SK35894A3 - Method of fermentating preparation of l-treonine by cultivation of production strain of escherichia coli 472 t-23 - Google Patents

Description

Oblasť.......techniky

Vynález sa týka spôsobu ferm en tácne j výroby; L-treoníriu kultiváciou produkčného kmeňa Escherichia coli 472 T-23 v tekutom živnom médiu obsahujúcom zdroje asimilovaného uhlíka a dusíka, minerálne živné solí a/alebo' stopové prvky a/alebo biofaktory, pri aerobných podmienkach.

Pote raj. š í.......stav.......techniky

L-treonín je esenciálna’ am i nokyseli n a používaná ako v živočíšnej výrobe na obohacovanie kŕmnych zmesí, tak aj v medicíne. 1 ekonomických a technických dôv odov bolo preto potrebné mat k dispozícií taký technologický postup, ktorým by bolo možné získavať túto aminokyselinu jednoducho a v prijaté!nom výťažku. Ako rentabilné sa javili a ďalej boli vyvinuté postupy biosyntetické, predovšetkým kultivácia vhodných mikroorganizmov, pri ktorých bola využitá ich schopnosť hromadiť L-treónín v kultivačnom médiu v relatívne množstvách. M i k roorgan i z m y,. 'vhodné na tento účel, Escherichia coli, syntetizujú ale potrebných predovšetkým pre proteosyntézu alebo ako intermediát biosyn.tézy izoleucínu. Až kombináciou metód mutácie, selekcie a génového inžinierstva sa podarilo získať kmeň Escherichia coli 472 T-23 (USA pat.spis

č. 4 278 765 ), ktorý bol schopný pri kultivácii v médiu so sacharózou ako zdrojom uhlíka hromadiť za 40 hodín až 40 g/1 L-treonínu pri konverzii sacharózy okolo 33 %. Ďalšími zásahmi médií vhodnými

G, s a p o darilo až 73 g/1, pri vysokých najmä kmene v množstvách,

L-treonin v 1 a s 1, n ú a doplnením a penicilínu

L-treonínu na 66 40 %.

Číslom ďalšieho vývoja výroby L-treonínu bolo nájdení takého spôsobu riadenia fermentácie, ktorý by umožňoval opti koncentráciami izoleucínu postupne zvýšiť v ý ť a ž k y konverzii sacharózy 38 až

/ málne ovplyvnenie metabolickej aktivity produkčného kmeňa, čim by sa dosiahlo nielen zvýšenie produkcie, ale aj vytvorenie predpokladov pre automatickú reguláciu novo vyvinutého technologického postupu fermentačnej výroby L-treonínu.

Podstata.......vynálezu

Týmto požiadavkám vyhovuje spôsob fermentačnej výroby L-treoriinu kultiváciou produkčného 'kmeňa Escherichia colí 472 T--23 podlá vynálezu v tekutom živnom médiu, obsahujúcom zdroje asimilovaného uhlíka á dusíka, minerálne živné soli a/alebo stopové prvky a/alebo biofaktory, pri aerobných podmienkach; podstata vynálezu potom spočíva v tom, že po začatí rastu produkčného mikroorganizmu pri súčasnej produkcii L-treonínu sa udržiava v živnom médiu pH ria hodnote 6,5 až 7,0, a obsah kyslíka na hodnote 20 až 25 % nasýtenia pridávaním roztoku sacharózy a amoniaku, a po zastavení rastu, ktorý sa prejaví poklesom rýchlosti na nulovú hodnotu a po poklese koncentrácie sacharózy v živnom médiu pod hodnotu 0,5 g/1 sa kultivácia ukončí.

Vysokú rastovú a produkčnú rýchlosť použitého mikroorganizmu je možné pri realizácii! spôsobu podlá vynálezu udržiavať počas celej doby fermentácie kontinuálnym dávkovaním roztoku sacharózy a roztoku amoniaku na základe merania pH, ktoré sa znižuje v dôsledku zvýšenej metabolickej aktivity mikroorganizmu v exponenciálnej fáze rastu a prejavuje sa zvýšením respirácie, znížením koncentrácie rozpusteného kyslíka., kyslíkovým limitom a zvýšenou spotrebou sacharózy. Na základe merania koncentrácie rozpusteného kyslíka a/alebo pH je dávkovaný roztok sacharózy, ktorý obnoví respiráciu a ďalej aj rast produkcie.

Uvedeným spôsobom podlá vynálezu sa velmi jednoduchým opatrením podarilo zvýšiť výťažky L-treoninu až na 80 g/1, pri konverzii sacharózy okolo 42 %.

.......v vhotovenía.......vynálezu

Do fermentačného tanku objemu 30 litrov, s miešadlom a prívodom sterilného vzduchu, sa umiestnilo 15 litrov kultivačného média, obsahujúceho 450 g afinovanej sacharózy, í·*^?

g kvasničného autolyzátu, 75 g síranu amónneho, 6 .g síranu horečnatého, 30 g dihydrogénfosforečnanu draselného, '0,3 g síranu železnatého, 0,3 g síranu manganatého a 9 g sójového oleja. Po sterilizácii (120 °C/30 min) sa kultivačné médium ochladilo na 37 °C, pridalo sa 2 g penicilínu G a uskutočnilo sa očkovanie 1 ml bunečnej suspenzie, získanej kultiváciou produkčného mikroorganizmu Escherichia colí 472 T-23 pri rovnakých podmienkach ako v produkčnom stupni.. Fermentácia prebiehala pri konštantnej teplote 37 °C, pretlaku 0,5 barr a rýchlosti prúdenia vzduchu 0,9 m/s, pri rýchlostí miešania 500 až 900 ot/min, udržiavanej automaticky tak, aby koncentrácia rozpusteného kyslíka (počiatočný stav 100 % nasýtenia) neklesla pod 20 % nasýtenia. Počas procesu bolí kontinuálne merané: koncentrácia rozpusteného kys-lika (počiatočný stav 100 % nasýtenia), pH, teplota, tlak a prietok vzduchu. Sem i kontinuálne bola sledovaná optická denzita (rastová rýchlosť) koncentrácie L-treonínu (produkčná rýchlosť.), koncentrácia sacharózy a koncentrácia am on i ak ál n eho dusíka.

Po 8 hodinách, produkčný organizmus stúpajúcej rastovej keď bol proces v rásť a produkovať rýchlostí a tým pokles koncentrácie rozpusteného kyslíka Do 20. kultivačnej hodiny sa pridávaním 25 % vodného roztoku 7,0. Spotreba zdroja uhlíka (asi bola indikovaná znížením koncentrácie rozpusteného koncentrácie rozpusteného dávkoval roztok litri 400 tak dlho.

sa do média v jednom amoniaku latentnej fáze, začal L-treoriín. V dôsledku aj respirácie, začal a zárov.en pokles pH.

pH automaticky ' upravovalo amoniaku na hodnotu 6,5 až v 20. 'kultivačnej, hodine) respirácie, čo viedlo ku zvýšeniu kyslíka v médiu. Pri zvýšení kyslíka o 25 % (na 25 % nasýtenia) afi novej sacharózy, obsahujúci g cukru a 2 5 0 rul 25 % vodného roztoku až sa koncentrácia rozpusteného kyslíka ustálila na hodnote 20 % nasýtenia.

Po poklese rozpusteného kyslíku pod 20 % nasýtenia (pri maximálnom miešaní 900 ot/min) sa dávkoval 70 % roztok sacharózy rýchlosťou 200 ml/hod, opäť automaticky v závislosti na zvýšení koncentrácie . rozpúšťaného kyslíka o 25 %; pH sa automaticky regulovalo na hodnotu 6,5 až 7,0 pridávaním 25 % •T vodného roztoku amoniaku.

Pri zastavení rastu a poklese rýchlosti rastu na nulovú hodnotu sa zastavilo dávkovanie sacharózy, jej koncentrácia' sa nechala klesnúť na hodnotu pod 0,5 g/1 a fermentácia sa ukončila. Po 42 hodinách kultivácie sa dosiahla produkcia 80 g/1 L-treonínu, pri konverzii sacharózy 42 %.

Z kultivačného média je možné L-treonín izolovať buď ako technický produkt alebo ako čistú kryštalickú substanciu.

Pri e mysel..riá využiteľnosť

L-treonín pripravený spôšobom podlá vynálezu je možné využiť tak v krmivárstve na výrobu kŕmnych zmesí, ako aj na farmaceutické (liečebné) účely.

Claims (1)

1. PATENT Ο V E

   NÁROKY

   Spôsob fermentačnej výroby L-treoníriu kultiváciou produkčného kmeňa Escherichía coli 472 T-23 v tekutom živnom médiu, obsahujúcom zdroje asi m i lov a t. e Iného uhlíka a dusíka, minerálne živné soli a/alebo stopové prvky a/alebo biofaktory, pri aer óbri y ch podmienkach, v y z n a'č u j ú c i s a t ý m, že sa po začatí rastu produkčného mikroorganizmu pri súčasnej produkcii L-treoriinu udržiava v živnom médiu pH na hodnote

   6,5 až 7,0 a obsah kyslíka na hodnote 20 až 25 % nasýtenia pridávaním roztoku sacharózy a roztoku amoniaku a po zastavení rastu a poklese rastovej rýchlosti mikroorganizmu na nulovú hodnotu a po poklese koncentrácie v živnom médiu pod hodnotu 0,5 g/l sa kultivácia ukonči.