okrem toho aj molekuly ECM sa môžu substituovať peptidmi, ktoré môžu ovplyvňovať bunkový rast a to s využitím známych techník.
Napríklad transformujúci rastový faktor-β, ktorý reguluje bunkový rast a ktorý sa reverzibilne viaže na určité molekuly ECM (napríklad na dekorín), sa môže pridat k ECM. Vďaka tomu sa dosiahne vyšší inhibičný účinok extracelulárnej matrice na bunkový rast.
Tiež aj heparín zabraňuje rastu ako transformovaných, tak aj netransformovaných bunkových línií, viď Matuoka a kol., Celí Structure and Function, 9, str. 357, (1984).
Rastový faktor bázových fibroblastov (bFGF) je tiež známy svojou schopnosťou podporiť bunkovú diferenciáciu pri spoločnej aplikácii s komponentami ECM, viď Bruine a kol., Extracellular Matrix Components Induce Endocrine Differentiation In vitro in NCI-H716 Cells (Komponenty extracelulárnej matrice indukujú diferenciáciu in vitro u buniek NCI-H716), Američan Journal of Pathology, 142, str. 773 až 782, (1993).
Rastové faktory môžu mať rôzne účinky na bunky pri ich spoločnej aplikácii s rôznymi zložkami ECM. Napríklad rastový faktor fibroblastov (FGF) je účinným diferenciačným faktorom a slabým mitogénom pre chromafinné bunky kultivované na laminíne. Avšak, ak sa FGF pridá k chromafinných bunkám kultivovaným na kolagéne, je slabým diferenciačným faktorom a naopak silným mitogénom. Podobné správanie bolo opísané tiež u analóga cAMP 8-(4-chlórfenyltio)-cAMP, viď Chu a kol., Neuroscience 95, str. 43 až 45, (1994).
V tabuľke 1 je uvedený čiastočný zoznam molekúl extracelulárne j matrice, rastových faktorov a chemických látok, ktoré ovplyvňujú proliferáciu a diferenciáciu určitých druhov buniek.
Tabuľka 1
Molekuly ECM, rastové faktory a chemické látky, ktoré ovplyvňujú proliferáciu a diferenciáciu.
Bunkový typ Induktor diferenciácie/inhibítor Promótor rastu proliferácie
Schwannova b. k. askorbová, kolagén TGF-β, dbcAMP (Vitrogén™), CultiSphers™/agaróza
PC12 NGF, dbcAMP, SGP Vitrogén™
Fibroblast TGF-β-Ι, CultiSphers™/ agaróza, SGP, k. askorbová
Myoblast kolagén, k. askorbová
Kmeňová nervová b. laminín, PepTite 2000, EGF, bFGF, TGF-a, CultiSphers™/PepTite amf iregulín 2000, ester forbolu, heparín, FGF a (CNTF alebo NGF)
Ľudská embryonálna rabdomyosarkómová bunková línia Ara-C
Ľudské fetálne b. nikotínamid (NIC)
pankreasových ostrovčekov
Astroblasty dbcAMP
• Swiss 3T3 SGP
Adrenokortikálne
b.
kolagén
Endokrinné b.
kolagén typu IV + HSPG, bFGF + Zložky ECM
Chromafinné b.
FGF + laminín,
8-(4-chlórfenyltio)-cAMP + laminín
FGF + kolagén,
8-(4-chlórfenyltio)-cAMP + + kolagén
Kmeňové hematopoietické rastový faktor tukových b.
BHK
TGF-B-l + k. askorbová
ECM z krysích b. E15
Keratinocyty
TGF-B-l
Endotelové b.
TGF-B-l
Neuroendokrinné
TGF-B-l
TGF-B-l + (ľudské karanoidné + k. askorbová, pankreasové b. (BON)) serotonín, FGF
Ľudská neuroblastómová bunková línia
SCT-1 kolagén, k. askorbová
Rastovými povrchmi v bioarteficiálnom orgáne sa rozumejú povrchy lumen bioarteficiálneho orgánu a ďalej potom ďalšie rastové povrchy, ako je napríklad vnútorná výstuha, ktorá môže byť zapuzdrená v BAO.
Tiež mikronosiče môžu poskytovať povrch na rast buniek. Použitie mikronosičov umožňuje dosiahnuť vyšší počet zapuzdre ných a rovnomerne distribuovaných buniek v bioarteficiálnom orgáne. To platí zvlášť pre bunky, u ktorých nastáva inhibícia rastu v dôsledku kontaktu so susednými bunkami. Komerčne je dostupných niekoľko typov mikronosičov vrátane dextránových mikronosičov Cytodex (Sigma, St. Louis, MO), želatínových mikronosičov s makroskopickými pórmi CultiSpher™ (HyClone Labs, Logan, UT) a sklenených mikronosičov. Tieto mikronosiče sa často používajú pri kultivácii buniek, ktoré vyžadujú ukotvenie na tuhej fáze. Bunkové línie, ktoré rastú na želatínových mikronosičoch s makroskopickými pórmi zahŕňajú OBHK, BHK-21, L-929, CHO-K1, rCHO, MDCK, V79, F9, HeLa a MBDK. Mikronosiče sa môžu tiež vytvoriť z iných molekúl extracelulárnej matrice, alebo sa nimi môžu potiahnuť. Príkladom takého nosiča je FACT™ potiahnutý kolagénom (Solo Hill Labs, Ann Arbor, MI).
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú bunky, ktoré produkujú biologicky aktívnu látku, vysiate na povrch mikronosiča potiahnutého komponentami ECM. Na tomto mikronosiči sú bunky kultivované ešte pred zapuzdrením a implantáciou. Dokument Cherksey WO 93/14790 sa týka kultivácie buniek na sklenených alebo plastikových mikroguľôčkach a následnej implantácie týchto mikroguľôčiek do mozgu recipienta.
V inom uskutočnení vynálezu sú bunky vysiate na mikronosič a suspendované v prítomnosti vhodnej matrice, ktorá inhibuje bunkový rast. Potom sú zapuzdrené do arteficiálneho orgánu. Vhodnou matricou, ktorá inhibuje bunkový rast je napríklad agaróza alebo agar na kultiváciu fibroblastov alebo kolagén pre adrenokortikoidné bunky. Materiál matrice fyzicky zabraňuje bunkám v ďalšom raste, ďalšia hydrofilná gélová matrica viď napríklad Dionne WO 92/19195.
V inom uskutočnení vynálezu sa môže pri substituovaní peptidovými sekvenciami, ktoré ovplyvňujú bunkovú adhéziu k matrici, použiť agaróza namiesto ECM. Napríklad agarózový hydrofilný gél môže byť substituovaný peptidovými sekvenciami laminínu alebo fibronektínu.
Pri tomto spôsobe sa bunky suspendujú v trojrozmernej matrici zloženej z agarózy substituovanej peptidovými sekvenciami, ktoré rozoznávajú bunkový povrchový receptor, ktorý sa podieľa na bunkovej adhézii. Dokázalo sa (v dvojrozmernej matrici), že niektoré peptidy zosilňujú bunkovú adhéziu, viď napríklad Pierschbacher a kol., Science 309, str. 30 až 33, (1984), Graf a kol., Biochemistry 26, str. 6896 až 6900 (1987), Smallheiser a kol., Dev. Brain Res. 12, str. 136 až 140, (1984), Jucker a kol., J. Neurosci. Res. 28, str. 507 až 517, (1991). Substituované agarózové matrice podľa vynálezu umožňujú prezentáciu vhodných molekulárnych úchytov pre bunkovú adhéziu v 3D. Výhodná koncentrácia agarózy je 1,25 % w/v alebo menšia, veľmi výhodne približne jedno percento. Výhodné sú sekvencie s obsahom RGD (t.j. ArgGlyAsp> AA^-AA^ podľa Sekvencie id. č. 2), sekvencie s obsahom YIGSR (TyrlleGlySerArg, AAs-AAg podľa Sekvencie id. č. 1) a sekvencie s obsahom IKVAV (IleLysValAlaVal, AAi;l-AAis podľa Sekvencie id.. č. 3) a sekvencie im podobné. Substitúcia sa môže uskutočniť pomocou bifunkčného konjugačného činidla ako je napríklad 11,1-karbonyldiimidazol alebo ľubovoľným iným vhodným spôsobom.
Významnou výhodou použitia agarózy namiesto zložiek ECM je, že prirodzené komponenty ECM môžu byť enzymaticky degradované po určitom čase in vivo, zatiaľ čo k degradácii agarózy nedochádza ľahko. Ďalšou výhodou použitia agarózy je to, že ide o definovaný produkt na rozdiel od materiálov ako je MatrigelR, ktorý je odvodený od tumorovej bunkovej línie a preto ide o nedefinovanú zmes. Dokázalo sa, že MatrigenR obsahuje bFGF, čo je účinný mitogén pre veľa bunkových typov. Agaróza je na rozdiel od toho jasne definovaným, termoreverzibilným hydrofilným gélom tvoreným výhradne polysacharidmi. Okrem fyzického obmedzenia bunkového rastu môže agaróza samotná inhibovať proliferáciu a indukovať diferenciáciu, viď napríklad Aulthouse, Expression of the Human Chondrocyte Phenotype In Vitro (Expresia fenotypmi ľudských chondrocytov in vitró), In Vitro Cellular and Developmental Biology 25, str. 659 až 668 (1989).
Agaróza sa môže ďalej chemicky modifikovať, napríklad pomocou PEO-PDMS, tak, aby sa dosiahla ešte väčšia inhibícia bunkového rastu, s výhodou bez toxických účinkov na bunky.
Rôzne bunkové typy môžu vykazovať rozdielne odpovede na danú molekulu ECM, alebo na nebunkovú extracelulárnu matricu z určitého zdroja, viď napríklad End a Engel, Multidomain proteins of the Extracellular Matrix and Cellular Growth (Viacdoménové proteíny extralelulárnej matrice a bunkový rast), str. 79 až 129, v knihe Receptor for Extracellular Matrix, editori McDonald a Mecham, Academic Press, New York, (1991). Odborník dokáže ľahko zistiť typ bunkovej odpovede na danú molekulu ECM, alebo na nebunkovú extracelulárnu matricu z určitého zdroja s cieľom stanoviť efektivitu takej molekuly na kontrolu bunkovej distribúcie.
Kontrola rastu pomocou modifikácie rastového povrchu BAO
Vynález opisuje spôsoby kontroly bunkového rastu v BAO pomocou chemickej modifikácie rastového povrchu tak, aby sa umožnila kontrola počtu a umiestnenia buniek v bioarteficiálnom orgáne. Rastový povrch bioarteficiálneho orgánu sa môže modifikovať kvôli kontrole bunkovej adhézie k rastovému povrchu. Rastovým povrchom BAO môže byť luminálny povrch BAO, interná membrána, mikronosič alebo vnútorná výstuha umiestnená ' vnútri BAO. V prípade mikronosičov alebo vnútornej výstuhy sa môžu bunky kultivovať na týchto štruktúrach in vitro ešte pred svojím zapuzdrením do bioarteficiálneho orgánu a pred implantáciou.
Membrána BAO sa môže modifikovať mnohými rôznymi známymi spôsobmi vrátane chemickej modifikácie a to tak, že sa na povrch BAO dostanú voľné karboxylové, hydroxylové alebo aminoskupiny alebo iné reaktívne funkčné skupiny, alebo sa môže povrch BAO modifikovať adsorpciou. Tieto reaktívne funkčné' skupiny, ktoré nie sú prítomné v základnej polymérnej štruktúre materiálu použitého na prípravu BAO, sa môžu použiť ako výcho• diskové miesta pre. ďalšiu modifikáciu.
V jednom uskutočnení vynálezu je modifikovaný luminálny povrch BAO tak, aby sa zvýšila bunková adhézia k tomuto povrchu. Kontrolovaná bunková adhézia k luminálnemu povrchu je výhodná na zvýšenie hladiny prežívajúcich buniek. Prednostnou adhéziou buniek k membráne sa môže dosiahnuť rovnomerná distribúcia buniek vnútri kapsule s použitím menej buniek ako sa používa u techník, ktoré používajú na imobilizáciu suspendovanie v hydrofilnom géli. Použitie menšieho množstva buniek má za následok zníženie koncentrácie bunkových zvyškov. Ďalším pozitívnym efektom je uľahčená difúzia živín k bunkám, pretože tieto sú v tesnom kontakte s vonkajšou membránou. Ak sa použije modifikovaná membrána bez polymérnej matrice tvoriacej vnútro kapsule, je možné sa tiež vyhnúť komplikáciám s transportom cez gél a adsorpciou proteínov alebo bunkových produktov na polymérny materiál matrice. Bunková adhézia sa môže zosilniť ošetrením luminálneho povrchu BAO poly-D-lyzínom s rôznymi molárnymi hmotnosťami. Poly-D-lyzín sa môže adsorbovať na luminálny povrch BAO pri inkubácii v pufrovanom roztoku pH 11. Výhodné je použitie poly-D-lyzínu s približnou molárnou hmotnosťou 67000 g/mol.
Peptidové deriváty, napríklad sekvencie s obsahom RGD (t.j. ArgGlyAsp, AA^-AA^ podľa Sekvencie id. č. 2), sekvencie s obsahom YIGSR (TyrlleGlySerArg, AA5-AAg podľa Sekvencie id. č. 1) vrátane GDPGYIGSR (CysAspProGlyTyrlleGlySerArg, Sekvencia id. č. 1) ako aj sekvencie s obsahom IKVAV (IleLysVa.lAlaVal, AAii-AAi5 podľa Sekvencie id. č. 3), s výhodou potom CysSerArgAlaArgLysGlnAlaAla (Sekvencia id. č. 3), sa ukazujú ako veľmi vhodné na zvýšenie bunkovej adhézie. Napríklad najobvyklejší z vyššie uvedených peptidov sekvencia RGD (ArgGlyAsp, AA2-AA4 podľa Sekvencie id. č. 2) môže byť chemicky naviazaná na membránu BAO pomocou známych spôsobov. Niektoré molekuly s obsahom sekvencie RGD (ArgGlyAsp, AA2~AA4 podľa Sekvencie id. č. 2) sú komerčne dostupné, napríklad PepTite™ (Telios).
V inom uskutočnení vynálezu je membrána BAO modifikovaná tak, že zabraňuje bunkovej adhézii. Takáto modifikácia sa do- siahne adsorpciou napríklad PEO-PDMS alebo poly-D-lyzín algi nátu. Výhodná je modifikácia pomocou PEO-PMDS zvlášť potom v prípade, že rastový povrch je pórovitý. Toto je dané tendenciou PEO-PDMS difundovať cez póry a adsorbovať sa pritom pomocou hydrofóbne-hydrofóbnej interakcie na povrch póru. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa použije nízkomolekulový (603 až 3000 g/mol) PEO-PDMS.
Toto uskutočnenie vynálezu je výhodné predovšetkým v prípade, že sú bunky vypestované na mikronosičoch a potom zapuzdrené do BAO. Týmto spôsobom sa môže dosiahnuť rovnomerná distribúcia buniek, môže sa kontrolovať počet buniek a bunková adhézia sa môže obmedziť len na mikronosič.
V inom uskutočnení vynálezu sa môžu použiť ako látky, ktoré podporujú bunkovú adhéziu, tak aj látky, ktoré zabraňujú bunkovej adhézii. Napríklad luminálny povrch BAO sa môže ošetriť látkou, ktorá zabraňuje bunkovej adhézii, zatiaľ čo bunkami potiahnuté mikroskopické guľôčky, alebo polymérna matrica, ktorá obklopuje bunky (ak je použitá) sa môžu naopak ošetriť látkou, ktorá zvyšuje bunkovú adhéziu.
V inom uskutočnení vynálezu sa môže vnútro BAO modifikovať vložením inertnej nosnej výstuhy ešte pred vlastným pridaním buniek. Táto nosná výstuha je štruktúrou vhodnou pre bunkovú adhéziu a rovnomernú distribúciu buniek v rámci kapsule. Zlúčeniny vhodné na prípravu takejto inertnej nosnej výstuhy zahŕňajú polyhydroxyetylmetakrylát (PHEMA) a poly(hydroxyetylmetakrylát-ko-metylmetakrylát) (PHEMA/MMA). Nosná výstuha sa môže ďalej modifikovať rôznymi chemickými látkami alebo proteínmi, vrátane vyššie uvedených, s cieľom kontroly rastu a diferenciácie buniek. V spôsobe podľa vynálezu sa roztok vhodného materiálu precipituje v BAO za vzniku požadovanej nosnej výstuhy.
V inom uskutočnení vynálezu sa bunky kultivujú na nosiči, ktorý sa použije ako vnútorná výstuha. Táto vnútorná výstuha môže byť z ľubovoľného biokompatibilného materiálu ako je napríklad titán alebo vhodný polymérny materiál. Táto výstuha môže mať formu podpery alebo môže tiež slúžiť ako nosná konštrukcia, ktorá poskytuje veľký povrch na rast buniek. Príkladom vhodného materiálu pre takú nosnú konštrukciu je netkaná polyesterová tkanina (NWPF - non woven polyester fabric) (Reemay, Tenessee). Existuje veľa druhov NWPF, ktoré sa líšia v hustote tkaniny a hrúbke rúna. Tieto techniky umožňujú presnú kontrolu počtu buniek v BAO, ako aj možnosť kvalifikovať ako bunky, tak aj nosnú výstuhu ešte pred vložením do BAO. Okrem toho sa môže dosiahnuť diferenciácia buniek kultivovaných na takom materiáli ešte pred vložením tohto materiálu do bioarteficiálneho orgánu. Táto nosná výstuha sa môže modifikovať napríklad peptidmi, ktoré ovplyvňujú bunkovú adhéziu, čím nastane indukcia bunkovej diferenciácie. Okrem toho tento materiál zvyšuje tuhosť BAO. Príprava bioarteficiálnych orgánov, ktoré obsahujú vnútornú výstuhu, je opísaná v súvisiacej prihláške SN 08/105 728.
BAO podľa vynálezu majú typicky aspoň jednu vonkajšiu semipermeabilnú membránu alebo obálku, ktorá obklopuje jadro obsahujúce bunky. Obálka umožňuje difúziu živín, biologicky aktívnych látok a iných vybraných produktov z a do BAO. BAO je biokompatibilný a s výhodou aj imunoizolačný. Jadro obsahuje izolované bunky buď suspendované v kvapalnom médiu alebo imobilizované v hydrofilnej gélovej matrici.
Je potrebné si uvedomiť, že vyššie opísané spôsoby a kompozície určené na kontrolu distribúcie buniek v BAO sa navzájom nevylučujú. Je výhodné použiť kombináciu niekoľkých vyššie uvedených spôsobov a kompozícií na dosiahnutie optimálnej kontroly bunkového rastu.
Môže byť napríklad výhodné produkovať bunky, ktoré boli geneticky upravené génom, ktorý kontroluje rast spôsobom podľa vynálezu, kultivovať tieto bunky na mikronosičoch ECM a potom zapuzdriť tieto mikronosiče potiahnuté bunkami do bioarteficiálneho orgánu, ktorého jeden alebo viac rastových povrchov sa modifikovalo tak, aby to umožnilo kontrolu bunkovej distribúcie.
Vonkajšia membrána BAO môže byť z rovnakého materiálu, z ktorého je jadro BAO, alebo sa môže pripraviť z iného materiálu. V obidvoch prípadoch sa vytvorí permselektívna vonkajšia alebo periférna membránová časť BAO. Táto membrána môže byť, ak je to požadované, imunoizolačná.
Výber materiálu použitého na prípravu BAO je určovaný množstvom faktorov a je detailne opísaný v Dionne WO 92/19195. Na prípravu obálky kapsule sa môžu použiť rôzne polyméry alebo zmesi polymérov. Polymérne membrány, ktoré tvoria BAO a rastové povrchy v jeho vnútri môžu byť tvorené polyakrylátmi (vrátane akrylových kopolymérov), polyvinylidénmi, kopolymérmi polyvinylchloridu, polyuretánmi, polystyrénmi, polyamidmi, acetátmi celulózy, nitrátmi celulózy, polysulfónmi, polyfosfazénmi, polyakrylonitrilmi (polyakrylonitril-ko-vinylchloridom) ako aj ich derivátmi, kopolymérmi a zmesami.
Bioarteficiálne orgány sa môžu pripraviť ľubovoľným vhodným spôsobom známym zo stavu techniky. Jedným takým spôsobom je spoločné prietlačné lisovanie polymérneho materiálu spolu so zrážadlom, ktoré môže obsahovať fragmenty biologických tkanív organely alebo bunkovú suspenziu a/alebo iné terapeutické agens, viď Dionne WO92/19195 a USA patenty 5 158 881, 5 283 187 a 5 284 761.
Obálka BAO môže byť jednoplášťová (typ 1 alebo 2) alebo dvojplášťová (typ 4). Jednoplášťové duté vlákno sa môže pripraviť rýchlym zrážaním len jedného povrchu polymérneho roztoku počas jeho spoločného vytlačovania s bunkovou suspenziou. Dvojplášťové duté vlákno sa môže pripraviť chladením dvoch povrchov polymérneho roztoku počas jeho vytlačovania. Typicky je u vláken typu 1 väčšia časť povrchu obsadená makropórmi v porovnaní s dutými vláknami typu 4. Duté vlákna typu 2 obsahujú stredné množstvo makropórov.
Kapsule podľa vynálezu môžu mať rôzne tvary napríklad valcový, diskový alebo guľový.
Veľkosť pórov v obálke BAO určuje nominálnu molárnu hmotnosť molekuly, ktorá ešte semipermeabilnou membránou môže prejsť (nMWCO - nominal Molecular Weight Cut Off). Molekuly s väčšou relatívnou molekulovou hmotnosťou ako je hodnota nMWCO nemôžu z fyzikálnych dôvodov membránou prechádzať. nMWCO je definovaná 90 % nepriepustnosťou pri konvektívnych podmienkach. V prípadoch, keď je výhodné, aby BAO bol imunoizolačný je veľkosť pórov v membráne zvolená tak, aby dané faktory produkované zapuzdrenými bunkami mohli difundovať von z kapsule, ale aby zároveň nebol možný opačný pohyb faktorov imunitnej odpovede hostiteľa do bioarteficiálneho orgánu. Typicky je hodnota nMWCO medzi 50 až 200 kDa, s výhodou potom medzi 90 až 150 kDa. Vo veľmi výhodnom uskutočnení vynálezu minimalizuje tiež zloženie membrány nežiadúce reakcie medzi efektorovými molekulami imunitnej reakcie vo vybranom implantačnom mieste a zložkami vonkajšej membrány BAO.
Jadro bioarteficiálneho orgánu podľa vynálezu je vytvorené tak, aby vytváralo vhodné podmienky pre konkrétne, vnútri izolované bunky. Jadro môže obsahovať kvapalné médium schopné zabezpečiť bunkový rast. Kvapalné jadrá sú vhodné na kultiváciu transformovaných buniek ako sú napríklad bunky PC12. V inom uskutočnení vynálezu môže jadro obsahovať gélovú matricu. Táto gélová matrica môže byť tvorená hydrofilným gélom (alginát, Vitrogen atď.), alebo zložkami extracelulárnej matrice, viď Dionne WO 92/19195.
Zlúčeniny, ktoré tvoria hydrofilné gély môžeme rozdeliť do troch skupín. V prvej skupine sú gély, ktoré nesú čistý negatívny náboj (napríklad alginát). Druhú skupinu tvoria gély, ktoré nesú pozitívny náboj (napríklad kolagén a laminín). Komerčne dostupné zložky extracelulárnej matrice, ktoré nesú pozitívny náboj, sú napríklad Matrigel™ a Vitrogen™. Do tretej skupiny môžeme zaradiť také gély, ktoré nenesú žiadny náboj (napríklad vysoko zosieťovaný polyetylénoxid alebo polyvinylalkohol).
Na uzavretie obálky BAO sa môže použiť ľubovoľný vhodný spôsob, vrátane využitia polymérnych adhezív a/alebo obŕubovania, zaväzovania alebo tepelného uzatvárania. Všetky tieto spôsoby sú známe v doterajšom stave techniky. Ďalej sa môže použiť ľubovoľný suchý spôsob uzatvárania. V takýchto spôsoboch je použitý nepórovitý inštalačný bod, ktorým sa do bioartificiálneho orgánu vloží roztok s obsahom vybranej bunky. Po naplnení sa kapsula bez meškania uzavrie. Taký spôsob je opísaný v súčasne podanej patentovej prihláške USA č. 08/082 407.
Pred implantáciou BAO do hostiteľského organizmu sa vo výhodnom uskutočnení vynálezu najprv uskutoční aspoň jedna skúška funkčnosti v podmienkach in vitro. Na tieto účely sa môžu použiť bežné skúšky alebo diagnostické testy, známe z doterajšieho stavu techniky (viď napríklad Methods in Enzymology, editori Abelson, Academic Press, 1993). Napríklad sa môžu použiť ELISA (enzyme-linked imunosorbent assay, imunosorpčná enzymatická technika stanovenia), chromatografická alebo enzymatická skúška, alebo biologická skúška špecifická pre konkrétny produkt. V prípade potreby je možné sledovať sekrečnú funkciu niektorého z implantátov počas určitej periódy s tým, že sa odoberajú vhodné vzorky (napríklad sérum) z tela recipienta a tie sa potom podrobia analýze. V prípade, že recipientom je primát, môže sa použiť mikrodialýza.
Počet BAO a ich veľkosť by mali byť dostatočné na dosiahnutie terapeutického účinku po implantácii BAO. Táto kvantita sa stanovuje z množstva biologickej aktivity potrebnej na konkrétnu aplikáciu. V prípade sekrečných buniek, ktoré uvoľňujú terapeutické substancie, sa na stanovenie požadovaného množstva sekretovanej látky použijú štandardné dávkovacie kritériá a predpoklady. Uvažované faktory viď Dionne WO 92/19195.
Implantácia bioarteficiálneho orgánu sa uskutoční za sterilných podmienok. BAO sa vo všeobecnosti implantuje na miesto, ktoré umožní vhodnú distribúciu sekretovaného produktu a transport živín k implantovaným bunkám či tkanivu a ďalej tiež umožní ľahký prístup k BAO pre prípad jeho vybratia a/alebo náhrady. Výhodným hostiteľským organizmom je primát, veľmi výhodným hostiteľom je potom človek.
Miesta na implantáciu podľa vynálezu zahŕňajú centrálny nervový systém, vrátane mozgu, miechy, komorovej vody a sklovca. Výhodnými miestami v mozgu sú striatum, cerebrálny kortex, jadrá subthalamu a bazálne Meynertovo jadro. Ďalším výhodným miestom je mozgomiechový mok, najlepšie v subarachniodálnom priestore a v oblastiach laterálnych ventrikúl. Ďalej vynález opisuje implantáciu do subkapsulárnych oblastí obličiek a ďalej intraperitoneálne, subkutánne alebo ľubovoľným iným terapeuticky užitočným spôsobom.
Vynález bude podrobnejšie opísaný v nasledovných príkladoch, ktoré však nie je možné v žiadnom prípade považovať za obmedzujúce pre uskutočnenie vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Kontrola rastu pomocou promótora Mxl
Myší promótor Mxl sa zfúzoval s rannými génmi vírusu SV40 a vzniknutý chimerický gén sa použil na prípravu transgénnej myši. Vzhľadom na to, že promótor Mxl je indukoyateľný prítomnosťou IFNa a IFNfi, je možné expresiu onkogénu v tkanivách alebo v bunkových kultúrach, pripravených z transgénnych zvierat, kontrolovať. Týmto spôsobom je možné, teda pripraviť podmienene imortalizované bunky.
Príprava transgénnych myší
Použil sa konštrukt Mxl-Tag, ktorý sa skladal z približne 2 kb dlhej časti promótora Mxl (t.j. z fragmentu Xbal-EcoRI) a z cDNA vytvorenej podľa intaktnej rannej oblasti vírusu SV40, ktorá kóduje ako veľké tak aj malé T antigény a ktorá bola k tomuto fragmentu pripojená. Tento konštrukt sa fúzoval proti smeru transkripcie s 3' neprekladanou oblasťou myšieho β-globínu a poly-A signálom (BamHI-Xbal fragment). B-globínový fragment sa vložil preto, aby poskytol miesta pre zostrih a aby sa zosilnila expresia cDNA v transgénnych zvieratách. Na obr. 1 je znázornená plazmidová mapa konštruktu Mxl.
Transgénne myši s obsahom konštruktu Mxl-Tag sa pripravili štandardnou technikou jadrovej mikroinjekcie do oplodneného myšieho vajíčka v štádiu jedinej bunky, viď Brinster a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, str. 4438 až 4442, (1985). Analýza pomocou Southernovho blotu tkanív myší dokázala, že intaktná kópia transgénu bola integrovaná do genómu.
Pomocou PCR amplifikácie, ktorá špecificky rozoznávala ranné oblasti vírusu SV40 sa dokázalo, že potomstvo týchto myší je DNA pozitívne.
Podmienene imortalizované kmeňové bunky
Z embryí DNA pozitívnych transgénnych myší E15 sa vybrali striatá. Striatá sa umiestnili do primárnych (individuálnych) bunkových kultúr do neurosférového média s obsahom EGF (50 ml DDH 0, 10 ml 10XDMEM/F12, 2,0 ml 30 % glukózy, 1,5 ml NaHCO , 0,5 ml 1 IM HEPES, 1,0 ml L-glutamínu, 10 ml lOx hormónovej zmesi (na 100 ml) a 25 ml DDH^O na premytie filtra). Neurosféry sa pripravili spôsobom podľa Weissa, PCT CA 92/00283 a Reynoldsa a Weissa, J. Neuroscience 12, str. 4565 až 4574, (1992). Bunky sa sedemkrát raz týždenne pasážovali a potom rozdelili do dvoch skupín: s a bez exogénneho inteŕferónu (IFN). Bunky sa previedli do kultivačných fliaš T25 a ich hustota sa upravila na 500000 buniek na 5 ml neurosférovom médiu s obsahom EGF. K polovici buniek sa potom pridal interferón (1000 jednotiek na ml). Kontrolné bunky neobdržali žiadny interferón. Bunky sa inkubovali pri teplote 37 ’C v 5 % CO2 a raz týždenne sa pasážovali.
Po 30 pasážovaniach (po 23 s interferónom) sa bunky umiestnili do média s obsahom séra (DMEM, 5 % fetálne hovädzie sérum a lx L-glutamín) s 1000 jednotkami IFN. Bunková hustota pred prídavkom IFN bola 1,25 milióna buniek na 15 ml. Čerstvý interferón sa pridával každý druhý deň.
Po siedmich dňoch sa médium odstránilo, bunky sa premyli vyváženým soľným roztokom HBSS (Hanks1 Balanced Sált Solution) a fľašky sa ľahko ošetrili trypsínom. Bunky sa resuspendovali v 10 ml média so sérom, zcentrifugovali dvojminútovou centrifugáciou pri 1000 g a médium sa odsalo. Bunky sa potom resuspendovali rozotretím ohňom očistenou pipetou v 2 ml média so sérom.
Približne 25000 buniek sa prenieslo v médiu DMEM s 5 % fetálnym teľacím sérom na krycie sklíčka ošetrené poly-ornitínom. IFN sa pridával k polovici z týchto krycích sklíčok (100 jednotiek na ml) každý druhý deň. Bunky sa špecificky vyfarbili pri detekcii T-antigénu SV40 (Tag) a gliového fibrilárneho kyslého proteínu (GFAP). GFAP je intermediárny filamentózny proteín špecificky exprimovaný astrocytmi. Detekcia sa uskutočňovala v rôznych intervaloch podľa nasledujúceho protokolu.
Krycie sklíčka sa pri teplote miestnosti počas 20 minút ponorili do 4 % paraformaldehydu v 0,1 M PBS. Potom sa dvakrát 5 minút premývali v PBS. Bunky sa permeabilizovali 100r % etanolom (2 minúty) a potom ešte dvakrát 5 minút premývali v 0,1 M PBS. Bunky sa klonovali 5 % normálnym kozím sérom (NGS) rozpusteným v 0,1 M PBS. Blokovanie prebiehalo pri teplote miestnosti počas aspoň 30 minút. Potom sa primárne protilátky resuspendovali v 1 % NGS. Tieto protilátky sa potom 2 hodiny aplikovali na krycie sklíčka pri teplote miestnosti, pričom myšia protilátka anti-Tag sa riedila 1 : 10 a králičia protilátka anti-GFAP sa riedila 1 : 500. Po dvojhodinovej inkubácii sa primárne bunky odstránili a krycie sklíčka sa dvakrát 5 minút premyli PBS pufrom.
Μ
Sekundárne protilátky sa nariedili v 1 % NGS a potom sa aplikovali na 30 minút na krycie sklíčka. Inkubácia prebiehala v temnote a pri teplote miestnosti. Použité protilátky sa nariedili kozou-anti-myšou/FITC 1 : 128 a kozou-anti-králičou/ /texaská červená 1 : 100. Potom sa sekundárne protilátky odstránili a krycie sklíčka sa dvakrát premyli 5 minút v PBS (v tme).
Krycie sklíčka sa potom fixovali pomocou Citiflour™ na sludy a uskladnili sa pri teplote 4 ’C až do prehliadania na fluorescenčnom mikroskope vybavenom rodamínovou a fluoresceínovou optikou.
V tomto súbore experimentov sa stanovilo ako rýchlo dochádza k poklesu koncentrácie T-antigénu po ukončení prídavkov interferónu. Ďalej sa stanovoval efekt koncentrácie T-antigénu na bunkovú proliferáciu a diferenciáciu. Diferenciácia sa stanovovala monitorovaním koncentrácií GFAP. GFAP je intermediárny filamentózny proteín špecificky exprimovaný dospelými astrocytmi. Pozorovali sa nasledujúce fluorescenčné výsledky.
Deň IFN (1000 jedn./ml) Kontrola (bez IFN)
Tag GFAP Tag GFAP
1 +++ - +++ -
4 +++ - + +/
7 +++ - +/- +/-
10 +++ — — +
Imunofarbenie Tag a GFAP ukázalo, že po určitom
v médiu so sérom pokračovali interferónom ošetrené bunky v expresii T-antigénu, pokračovali v proliferácii a neboli pozorované žiadne stopy expresie GFAP, zatiaľ čo u kontrolných buniek (bez interferónu) došlo k diferenciácii (nárastu expresie GFAP) a k ukončeniu delenia. To sa potvrdilo tiež vizuálnou kontrolou krycích sklíčok - štvrtý deň bol jasne viditeľný rozdiel v počte buniek. Desiaty deň bolo buniek ošetrovaných interferónom oveľa viac ako kontrolných.
Expresia T-antigénu vírusu SV40 v tomto konštrukte je regulovaná v závislosti na množstve pridanej regulačnej látky. V bunkových líniách podľa vynálezu sa dosiahla najvyššia hladina expresie T-antigénu (imunofluorescenčne merané) po prídavku 500 až 1000 jednotiek interferónu na ml média. Po prídavku 10 jednotiek na ml média sa pozorovala minimálna alebo žiadna expresia. Podľa očakávania proliferačná rýchlosť bola v korelácii s dávkou použitého IFN. Pri prídavku 100 jednotiek IFN sa pozorovalo minimálne alebo takmer žiadne bunkové delenie .
V ďalších experimentoch s touto bunkovou líniou Mxl Tag na EDF citlivých nervových kmeňových buniek sa dokázalo, že ich proliferáciu a diferenciáciu je možné kontrolovať. Populácia týchto buniek bola prinútená k diferenciácii potom, čo sa previedla z média s obsahom EGF do média s fetálnym hovädzím sérom. S prídavkom 1000 jednotiek/ml α/β interferónu začali proliferovať klastre plochých buniek podobných astrocytom a prípadne vyplnili kultivačné misky. Kontinuálne sa tieto bunky udržiavali v médiu s IFN počas 70 pasážovaní, pričom perióda zdvojenia bunkovej populácie bola 24 až 36 hodín. Pri testovaní pomocou skupiny protilátok špecifických ku gliovým a nervovým bunkám, boli tieto interferónom ošetrené bunky takmer všetky nestín a T-antigén pozitívne, slabo pozitívne na prítomnosť glutamín syntetázy a negatívne pri skúške na GFAP.
Po odstránení IFN z kultivačného médiei rýchlo klesla rýchlosť delenia týchto plochých buniek, vytratila sa imunoreaktivita s protilátkami proti T-antigénu a pozvoľne rástla imunoreaktivita s protilátkami proti glutamín syntetáze a proti GFAP. Tieto bunky prežívali niekoľko mesiacov in vitro a v pokračujúcej absencii IFN v kultivačnom médiu sa nepozorovala žiadna proliferácia. Je zaujímavé, že ako imunoreaktivita s protilátkami proti T-antigénu tak aj bunková proliferácia sa môže opätovne indukovať prídavkom IFN. Tým sa vytvorila bunková línia so schopnosťou kontrolovanej proliferácie a diferenciácie. 1
Príklad 2
Zapuzdrenie a implantácia buniek podľa príkladu 1 do ľudského hostiteľa
Príprava PAN/PVC vláken:
Semipermeabilné duté vlákna sa pripravili pomocou zvlákňovania prúdom vlhkého vzduchu (dry jet-wet spinning) (Cabasso, Hollow Fiber Membranes - Membrány z dutých vlákien, zväzok 12, Kirk-Othmerova Encyklopédia chemickej technológie, Wiley, New York, 3. vydanie, str. 492 až 517, 1980, Dionne, WO 92/19195). Asymetrické duté vlákna sa odlievali z 12,5 % roztoku kopolyméru polyakrylonitrilu a polyvinylchloridu (PAN/PVC) v dimetylsulfoxide (w/w). Výsledné dvojplášťové a jednoplášťové vlákna sa zbierali do vodného kúpeľa bez rozpúšťadiel, glycerinovali a sušili sa. Vlákna sa naplnili bunkami tak, aby výsledná bunková hustota bola 25000 buniek na μΐ a potom sa vlákna na konci zatavili.
Implantácia do hostiteľského organizmu
Zapuzdrené bunky sa implantovali do ľudského hostiteľského organizmu. Implantačné miesta zahŕňali laterálne komory a striatum mozgu. Postup implantácie bioarteficiálnych orgánov do mozgu viď Aebischer a kol., WO 93/00127.
Príklad 3
Podmienená imortalizácia neonatálnych buniek
Fragment s obsahom časti promótora vírusu myšieho prsníkového tumoru (MMTV) je fúzovaný s cDNA génmi rannej oblasti vírusu SV40. Bunky bunkovej línie E15 odvodené od neonatálnych astrocytov z mozgu krysy sa elektroporačne transfikovali a transformanti sa vybrali vďaka schopnosti proliferácie. Deliace sa bunky sa izolovali, namnožili a testovali na expresiu veľkého T-antigénu. Pri testovaní sa použili protilátky proti veľkému T-antigénu. Transformované bunky sa zapuzdrili do BAO a implantovali do hostiteľského organizmu, viď príklad 2. BAO sa ponechali v podmienkach in vivo počas jedného mesiaca. Potom sa bioarteficiálne orgány vybrali a porovnala sa distribúcia buniek v BAO s kontrolou kultivovanou počas rovnakého obdobia in vitro.
Príklad 4
Kolagénom redukovaná proliferácia a kyselinou askorbovou indukovaná diferenciácia buniek SCT-1.
Bunky SCT-1 sa klonovali z ischiatického nervového tumoru transgénnej myši PO-SV40 (Messing a kol., J. Neuroscience 14, str. 3533 až 3539 (1994)). Tieto bunky boli imunoreaktívne s protilátkami proti markerom Schwannových buniek S100 a Po, ako aj s protilátkami proti T-antigénu vírusu SV40. SCT-1 bunky sa kultivovali v troch rôznych vonkajších podmienkach: (1) tkanivová kultúra v plastickej hmote bez kyseliny askorbovej, (2) tkanivová kultúra v plastickej hmote s prídavkom 50 Mg/ml kyseliny askorbovej na indukciu diferenciácie, (3) suspendované v kolagéne typu 1.
Na plastikovom Substráte bez kyseliny askorbovej vykazovala väčšina buniek morfologické znaky podobné fibroblastóm. Avšak boli tu prítomné aj bipolárne bunky. Perióda zdvojenia bunkovej populácie bola 18 až 20 hodín a bunky nevykazovali žiadne znaky kontaktnej inhibície.
SCT-1 bunky kultivované v prítomnosti kyseliny askorbovej vykazovali pomalší rast a silnejšie špecifické farbenie na fibronektín a kolagén typu IV. Imunoreaktivita s protilátkami proti laminínu sa podrobila kontrole.
SCT-1 bunky suspendované v kolagéne typu I vykazovali bipolárnu morfológiu a dramaticky zníženú mitotickú aktivitu (perióda zdvojenia bola väčšia ako 30 dní).
Príklad 5
Inhibícia proliferácie buniek BHK pomocou kyseliny askorbovej a TGF-B
Bunky obličiek mláďat škrečkov (BHK - baby hamster kidney), ktoré sekretujú CNTF sa kultivovali na médiu DMEM s vysokým obsahom glukózy. Ošetrenie synchrónnych (confluent) kultúr BHK buniek TGF-Bl (2,5 ng/ml) a 100 μΜ kyselinou askorbovou redukovalo mitózu. Okrem toho sa zdalo, že sa bunky preťahujú a niektoré sa dokonca vyrovnávajú vedľa seba. Tieto výsledky dokazujú, že TGF-βΙ a kyselina askorbová inhibujú proliferáciu a indukujú diferenciáciu BHK buniek.
V ďalších experimentoch sa bunky BHK, ktoré sekretujú hNGF, ošetrili 2,5 ng/ml TGF-B a 100 μΜ kyseliny askorbovej pred svojím zapuzdrením do BAO a implantáciou. Ako kontrola poslúžili neošetrené bunky. Špecifické premenné boli nasledujúce: a) TGF-B/kyselina askorbová, žiadny Vitrogen™, b) TGF-B/kyselina askorbová, Vitrogen™, c) žiadny TGF-B/kyselina askorbová, Vitrogen™, d) žiadny TGF-B/kyselina askorbová, žiadny Vitrogen™. Okrem toho sa použilo niekoľko rôznych polymérov. Kapsule sa implantovali do striata dospelých krýs. Krysy sa usmrtili po 3 mesiacoch.
Príklad 6
Nervové kmeňové bunky proliferujú v prítomnosti EGF a diferencujú sa v jeho prítomnosti
Neurosferózy sa pripravili spôsobom podľa Weissa, PCT CA 92/00283. Neurosféry 68 sa zhromaždili a rozdelili. Polovica neurosfér sa rozotrela na suspenziu jednotlivých buniek a druhá polovica sa ponechala v klastroch. U suspenzie jednotlivých buniek sa stanovil počet buniek. Pre bunky v klastroch sa predpokladala rovnaká koncentrácia. Jednotlivé bunky a bunky v klastroch sa suspendovali zvlášť v rovnakých množstvách Vi trogenu™ a média na kultiváciu neurosfér s prídavkom 20 ng/ml EGF alebo média PC-1.
Bunkami s hustotou 25000 buniek na μΐ sa naplnili jednoplášťové bioarteficiálne orgány z dutých vlákien PAN/PVC pripravené podľa príkladu 2. Potom sa duté vlákna uzavreli a kultivovali sa buď v médiu na kultiváciu neurosfér s prídavkom EGF-1 alebo v médiu PC-1 (bez EGF-1).
BAO sa odobrali po 3 a 7 dňoch a špecificky imunocytochemicky sa farbili na obsah gliového fibrilárneho kyslého proteínu (GFAP). GFAP je intermediárny filamentózny proteín špecificky exprimovaný astrocytmi. Prítomnosť GFAP dokazuje, že sa nervové bunky diferenciovali na astrocyty. Namerali sa nasledujúce výsledky:
jednotlivé bunky, bez EGF jednotlivé bunky, EGF zhluky buniek, bez EGF zhluky buniek, EGF jednotlivé bunky, bez EGF jednotlivé bunky, EGF zhluky buniek, bez EGF zhluky buniek, EGF
Po 7. dni kultivácie nervové bunky diferenciova
Dni Reaktivita GFAP nízke %, GFAP negatívna nízke %, GFAP negatívna intenzívna + GFAP negatívna intenzívna + GFAP negatívna / neprítomnosti EGF sa zapuzdrené ί na astrocyty.
Príklad Ί
Účinok extracelulárnej matrice na BHK bunky
Príprava nebunkovej extracelulárnej matrice
Krysie meningálne bunky E15 získané z 15 dní starých myších embryí sa vysiali na viacjamkové kultivačné dosky a umož nila sa im synchronizácia. Po dvoch týždňoch sa stiahla monovrstva týchto buniek, ktorá sa prepasážovala.
Nebunková ECM sa extrahovala 30 minútovou inkubáciou s 0,1 % Tritonom X-100 NH OH.
a potom 3 minútovou inkubáciou 5 mM
Bunky BHK-hGNF
Línie buniek BHK, ktoré sekretujú NGF, sa produkovali nasledujúcim spôsobom. 2,51 kb dlhý fragment, ktorý obsahuje približne 37 párov báz z 3' konca prvého intrónu, zdvojená ATG sekvencia považovaná za začiatok translácie proteínu pre-pro-NGF a kompletná kódujúca sekvencia a celá 3' neprekla daná oblasť ľudského génu (Hoyle a kol., Neurón, 10, str. 1019 až 34, 1993) sa subklonovala do expresívneho vektora pNUT založeného na DHFR tesne vedľa promótora pre myší metalotioneín-1 proti smeru transkripcie (-650 až +7) a prvý intrón génu krysieho inzulínu II (Baetge a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, str. 5454 až 58 (1986)).
Bunky z obličiek mláďat škrečkov (BHK bunky) sa transfikovali konštruktom pNUT-B-NGF s použitím kalcium-fosfátovej metódy. BHK bunky rástli v DMEM s obsahom 10 % fetálneho hovädzieho séra, lx penicilínu/ streptomycínu/ ampicilínu B (0,8 g/1) a L-glutamínu (GIBCO), v 5 % oxide uhličitom a pri teplote 37 ’C. Transfikované BHK bunky sa selektovali v médiu s obsahom 200 μΜ metotraxátu (Sigma) počas 3 až 4 týždňov a rezistentné bunky sa ďalej udržiavali ako polyklonálna populácia v médiu buď s alebo bez 200 μΜ metotrexátu.
Transformované BHK-hNGF bunky sa pri hustote
Ι,ΟχΙΟ4 buniek/jamka vysiali na dosky s obsahom ECM extrahovanej z meningálnych buniek. BHK-hNGF s rovnakou hustotou sa vysiali tiež na kontrolné dosky bez ECM. Bunky sa spočítali hematocytometrom po 6 DIV.
Priemerné počty buniek v kontrolných jamkách boli 4,5xl0®+/-4,5xlOs. Priemerné počty buniek na doskách s extrahovanou ECM boli 9,9xlOs+/-4,9xlOs. Z týchto výsledkov je zrejmé 4,5-násobné zníženie bunkového rastu u ošetrených buniek.
Príklad 8
Adhézia buniek a bezbunkové extracelulárne matrice na vnútornej výstuhe
V ďalších experimentoch sa najprv vysiali primárne meningálne bunky na polyuretánové vlákna TECO™. Tieto vlákna sa používajú ako vnútorná výstuha bioarteficiálneho orgánu podľa vynálezu. Ako kultivačné médium sa použilo médium DMEM obohatené 10 % FBS. Po dvoch týždňoch sa vlákna 30 minút extrahovali 0,1 % Tritonom X-100 a potom 3 minúty 25 mM NH^OH. Niektoré vlákna sa imunologický vyfarbili pomocou protilátky proti fibronektínu, aby sa potvrdila prítomnosť nebunkového ECM na povrchu vlákien. Iné vlákna sa použili na testovanie bunkovej adhézie s bunkami BHK.
Príklad 9
Kultivácia buniek BHK na mikronosičoch zapuzdrených do BAO a modifikovaných pomocou PEO-PDMS
Príprava bioarteficiálnych orgánov substituovaných PEO-PDMS
Jednoplášťové BAO z dutých vlákien PAN/PVC sa pripravili podľa príkladu 2. Tieto BAO mali vnútorný priemer
642,6 + 36,7 μία a hrúbka steny bola vonkajší priemer 787,8 ± 32,2 μιη, pričom 67,8 ± 16,2 gm, koeficient nepriepustnosti
BSA bol 100 % a hydraulická permeabilita bola približne
21,8 ml/min/m2/mmHg.
Tieto PAN/PVC bioarteficiálne orgány sa substituovali PEO-PDMS za sterilných podmienok. 1 % alebo 5 % (v/v) roztok
PEO-PDMS (Huls, PS073, mol.hm. = 3126 g/mol, 82 hm. % PEO) sa pripravil rozpustením 1 alebo 5 ml PEO-PDMS v deionizovanej vode tak, aby celkový objem bol 100 ml. Roztok sa sterilné prefiltroval (póry 0,2 μπι) a potom sa injikoval do vlhkej PAN/PVC membrány. Membrána sa zatavila a ponorila do vodného roztoku. Vlákna sa prepláchli vyváženým soľným roztokom HBSS po 72 hodinách a pred použitím s bunkami.
NGF sekretujúce BHK bunky podľa príkladu 7 sa injikovali do týchto vlákien substituovaných PEO-PDMS podľa nasledujúceho postupu.
Postup plnenia a uzavierania vlákien
Suspenzie jednotlivých buniek BHK produkujúcich NGF, ktoré rástli s 90 % synchronizáciou, sa vypláchli PBS (bez vápnika a horčíka), štiepili trypsínom počas približne 1 minúty a peletovali centrifugáciou pri 1000 otáčkach za minútu počas 3 minút. Bunky sa resuspendovali v médiu na konečnú koncentráciu 2xlOv buniek/ml.
Bunky sa buď priamo injikovali do vlákien substituovaných PEO-PDMS alebo sa zmiešali s 0,15 % matričným roztokom VitrogenuR alebo 0,5 % roztokom agarózy a potom sa injikovali.
Vlákna sa potom plnili 2,5 μΐ bunkového roztoku alebo koagulačnej matričnej hmoty s obsahom buniek a matrice (10000 buniek/μΐ) s použitím zošikmenej špičky katétra a Hamiltonovej striekačky.
Kapsule sa uzavierali upevnením 1 až 1,1 cm dlhého úseku suchého dutého vlákna na dutý hriadeľ s priečne uzavretým proximálným koncom. Z hriadeľa bolo možné injikovanie buniek do vnútra zariadenia. Potom, čo sa vlákna naplnili 2,5 μΐ bunkovej suspenzie, septum sa odlomilo a prístupový otvor sa uzavrel pomocou svetlom polymérižujúceho akrylátu (Luxtrak™ LCM 24, ICI Resins US, Wilmington, MA). Následne sa kapsule vybavili manipulačným očkom. Na každú kapsulu sa pripevnila
1,5 cm dlhá silikónová trubica (hadička) s priemerom 0,020 na akrylátové hrdlo.
Nasledujúce bioarteficiálne orgány sa pripravili týmto spôsobom:
1. kontrola s nemodifikovanou obálkou, bez matrice
2. kontrola s nemodifikovanou obálkou, Vitrogen™
3. kontrola s nemodifikovanou obálkou, agaróza
4. obálka modifikovaná
5. obálka modifikovaná
6. obálka modifikovaná
7. obálka modifikovaná
8. obálka modifikovaná
9. obálka modifikovaná
1 % PEO-PDMS, bez matrice
1 % PEO-PDMS, Vitrogen™
1 % PEO-PDMS, agaróza
5 % PEO-PDMS, bez matrice
5 % PEO-PDMS, Vitrogen™
5 % PEO-PDMS, agaróza
BAO sa aklimatizovali počas 4 dní po zapuzdrení pri atmosférickom tlaku kyslíka a potom počas trvania experimentu pri nízkom tlaku (6650 Pa). Obr. 2 ukazuje sekréciu NGF (merané ELISA) po 4, 11 a 25 dňoch.
Údaje o uvoľňovaní NGF dokazujú, že samotná matrica má veľmi malý efekt na bunkovú produkciu. Avšak v prítomnosti PEO-PDMS je produkcia NGF podstatne nižšia pri použití agarózy a bez matrice, ale zostáva nezmenená pri použití Vitrogenu™. Percentuálne množstvo PEO-PDMS použité na modifikáciu tiež zrejme nemá výrazný vplyv na produkciu NGF. Z histologických údajov vyplýva, že BHK bunky zapuzdrené do agarózy majú pretiahnutú morfológiu a pokrývajú steny zariadenia (vlákna), zatiaľ čo vo vlastnej agaróze žije len veľmi málo buniek. BHK bunky injikované spoločne s agarózou do dutých vlákien modifikovaných PEO-PDMS tiež pokrývali steny vlákna, ale vykazovali guľovú morfológiu. V PAN/PVC vláknach modifikovaných PEO-PDMS bolo menej buniek ako v nemodifikovaných vláknach plnených agarózou, čo dokazuje, že bunkový rast bol kontrolovaný. Bunky vo vláknach naplnených Vitrogenom™ a vo vláknach naplnených len bunkovou suspenziou bez matrice neboli žiadnym spôsobom ovplyvnené modifikáciou vlákna.
BHK bunky v nemodifikovaných vláknach s matricou tvorenou Vitrogenom™ sa rovnomerne distribuovali a frakcia živých buniek bola 75 %. Bolo možné pozorovať nekrotické bunky v centrálnej časti vlákna. Modifikácia pomocou PEO-PDMS neovplyvnila bunkovú distribúciu, životaschopnosť alebo morfológiu. Pri použití agarózy ako matrice bola bunková distribúcia vynikajúca, pričom životaschopnosť buniek bola približne 90 %. Bunková morfológia BHK buniek bola pri použití agarózy ako matrice ovplyvnená modifikáciou membrány pomocou 1 % a 5 % PEO-PDMS. Bunky boli pretiahnuté pri použití nemodifikovaných PAN/PVC vlákien a viac zaguľatené pri použití modifikovaných vlákien. Bunky sa nenachádzali vnútri agarózovej matrice, ale v priestore medzi stenou vlákna a agarózovým jadrom. Bez použitia matrice bola bunková distribúcia menej uspokojivá a bunky vytvárali veľké klastre, tiež aj životaschopnosť buniek bola nižšia (okolo 60 %).
Príklad 10
Bunky BHK kultivované na guľôčkach CultiSphers™
NGF sekretujúce BHK bunky (viď príklad 7) sa kultivovali na kolagénom potiahnutých guľôčkach CultiSphers™. Guľôčky CultiSphers™ (1 g) sa rehydratovali v 50 ml PBS (CMF). 15x10® buniek sa suspendovalo v 1 ml rehydratovaných guľôčiek CultiSphers™. Táto suspenzia sa priamo injikovala do jednoplášových dutých vlákien PAN/PVC. Vlákna sa pripravili postupom opísaným v príklade 2 a naplnili a zatavili sa tak, ako bolo opísané v príklade 9. Zapuzdrené bunky sa testovali na sekréciu NGF pomocou ELISA testu a to v dňoch 2, 15 a 56. Médium sa doplňovalo trikrát týždenne. Na obrázku 3 sú znázornené výsledky. Z výslednej produkcie NGF je zrejmé, že BHK bunky sa môžu kultivovať na mikronosičoch CultiSphers™ po zapuzdrení do BAO. (legenda k obr. 3: A, D). Ďalej tieto údaje dokazujú, že BHK bunky/CultiSphers™ sa môžu ďalej suspendovať v agarózovej matrici pri malom alebo žiadnom dopade na sekréciu NGF (legenda k obr. 3: B, C).
Príklad 11
Použitie peptidových derivátov na kontrolu bunkových populácií a bunkovej distribúcie
V tomto príklade sa luminálny povrch bioarteficiálneho orgánu modifikoval PEO-PDMS, poly-D-lyzínom alebo PepTite 2000™ čo je komerčne dostupný proteín, ktorý zvyšuje bunkovú adhéziu.
V tomto súbore experimentov sa použili bunky obličiek mláďat škrečkov (BHK - baby hamster kidney) preto, že sú závislé na ukotvení na tuhej fáze a preto, že sa už vopred dokázalo, že sa viažu na membránu dutých vlákien.
Vlákna
Jednoplášťové BAO z dutých vlákien PAN/PVC sa pripravili podľa príkladu 2. Tieto BAO mali vnútorný priemer 625 μτα a hrúbka steny bola 50 μιη. Tieto vlákna sa sterilizovali ponorením do 70 % etanolu cez noc a potom sa opakovane prepláchli pufrom HBSS.
Modifikácia
1. PEO-PDMS: bioarteficiálne orgány sa modifikovali
PEO-PDMS nasledujúcim spôsobom: 1 % (v/v) roztok PEO-PDMS (Huls, PS073, mol. hm. = 3126 g/mol, 82 hm. % PEO) sa pripravil rozpustením 1 PEO-PDMS v deionizovanej vode tak, aby celkový objem bol 100 ml. Roztok sa sterilné prefiltroval (póry 0,2 gm) a potom sa injikoval do sterilnej PAN/PVC membrány. Membrána sa potom na 24 hodín ponorila do 1 % vodného roztoku PEO-PDMS pri teplote miestnosti. Vlákna sa trikrát prepláchli vodou a potom vyváženým soľným roztokom HBSS pred použitím s bunkami.
2. PDL: bioarteficiálne orgány sa modifikovali poly-D-lyzínom nasledujúcim spôsobom: vlákna sa ponorili do vodného roztoku poly-D-lyzínu (mol hm = 67000) s koncentráciou 2 mg/ml na 24 hodín pri teplote miestnosti. Vlákna sa trikrát prepláchli vodou a potom trikrát vyváženým soľným roztokom HBSS pred použitím s bunkami.
3. PepTite2000™: bioarteficiálne orgány sa modifikovali pomocou PepTite2000™ nasledujúcim spôsobom: vlákna sa ponorili do roztoku PBS s obsahom PepTite2000™ s koncentráciou 100 mg/ml. PepTite2000™ je nutné najskôr rozpustiť v etanole. Vlákna boli v tomto roztoku ponorené 24 hodín pri teplote miestnosti a potom sa trikrát prepláchli PBS pred injekciou buniek.
4. PAN/PVC: Kontrolné vlákna sa ponorili do vyváženého soľného roztoku HBSS na 24 hodín pri teplote miestnosti a potom sa trikrát prepláchli PBS pred injekciou buniek.
Bunky
BHK bunky s koncentráciou 5000 buniek/μΐ sa injikovali do modifikovaných dutých vlákien. Vlákna sa zatavili a umiestnili do skúmaviek so skrutkovým uzáverom. V týchto skúmavkách sa vlákna inkubovali v bezsérovom médiu (médium PC1) na otočnom bubne počas dvoch týždňov. Inkubačná teplota bola 37 ’C, rýchlosť otáčania bubna bola 2 otáčky za minútu. Vo vhodnom okamihu sa vlákna fixovali 4 % formaldehydom, dehydratovali v absolútnom etanole a vyfarbili hematoxylínom a eozínom (H&E) kvôli histologickej analýze bunkovej distribúcie, ktorá sa uskutočnila oxidom osmičelým.
PAN/PVC membrány modifikované poly-D-lyzínom vykazovali dobrú distribúciu buniek a ešte rovnomernejšiu distribúciu vykazovali vlákna modifikované PepTite2000'rM.
Modifikácia PAN/PVC vlákien pomocou PepTite2000™ sa uskutočnila dvomi spôsobmi. Pri prvom spôsobe modifikácie sa modifikoval len vnútorný luminálny povrch, zatiaľ čo pri druhom spôsobe modifikácie sa modifikoval ako vnútorný tak aj vonkajší povrch membrány. Prázdne BAO (bez buniek) sa testovali na celkový obsah aminokyselín, aby sa zistila schopnosť väzby poly-D-lyzínu a PepTite2000™ na membránu. Celkové množstvo aminokyselín naviazaných na kontrolné nemodifikované vlákna bolo približne 0,2 μg na jeden bioarteficiálny orgán. Celkové množstvo aminokyselín naviazaných na vlákna modifikované poly-D-lyzínom bolo približne 0,8 pg na jeden bioarteficiálny orgán s vnútorným modifikovaným povrchom a približne 2,6 Mg/BAO pre obojstranne modifikované membrány. Podobné bioartef iciálne orgány sa naplnili BHK bunkami a kultivovali 14 dní. Potom sa skúmali histologický. U kontrolných, nemodifikovaných BAO sa bunky distribuovali nerovnomerne vo veľkých klastroch po celej dĺžke vlákna. Naproti tomu obidva typy modifikovaných vlákien vykazovali rovnomernú bunkovú distribúciu pozdĺž vnútorného povrchu membrány.
Z týchto výsledkov vyplýva, že poly-D-lyzín a PepTite2000™ sú účinnými látkami na zvýšenie bunkovej adhézie k luminálnemu povrchu a sú preto efektívne na kontrolu bunkovej distribúcie v BAO.
Príklad 12
Použitie molekúl ECM na kontrolu rastu neurosfér.
Myšie neurosféry pasáže 71 sa pripravili tak, ako je opísané v príklade 1. Viacjamkové dosky sa vopred potiahli 0,5 % agarózou (Sea-Prep™), aby sa zabránilo prilepeniu neurosfér na plastikový povrch dosky. Bunky sa nanášali pri hustote približne 50000 buniek na jamku do jednotlivých matríc podľa experimentu. Pre každé zloženie matrice sa použili 3 jamky, dve z jamiek obsahovali médium PC-1 (kontrolné) a jedna obsahovala neurosféry s médiom EGF.
Hodnotila sa efektivita kontroly bunkového rastu u kolagénu typu 1 odvodeného z pokožky (Zydast™, Collagen Biomedical, Palo Alto), kolagénu typu 1 zo šliach (Organogenesis™), kolagénu typu 1 (Vitrogen™, Celtrix, Šanta Čiara) a agarózy.
Každá z látok sa testovala samotná alebo v kombinácii,s laminínom alebo s PepTite2000™ alebo s obidvoma.
Štvrtý a štrnásty deň sa bunky farbili fluoresceíndiacetátom/propídium jodidom (FDA/PI) a vyhodnotila sa ich životaschopnosť, rast a diferenciácia. Bunky kultivované na kolagéne Organogenesis™, PepTite2000™ a laminíne vykazovali najvyššiu diferenciáciu, pričom asi 90 % buniek bolo diferencovaných. Asi 80 % buniek kultivovaných na kombinácii agarózy, PepTite2000™ a laminínu bolo diferenciovaných.
Príklad 13
Použitie inertnej vnútornej výstuhy na kontrolu množstva BHK buniek á ich distribúcie v BAO.
Použili sa duté vlákna dvoch rôznych typov (viď príklad 2): jednoplášťové duté vlákna s permselektívnou membránou na vonkajšom povrchu a jednoplášťové duté vlákna s permselektívnou membránou na vnútornom povrchu.
Najskôr sa PAN/PVC vlákna zbavili glycerínu a sterilizovali ponorením do 70 % sterilné prefiltrovaného roztoku (inkubácia cez noc). Potom sa počas 1 až 2 hodín vlákna trikrát premyli sterilnou vodou.
Matrica vnútornej výstuhy tvorená 15 % polyhydroxyetylmetakrylátom (PHEMA) sa pripravila rozpustením 1,5 g PHEMA v 10 ml 95 % etanolu (Quantum). Ďalej sa pripravila matrica vnútornej výstuhy tvorená 10 % poly(hydroxyetylmetakrylátom-ko-metylmetakrylátom (PHEMA/MMA) rozpustením 1,0 g PHEMA/MMA v 10 ml 95 % etanolu. Kvôli ľahkému rozpusteniu polymérov sa roztoky miešali a zohrievali.
Roztoky PHEMA a PHEMA/MMA sa pomocou striekačky injikovali do PAN/PVC vlákien, ktoré sa potom ponorili do sterilnej vody. Naplnené vlákna sa vo vode ponechali dlhšie ako hodinu, aby sa zabezpečila precipitácia vnútornej výstuhy a difúzia etanolu von z jadra BAO. Konce vlákien sa ustrihli, pretože sú často znečistené PHEMA alebo PHEMA/MMA. Vlákna sa potom preniesli na Petriho misky so sterilným pufrom HBSS. Týmto spôsobom sa pripravili bioarteficiálne orgány s vnútornou výstuhou tvorenou PHEMA/MMA a kontrolné.
NGF sekretujúce BHK bunky (viď príklad 7) sa kultivovali v 10 % DMEM médiu s prídavkom glutamínu a antibiotík. Bunky sa z kultivačných nádob jemne vybrali pomocou 0,25 % trypsínu, premyli a resuspendovali sa v médiu PC1 tak, aby výsledná bunková hustota bola lxlO-7 buniek/ml.
Potom sa BHK-NGF bunky injikovali do dutých vlákien pri koncentrácii 10000 buniek/μΐ pomocou teflónového katétra veľkosti 22. BAO sa potom zatavili.
Pripravilo sa 5 bioarteficiálnych orgánov každého typu. Štyri bunky sa umiestnili do jamiek na 24 jamkovej kultivačnej doske s 1 ml média PC1. Piaty sa uložil do 3 až 4 ml média PC1 do vertikálnej skúmavky. Po 24 hodinách sa bioarteficiálny orgán umiestnený vo vertikálnej skúmavke pozdĺžne rozrezal a po 24 hodinách sa analyzoval farbením fluoresceíndiacetátom/propídium jodidom (FDA/PI). Týmto farbením sa stanovila bunková distribúcia vnútri vlákna. Pri prehliadaní pod fluorescenčným mikroskopom farbí FDA živé bunky do zelena, zatiaľ čo PI farbí mŕtve bunky do červená.
Zvyšné BAO sa kultivovali počas dvoch týždňov. Štyri dni po zapuzdrení sa bioarteficiálne orgány kultivovali pri vonkajšom tlaku kyslíka a potom sa im tlak kyslíka znížil na 6650 Pa počas trvania štúdie.
Funkčnosť buniek BHK-NGF sa testovala meraním sekretovaného NGF pomocou ELISA testu po 4, 7 a 14 dňoch. Bunky v BAO s obsahom vnútornej výstuhy PHEMA alebo PHEMA/MMA pokračovali v sekrécii NGF počas celého obdobia trvania štúdie. Ako histologické údaje tak aj údaje získané zo sekrécie NGF ukazujú, že vnútorná výstuha tvorená PHEMA alebo PHEMA/MMA umožňuje udrža nie funkčných živých buniek s rovnomernou distribúciou po celej dĺžke BAO. Najlepšie výsledky sa dosiahli s 10 % PHEMA/MMA vnútornou výstuhou.
Príklad 14
Použitie inertnej vnútornej výstuhy na kontrolu množstva buniek PC12 a ich distribúcie v BAO.
Vyhodnotila sa efektivita vnútorných výstuh tvorených PHEMA alebo PHEMA/MMA na kontrolu množstva a. distribúcie buniek PC12 v bioarteficiálnom orgáne.
Jednoplášťové duté vlákna sa pripravili podľa príkladu 2. Tieto vlákna mali vnútorný priemer 642 μιη a vonkajší priemer 787 μπι, pričom hrúbka steny bola 68 Mm, koeficient nepriepustnosti BSA bol 100 % a hydraulická permeabilita bola približne 22, ml/min/m2/mmHg.
Do týchto vlákien sa injikovali inertné vnútorné výstuhy z PHEMA alebo PHEMA/MMA (viď príklad 13).
Bunky PC-12 (lxlO-7 buniek/ml) v médiu HL-1 sa injikovali do vnútra týchto vlákien. Vlákna sa potom zatavili, vzniknuté BAO boli asi 1 cm dlhé. Bioarteficiálne orgány sa kultivovali pri teplote 37 ’C a atmosférickom tlaku v médiu HL-1. Funkčnosť BAO sa testovala stanovením bazálnych a draselnými iónmi indukovaných koncentrácií sekrečných katecholamínov po 1, 14 a 28 dňoch.
Výsledky ukazujú obrázky 4A a 5A (bazálna sekrécia) a 4B a 5B (sekrécia indukovaná K*). Tieto výsledky dokazujú, že bunky PC12 zapuzdrené do bioarteficiálnych orgánov s inertnou vnútornou výstuhou z PHEMA alebo PHEMA/MMA si zachovávajú svoju funkčnosť.
Bunková distribúcia sa vyhodnotila po 5 hodinách a po 4 dňoch. Vlákna sa vertikálne rozrezali a bunky sa vyfarbili
FDA/PI. Z výsledkov vyplýva, že vnútorné výstuhy z PHÉMA alebo PHEMA/MMA sú netoxické a podporujú životaschopnost a funkčnosť buniek PC12.
Príklad 15
Použitie NWPF na zosilnenie bunkovej adhézie a diferenciácie v BAO
Vyskúšalo sa šesť rôznych druhov NWPF (Reemay, Tenessee): #2470, #2295, #2024, #2055, #2033, #2250 (čísla viď Reemay). Tkanina bola dodaná vo forme listov, z ktorých sa vyrazili kotúče tak, aby sa vošli do jamiek v 24 jamkových doskách. Tieto NWPF disky sa na 6 hodín ponorili do 1 % (w/v) dodecylsulfátu sodného (SDS) a potom trikrát prepláchli vodou. Potom sa disky na 13 hodín ponorili do 1 % kyseliny sírovej (v/v vodný roztok) a potom sa opäť trikrát premyli vodou. Disky sa potom vysušili na papierových filtroch a sterilizovali sa v autokláve.
Potom sa disky inkubovali s bunkami troch rôznych druhov, pričom sa stanovovala bunková adhézia: BHK, AT-3 a TSA buniek. Pridalo sa približne 100000 buniek na 24 jamkovú dosku, ktorá obsahovala jeden zo 6 druhov NWPF spolu s médiom PC1. Použilo sa bezsérové médium, aby sa dala stanoviť adhézia buniek a zabránilo sa pritom klamlivým interferenciám so sérom (s výnimkou buniek TSA). Po 4 dňoch sa bunky BHK a AT-3 testovali na adhéziu pomocou PDA/PI. Morfológia buniek bola pretiahnutá a zdalo sa, že adherujú k Reemay NWPF #2250 a #2055. Po desiatich dňoch rástli bunky BHK najlepšie na NWPF #2250. Bunky AT-3 najlepšie adherovali k #2024 a #2295. Bunky AT-3 rástli najlepšie po 10 dňoch na vláknach #2024. Bunky TSA (v médiu s 10 % FCS) mali po 1 dni pretiahnutú morfológiu na vláknach #2250 a #2055 a najlepšie rástli na vláknach #2024. Po siedmich dňoch rástli tieto bunky najlepšie na #2055.
Príklad 16
Transgénne bunky SV40/DBH-NGF na mikronosičoch suspendovaných v matricovom materiáli.
Regulačné elementy génu pre dopamín-B-hydroxylázy (DBH) (Hoyle a kol., J. Neurosci. 14, str. 2455 až 2563, (1994)) sa použili na kontrolu spoločnej expresie T-antigénu vírusu SV40 (tsa58) (DBH-SV) a ľudského rastového faktora (DBH-hNGF) v transgénnych myšiach. Výsledkom spoločnej expresie chimerických génov boli novotvary v adrenálnej meduli a noradrenergných sympatetických gangliách. Nádory z brušnej oblasti jednej myši sa rozkrájali a nádorové tkanivo sa mechanicky disociovalo a previedlo do bunkovej kultúry (DMEM, 10 % FBS, 37 'C, 5 % CO2). Od začiatku kultivácie boli prítomné dva rôzne typy buniek. Jedným druhom buniek boli veľké ploché bunky podobné fibroblastóm a druhým typom boli malé jasné bunky s nervovými výbežkami. Malé bunky vykazovali znaky katecholaminergných neurónov vrátane imunoreaktivity s protilátkami proti neurofilamentom-L a -M a tyrozín hydroxyláze. Tieto bunky tiež reagovali s protilátkami proti T-antigénu vírusu SV40, na rozdiel od buniek podobných fibroblastóm, ktoré boli na tieto markery negatívne. Bunky sa jedenkrát týždenne pasážovali.
Bunky sa kultivovali na mikronosičoch CultiSphers™, viď príklad 10. Bunky sa suspendovali buď v alginátovej (1,5 %) alebo agarózovej (1 %) matrici. Alginátová matrica sa zosieťovala ponorením vlákien do 1 % roztoku chloridu vápenatého počas 5 minút po zapuzdrení. Matrice, ktoré obsahovali bunky a nosič CultiSphers™ sa injikovali do PAN/PVC dutých vlákien, viď príklad 10.
BAO naplnené bunkami sa kultivovali v bezsérovom médiu. Vo vybraných intervaloch sa vlákna premyli vodou a potom 30 minút inkubovali v pufri HBSS. Bazálne médium sa zhromaždilo a testovalo pomocou HPLC-ED na prítomnosť L-dopa. Ešte po 80 dňoch in vitro pokračovali bunky v sekrécii L-dopa.
Príklad 17
Geneticky modifikované myoblasty sekretujú po diferenciácii NGF
Myšie C2Či2 myoblasty sú výhodné tým, že sa rýchlo delia, môžu sa in vitro pestovať vo veľkom objeme, transformovať na expresiu proteínov a vybrané klony sa môžu ľahko izolovať. Myšie bunky C2Ci2 sa môžu diferencovať do post-mitotického stavu kultiváciou v médiu s nízkym obsahom séra. Tieto sú preto výhodné na zapuzdrenie v porovnaní s bunkami, ktorých proliferáciu nie je možné kontrolovať. Také bunky pokračujú v delení pokiaľ nenaplnia kapsulu a po niekoľkých mesiacoch je možné pozorovať akumuláciu bunkových zvyškov.
Testovala sa schopnosť transfikovanej bunkovej línie C2Ci2 podobnej myoblastom pokračovať v sekrécii hNGF aj po fúzii do myotubúl.
CzCi2 myoblastová bunková línia (ATCC) sa transfikovala génom pre hNGF pomocou Lipofektamínového reagens podľa protokolu výrobcu (Gibco). Bunky sa selektovali néi selekčnom médiu s prídavkom G148 počas 2 týždňov a potom sa testovali na sekréciu NGF. Bunky s hustotou 260 buniek na cm2 sa umiestnili do kultivačných nádob T75 a na 24 jamkové dosky s alebo bez krycích viečok. Bunky sa dvakrát týždenne prikrmovali prídavkom média DMEM s 10 % FBS. Bunky sa odobrali 1., 5., 8. a 13-ty deň a zmerala sa sekrécia NGF. Výsledky viď tabuľka 2.
Z výsledkov vyplýva, že transfikované myoblasty pokračujú v sekrécii požadovaného heterológneho produktu (NGF) ešte aj po konečnej diferenciácii do myotubúl.
Tabuľka 2
Časový priebeh selekcie buniek CC na sekréciu NGF sekrécia kultivačný percento percento NGF
b. línie čas konfluencie fúzie
rodič. b. línia deň 23.3 1 .1995 25 0 nesk.
+ NGF deň 1 25 0 nesk.
23.3 .95
rodič. b. línia deň 5 40 0 nesk.
+ NGF deň 5 30 0 nesk.
rodič. b. línia deň 8 98 5 •fc λ ★
+ NGF deň 8 90 1 0,0018
rodič. b. línia deň 13 1000 80 nedetego-
vateľný
+ NGF deň 13 100 50 0,014
% fúzie = % myoblastov, ktoré sa premenili na myotubule + NGF - znamená bunky C2Ci2 transformované génom hNGF rodič, b. línia - znamená netransformovanú b. líniu nesk. - znamená neskúšané nedetegovateľný znamená, že koncentrácia bola pod prahom detekcie *** ôsmy deň bunky narástli do veľkosti, príprava na fúziu, viac fúzujúcich buniek na miskách ako v T nádobkách (prietoková cytometria sa uskutočňuje s nádobkami)
Príklad 18
Geneticky upravené myoblasty sekretujú CNTF po svojej diferenciácii '
Myšie myoblasty C2Ci2 sa transfikovali expresívnym vektorom pNUT (Baetge a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, str.
5454 až 5458, (1986)), ktorý obsahoval gén pre ľudský CNTF.
Úroveň expresie génu hCNTF a bioaktivita tohto produktu sa analyzovala Nothern blotom, ELISA a ChAT aktivitou na embryonálnych miechach kultúr motorických neurónov. Zistil sa jeden kloň C2C12 so sekréciou približne 0,2 g CNTF/10 buniek/deň. Rýchlosť sekrécie hCNTF sa po diferenciácii týchto myoblastov C C nezmenila. Bunky CC - hCNTF dokázali Odvrátiť motorické neuróny od axotómiou indukovanej bunkovej smrti. Morfologické štúdie faciálnych jadier novorodených myší po 1 týždennej axotómii ukázali, že u kontrolných zvierat prežilo len 13,4 % faciálnych motorických neurónov, zatiaľ čo kontinuálna produkcia hCNTF mala za následok 22,7 % prežitia motorických neurónov.
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 1:
Cys Asp Pro Gly Tyr íle Gly Ser Arg
5
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 2:
Gly Arg Gly Asp Ser Pro
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 19 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 3:
Cys Ser Arg Ala Arg Lys Gin Ala Ala Ser íle Lys Val Ala
10
Val Ser Ala Asp Arg
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 5 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 4:
Gly Gly Gly Gly Gly

Claims (43)

1. Spôsob kontroly distribúcie buniek v bioarteficiálnom orgáne, vyznačujúci sa tým, že bunky sa ošetria takým spôsobom, ktorý inhibuje bunkovú proliferáciu alebo podporuje bunkovú diferenciáciu, pričom toto ošetrenie je účinné po in vivo implantácii do hostiteľského organizmu.
2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že ošetrenie zahŕňa transformáciu buniek génom podporujúcim proliferáciu, ktorý je funkčne spojený s regulovateľným promótorom tak, že expresia génu podporujúceho proliferáciu môže byť inhibovaná po in vivo implantácii do hostiteľského organizmu.
3. Spôsob podľa nároku 2,vyznačujúci sa tým, že gén podporujúci proliferáciu je onkogén..
4. Spôsob podľa nároku 3,vyznačujúci sa tým, že onkogén je zvolený zo skupiny tvorenej onkogénmi c-myc, v-mos, v-Ha-ras, rannými génmi vírusu SV40 a El-A.
5. Spôsob podľa nároku 2,vyznačujúci sa tým, že regulovateľný promótor je zvolený zo skupiny tvorenej promótormi regulovateľnými tetracyklínom, interferónmi, glukokortikoidmi a promótormi, ktoré sú regulované dlhou terminálnou repetíciou retrovírusov.
6. Spôsob podľa nároku 5,vyznačujúci sa tým, že promótorom je promótor Mxl a gén podporujúci proliferáciu je ranný gén vírusu SV40.
7. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že.ošetrenie zahŕňa transformáciu buniek génom potláčajúcim proliferáciu, ktorý je funkčne spojený s regulovateľným promótorom tak, že môže nastať expresia génu potláčajúceho proliferáciu po implantácii do hostiteľského organizmu in vivo, ale pritom môže byť táto expresia v podmienkach in vitro inhibovaná.
8. Spôsob podľa nároku 7,vyznačujúci sa tým, že génom potláčajúcim proliferáciu je tumor-supresívny gén zvolený zo skupiny tvorenej génmi p53 a RB.
9. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že ošetrenie zahŕňa transformáciu buniek génom indukujúcim diferenciáciu, ktorý je funkčne spojený s regulovateľným promótorom tak, že môže nastať expresia génu indukujúceho diferenciáciu po implantácii do hostiteľského organizmu in vivo, ale pritom môže byť táto expresia v podmienkach in vitro inhibovaná.
10. Spôsob podľa nároku 9,vyznačujúci sa tým, že génom indukujúcim diferenciáciu je gén HMG proteínu 14.
11. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že ošetrenie zahŕňa vystavenie buniek pôsobeniu zlúčeniny, ktorá inhibuje proliferáciu alebo indukuje diferenciáciu.
12. Spôsob podľa nároku 11,vyznačujúci sa tým, že zlúčenina inhibujúca proliferáciu alebo indukujúca diferenciáciu je zvolená zo skupiny tvorenej esterom forbolu, heparínom, TGF-b, kyselinou askorbovou, mytomycínom, Brdu, PGEx, dbcAMP, Ara-C, nikotínamidom a SGP.
13. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa1 tým, že ošetrenie zahŕňa ukončenie expozície buniek proliferáciu indukujúcim zlúčeninám alebo zlúčeninám inhibujúcim diferenciáciu.
14. Spôsob podľa nároku 13,vyznačujúci sa tým, že proliferáciu stimulujúcou zlúčeninou alebo diferenciáciu inhibujúcou zlúčeninou je látka zvolená zo skupiny tvorenej EGF, TGF-a a amfiregulínom, pričom bunkami sú kmeňové nervové bunky.
15. Spôsob podľa nároku 13,vyznačujúci sa tým, že proliferáciu stimulujúcou zlúčeninou alebo diferenciáciu inhibujúcou zlúčeninou je zmes látok z rodiny FGF rastových faktorov a aspoň jedna látka z rodiny rastových faktorov CNTF alebo NGF, pričom bunkami sú kmeňové nervové bunky.
16. Spôsob podľa nároku 13,vyznačujúci sa tým, že proliferáciu stimulujúcou zlúčeninou alebo diferenciáciu inhibujúcou zlúčeninou je multirodový rastový faktor, pričom bunkami sú hematopoietické bunky.
17. Spôsob kontroly distribúcie buniek v bioarteficiálnom orgáne, vyznačujúci sa tým, že je aspoň jeden rastový povrch bioarteficiálneho orgánu vystavený takému ošetreniu, ktoré inhibuje bunkovú proliferáciu a podporuje bunkovú diferenciáciu, pričom toto ošetrenie je účinné po in vivo implantácii do hostiteľského organizmu.
18. Spôsob podľa nároku 17,vyznačujúci sa tým, že ošetrením je potiahnutie rastového povrchu bioarteficiálneho orgánu účinným množstvom aspoň jednej molekuly z extracelulárnej matrice.
19. Spôsob podľa nároku 18,vyznačujúci sa tým, že rastový povrch potiahnutý molekulou z extracelulárnej matrice je vnútorný dutý povrch bioarteficiálneho orgánu.
20. Spôsob podľa nároku 18,vyznačujúci sa tým, že rastový povrch potiahnutý molekulou z extracelulárnej matrice obsahuje mikronosiče zapuzdrené v bioarteficiálnom orgáne.
21. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ošetrenie zahŕňa suspendovanie buniek v matrici z hydrofilného gélu vnútri bioarteficiálneho orgánu, pričom matrica je substituovaná proliferáciu inhibujúcimi alebo diferenciáciu indukujúcimi peptidmi alebo peptidovými sekvenciami.
22. Spôsob podľa nároku 21,vyznačujúci s á tým, že hydrofilná gélová matrica sa skladá z agarózy substituovanej peptidovými sekvenciami zvolenými zo skupiny tvorenej sekvenciami s obsahom RGD (ArgGlyAsp, AA2-AA4 podľa Sekvencie id. č. 2), sekvenciami s obsahom YIGSR (TyrlleGlySerArg, AAs-AAg podľa Sekvencie id. č. 1) a sekvenciami s obsahom IKVAV (IleLysValAlaVal, ÁA^-AA^ podľa Sekvencie id. č. 3).
23. Spôsob podľa nároku 20,vyznačujúci sa tým, že mikronosiče sú suspendované v hydrofilnej gélovej matrici podľa ľubovoľného z nárokov 21 až 22.
24. Spôsob kontroly distribúcie buniek v bioarteficiálnom orgáne, vyznačujúci sa tým, že je aspoň jeden rastový povrch bioarteficiálneho orgánu vystavený ošetreniu takým spôsobom, ktorý zosilní bunkovú priľnavosť k tomuto povrchu.
25. Spôsob podľa nároku 24,vyznačujúci sa tým, že ošetrenie zahŕňa substitúciu alebo adsorpciu zlúčeniny na rastový povrch, pričom táto zlúčenina je zvolená zo skupiny tvorenej poly(D-lyzínom), sekvenciami s obsahom RGD (ArgGlyAsp, AA^-AA^ podľa Sekvencie id. č. 2), sekvenciami s obsahom YIGSR (TyrlleGlySerArg, AAs-AAs podľa Sekvencie id. č. 1) a sekvenciami s obsahom IKVAV (IleLysValAlaVal, AA, -AA _ podľa Sekvencie id. č. 3). ,
3_ 3_ 3. 5
26. Spôsob podľa nároku 24,vyznačujúci sa tým, že ošetrenie zahŕňa vytvorenie inertnej nosnej mriežky v bioarteficiálnom orgáne.
27. Spôsob podľa nároku 26,vyznačujúci satým, že inertná nosná mriežka je vytvorená z látky zvolenej zo skupiny tvorenej polyhydroxyetylmetakrylátom a poly(hydroxyetylmetakrylátom-ko-metylmetakrylátom).
28. Spôsob kontroly distribúcie buniek v bioarteficiálnom orgáne, vyznačujúci sa tým, že je aspoň jeden rastový povrch bioarteficiálneho orgánu vystavený ošetreniu takým spôsobom, ktorý zabraňuje bunkám priľnúť k tomuto povrchu.
r
29. Spôsob podľa nároku 28,vyznačujúci sa tým, že ošetrenie zahŕňa substitúciu alebo adsorpciu PEO-PDMS na rastový povrch.
30. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že ošetrenie zahŕňa expozíciu buniek takej dávke UV žiarenia, ktorá inhibuje proliferáciu.
31. Bioarteficiálny orgán, vyznačujúci sa tým, že obsahuje
a) biokompatibilnú, permselektívnu obálku a
b) jadro tvorené živými bunkami, pričom tieto bunky sú ošetrené spôsobom podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 30 tak, že je možné kontrolovať distribúciu buniek v bioartef iciálnom orgáne, po implantácii do hostiteľského organizmu in vivo.
32. Bunka transformovaná rekombinantnou molekulou DNA, vyznačujúca sa tým, že obsahuje
a) proliferáciu podporujúci gén, ktorý ak je exprimovaný, je schopný indukovať bunkové delenie,
b) Mxl promótor operatívne spojený s génom podporujúcim proliferáciu, pričom taká bunka môže byť prinútená k proliferácii po expozícii takému množstvu interferónu, ktoré je schopné indukovať expresiu génu podporujúceho proliferáciu.
33. Bunka podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že gén podporujúci proliferáciu je veľký T-antigén vírusu SV 40.
34. Bunka podľa nároku 32, vy z naču j úca že je odvodená od kmeňových nervových buniek.
35. Bunka podľa nároku 32, vyznačujúca že sekretuje biologicky aktívnu látku.
sa tým, sa tým,
36.
Bunka že je sahom podľa nároku 35, vy z naču j úca geneticky transformovaná expresívnym génu, ktorý kóduje biologicky aktívnu m,
Ý vektorom s oblátku.
37.
Bunka podľa nároku 35 alebo 36, v y tým, že biologicky aktívna látka znač je zvolená zo skupiny u j ú c a sa tvorenej neurotransmitermi, hormónmi, cytokínmi, rastovými faktormi, protilátkami, krvnými koagulačnými faktormi a enzýmami.
38. Transgénny cicavec, vyznačujúci sa tým, že bol transformovaný rekombinantnou DNA molekulou, ktorá obsahuje
a) gén podporujúci proliferáciu, ktorý ak je exprimovaný, je schopný indukovať bunkové delenie
b) Mxl promótor operatívne spojený s génom podporujúcim proliferáciu.
39. Transgénny cicavec podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že gén podporujúci proliferáciu je veľký T-antigén vírusu SV 40.
40. Potomstvo transgénneho cicavca podľa nároku 38.
I
41. Bunky izolované z transgénneho cicavca podľa ľubovoľného z nárokov 38 alebo 40.
42. Bunka podľa nároku 41,vyznačujúca sa tým, že je to kmeňová nervová bunka. '
43. Spôsob prípravy podmienene imortalizovaných buniek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky
a) transformáciu buniek rekombinantnou molekulou DNA, ktorá obsahuje gén podporujúci proliferáciu, ktorý ak je exprimovaný, je schopný indukovať bunkové delenie a Mxl promótor operatívne spojený s génom podporujúcim proliferáciu, pričom transformácia je uskutočnená takým spôsobom, že bunka môže byť prinútená k proliferácii po expozícii takému množstvu interferónu, ktoré je schopné indukovať expresiu génu podporujúceho proliferáciu,
b) kultiváciu takto transformovaných buniek.
SK77-97A 1994-07-20 1995-07-20 A method of controlling cell distribution within bioartificial organ SK7797A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/279,773 US5935849A (en) 1994-07-20 1994-07-20 Methods and compositions of growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
US08/432,698 US5843431A (en) 1994-07-20 1995-05-09 Controlling proliferation of cells before and after encapsulation in a bioartificial organ by gene transformation
PCT/US1995/009281 WO1996002646A2 (en) 1994-07-20 1995-07-20 Growth control for cells encapsulated within bioartificial organs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK7797A3 true SK7797A3 (en) 1997-08-06

Family

ID=26959885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK77-97A SK7797A3 (en) 1994-07-20 1995-07-20 A method of controlling cell distribution within bioartificial organ

Country Status (20)

Country Link
US (7) US5853717A (sk)
EP (1) EP0771350A1 (sk)
JP (3) JPH10506266A (sk)
CN (1) CN1152938A (sk)
AU (1) AU698624B2 (sk)
BR (1) BR9508312A (sk)
CA (1) CA2195446C (sk)
CZ (1) CZ16397A3 (sk)
EE (1) EE9700018A (sk)
FI (1) FI970217A (sk)
HU (1) HUT77875A (sk)
IL (1) IL114671A0 (sk)
IS (1) IS4417A (sk)
MX (1) MX9700527A (sk)
NO (1) NO970156L (sk)
NZ (1) NZ290629A (sk)
PL (1) PL318288A1 (sk)
SK (1) SK7797A3 (sk)
TR (1) TR199500882A2 (sk)
WO (1) WO1996002646A2 (sk)

Families Citing this family (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU720662B2 (en) * 1995-04-07 2000-06-08 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Recombinant B-cell and uses thereof
JP4031033B2 (ja) * 1995-05-04 2008-01-09 アメリカ合衆国 Ｔ細胞の改良トランスフェクション法
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US5837234A (en) * 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
US5855613A (en) 1995-10-13 1999-01-05 Islet Sheet Medical, Inc. Retrievable bioartificial implants having dimensions allowing rapid diffusion of oxygen and rapid biological response to physiological change
US6054142A (en) * 1996-08-01 2000-04-25 Cyto Therapeutics, Inc. Biocompatible devices with foam scaffolds
US6150164A (en) * 1996-09-30 2000-11-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions of a bioartificial kidney suitable for use in vivo or ex vivo
US20050033132A1 (en) 1997-03-04 2005-02-10 Shults Mark C. Analyte measuring device
DE69841937D1 (de) * 1997-04-21 2010-11-25 California Inst Of Techn Multifunctionelle polymer-beschichtung
US6117643A (en) 1997-11-25 2000-09-12 Ut Battelle, Llc Bioluminescent bioreporter integrated circuit
US6872387B1 (en) 1998-02-24 2005-03-29 The Regents Of The University Of Michigan Three-dimensional hydrogel/cell system
DE19811574A1 (de) 1998-03-17 1999-09-23 Siemens Ag Verfahren und Vorrichtung zum Überwachen der Funktionsfähigkeit eines Katalysators einer Brennkraftmaschine
US6378527B1 (en) * 1998-04-08 2002-04-30 Chondros, Inc. Cell-culture and polymer constructs
US6303136B1 (en) 1998-04-13 2001-10-16 Neurotech S.A. Cells or tissue attached to a non-degradable filamentous matrix encapsulated by a semi-permeable membrane
US6171610B1 (en) 1998-04-24 2001-01-09 University Of Massachusetts Guided development and support of hydrogel-cell compositions
US6027744A (en) * 1998-04-24 2000-02-22 University Of Massachusetts Medical Center Guided development and support of hydrogel-cell compositions
JP2002526109A (ja) * 1998-10-02 2002-08-20 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッドステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ ザ ナショナル インステ アポトーシス誘導物質と方法
US6197294B1 (en) * 1998-10-26 2001-03-06 Neurotech S.A. Cell surface molecule-induced macrophage activation
US6713293B1 (en) 1999-02-08 2004-03-30 Friedrich Grummt Encapsulated cells containing an amplified expression vector as a drug delivery device
US6903244B1 (en) 1999-02-26 2005-06-07 University Of Utah Research Foundation Mice which are +/− or −/− for the elastin gene as models for vascular disease
US6365385B1 (en) 1999-03-22 2002-04-02 Duke University Methods of culturing and encapsulating pancreatic islet cells
US6303355B1 (en) 1999-03-22 2001-10-16 Duke University Method of culturing, cryopreserving and encapsulating pancreatic islet cells
AU769571B2 (en) * 1999-04-28 2004-01-29 Universitat Zurich Polyionic coatings in analytic and sensor devices
EP1283904A2 (en) 1999-11-03 2003-02-19 Oncotech, Inc. Cancer diagnosis using cell-sorting and gene-expression-profiles
US7560275B2 (en) * 1999-12-30 2009-07-14 Vbi Technologies, L.L.C. Compositions and methods for generating skin
US7575921B2 (en) * 1999-12-30 2009-08-18 Vbi Technologies, L.L.C. Spore-like cells and uses thereof
CA2399434C (en) * 2000-02-11 2010-10-19 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Isolation and transplantation of retinal stem cells
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
US6719970B1 (en) * 2000-07-10 2004-04-13 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method of generating cartilage
US6905875B2 (en) * 2000-10-12 2005-06-14 National University Of Singapore Non-disruptive three-dimensional culture and harvest system for anchorage-dependent cells
WO2002057428A1 (en) * 2000-10-30 2002-07-25 University Of Massachusetts Isolation of spore-like cells from tissues exposed to extreme conditions
US6998234B2 (en) * 2000-11-03 2006-02-14 Oncotech, Inc. Methods for cancer prognosis and diagnosis relating to tumor vascular endothelial cells
US6538010B1 (en) * 2000-11-08 2003-03-25 Research Triangle Institute Compounds and methods for promoting smoking cessation
JP3603103B2 (ja) * 2000-11-15 2004-12-22 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 動物（但し、ヒトを除く。）の受精卵の共培養担体及びこの担体を用いる動物（但し、ヒトを除く。）の受精卵の培養方法
US20020142304A1 (en) * 2001-03-09 2002-10-03 Anderson Daniel G. Uses and methods of making microarrays of polymeric biomaterials
US8815793B2 (en) * 2001-07-20 2014-08-26 Northwestern University Polymeric compositions and related methods of use
US7858679B2 (en) * 2001-07-20 2010-12-28 Northwestern University Polymeric compositions and related methods of use
US7618937B2 (en) * 2001-07-20 2009-11-17 Northwestern University Peptidomimetic polymers for antifouling surfaces
EP1281767A3 (en) 2001-07-31 2003-05-28 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of tumors
AU2002325712C1 (en) * 2001-08-30 2008-07-31 Stem Cell Therapeutics Inc. Differentiation of neural stem cells and therapeutic use theeof
US7332330B2 (en) 2001-09-11 2008-02-19 Renamed Biologics, Inc. Device for maintaining vascularization near an implant
ES2383169T3 (es) * 2001-09-14 2012-06-18 Stem Cell Therapeutics Inc. Aumento del número de células madre neurales inducido por prolactina y uso terapéutico del mismo
AR036402A1 (es) * 2001-09-18 2004-09-08 Stem Cell Therapeutics Inc Efecto de la hormona de crecimiento y de igf-1 sobre celulas madre neuronales.
WO2003054171A1 (en) * 2001-12-06 2003-07-03 The Regents Of The University Of California Method for differentiating islet precursor cells into beta cells
US10022078B2 (en) 2004-07-13 2018-07-17 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7442546B2 (en) * 2002-03-15 2008-10-28 The Regents Of The University Of Michigan Method of modulating inflammatory response
AU2003228348A1 (en) * 2002-03-20 2003-10-08 John T. Fassett Induction of hepatocyte proliferation in vitro by inhibition of cell cycle inhibitors
GB2387599B (en) * 2002-04-17 2005-08-10 Jason Peter Brown Methods for producing antibodies
US8187326B2 (en) * 2002-05-22 2012-05-29 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc. Attachment of absorbable tissue scaffolds to fixation devices
EP1369491A1 (en) 2002-06-05 2003-12-10 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue
US20030228261A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-11 Aladar Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue
US20030228287A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-11 Regents Of The University Of California Maintenance of islet cells
US7299805B2 (en) 2002-06-07 2007-11-27 Marctec, Llc Scaffold and method for implanting cells
US8911831B2 (en) * 2002-07-19 2014-12-16 Northwestern University Surface independent, surface-modifying, multifunctional coatings and applications thereof
US20080171012A1 (en) * 2007-01-11 2008-07-17 Phillip Messersmith Fouling Resistant Coatings and Methods of Making Same
DE10234742A1 (de) * 2002-07-30 2004-02-19 Bionethos Holding Verfahren und Vorrichtung zum Züchten von Zellen
US7368115B2 (en) * 2002-07-31 2008-05-06 Stem Cell Therapeutics Inc. Method of enhancing neural stem cell proliferation, differentiation, and survival using pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)
US7744651B2 (en) * 2002-09-18 2010-06-29 Warsaw Orthopedic, Inc Compositions and methods for treating intervertebral discs with collagen-based materials
US20040054414A1 (en) * 2002-09-18 2004-03-18 Trieu Hai H. Collagen-based materials and methods for augmenting intervertebral discs
JP2006515765A (ja) * 2002-11-15 2006-06-08 エスディージーアイ・ホールディングス・インコーポレーテッド 滑膜性関節を治療するためのコラーゲンベース材料および方法
WO2004046337A2 (en) * 2002-11-19 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Multilayered microcultures
AU2002952993A0 (en) 2002-11-29 2002-12-12 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Therapeutic and diagnostic agents
US20040186471A1 (en) * 2002-12-07 2004-09-23 Sdgi Holdings, Inc. Method and apparatus for intervertebral disc expansion
JP2006516134A (ja) * 2002-12-24 2006-06-22 アン−ゴ−ゲン・インコーポレイテッド 封入化細胞療法
US20060240058A1 (en) * 2003-04-16 2006-10-26 Galis Zorina S Combinatorial surface chip compositions for selection, differentiation and propagation of cells
ATE545699T1 (de) 2003-06-18 2012-03-15 Genelux Corp Modifizierte, rekombinante vacciniaviren und deren verwendungen
US20070173710A1 (en) * 2005-04-08 2007-07-26 Petisce James R Membranes for an analyte sensor
US7651596B2 (en) 2005-04-08 2010-01-26 Dexcom, Inc. Cellulosic-based interference domain for an analyte sensor
US9135402B2 (en) 2007-12-17 2015-09-15 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US7591801B2 (en) 2004-02-26 2009-09-22 Dexcom, Inc. Integrated delivery device for continuous glucose sensor
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
WO2005020677A1 (en) 2003-08-29 2005-03-10 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Method of selecting animal models from animals which have been subject to mutagenesis, and the use of myb transcription factors for screening
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
NZ547767A (en) 2003-12-24 2010-05-28 Inst Medical W & E Hall Therapeutic agents and uses therefor
WO2005077404A1 (en) 2004-02-13 2005-08-25 Stem Cell Therapeutics Corp. Use of luteinizing hormone (lh) and chorionic gonadotropin (hcg) for proliferation of neural stem cells and neurogenesis
US8808228B2 (en) 2004-02-26 2014-08-19 Dexcom, Inc. Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor
US20050202096A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-15 Jun Li Microcapsules for encapsulation of bioactive substances
WO2005099758A2 (en) * 2004-04-17 2005-10-27 The Board Of Trustees The Leland Standford Junior University Injectable bioartificial tissue matrix
WO2005108981A1 (en) 2004-05-12 2005-11-17 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research A method of cell isolation
US7310544B2 (en) 2004-07-13 2007-12-18 Dexcom, Inc. Methods and systems for inserting a transcutaneous analyte sensor
JP2008520783A (ja) * 2004-11-16 2008-06-19 ユニベルシテ・ド・リエージュ ヒドロゲルマトリックスおよびマイクロキャリアを含む活性物質供給システム
US8133178B2 (en) 2006-02-22 2012-03-13 Dexcom, Inc. Analyte sensor
AU2006228873B2 (en) * 2005-04-01 2011-08-18 Nsgene A/S A human immortalised neural precursor cell line
US8744546B2 (en) 2005-05-05 2014-06-03 Dexcom, Inc. Cellulosic-based resistance domain for an analyte sensor
WO2006121661A2 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Dexcom, Inc. Cellulosic-based resistance domain for an analyte sensor
EP1883446B8 (en) * 2005-05-17 2017-11-15 Gloria Therapeutics Sarl An implantable therapy system for treating a living being with an active factor
JP5777846B2 (ja) * 2005-06-15 2015-09-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アミン含有脂質およびその使用
DK1910535T3 (en) 2005-06-24 2016-09-26 The Walter And Eliza Hall Inst Of Medical Res Therapeutic pro-apoptotic BH-3-like molecules and method of forming and / or selecting the same
AU2006297041A1 (en) 2005-09-27 2007-04-05 Stem Cell Therapeutics Corp. Oligodendrocyte precursor cell proliferation regulated by prolactin
US9388382B2 (en) * 2005-10-05 2016-07-12 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Isolation of CD14 negative, CD45 positive and CD117 positive embryonic-like stem cells free of monocytes from human umbilical cord blood mononuclear cells
US7732539B2 (en) * 2006-02-16 2010-06-08 National Science Foundation Modified acrylic block copolymers for hydrogels and pressure sensitive wet adhesives
WO2007106986A1 (en) * 2006-03-17 2007-09-27 Stem Cell Therapeutics Corp. Dosing regimes for lh or hcg and epo for treatment of neurological disorders
US20080004431A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Warsaw Orthopedic Inc Method of manufacturing an injectable collagen material
US20080004703A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Warsaw Orthopedic, Inc. Method of treating a patient using a collagen material
US8399619B2 (en) * 2006-06-30 2013-03-19 Warsaw Orthopedic, Inc. Injectable collagen material
US8118779B2 (en) * 2006-06-30 2012-02-21 Warsaw Orthopedic, Inc. Collagen delivery device
WO2008011006A2 (en) 2006-07-18 2008-01-24 University Of Utah Research Foundation Methods for treating pain and screening analgesic compounds
US8563117B2 (en) * 2006-08-04 2013-10-22 Phillip B. Messersmith Biomimetic modular adhesive complex: materials, methods and applications therefore
JP5597836B2 (ja) 2006-08-04 2014-10-01 ケンジー ナッシュ コーポレイション バイオミメティック化合物およびその合成方法
KR100770440B1 (ko) * 2006-08-29 2007-10-26 삼성전기주식회사 질화물 반도체 발광소자
EP1895012A1 (en) 2006-08-30 2008-03-05 Universitätsklinikum Freiburg Method for inducing tumor apoptosis by increasing nitric oxide levels
US8835163B2 (en) * 2006-10-18 2014-09-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
US8673286B2 (en) 2007-04-09 2014-03-18 Northwestern University DOPA-functionalized, branched, poly(aklylene oxide) adhesives
US8383092B2 (en) * 2007-02-16 2013-02-26 Knc Ner Acquisition Sub, Inc. Bioadhesive constructs
AU2008262331B2 (en) 2007-06-07 2013-10-17 Wake Forest University Health Sciences Inkjet gene printing
WO2008154312A1 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Dexcom, Inc. Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor
CN101855337B (zh) * 2007-06-29 2017-10-31 船木真理 用于进行干细胞调节的软凝胶系统
EP4098177A1 (en) 2007-10-09 2022-12-07 DexCom, Inc. Integrated insulin delivery system with continuous glucose sensor
US8417312B2 (en) 2007-10-25 2013-04-09 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US8290559B2 (en) 2007-12-17 2012-10-16 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US8229535B2 (en) 2008-02-21 2012-07-24 Dexcom, Inc. Systems and methods for blood glucose monitoring and alert delivery
US8691569B2 (en) * 2008-03-17 2014-04-08 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US8828720B2 (en) * 2008-03-17 2014-09-09 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US8716018B2 (en) 2008-03-17 2014-05-06 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US9458431B2 (en) 2008-03-17 2016-10-04 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US20110143433A1 (en) * 2008-03-17 2011-06-16 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for Stem Cell Culture
WO2009125332A1 (en) * 2008-04-07 2009-10-15 Peter Bromley New and safe procedure for immunization against infectious diseases agents
US8969353B2 (en) 2008-11-07 2015-03-03 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
US20100125265A1 (en) * 2008-11-20 2010-05-20 Medtronic Vascular, Inc. Cell Delivery System to Induce Cell Growth and Angiogenesis
WO2010083841A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Nsgene A/S Improved cell lines and their use in encapsulated cell biodelivery
WO2010107392A1 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Agency For Science, Technology And Research Culture of pluripotent and multipotent cells on microcarriers
DK3290061T3 (da) 2009-08-28 2020-07-13 Sernova Corp Fremgangsmåder og anordninger til cellulær transplantation
CN102573860A (zh) 2009-10-02 2012-07-11 巴克斯特国际公司 用于治疗肾脏损伤的造血干细胞
CN104726394B (zh) 2009-11-12 2018-12-18 VCell治疗股份有限公司 类孢子细胞子群及其用途
US20110130465A1 (en) * 2009-12-01 2011-06-02 Nerites Corporation Coatings for prevention of biofilms
EP3403647A1 (en) 2009-12-01 2018-11-21 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP2609135A4 (en) 2010-08-26 2015-05-20 Massachusetts Inst Technology POLY (BETA-AMINO ALCOHOLS), THEIR PREPARATION AND USES THEREOF
EP2625577B1 (en) 2010-10-08 2019-06-26 Terumo BCT, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
CA2817215C (en) 2010-11-09 2017-05-09 Knc Ner Acquisition Sub, Inc. Adhesive compounds for use in hernia repair
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
CA2821515A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-ngf compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
WO2012075184A2 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Neurotech Usa, Inc. Cell lines that secrete anti-angiogenic antibody-scaffolds and soluble receptors and uses thereof
US9238716B2 (en) 2011-03-28 2016-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
RU2013154295A (ru) 2011-06-08 2015-07-20 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. КОМПОЗИЦИИ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ мРНК
CN102350008A (zh) 2011-10-25 2012-02-15 微创医疗器械(上海)有限公司 一种处理动物源性胶原纤维材料的方法
KR20140144680A (ko) 2012-02-17 2014-12-19 더 셰펜스 아이 리써치 인스티튜트 인간의 망막 전구세포의 표현형 프로필
JP2015508101A (ja) 2012-02-21 2015-03-16 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ Ｃｄ３４＋細胞を含む薬学的組成物
WO2013181424A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Neurotech Usa, Inc. Cryopreserved implantable cell culture devices and uses thereof
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
EP2882706A1 (en) 2012-08-13 2015-06-17 Massachusetts Institute of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
WO2014130770A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Cellular Dynamics International, Inc. Hepatocyte production via forward programming by combined genetic and chemical engineering
ES2708561T3 (es) 2013-03-14 2019-04-10 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
LT2968586T (lt) 2013-03-14 2018-11-26 Translate Bio, Inc. Cft mrnr kompozicijos bei su jomis susiję būdai ir panaudojimai
US10081609B2 (en) 2013-03-15 2018-09-25 The Broad Institute, Inc. Compounds for inducing proliferation and differentiation of cells, and methods of use thereof
US9888680B2 (en) 2013-04-04 2018-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Functional recovery of human lungs for transplantation
US9315472B2 (en) 2013-05-01 2016-04-19 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
US11229789B2 (en) 2013-05-30 2022-01-25 Neurostim Oab, Inc. Neuro activator with controller
EP3441109A1 (en) 2013-05-30 2019-02-13 Graham H. Creasey Flexible dermal patch for a topical nerve stimulator system
AU2014273883B9 (en) 2013-05-31 2020-06-18 University Of Utah Research Foundation Conotoxin peptides, pharmaceutical compositions and uses thereof
US20150044259A1 (en) * 2013-08-08 2015-02-12 Mauris N. DeSilva Scaffold for enhanced neural tissue regeneration
CA2922483A1 (en) 2013-09-11 2015-03-19 Neurotech Usa, Inc. Encapsulated cell therapy cartridge
CN112618732A (zh) 2013-10-22 2021-04-09 夏尔人类遗传性治疗公司 用于递送信使rna的脂质制剂
CA2928186A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
EA201690590A1 (ru) 2013-10-22 2016-12-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. ТЕРАПИЯ НЕДОСТАТОЧНОСТИ АРГИНИНОСУКЦИНАТ-СИНТЕТАЗЫ С ПОМОЩЬЮ мРНК
US10633625B2 (en) 2013-11-16 2020-04-28 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
EP3122866B1 (en) 2014-03-25 2019-11-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
US20170107486A1 (en) 2014-04-21 2017-04-20 Cellular Dynamics International, Inc. Hepatocyte production via forward programming by combined genetic and chemical engineering
CN117402871A (zh) 2014-04-25 2024-01-16 川斯勒佰尔公司 信使rna的纯化方法
WO2015184256A2 (en) 2014-05-30 2015-12-03 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
CN111588695A (zh) 2014-06-24 2020-08-28 川斯勒佰尔公司 用于递送核酸的立体化学富集组合物
WO2016004202A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
WO2016049421A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Terumo Bct, Inc. Scheduled feed
US11077301B2 (en) 2015-02-21 2021-08-03 NeurostimOAB, Inc. Topical nerve stimulator and sensor for bladder control
US10456356B2 (en) 2015-05-27 2019-10-29 Neurotech Usa, Inc. Use of encapsulated cell therapy for treatment of ophthalmic disorders
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
ES2893750T3 (es) * 2015-09-25 2022-02-10 Maxivax Sa Vacuna que comprende células inmunoaisladas que producen un inmunomodulador
EP3365429B1 (en) 2015-10-19 2020-03-11 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Production of virus-receptive pluripotent stem cell (psc)-derived hepatocytes
WO2017070738A1 (en) 2015-10-27 2017-05-04 The University Of Queensland A method of treatment and agents useful for same
JP6694512B2 (ja) 2015-12-30 2020-05-13 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド 幹細胞由来ヒト肝細胞を使用した微小組織形成
WO2017205667A1 (en) 2016-05-25 2017-11-30 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
CN106497877A (zh) * 2016-11-01 2017-03-15 南方医科大学 一种促进骨髓间充质干细胞向神经诱导分化的基质材料
WO2018157154A2 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized cftr mrna
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
EP3601521A2 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Terumo BCT, Inc. Cell expansion
MA49138A (fr) 2017-05-16 2020-03-25 Translate Bio Inc Traitement de la fibrose kystique par administration d'arnm à codons optimisés codant pour la cftr
US11331022B2 (en) 2017-10-24 2022-05-17 Dexcom, Inc. Pre-connected analyte sensors
JP2021500162A (ja) 2017-10-24 2021-01-07 デックスコム・インコーポレーテッド 事前接続された分析物センサ
CA3082390C (en) 2017-11-07 2023-01-31 Neurostim Oab, Inc. Non-invasive nerve activator with adaptive circuit
KR20210060480A (ko) 2018-08-24 2021-05-26 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 전령 rna의 정제 방법
CN113748200A (zh) * 2019-04-03 2021-12-03 赛康特集团有限责任公司 用于纺织品和纤维的人细胞沉积的细胞外基质涂层
AU2020268199A1 (en) 2019-05-09 2021-11-18 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of hepatocytes
WO2020264214A1 (en) 2019-06-26 2020-12-30 Neurostim Technologies Llc Non-invasive nerve activator with adaptive circuit
EP4017580A4 (en) 2019-12-16 2023-09-06 Neurostim Technologies LLC NON-INVASIVE NERVE ACTIVATOR WITH AMPLIFIED CHARGE DISTRIBUTION
US20230383261A1 (en) 2020-10-14 2023-11-30 Sana Biotechnology, Inc. Hepatocyte-like cells
GB2619893A (en) 2021-03-23 2023-12-20 Terumo Bct Inc Cell capture and expansion
KR20240005887A (ko) 2021-05-07 2024-01-12 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 성숙한 간세포를 발생시키는 방법

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4391909A (en) * 1979-03-28 1983-07-05 Damon Corporation Microcapsules containing viable tissue cells
US4495288A (en) * 1981-03-13 1985-01-22 Damon Biotech, Inc. Method of culturing anchorage dependent cells
US4402694A (en) * 1981-07-16 1983-09-06 Biotek, Inc. Body cavity access device containing a hormone source
US4485096A (en) * 1982-02-26 1984-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Tissue-equivalent and method for preparation thereof
US4479796A (en) 1982-11-15 1984-10-30 Medtronic, Inc. Self-regenerating drug administration device
US4489796A (en) * 1983-05-25 1984-12-25 Gte Laboratories Incorporated Insert for a mine tool roof bit and a method of drilling therewith
IL75554A (en) * 1985-06-18 1993-01-14 Yeda Res & Dev Matrix for cell cultivation in vitro
US4829000A (en) * 1985-08-30 1989-05-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reconstituted basement membrane complex with biological activity
US5049493A (en) * 1987-10-23 1991-09-17 California Institute Of Technology Enhancement of cell growth by expression of a cloned hemoglobin gene
US5283187A (en) * 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5158881A (en) * 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5156844A (en) * 1987-11-17 1992-10-20 Brown University Research Foundation Neurological therapy system
US5106627A (en) * 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5182111A (en) * 1987-11-17 1993-01-26 Boston University Research Foundation In vivo delivery of active factors by co-cultured cell implants
WO1993000127A1 (en) * 1991-06-28 1993-01-07 Brown University Research Foundation Neural implant system
US5270191A (en) * 1988-04-12 1993-12-14 Massachusetts Institute Of Technology Method for manipulation of the cell types of eukaryotes
DE68907220T2 (de) * 1988-04-12 1994-01-27 Massachusetts Inst Technology Verfahren zur manipulation des zelltyps von eukaryonten.
US5250414A (en) * 1988-11-04 1993-10-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Diagnostic methods using neurite growth regulatory factors
US5082670A (en) * 1988-12-15 1992-01-21 The Regents Of The University Of California Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system
US5538722A (en) * 1989-06-13 1996-07-23 Stanford University Isolation, growth, differentiation and genetic engineering of human muscle cells
JP3244696B2 (ja) * 1989-06-13 2002-01-07 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー ヒト筋肉細胞の単離、増殖および分化
WO1991000119A1 (en) * 1989-06-30 1991-01-10 Baxter International Inc. Implantable device
US5053332A (en) * 1989-07-24 1991-10-01 Cook Richard B Agarose beads, preferably incorporating biological materials
US5354736A (en) * 1989-08-14 1994-10-11 Regents Of The University Of California Synthetic compounds and compositions with enhanced cell binding
US5002661A (en) * 1989-08-25 1991-03-26 W. R. Grace & Co.-Conn. Artificial pancreatic perfusion device
GB8928884D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Feldmann Marc Transformed cell lines
GB9003791D0 (en) * 1990-02-20 1990-04-18 Ludwig Inst Cancer Res Transgenic animals,cell lines therefrom,and their use
US5101319A (en) * 1990-04-03 1992-03-31 Vistatech Corporation Pre-engineered electrode/dielectric composite film and related manufacturing process for multilayer ceramic chip capacitors
DE4123629A1 (de) * 1990-08-06 1992-02-20 Jakob Dr Bodziony Ein implantierbares und biologisch aktive substanzen sezernierendes bio-artifizielles organ, das auf dem prinzip des druckgradients funktioniert
CA2089582A1 (en) * 1990-08-15 1992-02-16 Richard P. Bunge Autotransplantation of schwann cells to promote nervous system repair
WO1992019195A1 (en) * 1991-04-25 1992-11-12 Brown University Research Foundation Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products
JPH07500260A (ja) * 1991-06-28 1995-01-12 ブラウン　ユニバーシティ　リサーチ　ファウンデーション 補充可能な神経移植装置および方法
WO1993001275A1 (en) * 1991-07-08 1993-01-21 Neurospheres Ltd. NOVEL GROWTH FACTOR-RESPONSIVE PROGENITOR CELLS WHICH CAN BE PROLIFERATED $i(IN VITRO)
AU2502592A (en) * 1991-08-23 1993-03-16 Denise Faustman Implantable immunoisolated therapeutic devices
CA2128630A1 (en) * 1992-01-23 1993-08-05 Bruce D. Cherksey A method for transplanting cells into the brain and therapeutic uses therefor
CA2134088A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Robert S. Ward Method of culturing viable cells and method of regulating the level of a compound in a body fluid
AU4114993A (en) * 1992-04-24 1993-11-29 Polymer Technology Group, Inc., The Biocompatible, therapeutic, implantable device
WO1993023431A1 (en) * 1992-05-14 1993-11-25 Baylor College Of Medicine Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy
WO1994001129A1 (en) * 1992-07-02 1994-01-20 The Salk Institute For Biological Studies Use of myoblasts for sustained delivery of gene products
WO1994003199A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of enhancing differentiation and survival of neuronal precursor cells
US5489743A (en) * 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
WO1994029442A2 (en) * 1993-06-14 1994-12-22 Basf Aktiengesellschaft Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
DE69430824T2 (de) * 1993-08-12 2003-01-23 Neurotech S.A., Evry Biokompatible immunoisolatorische Kapseln, die genetisch veränderte Zellen enthalten
US5453368A (en) * 1993-08-27 1995-09-26 Brown University Research Foundation Method of encapsulating biological substances in microspheres
US5550050A (en) * 1994-04-15 1996-08-27 Cytotherapeutics, Inc. Method for implanting encapsulated cells in a host

Also Published As

Publication number Publication date
NZ290629A (en) 1998-10-28
FI970217A0 (fi) 1997-01-17
EE9700018A (et) 1997-06-16
US5858747A (en) 1999-01-12
EP0771350A1 (en) 1997-05-07
AU698624B2 (en) 1998-11-05
BR9508312A (pt) 1999-06-01
JP2005224614A (ja) 2005-08-25
WO1996002646A2 (en) 1996-02-01
CN1152938A (zh) 1997-06-25
CA2195446C (en) 2010-05-25
CA2195446A1 (en) 1996-02-01
HUT77875A (hu) 1998-09-28
NO970156L (no) 1997-03-20
JPH10506266A (ja) 1998-06-23
US5840576A (en) 1998-11-24
PL318288A1 (en) 1997-06-09
FI970217A (fi) 1997-01-17
US5853717A (en) 1998-12-29
TR199500882A2 (tr) 1996-06-21
AU3142295A (en) 1996-02-16
WO1996002646A3 (en) 1996-05-17
US5776747A (en) 1998-07-07
CZ16397A3 (cs) 1998-03-18
IL114671A0 (en) 1995-11-27
JP2006198414A (ja) 2006-08-03
NO970156D0 (no) 1997-01-14
IS4417A (is) 1997-01-17
MX9700527A (es) 1997-04-30
US5795790A (en) 1998-08-18
US5833979A (en) 1998-11-10
US6392118B1 (en) 2002-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6392118B1 (en) Mx-1 conditionally immortalized cells
US5843431A (en) Controlling proliferation of cells before and after encapsulation in a bioartificial organ by gene transformation
Hurtado et al. Poly (D, L-lactic acid) macroporous guidance scaffolds seeded with Schwann cells genetically modified to secrete a bi-functional neurotrophin implanted in the completely transected adult rat thoracic spinal cord
US6231879B1 (en) Biocompatible devices with foam scaffolds
Loh et al. The regrowth of axons within tissue defects in the CNS is promoted by implanted hydrogel matrices that contain BDNF and CNTF producing fibroblasts
Mosahebi et al. A novel use of alginate hydrogel as Schwann cell matrix
AU697600B2 (en) Method for implanting encapsulated cells in a host
Woerly et al. Neural tissue engineering: from polymer to biohybrid organs
US20060153815A1 (en) Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue
US6495364B2 (en) Mx-1 conditionally immortalized cells
KR20110106302A (ko) 암 치료를 위한 세포외 기질 조성물
Plant et al. Implantation of collagen IV/poly (2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels containing Schwann cells into the lesioned rat optic tract
CA1307221C (en) Brain-derived growth factor
AU708186B2 (en) Growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
WO1991001760A1 (en) Human tumor cells implanted in non-human animals
Li et al. Encapsulation matrices for neurotrophic factor-secreting myoblast cells
Fang et al. Survival and differentiation of neuroepithelial stem cells on chitosan bicomponent fibers
WO2000006204A2 (en) Genetically engineered cells and tissues