CN113748200A - 用于纺织品和纤维的人细胞沉积的细胞外基质涂层 - Google Patents

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Abstract

一种形成涂覆的纺织品的方法，包括在纺织品的纤维上培养人细胞，使得人细胞在纺织品上产生并沉积人细胞外基质(hECM)。该方法还包括从hECM中去除人细胞，以提供纺织品和涂层的涂覆的纺织品，所述涂层包含在培养过程中由人细胞在纺织品上产生并沉积的hECM的残余物。涂覆的纺织品包括纺织品和纺织品上的涂层。涂层包括在涂层中的处于细胞沉积状态的hECM。一种固态生物反应器组合物，包括聚癸二酸甘油酯(PGS)加合物。PGS加合物包括PGS和促进因子或促进因子前体。另一种方法包括将涂覆的纺织品植入人体。该涂覆的纺织品是自体移植物。该涂层包括由来自人体的人细胞沉积的hECM。

Description

用于纺织品和纤维的人细胞沉积的细胞外基质涂层
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年4月3日提交的美国临时专利申请No.62/828,604的优先权和权益，其通过整体引用并入本文。
技术领域
本公开一般涉及生物医学材料的生物相容性。更具体地，本公开涉及使用原代人细胞或细胞系产生人细胞外基质(hECM)涂覆的编织的、编结的、非编织的或针织生物医学纺织品或纤维，其用作或用于可植入医疗装置、部件或体内支架、用于体外细胞扩增或干细胞分化的生物反应器支架、或用于常规细胞培养应用的基底。
背景技术
由于缺乏帮助身体将植入物识别为与人体相容的人体特异性信号部分(human-specific signaling moieties)，许多可植入设备产生炎症反应。升高免疫系统反应的发生率的增加降低植入物的性能和寿命，同时由于植入部位局部微环境的长期炎症而减缓了患者的愈合。
由某些细胞产生的细胞外基质(ECM)在体内为周围细胞提供结构支撑和生化支撑。生物医学装置中使用的ECM通常来自去细胞化的组织，其中ECM组分随后被粉碎并用作粉末或形成为各向同性水凝胶材料以应用于生物医学产品。虽然该过程存在提供天然粘附线索和细胞因子的ECM组分，但它与天然底层ECM结构不匹配，因此提供对炎症反应不太理想的预防。
为了改善细胞结合，异种ECM成分，例如牛源性胶原蛋白，经常被用作用于细胞培养或植入的产品中的结构材料或涂层材料。然而，异种材料也引发对植入装置的免疫反应。当这样的组分通过产品，例如由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物(由Corning Life Sciences(Tewksbury，MA)和BD Biosciences(San Jose，CA)以商品名Matrigel销售)用作体外组织培养基底时，由于产品开发周期两端的物种不匹配，在台式体外研究和临床应用之间经常存在脱节。这可以导致临床试验结果不佳和产品开发周期失败。
为了与天然组织结构和先天信号线索相匹配，一些医疗装置通过ECM的去细胞化而产生，该ECM可能在结构上弱并且在外科医生操作过程中失效。这些去细胞化装置通常依赖于供体组织或尸体组织的使用，这两种组织的供应量都非常有限。
2010年9月14日授权于Hiles的题为“Extracellular matrix compositematerials,and manufacture and use thereof”的美国专利No.7,795,027公开了使用各种类型的人细胞在可植入装置上分泌人ECM。Hiles使用一种方法，其中首先将可植入装置涂覆异种ECM，然后在所述异种ECM上培养人细胞，随后在分泌人ECM顶层后将人细胞去除。然而，底层的异种材料仍然可能引起炎症反应。
需要一种可植入装置，该装置被涂覆以减少或消除来自人宿主的炎症反应。
发明内容
示例性实施方案涉及用处于细胞沉积状态的人细胞外基质材料涂覆的纺织品以及形成和使用这样的涂覆的纺织品的方法。
根据一个示例性实施方案，形成涂覆的纺织品的方法包括在纺织品的至少一个纤维上培养人细胞，使得人细胞在纺织品上产生并沉积人细胞外基质(hECM)。该方法还包括从hECM中去除人细胞，以提供纺织品和涂层的涂覆的纺织品，所述涂层包括在培养过程中由人细胞在纺织品上产生并沉积的hECM的残余物。
根据另一个示例性实施方案，涂覆的纺织品包括纺织品和纺织品上的涂层。该涂层包括hECM。hECM在涂层中处于细胞沉积状态。
根据又一个示例性实施方案，固态生物反应器组合物包括聚癸二酸甘油酯加合物。聚癸二酸甘油酯加合物包括聚癸二酸甘油酯和促进因子或促进因子前体。
根据另一个示例性实施方案，一种方法包括将涂覆的纺织品植入人体。该涂覆的纺织品是包括纺织品和纺织品上的涂层的自体移植物。该涂层包括由来自人体的人细胞沉积的处于细胞沉积状态的人细胞外基质(hECM)。
从以下结合附图的更详细的描述中，本发明的各种特征和优点将变得显而易见，附图以示例的方式示出了本发明的原理。
附图说明
图1示意性地示出了克雷布斯循环的L-肉碱路线(shuttle)。
图2示出了未涂覆的纺织品。
图3示出了在本公开的一个实施方案中具有包括人细胞外基质材料的涂层的图2的纺织品。
图4示出了图2的未涂覆的纺织品、图3的涂覆的纺织品、和具有冻干细胞的纺织品的FTIR光谱。
图5示出了图4的光谱的900至1100cm-1波数区域。
图6示出了图4的光谱的1500至1800cm-1波数区域。
图7示出了图4的光谱的2700至3000cm-1波数区域。
图8示出了在纤维上细胞培养的不同阶段期间的细胞计数。
图9示出了图8的细胞培养物的细胞计数比。
图10示出了心脏成纤维细胞在ECM涂覆的纺织品上的铺展。
在任何可能的情况下，在所有附图中将使用相同的附图标记表示相同的部件。
具体实施方式
本文提供了组合物和形成组合物的方法，所述组合物包括在基底上的处于细胞沉积状态的人细胞外基质(hECM)组分的涂层。
在示例性实施方案中，基于人ECM产生细胞通过细胞培养的沉积，hECM组分处于细胞沉积状态。涂层的基底可以是任何合适的纺织品或纤维材料。通过细胞培养涂覆hECM可以在原纱或纤维或成品纺织品上进行。
合适的纺织品可以包括可适用于可植入的非可吸收纺织品以及各种可吸收材料的结构的任何纺织品材料，所述非可吸收纺织品包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚烯烃(例如聚丙烯、聚乙烯)、或聚乙烯醋酸乙烯酯、或胶原蛋白，所述可吸收材料包括但不限于聚乙醇酸(PGA)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)或聚己内酯(PCL)，所述可吸收材料可以与例如更持久的材料如PET和PTFE交织。
人细胞可以是产生和沉积细胞外基质的任何合适的人细胞。在一些实施方案中，人细胞是人成纤维细胞、平滑肌细胞、骨细胞、心肌细胞或软骨细胞。在一个优选的实施方案中，人细胞来自其中待植入纺织品的同一个体，从而产生自识别的ECM并赋予纺织品自体移植样特征。在其他实施方案中，细胞不是患者特异性的。在这样的实施方案中，人细胞可以来自与其中待植入纺织品的人不同的人，从而赋予纺织品同种异体移植样特性。在优选的实施方案中，涂层不含异种材料。
hECM材料可以是任何合适的hECM材料，包括但不限于蛋白聚糖，例如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素或硫酸角质素；非蛋白聚糖多糖，例如透明质酸；蛋白质，例如胶原蛋白或弹性蛋白；细胞粘附蛋白，例如纤连蛋白或层粘连蛋白；或其组合。
如本文所用，“细胞沉积状态”是指由细胞沉积产生的细胞外物质的结构和形态。
如本文所用，“掺杂(doped)”或“掺杂(doping)”是指促进因子添加到处理或过程中。
如本文所用，“封装”是指通过PGS微球工艺的递送结构的球形化。在一些实施方案中，PGS微球通过于2018年10月4日公开的Lu等人的题为“Cured BiodegradableMicroparticles and Scaffolds and Methods of Making and Using the Same”的美国专利申请公开No.2018/0280912中公开的方法形成，其通过整体引用并入本文。
如本文所用，“经处理的表面”是指用ECM涂层处理过并在可植入制品上提及或标识的任何表面。
如本文所用，“挤出物”是指通过具有或不具有头部的模具或其他合适的孔口通过力挤出或成形的任何材料或制品。
如本文所用，“异种”是指不是由植入物的目标物种的细胞形成的任何材料，例如对于人类患者，为非人类。
如本文所用，“同种异体移植物”是指由目标物种但不是植入物的目标个体的细胞形成的任何材料。
如本文所用，“自体移植物”是指由植入物的目标个体的细胞形成的任何材料。
在一些实施方案中，通过在沉积物种匹配的细胞外基质(ECM)的生物医学纺织品和纤维的表面上培养人细胞来提供人信号因子，这促进将植入物识别为“人的”以减少炎性反应并加速愈合。在一些实施方案中，这些人信号因子被分泌的细胞外基质捕获。在一些实施方案中，沉积的ECM可包括蛋白质组分，其可包括但不限于胶原蛋白或纤维蛋白。在一些实施方案中，沉积的ECM可包括糖胺聚糖，其可包括但不限于透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角蛋白或肝素。在一些实施方案中，沉积的ECM可含有生长因子，其可包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、白细胞介素(例如但不限于IL-2、IL-4和IL-5)或血小板衍生生长因子(PDGF)。
在一些实施方案中，将人ECM组分添加到纺织品表面降低或消除了用异种材料观察到的物种不匹配的潜在问题。
随着人细胞在纺织品和纤维上沉积ECM，产生了存在于天然人体组织中的ECM表面部分的良好类似物，其为沉积的ECM提供了改善的结构完整性，而不需要来自患者或尸体来源的供体组织。在一些实施方案中，从患者中获取细胞以制成ECM涂覆的纺织品或纤维的自体移植样版本。类似地，来自其他来源的原代人细胞或细胞系可用于产生现成的ECM涂覆的产品，用于同种异体移植样支架在其中有效的应用。
在一些实施方案中，直接在未修饰的纺织品或纤维上培养人ECM分泌细胞，使得不存在异种预涂层或任何其他异种组分和/或涂覆的纺织品或纤维不含异种材料。在示例性实施方案中，存在于涂覆的纺织品或纤维之中或之上的唯一生物材料是人细胞或人ECM分泌细胞的产物。换句话说，涂覆的纺织品或纤维不含非来源于人细胞或人ECM分泌细胞的生物材料。
在世界许多地方，存在文化和/或宗教障碍，阻止使用包含异种材料甚至同种异体材料的可植入设备。除了仅包括自体移植材料的先天非免疫原性优点之外，示例性实施方案还克服了这些文化和/或宗教障碍。在一些实施方案中，自体移植物可以被认为提供自治疗。
在一些实施方案中，在人细胞接种之前，通过表面改性(例如等离子体处理、酸/碱处理或机械变形)对底层纺织品或纤维进行预处理，以促进改善的细胞附着和ECM分泌。
在一些实施方案中，在用细胞接种之前，将非异种可吸收涂层如PGS施加到纺织品或纤维的表面，以改善细胞外基质分泌。非异种可吸收涂层用作底涂层，以更好地使细胞培养表面相容并接受hECM涂层。当非异种可吸收涂层包括PGS时，PGS可以向细胞培养物的细胞提供营养，并且还可以上调与人ECM分泌细胞产生和分泌一种或多种hECM分子相关的一种或多种基因。
在一些实施方案中，通过呈现与人ECM相关联的帮助身体识别“自我”的先天生物化学线索和结构线索来增强用作可植入装置和细胞培养技术中的部件的纺织品和纤维表面的生物界面，从而改善生物医学纺织品和生物医学纤维的生物性能并减少对这些材料的炎性反应。
在一些实施方案中，一种方法包括从患者提取成纤维细胞或其他hECM产生细胞，并在体外在纺织品或纤维结构上培养这些细胞。提取优选包括从其他细胞和任何细胞外或其他组织材料中分离和纯化hECM产生细胞，使得施加到纺织品或纤维上的不是细胞组织。相反，hECM产生细胞可以是暴露于纺织品或纤维的唯一细胞材料。随后的培养优选是细胞培养，而不是在纺织品或纤维上的组织培养。在一些实施方案中，细胞培养物包含在波混合生物反应器袋式系统中。一旦经过足够的时间使成纤维细胞ECM沉积以涂覆和/或覆盖纺织品或纤维表面，该方法包括移除成纤维细胞以产生具有患者特异性ECM涂层的去细胞化的纺织品或纤维表面，从而改善植入后的细胞整合。在一些实施方案中，去细胞化的涂覆的纺织品或纤维不含细胞。
在一些实施方案中，一种方法利用来自患者的干细胞来源的细胞在纺织品或纤维上进行ECM沉积。
在一些实施方案中，一种方法利用混合的人细胞群在纺织品或纤维上进行ECM沉积。
在一些实施方案中，一种方法利用对目标植入位点具有特异性的成纤维细胞，例如用于皮肤护理应用的真皮成纤维细胞或用于心血管移植物和补片的心脏成纤维细胞。
在一些实施方案中，一种方法利用非患者特异性的人细胞，用于在人细胞沉积ECM和随后的细胞移除之后产生现成的hECM增强的纺织品或纤维产品。
在一些实施方案中，一种方法包括将患者自身的细胞留在先前植入并随后移除的纺织品或纤维上以作为组织工程产品再植入。在一些实施方案中，纺织品或纤维在遗传修饰或分化后被再植入。在一些实施方案中，一种方法包括通过内皮细胞的二次培养进一步处理具有细胞沉积的ECM的纺织品或纤维的hECM增强的表面，以在植入或再植入之前预血管化纺织品或纤维。
在一些实施方案中，一种方法在植入之前、细胞移除之后，将其他细胞信号因子，例如生长因子或细胞捕获剂如肝素，掺入到hECM增强的纺织品或纤维表面。
在一些实施方案中，一种方法包括在成纤维细胞培养基中用一种或多种ECM产生加速因子如抗坏血酸(维生素C)处理用纺织品或纤维培养的细胞。
在一些实施方案中，该方法不包括或不需要形成初步的异种ECM涂层或同种异体ECM涂层，并且最终产品的用途在应用于单独的纺织品组分或纤维组分、作为装置的可植入纺织品或纤维或在体外培养支架方面是灵活的。此外，根据细胞来源，涂覆的纺织品或纤维可用于自体移植样或同种异体移植样模式。涂覆的纺织品或纤维表面呈现的高表面积更好地促进了身体对纺织品或纤维的“类人”识别。
在一些实施方案中，一种方法通过由人细胞在纺织品或纤维表面上沉积的hECM来匹配生物结构取向，这提供可容易地添加到其他医疗装置的复合结构，作为次级组分以增强组织整合或作为容易手术处理的可植入装置，例如网或补片。
在一些实施方案中，一种方法不仅提供了通过使用人细胞匹配正确的物种的能力，还提供了匹配在感兴趣的组织中发现的细胞的能力，以产生针对植入位点的特异性定制的个性化支架以增强愈合。典型的可植入生物纺织品或生物纤维应用依赖于宿主细胞的细胞浸润和原位ECM沉积来驱动组织整合，而本公开的组合物和方法通过向宿主组织提供预制备的hECM模板以提供当前可植入纺织品或纤维产品中缺乏的一个或多个宿主识别信号部分来加速整合过程。
在一些实施方案中，涂覆的纺织品或纤维是可植入的纺织品或纤维应用以及涉及用于纺织品生成的纤维生产的应用或其他纤维应用(例如缝合)的一部分。织结的、编织的、针织的和非编织的纺织品支架可以使用常规的纺织品制备方法来制备，机械和生物降解性能被设计成适合它们的下游应用。在一些实施方案中，通过活组织切片从患者获取人细胞，例如成纤维细胞，或可以从二次商业来源获得非患者来源的细胞。对于取自患者的细胞，可通过细胞分选技术，例如流式细胞术或基于抗体的方法，将hECM产生细胞与其他组织替代物或其他细胞分离。然后可以将hECM产生细胞接种到灭菌的纺织品支架上并培养预定的培养时间，例如，在2至28天，或者2至3天，或者2至7天，或者7至14天，或者14至28天的范围内，或其间的任何范围或子范围，以增殖并产生与目标植入位点组织相关的hECM。培养时间可以取决于活组织切片材料的量和用于再植入的纺织品支架的尺寸。然后可以将改性的纺织品或纤维冷冻干燥以保存在hECM层中捕获的细胞因子，然后或者直接植入患者体内或者作为次级成分掺入医疗设备中以增强组织整合。
在一些实施方案中，在细胞培养完成后，可以通过酶处理，例如通过使用胰蛋白酶或分散酶，从hECM改性的纺织品或纤维表面去除细胞。在其他实施方案中，在细胞去除过程中使用特定的酶处理来消化特定的ECM组分，例如胶原酶去除胶原蛋白或弹性蛋白酶去除弹性蛋白。在其他实施方案中，化学处理用于从沉积的ECM中去除细胞，例如通过使用去污剂、酸性处理或碱性处理。在一些实施方案中，向细胞去除溶液中添加螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)，以去除被细胞用于细胞-基底结合或细胞-细胞结合的金属离子。在其他实施方案中，使用循环的冷冻和解冻来杀死细胞以从ECM中去除细胞。在其他实施方案中，细胞受到电力以将细胞膜进行电穿孔来杀死细胞，从而将其从分泌的ECM中去除。在另一个实施方案中，通过加入一种或多种可溶性凋亡诱导因子，例如紫杉醇、喜树碱、依托泊苷或盐酸阿霉素，来诱导细胞凋亡以促进其从分泌的ECM中去除。在一些实施方案中，向溶液中加入核酸内切酶，例如benzoase，以从细胞-ECM分泌的涂层纺织品或纤维中分解和去除残留的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
在一些实施方案中，人成纤维细胞通过商业来源获得并培养，以在同种异体移植样的现成产品中的纺织品或纤维上产生hECM涂层。与未处理的纺织品或纤维或涂有异种ECM试剂的纺织品或纤维相比，这种配置预计具有显著更好的生物界面性能，因为无细胞hECM纺织品缺乏可能诱发负面生物反应的外源ECM。
通过专门为纺织品用途设计的改进的生物染色系统(例如通过一次性生物反应器细胞扩增袋制成的系统)，个性化药物工作流程的进一步进展使得患者自身细胞的应用能够应用于在纺织品或纤维上生成hECM涂层。真皮成纤维细胞可以是优选的并足够用于大多数自体移植应用，因为它们最容易从患者身上获得。
虽然可以从特定的患者组织中获取细胞，但可能难以从心血管应用等位置获得组织匹配的细胞，在这些位置，任何获取过程都应尽可能微创。未来可能有机会使用更容易获得的干细胞来源来产生特定的组织ECM产生细胞，例如使用脂肪来源干细胞(ADSC)来产生ECM产生细胞的特定“细胞株”，如用于心脏等组织的成纤维细胞，其中外科医生可能不希望去除任何心脏组织来获得成纤维细胞。
待涂覆的纺织品或纤维可以是编织的、织结的、针织的和/或非编织的。待涂覆的纺织品的纤维可以在旦尼尔数和长丝类型(例如单丝、复丝、变形纤维(texturizedfiber)、纱线捻度或股(ply))方面变化。待涂覆的纺织品的纤维可以具有多种合适的横截面几何形状中的任何一种，例如圆形、十字形、扁平形、椭圆形、多叶形、矩形或正方形。
待涂覆的纺织品支架可使用由替代合成材料组成的纤维来产生，包括但不限于PET、PCL、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚丙烯(PP)或聚偏二氟乙烯(PVDF)。或者，待涂覆的纺织品支架可使用由替代的生物衍生材料组成的纤维产生，例如胶原蛋白、纤维蛋白、藻酸盐、壳聚糖或蚕丝。或者，待涂覆的纺织品支架可以使用合成-合成聚合物、合成-生物聚合物或生物-生物聚合物的共混物来产生。
待涂覆的纺织品支架可另外接种组织特异性支持细胞以帮助成纤维细胞产生ECM，例如用于软骨包裹产品的软骨细胞或用于真皮补片的角质细胞，以进一步调节ECM表面并沉积对目标组织或涂覆产品的植入位置具有特异性的细胞因子。
在纺织品支架上的细胞培养可以在例如烧瓶、培养皿、多孔板、软塑料生物密封袋或生物反应器系统中进行。可以调节培养时间来调节hECM层的密度/厚度。
在一些实施方案中，将另外的细胞粘附配体掺入hECM层中以进一步调节组织和细胞整合。
在一些实施方案中，通过首先培养一种细胞类型，然后在去除第一种细胞类型之后培养第二种不同类型的细胞来沉积不同ECM的多个连续层，以重现天然存在的生物结构顺序，例如支撑功能性ECM层(第二层)的致密基底层(第一层)。
在一些实施方案中，由成纤维细胞直接在纺织品或纤维上产生的ECM涂层改善了该纺织品或纤维相对于不具有ECM涂层、具有不是由成纤维细胞直接在纺织品或纤维上产生的ECM涂层、或具有非人ECM涂层的纺织品或纤维的生物相容性。
在一些实施方案中，一种方法将细胞系与制品共培养。工程形式的纺织品或纤维可以组装成可吸收的或不可吸收的。纺织品或纤维的表面可根据需要进行预处理，以允许生物可降解聚合物的“连接(tie)”或“轻触(kiss)”层，所述生物可降解聚合物例如含甘油癸二酸酯的聚合物，例如PGS、赖氨酸-聚癸二酸甘油酯(KPGS)、癸二酸甘油酯氨基甲酸酯(PGSU)或另一种PGS加合物。可以将含PGS的层配制成营养支持选项。可以包括PGS和细胞粘附促进剂的加合物以增强细胞与表面的粘附。合适的细胞粘附促进剂可以包括但不限于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)或酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)，即与细胞粘附到ECM相关的肽。在一些实施方案中，该方法包括将制品暴露于组织特异性成纤维细胞系，培养和扩增组织特异性成纤维细胞系以产生并沉积ECM材料，以及收获组织特异性成纤维细胞系以使制品去细胞化。该方法还可包括用PGS雾或其他合适的生物粘附剂或胶泥(mortar)将不牢固或弱的ECM涂层固定和/或固定到制品上。
在一些实施例中，含PGS的层通过在形成固态生物活性表面中提供一种或多种促进因子或促进因子前体(例如辅因子或辅酶部分)而不仅仅是提供营养支持。在一些实施方案中，含PGS的层包括至少一种促进因子或促进因子前体，例如，有助于驱动在含有含PGS的层的表面上培养的细胞的线粒体中的克雷布斯循环(也称为柠檬酸循环(CAC)或三羧酸(TCA)循环)的促进因子或促进因子前体。在一些实施方案中，培养的细胞是自体移植细胞。克雷布斯循环对细胞代谢重要，因此对疾病的健康和病理也重要。克雷布斯循环导致营养物质氧化，为产生对于细胞可用的化学能。
克雷布斯循环中能量生产的主要来源是脂肪酸，而不是糖。脂肪酸是碳源，因此脂肪酸路径对细胞生物能学重要。脂肪酸代谢路径的重要促进因子是辅酶Q10(CoQ10)、氨基酸L-肉碱和钙镁ATP酶。L-肉碱是脂肪酸路线系统的一部分，在克雷布斯循环中与CoQ10协同工作，如图1所示。
如图1所示，在甲基化酶的存在下由蛋白质结合的L-赖氨酸和L-甲硫氨酸形成三甲基赖氨酸。在维生素C、铁和羟化酶的存在下由三甲基赖氨酸形成羟基三甲基赖氨酸。在维生素B6和醛缩酶的存在下由羟基三甲基赖氨酸形成γ-丁基甜菜碱醛。在烟酸和脱氢酶的存在下由γ-丁基甜菜碱醛形成γ-丁基甜菜碱。在维生素C、铁和羟化酶的存在下由γ-丁基甜菜碱形成L-肉碱。
CoQ10，也称为泛醌，普遍存在于真核细胞中，对线粒体健康至关重要，具有以下化学结构：
Figure BDA0003293093950000121
L-肉碱是一种在体内由促进因子前体赖氨酸合成的季氨基酸，其具有以下化学结构：
Figure BDA0003293093950000122
在一些实施方案中，涂层或支架材料包括一种或多种碳源，例如在PGS或PGS加合物中的甘油和/或癸二酸，作为供给克雷布斯循环的营养支持物，以及一种或多种促进因子或促进因子前体，例如CoQ10、L-肉碱、赖氨酸、钙和/或镁，其驱动克雷布斯循环，从而促进培养细胞产生能量并改善培养细胞健康和ECM产生。
在一些实施方案中，不同的PGS加合物，包括作为促进因子或促进因子前体的特定辅因子/辅酶部分，被共混入单一载体膜中。
在一些实施方案中，不同的PGS加合物是分层的，并且聚合物流动产生层的并合。
在一些实施方案中，涂层或支架材料包括固态生物反应器组合物，该组合物包括KPGS加合物、PGS-镁(PGS-Mg)加合物和CoQ10的组合。由于固态生物反应器组合物不具有用于PGS加合的反应性基团，因此可将CoQ10复合到其中。这样的固态生物反应器组合物可用于多种应用中的任何一种，包括但不限于添加到用于生物反应器设计或植入物涂层的纺织品基底中。
在一些实施方案中，PGS分解后由细胞合成脂肪酸的速率增加，因为产生促进因子的细胞能量因促进因子或促进因子前体的存在而减少或消除。在一些实施方案中，基于细胞对hECM生产的需求分别制备和共混合一系列PGS加合物，以增加hECM生产，从而定制细胞能量需求。在一些实施方案中，培养的细胞是自体移植细胞，使得所得的hECM具有自体移植特性。在一些实施方案中，具有比皮肤细胞更高的能量需求的心肌细胞和/或肝细胞可能需要比另一种更高水平的一种能量驱动加合物以保持细胞处于最佳工作(burn)速率。
在一些实施方案中，一种方法包括在细胞培养之前制备挤出物表面。挤出物可以是纤维、膜模制形状、模切、模板或设计可植入装置所需的任何构造。挤出物表面可以进行后处理，以预活化或处理表面，用于连接、轻触或对准(direct)细胞沉积物。在一些实施方案中，预活化的沉积可以包括细胞粘附促进剂RGD、IKVAV或YIGSR中的一种，或RGD、IKVAV或YIGSR的PGS加合物。挤出物可以接种一种或多种合适的细胞系。
在一些实施方案中，一种方法包括细胞系的微球封装或表面附着。在PGS微球技术中，细胞可以预封装以直接递送到经处理的表面。可以通过合适的载体和/或合适的沉积技术将预封装的细胞直接递送到表面。可以将预封装的细胞配制成治疗涂层。
在一些实施方案中，一种方法包括在湿态、熔体流动或静电纺丝下活化可吸收和不可吸收的纤维。纤维原料可以通过多种沉积工艺中的任何一种(包括但不限于喷涂、浸渍和/或涂覆)来进行带有活化处理的纺丝整理。纤维树脂原料可以改性或与营养补充剂共混。制造的纤维制品可采用海岛形以形成混合掺杂组合物，所述混合掺杂组合物可包括可吸收海中的非可吸收岛、可吸收海中不同降解速率的可吸收岛、或具有经表面改性以接受细胞接触、粘附和/或定殖的海的非可吸收海岛。纺织品、纤维或工程制品可由改性原料制造或形成，以增强细胞-表面相互作用。纺织品纤维可通过改性处理形成，例如掺杂营养物的纺丝整理、纺丝整理期间细胞在纤维表面上的直接附着或沉积、或静电纺丝期间细胞的气溶胶共沉积。
在一些实施方案中，一种方法包括在制品的表面上沉积细胞或胶原蛋白。合适的低剪切和低热沉积方法包括但不限于喷涂、涂覆、纺丝、雾化、气溶胶化和重力。纺织品织物可设计为过滤结构，由此在过滤作用期间将具有活细胞系的悬浮培养物截留在纺织品织物的纤维结构上和纤维结构内。可以用表面活化处理预处理或掺杂纺织品结构，制品可以浸涂。包括胶原蛋白表面配位部分的成品纤维原料、纺织品或挤出物制品可以与能够产生重组胶原蛋白的重组生物体共培养(共孵育)，使得所产生的多肽结合或沉淀到共培养(共孵育)的制品的表面上，而没有微生物沉积或掺入。
在一些实施方案中，通过表征ECM沉积和/或对沉积的ECM涂覆的纺织品或纤维的响应来评估ECM涂覆的纺织品或纤维。
在一些实施方案中，一种方法包括在编织的、编结的或针织的纺织品上培养人成纤维细胞以在纺织品的表面上形成ECM。将成纤维细胞在纺织品上培养一周，以在纺织品表面产生和沉积人ECM。然后通过胰蛋白酶化去除成纤维细胞。可以用表面活性剂洗涤涂覆的纺织品以去除结合在沉积的ECM中的可溶性细胞因子蛋白。或者，如果可溶性细胞因子蛋白的存在有利于下游应用，则可不洗涤涂覆的纺织品。涂覆的纺织品可以冷冻干燥或在仍然潮湿时使用，用以进一步加工或评估。与未处理的纺织品相比，可以通过经处理的纺织品的组织学染色、电子显微或红外光谱来评估ECM沉积。
在一些实施方案中，将次级细胞类型，例如人间充质干细胞，随后接种在沉积hECM的纺织品表面上并培养一周，随后进行测试以评估物种匹配的hECM的预沉积是否改善了细胞对纺织品的反应。测试可以包括将细胞对涂覆hECM的纺织品的反应与细胞对未涂有hECM的纺织品的反应进行比较。在一些实施方案中，通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)分析、2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐(WST)分析或
Figure BDA0003293093950000141
分析(AccuMed International,Inc.,伊利诺伊州芝加哥市)来评估增殖速率。其他评估技术可以包括但不限于：评估附着效力的细胞计数、评估细胞活力的活/死分析、固定和染色细胞以观察早期和晚期培养时间点的细胞形态差异，以及评估细胞产生细胞因子的目标细胞因子的特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)。当存在预沉积的hECM时，预期增殖速度和附着会改善。
在比较性实施方案中，随后将次级细胞类型(例如人间充质干细胞)接种在具有沉积的非人ECM(例如由大鼠成纤维细胞沉积的ECM)的纺织品表面上，并培养一周，随后进行测试以评估物种不匹配ECM的预沉积是否影响细胞对纺织品的反应。改测试可以包括将细胞对非人ECM涂覆的纺织品的反应与细胞对hECM涂覆的纺织品的反应进行比较。在一些实施方案中，通过MTT分析、WST分析或
Figure BDA0003293093950000151
分析来评估增殖率。其他评估技术可以包括但不限于：评估附着效力的细胞计数、评估细胞活力的活/死分析、固定和染色细胞以观察早期和晚期培养时间点的细胞形态差异，以及评估细胞产生细胞因子的目标细胞因子的特异性ELISA。当存在预沉积的非人ECM时，预期性能会降低。
除了前述的应用之外，细胞沉积的ECM涂层可能还有除了作为人体植入物的一部分以外的应用。
在一些实施方案中，使用非人的物种特异性细胞形成用于兽医应用的涂覆的纺织品或纤维，所述非人物种特异性细胞可以包括但不限于犬细胞、猫细胞、猪细胞、马细胞或禽类细胞。
在一些实施方案中，涂覆的纺织品或纤维用作现有实验室培育的肉制品，例如碎牛肉或汉堡替代品的可撕顶部和底部开启层，如在杂货店用于分割熟食干酪切片的纸片。
在一些实施方案中，涂覆的纺织品或纤维用于产生各向异性组织支架，例如当纺织品或纤维具有用于应用(如外周神经移植物或心脏补片)的优选取向时。
在一些实施方案中，涂覆的纺织品或纤维在严重烧伤伤口的治疗中用作伤口密封剂或填充材料以促进细胞再浸润。
在一些实施方案中，涂覆的纺织品或纤维用于护肤品行业，用于体外筛选在皮肤中发现的人胶原蛋白的各种因子和制剂，例如，抗衰老霜或紫外(UV)光对皮肤的影响，其中hECM涂覆的纺织品用作在动物上测试的理想替代物。
实施例
在以下实施例的上下文中进一步描述本发明，这些实施例以举例说明而非限制的方式给出。
实施例1
将人心脏成纤维细胞在织造的PVDF纺织品上培养六天的细胞培养，然后使用UV光诱导细胞凋亡并盐水洗涤以去除细胞。图2示出了在制造后且细胞培养前的织造的PVDF纺织品10。在接种细胞进行培养之前，织造的PVDF纺织品10不存在ECM涂层。图3示出了人心脏成纤维细胞培养和细胞去除后的织造的PVDF纺织品。图2中织造的PVDF纺织品上的可见纹理表明纺织品上存在人心脏成纤维细胞沉积的ECM 12。
实施例2
傅里叶变换红外(FTIR)光谱用于表征未涂覆的PVDF织造纺织品和实施例1的去细胞化的涂覆的PVDF织造纺织品以及冻干的人心脏成纤维细胞(HCF)细胞，以化学鉴定来自细胞的细胞外基质沉积。图4示出了三个样品的全光谱。图5示出了波数为900cm-1至1100cm-1的放大的感兴趣区域，其中在冻干细胞中观察到波数为1041cm-1的指示多糖存在的C-O拉伸键，但在天然PVDF纺织品或去细胞化PVDF中不存在该键，这表明实施例1的去细胞化纺织品中不再存在细胞。图6示出了波数为1500cm-1至1800cm-1的另一个放大的感兴趣区域，其中对于实施例1的去细胞化PVDF，波数为1653cm-1和1544cm-1的两个酰胺峰指示由在织造的PVDF纺织品上培养的来自心脏成纤维细胞的蛋白质沉积ECM的存在。图7示出了波数为2700cm-1至3000cm-1的又一个放大的感兴趣区域，其中当表征冻干细胞时，存在细胞膜中含有的脂质的CH2和CH3拉伸峰，波数为2757cm-1、2929cm-1和2853cm-1，但在实施例1的原PVDF纺织品和去细胞化的PVDF中不存在这些峰。
实施例3
在PET模纱组织、PET平纹组织和涂有PGS的PGA纺织品上进行与实施例1所述类似的细胞培养。在四种不同样品的细胞培养过程中，通过使用UV-vis光谱仪将由分析测得的细胞增殖速率与已知细胞稀释度的标准曲线相关联，使用
Figure BDA0003293093950000161
分析来以量热法测定细胞计数，以测定在两轮单独的培养中培养1天和6天后的细胞计数，其结果显示在图8中。该分析表明，当细胞在第一轮细胞培养过程中在涂覆有由心脏成纤维细胞沉积的ECM的去细胞化纺织品支架上培养时，增殖水平在第二轮心脏成纤维细胞培养过程中升高。图9示出了当心脏成纤维细胞在人细胞沉积的ECM涂覆的纺织品支架上培养时，与第一轮的原支架相比，增殖因子(第6天的细胞计数与第1天的细胞计数之比)在第二轮中显著更高，而与所使用的具体纺织品无关。
实施例4
将实施例3的用心脏成纤维细胞细胞培养所得的ECM涂覆的、PGS涂覆的PGA纺织品盘用钙黄绿素AM染色并通过荧光显微镜成像。钙黄绿素AM是一种活细胞追踪器，在活细胞的细胞溶质中发出荧光。图10示出了所得的荧光显微镜图像。浅色表示活的心脏成纤维细胞，深色表示ECM涂覆的纺织品盘上没有活细胞的区域。图像显示心脏成纤维细胞在ECM涂覆的、PGS涂覆的PGA纺织品盘上的正常铺展和附着。
本文引用的所有参考文献均通过整体引用并入本文。
尽管前述说明书说明和描述了示例性实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物代替其元素。另外，在不脱离本发明的实质范围的情况下，可以做出许多改进以使特定情况或材料适应本发明的教导。因此，本发明不限于作为预期用于实施本发明的最佳方式而公开的特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求范围内的所有实施方案。

Claims (20)

1.一种形成涂覆的纺织品的方法，所述方法包括：
在纺织品的至少一个纤维上培养人细胞，使得人细胞在纺织品上产生并沉积人细胞外基质(hECM)；和
从hECM中去除人细胞，以将涂覆的纺织品提供为纺织品和包含在培养过程中由人细胞在纺织品上产生并沉积的hECM的残余物的涂层。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人细胞是人成纤维细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述人细胞是从需要所述涂覆的纺织品的人提取的自体移植细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在培养前改性所述至少一个纤维的表面，以促进细胞粘附到所述表面。
5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括改性所述至少一个纤维的表面，以增强由人细胞产生hECM。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述改性包括用包含聚癸二酸甘油酯加合物的固态生物反应器组合物涂覆所述至少一个纤维的表面，其中所述聚癸二酸甘油酯加合物包含聚癸二酸甘油酯和促进因子或促进因子前体。
7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述至少一个纤维上培养人细胞之前，用聚癸二酸甘油酯层涂覆所述纺织品的至少一个纤维。
8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述去除后在所述纺织品上培养第二类型的人细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括从人提取所述人细胞，和在培养前纯化所述人细胞。
10.一种涂覆的纺织品，其包括：
纺织品；和
纺织品上的涂层，所述涂层包含人细胞外基质(hECM)，其中所述hECM在所述涂层中处于细胞沉积状态。
11.根据权利要求10所述的涂层，其中所述纺织品包含选自由以下组成的组的聚合物材料：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、胶原蛋白、聚乙醇酸、聚癸二酸甘油酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚三亚甲基碳酸酯和聚己内酯。
12.根据权利要求10所述的涂覆的纺织品，其中所述纺织品是编织的、编结的、非编织的或针织的。
13.根据权利要求10所述的涂覆的纺织品，其中所述hECM选自由以下组成的组：人蛋白聚糖、人硫酸乙酰肝素、人硫酸软骨素、人硫酸角质素、人非蛋白聚糖多糖、人透明质酸；人胶原蛋白、人弹性蛋白、人纤连蛋白、人层粘连蛋白及它们的组合。
14.根据权利要求10所述的涂覆的纺织品，其中所述涂覆的纺织品不含异种材料。
15.根据权利要求10所述的涂覆的纺织品，其中所述涂覆的纺织品是去细胞化的。
16.根据权利要求10所述的涂覆的纺织品，其中所述涂层进一步包括在所述纺织品上的聚癸二酸甘油酯层。
17.根据权利要求10所述的涂覆的纺织品，其中所述纺织品包括至少一种包含含甘油癸二酸酯的聚合物的纤维。
18.根据权利要求10所述的涂覆的纺织品，其中所述hECM来自从需要所述涂覆的纺织品的人提取的自体移植细胞。
19.一种固态生物反应器组合物，其包含聚癸二酸甘油酯加合物，其中所述聚癸二酸甘油酯加合物包含聚癸二酸甘油酯和促进因子或促进因子前体。
20.一种方法，其包括：
将涂覆的纺织品植入人体，其中所述涂覆的纺织品是包含纺织品和所述纺织品上的涂层的自体移植物，所述涂层包含由来自所述人体的人细胞沉积的处于细胞沉积状态的人细胞外基质(hECM)。
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