SK284247B6 - Lipozómový prípravok 6,9- bis[(2-aminoetyl)amino]benzo[g]izochinolín-5,10-dión dimaleátu a jeho použitie - Google Patents

Abstract

Lipozómový prípravok zlúčeniny 6,9-bis-[(2- aminoetyl)amino]benzo[g]-izochinolín-5,10-dión dimaleátu - BBR 2778, ktorý zahrnuje fosfatidylcholín, cholesterol a zlúčeninu BBR 2778 v hmotnostnom pomere cholesterol/fosfolipid 1 : 2 až 1 : 7 a v hmotnostnom pomere BBR 2778/fosfolipid 1 : 4 až 1 : 25.ŕ

Description

Prítomný vynález sa týka lipozómových farmaceutických prípravkov zlúčeniny 6,9-bis-[(2-aminoetyl)amino]benzo[g]izochinolín-5,10-dión dimaleátu (BBR 2778).

Doterajší stav techniky

Lipozómy sú vodné disperzie prírodných a/alebo syntetických fosfolipidov (biokompatibilné a biodegradovateľné) usporiadaných v jednej alebo viacerých dvojvrstvách. Keď sa fosfolipidy hydratujú vo vodnom prostredí, samovoľne tvoria koloidné mikročastice alebo nosiče, obyčajne priemeru 0,05 až 5,0 pm. Veľkosť lipozómovej častice sa pohybuje od 0,025 pm až 2,5 pm, v závislosti od ich štruktúry, ktorá môže byť jednoduchou alebo niekoľkonásobnou dvojvrstvovou štruktúrou. Veľkosť vezikula je kritický parameter na zistenie polčasu rozpadu lipozómov a ovplyvňuje objem zapuzdreného liečiva.

Lipozómy môžu byť klasifikované podľa ich zloženia z prirodzených a/alebo syntetických fosfolipidov (fosfosfingolipidy) a ich dvojvrstva môže ďalej obsahovať ďalšie zložky, ako napríklad cholesterol a lipidom konjugované hydrofilné polyméry. V závislosti od ich veľkosti a množstva dvojvrstiev, môžu byť tiež lipozómy rozdelené do nasledujúcich kategórií: (a) multilameláme vezikulá (MLV), (b) veľké jednovrstvové vezikulá (LUV), (c) malé jednovrstvové vezikulá (SUV), (d) viacvezikulové vezikulá (MVV), (e) oligolameláme vezikulá (OLV).

Chemicko-fyzikálne vlastnosti fosfolipidov, ktoré tvoria lipozómy, ako napríklad membránová tekutosť, hustota náboja, stérická zábrana a priepustnosť, ovplyvňujú interakciu medzi lipozómami a krvnými zložkami, tkanivami a bunkami.

Lipozómy sú zjavne potenciálne hodnotné nosiče pre lieky. Schopnosť lipozómov obsahujúcich, nosiacich a uvoľňujúcich lieky viedlo k množstvu klinických aplikácií. Zjednodušene, použitie lipozómov vo farmaceutickej oblasti je ako netoxických nosičov pre nerozpustné liečivá. Komplexnejšie aplikácie zahrnujú použitie lipozómov ako „zásobníkov“ na predĺžené uvoľňovanie liečiva alebo na lokalizáciu liečiva, buď na zabránenie, alebo dosiahnutie špecifického tkaniva. Liečivo v lipozómovej forme poskytlo priaznivé výsledky v liečení a prevencií množstva chorôb, ako je napríklad antimikrobiálna terapia, protirakovinová terapia, ako adjuvans vo vakcínovej, hormonálnej a enzýmovej terapii, v diagnostických technikách a v liečení kožných a očných chorôb. Liečivá použité na liečenie chorôb, ako je napríklad rakovina, majú obvykle obmedzený terapeutický index a môžu byť vysoko toxické pre normálne tkanivá. Lipozómové prípravky môžu zlepšiť terapeutický index, modifikáciou biodistribúcie liečiva. Niektoré experimenty s lipozómom zapuzdrenými antracyklínmi s predĺženým plazmovým polčasom rozpadu ukázali zmiernenie v kardiotoxicite a lepšom prežití zvierat v porovnaní s kontrolami, ktoré zahrnovali voľné liečivo. V prípade doxorubicínu, antrachinónového protirakovinového liečiva, použitie lipozómových prípravkov dokazuje, že sú efektívne v znižujúcej sa toxicite. Doxorubicinový najnebezpečnejší vedľajší účinok je progresívny, nevyliečiteľné poškodenie srdca. Lipozómom zapuzdrený doxorubicín ukázal nízku toxicitu, aj za udržania jeho terapeutickej účinnosti. US 4 797 285, US 4 898 735 a US 5 043 166 opisujú doxorubicín/lipozómové prípravky a ich použitie na liečenie rakoviny.

Zlúčenina BBR 2778 je antrachinónové protirakovinové liečivo s protirakovinovou účinnosťou a zníženou kardiotoxicitou nasledujúceho vzorca

.COOH

COOH

Úplný opis zlúčeniny BBR 2778 je uvedený v US 5 587 382, US 5 717 099, US 5 506 709 a v J. Med. Chem., 1994, zväzok 37, 828 až 837.

Po i. v. podávaní dávok 40 až 60 mg/kg BBR 2778 ako bolus CD1 myšiam, smrť niektorých zvierat sa spozoruje buď počas, alebo okamžite po liečení.

Takéto náhle smrti sú pravdepodobne spôsobené jedným z nasledujúcich faktorov týkajúcich sa použitia BBR 2778: trombogénna účinnosť, zmena parametrov hemokoagulácie s následnou tvorbou roztrúsených intravaskulárnych koagulácii, indukcia anafylaktického šoku, priamy toxický účinok na centrálny nervový systém, arytmogénna účinnosť, elektrolytická nerovnováha. Tento od dávky závislý jav sa znižuje jednak znížením injekčnej rýchlosti (0,1 ml/min., 7 až 8 minút na injekciu) a tiež intraperitoneálnym podávaním.

Zásadným problém predkladaného vynálezu bolo teda nájsť vhodný prípravok zlúčeniny BBR 2778 na prekonanie nevýhod uvedených skôr, najmä náhle úmrtia spozorované po bonusovom podaní účinných zložiek. Prekvapivo bolo zistené, že BBR 2778 lipozómový prípravok charakterizovaný konkrétnou kompozíciou, úspešne rieši uvedený problém.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je teda lipozómový prípravok zlúčeniny 6,9-bis-[(2-aminoetyl)amino]benzo[g]izochínolín-5,10-dión dimaleátu - BBR 2778 pozostávajúci z lipozómov obsahujúcich fosfatidylcholín, cholesterol a BBR 2778 v hmotnostnom pomere cholesterol/fosfolipid 1 : 2 až I : 7 a v hmotnostnom pomere BBR 2778/-fosfolipid 1 : 4 až 1 : 25. Fosfatidylcholín výhodne obsahuje zvyšky mastných kyselín, vybraných z kyseliny palmitovej, olejovej, linolovej, gamma-linolovej, linolénovej a stearovej, a lipozóm je tvorený zmesou hydrogenovaných a nehydrogcnovaných fosfatidylcholínov zahrnujúcich mastné kyseliny, v pomere 1 : 2 až 2 : 1, výhodnejšie uvedená zmes pozostáva z hydrogenovaného fosfatidylcholinu, ktorý má teplotu topenia 120 °C a teplotu kryštalizácie 90 °C a nehydrogenovaného fosfatidylcholinu, ktorý má termogram uvedený na obr. 5. Hydrogenované a nehydrogenované fosfatidylcholíny s obsahom uvedených zmesí sú komerčne prístupné pod názvom PHOSPHOLIPON® 90 H alebo PHOSPHOLIPON® 90.

Výhodne, zmes podľa vynálezu zahŕňa, okrem uvedených zložiek, nabité zlúčeniny ako napríklad stearylamín a dicetylfosfát. Pridanie uvedených zložiek poskytne lipozómom povrchový náboj, ktorý spôsobuje ich vzájomný odpor, teda predchádza ich kolapsu. Fosfolipidová zmes môže tiež obsahovať dodecylsíran sodný, cremophor RH60, alfa-tokoferolfosfát a octan vápenatý. Okrem toho môžu byť v membránovej dvoj vrstve zahrnuté malé frakcie (5 až 19 % molových) zlúčenín s hydrofilnými skupinami, ako je napríklad monosialogangliozid, hydrogenovaný fosfatidylino sitol a lipidom konjugované polyetylénglykoly (PEG-DSPE, aby sa zmenšila interakcia medzi lipozómami a bunkami a krvnými zložkami.

Lipozómové prípravky podľa vynálezu sa testovali in vivo na protinádorovú účinnosť a toxicitu. P388 murínová leukémia sa použila ako nádorový model. Najmä sa vyhodnotila inhibítorová účinnosť na náhle úmrtia, v porovnaní s kontrolnou skupinou, ktorej bol podávaný prípravok voľného liečiva. Detaily sú uvedené v príkladoch. Výsledky testov ukazujú, že lipozómové prípravky podľa vynálezu spôsobujú pozoruhodné zlepšenie priemerného času prežitia a výrazné zníženie toxicity. Okrem toho sa už nezaznamenali náhle úmrtia.

Na záver možno uviesť, že prípravky podľa vynálezu udržiavajú protirakovinovú účinnosť bez spôsobenia náhleho úmrtia, ktoré sa pozorovalo v prípade voľného liečiva alebo ďalších konvenčných prípravkov účinnej zložky.

Nasledujúce príklady ilustrujú vynález vo väčších detailoch.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 až 3 znázorňujú plynové chromatogramy štandardu, PHO 90 a PHO 90H.

Obr. 4 a 5 znázorňujú termogramy dvoch fosfolipidov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Purifikácia lecitínu na fosfatidylcholín

Základným zdrojom lecitínu sú rastlinné oleje zo sójového bôbu, bavlny, slnečnice a repkových semien alebo zo živočíšnych tkanív (vajcia). Čo sa týka vyprodukovaných množstiev, sú najvýznamnejšie sójové a vaječné lecitíny. Sójové bôby sa podrobili extrakcii s hexánom za získania surového lecitínu polotuhej konzistencie, ktorý obsahoval: 52 % fosfolipidov, 35 % olejov a tukov, 10 % glykolipidov a cukrov, 2 % nesaponiŕikateľných látok a 1 % vody.

Mastné kyseliny sa extrahovali zo surového lecitínu za získania jemného alebo granulovaného lecitínového prášku, ktorý sa ďalej extrahoval s etanolom a fŕakcionoval za získania čistejších lecitínov s vyššími obsahmi fosfatidvlcholínu.

Surový lecitín sa tiež čistil použitím jednoduchého spôsobu priemyselnej výroby fosfatidylcholínu extrakciou s acetónom, ako je opísané v US 5 442 276.

Čistenie surového lecitínu

SurovýIecNín

Extrakcia (etanol) chromatografia (silkagél)

PHOSPHOLIPON 80

PHOSPHOLIPON® 90H (PHO 90H) sa získal hydrogenáciou PHOSPHOLIPON® 90 (PHO 90).

Dva komerčné fosfolipidy (Rhône - Poulenc Rorer) majú nasledujúce charakteristiky: PHOSPHOLIPON® 90 (PHO 90):

- peroxidový index: max. 5

- hodnota kyslosti: max. 0,5

- etanol: max. 0,5 %

- voda: max 1,5 %

- forma: žltá pastovitá tuhá látka

- pridanie d, Ια-tokoferol min. 0,1 % PHOSPHOLIPON® 90H -jódové číslo: max. 1

- voda: max. 2,0 %

- teplota fázového prechodu 20 % disperzie v H₂O asi 54 °C

- forma: biela kryštalická tuhá látka.

Glyccrolové 1- a 2-polohy v fosfatidylcholínovej molekule sa esterifikujú s mastnými kyselinami, ako je napríklad kyselina palmitová, olejová, linolová, linolénová a stearová.

Príklad 2

Chromatografická analýza fosfolipidov

Zmes mastných kyselín fosfatidylcholínových vzoriek čo sa týka kvantitatívnych alebo kvalitatívnych údajov sa stanovila pomocou GLC analýzy. Mastné kyseliny vo fosfolipidových vzorkách sa určili a dávkovali použitím metylesterov mastných kyselín (Carlo Erba) a štandardného olivového oleja.

Saponifikácia vzorky: 50 mg produktu sa umiestnilo v skúmavke a pridali sa 3 ml IN hydroxidu sodného (Baker). T-skúmavka sa pevne hermeticky uzatvorila a umiestnila do vhodnej sušiarne pri 110 °C počas jednej hodiny. Po ochladení na teplotu miestnosti sa vzorka okyslila 2N kyselinou chlorovodíkovou (Baker) a extrahovala sa 10 ml zmesi n-hexán/etylacetátu 90/10 (Merck). Organické rozpúšťadlo sa odstránilo za mierneho prúdenia dusíka.

Esterifikácia vzoriek: organická fáza sa odstránila z t-skúmavky, pridal sa 1 ml BF₃ v metanole, t-skúmavka sa pevne hermeticky uzatvorila a ponechala 1 hodinu pri 100 °C. Po ochladení na teplotu miestnosti sa vzorka pridala k 5 ml destilovanej vody a extrahovala sa dvakrát vždy 5 ml zmesi «-hexán/etylacetát 90/10. 1 gl organickej fázy sa sušil nad Na₂SO₄, potom injektoval do plynového chromatografického zariadenia.

Použité podmienky:

Plynový chromatograf: Mega 5300 Carlo Erba Stĺpec: Megawax, dĺžka 30 m, i. d. 0,32 mm, f. t. 0,25 gm Nosič: rýchlosť hélia rýchlosť 45 cm/s Injektor: rozdelenie 1/100 a 250 °C Detektor: F.I.D. pri teplote 280 °C

Sušička: 120 °C počas 1 minúty Konečná teplota: 250 °C, s tepelným nárastom 5 °C /min.

Na obr. 1 až 3 sú znázornené plynové chromatogramy štandardu, PHO 90 a PHO 90H.

Tabuľka 1 uvádza percentá kyselín v analyzovaných lipidoch chromatografia (oxid hlinitý)

PHOSPHOLIN 90 hydrogenácla

PHOSPHOLIN 90H

Tabuľka 1

Mastné kyseliny	PHOSPHOLIPON 80	PHOSPHOLIPON 90H
stearová	4.13	85
palmitová	14,21	14
olejová	9.34	-
linolová	64,44	•
gamma-linolová	1.50	-
linolénová	5.88	-

Príklad 3

Fosfolipidové tepelné analýzy

Komerčné fosfolipidy PHO 90 a PHO 90H, obidva samostatne a v zmesi, sa analyzovali DSC.

Vzorky sa pripravili nasledovne: 500 mg PHO 90 sa rozpustilo v 10 ml dichlórmetánu + 1 ml MeOH (S J, 500 mg PHO 90H sa rozpustilo v 10 ml dichlórmetánu + + 1 ml MeOH (S₂).

Vzorka 1: 2 ml S] Vzorka 2: 2 ml S₂ Vzorka 3: 0,5 ml S] + 1,5 ml S₂ Vzorka 4: 1 ml S] + 1 ml S₂ Vzorka 5: 1,5 ml Sj + 0,5 ml S₂

Vzorky sa sušili pod prúdom dusíka za mierneho ohrievania, potom sa analyzovali DSC. Analýza sa uskutočnila s Mettler DSC 20, ohriatie na 200 °C s gradientom nárastu 3 °C/minútu, potom ochladenie vzorky.

Obr. 4 a 5 uvádzajú termogramy dvoch fosfolipidov. Ako je zaznamenané na obr. 4, PHO 90H má výraznú, dobre definovanú teplotu topenia 120 °C a teplotu kryštalizácie 90 °C.

Čo sa týka PHO 90, obr. 5 ukazuje, že to nie je kryštalický prášok, ale pastovitá látka, a ako v prípade všetkých tukov, nemá dobre definovanú teplotu topenia, ale bod mäknutia, ktorý je teplotou, pri ktorej tuk začína tiecť a teplotu čírenia, ktorá je teplotou, pri ktorej je tuk úplne číry.

Potvrdí sa to termogramom PHO 90, v ktorom široká skupina zodpovedá teplote mäknutia spozorovanému namiesto definovaného vrcholu, ako je to v prípade PHO 90H termogramu.

Ako jc vidieť na termogramoch zmesí, zníženie teploty kryštalizácie sa spozoruje pri nižších teplotách, ktoré sa ďalej znižujú od zmesi PHO 90H : PHO 90 2 : 1 na 1 : 1, až do konečného úplného zmiznutia v zmesi PHO 90H : PHO 90 1 : 2, v ktorej PHO 90 pôsobenie prevláda.

Príklad 4

Príprava lipozómového prípravku

3,6 g PHO 90, 1,8 g PHO 90H (pomer 2 : 1) a 0,52 g cholesterolu sa umiestnilo do 500 ml banky s guľatým dnom a pridalo sa 50 ml dichlórmetánu. Zmes sa sonikovala počas približne 10 minút na podporu rozpustenia. Výsledný roztok sa odparil do sucha v rotačnej tenkovrstvovej odparke (Rotavapor) pri teplote 40 °C za vákua a so slabou rotáciou až do získania homogénneho fosfolipidového filmu.

Výsledný fosfolipidový film sa ochladil, potom sa pridal k roztoku BBR 2778 pripravenom rozpustením 300 mg BBR 2278 v 60 ml zmesi voda/propylénglykol 60/40 a filtráciou cez 0,22 pm filter a 10 ml sklenených guľôčok so stredným priemerom 2 mm. Banka s guľatým dnom spojená s rotačnou odparkou sa ponechala za pomalého pohybu cez noc (15 hodín, 300 otáčok/min.) pri teplote miestnosti a tlaku až do úplnej rehydratácie. Tabuľka 2 zaznamenáva analýzu výsledného BBR 2778 prípravku.

Tabuľka 2

Formulácia BBR 2778
% zapuzdrené v lipozómoď	85,82
celková koncentrácia BBR 2778 (mg/ml)	4,76
% lipozómov veľkosti 0,22 pm	63,53

Príklad 5

Vyhodnotenie protirakovinovej účinnosti BBR 2778 lipozómov

Zvieratá: myši poskytnuté Charles River Breeding Laboratories (Calco, Como, Italy), boli to samčie myši 6 až 8 týždňové za štandardných podmienok umiestnenia.

Prípravky: BBR 2778 rozpustený a zriedený v sterilnej vode tesne pred podaním 10 mg/kg myšiam sa použil ako štandard. Použil sa lipozómový prípravok z príkladu 4.

Rakovinový model: P388 myšia leukémia, poskytnutá NCI Frederick CanceT Facility (USA) sa udržiava až do série intraperitoneálnych transplantátov v DBA2 myšiach. Myši sa transplantovali s 10⁶ buniek/myšia P388 leukémia, lipozómová zlúčenina a referenčný štandard sa podávali

i. v. v dňoch 1,4, 7 po rakovinovom transplantovaní.

Protirakovinový účinok sa určil ako percentuálne zvýšenie čo sa týka času prežitia myší, vyjadrené ako T/C % pomer priememeho času prežitia (TMS) ošetrenej skupiny (T) k priemernému času prežitia kontrolnej skupiny (C):

TMS ošetrené zvieratá

T/C%= —--x 100

TMS kontrolované zvieratá

Tabuľka 3 uvádza výsledky protirakovinovej účinnosti BBR 2778 v testovanom prípravku.

Tabuľka 3

Zlúčenina	Dávka (mg/kg/deň)	T/C%	TOX	Náhle úmrtia
Kontroly		100	0/9
Roztok BBR 2778	18	199**	1/56
	27	226**	9/71
	40	159”	32/53	2/53
	60	36“	23/32	2/32
Prípravok z príkladu 4	nosič	100	0/8
	18	187:194	0/17
	27	225; 244	0/17
	40	267; 250	2/16
	60	87:44	17/17

* množstvá toxických úmrti/celkový počet myM *· priemerné hodnoty viacerých testov

Porovnanie prípravku príkladu 4 a roztoku BBR 2778 jasne dokazuje vymiznutie náhlych úmrtí pri myšiach, ktorým sa podáva lipozómový prípravok. Analýza každej jednotlivej podávanej dávky ukazuje zmeny v T/C % a toxicite medzi lipozómovým prípravkom a prípravkom roztoku; pri dávkach 18 mg/kg a 28 mg/kg sa žiadne podstatné rozdiely nezaznamenali čo sa týka T/C %, zatiaľ čo sa týka toxicity sa zaznamenali zmeny len po liečení s nezapuzdrenými BBR 2778.

Prípravok podľa vynálezu v porovnaní s BBR 2778 v roztoku pri dávke 40 mg/kg spôsobuje pozoruhodné zlepšenie stredného času prežitia: 287, 250 a 150 každý jednotlivo a výrazné zníženie v toxicite (12 % a 60,4 %, každý jednotlivo). Dávka 60 mg/kg je toxická s oboma prípravkami.

Preto je možné uviesť, že podávanie lipozómového prípravku BBR 2778 podľa vynálezu nespôsobuje žiadne náhle úmrtia a znižuje toxicitu.

Pokiaľ ide o protirakovinový účinok, výsledky z testov BBR 2778 v roztoku sa potvrdili, dokonca s pozoruhodným zvýšením v T/C % na niektoré dávky.

Claims (6)

1. Lipozómový prípravok zlúčeniny 6,9-bis-[(2-aminoetyl)amino]benzo[g]izochinolín-5,10-dión dimaleátu - BBR 2778 vzorca (I)

XOOH

COOH (I), vyznačujúci sa tým, že zahrnuje fosfatidylcholín, cholesterol a zlúčeninu vzorca (I) v hmotnostnom pomere cholesterol/fosfolipid 1 : 2 až 1 : 7 a v hmotnostnom pomere zlúčenina vzorca (I)/fosfolipid 1 : 4 až 1 : 25.

2. Lipozómový prípravok podľa nároku 1, v y z n a čujúci sa tým, že fosfatidylcholín zahrnuje zvyšky mastných kyselín, vybraných z kyseliny palmitovej, olejovej, linolovej, gamma-linolovej, linolénovej a stearovej.

3. Lipozómový prípravok podľa nároku 1, v y z n a čujúci sa tým, že fosfatidylcholín je zmes hydrogenovanej a nehydrogenovanej formy v hmotnostnom pomere 1 : 2 až 2 : 1.

4. Lipozómový prípravok podľa nároku 3, v y z n a čujúci sa tým, že hydrogenovaná forma má teplotu topenia 120 °C a teplotu kryštalizácie 90 °C a nehydrogenovaná forma má termogram uvedený na obr. 5.

5. Lipozómový prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje stearylamin a/alebo dicetylfosfát.

6. Lipozómový prípravok podľa nárokov 1 až 5 na použitie ako protirakovinový liek.